JP2023513487A - Ｇｍ１ガングリオシドーシスを治療するのに有用な組成物 - Google Patents

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Abstract

ＡＡＶカプシドと、ヒトβ－ガラクトシダーゼをコードする配列を含むベクターゲノムと、を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの投与を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスの治療に有用な治療レジメンが提供される。ｒＡＡＶベクターを含有する組成物、およびｒＡＡＶベクターの投与を含む、患者においてＧＭ１ガングリオシドーシスを治療する方法も提供される。【選択図】図１Ａ

Description

ＧＭ１ガングリオシドーシス（本明細書で以降ＧＭ１と称される）は、ＧＭ１ガングリオシドおよびケラタン硫酸の分解の第１のステップを触媒する酵素であるリソソーム酸ベータガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）をコードするＧＬＢ１遺伝子の変異によって引き起こされる常染色体劣性遺伝リソソーム蓄積症である（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ－Ｐｉｅｒｒｉ ａｎｄ Ｓｃａｇｌｉａ，２００８，ＧＭ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ：Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，９４：３９１－９６）。ＧＬＢ１遺伝子は、染色体３に位置しており、β－ｇａｌリソソーム酵素をコードする２．５ｋｂの転写産物およびエラスチン結合タンパク質（ＥＢＰ）をコードする２．０ｋｂの転写産物といった、２つの代替的にスプライシングされたｍＲＮＡをもたらす（Ｏｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．１９８８，Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１５７：２３８－４４、Ｍｏｒｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．１９８９，Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｍＲＮＡ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｃ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ａ ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６４：２０６５５－６３）。β－ｇａｌは、８５ｋＤａの前駆体として合成され、８８ｋＤａの形態へと翻訳後グリコシル化され、成熟６４ｋＤａリソソーム酵素へと処理される（Ｄ’Ａｚｚｏ ｅｔ ａｌ．１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｆｅｃｔ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ａｎｄ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｍａｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，７９：４５３５－３９）。リソソーム内で、酵素は、保護タンパク質カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）およびノイラミニダーゼヒドロラーゼと複合体化される。
残留β－ｇａｌをほとんど産生しないか、または全く産生しないＧＬＢ１対立遺伝子を保有する患者において、ＧＭ１ガングリオシドは、脳全体のニューロンに蓄積し、急速進行性の神経変性疾患を引き起こす（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ－Ｐｉｅｒｒｉ ａｎｄ Ｓｃａｇｌｉａ ２００８）。疾患の病因につながる分子機構はまだよく理解されていないが、仮説には、重大な神経細胞空胞変性の領域でのアストログリオーシスおよびミクログリオーシス、神経細胞アポトーシスを伴う、神経細胞死および脱髄（Ｔｅｓｓｉｔｏｒｅ ｅｔ ａｌ．２００４，ＧＭ１－Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｆｏｌｄｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｃａｕｓｅｓ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｅａｔｈ ｉｎ ａ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，１５：７５３－６６）、ミエリン欠損を引き起こす異常な軸索内輸送（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｏｒｎ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｔｈｅ ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ＧＭ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ：ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｉｃ ｌｏｓｓ ａｎｄ ａｘｏｎａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ，１０７：５３９－４５）、神経細胞－希突起神経膠細胞相互作用の撹乱（Ｆｏｌｋｅｒｔｈ １９９９，Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｗｈｉｔｅ Ｍａｔｔｅｒ ｉｎ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５８：８８７－９０２、Ｋａｙｅ ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｄｙｓｍｙｅｌｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＧＭ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ’，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，８：２５５－６１）、ならびに炎症応答（Ｊｅｙａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｓ ａ ｈａｌｌｍａｒｋ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ＧＭ１ ａｎｄ ＧＭ２ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ，Ｂｒａｉｎ，１２６：９７４－８７）が含まれる。
現時点で、ＧＭ１の疾患を改変する療法は存在しない。栄養チューブの配置、呼吸療法、および抗てんかん薬を含む支持ケアおよび対症療法が、現在の治療アプローチである（Ｊａｒｎｅｓ Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｅｓ：Ｍａｐｐｉｎｇ ａ ｔｉｍｅｌｉｎｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１２１：１７０－７９）。ＧＭ１およびＧＭ２患者において、グルコシルセラミドシンターゼ阻害剤であるミグルスタットによる基質合成抑制療法（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ、ＳＲＴ）が評価されている。ミグルスタットは、一般に、良好な耐容性であるが、症状管理または疾患進行において顕著な改善をもたらさず、一部の患者は、用量を制限する胃腸副作用を経験する（Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｒｅｇｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ）。ケトン食と組み合わせて使用する場合、ミグルスタットは、十分に耐容性であり、一部の患者で生存率を増加させることが示されている（Ｊａｒｎｅｓ Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。しかしながら、ミグルスタットを用いた無作為化対照研究は行われておらず、ミグルスタットはＧＭ１ガングリオシドーシスの治療用に承認されていないことに留意されたい。この疾患では、骨髄または臍帯血を用いた造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の実績は限られている。２型ＧＭ１を有する患者において行われた骨髄移植は、症状が出る前の幼若発症性ＧＭ１－ガングリオシドーシスを有する患者において白血球β－ガラクトシダーゼレベルを正常化したが、長期的な臨床転帰は改善されなかった（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ＧＭ１－ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ．２８（５）：７９７－７９８）。ＨＳＣＴの効果が遅いため、急速進行性の１型ＧＭ１疾患には好適ではない（Ｐｅｔｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｅｗａｒｄ，２００３，Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．３１：２２９）。パルボウイルスファミリーのメンバーであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、約４．７キロ塩基（ｋｂ）長の一本鎖直鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する小さな非エンベロープ型の正二十面体ウイルスである。野生型ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に逆位末端反復（ＩＴＲ）、ならびに２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるｒｅｐおよびｃａｐを含む。ｒｅｐは、ＡＡＶの生活環に必要なｒｅｐタンパク質をコードする４つの重複遺伝子から構成され、ｃａｐは、カプシドタンパク質の重複ヌクレオチド配列であるＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含有し、これらは自己集合して正十二面体対称のカプシドを形成する。
ＡＡＶは、Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に割り当てられており、これは、このウイルスが、精製されたアデノウイルスストック中の混入物質として発見されたからである。ＡＡＶの生活環には、感染後にＡＡＶゲノムが宿主染色体に特異的に組み込まれる部位である潜伏相と、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスのいずれかの感染後に、組み込まれたゲノムが、その後に感染性ウイルスへと救出、複製、およびパッケージングされる感染相とが含まれる。非分裂細胞を含め、非病原性の広範な宿主範囲の感染性、および潜在的な部位特異的染色体組み込みといった特性により、ＡＡＶは、遺伝子導入のための魅力的なツールとなる。
異常なＧＬＢ１遺伝子に関連する状態の治療のための代替療法が望まれる。
ＧＭ１ガングリオシドーシスに関連する症状を治療および／または減少させることを必要とするヒト患者においてそれを行うのに有用な、治療用の組換え（ｒ）複製欠損性アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が提供される。ｒＡＡＶは、望ましくは複製欠損性であり、標的化されたヒト細胞におけるその発現を指令する調節配列の制御下でヒト（ｈ）β－ガラクトシダーゼをコードするＧＬＢ１遺伝子を含むベクターゲノムを保有し、本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１と称され得る。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを含む。このｒＡＡＶは、本明細書ではｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１と称されるが、特定の場合では、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１ベクター、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＬＢ１、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＬＢ１ベクター、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１、またはＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１ベクターという用語は、同じ構築物を参照するために互換的に使用される。
一態様では、本明細書に提供されるのは、ヒト患者のＧＭ１ガングリオシドーシスの治療に有用な治療レジメンであって、レジメンが、ＡＡＶカプシドと、標的細胞におけるその発現を指令する調節配列の制御下でヒトβ－ガラクトシダーゼをコードする配列を含むベクターゲノムと、を有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの投与を含み、投与が、（ｉ）患者が約１ヶ月齢～約４ヶ月齢である、約１．６×１０１３～約１．６×１０１４ＧＣ、（ｉｉ）患者が少なくとも約４ヶ月齢～８ヶ月齢未満である、約２．１×１０１３～約２．１×１０１４ＧＣ、（ｉｉｉ）患者が少なくとも８ヶ月齢～最大１２ヶ月齢である、約２．６×１０１３～約２．６×１０１４ＧＣ、または（ｉｖ）患者が少なくとも１２ヶ月齢である、約３．２×１０１３～約３．２×１０１４ＧＣを含む単回用量の大槽内（ＩＣＭ）注射を含む、治療レジメンである。特定の実施形態では、ヒトβ－ガラクトシダーゼコード配列は、配列番号８、配列番号７、配列番号６、もしくは配列番号５に示されるヌクレオチド配列、または配列番号４のアミノ酸２４～６７７の成熟β－ガラクトシダーゼをコードする、配列番号８、配列番号７、配列番号６、もしくは配列番号５のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む。特定の実施形態では、コードされるヒトβ－ガラクトシダーゼは、（ａ）配列番号４の約アミノ酸１～６７７、および（ｂ）配列番号４の約アミノ酸２４～６７７に融合した異種リーダー配列を含む合成ヒト酵素から選択される配列を有する。さらなる実施形態では、ベクターゲノムはまた、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターに由来する調節エレメント、キメライントロン、ポリＡシグナル、および／または３’ＩＴＲ配列を含む。特定の実施形態では、患者は、１型（乳児）ＧＭ１または２ａ型（後期乳児）ＧＭ１を有すると特定されている。特定の実施形態では、レジメンは、ｒＡＡＶの送達の少なくとも１日前または当日の、少なくとも１つの免疫抑制性併用療法の患者への投与を含む。免疫抑制性併用療法は、１つ以上のコルチコステロイド、任意選択的に経口プレドニゾロンを含み得る。特定の実施形態では、免疫抑制性併用療法は、ｒＡＡＶの投与後少なくとも３～４週間継続する。特定の実施形態では、治療の有効性は、発作の発症の遅れ、発作の頻度の低減、血清および／または脳脊髄液中のβ－ガラクトシダーゼ、ならびに磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって測定される脳組織の体積変化のうちの１つ以上によって評価される。
一態様では、本明細書で提供されるのは、組成物であって、ＡＡＶカプシドと、ヒトβ－ガラクトシダーゼコード配列を含むベクターゲノムと、標的細胞におけるその発現を指令する発現制御配列と、を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを含み、ｒＡＡＶベクターが、それを必要とするヒト対象に、（ｉ）患者が約１ヶ月齢～約４ヶ月齢である、約１．６×１０１３～約１．６×１０１４ＧＣ、（ｉｉ）患者が少なくとも約４ヶ月齢～８ヶ月齢未満である、約２．１×１０１３～約２．１×１０１４ＧＣ、（ｉｉｉ）患者が少なくとも８ヶ月齢～最大１２ヶ月齢である、約２．６×１０１３～約２．６×１０１４ＧＣ、または（ｉｖ）患者が少なくとも１２ヶ月齢である、約３．２×１０１３～約３．２×１０１４ＧＣの用量を投与するための大槽内（ＩＣＭ）注射のために製剤化される。特定の実施形態では、ヒトβ－ガラクトシダーゼコード配列は、配列番号８、配列番号７、配列番号６、もしくは配列番号５に示されるヌクレオチド配列、または配列番号４のアミノ酸２４～６７７の成熟β－ガラクトシダーゼをコードする、配列番号８、配列番号７、配列番号６、もしくは配列番号５のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む。さらなる実施形態では、ベクターゲノムはまた、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターに由来する調節エレメント、キメライントロン、ポリＡシグナル、および／または３’ＩＴＲ配列を含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、脳質量１グラム当たり３．３３×１０１０ＧＣ～脳質量１グラム当たり３．３３×１０１１ＧＣを送達するように懸濁液の状態で製剤化され、任意選択的に、投与用量の体積が、約３．０ｍＬ～約５．０ｍＬである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、６～９のｐＨを有する製剤緩衝液中にあり、任意選択的に、ｐＨが約７．２である。特定の実施形態では、組成物は、ｒＡＡＶの送達の少なくとも１日前または当日の、少なくとも１つの免疫抑制剤の患者への投与を含む併用療法に使用するためのものである。免疫抑制剤は、コルチコステロイド、任意選択的に経口送達されるプレドニゾロンであり得る。
一態様では、本明細書で提供されるのは、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する患者を治療する方法であって、本方法が、単回用量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を患者に大槽内（ＩＣＭ）注射によって投与することを含み、ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドと、標的細胞におけるその発現を指令する調節配列の制御下でヒトβ－ガラクトシダーゼをコードする配列を含むベクターゲノムと、を含み、単回用量が、患者の推定脳質量１グラム当たり１×１０１０ＧＣ～３．４×１０１１ＧＣである、方法である。特定の実施形態では、患者は、１８ヶ月齢以前にＧＭ１症状を発症する。特定の実施形態では、患者は、６ヶ月齢以下でＧＭ１症状を発症する。特定の実施形態では、患者は、６～１８ヶ月齢でＧＭ１症状を発症する。特定の実施形態では、患者は、１型（乳児）ＧＭ１を有する。他の実施形態では、患者は、２ａ型（後期乳児）ＧＭ１を有する。特定の実施形態では、対象は、少なくとも４ヶ月齢、４～３６ヶ月齢、４～２４ヶ月齢、６～３６ヶ月齢、６～２４ヶ月齢、１２～３６ヶ月齢、または１２～２４ヶ月齢である。特定の実施形態では、単回用量は、患者の推定脳質量１グラム当たり３．３×１０１０ＧＣである。特定の実施形態では、単回用量は、２．１×１０１３～２．５×１０１３ＧＣのｒＡＡＶまたは２．６×１０１３～３．１×１０１３ＧＣのｒＡＡＶである。特定の実施形態では、単回用量は、３．２×１０１３～４．５×１０１３ＧＣのｒＡＡＶである。特定の実施形態では、単回用量は、患者の推定脳質量１グラム当たり１．１１×１０１１ＧＣである。特定の実施形態では、単回用量は、６．８×１０１３～８．６×１０１３ＧＣのｒＡＡＶ、８．７×１０１３～０．９×１０１４ＧＣのｒＡＡＶ、または１．０×１０１４～１．５×１０１４ＧＣのｒＡＡＶである。特定の実施形態では、患者は、４～８ヶ月齢であり、単回用量は、２．１×１０１３ＧＣのｒＡＡＶである。特定の実施形態では、患者は、４～８ヶ月齢であり、単回用量は、６．８×１０１３ＧＣのｒＡＡＶである。特定の実施形態では、患者は、８～１２ヶ月齢であり、単回用量は、２．６×１０１３ＧＣのｒＡＡＶである。特定の実施形態では、患者は、８～１２ヶ月齢であり、単回用量は、８．７×１０１３ＧＣのｒＡＡＶである。特定の実施形態では、患者は、少なくとも１２ヶ月齢であり、単回用量は、３．２×１０１３ＧＣのｒＡＡＶである。特定の実施形態では、患者は、少なくとも１２ヶ月齢であり、単回用量は、１．０×１０１４ＧＣのｒＡＡＶである。特定の実施形態では、本方法は、造血幹細胞移植のステップをさらに含む。特定の実施形態では、本方法は、患者にステロイドを投与するステップをさらに含む。ステロイドは、コルチコステロイドであり得る。特定の実施形態では、本方法は、少なくとも２１日間にわたるステロイドの毎日投与を含む。特定の実施形態では、本方法は、３０日間にわたるステロイドの毎日投与を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号８、配列番号７、配列番号６、もしくは配列番号５に示されるヌクレオチド配列、または配列番号４のアミノ酸２４～６７７の成熟β－ガラクトシダーゼをコードする、配列番号８、配列番号７、配列番号６、もしくは配列番号５のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む、ヒトβ－ガラクトシダーゼをコードする配列を含む。ヒトβ－ガラクトシダーゼは、配列番号４のアミノ酸配列、またはその機能性断片を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５から選択される配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５と少なくとも９５％同一の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターに由来する調節エレメント、キメライントロン、ポリＡシグナル、および／または３’ＩＴＲ配列をさらに含む。
