WO2023219533A1 - Аденоассоциированный вирусный вектор на основе серотипа aav.php.b и его применение - Google Patents

Аденоассоциированный вирусный вектор на основе серотипа aav.php.b и его применение Download PDF

Info

Publication number
WO2023219533A1
WO2023219533A1 PCT/RU2023/050104 RU2023050104W WO2023219533A1 WO 2023219533 A1 WO2023219533 A1 WO 2023219533A1 RU 2023050104 W RU2023050104 W RU 2023050104W WO 2023219533 A1 WO2023219533 A1 WO 2023219533A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
aav
php
seq
protein
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/RU2023/050104
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Петр Петрович РОДИОНОВ
Роман Васильевич ДРАЙ
Максим Андреевич МАГРУК
Виталий Феликсович ЛАТЫПОВ
Валерия Бяшимовна САПАРОВА
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from RU2022112789A external-priority patent/RU2022112789A/ru
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм"
Publication of WO2023219533A1 publication Critical patent/WO2023219533A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors

Definitions

  • the present invention relates to biotechnology.
  • a recombinant adeno-associated rAAV vector based on the AAV.PHP.B serotype is described, containing a polynucleotide encoding the motor neuron survival protein SMN (hereinafter referred to as AAV.PHP.B.SMN), intended for modulating motor function in a subject with motor neuron disorder, in particular for treatment of spinal muscular atrophy.
  • AAV.PHP.B.SMN motor neuron survival protein
  • Spinal muscular atrophy is an autosomal recessive hereditary neuromuscular disorder, most commonly seen in infants and children, caused by gradual and irreversible impairment of motor neuron function in the anterior horn of the spinal cord, leading to symmetrical weakening and subsequent muscle atrophy.
  • a patient with SMA gradually loses the ability to crawl, walk, control his own body, sit independently, eat, swallow and breathe [1].
  • the genetic cause of SMA is mutations or deletions of the SMN1 gene, located on the long arm of chromosome 5 (5ql l.2-ql3.3).
  • the SMN1 gene encodes the SMN (survival of motor neuron) protein, which is necessary for the functioning of motor neurons.
  • SMA is caused by homozygous deletions of exons 7 and 8 of the SMN1 gene or, in most cases, exon 7 [2].
  • the main factor determining the severity and prognosis of patients with SMA is the number of copies of the SMN2 gene (centromeric copy of SMNI).
  • the SMN2 gene also produces the full-length functional SMN protein, but in relatively small quantities compared to the SMN1 gene (up to 10%). The more copies of the SMN2 gene, the less pronounced the clinical symptoms of SMA are, as a rule, [3].
  • SMA SMA-associated neurodegenerative disease
  • SMA type I (Werdnig-Hoffmann disease) is one of the most severe and common forms of this neurodegenerative disorder, accounting for more than 60% of SMA patients. Characterized by early onset, before 6 months of age, and death from respiratory failure before 2 years of age. Children suffering from Werdnig-Hoffmann disease are unable to hold their head up, roll over, or sit without support. Proximal symmetrical muscle weakness, lack of motor development and muscle hypotonia are the main clinical signs of SMA type I. Difficulties with swallowing and sucking are observed, which also contributes to a decrease in airway protection and increases the risk of developing aspiration pneumonia.
  • a promising method for treating SMA is gene therapy aimed at delivering the functional SMN1 gene to the central nervous system [5].
  • FDA US Food and Drug Administration
  • ZOLGENSMA® is a suspension for intravenous administration containing a recombinant self-complementary adeno-associated viral vector AAV9, capable of crossing the blood-brain barrier and penetrating the cells of the central nervous system, containing a polynucleotide encoding the SMN protein.
  • STR1VE-US NCT03306277
  • a single infusion of the drug can restore SMN expression in motor neurons lacking the functional SMN1 gene.
  • Structure of the expression cassette of the drug ZOLGENSMA® left ITR, CMV enhancer, chicken actin gene promoter (SV promoter), intron of the late gene 16S subunit of the SV40 virus (SV40), SMN1, BGH polyadenylation signal, right ITR.
  • rAAVs Adeno-associated viral vectors
  • Adeno-associated virus belongs to the Dependoparvovirus genus of the Parvoviridae family of viruses. It is a small (20 nm), non-enveloped virus, incapable of independent replication. Many different AAV serotypes have been described in humans and primates. Known serotypes can infect cells of various types of tissues. Tissue specificity is determined by the serotype of the capsid proteins, so vectors based on adeno-associated virus are constructed by specifying the required serotype.
  • the genome of the adeno-associated virus contains (+ or -) single-stranded DNA (ssDNA) about 4.7 thousand nucleotides in length. At the ends of the genomic DNA molecule there are inverted terminal repeats (ITRs).
  • the genome contains two open reading frames (ORFs): Rep and Car, which contain several alternative reading frames encoding various protein products. Rep products are essential for AAV replication, with the Cap gene encoding 3 capsid proteins (VP1, VP2, and VP3) among other alternative products. Proteins VP1, VP2 and VP3 are in a ratio of 1:1:10, forming an icosahedral capsid [10].
  • rAAV recombinant AAV vector
  • an ITR-flanked expression cassette is packaged into the AAV capsid. Genes required for AAV replication are not included in the cassette.
  • the efficiency of rAAV-mediated gene transfer is hampered by the requirement to convert the single-stranded (ssDNA) genome to double-stranded DNA (dsDNA) before expression.
  • the step of converting ssDNA to dsDNA can be eliminated by using vectors containing a self-complementary genome (scAAV), the coding region of which has been designed to form an intramolecular double-stranded DNA template.
  • scAAV self-complementary genome
  • scAAV During scAAV infection, instead of cell-mediated second-strand DNA synthesis or strand pairing of two viral particles, the two complementary scAAV halves will bind to form a single double-stranded DNA unit ready for expression.
  • the disadvantage of this design is that instead of the full coding capacity of rAAV (4.7-6 kb), scAAV can only contain about half of this capacity ( ⁇ 2.4 kb) [I].
  • Another important disadvantage is increased immunogenicity compared to ssAAV: scAAV induce a more pronounced immune response by signaling through TLR9 [12].
  • scAAV vectors W02010071832, RU2743398, RU2603740, CN112725344
  • ssAAV vectors EA201992032, W02019011817, WO2020127813, WO2021246909
  • the purpose of the present invention is to optimize the vector for delivering the SMN1 gene used in the gene therapy drug ZOLGENSMA®, which is the closest analogue of the present invention, by replacing the AAV9 capsid with the AAV.PHP.B capsid.
  • Another object of the present invention was to optimize the above vector by replacing both the AAV capsid and the expression cassette, while simultaneously replacing the self-complementary genome (sc) with a single-stranded genome (ss).
  • the present invention is based on the discovery that the recombinant adeno-associated vector AAV.SMN based on the serotype AAV.PHP.B (hereinafter referred to as AAV.PHP.B.SMN) promotes more effective therapy for SMA compared to the AAV9.SMN vector.
  • the recombinant adeno-associated virus AAV.PHP.B (SEQ ID NO 1), differs from AAV9 (SEQ ID NO 2) by the insertion of the heptapeptide amino acid insert TLAVPFK between amino acids 588 and 589 of the VP1 capsid of AAV9, which ensures increased permeability of the blood-brain barrier and selective transduction of CNS cells into comparison with AAV9 [16].
  • Recombinant adeno-associated AAV vectors based on the AAV.PHP.B serotype capable of delivering the SMN1 gene to the CNS are unknown from the prior art.
  • the present invention relates to a recombinant adeno-associated viral (rAAV) vector based on the AAV.PHP.B serotype containing a polynucleotide encoding a survival motor neuron (SMN) protein.
  • rAAV adeno-associated viral
  • the SMN protein is encoded by the SMN1 gene (SEQ ID NO:3).
  • the SMN protein may be encoded by a codon-optimized SMN1 gene.
  • the SMN protein contains the amino acid sequence of SEQ ID NO:4.
  • the SMN protein contains an amino acid sequence that has at least 90% identity to the sequence of SEQ ID NO:4.
  • the invention relates to the vector AAV.PHP.B.SMN, the capsid of which includes the VP1 protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the invention provides a vector AAV.PHP.B.SMN, the capsid of which includes a VP1 protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with one or more point mutations.
  • the invention provides a vector AAV.PHP.B.SMN having a single-stranded genome encoding the SMN protein (ssAAV).
  • ssAAV single-stranded genome encoding the SMN protein
  • the invention relates to an AAV.PHP.B.SMN vector having a single-stranded genome (ssAAV) encoding an SMN protein, the genome being packaged in a capsid comprising the AAV.PHP.B VP1 protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence with one or more point mutations, and the expression cassette includes the following elements in the direction from the 5' end to the 3' end:
  • ssAAV single-stranded genome
  • the invention relates to an AAV.PHP.B.SMN vector having a single-stranded genome (ssAAV) encoding an SMN protein, wherein said genome is packaged in a capsid comprising the AAV.PHP.B VP1 protein having the amino acid sequence SEQ ID N0:1 or amino acid sequence with one or more point mutations, and the expression cassette has the sequence of SEQ ID N0:5 or 90% identical to SEQ ID N0:5.
  • ssAAV single-stranded genome
  • the invention provides a vector AAV.PHP.B.SMN having a self-complementary genome (scAAV) encoding SMN.
  • scAAV self-complementary genome
  • the invention relates to an AAV.PHP.B.SMN vector having a self-complementary genome (scAAV) encoding SMN, wherein said genome is packaged in a capsid comprising the AAV.PHP.B VP1 protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence with one or more point mutations, and the expression cassette includes the following elements in the direction from the 5' end to the 3' end:
  • scAAV self-complementary genome
  • the invention relates to an AAV.PHP.B.SMN vector having a self-complementary genome (scAAV) encoding an SMN protein, wherein said genome is packaged in a capsid comprising the AAV.PHP.B VP1 protein having the amino acid sequence of SEQ ID N0: 1 or an amino acid sequence with one or more point mutations, and the expression cassette has the sequence SEQ ID N0:6 or 90% identical to SEQ ID N0:6.
  • scAAV self-complementary genome
  • the invention provides a pharmaceutical composition for delivering the SMN1 gene (SEQ ID NO:3) to target cells, comprising the AAV.PHP.B.SMN vector described above in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • the invention relates to the use of an AAV.PHP.B.SMN vector or a pharmaceutical composition comprising an AAV.PHP.B.SMN vector for delivering the SMN1 gene (SEQ ID NO:3) to target cells.
  • a pharmaceutical composition comprising an AAV.PHP.B.SMN vector for delivering the SMN1 gene (SEQ ID NO:3) to target cells.
  • AAV.PHP.B capsid is a self-assembled AAV capsid consisting of three proteins: VP1, VP2, VP3.
  • the AAV.PHP.B capsid proteins are translated from two mRNAs formed as a result of alternative splicing of the cap gene, which has the nucleotide sequence SEQ ID NO:7, or a sequence corresponding to it at least 70%, at least 75%, according to at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 99%, which encodes the amino acid sequence VP1 SEQ ID NO: 1.
  • the “AAV.PHP.B capsid” includes an AAV having the amino acid sequence of proteins VP1 SEQ ID N0:1, VP2 SEQ ID N0:21, and VP3 SEQ ID N0:22 with one or more point mutations.
  • Variants of point mutations in the sequence of capsid proteins VP1-VP3 AAV.PHP.B is a replacement of at least one amino acid residue in the VP1-VP3 proteins with another amino acid residue.
  • multiple point mutations we mean two, three, four, five, six, seven, eight, nine or ten point substitutions.
  • Additional embodiments of the invention include substitutions (mutations) that are conservative in nature, i.e. substitutions with amino acids having similar physicochemical properties of side chains.
  • amino acids are usually divided into five groups: (1) neutral: glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline; (2) acidic: glutamate and aspartate; (3) basic: lysine, arginine, histidine; (4) polar: methionine, asparagine, glutamine, cysteine, threonine series; (5) aromatic: phenylalanine, tyrosine, tryptophan (Table 2).
  • a polypeptide of interest may include up to about 5-10 conservative or non-conservative amino acid substitutions, so long as the desired function of the molecule remains unaffected.
  • Recombinant AAV or "rAAV” is a DNase-resistant viral particle containing two elements, an AAV capsid and a vector genome containing at least non-AAV coding sequences packaged into an AAV capsid.
  • the capsid contains about 60 proteins, consisting of VP1 proteins, VP2 proteins and VP3 proteins, which self-assemble to form the capsid.
  • “recombinant AAU” or “gAAU” may be used interchangeably in the phrase “gAAU vector.”
  • gAAV is a “replication-defective virus” or “viral vector” because it lacks any functional AAV rep gene or functional AAV cap gene and is therefore unable to replicate.
  • the only AAU sequences are AAU inverted terminal repeat (ITR) sequences, typically located at the extreme 5' and 3' ends of the vector genome to ensure that the gene and regulatory sequences located between the ITRs are packaged within the AAU capsid.
  • ITR inverted terminal repeat