一態様では、本明細書で提供されるのは、単位剤形の薬学的組成物であって、緩衝液中に１×１０１３ＧＣ～５×１０１４の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含み、ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドと、標的細胞におけるその発現を指令する調節配列の制御下でヒトβ－ガラクトシダーゼをコードする配列を含むベクターゲノムと、を含む、薬学的組成物である。特定の実施形態では、組成物は、大槽内（ＩＣＭ）注射のために製剤化される。特定の実施形態では、緩衝液は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、およびポロキサマー１８８を含む。さらなる実施形態では、緩衝液は、１ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭの塩化カリウム、１．４ｍＭの塩化カルシウム、０．８ｍＭの塩化マグネシウム、および０．００１％のポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、組成物は、２．１×１０１３～２．５×１０１３ＧＣのｒＡＡＶ、２．６×１０１３～３．１×１０１３ＧＣのｒＡＡＶ、３．２×１０１３～４．５×１０１３ＧＣのｒＡＡＶ、６．８×１０１３～８．６×１０１３ＧＣのｒＡＡＶ、８．７×１０１３～０．９×１０１４ＧＣのｒＡＡＶ、または１．０×１０１４～１．５×１０１４ＧＣのｒＡＡＶを含む。提供される薬学的組成物は、配列番号８、配列番号７、配列番号６、もしくは配列番号５に示されるヌクレオチド配列、または配列番号４のアミノ酸２４～６７７の成熟β－ガラクトシダーゼをコードする、配列番号８、配列番号７、配列番号６、もしくは配列番号５のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む、ヒトβ－ガラクトシダーゼをコードする配列を有するベクターゲノムを有するｒＡＡＶを含む。特定の実施形態では、ヒトβ－ガラクトシダーゼは、配列番号４のアミノ酸配列、またはその機能性断片を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５から選択される配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５と少なくとも９５％同一の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターに由来する調節エレメント、キメライントロン、ポリＡシグナル、および／または３’ＩＴＲ配列を含む。
本発明のこれらの態様および他の態様は、以下の本発明の詳細な説明から明らかになる。
５’ＩＴＲ、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、キメライントロン、ヒトβ－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）をコードするＧＬＢ１遺伝子、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル、および３’ＩＴＲを示すＡＡＶベクターゲノム（すなわち、「ＡＡＶｈｕ６８．Ｕｂｃ．ｈＧＬＢ１ｃｏ．ＳＶ４０」）の概略図を提供する。 シスプラスミドによって保有されるＡＡＶベクターゲノムを含有するシスプラスミドｐＡＡＶ．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１ｃｏ．ＳＶ４０．ＫａｎＲの概略図を提供する。ＧＬＢ１：β－ガラクトシダーゼ、ＩＴＲ：逆位末端反復、ＫａｎＲ：カナマイシン耐性、Ｏｒｉ：複製起点、ポリＡ：ポリアデニル化、およびＵｂＣ：ユビキチンＣ。 ４つのタンパク質をコードする全長ＡＡＶ２複製酵素（ＡＡＶ２ Ｒｅｐ）およびＡＡＶｈｕ６８ ＶＰ１カプシド遺伝子（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質をコードする）のコード配列を含むトランスプラスミドの概略図を提供する。ＡＡＶ２：アデノ随伴ウイルス血清型２、ＡＡＶｈｕ６８：アデノ随伴ウイルス血清型ｈｕ６８、Ｃａｐ：カプシド、ＫａｎＲ：カナマイシン耐性、Ｏｒｉ：複製起点、およびＲｅｐ：複製酵素。 異なるプロモーターを使用してヒトβ－ｇａｌを発現するｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１で治療された野生型マウスのそれぞれ脳および脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるβ－ｇａｌ活性を示す。野生型マウスは、ＣＢ７、ＥＦ１ａまたはＵｂＣプロモーターからヒトＧＬＢ１を発現するｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の単回脳室内（ＩＣＶ）注射により治療された（１群当たりｎ＝１０）。未治療の野生型マウス（ｎ＝５）は、対照として機能した。ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１投与から１４日後に脳（前頭皮質）およびＣＳＦを採取し、蛍光発生基質を使用してβ－ｇａｌ活性を測定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、クラスカル・ウォリス検定、その後、ダン検定。 ＧＬＢ１ノックアウトマウス研究における血清および末梢臓器のβ－ｇａｌ活性を示す。ＧＭ１のＧＬＢ１ノックアウトマウスモデル（ＧＬＢ１遺伝子にホモ接合性変異を保有するマウス、またはＧＬＢ１－／－マウス）を使用して、前臨床試験を行った。この試験は、ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１で治療されたＧＬＢ１－／－マウス、ビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水、またはＰＢＳ）で治療されたＧＬＢ１－／－マウス、およびヘテロ接合体ＧＬＢ１変異担体である無疾患マウス、またはビヒクルで治療されたＧＬＢ１＋／－マウスを比較した。この試験では、すべてのマウスを、１ヶ月齢で治療し、典型的にはＧＭ１マウスが進行性疾患を有する乳児ＧＭ１患者と同様の脳ＧＭ１ガングリオシドレベルに関連する顕著な歩行異常を発症する時期である４ヶ月齢まで観察した。すべてのマウスを、いずれかの試験ベクター（以下の図でＡＡＶとして示される）またはビヒクルのいずれかの脳室内（またはＩＣＶ）注射で治療した。治療から９０日後、すべての動物を安楽死させ、組織学的分析および生化学的分析のために、組織を回収した（剖検と称される）。血清β－ｇａｌ活性を、治療前および治療後の様々な時点（０、１０、２８、６０、および９０日目）で測定した。剖検時に、脳、ＣＳＦおよび末梢臓器におけるβ－ｇａｌ活性を評価した。β－ｇａｌ活性を、蛍光発生基質を使用して、血清（図３Ａ）、ならびに肺（図３Ｂ）、肝臓（図３Ｃ）、心臓（図３Ｄ）および脾臓（図３Ｅ）試料でそれぞれ測定した。ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水（ビヒクル）、ＡＡＶ：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリス検定、その後、ダン検定。ＮＳ：有意差なし。図３Ａは、ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１治療されたＧＬＢ１－／－マウスが、ビヒクル治療されたＧＬＢ１－／－マウスよりも実質的に高い治療後の血清β－ｇａｌ活性を有し、ビヒクル治療されたヘテロ接合性対照マウスと同様のβ－ｇａｌ活性を有していたことを示す。すべてのＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１治療マウスについて、治療後短期間で、ナノモル／ミリリットル／時間、またはｎｍｏｌ／ｍｌ／時間で測定した血清β－ｇａｌ活性の上昇を達成し、２匹のＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１治療マウスを除くすべての試験全体を通してこれが持続し、この２匹は、両方ともヒトβ－ｇａｌに対する抗体を示した。図３Ｂ～３Ｅは、剖検後の肺、肝臓、心臓、および脾臓におけるβ－ｇａｌ活性を示す。各臓器において、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１ ＧＬＢ１－／－マウスにおけるβ－ｇａｌ活性は、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスにおける活性レベルを上回った。このデータは、末梢臓器に修正したβ－ガル酵素活性を提供するｈＧＬＢ１の可能性を裏付けており、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１ベクターによる治療は、ＧＭ１患者で観察されたＣＮＳおよび末梢の両方の徴候に対処することができることを示唆している。 ナノモル／ミリグラム／時間、またはｎｍｏｌ／ｍｇ／時間で測定した脳、および剖検後のＣＳＦにおけるβ－ｇａｌ活性を示す。ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１治療マウスにおけるβーｇａｌ活性は、脳およびＣＳＦの両方において、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスを上回った。剖検で脳（前頭皮質）およびＣＳＦを採取し、蛍光発生基質を使用してβ－ｇａｌ活性を測定した。ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水（ビヒクル）、ＡＡＶ：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリス検定、その後、ダン検定。ＮＳ：有意差なし。統計的有意性は重要であり、本明細書で使用される場合、ｐ値で示される。ｐ値は、報告された結果が純粋に偶然によって達成された確率である（例えば、ｐ値＜０．００１は、観察された変化が純粋に偶然に起因するものである可能性が０．１％未満であることを意味する）。一般に、０．０５未満のｐ値は、統計的に有意であるとみなされる。 ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１治療ＧＬＢ１－／－マウスの脳におけるヘキソサミニダーゼ（ＨＥＸ）活性の減少を示す。剖検で脳（前頭皮質）を採取し、蛍光発生基質を使用して、ＨＥＸ活性を測定した。ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水（ビヒクル）、ＡＡＶ：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリス検定、その後、ダン検定。ＮＳ：有意差なし。剖検後に、生化学的アッセイおよび組織学的アッセイを使用して、脳の異常の修正を評価した。リソソーム酵素は、リソソーム蓄積症において頻繁に上方制御され、その観察結果は、ＧＭ１患者において確認されている。したがって、脳溶解物中のリソソーム酵素ＨＥＸの活性を測定した。この図は、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１治療ＧＬＢ１－／－マウスにおけるＨＥＸの活性が、ＧＬＢ１＋／－対照マウスと比較して正常化された一方で、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－は、総ＨＥＸ活性の上昇を示したことを示す。 β－ｇａｌ活性と抗β－ｇａｌ抗体との間の相関関係を示す。剖検時に、ＡＡＶ治療マウスから採取した血清試料中のβ－ｇａｌ活性および血清抗β－ｇａｌ抗体を測定した。各点は、個々の動物を表す。 ＡＡＶ治療ＧＬＢ１－／－マウスにおける歩行異常の修正を示す。図７Ａおよび７Ｂは、平均５ヶ月齢の未治療ＧＬＢ１－／－マウス（ｎ＝１２）およびＧＬＢ１＋／－対照（ｎ＝２２）が、２日連続でＣａｔＷａｌｋを使用して評価されたことを示す。少なくとも３回の試行にわたって、各動物について、平均歩行速度（図７Ａ）および後肢の足跡長（図７Ｂ）を定量化した。＊＊ｐ＜０．０１ マン・ホイットニー検定。図７Ｃおよび７Ｄは、４ヶ月齢の未治療ＧＬＢ１＋／－マウス（ｎ＝１５）およびビヒクルで治療されたＧＬＢ１－／－（ｎ＝１５）マウス、ならびにＡＡＶ治療ＧＬＢ１－／－マウス（ｎ＝１４）が、ＣａｔＷａｌｋを使用して評価されたことを示す。少なくとも３回の試行にわたって、試験の２日目に、各動物について、平均歩行速度（図７Ｃ）および後肢の足跡長（図７Ｄ）を定量化した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリス検定、その後、ダン検定。ＮＳ：有意差なし。図７Ｅ～Ｇは、ＡＡＶ治療ＧＬＢ１－／－マウス（図７Ｇ）およびビヒクル治療ＧＬＢ１＋／－（図７Ｅ）およびＧＬＢ１－／－（図７Ｆ）対照についての代表的な後肢の足跡を示す。 歩行速度と歩行パラメータとの間の相関関係を示す。ＧＬＢ１＋／－対照（ｎ＝２２）を、ＣａｔＷａｌｋシステムを使用して２日連続で評価した。試験２日目の少なくとも３回の試行で測定された歩行パラメータが記録された。相関分析は、歩行速度と、歩幅長などの歩行パラメータとの間の強い相関関係を実証した（スピアマンｒ＝０．７４３２、ｐ＜０．００１、図８Ａ）。対照的に、後肢の足跡長は速度に依存しなかった（スピアマンｒ＝－０．１２３９、ｐ＝０．４２３、図８Ｂ）。 ＩＣＶ注射によって４つの用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１（１．３×１０１１ＧＣ、４．４×１０１０ＧＣ、１．３×１０１０ＧＣもしくは４．４×１０９ＧＣ）またはビヒクルのうちの１つを受けたＧＬＢ１－／－マウスのβ－ｇａｌ活性（図９Ａ）、体重（図９Ｂ）、神経学的検査スコア（神経検査スコア、図９Ｃ）、後肢の足跡長（図９Ｄ）、およびスイング時間（図９Ｅ）ならびに後肢の歩幅長（図９Ｆ）を提供する。ビヒクル（Ｈｅｔ＋ビヒクル）を投与されるＧＬＢ１＋／－マウスは、対照として機能する。さらなる詳細は、実施例４のセクションＡで提供される。図９Ｇは、最大用量のｒＡＡＶを投与されたＧＬＢ１－／－マウスにおける血清中の平均β－ｇａｌ活性を示す。ＧＬＢ１は、正常なビヒクル治療ＧＬＢ１＋／－対照のおよそ１０倍高かった。２番目に高い用量のｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１で、ＧＬＢ１－／－マウスにおける血清β－ｇａｌ活性は、正常なビヒクル治療ＧＬＢ１＋／－対照のものと類似していた。すべての他のｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１用量のＧＬＢ１－／－マウスにおける血清β－ｇａｌ活性は、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－対照のものと類似していた。 ＡＡＶｈｕ６８（配列番号２）のｖｐ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列（アラインメントにおいてｈｕ６８．ｖｐ１とラベル付けされる）と、ＡＡＶ９（配列番号２０）、ＡＡＶｈｕ３１（アラインメントにおいてｈｕ．３１とラベル付けされる、配列番号２１）、およびＡＡＶｈｕ３２（アラインメントにおいてｈｕ．３２とラベル付けされる、配列番号２２）とのアラインメントを提供する。ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ３１およびＡＡＶｈｕ３２と比較して、２つの変異（Ａ６７ＥおよびＡ１５７Ｖ）がＡＡＶｈｕ６８において重要であることが見出され、図１０Ａにおいて、丸く囲んである。 ＡＡＶｈｕ６８（配列番号１）のｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列と、ＡＡＶ９（配列番号２３）、ＡＡＶｈｕ３１（配列番号２４）、およびＡＡＶｈｕ３２（配列番号２５）とのアラインメントを提供する。 ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１原薬を生産するための製造プロセスの例示的なフローチャートを提供する。ＡＥＸ：アニオン交換、ＣＲＬ：Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｄｄＰＣＲ：ドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応、ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地、ＤＮＡ：デオキシリボ核酸、ＦＦＢ：最終製剤緩衝液、ＧＣ：ゲノムコピー、ＨＥＫ２９３：ヒト胚性腎臓２９３細胞、ＩＴＦＦＢ：髄腔内最終製剤緩衝液、ＰＥＩ：ポリエチレンイミン、Ｐｈ．Ｅｕｒ．：欧州薬局方、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＴＦＦ：接線流濾過、ＵＳＰ：米国薬局方、ＷＣＢ：作業用細胞バンク。 ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１薬物製品を生産するための製造プロセスの例示的なフローチャートを提供する。Ａｄ５：アデノウイルス血清型５、ＡＵＣ：分析用超遠心分離、ＢＤＳ：バルク原薬、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、ＣＺ：Ｃｒｙｓｔａｌ Ｚｅｎｉｔｈ、ｄｄＰＣＲ：液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応、Ｅ１Ａ：初期領域１Ａ（遺伝子）、ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ、ＦＤＰ：最終薬物生成物、ＧＣ：ゲノムコピー、ＨＥＫ２９３：ヒト胚性腎臓２９３細胞、ＩＴＦＦＢ：髄腔内最終製剤緩衝液、ＫａｎＲ：カナマイシン耐性（遺伝子）、ＭＳ：質量分析、ＮＧＳ：次世代配列決定、Ｐｈ．Ｅｕｒ．：欧州薬局方、ｑＰＣＲ：定量的ポリメラーゼ連鎖反応、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＴＣＩＤ５０：５０％組織培養感染用量、ＵＰＬＣ：超高性能液体クロマトグラフィー、ＵＳＰ：米国薬局方。 ＫＯに対するビヒクル対照およびヘテロ接合マウスに対するビヒクル対照を有する、１．３×１０１１ＧＣ、４．４×１０１０ＧＣ、１．３×１０１０ＧＣ、および４．４×１０９ＧＣの用量での、３００日目までの試験における各コホートの生存データを示す。 各神経学的評価期間の時点での各コホートの平均総重症度スコアを示す。図１４Ａは、歩幅長（ｃｍ）を提供する。図１４Ｂは、後肢の足跡長（ｃｍ）を提供する。図１４Ｃは、神経学的検査の総スコアを提供する。 ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１治療ＧＬＢ１－／－マウス、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウス、およびビヒクル治療ＧＬＢ１＋／－対照マウスの脳切片を、ベースライン（図１５Ａ、１日目、１ヶ月齢）１５０日目（図１５Ｂ）および３００日目（図１５Ｃ）で比較する組織学的分析も行われ、その結果を提供する。 図１６Ａは、血清β－ｇａｌ活性（ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間）を提供し、図１６Ｂは、β－ｇａｌ活性が、評価したすべてのマウスのＣＳＦにおいて検出可能であったことを示す。試験したｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１の２つの最大用量を投与したＧＬＢ１－／－マウスは、正常なビヒクル治療ＧＬＢ１＋／－対照のものを上回る平均ＣＳＦ β－ｇａｌ活性レベルを示した。ＣＳＦにおけるβ－ｇａｌ活性は、一般に用量依存的であったが、２つの最小用量群においてβ－ｇａｌ活性は類似しているように見えた。 試験ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１治療ＧＬＢ１－／－マウスおよびビヒクル治療対照の脳（図１７Ａ、１５０日目および図１７Ｂ、３００日目）、心臓（図１７Ｃ、１５０日目および図１７Ｄ、３００日目）、肝臓（図１７Ｅ、１５０日目および図１７Ｆ、３００日目）、脾臓（図１７Ｇ、１５０日目および図１７Ｈ、３００日目）、肺（図１７Ｉ、１５０日目および図１７Ｊ、３００日目）、または腎臓（図１７Ｋ、図１５０日目および図１７Ｌ、３００日目）におけるβ－ガラクトシダーゼ活性を評価する結果を示す。β－ｇａｌは、評価したすべてのマウスのＣＳＦにおいて検出可能であった。試験したｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１の２つの最大用量を投与したＧＬＢ１－／－マウスは、正常なビヒクル治療ＧＬＢ１＋／－対照のものを上回る平均ＣＳＦ β－ｇａｌ活性レベルを示した。ＣＳＦにおけるβ－ｇａｌ活性は、一般に用量依存的であったが、２つの最小用量群においてβ－ｇａｌ活性は類似しているように見えた。 組織学的分析および０（なし）～５（重度）の病変の重症度のスコアリングによって測定されるような、１２０日目における背側根神経節（ＤＲＧ）および脊髄病変の重症度を示す。矢印は、感覚神経活動電位が低下した、最も重度の軸索損失および線維症を示した２匹の動物について描かれている。 組織学的分析および０（なし）～５（重度）の病変の重症度のスコアリングによって測定されるような、１２０日目における正中神経軸索変性症および正中神経軸索周囲線維症を示す。矢印は、感覚神経活動電位が低下した、最も重度の軸索損失および線維症を示した２匹の動物について描かれている。 マイクロボルト（ＭＶ）単位での正中感覚活動電位によって測定されるような、１２０日目までの試験中の各測定点における正中感覚神経伝導の変化を示す。 両側正中神経感覚活動電位振幅（ＳＮＡＰ）および伝導速度の結果を示す。幼若ＮＨＰは、３．０×１０１２ＧＣ（低用量）、１．０×１０１３ＧＣ（中用量）、または３．０×１０１３ＧＣ（高用量）（Ｎ＝３／群）の用量で、ビヒクル（ＩＴＦＦＢ、Ｎ＝２／群）またはｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１試験ベクターのいずれかの単一のＩＣＭ投与を受けた。感覚神経伝導試験を、ＢＬおよび２８±３、６０±３、９０±４、および１２０±４日目に実施した。左右の正中神経のＳＮＡＰ振幅および伝導速度を提示する。略語：ＢＬ：ベースライン、ＧＣ：ゲノムコピー、ＩＣＭ：大槽内、ＩＴＦＦＢ：髄腔内最終製剤緩衝液、Ｎ：動物数、ＮＨＰ：非ヒト霊長類、ＳＮＡＰ：感覚神経活動電位。 ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１試験ベクターまたはビヒクルで治療したＮＨＰのＣＳＦおよび血清におけるヒトβ－ガラクトシダーゼ活性の結果を示す。幼若ＮＨＰは、３．０×１０１２ＧＣ（低用量）、１．０×１０１３ＧＣ（中用量）、または３．０×１０１３ＧＣ（高用量）（Ｎ＝３／群）の用量で、ビヒクル（ＩＴＦＦＢ、Ｎ＝２／群）またはｒＡＡＶ．ＧＬＢ１のいずれかの単一のＩＣＭ投与を受けた。ＣＳＦおよび血清を、示された日に採取し、ヒトβ－ｇａｌ活性について分析した。破線は、ベースラインの内因性β－ｇａｌ活性レベルを表す。図２２Ａは、ＣＳＦのβ－ｇａｌ活性を示す。図２２Ｂは、血清のβ－ｇａｌ活性を示す。図２２Ｃおよび２２Ｄは、１４日目の結果の拡大図を示す。白抜きの形状は、治療時に、ベクターカプシドに対して、血清循環ＮＡｂについて陰性であった動物を示す。黒色の形状は、治療時に、ベクターカプシドに対して、血清循環ＮＡｂについて陽性であった動物を示す。略称：β－ｇａｌ：β－ガラクトシダーゼ、ＢＬ：ベースライン、ＧＣ：ゲノムコピー、ＩＣＭ：大槽内、ＩＴＦＦＢ：髄腔内最終製剤緩衝液、Ｎ：動物数、ＮＡｂ：中性抗体、ＮＨＰ：非ヒト霊長類、ＳＥＭ：平均の標準誤差。 ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１のＮＨＰへのＩＣＭ投与後６０日目のベクター生体内分布を提供する。示される組織を、３．０×１０１２ＧＣ（低用量）、１．０×１０１３ＧＣ（中用量）、または３．０×１０１３ＧＣ（高用量）（Ｎ＝３／群）の用量で、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１の単回ＩＣＭ投与後６０日目の幼若ＮＨＰから剖検時に採取した。また、ビヒクル（ＩＴＦＦＢ）治療ＮＨＰ（Ｎ＝２）から対照として組織を採取した。各棒グラフは、ＤＮＡ１μｇ当たり検出された平均ベクターゲノムを表す。誤差バーは、ＳＥＭを表す。ＬＯＤは、５０ＧＣ／μｇＤＮＡであった。略語：ＤＮＡ：デオキシリボ核酸、ＧＣ：ゲノムコピー、ＩＣＭ：大槽内、ＩＴＦＦＢ：髄腔内最終製剤緩衝液、ＬＯＤ：検出限界、Ｎ：動物数、ＮＨＰ：非ヒト霊長類、ＳＥＭ：平均の標準誤差。 ｒＡＡＶ．ｈＧＢＬ１のＮＨＰへのＩＣＭ投与後１２０日間のベクター生体内分布を提供する。示される組織を、３．０×１０１２ＧＣ（低用量）、１．０×１０１３ＧＣ（中用量）、または３．０×１０１３ＧＣ（高用量）（Ｎ＝３／群）の用量で、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１の単回ＩＣＭ投与１２０日目の若年ＮＨＰから剖検時に採取した。また、ビヒクル（ＩＴＦＦＢ）治療ＮＨＰ（Ｎ＝２）から対照として組織を採取した。各棒グラフは、ＤＮＡ１μｇ当たり検出された平均ベクターゲノムを表す。誤差バーは、ＳＥＭを表す。ＬＯＤは、５０ＧＣ／μｇＤＮＡであった。略語：ＤＮＡ：デオキシリボ核酸、ＧＣ：ゲノムコピー、ＩＣＭ：大槽内、ＩＴＦＦＢ：髄腔内最終製剤緩衝液、ＬＯＤ：検出限界、Ｎ：動物数、ＮＨＰ：非ヒト霊長類、ＳＥＭ：平均の標準誤差。
ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１）を治療するための、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく組成物および方法が本明細書に提供される。ＡＡＶｈｕ６８カプシドを有し、ヒトβ－ガラクトシダーゼ酵素をコードする正常なＧＬＢ１遺伝子を有するベクターゲノムを保有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）（ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１）の有効量のゲノムコピー（ＧＣ）が患者に送達される。望ましくは、このｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１は、水性緩衝液とともに製剤化される。特定の実施形態では、懸濁液は、髄腔内注射に好適である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１は、ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１（ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１とも称される）であり、ＧＬＢ１遺伝子（すなわち、β－ガラクトシダーゼ（本明細書で使用される場合、ＧＬＢ１酵素、β－ｇａｌ、またはガラクトシダーゼとも称される）コード配列）は、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）に由来するプロモーターを含む調節配列の制御下にある。特定の実施形態では、本組成物は、大槽内注射（ＩＣＭ）注射を介して送達される。
本明細書でＡＡＶｈｕ６８と称される系統群Ｆのアデノ随伴ウイルスのカプシドをコードする核酸配列は、ＡＡＶｈｕ６８カプシドおよびベクターゲノムを保有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の産生に利用される。本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」という用語は、ウイルスカプシド（例えば、ＡＡＶカプシド）にパッケージングされ、宿主細胞または患者の細胞に送達可能である核酸分子を指す。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’および３’最末端でベクターゲノムをＡＡＶカプシドにパッケージングするのに必要な逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を有し、それらの間に、その発現を指令する配列に作動可能に連結された本明細書に記載のＧＬＢ１遺伝子を含有する、発現カセットである。ＡＡＶｈｕ６８に関連する追加の詳細は、ＷＯ２０１８／１６０５８２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）およびこの詳細な説明に提供される。本明細書に記載のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１は、ＧＬＢ１遺伝子を含むベクターゲノムを、脳、海馬、運動皮質、小脳、および運動ニューロンを含む中枢神経系（ＣＮＳ）内の細胞に送達するのに非常に好適である。これらのｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１は、ＣＮＳ内の他の細胞、ならびにＣＮＳ外の特定の他の組織および細胞を標的にするために使用され得る。代替的に、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ベクターゲノムをＣＮＳに送達するのにも好適な別のカプシド、例えば、ＡＡＶｃｙ０２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ０８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｂｂ０１、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶ１、ＡＡＶｈｕ４８、ＡＡＶｃｙ０５、ＡＡＶｈｕ１１、ＡＡＶｈｕ３２、またはＡＡＶｐｉ０２によって置き換えられ得る。
Ｉ．ＧＭ１および治療用ＧＬＢ１遺伝子
ＧＭ１ガングリオシドーシス（すなわち、ＧＭ１）は、臨床表現型に基づいて、以下の３つの型に分類することができる。（１）出生から６ヶ月までに発症し、筋緊張低下、重度の中枢神経系（ＣＮＳ）変性を伴う急速進行性であり、１～２歳までに死亡する、１型または幼児形態、（２）７ヶ月～３歳までに発症し、運動および認知発達の遅れがあり、進行がより遅い、２型の後期幼児または幼若型、ならびに（３）後期に発症し（３～３０歳）、尾状核におけるスフィンゴ糖脂質の局所沈着に起因する進行性錐体外路障害を伴う、３型の成人または慢性バリアント（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ－Ｐｉｅｒｒｉ ａｎｄ Ｓｃａｇｌｉａ，２００８．ＧＭ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ：Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，９４：３９１－９６）。６ヶ月齢以前に症状が発症した乳児ＧＭ１対象は、運動障害および認知障害の両方の迅速かつ予測可能な進行を一様に示す。患者の大部分は、生後数年以内に死亡する（生存期間の中央値は４６ヶ月、Ｊａｒｎｅｓ Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。共通の基礎となる病態生理にもかかわらず、成人型（３型）のＧＭ１表現型は可変であり、疾患の経過は顕著に軽度である。３型ＧＭ１の患者のほとんどは、最初に小児後期に神経学的症状を発症し、その後の成人期における進行はほとんど見られなかった。
各々の型の重症度は、ＧＬＢ１遺伝子によってコードされるβ－ｇａｌ酵素の残留活性と逆相関関係にある（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ－Ｐｉｅｒｒｉ ａｎｄ Ｓｃａｇｌｉａ，２００８）。ヒトにおいて、１３０を超える疾患を引き起こすＧＬＢ１変異が特定されてきた（Ｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ａｌｌｅｌｅｓ ｉｎ ＧＭ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｅａｒｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ＧＬＢ１ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．７８（３）：２３６－２４６、およびＣａｃｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｍ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍｏｒｑｕｉｏ Ｂ ｄｉｓｅａｓｅ：Ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｉｎｄｉｎｇｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ （ＢＢＡ）－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ．１８１２（７）：７８２－７９０）。いくつかのＧＬＢ１変異は、遺伝的および生化学的に分析されており、臨床表現型と相関関係にあるが（Ｇｕｒｕｒａｊ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ａｎｄ Ｎｏｖｅｌ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＧＭ１ Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０（１）：５７－６０、Ｃａｃｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１、およびＳｐｅｒｂ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｒａｚｉｌｉａｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＧＭ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ．Ｇｅｎｅ．５１２（１）：１１３－１１６）、多くのＧＬＢ１変異は、依然として特性決定されていない。広義には、患者の遺伝子型は、様々な量の残留酵素活性をもたらすが、一般的にいえば、残留酵素活性が高いほど、表現型は、より軽度である（Ｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８，ＳＡＡＭＰ ２．０：Ａｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔ ｇｅｎｏｔｙｐｅ－ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．９３（５）：１００８－１０１４）。ＧＭ１の診断は、β－ｇａｌおよびノイラミニダーゼの生化学アッセイによって、および／またはＧＬＢ１分子分析によってのいずれかで確認される。しかしながら、罹患した個体の臨床症状を予測する際に遺伝子型－表現型の相関を使用するには限界があり、これは、残存酵素活性自体がＧＬＢ１遺伝子の変異によって引き起こされる疾患サブタイプを予測することができないためである（Ｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃａｃｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。予測値は、一般に重度の早期発症の表現型を伴って存在する２つの重大な変異（すなわち、ＧＬＢ１酵素活性を示さない変異）を有する個体にとって最良である（Ｃａｃｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｓｐｅｒｂ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。兄弟姉妹の一致率に関するデータはほとんどないが、乳児ＧＭ１を有する兄弟姉妹における臨床経過が、発症するまでの時間および一般的な疾患徴候の観点で類似していることを示している（Ｇｕｒｕｒａｊ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
本明細書で提供される遺伝子治療ベクター、すなわち、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１）、またはそれらを含む組成物は、正常なレベルの機能性ベータ－ガラクトシダーゼの欠損に関連する状態の治療に有用である。本明細書で使用される場合、遺伝子治療ベクターは、本明細書に記載されるｒＡＡＶを指し、患者を治療する際の使用に好適である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、ＧＭ１の１型を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、ＧＭ１の２型を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、ＧＭ１の３型を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、ＧＭ１の１型および２型を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、１８ヶ月齢以下であるＧＭ１患者を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、ＧＭ１の１型および２型を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、３６ヶ月齢以下であるＧＭ１患者を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、３型を除くＧＭ１の治療のためのものである。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、正常なレベルの機能性β－ガラクトシダーゼの欠損に関連する神経学的状態の治療に有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、ＧＭ１ガングリオシドーシスに関連する症状の改善に有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、ＧＭ１ガングリオシドーシスに関連する神経学的症状の改善に有用である。
特定の実施形態では、患者は、乳児ガングリオシドーシスを有し、１８ヶ月齢以下である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を受ける患者は、１ヶ月齢～１８ヶ月齢である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を受ける患者は、４ヶ月齢～１８ヶ月齢である。特定の実施形態では、乳児は、４ヶ月齢未満である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を受ける患者は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、または約１８ヶ月齢である。特定の実施形態では、患者は、幼児、例えば、１８ヶ月齢～３歳である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を受ける患者は、３歳～６歳、３歳～１２歳、３歳～１８歳、３歳～３０歳である。特定の実施形態では、患者は、１８歳以上である。
特定の実施形態では、ＧＭ１ガングリオシドーシスに関連する症状の改善は、治療後に、例えば、寿命の増加（生存）、栄養チューブの必要性の低減、発作の発生率、頻度、長さの低減、および発作の発症の遅れ、例えばＰｅｄｓＱＬによって測定されるような生活の質の改善、神経認知低下に向かう進行の減少および／または神経認知発達の改善、例えば、発達の改善、またはＢａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）およびｔｈｅ Ｖｉｎｅｌａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｓｃａｌｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｖｉｎｅｌａｎｄ－ＩＩ）によって測定されるような、適応行動、認知、言語（受容的および表現的コミュニケーション）、ならびに運動機能（粗大運動、微細運動）の改善、運動マイルストーンの達成時年齢の早期化、および喪失時年齢の後期化、脳組織（大脳皮質および他の小さな構造）体積および心室体積の増加の遅れ、脳梁、尾状核および被殻、ならびに小脳皮質を含む脳下部構造のサイズ低下の遅れ、ならびに脳萎縮および体積変化の安定化、視床および基底神経節における異常なＴ１／Ｔ２シグナル強度の進行の遅れ、ＣＳＦおよび血清におけるβ－ｇａｌ酵素活性の増加、ＣＳＦ ＧＭ１ガングリオシド濃度の減少、血清および／または尿のケラタン硫酸レベルの減少、ヘキソサミニダーゼ活性の低下、脳における炎症反応の減少、異常な肝臓および脾臓の体積の遅れ、異常なＥＥＧおよび視覚誘発電位（ＶＥＰ）の遅れ、ならびに／あるいは嚥下障害、歩行機能、運動スキル、言語、および／または呼吸機能の改善を含むものが観察される。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶ療法がない状態では適格ではなかった患者について、患者は、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１注射の後に併用療法を受ける。かかる併用療法は、酵素補充療法、基質抑制療法（例えば、ミグルスタット（ＯＧＴ９１８、Ｎ－ブチル－デオキシノジリマイシン）による、タンガニル（アセチル－ＤＬ－ロイシン）治療、呼吸療法、栄養チューブ使用、抗てんかん薬）、または骨髄もしくは臍帯血による造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を含み得る。
任意選択的に、必要とする対象において、免疫抑制性併用療法を使用してもよい。かかる併用療法のための免疫抑制剤としては、限定されないが、グルココルチコイド、ステロイド、抗代謝剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシンまたはラパログ）、および細胞分裂阻害剤（アルキル化剤、抗代謝剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、またはイムノフィリンに対して活性な薬剤を含む）が挙げられる。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）特異的抗体またはＣＤ３特異的抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、またはＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）結合剤を含み得る。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１投与前または投与後０、１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上の日に開始され得る。かかる免疫抑制療法は、１つ、２つ、またはそれより多い薬物（例えば、グルココルチコイド、プレドニゾロン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）および／またはシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の投与を伴い得る。かかる免疫抑制薬は、同じ用量または調整用量で、１回、２回、またはさらに多くの回数、必要とする患者／対象に投与され得る。かかる療法は、同じ日に２つ以上の薬物（例えば、プレドニゾロン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）および／またはシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の併用投与を伴い得る。これらの薬物のうちの１つ以上は、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１投与後、同じ用量または調整用量で継続され得る。かかる療法は、必要に応じて、約１週間（７日間）、約６０日間、またはそれ以上であり得る。特定の実施形態では、タクロリムスを含まないレジメンが選択される。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるｒＡＡＶ．ＧＬＢ１（例えば、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１，ｒＡＡＶ．ＵｂＣ．ＧＬＢ１）の「有効量」は、ＧＭ１ガングリオシドーシスに関連する症状の改善を達成する量である。特定の実施形態では、本明細書に提供されるｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の「有効量」は、以下のエンドポイントのうちの１つ以上を達成する量である。脳脊髄液（ＣＳＦ）中のβ－ｇａｌの薬理学および生物学的活性の増加、血清中のβ－ｇａｌの薬理学および生物学的活性の増加、患者の平均寿命（生存）の増加、ＧＭ１ガングリオシドーシスの疾患進行の遅れ（年齢に好適な発達および運動マイルストーンの達成時年齢、喪失時年齢、および維持または獲得する患者のパーセンテージのうちの１つ以上によって評価される）、Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ＢＳＩＤ、例えば、ＢＳＩＤ Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ））の年齢に相当する認知、粗大運動、微細運動、受容的および表現的コミュニケーションスコアの変化のうちの１つ以上に基づく神経認知発達の改善、Ｖｉｎｅｌａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｓｃａｌｅｓの各ドメインについての標準スコアの変化。年長の小児および成人の場合、本明細書に提供されるｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の「有効量」は、いくつかの実施形態では、嚥下障害、歩行機能、運動スキル、言語、および／または呼吸機能、Ｖｉｎｅｌａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｓｃａｌｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｖｉｎｅｌａｎｄ－ＩＩ）の各ドメインについての標準スコアの変化、発作頻度の低下および発作開始年齢、２４ヶ月齢での栄養チューブからの独立の確立の改善を改善する量であり得る。年齢に好適な発達および運動マイルストーンの例は、世界保健機関（ＷＨＯ）によって提供されている。例えば、Ｗｉｊｎｈｏｖｅｎ Ｔ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｇｒｏｓｓ ｍｏｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ＷＨＯ Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔｕｄｙ．Ｆｏｏｄ Ｎｕｔｒ Ｂｕｌｌ．２５（１ Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ３７－４５、および以下の表を参照されたい。特定の実施形態では、本明細書に提供されるｒＡＡＶ．ＧＬＢ１（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８、ＧＬＢ１）の「有効量」は、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１が、ＣＳＦおよび血清のβ－ガラクトシド活性、ＣＳＦのＧＭ１濃度、ならびに血清および尿のケラタン硫酸、脳ＭＲＩの変化、肝臓および脾臓の体積のモニタリング、ＥＥＧおよび視覚誘発電位（ＶＥＰ）に対するモニタリングに及ぼす薬力学的効果を達成する量である。