  • nuclease resistant indicates that the AAV capsid is assembled around an expression cassette that is designed to deliver the gene into the host cell, and protects these packaged genomic sequences from degradation (cleavage) during the nuclease incubation steps designed to remove nucleic acid contaminants that may be present during the manufacturing process.
  • non-viral genetic elements used in the production of rAAV will be referred to as plasmids.
  • plasmids are nucleic acids that may encode sequences required for rAAV assembly, such as AAV capsid proteins, germ proteins, or accessory proteins required for rAAV production that are not packaged into rAAV.
  • a production plasmid may carry a vector genome that is packaged into rAAV.
  • the term “vector genome” refers to the nucleic acid sequence packaged within the rAAV capsid that forms the viral particle. This nucleic acid sequence contains AAV inverted terminal repeat (TTR) sequences.
  • the vector genome contains at least the 5' to 3' ITR of the AAV, coding sequence(s), and the 3' ITR of the AAV. ITRs from AAV2, an AAV source other than the capsid, or other than full-length ITRs may be selected.
  • the ITRs are derived from the same AAV source as the AAV that provides ger (replication) function during AAV production or transcomplementation. Additionally, other ITRs may be used.
  • the vector genome contains regulatory sequences that direct the expression of gene products. Suitable vector genome components are described in more detail below.
  • the term "expression cassette” refers to a nucleic acid molecule encoding an SMN protein sequence and expression control sequences that direct expression of SMN sequences in a host cell (e.g., promoter, enhancer, poly A), wherein the cassette may be packaged within the capsid of a viral vector (e.g., viral particle).
  • a viral vector e.g., viral particle
  • Such an expression cassette for creating a viral vector contains the SMN sequences described in the present invention flanked by viral genome packaging signals and other expression control sequences described below.
  • the packaging signals are the 5' inverted terminal repeat (ITR) and the 3' ITR.
  • the term "transgene” can be used interchangeably with "expression cassette”.
  • the term “SMN” includes any isoform of SMN that restores a desired function, reduces a symptom, or provides another desired physiological result when delivered by the composition or method provided herein.
  • the examples provided herein use the longest isoform, isoform D, which is believed to be the predominant transcript produced by the gene in a patient not affected by SMN deficiency or defect.
  • Isoform D is a 294 amino acid protein [see, for example, NCBI accession number NM_000344.4; NP_000335; ENSEMBL ID ENST00000380707], the protein sequence is reproduced in SEQ ID NO:4, and the coding sequence is reproduced in SEQ ID NO: 3.
  • another isoform of the SMN protein may be selected.
  • rAAV.PHP.B.SMN viral vectors consisting of an outer AAV.PHP.B capsid and an internal DNA genome encoding the SMN protein.
  • the single-stranded DNA (ssDNA) genome is packaged inside the capsid.
  • dsDNA self-complementary DNA genome
  • the ssDNA and dsDNA genome consists of a human survival motor neuron (SMN) transgene flanked by two AAV inverted terminal repeats (ITRs).
  • the SMN transgene includes an enhancer, a promoter, an intron, the coding sequence of the SMN1 gene, and a polyadenylation signal (polyA signal).
  • ITRs are the genetic elements responsible for genome replication and packaging during vector production and are the only viral cis elements required for rAAV generation.
  • expression of the SMN coding sequence is driven by a promoter/enhancer derived from the immediate early (IE) region of human cytomegalovirus (hCMV). Transcription from this promoter is enhanced by the presence of an intron of the hBGl gene (hemoglobin gamma-1 subunit gene).
  • the polyA signal hGHl (polyadenylation signal of the human growth hormone gene) is turned on to mediate termination of human SMN mRNA transcripts.
  • expression of the SMN coding sequence is driven by a promoter/enhancer derived from the chicken beta-actin gene and the human cytomegalovirus (hCMV) immediate early (IE) region. Transcription from this promoter/enhancer is enhanced by the presence of an intron late gene of the 16S subunit of the SV40 virus.
  • the BGH polyA signal (bovine growth hormone polyadenylation signal) is turned on to mediate termination of human SMN mRNA transcripts.
  • SMN1 or “SMN1” is meant a gene that encodes an SMN protein that provides at least about 50%, at least about 75%, at least about 80%, at least about 90%, or about 100 %, or more than 100% of the level of biological activity of the native motor neuron survival protein.
  • the SMN2 gene a centromeric copy of SMN1
  • the SMN protein also encodes the SMN protein, but in smaller quantities compared to SMN1.
  • patients who lack a functional SMN1 gene exhibit SMA phenotypic variability to varying degrees. Thus, in some cases it may be desirable for the SMN protein to provide less than 100% of the biological activity of the native SMN protein.
  • the amino acid sequence of a functional SMN is the sequence of SEQ ID NO:4 or a sequence having at least 90% identity thereto.
  • sequence identity refers to residues in two sequences that are similar when aligned to a match. Sequence identity comparisons can be made across the entire length of the genome, preferably a total length of gene coding sequence or fragment of at least about 500 to 5000 nucleotides. However, identity between smaller fragments may also be necessary, e.g., of at least about nine nucleotides, typically of at least about 20 to 24 nucleotides, of at least about 28 to 32 nucleotides, of at least about 36 or more nucleotides.
  • the percentage identity for amino acid sequences is determined over the entire length of the protein, polypeptide, from about 32 amino acids to about 330 amino acids, or for a peptide fragment thereof, or the coding sequences of corresponding nucleic acid sequences.
  • the length of a suitable amino acid fragment can be at least 8 amino acids and can be up to about 700 amino acids.
  • identity is defined with respect to the "aligned” sequences.
  • Aligned sequences or “alignments” refer to a variety of nucleotide sequences or protein (amino acid) sequences, often containing corrections for missing or additional bases or amino acids compared to the reference sequence.
  • the identity of amino acid sequences can be determined by sequence alignment using various algorithms and/or computer programs known in the art or commercially available (for example, BLAST, ExPASy; ClustalO; FASTA; using, for example, the Needleman-Wunsch algorithm, the Smith-Wunsch algorithm Waterman).
  • Numerous sequence alignment programs are also available for nucleotide sequences. Examples of such programs include Clustal Omega, Clustal W, CAP Sequence Assembly, BLAST, MAP and MEME.
  • the AAV vector contains AAV ITR sequences.
  • the ITRs are from an AAV other than the one that provides the capsid.
  • ITR sequences from wild-type AAV or modified ITR sequences can be used.
  • An ITR from AAV2 may be selected as the wild-type ITR. If the ITR is from AAV2 and the AAV capsid is from another AAV source, the resulting vector can be called pseudotyped.
  • the AAV vector genome contains the AAV 5' ITR, SMN coding sequences, regulatory sequences, and the AAV 3' ITR. However, other configurations of these elements may be suitable.
  • Modified ITR sequences can be generated by introducing mutations into ITRs derived from wild-type AAV. Modified ITR sequences can promote the formation of dsDNA.
  • the expression cassette typically contains, as an expression control sequence, a premotor sequence located, for example, between the selected 5' 1TR sequence and the SMN coding sequence.
  • a premotor sequence located, for example, between the selected 5' 1TR sequence and the SMN coding sequence.
  • expression of the SMN coding sequence is driven by a promoter/enhancer derived from human cytomegalovirus (hCMV) immediate early (IE) region.
  • hCMV human cytomegalovirus
  • IE immediate early
  • promoter specifically refers to a DNA element that promotes transcription of a polynucleotide to which the promoter is operably linked.
  • a promoter may also form part of a promoter/enhancer element.
  • promoter generally refers to the location on a nucleic acid molecule to which RNA polymerase and/or associated factors bind and from which transcription is initiated.
  • Enhancers enhance promoter activity temporally as well as spatially. There are many promoters known in the art that are transcriptionally active in a wide range of cell types. Promoters can be divided into two classes: those that function constitutively and those that are regulated by induction or release of repression.
  • CMV cytomegalovirus
  • IE immediate early
  • hCMV human cytomegalovirus
  • the human cytomegalovirus (hCMV) immediate early (IE) region and functional expression-triggering fragments and/or functional expression-enhancing fragments derived therefrom are, for example, described in EP 0173177 and EP 0323997 and are also well known in the art.
  • the expression cassette and/or vector may contain one or more other suitable transcription initiation, termination sequences, efficient RNA processing signals, such as splicing and polyadenylation (poly A) signals; sequences that stabilize cytoplasmic mRNA, such as WPRE; sequences that increase translation efficiency (ie, the Kozak consensus sequence); sequences that increase protein stability; and, if desired, sequences that enhance secretion of the encoded product.
  • efficient RNA processing signals such as splicing and polyadenylation (poly A) signals
  • sequences that stabilize cytoplasmic mRNA, such as WPRE sequences that increase translation efficiency (ie, the Kozak consensus sequence); sequences that increase protein stability; and, if desired, sequences that enhance secretion of the encoded product.
  • control sequences varies depending on the host organism; in prokaryotes, such control sequences typically include a promoter, a ribosome binding site, and transcription termination sequences; in eukaryotes, such control sequences typically
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for delivering the SMN1 gene to target cells, which includes the above recombinant AAV.PHP.B virus in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • composition means a composition comprising the above recombinant AAV.PHP.B virus of the invention and at least one of the components selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable and pharmacologically compatible excipients, such as excipients, solvents, diluents, carriers, delivery vehicles, preservatives, stabilizers, emulsifiers, suspending agents, thickeners, prolonged delivery regulators, the choice and ratio of which depends on the route of administration and dosage.
  • the injectable carrier is usually liquid.
  • the carrier for other modes of administration may be solid or liquid.
  • water containing additives generally accepted for injection solutions such as buffering and isotonic agents, stabilizers and solubilizers.
  • Pharmaceutical compositions according to The present invention and methods for making them will be obvious to those skilled in the art.
  • the production of pharmaceutical compositions should preferably comply with GMP (Good Manufacturing Practices) requirements.
  • the present invention relates to the use of the above recombinant AAV.PHP.B virus or the above composition for delivering the SMN1 gene to target cells.
  • Any method of introducing an AAV-based recombinant virus accepted in the art can be suitably used for the above-mentioned AAV.PHP.B-based recombinant virus of the present invention.
  • the AAV.PHP.B recombinant virus of the invention is preferably introduced into the cell in a biologically effective amount.
  • a "biologically effective" amount of a recombinant virus is an amount that is sufficient to cause infection (or transduction) and expression of a heterologous nucleic acid sequence in a cell. If the virus is introduced into a cell in vivo (eg, the virus is administered to a subject as described below), a "biologically effective" amount of the viral vector is an amount that is sufficient to cause transduction and expression of a heterologous nucleic acid sequence in the target cell.
  • the above recombinant virus based on AAV.PHP.B is not used to modify the genetic integrity of human germline cells.
  • FIG. 1A - 1C show the results of determining the expression of SMN1 at the mRNA level after transfection with plasmids sc-AAV-SMNl and ss-AAV-SMNl.
  • Figure 1A shows the results of determining the amount of SMN1 RNA in the reaction mixture.
  • Figure 1B shows the results of determining the amount of hGAPDH RNA in the reaction mixture.
  • FIG. 1C shows normalization of SMN1 RNA levels to hGAPDH based on background expression in control cells without the addition of transfection agent and plasmids (CR).
  • FIG. 2A and 2B show the results of determination of the SMN protein after transfection with plasmids sc-AAV-SMNl and ss-AAV-SMNl.
  • FIG. Figure 2A shows the results of determining the SMN protein by Western blotting:
  • Figure 2B shows the results of determining the SMN protein in samples by ELISA.
  • Some elements of the genetic constructs including the SMN1 gene sequence, were obtained by chemical synthesis at Atum Dna2.0.
  • Standard methods are used to manipulate DNA [17].
  • E. soy cells are grown on a selective medium supplemented with an antibiotic. Plasmid DNA is isolated using commercial kits. The required DNA fragments are obtained using PNR or restriction endonucleases. Electrophoretic separation of DNA fragments is carried out in an agarose gel. DNA fragments of the required size are isolated from the gel using commercial kits. The DNA concentration is determined by spectrophotometry. After ligation of DNA fragments, the bacterial cells are electroporated. Transformed cells are selected on a selective medium with the addition of an antibiotic, and then plasmid DNA is isolated from them. Correctness of genetic constructs confirmed by restriction mapping, TTL? and Sanger sequencing. DNA sequence analysis was carried out using the SnapGene 3.2.1 program.