Figure 2023513487000002
本明細書に記載のｒＡＡＶ．ＧＬＢ１、およびそれを含む組成物は、ヒトβ－ガラクトシダーゼ（正常なβ－ガラクトシド酵素とも称され得る）またはその機能性断片をコードし、発現するＧＬＢ１遺伝子（すなわち、β－Ｇａｌコード配列）を含有する。ＧＬＢ１酵素は、β－ガラクトシドの単糖への加水分解を触媒する。ヒトβ－ガラクトシダーゼのアミノ酸配列（２０３４ｂｐ、６７７ａａ、Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＡＡＡ５１８１９．１、ＥＣ３．２．１．２３）は、本明細書において、配列番号４として再現され、β－ガラクトシダーゼのアイソフォーム１としても認識される。例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１６２７８（ＢＧＡＬ＿ＨＵＭＡＮ）を参照されたい。特定の実施形態では、ＧＬＢ１酵素は、配列番号４のアミノ酸２４～アミノ酸６７７の配列（すなわち、シグナルペプチドを含まない成熟ＧＬＢ１酵素）を有し得る。特定の実施形態では、ＧＬＢ１酵素は、配列番号４のアミノ酸３１～アミノ酸６７７の配列（すなわち、β－ガラクトシダーゼのアイソフォーム３）を有し得る。特定の実施形態では、ＧＬＢ１酵素は、配列番号２６のアミノ酸配列を有するアイソフォーム２である。全長β－ガラクトシダーゼの機能を保持する任意の断片は、本明細書に記載のＧＬＢ１遺伝子によってコードされてもよく、「機能性断片」と称される。例えば、β－ガラクトシダーゼの機能性断片は、全長β－ガラクトシダーゼ（すなわち、配列番号４のアミノ酸２４～アミノ酸６７７の配列を有するβ－ガラクトシダーゼであり得る正常なＧＬＢ１酵素、または３つのアイソフォームのうちのいずれか１つ）の活性の少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれ以上を有し得る。β－ガラクトシダーゼの活性を評価する方法は、実施例ならびに刊行物に見出すことができる。例えば、Ｒａｄｏｓｌａｗ Ｋｗａｐｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｉｄ β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ： Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１４ Ｊａｎ；２９（１）：５７－６２を参照されたい。特定の実施形態では、機能性断片は、全長β－ガラクトシダーゼのＮ末端および／またはＣ末端に、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはそれ以上のアミノ酸を欠く、切断β－ガラクトシダーゼである。特定の実施形態では、機能性断片は、全長β－ガラクトシダーゼと比較して、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換を含有する。本明細書で使用される場合、保存的アミノ酸置換は、所与のアミノ酸を、類似の生化学的特性（例えば、電荷、疎水性、およびサイズ）を有する異なるアミノ酸に変更するタンパク質中のアミノ酸置き換えである。
一実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号５の配列を有する。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号６の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号７の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号８の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号６と少なくとも９５％同一～９９．９％同一の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号６と少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％同一の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号７と少なくとも９５％同一～９９．９％同一の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号７と少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％同一の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号８と少なくとも９５％同一～９９．９％同一の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号８と少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％同一の配列を有するように操作される。さらなる実施形態では、操作された配列は、全長β－ガラクトシダーゼまたはその機能性断片をコードする。なおさらなる実施形態では、操作された配列は、配列番号４のアミノ酸２４～アミノ酸６７７、またはその機能性断片をコードする。別の実施形態では、操作された配列は、配列番号４のアミノ酸配列、またはその機能性断片をコードする。
特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、シグナル（リーダー）ペプチドと、配列番号４のアミノ酸２４～６７７であるＧＬＢ１成熟タンパク質と、を含む、β－ガラクトシド酵素をコードする。リーダー配列は、好ましくは、ヒト起源またはヒトリーダー配列の誘導体であり、約１５～約２８アミノ酸、好ましくは約２０～２５アミノ酸、または約２３アミノ酸長である。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、天然シグナルペプチド（配列番号４のアミノ酸１～２３）である。特定の実施形態では、ＧＬＢ１酵素は、天然リーダー配列（配列番号４のアミノ酸１～２３）の代わりに外来性リーダー配列を含む。別の実施形態では、リーダーは、ヒトＩＬ２または変異リーダー由来であり得る。別の実施形態では、ヒトセルピンＦ１分泌シグナルは、リーダーペプチドとして使用され得る。
ＩＩ．ＡＡＶｈｕ６８
ＡＡＶｈｕ６８（以前はＡＡＶ３Ｇ２と称されていた）は、配列番号２の番号付けに基づいて、ｖｐ１の６７位および１５７位にある２つのコードされたアミノ酸によって、別の系統群ＦのウイルスＡＡＶ９と異なる。対照的に、他の系統群ＦのＡＡＶ（ＡＡＶ９、ｈｕ３１、ｈｕ３１）は、６７位にＡｌａおよび１５７位にＡｌａを有する。配列番号２の番号付けに基づいて１５７位にバリン（ＶａｌまたはＶ）を有し、任意選択的に、配列番号２の番号付けに基づいて６７位にグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）を有する、新規のＡＡＶｈｕ６８カプシドおよび／または操作されたＡＡＶカプシドが提供される。
本明細書で使用される場合、ＡＡＶの群に関連する「系統群（ｃｌａｄｅ）」という用語は、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアラインメントに基づいて、（少なくとも１０００複製物のうちの）少なくとも７５％のブートストラップ値および０．０５以下のポアソン補正距離測定値による隣接結合（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ）アルゴリズムを使用して決定されるような、互いに系統的に関連するＡＡＶの群を指す。隣接結合アルゴリズムは、文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。このアルゴリズムを実装するために使用することができるコンピュータプログラムが利用可能である。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは、修正されたＮｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装する。これらの技術およびコンピュータプログラム、ならびにＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書で特定される系統群のうちの１つに含まれるか、別の系統群に含まれるか、またはこれらの系統群の外側にあるかを容易に決定することができる。例えば、系統群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦを特定し、新規ＡＡＶであるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５３０５５３～ＡＹ５３０６２９の核酸配列を提供する、Ｇ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００４ Ｊｕｎ；７８（１０）：６３８１－６３８８を参照されたい。また、ＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、さらに、以下のうちの１つ以上を特徴とする。ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパクが、配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、配列番号１から産生されるｖｐ１タンパク質、もしくは配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、もしくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質、ならびに／あるいは配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、もしくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質を含む。
ＡＡＶｈｕ６８のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、典型的には、全長ｖｐ１アミノ酸配列（アミノ酸（ａａ）１～７３６）をコードする同じ核酸配列によってコードされる選択的スプライスバリアントとして発現される。任意選択的に、ｖｐ１コード配列は、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質を発現させるために単独で使用される。代替的に、この配列は、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）および／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）、またはそれらに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（例えば、配列番号１の約ヌクレオチド（ｎｔ）６０７～約ｎｔ２２１１から転写されるｍＲＮＡ）を含まない、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）をコードする核酸配列、または配列番号２のａａ２０３～７３６をコードする配列番号１と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一の配列のうちの１つ以上と共発現され得る。追加的に、または代替的に、ｖｐ１コード配列および／またはｖｐ２コード配列は、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）、またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（例えば、配列番号１のｎｔ４１２～２２１１から転写されるｍＲＮＡ）を含まない、配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をコードする核酸配列、または配列番号２の約ａａ１３８～７３６をコードする配列番号１と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一の配列と共発現され得る。
本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶｈｕ６８は、配列番号２のｖｐ１アミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８核酸配列からカプシドを発現する産生系で産生されるｒＡＡＶｈｕ６８カプシドと、任意選択的に、追加の核酸配列（例えば、ｖｐ１および／またはｖｐ２固有領域を含まないｖｐ３タンパク質をコードするもの）を有する。単一の核酸配列ｖｐ１を使用した産生から得られるｒＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、およびｖｐ３タンパク質の異種集団を産生する。より特定的には、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２の予測されるアミノ酸残基からの修飾を有するｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内の亜集団を含有する。これらの亜集団は、最低限、脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基を含む。例えば、アスパラギン－グリシン対におけるアスパラギンは、高度に脱アミド化される。
一実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１核酸配列は、配列番号１の配列、またはそれに相補的な鎖、例えば、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡを有する。特定の実施形態では、ｖｐ２および／またはｖｐ３タンパク質は、追加的または代替的に、例えば、選択された発現系においてｖｐタンパク質の比率を変化させるために、ｖｐ１とは異なる核酸配列から発現され得る。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）および／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）、またはそれらに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）を含まない、配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）をコードする核酸配列も提供される。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）、またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号１のｎｔ４１２～２２１１）を含まない、配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をコードする核酸配列も提供される。
しかしながら、配列番号２のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の核酸配列、または配列番号２をコードする配列番号１と少なくとも７０％～９９％同一、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有する。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の核酸配列、または配列番号２のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３６）をコードする配列番号１の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２１１と少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有する。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１の核酸配列、または配列番号２のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０３～７３６）をコードする配列番号１のｎｔ６０７～ｎｔ約２２１１と少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有する。
ＤＮＡ（ゲノムもしくはｃＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、このＡＡＶｈｕ６８カプシドをコードする核酸配列を設計することは、当該技術分野の範囲内である。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１で提供される。また、図１１Ａ～１１Ｅも参照されたい。他の実施形態では、配列番号１と７０％～９９．９％同一の核酸配列は、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質を発現するように選択され得る。特定の他の実施形態では、核酸配列は、配列番号１と少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％～９９．９％同一である。かかる核酸配列は、選択された系（すなわち、細胞型）における発現のためにコドン最適化されてもよく、様々な方法によって設計することができる。この最適化は、オンラインで入手可能な方法（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ）、公開された方法、またはコドン最適化サービスを提供する企業、例えば、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用して実行され得る。１つのコドン最適化法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国国際特許公開第２０１５／０１２９２４号に記載される。また、例えば、米国特許公開第２０１４／００３２１８６号および米国特許公開第２００６／０１３６１８４号を参照されたい。好適には、産物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長を修飾する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＯＲＦの断片のみを改変してもよい。これらの方法のうちの１つを使用することによって、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用し、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を産生し得る。コドンに実際の変化を行うために、または本明細書に記載されるように設計されたコドン最適化コード領域を合成するために、いくつかのオプションが利用可能である。かかる修飾または合成は、当業者によく知られている標準的かつ通常の分子生物学的操作を使用して行うことができる。あるアプローチでは、各々の長さが８０～９０ヌクレオチドであり、所望の配列長にわたる一連の相補的なオリゴヌクレオチド対は、標準的な方法によって合成される。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニーリングしたときに、粘着末端を含有し、８０～９０塩基対の二本鎖断片を形成するように合成され、例えば、対の中の各オリゴヌクレオチドは、その対の中の他のオリゴヌクレオチドに対して相補的な領域を超えて３、４、５、６、７、８、９、１０、またはより多くの塩基を伸長するように合成される。オリゴヌクレオチドの各対の一本鎖末端は、オリゴヌクレオチドの別の対の一本鎖末端とアニーリングするように設計される。オリゴヌクレオチド対をアニーリングし、次いで、これらの二本鎖断片のうちのおよそ５～６個を、粘着性一本鎖末端を介して一緒にアニーリングし、次いで、それらを一緒にライゲーションし、標準的な細菌クローニングベクター、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆから入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングする。次いで、構築物を標準的な方法によって配列決定する。これらの構築物のいくつかは、一緒にライゲーションされた８０～９０塩基対の断片のうちの５～６個の断片からなり、すなわち、約５００塩基対の断片が調製され、その結果、所望の配列全体が、一連のプラスミド構築物で表される。次いで、これらのプラスミドのインサートを、適切な制限酵素で切断し、一緒にライゲーションし、最終構築物を形成する。次いで、最終構築物を、標準的な細菌クローニングベクターにクローニングされ、配列決定される。追加の方法は、当業者にすぐに明らかになるだろう。加えて、遺伝子合成は、商業的に容易に利用可能である。
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号１の核酸配列、または本明細書で記載される修飾（すなわち、脱アミド化アミノ酸）を有する配列番号２のｖｐ１アミノ酸配列をコードする少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の配列を使用して産生される。特定の実施形態では、ｖｐ１アミノ酸配列は、配列番号２で再現される。
本明細書で使用される場合、ｖｐカプシドタンパク質を参照するために使用される場合、「異種」という用語またはその任意の文法的変形は、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではないエレメントからなる集団を指す。配列２は、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質のコードされたアミノ酸配列を提供する。ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質（代替的に、アイソフォームと称される）に関連して使用される「異種」という用語は、カプシド内のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質のアミノ酸配列における違いを指す。ＡＡＶカプシドは、予測されたアミノ酸残基の修飾を有する、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に亜集団を含有する。これらの亜集団は、最低限、特定の脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は、アスパラギン－グリシン対における少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に他の脱アミド化アミノ酸をさらに含み、脱アミド化は、アミノ酸変化および他の任意選択的な修飾をもたらす。
本明細書で使用される場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、少なくとも１つの定義された共通の特徴を有し、少なくとも１つの群メンバーから、参照群のすべてのメンバーよりも少ないメンバーからなるｖｐタンパク質の群を指す。例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、少なくとも１つのｖｐ１タンパク質であり、すべてのｖｐ１タンパク質よりも少ない。ｖｐ３の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、１つのｖｐ３タンパク質から、すべてのｖｐ３タンパク質よりも少なくてもよい。例えば、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、ｖｐ１タンパク質は、ｖｐタンパク質の亜集団であり得、ｖｐ２タンパク質は、ｖｐタンパク質の別の亜集団であり得、ｖｐ３はなお、ｖｐタンパク質のさらなる亜集団である。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度脱アミド化アスパラギン、例えば、アスパラギン－グリシン対で異なる修飾を有する亜集団を含み得る。
別途指定されない限り、高度脱アミド化は、参照アミノ酸位置での予測されたアミノ酸配列と比較して、参照アミノ酸位置での少なくとも４５％の脱アミド化、少なくとも５０％の脱アミド化、少なくとも６０％の脱アミド化、少なくとも６５％の脱アミド化、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または最大約１００％の脱アミド化を指す（例えば、配列番号２（ＡＡＶｈｕ６８）の番号付けに基づいて、アミノ酸５７でのアスパラギンの少なくとも８０％は、総ｖｐ１タンパク質に基づいて脱アミド化されてもよく、総ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質に基づいて脱アミド化されてもよい）。かかるパーセンテージは、２Ｄゲル、質量分析技術、または他の好適な技術を使用して決定され得る。
理論に束縛されることを望まないが、ＡＡＶカプシド中のｖｐタンパク質中の少なくとも高度に脱アミド化される残基の脱アミド化は、本質的に非酵素的であると考えられ、選択されたアスパラギンを脱アミド化するカプシドタンパク質内の官能基、およびより少ない程度でグルタミン残基によって引き起こされる。大部分の脱アミド化ｖｐ１タンパク質の効率的なカプシド組み立ては、これらの事象がカプシド組み立て後に生じるか、または個々のモノマー（ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３）における脱アミド化が構造的に十分許容され、ほとんどが組み立て動態に影響を及ぼさないことを示す。一般に、細胞侵入前に内部に位置すると考えられているＶＰ１固有（ＶＰ１－ｕ）領域（約ａａ１～１３７）における広範な脱アミド化は、カプシド組み立ての前にＶＰ脱アミド化が生じ得ることを示唆する。Ｎの脱アミド化は、そのＣ末端残基の骨格窒素原子を介して、Ａｓｎの側鎖アミド基炭素原子に対して求核攻撃を行うことによって生じ得る。中間環閉鎖スクシンイミド残基が形成されると考えられる。次いで、スクシンイミド残基は、高速加水分解を行って、最終産物であるアスパラギン酸（Ａｓｐ）またはイソアスパラギン酸（ＩｓｏＡｓｐ）をもたらす。したがって、特定の実施形態では、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）の脱アミド化は、ＡｓｐまたはＩｓｏＡｓｐをもたらし、例えば、以下に例示するように、スクシンイミド中間体を介して相互変換され得る。
Figure 2023513487000003
本明細書に提供されるように、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３中の各脱アミド化Ｎは、独立して、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、イソアスパラギン酸（ｉｓｏＡｓｐ）、アスパルテート、および／またはＡｓｐおよびｉｓｏＡｓｐの相互変換ブレンド、またはこれらの組み合わせであり得る。任意の好適な比率のα－グルタミン酸およびイソアスパラギン酸が存在し得る。例えば、特定の実施形態では、比率は、アスパラギン酸対イソアスパラギン酸が１０：１～１：１０、アスパラギン酸対イソアスパラギン酸が約５０：５０、またはアスパラギン酸対イソアスパラギン酸が約１：３、または別の選択された比率であり得る。
特定の実施形態では、１つ以上のグルタミン（Ｑ）は、脱アミド化されてグルタミン酸（Ｇｌｕ）、すなわちα－グルタミン酸、γ－グルタミン酸（Ｇｌｕ）、またはα－およびγ－グルタミン酸のブレンドになってもよく、共通のグルタルイミド中間体を介して相互変換され得る。任意の好適な比率のα－グルタミン酸およびγ－グルタミン酸が存在し得る。例えば、特定の実施形態では、比率は、α：γが１０：１～１：１０、α：γが約５０：５０、またはα：γが約１：３、または別の選択された比率であってもよい。
Figure 2023513487000004
したがって、ｒＡＡＶは、最低限、少なくとも１つの高度脱アミド化アスパラギンを含む少なくとも１つの亜集団を含む、脱アミド化アミノ酸を有するｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３タンパク質のｒＡＡＶカプシド内に亜集団を含む。さらに、他の修飾は、特に、選択されたアスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）残基位置での異性化を含み得る。さらに他の実施形態では、修飾は、Ａｓｐ位置でのアミド化を含み得る。
特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、少なくとも４個～少なくとも約２５個の脱アミド化アミノ酸残基位置を有するｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３の亜集団を含有し、そのうちの少なくとも１％～１０％は、ｖｐタンパク質のコードされたアミノ酸配列と比較して、脱アミド化される。これらの大部分は、Ｎ残基であり得る。しかしながら、Ｑ残基も脱アミド化され得る。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、実施例１に提供され、参照により本明細書に組み込まれる表に示される位置に、２つ、３つ、４つ以上の脱アミド化残基の組み合わせを含む亜集団を有するｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３タンパク質を有するＡＡＶカプシドを有する。ｒＡＡＶの脱アミド化は、２Ｄゲル電気泳動、および／または質量分析（ＭＳ）、および／またはタンパク質モデリング技術を使用して決定され得る。オンラインクロマトグラフィーは、Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐカラム、およびＮａｎｏＦｌｅｘ源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦに連結されたＴｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実行され得る。ＭＳデータは、サーベイスキャン（２００～２０００ｍ／ｚ）からの最も豊富に存在するまだ配列決定されていない前駆イオンを動的に選択する、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦのためのデータ依存性の上位２０法を使用して取得される。配列決定は、予測自動ゲイン制御によって決定される１ｅ５イオンの標的値を有する、より高エネルギーの衝突解離断片化によって行われ、前駆体の単離は、４ｍ／ｚのウィンドウで行われた。サーベイスキャンは、ｍ／ｚ２００、解像度１２０，０００で取得された。ＨＣＤスペクトルの解像度は、最大イオン注射時間５０ｍｓおよび正規化された衝突エネルギー３０で、ｍ／ｚ２００で３０，０００に設定されてもよい。ＳレンズＲＦレベルは、消化からのペプチドによって占められるｍ／ｚ領域の最適伝送を与えるために、５０に設定されてもよい。断片化選択からの単一の割り当てられていない帯電状態、または６以上の帯電状態を有する前駆イオンは、除外され得る。ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ １．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、取得したデータの分析に使用してもよい。ペプチドマッピングのために、固定修飾としてカルバミドメチル化設定された単一エントリのタンパク質ＦＡＳＴＡデータベース、可変修飾として酸化、脱アミド化、およびリン酸化の設定、１０ｐｐｍ質量精度、高プロテアーゼ特異性、ならびにＭＳ／ＭＳスペクトルにおける信頼レベル０．８を使用して検索を実施する。好適なプロテアーゼの例としては、例えば、トリプシンまたはキモトリプシンが含まれ得る。脱アミド化ペプチドの質量分析による特定は、脱アミド化が、元の分子の質量に＋０．９８４Ｄａ（－ＯＨ基と－ＮＨ２基との間の質量差）を加えるため、比較的簡単である。特定のペプチドの脱アミド化率は、脱アミド化ペプチドの質量面積を、脱アミド化およびネイティブペプチドの面積の合計で除することによって決定される。脱アミド化の可能性がある部位の数を考慮すると、異なる部位で脱アミド化されている同重種は、単一のピークで共移動し得る。その結果、複数の脱アミド化の可能性がある部位を有するペプチドに由来する断片イオンを使用して、脱アミド化の複数の部位を位置決定または区別することができる。これらの場合に、観測される同位体パターン内の相対強度を使用して、異なる脱アミド化ペプチド異性体の相対的な存在率を特異的に決定することができる。この方法は、すべての異性体種についての断片化効率が同じであり、脱アミド化部位に依存しないことを想定する。これらの例示的な方法について多くの変化が使用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。例えば、適切な質量分光計としては、例えば、四重極飛行時間型質量分析計（ＱＴＯＦ）、例えば、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ ｏｒ Ａｇｉｌｅｎｔ ６５３０、またはオービトラップ型装置、例えば、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ ｏｒ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）が挙げられ得る。好適な液体クロマトグラフィーとしては、例えば、Ｗａｔｅｒｓ製のＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム、またはＡｇｉｌｅｎｔシステム（１１００または１２００シリーズ）が挙げられる。好適なデータ分析ソフトウェアとしては、例えば、ＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ ａｎｄ Ｐｅｐｆｉｎｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｐｅａｋｓ ＤＢ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）が挙げられ得る。さらに他の技術は、例えば、２０１７年６月１６日にオンラインで公開されたＸ．Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．５，ｐｐ．２５５－２６７に記載され得る。
脱アミド化に加えて、他の修飾が生じても、１つのアミノ酸が、異なるアミノ酸残基に変換されることはない。かかる修飾は、アセチル化残基、異性化、リン酸化、または酸化を含み得る。脱アミド化の調節：特定の実施形態では、ＡＡＶは、アスパラギン－グリシン対におけるグリシンを変更して、脱アミド化を低減するように修飾される。他の実施形態では、アスパラギンは、異なるアミノ酸、例えば、より遅い速度で脱アミド化するグルタミン、またはアミド基を欠くアミノ酸（例えば、グルタミンおよびアスパラギンは、アミド基を含有する）、および／またはアミン基を欠くアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジンが、アミン基を含有する）に変更される。本明細書で使用される場合、アミドまたはアミン側基を欠くアミノ酸は、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン、および／またはプロリンを指す。記載されるような修飾は、コードされたＡＡＶアミノ酸配列中に見出されるアスパラギン－グリシン対のうちの１つ、２つ、または３つにあり得る。特定の実施形態では、かかる修飾は、アスパラギン－グリシン対の４つすべてでは行われない。したがって、ＡＡＶおよび／または操作されたＡＡＶバリアントの脱アミドを低減するための方法は、より低い脱アミド率を有する。追加的に、または代替的に、１つ以上の他のアミドアミノ酸を非アミドアミノ酸に変更して、ＡＡＶの脱アミド化を低減し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される変異体ＡＡＶカプシドは、グリシンがアラニンまたはセリンに変化するように、アスパラギン－グリシン対における変異を含有する。変異体ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶが天然に４つのＮＧ対を含む位置に、１つ、２つ、または３つの変異体を含有し得る。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶが天然に５つのＮＧ対を含む位置に、１つ、２つ、３つ、または４つのかかる変異体を含有し得る。特定の実施形態では、変異体ＡＡＶカプシドは、ＮＧ対に単一の変異のみを含有する。特定の実施形態では、変異体ＡＡＶカプシドは、２つの異なるＮＧ対に変異を含有する。特定の実施形態では、変異体ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶカプシド中で構造的に離れた位置に位置する２つの異なるＮＧ対に変異を含有する。特定の実施形態では、変異は、ＶＰ１固有領域にはない。特定の実施形態では、変異のうちの１つは、ＶＰ１固有領域にある。任意選択的に、変異体ＡＡＶカプシドは、ＮＧ対中に修飾を含まないが、ＮＧ対から外れて位置する１つ以上のアスパラギンまたはグルタミン中の脱アミド化を最小限に抑えるか、または排除するために変異を含有する。
特定の実施形態では、野生型ＡＡＶカプシド中のＮＧのうちの１つ以上を排除するＡＡＶカプシドを操作することを含む、ｒＡＡＶの効力を増加させる方法が提供される。特定の実施形態では、「ＮＧ」の「Ｇ」のコード配列は、別のアミノ酸をコードするように操作される。以下の特定の例では、「Ｓ」または「Ａ」が置換される。しかしながら、他の好適なアミノ酸コード配列が選択され得る。実施例１の表を参照されたい（参照により本明細書に組み込まれる）。
ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質において、４個の残基（Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、Ｎ５１２）は、７０％を超える脱アミド化レベルを日常的に示し、様々なロットにわたって、ほとんどの場合９０％を超える。さらなるアスパラギン残基（Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７、およびＱ５９９）も、様々なロットにわたって最大約２０％の脱アミド化レベルを示す。脱アミド化レベルは、最初にトリプシン消化を使用して特定され、キモトリプシン消化で検証された。
ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２の予測されるアミノ酸残基からの修飾を有するｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内の亜集団を含有する。これらの亜集団は、最低限、特定の脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は、配列番号２のアスパラギン－グリシン対における少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に他の脱アミド化アミノ酸をさらに含み、脱アミド化は、アミノ酸変化および他の任意選択的な修飾をもたらす。配列番号３は、修飾ＡＡＶｈｕ６８カプシドのアミノ酸配列を提供し、あるパーセンテージの脱アミド化アミノ酸または別様に修飾されたアミノ酸を有し得る位置を示す。これらおよび他の修飾の様々な組み合わせは、本明細書に記載されている。
他の実施形態では、本方法は、ｒＡＡＶの収率を増加させること、したがって、細胞溶解の前に、または細胞溶解を必要とせずに、上清中に存在するｒＡＡＶの量を増加させることを伴う。この方法は、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１カプシドタンパク質のアミノ酸番号を有する整列に基づいて、ＡＡＶ ＶＰ１カプシド遺伝子を操作して、６７位でＧｌｕ、１５７位でＶａｌ、または両方を有するカプシドタンパク質を発現させることを含む。他の実施形態では、本方法は、ＶＰ２カプシド遺伝子を操作して、１５７位にＶａｌを有するカプシドタンパク質を発現することを伴う。さらに他の実施形態では、ｒＡＡＶは、修飾カプシドを有し、６７位にＧｌｕおよび１５７位にＶａｌの、ｖｐ１およびｖｐ２のカプシドタンパク質の両方を含む。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ９カプシド」は、複数のＡＡＶ９ ｖｐタンパク質から構成される自己集合ＡＡＶカプシドである。ＡＡＶ９ ｖｐタンパク質は、典型的には、配列番号２３の核酸配列、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ９９２６４のｖｐ１アミノ酸配列をコードする、それと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の配列によってコードされる選択的スプライスバリアントとして発現される。特定の実施形態では、「ＡＡＶ９カプシド」は、ＡＡＳ９９２６４と９９％同一、または配列番号２０と９９％同一のアミノ酸配列を有するＡＡＶを含む。ＵＳ７９０６１１１およびＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ９バリアント」は、例えば、ＷＯ２０１６／０４９２３０、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／０３４４９１１、およびＵＳ８，７３４，８０９に記載されるものを含む。
カプシド、したがってコード配列を生成する方法、およびｒＡＡＶを産生するための方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）およびＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。
「実質的相同性」または「実質的類似性」という用語は、核酸、またはその断片を参照する場合、別の核酸（またはその相補的鎖）と適切なヌクレオチド挿入または欠失によって最適にアラインメントされるとき、アラインメントされる配列の少なくとも約９５～９９％のヌクレオチド配列同一性を有することを示す。好ましくは、相同性は、全長配列、またはそのオープンリーディングフレーム、または少なくとも１５ヌクレオチド長である別の適切な断片にわたる相同性である。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
核酸配列の文脈で「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、または「同一パーセント」という用語は、最大限対応するようにアラインメントさせたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、または、少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片にわたってもよく、これが望ましい。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。同様に、「パーセント配列同一性」は、タンパク質の全長わたるアミノ酸配列またはその断片について容易に決定することができる。好適には、断片は、少なくとも約８アミノ酸長であり、最大で約７００アミノ酸長であり得る。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
「実質的相同性」または「実質的類似性」という用語は、核酸、またはその断片を参照する場合、別の核酸（またはその相補的鎖）と適切なアミノ酸挿入または欠失によって最適にアラインメントされるとき、アラインメントされる配列の少なくとも約９５～９９％のアミノ酸配列同一性を有することを示す。好ましくは、相同性は、全長配列、またはそのオープンリーディングフレーム、または少なくとも８アミノ酸長、またはより望ましくは、少なくとも１５アミノ酸である別の好適な断片にわたる相同性である。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
「高度に保存された」という用語は、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは９７％を超える同一性を意味する。同一性は、当業者によって知られているアルゴリズムおよびコンピュータプログラムに頼ることによって、当業者によって容易に決定される。
一般的に、２つの異なるアデノ随伴ウイルス間の「同一性」、「相同性」または「類似性」について言及する場合、「同一性」、「相同性」または「類似性」は、「アラインメントされた」配列を参照して決定される。「アラインメントされた」配列または「アラインメント」とは、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損または追加塩基またはアミノ酸についての補正を含む。例では、公開されたＡＡＶ９配列を参照点として使用してＡＡＶアラインメントを行う。アラインメントは、公的または商業的に利用可能な様々な多重配列整列プログラムのいずれかを使用して行われる。かかるプログラムの例としては、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＭＡＰ」、および「ＭＥＭＥ」が挙げられる。かかるプログラムの他のソースは、当業者に既知である。代替的に、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上に記載のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会および検索配列の間の最良の重複領域のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、本明細書に参考として組み込まれる、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１で提供される、そのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６およびスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ因子）を用いるＦａｓｔａ（商標）を使用して決定することができる。例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、および「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムなどのアミノ酸配列のための複数の配列アラインメントプログラムも利用可能である。一般的に、これらのプログラムのいずれかをデフォルト設定で使用するが、当業者は、これらの設定を必要に応じて変更し得る。代替的に、当業者は、参照のアルゴリズムおよびプログラムによって提供されるものと少なくとも同じレベルの同一性またはアラインメントを提供する、別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。