  • HEK293 cells are quickly thawed within 40-60 sec in a water bath at 37 °C. Unscrew the cap, take out the entire volume of the cell suspension and transfer it to a 15 ml Falcon tube in 8 ml of EMEM medium with glutamine supplemented with 10% FBS. Carefully pipet and then centrifuge for 5 minutes at a speed of 170 g at room temperature (hereinafter referred to as RT). The supernatant is collected, 2 ml of medium is left in the test tube, and the sediment is carefully pipetted. The concentration and viability of cells are assessed by direct counting in a Goryaev chamber.
  • Cells are seeded into T75 culture flasks (area 75 cm 2 ) with a ventilated lid at a concentration of 3-5x10 4 cells/ml in 15 ml EMEM with 10% FBS without antibiotics. Cells are cultured in a CO2 incubator at a temperature of 37 °C in a humidified atmosphere of 5% CO2 for 48-72 hours.
  • Cell passaging is carried out when the confluency in the vial reaches 80-90%.
  • the old culture medium is removed from the T75 flasks.
  • the cells are washed with 10 ml of DPBS, after which 3 ml of a 0.25% trypsin-0.53 mM EDTA solution is added to each vial.
  • Wet the surface of the bottle by shaking and incubate for 10 minutes in a CO2 incubator at a temperature of 37 °C.
  • the completeness of cell detachment is monitored under a microscope. Add 10 ml of complete growth medium to each bottle to inactivate trypsin, carefully wash the bottom of the bottle and transfer the cells into 50 ml Falcon bottles.
  • the cells are carefully resuspended and centrifuged for 5-10 minutes at a speed of 170-300 g at RT. The supernatant is taken, 5-10 ml of cell suspension is left in vials, pipetted, the concentration is measured and viability is assessed using a Goryaev chamber.
  • Cells are seeded into T75 flasks at a concentration of 3.0-5.0x10 4 cells/ml. The required number of cells is transferred into 15 ml of complete growth medium and cultured in a CO2 incubator for 48-72 hours at a temperature of 37 °C in an atmosphere of 5% CO2.
  • TurboFect Transfection Reagent (Sigma-Aldrich) (hereinafter referred to as TurboFect) is carried out according to the manufacturer's recommendations.
  • TurboFect Transfection Reagent
  • cells are scattered into the wells of a 6-well plate at a concentration of 1x10 5 cells/ml in 3 ml of complete EMEM growth medium. Incubate for 24-48 hours in a CO2 incubator at a temperature of 37 °C in an atmosphere of 5% CO2. Transfection is carried out at a monolayer density of 70-90%.
  • transfection mixture 150 ⁇ l of EMEM medium is added to 2 separate Eppendorf microtubes, 5 ⁇ l of TurboFect is added to one, 1.5 ⁇ g of plasmid DNA is added to the other, and mixed by vortex for 5 sec. Then the DNA-lipid complex is prepared by mixing a 1:1 mixture of DNA and diluted Turbofect reagent, vortex mixing for 5 sec and incubating for 20 min at RT. The transfection mixture is added to the appropriate wells of the culture plate and incubated for 48 hours in a CO2 incubator at a temperature of 37 °C in an atmosphere of 5% CO2. Cells not transfected with plasmid DNA serve as a negative control.
  • the growth medium is removed and discarded, and the cells are carefully washed with 2 ml of DPBS solution.
  • DPBS a 0.25% trypsin-EDTA solution
  • the cells are washed with 5 ml of DPBS, centrifuged for 5 min at 250 g at 4 °C, and the supernatant is removed.
  • the cells are resuspended in 2.1 ml of DPBS, 1 ml is transferred into 1.5 ml microtubes, centrifuged for 5 min at 250 g at 4 °C, and the supernatant is carefully removed. The cells are then used for RNA isolation/lysate preparation or frozen (-20°C).
  • the polymerase chain reaction was carried out using a Real-Time CFX96 Touch thermal cycler (BioRad).
  • a Real-Time CFX96 Touch thermal cycler BioRad
  • To perform rRTPCR based on the intercalating dye SYBR use a ready-made PCR mixture SsoAdvancedTM Universal SYBR® Green Supermix.
  • To construct calibration curves add 5 ⁇ l of SsoAdvanced universal SYBR Green supermix, 0.5 ⁇ l of forward and reverse primer (10 ⁇ M), 2 ⁇ l of deionized water, 2.5 ⁇ l of plasmid DNA standards into a reaction with a total volume of 10 ⁇ l.
  • the concentration of SMN1 cDNA is normalized to the concentration of the housekeeping gene hGAPDH:
  • SMN1 expression after transfection is calculated taking into account background expression in control cells without the addition of a transfection agent and plasmids (CR):
  • the efficiency of passing the PNR for each target is in the range of 90-110%; R2 value not lower than 0.99; the number of detected molecules exceeds 10,000/ ⁇ l of the reaction mixture.
  • beta-actin loading control
  • primary antibodies P-Actin (8H10D10) Mouse mAb at a dilution of 1/1000 and secondary antibodies Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) at a dilution of 1/20,000 are used.
  • the chemiluminescence signal is detected in a gel documentation system Fusion SL2.
  • the analysis is carried out using the SMN ELISA Kit (Abeam ⁇ ) according to the instructions for the kit. Before analysis, all reagents, strips, standard and test samples are first brought to room temperature. Before each analysis, sample preparation of a standard SMN sample and cell samples is carried out. A stock solution of the SMN standard sample with a concentration of 3,200 pg/ml is prepared by diluting 1 Standard tube in 1 ml of Assay Buffer 13. Solutions of standards 1,600, 800, 400, 200, 100 and 50 pg/ml are prepared by a series of two-fold dilutions in Assay Buffer 13. Assay Buffer 13 is used as a blank sample with an SMN concentration of 0 pg/ml.
  • Cell lysates are diluted in Assay Buffer 13 to an arbitrary concentration of 500 and 2000 cells/ml. Additionally, the homogeneity of protein isolation is assessed using the DC protein assay kit (Bio-Rad) according to the instructions for the kit. Absorbance is detected at a main wavelength of 450 nm and a reference wavelength of 580 nm on a plate spectrophotometer. A 4-parameter calibration curve is constructed using the values obtained for standard solutions. Based on the calibration curve, the instrument automatically calculates the SMN concentrations in the test samples. A comparison is made between the converted SMN concentrations in pg/ml and the absolute absorption values in optical density units.
  • Recombinant AAV virus particles are produced by transient transfection of HEK293 cells with three plasmids:
  • the cells After suspension cultivation of HEK293 packaging cells and transfection with the described plasmids, the cells are lysed, the supernatant is clarified and concentrated. After several stages of chromatographic purification, the target product is enriched by ultracentrifugation in an iodixanol density gradient (OptiPrep) or by ion exchange chromatography.
  • OptiPrep iodixanol density gradient
  • the titer of viral particles is determined using quantitative PNR methods.
  • a formulation solution containing water or buffer, sodium chloride, glycine, hyaluronic acid and/or other excipients is used.
  • the final solution of viral particles is stored frozen (-20 °C) or in lyophilized form.
  • DNA fragment 1 was purified using the CleanMag DNA kit (Evrogen).
  • the pAAV-GFP vector (Cell Biolabs) is incubated with the restriction endonucleases Clal and Xbal.
  • the 4.6 kb fragment was excised from the gel, purified using the Cleanup Standard kit (Evrogen) and ligated to DNA fragment 1 using T4 DNA ligase.
  • the ligated mixture is used to transform strain c2523 (NEB) by electroporation.
  • the correctness of plasmid DNA isolated from colonies grown in LB medium with ampicillin (100 ⁇ g/ml) was confirmed by sequencing.
  • the final genetic construct ss-AAV-SMNl is characterized by the following elements necessary for production of the plasmid in E. coli and assembly of AAV in HEK293:
  • CMV enhancer SEQ ID NO: 10;
  • hGHl polyadenylation signal SEQ ID NO: 13;
  • the pF1254 construct is obtained by replacing the resistance gene in the pscAAV-GFP_addgene-323964 plasmid from ampicillin to kanamycin.
  • the pF1256 construct is obtained based on the plasmids of the pF1254 plasmid, into which a DNA fragment synthesized by ATUM is inserted at the Sad and Avril restriction sites, which contains the promoter of the chicken beta-actin gene, the intron of the late gene of the 16S subunit of the SV40 virus for constitutive expression; BGH polyadenylation signal.
  • the pF1262 construct is obtained based on the addgene-plasmid-92399-sequence-178249 and pF1256 plasmids.
  • the NCR product of 859 bp in size obtained as a result of amplification of the plasmid addgene-plasmid-92399-sequence-178249 with primers Pr2344 (5' - cccaactgatcttcagcatc - 3') and Pr2337 (5' - cgcgcttcgcttttttatagg - 3'), is excised from gel, cleaned using the Cleanup Standard kit (Evrogen).
  • DNA fragment 1 was purified using the CleanMag DNA kit (Evrogen).
  • Vector pF1256 is incubated with restriction endonucleases Spel and BsrDI.
  • the 2.9 kb fragment was excised from the gel, purified using the Cleanup Standard kit (Evrogen) and ligated to DNA fragment 1 using T4 DNA ligase.
  • the ligated mixture is used to transform an E. coli strain by electroporation. Plasmid correctness DNA isolated from colonies grown in LB medium with kanamycin (50 ⁇ g/ml) was determined by sequencing.
  • the vector obtained in the previous step and ATUM_126497_pF1257 are incubated with restriction endonucleases EcoRI-HF and Xbal.
  • the corresponding 3.3 kb and 1 kb fragments were excised from the gel, purified using the Cleanup Standard kit (Evrogen) and ligated using T4 DNA ligase.
  • the ligated mixture is used to transform the E. soy strain by electroporation.
  • the correctness of plasmid DNA isolated from colonies grown in LB medium with kanamycin (50 ⁇ g/ml) was determined by sequencing.
  • the final genetic construct sc-AAV-SMNl is characterized by the following elements necessary for production of the plasmid in E. soy and assembly of AAV in HEK293:
  • BGH polyadenylation signal SEQ ID N0:19;
  • FIG. Figure 1B shows the results of real-time RT-PCR analysis of SMN1 expression in samples.
  • expression of SMN1 is observed after transfection, while for negative control samples without the addition of plasmids, the signal remains at the background level.
  • expression of the housekeeping gene hGAPDH is observed at a comparable level, which confirms the quality of sample preparation and the uniformity of sample loading for the PPR reaction.
  • expression of the SMN1 gene is observed.
  • the level of SMN1 mRNA is 4 times higher than the expression level for the ss-AAV-SMNl expression construct compared to sc-AAV-SMNl.
  • FIG. 2A shows the results of determining the SMN protein in cell lysates after transfection by Western blotting. After incubation with antibodies that recognize the SMN protein, a specific band of a size corresponding to the molecular weight of the target protein (31 kDa SMN) is observed; there is no signal in control samples without transfection. Incubation with antibodies that recognize the housekeeping gene actin confirms the uniformity of sample loading. The data obtained confirm the presence of the SMN protein in the studied cell lysates.
  • the SMN protein content of transfected cells was quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (Fig. 2B).
  • the expression of the SMN1 gene at the mRNA level corresponds to the levels of SMN protein translation (Fig. 2).
  • Example 5 Obtaining a genetic construct for the expression of Rep (AAV2) and Cap (AAV-PhP.B) proteins
  • plasmid for expression of Rep replication genes of serotype AAV2 Car genes of serotype AAV_PhP.B or AAV9, corresponding to SEQ ID N0:7 and SEQ ID N0:8;
  • ion exchange chromatography was carried out using a CIMmultus® QA 1 mL Monolithic Column (2 cw) or similar, designed for the separation of large biomolecules.
  • the buffer was replaced using TFF.
  • PBS, pH 7.4, supplemented with 0.005% Pluronic F68 was used as a formulation buffer to reduce aggregation of viral particles.
  • FVB/N SMNA7 mouse strains This line lacks the endogenous mouse SMN1 gene but has two copies of intact human SMN2 (hSMN2) and two more copies of hSMN2 with exon 7 deleted, which together provide sufficient SMN expression to prevent embryonic lethality.
  • the FVB/N SMNA7 mouse model reproduces features of spinal muscular atrophy (SMA) such as low SMN expression, motor neuron loss, weakness, and premature death.
  • SMA spinal muscular atrophy
  • Animal supplier - JAX® strain #005025. According to laboratory research survival of homozygotes is 15-22 days. Animal survival for 40 days or more corresponds to complete replacement of the SMN1 gene function in FVB/N SMNA7 mice.
  • test samples were injected into newborn mice intravenously into the temporal vein.
  • three doses were studied: 1.20E+13, 7.50E+13 vg/kg and 1D0E+14 vg/kg; phosphate-buffered saline with the addition of 0.005% Pluronic F68 was administered as a control.
  • Constructs based on serotype sc-AAV-9, ss-AAV-PHP.B and sc-AAV-PHP.B were tested as test samples. All designs were obtained using the method described above. After administration of test or control samples, animals were observed for 40 days.
  • ss-AAV-PHP.B-based constructs may provide a better safety profile when used at similar doses with sc-AAV-9 due to potentially reduced immunogenicity.
  • AAV-PHP.B serotype may allow dose reduction compared to already approved gene therapy drugs and/or reduce the incidence of adverse drug reactions.
  • a possible dose reduction and/or improvement in the safety profile will allow the use of this drug in patients older than two years.
  • AAV-2 adeno-associated virus