ＩＩＩ． ｒＡＡＶ
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、遺伝子送達に好適なビヒクルとして記載されている。典型的には、ｒＡＡＶによる送達のための導入遺伝子（例えば、ＧＬＢ１遺伝子）を含む外因性発現カセットは、天然ＡＡＶ源由来の機能性ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を置き換え、複製不能なベクターをもたらす。これらのｒｅｐおよびｃａｐの機能は、ベクター産生系中にトランスで提供されるが、最終ｒＡＡＶ中には存在しない。
上に示されるように、ＡＡＶカプシドと、最低限、ベクターゲノムをカプシドにパッケージングするのに必要なＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、ＧＬＢ１遺伝子、およびそのための発現を指令する調節配列を含むベクターゲノムと、を有する、ｒＡＡＶが提供される。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ６８由来である。本明細書の実施例は、一本鎖ＡＡＶベクターゲノムを利用するが、特定の実施形態では、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶベクターゲノムを含むｒＡＡＶが本発明に利用され得る。
必要な調節制御エレメントは、ｒＡＡＶを取り込む細胞中でその転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式で遺伝子（例えば、ＧＬＢ１）と作動可能に連結される。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」配列には、目的の遺伝子と連続する発現制御配列、および目的の遺伝子を制御するためにトランスで、または離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。かかる調節配列は、典型的には、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリＡ、自己切断リンカー（例えば、フーリン、フーリン－Ｆ２Ａ、ＩＲＥＳ）のうちの１つ以上を含む。以下の例は、ＧＬＢ１遺伝子の発現のために、ＣＢ７プロモーター（例えば、配列番号１０）、ＥＦ１ａプロモーター（例えば、配列番号１１）、またはヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター（例えば、配列番号９）を利用する。しかしながら、特定の実施形態では、他のプロモーター、または追加のプロモーターが選択され得る。
特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子に加えて、別の１つ以上の遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ配列が含まれ得る。かかる遺伝子産物は、例えば、目的のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、または他の遺伝子産物であり得る。有用な遺伝子産物としては、ｍｉＲＮＡが挙げられ得る。ｍｉＲＮＡおよび他の低分子干渉核酸は、標的ＲＮＡ転写産物の切断／分解または標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制を介して遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、典型的には、最終的な１９～２５の非翻訳ＲＮＡ産物として天然に発現される。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用を介してそれらの活性を示す。これらの内因性の発現ｍｉＲＮＡは、ヘアピン前駆体を形成し、これがその後、ｍｉＲＮＡ二本鎖へと処理され、さらに「成熟」一本鎖ｍｉＲＮＡ分子へと処理される。この成熟ｍｉＲＮＡは、多タンパク質複合体ｍｉＲＩＳＣを導き、これが、成熟ｍｉＲＮＡに対する相補性に基づいて、標的ｍＲＮＡの標的部位（例えば、３’ＵＴＲ領域中の）を特定する。
特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＧＢＬ１コード配列に加えて、安全性を改善し、および／または副作用を低減させるために背側根神経節を非標的化するのに有用な１つ以上のｍｉＲを含有するように操作され得る。かかるｄｒｇ脱標的化配列は、背側根神経節におけるＧＬＢ１産物の発現を最小限に抑えるか、または防止するように、ＧＬＢ１コード配列と作動可能に連結される。好適なｄｒｇ脱標的化配列は、２０１９年１２月２０日に出願され、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＲＧ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」という名称のＰＣＴ／ＵＳ１９／６７８７２に記載される。
ＡＡＶベクターゲノムは、典型的には、シス作用性５’および３’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ “Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，編集Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、約１４５塩基対（ｂｐ）の長さである。好ましくは、ＩＴＲをコードする実質的に完全な配列が分子中で使用されるが、これらの配列のある程度の最小限の修飾は許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当業者の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、およびＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）などの文書を参照されたい）。本発明で使用されるこのような分子の一例は、導入遺伝子を含有する「シス作用性」プラスミドであり、選択された導入遺伝子配列および関連する調節エレメントは、５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するのとは異なるＡＡＶ由来である。一実施形態では、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。Ｄ配列および末端分解部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されている。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、外部Ａエレメントが欠失している、１３０塩基対の短縮ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。短縮ＩＴＲは、内部Ａエレメントを鋳型として使用して、ベクターＤＮＡ増幅中に１４５塩基対の野生型長さに戻される。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’および３’ＩＴＲが使用される。しかしながら、他のＡＡＶ供給源に由来するＩＴＲが選択され得る。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源由来である場合、得られたｒＡＡＶは、シュードタイプであると称され得る。しかしながら、これらのエレメントの他の構成も好適であり得る。
特定の実施形態では、発現制御配列（調節配列）の一部として、例えば、選択される５’ＩＴＲ配列とコード配列との間に位置する追加的または代替的なプロモーター配列が含まれ得る。構成的プロモーター、調節可能なプロモーター（例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８およびＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい）、組織特異的プロモーター（例えば、ニューロン特異的プロモーターもしくはグリア細胞特異的プロモーター、またはＣＮＳ特異的プロモーター）、または生理学的手がかりに応答するプロモーターが、本明細書に記載のｒＡＡＶに利用され得る。プロモーターは、異なる供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリモウイルスプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）または神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜伏関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックス金属タンパク質プロモーター（ＭＰＰ）、およびニワトリベータ－アクチンプロモーターから選択され得る。他の好適なプロモーターは、ＣＢ７プロモーターを含み得る。プロモーターに加えて、ベクターゲノムは、１つ以上の他の適切な転写開始配列、転写終結配列、エンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列（例えば、ＷＰＲＥ）、翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強する配列、および必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含有し得る。好適なエンハンサーの一例は、ＣＭＶエンハンサーである。他の好適なエンハンサーには、所望の標的組織適応症に適切なものが含まれる。一実施形態では、調節配列は、１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、調節配列は、２つ以上の発現エンハンサーを含有する。これらのエンハンサーは、同じであってもよく、または互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、ＣＭＶ前初期エンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピー中に存在し得る。代替的に、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列によって分離される。さらに別の実施形態では、発現カセットは、イントロン、例えば、ニワトリベータ－アクチンイントロンをさらに含有する。特定の実施形態では、イントロンは、キメライントロン（ＣＩ）－ヒトβ－グロビンスプライスドナーおよび免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）スプライスアクセプターエレメントからなるハイブリッドイントロンである。他の好適なイントロンとしては、当該技術分野で既知のものが含まれ、例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８に記載されるものなどが含まれる。好適なポリＡ配列の例には、例えば、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、および合成ポリＡが含まれる。任意選択的に、１つ以上の配列を選択して、ｍＲＮＡを安定させてもよい。かかる配列の一例は、修飾ＷＰＲＥ配列であり、これは、ポリＡ配列の上流およびコード配列の下流で操作され得る（例えば、ＭＡ Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５－６１９を参照されたい）。特定の実施形態では、ＷＰＲＥ配列は、存在しない。
特定の実施形態では、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－プロモーター－任意選択的なエンハンサー－任意選択的なイントロン－ＧＬＢ１遺伝子－ポリＡ－３’ＩＴＲを含むベクターゲノムが構築される。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来ではない。特定の実施形態では、２つ以上のプロモーターが存在する。特定の実施形態では、エンハンサーは、ベクターゲノムに存在する。特定の実施形態では、２つ以上のエンハンサーが存在する。特定の実施形態では、イントロンは、ベクターゲノムに存在する。特定の実施形態では、エンハンサーおよびイントロンが存在する。特定の実施形態では、イントロンは、ヒトベータ－グロビンスプライスドナーおよび免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）スプライスアクセプターエレメントからなるハイブリッドイントロンである、キメライントロン（ＣＩ）である。特定の実施形態では、ポリＡは、ＳＶ４０ポリＡ（すなわち、サルウイルス４０（ＳＶ４０）後期遺伝子に由来するポリアデニル化（ポリＡ）シグナル）である。特定の実施形態では、ポリＡは、ウサギベータ－グロビン（ＲＢＧ）ポリＡである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ＣＢ７プロモーター－ＧＬＢ１遺伝子－ＲＢＧポリＡ－３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ＥＦ１ａプロモーター－ＧＬＢ１遺伝子－ＳＶ４０ポリＡ－３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ＵｂＣプロモーター－ＧＬＢ１遺伝子－ＳＶ４０ポリＡ－３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号５を有する。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号６を有する。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号７を有する。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号８を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１２の配列、またはそれと少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％～約９９．９％同一の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１３の配列、またはそれと少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％～約９９．９％同一の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１４の配列、またはそれと少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％～約９９．９％同一の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１５の配列、またはそれと少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％～約９９．９％同一の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１６の配列、またはそれと少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％～約９９．９％同一の配列を有する。
ＩＶ．ｒＡＡＶ産生
ＡＡＶウイルスベクター（例えば、組換え（ｒ）ＡＡＶ）の産生における使用のために、ベクターゲノムは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミド上に保有され得る。本発明に有用なプラスミドは、特に、インビトロで原核細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞に複製およびパッケージングするのに好適であるように操作され得る。好適なトランスフェクション技術およびパッケージング宿主細胞は、既知であり、かつ／または当業者によって容易に設計することができる。例示的な産生プロセスは、図１２Ａ～１２Ｂに提供される。
ベクターとしての使用に好適なＡＡＶを生成し、単離するための方法は、当該技術分野において既知である。一般に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ ＆ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、および以下に引用される参考文献を参照されたい（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。遺伝子をビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、遺伝子を含有する核酸分子と同じ構築物においてシスで必要とされる唯一のＡＡＶ構成要素である。ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給され得る。
一実施形態では、選択される遺伝子エレメントは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によってＡＡＶパッケージ細胞に送達され得る。好適なＡＡＶパッケージング細胞も作製され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技法を含む。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，編集Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。
「ＡＡＶ中間体」または「ＡＡＶベクター中間体」という用語は、それにパッケージされた所望のゲノム配列を欠失している組み立てられたｒＡＡＶカプシドを指す。これらはまた、「空の」カプシドと称され得る。そのようなカプシドは、発現カセットの検出可能なゲノム配列を全く含まないか、または遺伝子産物（例えば、β－ｇａｌ）の発現を達成するには不十分な部分的にパッケージされたゲノム配列のみを含み得る。これらの空のカプシドは、宿主細胞に目的の遺伝子を導入するために非機能的である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１または本明細書に記載される組成物は、ＡＡＶ中間体を少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％含まなくてもよく、すなわち、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、または０．１％より少ないＡＡＶ中間体を含有する。
本明細書に記載される組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知の技術を使用して生成され得る。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列、機能性ｒｅｐ遺伝子、最低限、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）および導入遺伝子で構成される発現カセット、ならびに発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングするのを可能にするのに十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを含む。カプシドを生成する方法、そのためのコード配列、およびｒＡＡＶウイルスベクターの産生方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）、およびＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。
一実施形態では、組換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶｈｕ６８）を産生するのに有用な産生細胞培養物が提供される。かかる細胞培養物は、宿主細胞においてＡＡＶカプシドタンパク質を発現する核酸、ＡＡＶカプシド中にパッケージングするのに好適な核酸分子、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲを含有するベクターゲノム、および細胞（例えば、必要とする患者における細胞）における遺伝子の発現を指令する調節配列に作動可能に連結されたＧＬＢ１遺伝子、ならびに組換えＡＡＶカプシド中にベクターゲノムをパッケージングするのを可能にするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能およびアデノウイルスヘルパー機能を含有する。一実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物細胞（例えば、特に、ヒト胚性腎臓２９３細胞）または昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞）で構成される。特定の実施形態では、バキュロウイルスは、組換えＡＡＶｈｕ６８カプシド中にベクターゲノムをパッケージングするのに必要なヘルパー機能を提供する。
任意選択的に、ｒｅｐ機能は、カプシド源ＡＡＶであるＡＡＶｈｕ６８以外のＡＡＶによって提供される。特定の実施形態では、ｒｅｐ機能の少なくとも一部は、ＡＡＶｈｕ６８由来である。別の実施形態では、ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶｈｕ６８以外の異種ｒｅｐタンパク質であり、例えば、限定されないが、ＡＡＶ１ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ３ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ４ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ５ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ６ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ７ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ８ ｒｅｐタンパク質、またはｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０、ｒｅｐ６８／７８、およびｒｅｐ４０／５２、またはそれらの断片、あるいは別の供給源であり得る。これらのＡＡＶｈｕ６８または変異体ＡＡＶカプシド配列のいずれかは、宿主細胞中でそれらの発現を指令する外因性調節制御配列の制御下にあり得る。
一実施形態では、細胞は、好適な細胞培養物（例えば、ＨＥＫ２９３もしくはＳｆ９）または懸濁液で製造される。本明細書に記載される遺伝子療法ベクターを製造するための方法には、遺伝子療法ベクターの産生に使用されるプラスミドＤＮＡの生成、ベクターの生成、およびベクターの精製などの、当該技術分野で周知の方法が含まれる。一部の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ｒＡＡＶであり、産生されたプラスミドは、目的の遺伝子を含むＡＡＶベクターゲノムをコードするＡＡＶシス－プラスミド、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶトランス－プラスミド、およびアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、ならびにベクター含有細胞および培養培地の回収などの方法ステップを含み得る。回収されたベクター含有細胞および培養培地は、本明細書では粗細胞回収物と称される。さらに別の系では、遺伝子療法ベクターは、バキュロウイルスベースのベクターによる感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生系に関する概説については、一般に、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照されたく、各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらおよび他のＡＡＶ産生系を作製し、使用する方法は、以下の米国特許第５，１３９，９４１号、同第５，７４１，６８３号、同第６，０５７，１５２号、同第６，２０４，０５９号、同第６，２６８，２１３号、同第６，４９１，９０７号、同第６，６６０，５１４号、同第６，９５１，７５３号、同第７，０９４，６０４号、同第７，１７２，８９３号、同第７，２０１，８９８号、同第７，２２９，８２３号、および同第７，４３９，０６５号にも記載され、それらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
粗細胞回収物は、その後、ｒＡＡＶ回収物の濃縮、ｒＡＡＶ回収物の透析濾過、ｒＡＡＶ回収物の顕微溶液化、ｒＡＡＶ回収物のヌクレアーゼ消化、顕微溶液化された中間体の濾過、クロマトグラフィーによる粗精製、超遠心分離による粗精製、接線流濾過による緩衝液交換、および／またはバルクｒＡＡＶを調製するための製剤化および濾過などの方法ステップに供され得る。
２ステップの高塩濃度でのアフィニティークロマトグラフィー精製、続いて、アニオン交換樹脂クロマトグラフィーを使用して、ｒＡＡＶ薬物製品を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、２０１６年１２月９日に出願されたＷＯ２０１７／１６０３６０、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０号、およびその優先権書類、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０７１号、および２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ９」という名称の同第６２／２２６，３５７号に、より詳細に記載されており、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。
空の粒子および完全粒子の含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配により精製された調製物、ゲノムコピー（ＧＣ）の数＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド体積が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験物品ピークのバンド体積中の粒子の数を算出する。次いで、ロードされた２０μＬ当たりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛け算し、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで割り算し、ゲノムコピーに対する粒子の比率（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ－ＧＣ／ｍＬは、空ｐｔ／ｍＬを与える。空ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割り、１００を掛け算することによって、空粒子のパーセンテージを得る。
一般に、空のカプシドおよびパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶ粒子のためのアッセイ方法は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性カプシドについて試験するために、本方法は、処理されたＡＡＶストックを、３つのカプシドタンパク質を分離することが可能な任意のゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、緩衝液中に３～８％のトリス酢酸塩を含有する勾配ゲル）に供することと、次いで、試料材料が分離されるまでゲルを試行することと、ナイロンまたはニトロセルロース膜、好ましくはナイロンの上でゲルをブロッティングすることと、を含む。次いで、抗ＡＡＶカプシド抗体、好ましくは抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくはＢ１抗ＡＡＶ－２モノクローナル抗体を、変性カプシドタンパク質に結合する一次抗体として使用する（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、または比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのために、カラム断片からの試料を採取し、還元剤（例えばＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥローディング緩衝液中で加熱してもよく、カプシドタンパク質を、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えばＮｏｖｅｘ）上で解像させた。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って、または他の好適な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビーもしくはクマシー色素を用いて、銀染色を実施してもよい。一実施形態では、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）によって測定することができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅ Ｉ（または別の好適なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活性化後、試料は、さらに希釈され、プライマーおよびプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ｒＡＡＶ中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを使用して、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を作成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）の値を使用して、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することによって、ベクターゲノム力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用可能である。
一態様では、広域スペクトルセリンプロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なもの）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より特定的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、標準アッセイと同様であるが、但し、ＤＮａｓｅ Ｉ消化の後に、試料をプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテイナーゼＫで処理した後、熱不活性化させる。好適には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテイナーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮されてもよい。典型的には、プロテイナーゼＫ処理は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理ステップは、一般に、約５５℃で約１５分間、実施されるが、より低い温度（例えば、約３７℃～約５０℃）でより長時間（例えば、約２０分間～約３０分間）、またはより高い温度（例えば、最高約６０℃）でより短時間（例えば、約５～１０分間）実施されてもよい。同様に、熱不活性化は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準アッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。
追加的に、または代替的に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用され得る。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖および自己相補性ＡＡＶベクターゲノム力価を決定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。
簡潔にいうと、パッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶｈｕ６８粒子をゲノム欠損ＡＡＶｈｕ６８中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶｈｕ６８ウイルス粒子およびＡＡＶｈｕ６８カプシド中間体を含む懸濁液を高性能液体クロマトグラフィーに供することを伴い、ＡＡＶｈｕ６８ウイルス粒子およびＡＡＶｈｕ６８中間体は、約１０．２のｐＨで平衡化された強アニオン交換樹脂に結合し、約２６０ナノメートル（ｎｍ）および約２８０ｎｍで紫外線吸光度について溶出液をモニタリングしながら、塩勾配に供される。ｒＡＡＶｈｕ６８にはあまり最適ではないが、ｐＨは約１０．０～１０．４の範囲であり得る。この方法では、ＡＡＶｈｕ６８完全カプシドは、断片から収集され、Ａ２６０／Ａ２８０比が変曲点に達したときに溶出する。一例では、アフィニティークロマトグラフィーステップのために、透析濾過された生成物を、ＡＡＶ２／ｈｕ６８血清型を効率的に捕捉するＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティー樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用し得る。これらのイオン性条件下、残留細胞ＤＮＡおよびタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は、効率的に捕捉される。
また、産生ベクター（プラスミドなど）、または本明細書に記載されるベクターゲノムおよび／もしくはｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を産生するための宿主細胞も、本明細書に提供される。本明細書で使用される場合、本明細書に記載される遺伝子治療ベクターを生成および／またはパッケージングするために、ベクターゲノムを宿主細胞に運ぶ産生ベクター。
ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１）は、好適な生理学的に適合性の組成物（例えば、緩衝生理食塩水）中に懸濁される。この組成物は、保管のために凍結され、後に解凍され、任意選択的に、好適な希釈剤で希釈され得る。代替的に、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１は、凍結および解凍ステップを進めることなく患者への送達に好適な組成物として調製され得る。
Ｖ．組成物および使用
本明細書に提供されるのは、少なくとも１つのｒＡＡＶストック（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８ストックまたは変異体ｒＡＡＶｈｕ６８ストックと、任意選択的な担体、賦形剤および／または防腐剤と、を含有する組成物である。
本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶの「ストック」は、ｒＡＡＶの集団を指す。脱アミド化に起因するカプシドタンパク質の不均一性にもかかわらず、ストック内のｒＡＡＶは、同一のベクターゲノムを共有することが予想される。ストックは、例えば、選択されたＡＡＶカプシドタンパク質および選択された産生系に特徴的な不均一な脱アミド化パターンを有するカプシドを有するｒＡＡＶを含み得る。ストックは、単一の産生系から産生されてもよく、または産生系の複数の実行からプールされてもよい。本明細書に記載されるものを含むが、これらに限定されない様々な産生系が選択され得る。
特に、組成物は、ＧＭ１ガングリオシドーシスの治療のためのものである。一実施形態では、組成物は、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する患者、または１８ヶ月齢以下の乳児ガングリオシドーシスを有する患者への投与に好適である。一実施形態では、組成物は、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する患者、または３６ヶ月齢以下の乳児ガングリオシドーシスを有する患者への投与に好適である。一実施形態では、組成物は、ＧＭ１ガングリオシドーシスの症状を改善するために、またはＧＭ１ガングリオシドーシスの神経学的症状を改善するために、それを必要とする患者への投与に好適である。いくつかの実施形態では、組成物は、ＧＭ１ガングリオシドーシスの治療のための医薬の製造に使用するためのものである。
本明細書で使用される場合、「担体」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足活性成分を組成物中に組み込むこともできる。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるｒＡＡＶ．ＧＬＢ１と、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物である。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギーまたは類似の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるｒＡＡＶ．ＧＬＢ１と、送達ビヒクルと、を含む、組成物である。リポソーム、ナノカプセル、ミクロ粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などのような送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。詳細には、ｒＡＡＶ送達ベクターゲノムは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などのいずれかに封入された送達ために製剤化され得る。
一実施形態では、組成物は、対象／患者への送達に好適な最終製剤を含み、例えば、生理的に適合するｐＨおよび塩濃度に緩衝化された水性液体懸濁液である。任意選択的に、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、凍結乾燥され、投与時に再構築されてもよい。
好適な界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせは、非毒性である非イオン性界面活性剤の中から選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］（ポロキサマー１８８としても知られる）など、末端が一級ヒドロキシル基の二官能ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖で構成される非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ１５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般的に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの場合）の後に３桁の数字で命名され、最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与え、最後の１桁×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与える。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。一実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％（ｗ／ｗ％、重量比に基づく）の量で存在し得る。別の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％（ｖ／ｖ％、体積比に基づく）の量で存在し得る。さらに別の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％の量で存在し、ここで、ｎ％は、懸濁液１００ｍＬ当たりのｎグラムを示す。
ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１は、細胞をトランスフェクトするのに十分な量で投与され、十分なレベルの遺伝子導入および発現を提供して、過度の悪影響なしに、または医学的に許容される生理学的効果を伴う治療効果を提供し、これは医学分野の当業者によって決定され得る。従来の薬学的に許容される投与経路には、限定されないが、所望の臓器（例えば、脳、ＣＳＦ、肝臓（任意選択的に、肝動脈を介して）、肺、心臓、眼、腎臓）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、髄腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、実質内、脳室内、髄腔内、ＩＣＭ、腰椎穿刺、および他の非経口の投与経路が含まれる。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。
ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の用量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重、および健康状態などの要因に依存し、したがって、患者間で異なり得る。例えば、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の治療に有効なヒト投与量は、一般に、１ｍＬ当たり約１×１０９～１×１０１６個のベクターゲノムコピーを含有する約１００ｍＬの領域に対して約２５～約１０００マイクロリットルの範囲である。特定の実施形態では、約１ｍＬ～約１５ｍＬ、または約２．５ｍＬ～約１０ｍＬ、または約５ｍＬの体積の懸濁液が送達される。特定の実施形態では、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、または約１５ｍＬの体積の懸濁液が送達される。
いくつかの実施形態では、組成物は、単回用量で投与するためのものである。いくつかの実施形態では、組成物は、複数回用量で投与するためのものである。
特定の実施形態では、患者当たり約８×１０１２ゲノムコピー（ＧＣ）のｒＡＡＶ．ＧＬＢ１～患者当たり約３×１０１４ＧＣのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の用量が、本明細書に記載の体積で投与される。特定の実施形態では、患者当たり約２×１０１２ＧＣのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１～患者当たり約３×１０１４ＧＣのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１、または患者当たり約２×１０１３ＧＣのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１～患者当たり約３×１０１４ＧＣのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１、または患者当たり約８×１０１３ＧＣのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１～患者当たり約３×１０１４ＧＣのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１、または患者当たり約９×１０１３ＧＣのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１、または合計で約８．９×１０１２～２．７×１０１４ＧＣの用量が、上述の体積で投与される。
特定の実施形態では、脳質量１ｇ当たり１×１０１０ＧＣ（ＧＣ／ｇ脳質量）のｒＡＡＶ．ＧＬＢ１～３．４×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量が、本明細書に記載される体積で投与される。特定の実施形態では、３．４×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～３．４×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量、または１．０×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量～３．４×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量、または約１．１×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量、または約１．１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３．３×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量が、上述の体積で投与される。特定の実施形態では、脳質量１グラム当たり約３．０×１０９、約４．０×１０９、約５．０×１０９、約６．０×１０９、約７．０×１０９、約８．０×１０９、約９．０×１０９、約１．０×１０１０、約１．１×１０１０、約１．５×１０１０、約２．０×１０１０、約２．５×１０１０、約３．０×１０１０、約３．３×１０１０、約３．５×１０１０、約４．０×１０１０、約４．５×１０１０、約５．０×１０１０、約５．５×１０１０、約６．０×１０１０、約６．５×１０１０、約７．０×１０１０、約７．５×１０１０、約８．０×１０１０、約８．５×１０１０、約９．０×１０１０、約９．５×１０１０、約１．０×１０１１、約１．１×１０１１、約１．５×１０１１、約２．０×１０１１、約２．５×１０１１、約３．０×１０１１、約３．３×１０１１、約３．５×１０１１、約４．０×１０１１、約４．５×１０１１、約５．０×１０１１、約５．５×１０１１、約６．０×１０１１、約６．５×１０１１、約７．０×１０１１、約７．５×１０１１、約８．０×１０１１、約８．５×１０１１、約９．０×１０１１ＧＣの用量が、上述の体積で投与される。特定の実施形態では、用量は、ＧＭ１動物モデルで示された最小有効用量を反映し、脳質量１グラム当たりのゲノムコピーに基づいて、ヒト患者で使用するために調整された。一実施形態では、ヒト患者で使用するための用量は、以下の表に列挙される想定脳質量を使用して計算される。
Figure 2023513487000005
Figure 2023513487000006