Abstract

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Описан рекомбинантный аденоассоциированный вектор rAAV на основе серотипа AAV.PHP.B, содержащий полинуклеотид, кодирующий белок выживаемости двигательных нейронов SMN, предназначенный для модулирования двигательной функции у субъекта с нарушением двигательных нейронов, в частности для лечения спинальной мышечной атрофии.

Description

АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫЙ ВИРУСНЫЙ ВЕКТОР НА ОСНОВЕ СЕРОТИПА AAV.PHP.B И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Описан рекомбинантный аденоассоциированный вектор rAAV на основе серотипа AAV.PHP.B, содержащий полинуклеотид, кодирующий белок выживаемости двигательных нейронов SMN (далее - AAV.PHP.B.SMN), предназначенный для модулирования двигательной функции у субъекта с нарушением двигательных нейронов, в частности для лечения спинальной мышечной атрофии.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Спинальная мышечная атрофия - аутосомно-рецессивное наследственное нервно- мышечное заболевание, чаще проявляющееся у младенцев и детей, причиной которого является постепенное и необратимое нарушение функций двигательных нейронов в передних рогах спинного мозга, приводящее к симметричному ослабеванию и затем к атрофии мышц. Пациент со СМА постепенно теряет способность ползать, ходить, управлять собственным телом, самостоятельно сидеть, есть, глотать и дышать [1].
Генетической причиной СМА являются мутации или делеции гена SMN1, расположенного на длинном плече 5-й хромосомы (5ql l.2-ql3.3). Ген SMN1 кодирует белок выживания моторного нейрона SMN (survival of motor neuron), необходимый для работы двигательных нейронов. Примерно у 96 % пациентов СМА вызвана гомозиготными делециями экзонов 7 и 8 гена SMN1 или, в большинстве случаев, экзона 7 [2].
Основным фактором, определяющим степень тяжести и прогноз пациентов со СМА, считается количество копий гена SMN2 (центромерная копия SMNI). Ген SMN2 тоже продуцирует полноразмерный функциональный белок SMN, но в относительно малых количествах по сравнению с геном SMN1 (до 10%). Чем больше копий гена SMN2, тем, как правило, менее выражены клинические симптомы СМА [3].
Таким образом, утрата гена SMN1 и, как следствие, сниженный уровень белка SMN частично компенсируются SMN-белком гена SMN2. Данный феномен объясняет фенотипическую вариабельность внутри СМА. В соответствии с пониманием компенсаторной роли гена SMN2 в современную клиническую классификацию СМА входит и число копий SMN2 (Таблица 1) [3].
Таблица 1. Классификация СМА (Prior T.W., 2020) [4]
Figure imgf000003_0001
Наиболее неблагоприятные формы СМА с летальным исходом проявляются у младенцев и детей. Взрослые формы СМА (IV типа, возраст дебюта от 5 лет), отличаются более благоприятным клиническим течением. Двигательные нарушения у взрослых носят мягкий характер, больные не испытывают трудностей с дыханием и питанием, сохраняют способность ходить в зрелом возрасте.
СМА I типа (болезнь Верднига - Гоффманна) является одной из наиболее тяжелых и распространенных форм этого нейродегенеративного расстройства, на нее приходится более 60 % больных СМА. Характеризуется ранним началом, в возрасте до 6 месяцев, и смертью от дыхательной недостаточности до достижения 2-летнего возраста. Дети, страдающие болезнью Верднига - Гоффманна, не способны держать голову, переворачиваться, сидеть без поддержки. Проксимальная симметричная мышечная слабость, отсутствие моторного развития и мышечная гипотония - основные клинические признаки СМА типа I. Наблюдаются трудности с глотанием и сосанием, что также способствует снижению защиты дыхательных путей и увеличивает риск развития аспирационной пневмонии.
Перспективным способом лечения СМА является генная терапия, нацеленная на доставку функционального гена SMN1 в ЦНС [5]. В 2019 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило первый лекарственный препарат для генной терапии СМА I степени у детей младше 2 лет ZOLGENSMA® (онасемноген абепарвовек) (группа компаний Новартис) [6]. ZOLGENSMA® является суспензией для внутривенного введения, содержащей рекомбинантный самокомплементарный аденоассоциированный вирусный вектор AAV9, способный преодолевать гематоэнцефалический барьер и проникать в клетки ЦНС, содержащий полинуклеотид, кодирующий белок SMN. Клинически доказано (STR1VE-US (NCT03306277)), что однократная инфузия препарата способна восстановить SMN-экспрессию в моторных нейронах, лишённых функционального гена SMN1. Структура экспрессионной кассеты лекарственного препарата ZOLGENSMA®: левый ITR, CMV-энхансер, промотор гена актина курицы (СВ- промотор), интрон позднего гена 16S субъединицы вируса SV40 (SV40), SMN1, сигнал полиаденилирования BGH, правый ITR.
Аденоассоциированные вирусные векторы (rAAV) считаются самыми безопасными и одними из наиболее широко используемых вирусных векторов для переноса генов in vivo. Они способны инфицировать клетки различных тканей, обеспечивая мощную и устойчивую экспрессию трансгена, являются непатогенными и и имеют низкий профиль иммуногенности [7-9].
Аденоассоциированный вирус (AAV) принадлежит к роду Dependoparvovirus семейства вирусов Parvoviridae. Представляет собой небольшой (20 нм), неспособный к самостоятельной репликации, безоболочечный вирус. У человека и приматов описано множество различных серотипов AAV. Известные серотипы могут инфицировать клетки различных видов тканей. Тканевая специфичность определяется серотипом белков капсида, поэтому векторы на основе аденоассоциированого вируса конструируют, задавая необходимый серотип.
Геном аденоассоциированного вируса содержит (+ или -) одноцепочечную ДНК (ssDNA) длиной около 4,7 тысяч нуклеотидов. На концах молекулы геномной ДНК располагаются инвертированные концевые повторы (англ, inverted terminal repeats, ITRs). Геном содержит две открытые рамки считывания (англ. ORF): Rep и Сар, содержащие в себе несколько альтернативных рамок считывания, кодирующих различные белковые продукты. Продукты Rep имеют важное значение для репликации AAV, при этом ген Сар, помимо других альтернативных продуктов, кодирует 3 капсидных белка (VP1, VP2 и VP3). Белки VP1, VP2 и VP3 находятся в соотношении 1:1:10, образуя икосаэдрический капсид [10]. При образовании рекомбинантного вектора AAV (rAAV) кассета экспрессии, фланкированная ITR, упаковывается в капсид AAV. Гены, необходимые для репликации AAV, не входят в кассету. Эффективности опосредованного rAAV переноса генов препятствует необходимость конвертации одноцепочечного (оцДНК) генома в двухцепочечную ДНК (дцДНК) перед экспрессией. Стадию конвертации оцДНК в дцДНК можно исключить посредством использования векторов, содержищих самокомплементарный геном (scAAV), кодирующая область которых была разработана для формирования внутримолекулярной двухцепочечной матрицы ДНК. При scAAV-инфицировании вместо клеточно-опосредованного синтеза второй цепи ДНК или спаривания цепей двух вирусных частиц, две комплементарные половины scAAV будут связываться с образованием одной двухцепочечной единицы ДНК, готовой к экспрессии. Недостаток этой конструкции заключается в том, что вместо полной кодирующей емкости rAAV (4,7-6 кб) scAAV может содержать только около половины этой емкости (~2,4 кб) [И]. Еще одним важным недостатком является повышенная по сравнению с ssAAV иммуногенность: scAAV индуцируют более выраженный иммунный ответ путем передачи сигналов через TLR9 [12].
Из уровня техники известны как scAAV векторы (W02010071832, RU2743398, RU2603740, CN112725344), так и ssAAV векторы (ЕА201992032, W02019011817, WO2020127813, WO2021246909) для доставки гена SMN1 в ЦНС субъекта, страдающего спинальной мышечной атрофией.
Анализ уровня техники показал, что одной из насущных проблем в лечении спинальной мышечной атрофии генно-терапевтическими препарами являются иммуннотоксические реакции. Наиболее частым проявлением таких реакций считается гепатотоксичность, которая характеризуется значительным повышением активности печеночных трансаминаз. Гепатотоксичность наблюдается почти у трети пациентов, получивших геннотерапевтический препарат для лечения СМА, у некоторых из них введение вирусного вектора приводит к тяжелому повреждению печени с развитием острой печеночной недостаточности [13]. Нежелательные иммунотоксические реакции связаны с высокой дозой вводимых вирусных векторов. Иммунотоксические реакции развиваются несмотря на профилактическое введение глюкокортикостероидов. В исследованиях, оценивающих эффективность и безопасность разных доз геннотерапевтических препаратов, наблюдается коррелляция между дозой и иммунным ответом на препарат [14,15]. Учитывая дозозависимый харакатер иммунотоксических реакций, снижение дозы геннотерапевтического препарата для лечения СМА позволит снизить частоту нежелательных реакций у пациентов. Одним из способов снижения дозы является оптимизация векторов для увеличения трансдукции в целевой популяции клеток.
Цель настоящего изобретения - оптимизация вектора для доставки гена SMN1, используемого в геннотерапевтическом препарате ZOLGENSMA®, который является наиболее близким аналогом настоящего изобретения, путем замены капсида AAV9 на капсид AAV.PHP.B. Еще одной целью настоящего изобретения явилась оптимизация вышеупомянутого вектора путем замены как капсида AAV, так и кассеты экспрессии с одновременной заменой самокомплементарного генома (sc) на одноцепочесный геном (ss).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение основано на открытии того, что рекомбинантный аденоассоциированный вектор AAV.SMN на основе серотипа AAV.PHP.B (далее - AAV.PHP.B.SMN) способствует более эффективной терапии СМА по сравнению с вектором AAV9.SMN. Рекомбинантный аденоассоциированный вирус AAV.PHP.B (SEQ ID NO 1), отличается от AAV9 (SEQ ID NO 2) инсерцией гептапептидной аминокислотной вставки TLAVPFK между аминокислотами 588 и 589 VP1 капсида AAV9, что обеспечивает повышение проницаемости гематоэнцефалического барьера и селективную трансдукцию клеток ЦНС в сравнении с AAV9 [16]. Из уровня техники неизвестны рекомбинантные аденоассоциированные векторы AAV на основе серотипа AAV.PHP.B, способные доставлять ген SMN1 в ЦНС.
Проведенное нами исследование эффективности векторов AAV.PHP.B.SMN (пример 7) в сравнении с AAV.9.SMN в лечении СМА у мышей, лишенных гена SMN1, показало, что использование векторов AAV.PHP.B способствует большей выживаемости животных.
Настоящее изобретение относится к рекомбинантному аденоассоциированному вирусному (rAAV) вектору на основе серотипа AAV.PHP.B, содержащему полинуклеотид, кодирующий белок выживаемости двигательных нейронов (SMN).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения белок SMN кодирован геном SMN1 (SEQ ID N0:3). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения белок SMN может быть кодирован кодон- оптимизированным геном SMN1. В предпочтительном варианте осуществления изобретения белок SMN содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:4.
В дополнительном варианте осуществления изобретения белок SMN содержит аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 90% идентичностью с последовательностью SEQ ID N0:4.
В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к вектору AAV.PHP.B.SMN, капсид которого включает белок VP1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 1.
В дополнительных вариантах осуществления изобретение относится к вектору AAV.PHP.B.SMN, капсид которого включает белок VP1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 1 с одной или несколькими точечными мутациями.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к вектору AAV.PHP.B.SMN, имеющему одноцепочечный геном, кодирующий белок SMN (ssAAV).
В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к вектору AAV.PHP.B.SMN, имеющему одноцепочечный геном (ssAAV), кодирующий белок SMN, причем указанный геном упакован в капсид, включающий белок VP1 AAV.PHP.B, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID N0:1 или аминокислотную последовательность с одной или несколькими точечными мутациями, а экспрессионная кассета включает следующие элементы в направлении от 5'-конца к З'-концу:
ITR;
CMV энхансер;
CMV промотер;
SMN1 сигнал полиаденилирования hGHl;
ITR.
В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к вектору AAV.PHP.B.SMN, имеющему одноцепочечный геном (ssAAV), кодирующий белок SMN, при чем указанный геном упакован в капсид, включающий белок VP1 AAV.PHP.B, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID N0:1 или аминокислотную последовательность с одной или несколькими точечными мутациями, а экспрессионная кассета имеет последовательность SEQ ID N0:5 или на 90 % идентичную SEQ ID N0:5.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к вектору AAV.PHP.B.SMN, имеющему самокомплементарный геном (scAAV), кодирующий SMN.
В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к вектору AAV.PHP.B.SMN, имеющему самокомплементарный геном (scAAV), кодирующий SMN, при чем указанный геном упакован в капсид, включающий белок VP1 AAV.PHP.B, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID N0:1 или аминокислотную последовательность с одной или несколькими точечными мутациями, а экспрессионная кассета включает следующие элементы в направлении от 5'-конца к З'-концу:
ITR
CMV энхансер;
СВ промотор
SV40 интрон
SMN1 сигнал полиаденилирования BGH;
ITR
В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к вектору AAV.PHP.B.SMN, имеющему самокомплементарный геном (scAAV), кодирующий белок SMN, при чем указанный геном упакован в капсид, включающий белок VP1 AAV.PHP.B, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 1 или аминокислотную последовательность с одной или несколькими точечными мутациями, а экспрессионная кассета имеет последовательность SEQ ID N0:6 или на 90 % идентичную SEQ ID N0:6.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, предназначенной для доставки гена SMN1 (SEQ ID N0:3) в целевые клетки, содержащей вектор AAV.PHP.B.SMN, описанный выше, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.
В дополнительном варианте осуществления изобретение относится к применению вектора AAV.PHP.B.SMN или фармацевтической композиции, содержащей вектор AAV.PHP.B.SMN, для доставки гена SMN1 (SEQ ID N0:3) в целевые клетки. ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Используемый в настоящем документе термин капсид AAV.PHP.B представляет собой самоорганизующийся капсид AAV, состоящий из трех белков: VP1, VP2, VP3. Белки капсида AAV.PHP.B транслируются из двух мРНК, формирующихся в результате альтернативного сплайсинга гена cap, который имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID N0:7, или последовательность, соответствующей ей по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99%, которая кодирует аминокислотную последовательность VP1 SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах осуществления изобретения «капсид AAV.PHP.B» включает в себя AAV, имеющий аминокислотную последовательность белков VP1 SEQ ID N0:1, VP2 SEQ ID N0:21 и VP3 SEQ ID N0:22 с одной или несколькими точечными мутациями. Варианты точечных мутаций в последовательности белков капсида VP1-VP3 AAV.PHP.B представляет собой замену, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка в белках VP1-VP3 на другой аминокислотный остаток.
Под «несколькими точечными мутациями» подразумеваются две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять точечных замен.
Дополнительные варианты осуществления изобретения включают замены (мутации), которые являются консервативными по природе, т.е. замены на аминокислоты, обладающие схожими физико-химическими свойствами боковых цепей. В частности, аминокислоты обычно делят на пять групп: (1) нейтральные: глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин; (2) кислые: глутамат и аспартат; (3) основные: лизин, аргинин, гистидин; (4) полярные: метионин, аспарагин, глутамин, цистеин, серии треонин; (5) ароматические: фенилаланин, тирозин, триптофан (таблица 2).
Таблица 2. Группы аминокислот в зависимости от их физико-химических свойств
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
Например, достаточно обосновано предсказание о том, что выделенная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или схожая консервативная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту не окажет существенного влияния на биологическую активность. Например, полипептид, представляющий интерес, может включать вплоть до приблизительно 5-10 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, при условии, что желаемая функция молекулы остается незатронутой.
«Рекомбинантный ААУ» или «гААУ» представляет собой устойчивую к ДНКазе вирусную частицу, содержащую два элемента, капсид AAV и векторный геном, содержащий по меньшей мере не кодирующие AAV последовательности, упакованные в капсид AAV. В некоторых вариантах осуществления изобретения капсид содержит около 60 белков, состоящих из белков VP1, белков VP2 и белков VP3, которые самоорганизуются с образованием капсида. Если не указано иное, «рекомбинантный ААУ» или «гААУ» могут использоваться взаимозаменяемо в словосочетании «вектор гААУ». гААУ представляет собой «вирус, дефектный по репликации» или «вирусный вектор», так как в нем отсутствует какой-либо функциональный ген rep AAV или функциональный ген cap AAV, вследствие чего он не способен к репликации. В некоторых вариантах осуществления изобретения единственными последовательностями ААУ являются последовательности инвертированных концевых повторов (ITR) ААУ, обычно расположенные на крайних 5' и 3’ концах векторного генома, чтобы обеспечить упаковку гена и регуляторных последовательностей, расположенных между ITR, внутрь капсида ААУ.
Термин «устойчивый к нуклеазе» указывает на то, что капсид AAV собран вокруг экспрессионной кассеты, которая предназначена для доставки гена в клетку- хозяина, и защищает эти упакованные геномные последовательности от деградации (расщепления) во время этапов инкубации нуклеазы, предназначенных для удаления загрязняющих нуклеиновых кислот, которые могут присутствовать в процессе производства.
В определенных вариантах осуществления изобретения невирусные генетические элементы, используемые при продуцировании rAAV, будут упоминаться как плазмиды. Такие плазмиды представляют собой нуклеиновые кислоты, которые могут кодировать последовательности, необходимые для сборки rAAV, например белки капсида AAV, гер-белки, или вспомогательные белки необходимые для продуцирования rAAV, которые не упакованы в rAAV. Альтернативно, такая плазмида продукции может нести векторный геном, который упакован в rAAV.
Используемый в данном документе, термин «векторный геном» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, упакованной внутрь капсида rAAV, который образует вирусную частицу. Такая последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательности инвертированных концевых повторов (TTR) AAV. В приведенных в данном документе примерах векторный геном содержит, как минимум, от 5' до 3’, 5' ITR AAV, кодирующую последовательность (-и) и 3’ ITR AAV. Могут быть выбраны ITR из AAV2, источника AAV, отличного от капсида, или отличные от полноразмерных ITR. В некоторых вариантах осуществления изобретения ITR получены из того же источника AAV, что и AAV, который обеспечивает функцию гер (репликации) во время продуцирования или транскомплементации AAV. Кроме того, могут использоваться другие ITR. Кроме того, векторный геном содержит регуляторные последовательности, которые направляют экспрессию генных продуктов. Подходящие компоненты векторного генома более подробно описаны ниже.
В некоторых вариантах осуществления изобретения термин «экспрессионная кассета» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность белка SMN и последовательности контроля экспрессии, которые направляют экспрессию последовательностей SMN в клетке-хозяине (например, промотор, энхансер, поли А), при этом кассета может быть упакована в капсид вирусного вектора (например, вирусную частицу). Такая экспрессионная кассета, предназначенная для создания вирусного вектора, содержит последовательности SMN, описанные в настоящем изобретении, фланкированные сигналами упаковки вирусного генома и другими последовательностями контроля экспрессии, описанными ниже. Например, для вирусного вектора AAV сигналами упаковки являются 5'- инвертированный концевой повтор (ITR) и З'-ITR. В некоторых вариантах осуществления изобретения термин «трансген» можно использовать взаимозаменяемо с «экспрессионной кассетой».
Используемый в настоящем документе термин «SMN» включает в себя любую изоформу SMN, которая восстанавливает желаемую функцию, уменьшает симптом или обеспечивает другой желаемый физиологический результат при доставке композиции или в способе, представленных в настоящем документе. В приведенных в данном документе примерах используется самая длинная изоформа, изоформа D, которая, как полагают, является преобладающим транскриптом, продуцируемым геном, у пациента, не затронутого дефицитом или дефектом SMN. Изоформа D представляет белок из 294 аминокислот [см., например, регистрационный номер NCBI NM_000344.4; NP_000335; ENSEMBL ID ENST00000380707], последовательность белка воспроизведена в SEQ ID N0:4, и кодирующая последовательность воспроизведена в SEQ ID NO: 3. Однако может быть выбрана другая изоформа белка SMN.
В настоящем документе также представлены вирусные векторы rAAV.PHP.B.SMN, состоящие из внешнего капсида AAV.PHP.B и внутреннего генома ДНК, кодирующего белок SMN. В одном из вариантов внутри капсида упакован геном одноцепочечной ДНК (оцДНК). В другом из вариантов внутри капсида упакован самокомплементарный геном ДНК (дцДНК). Геном оцДНК и дцДНК состоит из трансгена выживания моторного нейрона (SMN) человека, фланкированного двумя инвертированными концевыми повторами (ITR) AAV. Трансген SMN включает энхансер, промотор, интрон, кодирующую последовательность гена SMN1 и сигнал полиаденилирования (полиА сигнал). ITR являются генетическими элементами, ответственными за репликацию и упаковку генома во время продуцирования вектора, и являются единственными вирусными цис-элементами, необходимыми для генерации rAAV. В геноме оцДНК экспрессия кодирующей последовательности SMN управляется промотором/энхансером, полученным из немедленной ранней (IE) области цитомегаловируса (hCMV) человека. Транскрипция с этого промотора усиливается присутствием интрона гена hBGl (ген субъединицы гемоглобина гамма- 1). ПолиА сигнал hGHl (сигнал полиаденилирования гена гормона роста человека) включается для обеспечения терминации транскриптов мРНК SMN человека. В самокомплементарном геноме экспрессия кодирующей последовательности SMN управляется промотором/энхансером, полученным из гена бета-актина курицы и немедленной ранней (IE) области цитомегаловируса (hCMV) человека. Транскрипция с этого промотора/энхансера усиливается присутствием интрона позднего гена 16S субъединицы вируса SV40. ПолиА сигнал BGH (сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста) включается для обеспечения терминации транскриптов мРНК SMN человека.
Под «функциональным SMN1» или «SMN1» подразумевается ген, который кодирует белок SMN, который обеспечивает по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, или около 100 %, или более чем 100% от уровня биологической активности нативного белка выживания моторных нейронов. Кроме этого, ген SMN2, центромерная копия SMN1, также кодирует белок SMN, но в меньших количествах по сравнению с SMN1. На основании количества копий SMN2 пациенты, у которых отсутствует функциональный ген SMN1, проявляют фенотипическую вариабельность СМА в различной степени. Таким образом, в некоторых случаях может быть желательным, чтобы белок SMN обеспечивал менее чем 100% биологической активности нативного белка SMN.
В одном варианте осуществления изобретения аминокислотная последовательность функционального SMN представляет собой последовательность SEQ ID N0:4 или последовательность, имеющую по меньшей мере 90 % идентичности с ней.
Термин «процент (%) идентичности», «идентичность последовательности», «процент идентичности последовательности» или «на ... процентов идентичная» в контексте последовательностей нуклеиновых кислот относится к остаткам в двух последовательностях, которые являются аналогичными при выравнивании на совпадение. Сравнение идентичности последовательностей может выполняться по всей длине генома, желательна полная длина последовательности, кодирующей ген, или фрагмента по меньшей мере около от 500 до 5000 нуклеотидов. Однако также может быть необходима идентичность между более мелкими фрагментами, например, из по меньшей мере около девяти нуклеотидов, как правило, из по меньшей мере около от 20 до 24 нуклеотидов, из по меньшей мере около от 28 до 32 нуклеотидов, из по меньшей мере около 36 или более нуклеотидов.
Процент идентичности для аминокислотных последовательностей определяется по всей длине белка, полипептида, от около 32 аминокислот до около 330 аминокислот, или для их пептидного фрагмента, или кодирующих последовательностей соответствующих последовательностей нуклеиновых кислот. Длина подходящего аминокислотного фрагмента может составлять по меньшей мере 8 аминокислот и может быть до около 700 аминокислот. Как правило, когда речь идет об «идентичности», «гомологии» или «сходстве» между двумя различными последовательностями, «идентичность», «гомология» или «сходство» определяются по отношению к «выровненным» последовательностям. «Выровненные» последовательности или «выравнивания» относятся к множеству нуклеотидных последовательностей или белковых (аминокислотных) последовательностей, часто содержащих коррекции для отсутствующих или дополнительных оснований или аминокислот по сравнению с эталонной последовательностью. Идентичность аминокислотных последовательностей может быть определена путем выравнивания последовательностей с использованием различных алгоритмов и/или компьютерных программ, известных в данной области техники или коммерчески доступных (например, BLAST, ExPASy; ClustalO; FASTA; используя, например, алгоритм Нидлмана-Вунша, алгоритм Смита-Уотермана). Многочисленные программы выравнивания последовательностей также доступны и для нуклеотидных последовательностей. К примерам таких программ относится Clustal Omega, Clustal W, CAP Sequence Assembly, BLAST, MAP и MEME.
Вектор AAV содержит последовательности ITR AAV. В одном варианте осуществления изобретения ITR взяты из AAV, отличного от того, который предоставляет капсид. В предпочтительном варианте осуществления изобретения (в целях ускорения регистрации лекарственного препарата) могут быть использованы последовательности ITR из AAV дикого типа или модифицированные последовательности ITR. В качестве ITR дикого типа может быть выбран ITR из AAV2. Если ITR из AAV2, а капсид AAV - из другого источника AAV, результирующий вектор может быть назван псевдотипированным. Как правило, векторный геном AAV содержит 5' ITR AAV, кодирующие последовательности SMN, регуляторные последовательности и 3' ITR AAV. Однако и другие конфигурации этих элементов могут быть подходящими. Модифицированнные последовательности ITR могут быть получены путем внесения мутаций в ITR, полученные из AAV дикого типа. Модифицированные последовательности ITR могут способствовать формированию дцДНК.
Экспрессионная кассета, как правило, в качестве последовательности контроля экспрессии содержит премоторную последовательность, расположенную, например, между выбранной 5' 1TR последовательностью и кодирующей последовательностью SMN. В описанном в настоящем документе геноме оцДНК экспрессия кодирующей последовательности SMN управляется промотором/энхансером, полученным из немедленной ранней (IE) области цитомегаловируса (hCMV) человека. В описанном в настоящем документе самокомплементарном геноме экспрессия кодирующей последовательности SMN управляется промотором/энхансером, полученным из гена бета-актина курицы и немедленной ранней (IE) области цитомегаловируса (hCMV) человека.
Термин «промотор», используемый в настоящем документе, в частности, относится к элементу ДНК, который способствует транскрипции полинуклеотида, с которым функционально связан промотор. Промотор может также составлять часть элемента «промотор/энхансер». Хотя физические границы между элементами «промотор» и «энхансер» не всегда ясны, термин «промотор» обычно относится к месту на молекуле нуклеиновой кислоты, с которым связывается РНК-полимераза и/или связанные с ней факторы, и с которого инициируется транскрипция. Энхансеры усиливают активность промотора во времени, а также пространственно. В данной области известно множество промоторов, которые транскрипционно активны в широком диапазоне типов клеток. Промоторы могут быть разделены на два класса: на функционирующие конститутивно и регулируемые индукцией или снятием репрессии. Для экспрессии белка пригодны оба класса. Промоторы, которые используются для продукции высокого уровня полипептидов в эукариотических клетках и, в частности, в клетках млекопитающих, должны быть сильными и, предпочтительно, должны быть активными в широком диапазоне типов клеток. Сильные конститутивные промоторы, которые способны запускать экспрессию во многих типах клеток, хорошо известны в данной области и, поэтому, нет необходимости в их подробном описании в данном документе. В соответствии с одним из вариантов настоящего изобретения предпочтительно использовать промотор цитомегаловируса (CMV). Промотор или промотор/энхансер, полученные из немедленной ранней (IE) области цитомегаловируса (hCMV) человека, в особенности подходят в качестве промотора в экспрессионной кассете по настоящему изобретению. Немедленная ранняя (IE) область цитомегаловируса (hCMV) человека и полученные из нее функциональные запускающие экспрессию фрагменты и/или функциональные усиливающие экспрессию фрагменты, например, описаны в ЕР 0173177 и ЕР 0323997, а также хорошо известны в данной области. В соответствии с другим вариантом настоящего изобретения предпочтительно использовать промотор/энхансер, полученный из гена бета-актина курицы и немедленной ранней (IE) области цитомегаловируса (hCMV) человека. В дополнение к промотору/энхансеру экспрессионная кассета и/или вектор могут содержать одну или более других подходящих последовательностей инициации, терминации транскрипции, сигналов эффективного процессирования РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования (поли А); последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК, например WPRE; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козак); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию кодируемого продукта. Характер таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма- хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосомы, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промоторы и последовательности терминации транскрипции. Термин «контролирующие последовательности» включает, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, присутствие которых является полезным, например, лидирующие последовательности и последовательности слившихся клеток.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для доставки гена SMN1 в целевые клетки, которая включает вышеуказанный рекомбинантный вирус на основе AAV.PHP.B в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.
Термин «фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя вышеуказанный рекомбинантный вирус на основе AAV.PHP.B по изобретению и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых эксципиентов, таких как наполнители, растворители, разбавители, носители, средства доставки, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от способа назначения и дозировки. Носитель для инъекций обычно является жидким. Носитель для других способов введения может быть твердым или жидким. В качестве инъекционной среды предпочтительно использовать воду, содержащую добавки, общепринятые для инъекционных растворов, такие как буферные и изотонические агенты, стабилизаторы и солюбилизаторы. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению и способы их изготовления являются очевидными для специалистов в этой области. Производство фармацевтических композиций предпочтительно должно соответствовать требованиям GMP (надлежащей производственной практики).
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению вышеуказанного рекомбинантного вируса на основе AAV.PHP.B или вышеуказанной композиции для доставки гена SMN1 в целевые клетки. Любой способ введения рекомбинантного вируса на основе AAV, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для вышеуказанного рекомбинантного вируса на основе AAV.PHP.B по настоящему изобретению.
Рекомбинантный вирус на основе AAV.PHP.B по изобретению предпочтительно вводят в клетку в биологически эффективном количестве. «Биологически эффективное» количество рекомбинантного вируса представляет собой количество, которое достаточно, чтобы вызвать инфекцию (или трансдукцию) и экспрессию гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетке. Если вирус вводят в клетку in vivo (например, вирус вводят субъекту, как описано ниже), «биологически эффективное» количество вирусного вектора представляет собой количество, которое достаточно, чтобы вызвать трансдукцию и экспрессию гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетке-мишени. Вышеуказанный рекомбинантный вирус на основе AAV.PHP.B не используется для модификации генетической целостности клеток зародышевой линии человека.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фиг. 1А - 1С приведены результаты определения экспрессии SMN1 на уровне мРНК после трансфекции плазмидами sc-AAV-SMNl и ss-AAV-SMNl.
На фиг. 1А представлены результаты определения количества РНК SMN1 в реакционной смеси.
На фиг. 1В приведены результаты определения количества РНК hGAPDH в реакционной смеси.
На фиг. 1С показана нормализация уровня РНК SMN1 к hGAPDH с учетом фоновой экспрессии в контрольных клетках без добавления трансфецирующего агента и плазмид (КО).
На фиг. 2А и 2В приведены результаты определения белка SMN после трансфекции плазмидами sc-AAV-SMNl и ss-AAV-SMNl. На фиг. 2А приведены результаты определения белка SMN методом Вестерн- блоттинга:
1 - Блот после инкубации с антителами Anti-SMN/Gemin 1. М - белковый маркер PageRuler Plus Prestained Protein Ladder; для каждого варианта трансфекции sc- AAV-SMN1, ss-AAV-SMNl и контроля без добавления плазмиды (КО) загружено по 2 клеточного лизата, приготовленных независимо.
2 - Блот после инкубации с антителами, узнающими белок домашнего хозйства Р- Actin (8H10D10) Mouse mAb.
На фиг. 2В приведены результаты определения белка SMN в образцах методом ИФА.
При изучении трансляции целевого белка SMN методом ИФА проведено не менее трех независимых экспериментов по трансфекции, включая контроль без добавления трансфецирующего агента и плазмид, определены среднее значение, стандартное отклонение (SD) и коэффициент вариации (CV); sc-AAV-SMNl - клетки НЕК293 после трансфекции плазмидой sc-AAV-SMNl; ss-AAV-SMNl- клетки НЕК293 после трансфекции плазмидой ss-AAV-SMNl;
КО - клетки НЕК293 без добавления плазмид и трансфецирующего агента.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Материалы и методы
Методы молекулярного клонирования
Некоторые элементы генетических конструкций, включая последовательность гена SMN1, получены методом химического синтеза в компании Atum Dna2.0.
Для манипуляций с ДНК используют стандартные методы [17]. Для выделения плазмидной ДНК клетки Е. сой растят на селективной среде с добавлением антибиотика. Плазмидную ДНК выделяют с помощью коммерческих наборов. Необходимые фрагменты ДНК получают с помощью ПНР или эндонуклеаз рестрикции. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводят в агарозном геле. Фрагменты ДНК нужного размера выделяют из геля коммерческими наборами. Концентрацию ДНК определяют методом спектрофотометрии. После лигирования фрагментов ДНК проводят электропорацию бактериальных клеток. Трансформированные клетки отбирают на селективной среде с добавлением антибиотика, затем из них выделяют плазмидную ДНК. Корректность генетических конструкций подтверждена рестрикционным картированием, ТТЛ? и секвенированием по Сэнгеру. Анализ последовательностей ДНК проведен в программе SnapGene 3.2.1.
Культивирование клеток НЕК293
Разморозка клеток Нек293
Клетки НЕК293 быстро, в течение 40-60 сек, размораживают на водяной бане при температуре 37 °C. Откручивают крышку, отбирают весь объем клеточной суспензии и переносят в 15 мл пробирку типа Falcon в 8 мл среды ЕМЕМ с глутамином с добавлением 10% FBS. Аккуратно пипетируют, после чего центрифугируют в течение 5 мин со скоростью 170g при комнатной температуре (далее - RT). Отбирают супернатант, оставляют в пробирке 2 мл среды, осадок тщательно пипетируют. Оценивают концентрацию и жизнеспособность клеток прямым подсчетом в камере Г оряева.
Клетки рассаживают в культуральные флаконы Т75 (площадь 75 см2) с вентилируемой крышкой в концентрации 3-5х104 кл/мл в 15 мл ЕМЕМ с 10% FBS без антибиотиков. Клетки культивируют в СОг-инкубаторе при температуре 37 °C во влажной атмосфере 5% СОг в течение 48-72 часов.
Пассирование Нек293
Пассирование клеток проводят по достижении конфлюэнтности во флаконе 80- 90%. Из флаконов Т75 удаляют старую культуральную среду. Клетки промывают 10 мл DPBS, после чего в каждый флакон вносят по 3 мл 0,25% раствора трипсина-0, 53 мМ ЭДТА. Смачивают поверхность флакона покачиванием и инкубируют 10 мин в СОг- инкубаторе при температуре 37 °C. Полноту открепления клеток контролируют под микроскопом. Вносят в каждый флакон по 10 мл полной ростовой среды для инактивации трипсина, аккуратно промывают дно флакона и переносят клетки в 50 мл флаконы типа Falcon. Клетки тщательно ресуспендируют и центрифугируют в течение 5-10 мин со скоростью 170-300g при RT. Отбирают супернатант, оставляют во флаконах по 5-10 мл клеточной суспензии, пипетируют, измеряют концентрацию и оценивают жизнеспособность на камере Горяева. Клетки рассаживают во флаконы Т75 в концентрации 3,0-5,0х104 кл/мл. Необходимое количество клеток переносят в 15 мл полной ростовой среды и культивируют в СОг-инкубаторе в течение 48-72 часов при температуре 37 °C в атмосфере 5% СОг-
Трансфекция клеток НЕК293 Трансфекцию TurboFect Transfection Reagent (Sigma- Aldrich) (далее - TurboFect) проводят согласно рекомендациям производителя. Для трансфекции клетки рассеивают в лунки 6-луночного планшета в концентрации 1х105 клеток/мл в 3 мл полной ростовой среды ЕМЕМ. Инкубируют 24-48 ч в СОг-инкубаторе при температуре 37 °C в атмосфере 5% СОг- Трансфекцию проводят при плотности монослоя 70-90%. Для приготовления трансфецирующей смеси в 2 отдельные микропробирки типа Eppendorf вносят по 150 мкл среды ЕМЕМ, в одну добавляют 5 мкл TurboFect, в другую вносят 1,5 мкг плазмидной ДНК, перемешивают на вортексе 5 сек. Затем готовят ДНК- липидный комплекс, смешав 1:1 смесь ДНК и разбавленный реагент Turbofect, перемешивают на вортексе 5 сек и инкубируют 20 мин при RT. Трансфекционную смесь вносят в соответствующие лунки культурального планшета и инкубируют в течение 48 часов в СОг-инкубаторе при температуре 37 °C в атмосфере 5% СОг- Отрицательным контролем служат клетки, нетрансфицированные плазмидной ДНК.
Для каждой экспрессионной кассеты проводят не менее трех независимых повторов трансфекции в одинаковых условиях.
Отбор клеток НЕК293, приготовление лизатов, выделения РНК и синтез кДНК
По окончанию культивирования клеток ростовую среду отбирают и утилизируют, клетки аккуратно промывают 2 мл раствора DPBS. После удаления DPBS в лунки вносят по 1 мл раствора трипсина-ЭДТА 0,25%, инкубируют 10 мин при 37°С, добавляют 2 мл DPBS, аккуратно перемешивают и переносят суспензию клеток в 15 мл пробирку, добавляют 5 мл DPBS, перемешивают, центрифугируют 5 мин на скорости 250 g при 4 °C, удаляют супернатант. Клетки промывают 5 мл DPBS, центрифугируют 5 мин на скорости 250 g при 4 °C, удаляют супернатант. Затем клетки ресуспендируют в 2,1 мл DPBS, переносят по 1 мл в 1,5 мл микропробирки, центрифугируют 5 мин на скорости 250 g при 4 °C, аккуратно удаляют супернатант. Далее клетки используют для выделения РНК/приготовления лизатов или замораживают (-20 °C).
Непосредственно перед началом работы готовят лизирующий буфер RIPA. В пробирки с клетками добавляют лизирующий буфер, инкубируют 10 минут на льду. Затем лизаты центрифугируют 20 минут при +4°С, 18000 g, аликвотируют по 20 мкл и переносят в низкотемпературный морозильник (-80°С). Тотальную РНК выделяют с помощью набора Thermo Scientific GeneJET RNA Purification Kit согласно инструкции производителя. Синтез кДНК проводят с помощью набора QuantiTect Reverse Transcription Kit согласно инструкции производителя.
Анализ экспрессии гена SMN1
ОТ-ПЦР в реальном времени
Полимеразную цепную реакцию проводят на амплификаторе Real-Time CFX96 Touch (BioRad). Для постановки рвПЦР на основе интеркалирующего красителя SYBR используют готовую смесь для ПЦР SsoAdvancedTM Universal SYBR® Green Supermix. Для построения калибровочных кривых в реакцию общим объемом 10 мкл вносят 5 мкл SsoAdvanced universal SYBR Green supermix, no 0,5 мкл прямого и обратного праймера (10 мкМ), 2 мкл деионизованной воды, 2,5 мкл стандартов плазмидной ДНК. Для анализа образцов кДНК в реакцию общим объемом 10 мкл вносят 5 мкл SsoAdvanced universal SYBR Green supermix, no 0,5 мкл прямого и обратного праймера (10 мкМ), 3,5 мкл деионизованной воды, 1 мкл образцов кДНК. Результаты амплификации оценивают при помощи программы Bio-Rad CFX Manager. С использованием соответствующих стандартных кривых рассчитывают содержание кДНК SMN1 и hGAPDH в образцах клеток НЕК293 после трансфекции (количество молекул кДНК/1 мкл реакционной смеси).
Для подсчета уровня экспрессии гена SMN1 (Е) концентрацию кДНК SMN1 нормализуют к концентрации гена домашнего хозяйства hGAPDH:
L=[SMNl][hGAPDH]E=[SMNl] [hGAPDH]
Экспрессию SMN1 после трансфекции рассчитывают с учетом фоновой экспрессии в контрольных клетках без добавления трансфецирующего агента и плазмид (КО):
LsMNl — Кгрансфекция LKO
Критерии пригодности системы: эффективность прохождения ПНР для каждой мишени находится в интервале 90-110%; значение R2 не ниже 0,99; количество детектируемых молекул превышает 10000/мкл реакционной смеси.
Определение белка SMN
Вестерн-блоттинг
10 мкл клеточного лизата инкубируют с 2,5 мкл загрузочного буфера с DTT LB, перемешивают и кипятят при 95°С 3 минуты. Проводят белковый электрофорез в полиакриламидном 12% геле. Режим проведения электрофореза для Glycine-SDS- PAGE: концентрирующий гель 70 В (20 мин, разделяющий гель 100-130 В, мин). Условия переноса: 1 час при 100 В. Для детекции белка SMN используют первичные антитела Anti-SMN/Gemin 1 antibody (аЬ223068) в разведении 1/5000 и вторичные антитела Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) в разведении 1/20 000. Для детекции бета- актина (контроль загрузки) используют первичные антитела Р-Actin (8H10D10) Mouse mAb в разведении 1/1000 и вторичные антитела Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) в разведении 1/20 000. Сигнал хемилюминесценции детектируют в гельдокументирующей системе Fusion SL2.
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Анализ проводят с помощью набора SMN ELISA Kit (Abeam©) по инструкции к набору. Перед анализом все реагенты, стрипы, стандартные и исследуемые образцы предварительно доводят до комнатной температуры. Перед каждым анализом проводят пробоподготовку стандартного образца SMN и образцов клеток. Стоковый раствор стандартного образца SMN с концентрацией 3 200 пг/мл готовят разведением 1 пробирки Standard в 1 мл Assay Buffer 13. Серией двукратных разведений в Assay Buffer 13 готовят растворы стандартов 1 600, 800, 400, 200, 100 и 50 пг/мл. В качестве бланкового образца с концентрацией SMN 0 пг/мл используют Assay Buffer 13. Клеточные лизаты разводят в Assay Buffer 13 до условной концентрации 500 и 2000 клеток/мл. Дополнительно оценивают однородность выделения белка с помощью набора DC protein assay (Bio-Rad) по инструкции к набору. Детектируют абсорбцию при основной длине волны 450 нм и референсной длине волны 580 нм на планшетном спектрофотометре. Проводят построение 4-х параметрической калибровочной кривой, используя значения, полученные для стандартных растворов. На основе калибровочной кривой прибор автоматически рассчитывает концентрации SMN в исследуемых образцах. Проводят сравнение пересчитанных концентраций SMN в пг/мл и абсолютных значений абсорбции в единицах оптической плотности.
Сборка и очистка рекомбинантных вирусных частиц AAV
Рекомбинантные вирусные частицы AAV получают посредством транзиентной трансфекции клеток НЕК293 тремя плазмидами:
1. плазмидой ss-AAV-SMNl или sc-AAV-SMNl для экспрессии в составе одноцепочечного или самокомплементарного вектора соответственно, при этом кодируемый белок SMN может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности SEQ ID N0:4;
2. плазмидой для экспрессии генов репликации Rep серотипа AAV2, генов Сар серотипа AAV.PhP.B или AAV9, соответствующих SEQ ID N0:1 и SEQ ID N0:2 или с одиночными или несколькими точечными мутациями;
3. плазмидой для экспрессии генов аденовируса Ad5, необходимых для сборки и упаковки капсидов AAV.
После суспезионного культивирования пакующих клеток НЕК293 и проведения трансфекции описанными плазмидами клетки лизируют, супернатант осветляют и концентрируют. После нескольких стадий хроматографической очистки целевой продукт обогащают методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности иодиксанола (OptiPrep) или методом ионообменной хроматографии.
Титр вирусных частиц определяют с помощью методов количественной ПНР.
Для приготовления препарата вирусных частиц используют раствор для формуляции, содержащий воду или буфер, хлористый натрий, глицин, гиалуроновую кислоту и/или другие эксципиенты. Финальный раствор вирусных частиц хранят замороженным (-20 °C) или в лиофилизированной форме.
Пример 1. Получение генетической конструкции ss-AAV-SMNl
ППР-продукт размером 1 кб, полученный в результате амплификации плазмиды ATUM_126497_pF1257, содержащий последовательность гена SMN1 дикого типа SEQ ID N0:1, с праймерами pr2324 (5’-ttccatcatcgat(ClaI)tgtaattcatgagccaccatggcgatgagcag-3’) и рг2325 (5’ -tagcggatctaga(XbaI)ttaatttaaggaatgtgagcaccttcc- 3’), вырезают из геля, очищают с использованием набора Cleanup Standard (Евроген). После инкубации с эндонуклеазами рестрикции Clal и Xbal в течение 3-х часов при 37 °C ДНК-фрагмент 1 очищают с помощью набора CleanMag DNA (Евроген). Вектор pAAV-GFP (Cell Biolabs) инкубируют с эндонуклеазами рестрикции Clal и Xbal. Фрагмент размером 4,6 кб вырезают из геля, очищают с использованием набора Cleanup Standard (Евроген) и лигируют с ДНК-фрагментом 1 с помощью Т4 ДНК лигазы. Лигированную смесь используют для трансформации штамма с2523 (NEB) методом электропорации. Корректность плазмидной ДНК, выделенной из колоний, выросших на среде LB с ампицилином (100 мкг/мл), подтверждают секвенированием. Финальная генетическая конструкция ss-AAV-SMNl характеризуется следующими элементами, необходимыми для наработки плазмиды в Е. coli и сборке AAV в НЕК293:
1. инвертированный тандемный повтор ITR, SEQ ID N0:9;
2. CMV энхансер, SEQ ID NO: 10;
3. CMV промотер, SEQ ID N0:11;
4. интрон гена бета субъединицы гемоглобина, SEQ ID NO: 12;
5. SMN1, SEQ ID N0:3;
6. сигнал полиаденилирования hGHl, SEQ ID NO: 13;
7. инвертированный тандемный повтор ITR, SEQ ID N0:14;
8. высоко-копийный бактериальный ориджин репликации
9. ген устойчивости к ампицилину
Пример 2. Получение генетической конструкции sc-AAV-SMNl
На первом этапе получают конструкцию pF1254 путем замены гена устойчивости в плазмиде pscAAV-GFP_addgene-323964 с ампицилиновой на канамициновую.
На следующем этапе получают конструкцию pF1256 на основе плазмид плазмиды pF1254, в которую по сайтам рестрикции Sad и Avril вставляют фрагмент ДНК, синтезированный компанией ATUM, в котором представлены промотор гена бета- актина курицы, интрон позднего гена 16S субъединицы вируса SV40 для конституитивной экспрессии; сигнал полиаденилирования BGH.
Далее получают конструкцию pF1262 на основе плазмид addgene-plasmid-92399- sequence- 178249 и pF1256. НЦР-продукт размером 859 п.о., полученный в результате амплификации плазмиды addgene-plasmid-92399-sequence-178249 с праймерами Рг2344 (5’ - cccaactgatcttcagcatc - 3’) и Рг2337 (5’- cgcgcttcgctttttatagg - 3’), вырезают из геля, очищают с использованием набора Cleanup Standard (Евроген). После инкубации с эндонуклеазами рестрикции Spel и Ecil в течение 3-х часов при 37 °C ДНК-фрагмент 1 очищают с помощью набора CleanMag DNA (Евроген). Вектор pF1256 инкубируют с эндонуклеазами рестрикции Spel и BsrDI. Фрагмент размером 2,9 кб вырезают из геля, очищают с использованием набора Cleanup Standard (Евроген) и лигируют с ДНК- фрагментом 1 с помощью Т4 ДНК лигазы. Лигированную смесь используют для трансформации штамма Е. coli методом электропорации. Корректность плазмидной ДНК, выделенной из колоний, выросших на среде LB с канамицином (50 мкг/мл), определяют секвенированием.
Для создания генетической конструкции sc-AAV-SMNl вектор, полученный на предыдущем этапе, и ATUM_126497_pF1257 инкубируют с эндонуклеазами рестрикции EcoRI-HF и Xbal. Соответствующие фрагменты размерами 3,3 кб и 1 кб вырезают из геля, очищают с использованием набора Cleanup Standard (Евроген) и лигируют с помощью Т4 ДНК лигазы. Лигированную смесь используют для трансформации штамма Е. сой методом электропорации. Корректность плазмидной ДНК, выделенной из колоний, выросших на среде LB с канамицином (50 мкг/мл), определяют секвенированием.
Финальная генетическая конструкция sc-AAV-SMNl характеризуется следующими элементами, необходимыми для наработки плазмиды в Е. сой и сборке AAV в НЕК293:
1. модифицированный инвертированный тандемный повтор ITR-dTRS, SEQ ID N0:15;
2. CMV энхансер, SEQ ID NO: 16;
3. промотор гена бета-актина курицы, SEQ ID N0:17;
4. интрон позднего гена 16S субъединицы вируса SV40, SEQ ID N0:18;
5. SMN1, SEQ ID N0:3;
6. сигнал полиаденилирования BGH, SEQ ID N0:19;
7. инвертированный тандемный повтор ITR, SEQ ID N0:20;
8. высоко-копийный бактериальный ориджин репликации
9. ген устойчивости к канамицину
Пример 3. Проверка экспрессии гена SMN1 после трансфекции плазмидами sc- AAV-SMNl и ss-AAV-SMNl
На фиг. 1А и фиг. 1В представлены результаты анализа экспрессии SMN1 в образцах методом ОТ-ПЦР в реальном времени. В исследуемых образцах после трансфекции наблюдается экспрессия SMN1, в то время как для образцов отрицательного контроля без добавления плазмид сигнал остается на фоновом уровне. При этом во всех исследуемых образцах наблюдается экспрессия гена домашнего хозяйства hGAPDH на сопоставимом уровне, что потдверждает качество пробоподготовки и однородность загрузки образцов для проведения ПНР реакции. Во всех образцах трансфецированных плазмидами наблюдается экспрессия гена SMN1. При этом уровень мРНК SMN1 в 4 раза превышает уровень экспрессии для экспрессионной конструкции ss-AAV-SMNl по сравнению с sc-AAV-SMNl.
Пример 4. Проверка трансляции белка SMN после трансфекции плазмидами sc- AAV-SMNl и ss-AAV-SMNl
На фиг. 2А представлены результаты определения белка SMN в клеточных лизатах после трансфекции методом Вестерн-блоттинга. После инкубации с антителами, узнающими белок SMN, наблюдается специфичная полоса размера, соответствующего по молекулярной массе целевому белку (31кДа SMN), в контрольных образцах без трансфекции сигнал отсутствует. Инкубация с антителами, узнающими ген домашнего хозяйства актин, подтверждает однородность загрузки образцов. Полученные данные подтверждают наличие белка SMN в исследуемых клеточных лизатах.
Содержание белка SMN в трансфецированных клетках было количественно определено с помощью иммуноферментного анализа (фиг. 2В).
Для образцов после трансфекции плазмидами ss-AAV-SMNl и sc-AAV-SMNl наблюдается достоверное отличие от КО, при этом сигнал для ss-AAV-SMNl превышает сигнал для sc-AAV-SMNl в 6,3 раза.
Таким образом, экспрессия гена SMN1 на уровне мРНК (фиг. 1) соответствуют уровням трансляции белка SMN (фиг. 2).
Пример 5. Получение генетической конструкции для экспрессии белков Rep (AAV2) и Cap (AAV-PhP.B)
Для получения генетической конструкции Rep2 PhP.B коммерческие вектора pUCmini-iCAP-PHP.B (Addgene, 103002) и pAAV2-9n (Addgene, 112865) инкубируют с эндонуклеазами рестрикции Sbfl и BsiWI. Фрагменты размерами 1,2 кб (pUCmini-iCAP- РНР.В) и 6 кб (pAAV2-9n) вырезают из геля, очищают с использованием набора Cleanup Standard (Евроген) и лигируют с помощью Т4 ДНК лигазы. Лигированную смесь используют для трансформации штамма с2523 (NEB) методом электропорации. Корректность плазмидной ДНК, выделенной из колоний, выросших на среде LB с ампицилином (100 мкг/мл), подтверждают секвенированием. Пример 6. Создание вирусных препаратов ss-AAV и sc-AAV, несущих функциональный ген SMN1.
Для трансфекции пакующих клеток НЕК293 использовались следующие генетические конструкции:
1. плазмида ss-AAV-SMNl или sc-AAV-SMNl для экспрессии гена SMN1 в составе одноцепочечного или самокомплементарного вектора согласно SEQ ID N0:5 и SEQ ID N0:6 соответственно;
2. плазмида для экспрессии генов репликации Rep серотипа AAV2, генов Сар серотипа AAV_PhP.B или AAV9, соответствующих SEQ ID N0:7 и SEQ ID N0:8;
3. плазмида для экспрессии генов аденовируса Ad5.
Суспезионное культивирование пакующих клеток НЕК293 проводили в волновом биореакторе, через 72 часа после трансфекции клетки лизировали добавлением дететергента Triton Х100, затем осуществляли глубинную фильтрацию полученного лизата через фильтр Clarisolve 20MS или аналогичный. Затем проводили фильтрацию с использованием мембранного капсульного гидрофильного фильтра с размером пор 0,2 шп, концетрирование и диафильтрацию с помощью TFF. На первой стадии хроматографической очистки использовали сорбент POROS CaptureSelect AAV9 Affinity Resin. Далее проводили ионно-обменную хроматографию с использованием колонки CIMmultus® QA 1 mL Monolithic Column (2 цш) или аналогичной, предназначенной для разделения больших биомолекул. На последнем этапе осуществляли замену буфера с помощью TFF. В качестве буфера для формуляци использовали PBS, pH 7,4 с добавлением 0,005% Pluronic F68 для снижения агрегации вирусных частиц.
Пример 7. Эффект конструкций на выживаемость мышей SMNA7
Настоящее исследование проведено с использованием линий мышей FVB/N SMNA7. Данная линия лишена эндогенного мышиного гена SMN1, но имеет две копии интактного человеческого SMN2 (hSMN2) и еще две копии hSMN2 с удаленным экзоном 7, которые вместе обеспечивают достаточную экспрессию SMN для предотвращения эмбриональной гибели. Модель на основе линии мышей FVB/N SMNA7 воспроизводит такие особенности течения спинальной мышечной атрофии (СМА), как низкий уровень экспрессии SMN, потеря двигательных нейронов, слабость и преждевременная смерть. Поставщик животных - JAX®, strain #005025. По данным исследований лаборатории выживаемость гомозигот составляет 15-22 дня. Выживаемость животных в течение 40 дней и более соответствует полному замещению функции гена SMN1 у мышей FVB/N SMNA7.
Исследуемые образцы вводили новорожденным мышам внутривенно в височную вену. Для каждого образца было исследовано по три дозы: 1,20Е+13, 7,50Е+13 vg/кг и 1Д0Е+14 vg/кг, в качестве контроля вводили фосфатно-солевой буфер с добавлением 0,005% Pluronic F68. В качестве тестируемых образцов были исследованы конструкции на основе серотипа sc-AAV-9, ss-AAV-PHP.B и sc-AAV-PHP.B. Все конструкции были получены способом, указанным выше. После введения тестируемых или контрольного образцов за животными наблюдали в течение 40 дней.
Для значения выживаемости приведена описательная статистика в виде среднего (Mean) и стандартного отклонения (SD) в соответствии с рекомендациями Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств [18]. Оценка нормальности распределения выполнена с помощью теста Шапиро-Уилка. Для межгрупповых сравнений использовали t-критерий Стьюдента или U-критерия Манна- Уитни в зависимости от результатов теста на нормальность распределения. Различия считали достоверными при р<0,05. Все тестируемые образцы сравнивали с контролем, образцы на основе капсида AAV-PHP.B также сравнивали с аналогичными дозами образцов на основе капсида AAV-9.
По результатам исследования выживаемость животных в группах, которые получили тестируемые образцы, была значимо выше, чем в контрольной группе (Таблица 3). Попарное сравнение аналогичных доз конструкций на основе AAV-PHP.B и AAV-9 продемонстрировало значимое превосходство капсида AAV-PHP.B при введении препарата в дозах ниже 1Д0Е+14 vg/кг. Наибольшая эффективность была зарегистрирована для конструкции на основе вирусного вектора sc-AAV-PHP.B-SMN: данная композиция в дозе 7,50Е+13 vg/кг по эффективности была сопоставима с дозой 1Д0Е+14 vg/кг для sc-AAV-9-SMN. Использование AAV-PHP.B в качестве вектора для доставки гена SMN1 способствует достижению целевой выживаемости при введении меньших доз препарата вероятно вследствие более эффективной трансдукции целевой популяции клеток. Таблица 3. Выживаемость мышей SMNA7 при введении контрольного и тестируемых образцов
Figure imgf000029_0001
* - 1- критерий Стьюдента,
# - U-критерий Манна-Уитни
Таким образом, благодаря увеличенной проницаемости гематоэнцефалического барьера и селективности трансдукции для конструкций на основе вектора AAV-PHP.B возможен более благоприятный профиль безопасности препарата для лечения спинальной мышечной атрофии. Применение конструкций на основе ss-AAV-PHP.B может способствовать лучшему профилю безопасности при использовании аналогичных доз с sc-AAV-9 из-за потенциально сниженной иммуногенности.
Использование серотипа AAV-PHP.B может способствовать уменьшению дозы по сравнению с уже зарегистрированными препаратами генной терапии и/или уменьшить частоту нежелательных реакций на введение препарата. Кроме того, возможное снижение дозы и/или улучшение профиля безопасности позволят применять данный препарат у пациентов старше двух лет. Список литературы
1. Markowitz J. A., Singh P., Darras В. T. Spinal Muscular Atrophy: A Clinical and
Research Update. Pediatric Neurology. 2012, 46(1): 1-12. doi: 10.1016/j .pediatrneurol.2011.09.001
2. Mercuri E., Finkel R. S., Muntoni F. et al. Diagnosis and management of spinal muscular atrophy: Part 1: Recommendations for diagnosis, rehabilitation, orthopedic and nutritional care. Neuromuscular Disorders. 2018, 2:103— 115. https://doi.Org/10.1016/j.nmd.2017.l l.005
3. Butchbach M. E. Copy Number Variations in the Survival Motor Neuron Genes: Implications for Spinal Muscular Atrophy and Other Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Molecular Biosciences. 2016; 3:7. doi: 10.3389/fmo lb.2016.00007
4. Prior T. W, Eeach M. E, Finanger E. Spinal Muscular Atrophy. 2000 Feb 24 [Updated 2020 Dec 3]. In: Adam M. P, Ardinger H. H, Pagon R. A, et al., editors. GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2021. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1352/
5. Passini M. A., Cheng S. H. Prospects for the gene therapy of spinal muscular atrophy. Trends in Molecular Medicine, 2011; 17(5):259— 265. doi: 10.1016/j. mo Imed.2011.01.002
6. Food and Drug Administration (FDA). URE: https://www.fda.gov/vaccines-blood- biologics/zolgensma /jara обращения 04.05.22)
7. Joseph R. Smith- Arica, Jeffrey S. Bartlett. Gene therapy: Recombinant adeno- associated virus vectors. Current Cardiology Reports. 2001 ; 3:43-49.
8. Passini M. A., Fee E. B., Heuer H. H., Wolf J. H. Distribution of a Lysosomal Enzyme in the Adult Brain by Axonal Transport and by Cells of the Rostral Migratory Stream The Journal of Neuroscience, 2002; 22:6437-6446. doi: 10.1523/JNEUROSCI.22-15- 06437.2002
9. High K. A., Aubourg P. rAAV human trial experience. Methods in Molecular Biology. 2011 ; 807:429-457.
10. Xie Q., Bu W., Bhatia S., Hare J., Somasundaram T., Azzi A., Chapman M. S. The atomic structure of adeno-associated virus (AAV-2), a vector for human gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2002; 99(16), 10405- 10410. doi: 10.1073/pnas.162250899
11. McCarty D. M. Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications. Molecular Therapy. 2008; 16(10): 1648-1656. doi: 10.1038/mt.2008.171 Martino A. T, Suzuki M., Markusic D. M, et al. The genome of self-complementary adeno-associated viral vectors increases Toll- like receptor 9-dependent innate immune responses in the liver. Blood. 2011;117(24):6459-6468. doi:10.1182/blood-2010-10-
314518 Food and Drug Administration (FDA). URL: https://www.fda.gov/media/126109/download (дата обращения 04.05.22) Food and Drug Administration (FDA). Cellular, Tissue, and Gene Therapies Advisory
Committee (CTGTAC) Meeting #70. Toxicity Risks of Adeno-associated Virus (AAV) Vectors for Gene Therapy (GT), September 2-3, 2021. URL: https://www.fda.gov/media/151599/download_^aTa обращения 04.05.22). BLA Clinical Review Memorandum, onasemnogene abeparvovec-xioi, STN 125694/0, May 23, 2019. URL: https://www.fda.gov/media/128116/download (дата обращения 04.05.22). Deverman В. E., Pravdo P. L., Simpson В. P., Kumar S. R., Chan K. Y., Banerjee A., Gradinaru V. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 2016, 34(2): 204-209. doi:10.1038/nbt.3440 Sambrook J. F. Molecular Cloning: a Laboratory Manual (Fourth Edition). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2014. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К, 2012.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Рекомбинантный аденоассоциированный вирусный (rAAV) вектор на основе серотипа AAV.PHP.B, содержащий полинуклеотид, кодирующий белок выживаемости двигательных нейронов (SMN).
2. rAAV вектор по и. 1, отличающийся тем, что белок SMN кодирован SMN1 человека.
3. rAAV вектор по и. 2, отличающийся тем, что белок SMN содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:4.
4. rAAV вектор по и. 2, отличающийся тем, что белок SMN содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности SEQ ID N0:4.
5. Рекомбинантный вирусный вектор на основе AAV.PHP.B по пи. 1-4, где капсид включает белок VP1 AAV.PHP.B, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID N0:1.
6. Рекомбинантный вирусный вектор на основе AAV.PHP.B по пи. 1-5, где капсид включает белок VP1 AAV.PHP.B, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID N0:1 с одной или несколькими точечными мутациями.
7. Рекомбинантный вирусный вектор на основе AAV.PHP.B по пи. 1-6, отличающийся тем, что имеет одноцепочечный геном (ssAAV), кодирующий белок SMN.
8. Рекомбинантный вирусный вектор на основе AAV.PHP.B по пи. 7, отличающийся тем, что капсид включает белок VP1 AAV.PHP.B, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID N0:1 или аминокислотную последовательность с одной или несколькими точечными мутациями, а экспрессионная кассета включает следующие элементы в направлении от 5'-конца к З'-концу:
ITR;
CMV энхансер;
CMV промотер
SMN1 сигнал полиаденилирования hGHl;
ITR.
9. Рекомбинантный вирусный вектор на основе AAV.PHP.B по пп. 7-8, отличающийся тем, что капсид включает белок VP1 AAV.PHP.B, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID N0:1 или аминокислотную последовательность с одной или несколькими точечными мутациями, а экспрессионная кассета имеет последовательность SEQ ID N0:5 или на 90 % идентичную SEQ ID N0:5.
10. Рекомбинантный вирусный вектор на основе AAV.PHP.B по пп. 1-6, отличающийся тем, что имеет само-комплементарный геном (scAAV), кодирующий белок SMN.
11. Рекомбинантный вирусный вектор на основе AAV.PHP.B по и. 10 отличающийся тем, что капсид включает белок VP1 AAV.PHP.B, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID N0:1 или аминокислотную последовательность с одной или несколькими точечными мутациями, а экспрессионная кассета включает следующие элементы в направлении от 5'-конца к З'-концу:
ITR
CMV энхансер;
СВ промотор
SV40 интрон
SMN1 сигнал полиаденилирования BGH;
ITR
12. Рекомбинантный вирусный вектор на основе AAV.PHP.B по пп. 10-11 отличающийся тем, что капсид включает белок VP1 AAV.PHP.B, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID N0:1 или аминокислотную последовательность с одной или несколькими точечными мутациями, а экспрессионная кассета имеет последовательность SEQ ID N0:6 или на 90 % идентичную SEQ ID N0:6.
13. Фармацевтическая композиция для доставки гена SMN1 в целевые клетки, включающая рекомбинантный вирусный вектор на основе AAV.PHP.B по пп. 1-12 в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.
14. Применение рекомбинантного вирусного вектора на основе AAV.PHP.B по пп. 1-12 или композиции по и.13 для доставки гена SMN1 в целевые клетки.
PCT/RU2023/050104 2022-05-11 2023-04-28 Аденоассоциированный вирусный вектор на основе серотипа aav.php.b и его применение WO2023219533A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2022112789A RU2022112789A (ru) 2022-05-11 Аденоассоциированный вирусный вектор, состоящий из белков капсида рнр.в, нуклеиновой кислоты, кодирующей белок smn, и его применение
RU2022112789 2022-05-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023219533A1 true WO2023219533A1 (ru) 2023-11-16

Family

ID=88730651

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2023/050104 WO2023219533A1 (ru) 2022-05-11 2023-04-28 Аденоассоциированный вирусный вектор на основе серотипа aav.php.b и его применение

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023219533A1 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021014428A1 (en) * 2019-07-25 2021-01-28 Novartis Ag Regulatable expression systems
WO2022045935A1 (en) * 2020-08-28 2022-03-03 Joint Stock Company "Biocad" Aav5-based vaccine against sars-cov-2

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021014428A1 (en) * 2019-07-25 2021-01-28 Novartis Ag Regulatable expression systems
WO2022045935A1 (en) * 2020-08-28 2022-03-03 Joint Stock Company "Biocad" Aav5-based vaccine against sars-cov-2

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE PROTEIN ANONYMOUS : "Sequence 5 from patent US 11149256", XP093110404, retrieved from NCBI *
DATABASE PROTEIN ANONYMOUS : "Sequence 8 from patent US 9585971", XP093110403, retrieved from NCBI *
DATABASE PROTEIN ANONYMOUS : "Sequence 9 from patent US 6080577", XP093110405, retrieved from NCBI *
PALAZZI XAVIER, PARDO INGRID D., SIRIVELU MADHU P., NEWMAN LEAH, KUMPF STEVEN W., QIAN JESSIE, FRANKS TANIA, LOPES SARAH, LIU JUNE: "Biodistribution and Tolerability of AAV-PHP.B-CBh- SMN1 in Wistar Han Rats and Cynomolgus Macaques Reveal Different Toxicologic Profiles", HUMAN GENE THERAPY, MARY ANN LIEBERT, INC. PUBLISHERS, GB, vol. 33, no. 3-4, 1 February 2022 (2022-02-01), GB , pages 175 - 187, XP093110400, ISSN: 1043-0342, DOI: 10.1089/hum.2021.116 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11732246B2 (en) Compositions useful in treatment of ornithine transcarbamylase (OTC) deficiency
TWI743442B (zh) 用於基因治療之經修飾的弗里德賴希（ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ）運動失調基因及載體
JP6322605B2 (ja) 組換えａａｖベクターの高力価ヘルパーなし調製物を生成するための方法
US7943374B2 (en) Super-size adeno-associated viral vector harboring a recombinant genome larger than 5.7 kb
JP2018537984A (ja) 脊髄性筋萎縮症の処置において有用なアデノ−関連ウイルスベクター
CN112225793B (zh) 一种溶酶体靶向肽及其融合蛋白、携带融合蛋白编码序列的腺相关病毒载体及其应用
KR20210076051A (ko) 간-특이적 유전자 대체 요법에 의한 중증 pku 치료를 위한 개선된 인간 pah의 생성
US20240067987A1 (en) Adeno-associated variants, formulations and methods for pulmonary delivery
US20230040603A1 (en) Compositions useful for treating gm1 gangliosidosis
WO2022164351A1 (en) Synergistic effect of smn1 and mir-23a in treating spinal muscular atrophy
WO2023219533A1 (ru) Аденоассоциированный вирусный вектор на основе серотипа aav.php.b и его применение
JP2023513487A (ja) Ｇｍ１ガングリオシドーシスを治療するのに有用な組成物
KR20210132095A (ko) 크라베병의 치료에 유용한 조성물
US11779655B2 (en) AAV-ABCD1 constructs and use for treatment or prevention of adrenoleukodystrophy (ALD) and/or adrenomyeloneuropathy (AMN)
RU2807158C2 (ru) Генотерапевтические конструкции для лечения болезни вильсона
US20220347317A1 (en) Aavrh74 vectors for gene therapy of muscular dystrophies
JP2007504219A (ja) 関節リウマチのインビボ遺伝子治療のためのａａｖベクター
WO2023133574A1 (en) Compositions and methods useful for treatment of c9orf72-mediated disorders
CN116648503A (zh) 通过肝导向基因替代疗法治疗pku的人pah表达盒

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23803923

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1