任意の副作用に対する治療効果のバランスをとるために、投薬量を調整し、そのような投薬量は、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１が利用されるための治療用途に応じて変化し得る。導入遺伝子産物（例えばβ－ｇａｌ）の発現のレベルをモニタリングして、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１、好ましくはミニ遺伝子（例えば、ＧＬＢ１遺伝子）を含有するｒＡＡＶをもたらす投薬頻度を決定することができる。任意選択的に、治療目的で記載されているものと同様の投与レジメンは、本発明の組成物を使用した免疫化に利用され得る。
複製欠損性ウイルス組成物は、投薬量単位で製剤化され、ヒト患者にとって、（対象を治療するために）約１．０×１０９ＧＣ～約１．０×１０１６ＧＣの範囲にある量の複製欠損性ウイルス（例えば、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１、またはｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１）を含有し、その範囲内のすべての整数または小数量、好ましくは１．０×１０１２ＧＣ～１．０×１０１４ＧＣを含有し得る。一実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、または９×１０９ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、または９×１０１０ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、または９×１０１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、または９×１０１３ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、または９×１０１４ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、または９×１０１５ＧＣを含むように製剤化される。一実施形態では、ヒトへの適用のために、用量は、範囲内のすべての整数または少数を含む、用量当たり１×１０１０～約１×１０１２ＧＣの範囲であり得る。
これらの上述の用量は、治療される領域のサイズ、使用されるウイルス力価、投与経路、および方法の所望の効果に応じて、約２５～約１０００マイクロリットルの範囲、またはそれより大きな体積、またはその範囲内のすべての数を含む様々な体積の担体、賦形剤、もしくは緩衝液製剤で投与され得る。一実施形態では、担体、賦形剤または緩衝液の体積は、少なくとも約２５μＬである。一実施形態では、体積は、約５０μＬである。別の実施形態では、体積は、約７５μＬである。別の実施形態では、体積は、約１００μＬである。別の実施形態では、体積は、約１２５μＬである。別の実施形態では、体積は、約１５０μＬである。別の実施形態では、体積は、約１７５μＬである。さらに別の実施形態では、体積は、約２００μＬである。別の実施形態では、体積は、約２２５μＬである。さらに別の実施形態では、体積は、約２５０μＬである。さらに別の実施形態では、体積は、約２７５μＬである。さらに別の実施形態では、体積は、約３００μＬである。さらに別の実施形態では、体積は、約３２５μＬである。別の実施形態では、体積は、約３５０μＬである。別の実施形態では、体積は、約３７５μＬである。別の実施形態では、体積は、約４００μＬである。別の実施形態では、体積は、約４５０μＬである。別の実施形態では、体積は、約５００μＬである。別の実施形態では、体積は、約５５０μＬである。別の実施形態では、体積は、約６００μＬである。別の実施形態では、体積は、約６５０μＬである。別の実施形態では、体積は、約７００μＬである。別の実施形態では、体積は、約７００～１０００μＬである。いくつかの実施形態では、体積は、約１ｍＬ～１０ｍＬであり、いくつかの実施形態では、体積は、１５ｍＬ未満である。
特定の実施形態では、用量は、約１×１０９ＧＣ／ｇ脳質量から約１×１０１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約３×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約１．８５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。
一実施形態では、ウイルス構築物は、少なくとも約少なくとも１×１０９ＧＣ～約１×１０１５、または約１×１０１１～５×１０１３ＧＣの用量で送達され得る。これらの用量および濃度の送達のために好適な体積は、当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの体積が選択されてもよく、成人のために、より高体積が選択される。典型的には、新生児のために、好適な体積は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年長の乳児のために、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択され得る。幼児のために、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの体積が選択され得る。小児のために、最大約３０ｍＬの体積が選択され得る。１０代前半および１０代のために、最大約５０ｍＬの体積が選択され得る。さらに他の実施形態では、患者は、約５ｍＬ～約１５ｍＬの体積での髄腔内投与を受けてもよく、これが選択されるか、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬを受けてもよい。他の適切な体積および投薬量が決定され得る。任意の副作用に対する治療効果のバランスをとるために、投薬量を調整してもよく、そのような投薬量は、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１が利用されるための治療用途に応じて変化し得る。
上述のｒＡＡＶ．ＧＬＢ１は、公開された方法に従って宿主細胞に送達され得る。好ましくは生理学的に適合性のある担体に懸濁されたｒＡＡＶは、ヒトまたは非ヒト哺乳類患者に投与され得る。特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、ｒＡＡＶは、好適には、生理食塩水、界面活性剤、および生理学的に適合性の塩または塩の混合物を含有する水溶液に懸濁される。好適には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～９、またはｐＨ６．０～７．５、またはｐＨ６．２～７．７、またはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、またはｐＨ７．２～７．８、または約ｐＨ７．０の範囲に調整される。特定の実施形態では、製剤は、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、または約７．８のｐＨに調整される。特定の実施形態では、髄腔内送達の場合、約７．２８～約７．３２、約６．０～約７．５、約６．２～約７．７、約７．５～約７．８、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、または約７．８のｐＨが望ましいが、静脈内送達の場合、約６．８～約７．２のｐＨが望ましい可能性がある。しかしながら、より広範囲にある他のｐＨ、およびこれらの下位範囲が、他の送達経路のために選択され得る。
別の実施形態では、組成物は、担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを含む。好適な担体は、導入ウイルスが指向する適応症の観点で、当業者によって容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体は、生理食塩水を含み、様々な緩衝化溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）を用いて製剤化され得る。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、および水が挙げられる。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが注入チューブに粘着するのを防ぐが、インビボでのｒＡＡＶ結合活性を妨害しない構成要素を含むべきである。好適な界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせは、非毒性である非イオン性界面活性剤の中から選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するポロキサマー１８８（商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８としても知られている）などの、末端が一級ヒドロキシル基の二機能性ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ－オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般的に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの場合）の後に３桁の数字で命名され、最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与え、最後の１桁×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与える。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％の量で存在してもよい。
一例では、製剤は、例えば、水中に塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ）、二塩基性リン酸ナトリウム、およびそれらの混合物のうちの１つ以上を含む、緩衝化食塩水溶液を含有し得る。好適には、髄腔内送達のために、モル浸透圧濃度は、脳脊髄液と適合する範囲内（例えば、約２７５ミリオスモル／リットル（ｍＯｓｍ／Ｌ）～約２９０ｍＯｓｍ／Ｌ）である。例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／－ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６－ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照されたい。任意選択的に、髄腔内送達では、商業的に入手可能な希釈剤が懸濁化剤として、または別の懸濁化剤および他の任意選択的な賦形剤と組み合わせて使用され得る。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ（登録商標）溶液［Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照されたい。各１０ｍＬのＥｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ溶液には以下が含まれる：塩化ナトリウム、ＵＳＰ－７３ｍｇ；重炭酸ナトリウム、ＵＳＰ－１９ｍｇ；デキストロース、ＵＳＰ－８ｍｇ；硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ、ＵＳＰ－３ｍｇ；塩化カリウム、ＵＳＰ－３ｍｇ；塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ、ＵＳＰ－２ｍｇ；リン酸ナトリウム、二塩基性・７Ｈ２Ｏ、ＵＳＰ－２ｍｇ；注射用水、ＵＳＰ－１０ｍＬになるまでの量。電解質の濃度：ナトリウム（１４９ｍＥｑ／リットル）；重炭酸塩（２２．６ｍＥｑ／リットル）；カリウム（４．０ｍＥｑ／リットル）；塩化物（１３２ｍＥｑ／リットル）；カルシウム（２．７ｍＥｑ／リットル）；硫酸塩（２．４ｍＥｑ／リットル）；マグネシウム（２．４ｍＥｑ／リットル）；リン酸塩（１．５ｍＥｑ／リットル）。
成分の式および分子量は、以下のとおりである。
Figure 2023513487000007
Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ溶液のｐＨは６～７．５であり、モル浸透圧濃度は、１リットル当たり２８８ｍＯｓｍｏｌである（計算値）。特定の実施形態では、髄腔内最終製剤緩衝液（ＩＴＦＦＢ）製剤緩衝液は、緩衝生理食塩水、ならびにナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、またはそれらの混合物のうちの１つ以上を含む人工脳脊髄液と、界面活性剤とを含む。特定の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の約０．０００５％～約０．００１％を含む。さらなる実施形態では、パーセンテージ（％）は、重量（ｗ）比（すなわち、ｗ／ｗ）に基づいて計算される。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１（例えば、ＩＴＦＦＢ製剤）を含有する組成物は、ｐＨが、６．０～７．５、または６．２～７．７、または６．８～８、または７．２～７．８、または７．５～８の範囲にある。特定の実施形態では、最終製剤は、ｐＨが、約７、または７～７．４、または７．２である。特定の実施形態では、髄腔内送達の場合、７．５を超えるｐＨ、例えば、７．５～８、または７．８が望ましい場合がある。
特定の実施形態では、髄腔内送達ならびに他の送達経路には、約７のｐＨが望ましい。
特定の実施形態では、製剤は、重炭酸ナトリウムを含まない緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。かかる製剤は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、およびこれらの組み合わせのうちの１つ以上を水中に含む緩衝生理食塩水溶液、例えば、Ｈａｒｖａｒｄ緩衝液を含有し得る。水溶液は、以前はＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８という商品名で販売されていたＢＡＳＦから市販されているポロキサマーであるＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８をさらに含有し得る。特定の実施形態では、水溶液は、７．２のｐＨを有し得る。特定の実施形態では、水溶液は、約７のｐＨを有し得る。
別の実施形態では、製剤は、１ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、１．４ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、０．８ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、および０．００１％のポロキサマー（例えば、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標））１８８を含む、緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。特定の実施形態では、製剤は、約７．２のｐＨを有する。特定の実施形態では、製剤は、約７のｐＨを有する。例えば、ｈａｒｖａｒｄａｐｐａｒａｔｕｓ．ｃｏｍ／ｈａｒｖａｒｄ－ａｐｐａｒａｔｕｓ－ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ－ｆｌｕｉｄ．ｈｔｍｌを参照されたい。特定の実施形態では、Ｈａｒｖａｒｄ緩衝液は、Ｈａｒｖａｒｄ緩衝液でより良好なｐＨ安定性が観察されるため、好ましい。以下の表は、Ｈａｒｖａｒｄ緩衝液とＥｌｌｉｏｔ’ｓ Ｂ緩衝液の比較を提供する。
脳脊髄液（ＣＳＦ）組成物
Figure 2023513487000008
特定の実施形態では、製剤緩衝液は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含む人工ＣＳＦである。他の実施形態では、製剤は、１つ以上の浸透促進剤を含有し得る。適切な浸透促進剤の例は、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、またはＥＤＴＡを含んでもよい。
任意選択的に、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体に加えて、防腐剤または化学的安定剤などの他の従来の医薬成分を含み得る。好適な例示的な防腐剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学的安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。
本発明による組成物は、上に定義されるような薬学的に許容される担体を含み得る。好適には、本明細書に記載される組成物は、薬学的に好適な担体に懸濁され、および／または注射、浸透ポンプ、髄腔内カテーテルを介して対象に送達するために、または別のデバイスもしくは経路による送達のために設計された好適な賦形剤と混合された１つ以上のＡＡＶを有効量含む。一例では、組成物は、髄腔内送達用に製剤化される。一実施形態では、組成物は、大槽内注射（ＩＣＭ）を介した投与用に製剤化される。一実施形態では、組成物は、大槽内へのＣＴガイド下の後頭下注射を介した投与のために製剤化される。
本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」または「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への注射を介する、より特定的には、脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するようにクモ膜下腔への注射を介する、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰部穿刺、脳室内（側脳室内（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／槽内、および／またはＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰椎穿刺の手段によって、クモ膜下腔全体に拡散させるために導入され得る。別の例では、大槽内への注射であってもよい。
本明細書で使用される場合、「大槽内送達」または「大槽内投与」という用語は、小脳延髄大槽の脳脊髄液への直接的な薬物の投与経路、より具体的には、後頭下穿刺による、もしくは大槽内への直接注射による、または永続的に配置されたチューブによる、薬物の投与経路を指す。
特定の実施形態では、製剤緩衝液および本明細書に提供されるｒＡＡＶ．ＧＬＢ１（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１）を含む水性組成物が、それを必要とする患者に送達される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１は、ＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶｈｕ６８カプシド）および５’ＡＡＶ ＩＴＲ－プロモーター－任意選択的なエンハンサー－任意選択的なイントロン－ＧＬＢ１遺伝子－ポリＡ－３’ＩＴＲを含むベクターゲノムを有する。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来ではない。特定の実施形態では、２つ以上のプロモーターが存在する。特定の実施形態では、エンハンサーは、ベクターゲノムに存在する。特定の実施形態では、２つ以上のエンハンサーが存在する。特定の実施形態では、イントロンは、ベクターゲノムに存在する。特定の実施形態では、エンハンサーおよびイントロンが存在する。特定の実施形態では、ポリＡは、ＳＶ４０ポリＡである。特定の実施形態では、ポリＡは、ウサギベータ－グロビン（ＲＢＧ）ポリＡである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ＣＢ７プロモーター－ＧＬＢ１遺伝子－ＲＢＧポリＡ－３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ＥＦ１ａプロモーター－ＧＬＢ１遺伝子－ＳＶ４０ポリＡ－３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ＵｂＣプロモーター－ＧＬＢ１遺伝子－ＳＶ４０ポリＡ－３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号５を有する。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号６を有する。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号７を有する。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号８を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１２の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１３の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１４の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１５の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１６の配列を有する。
特定の実施形態では、最終製剤緩衝液は、緩衝生理食塩水、ならびにナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、またはそれらの混合物のうちの１つ以上を含む、人工脳脊髄液と、界面活性剤とを含む。特定の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の約０．０００５％～約０．００１％である。特定の実施形態では、界面活性剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８である。特定の実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８は、懸濁液の約０．０００１％の量で存在する。特定の実施形態では、組成物は、髄腔内送達の場合、ｐＨが７．５～７．８の範囲である。特定の実施形態では、組成物は、髄腔内送達の場合、ｐＨが、６．２～７．７、もしくは６．９～７．５の範囲、または約７である。一実施形態では、パーセンテージ（％）は、重量比または体積比に基づいて計算される。別の実施形態では、パーセンテージは、「最終体積１００ｍｌ当たりのグラム数」を表す。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物の治療は、感覚神経毒性および無症状性感覚ニューロン病変に関して十分に耐容性である、動物および／またはヒト患者におけるＤＲＧ感覚ニューロンの最小～軽度の無症状変性を有する。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、治療される対象／患者の機能的転帰および臨床転帰の改善に有用である。かかる転帰は、組成物の投与後、約３０日、約６０日、約９０日、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、約１３ヶ月、約１４ヶ月、約１５ヶ月、約１６ヶ月、約１７ヶ月、約１８ヶ月、約１９ヶ月、約２０ヶ月、約２１ヶ月、約２２ヶ月、約２３ヶ月、約２４ヶ月、約２．５年、約３年、約３．５年、約４年、約４．５年で測定されてもよく、次いで毎年、約５年まで測定されてもよい。測定頻度は、約１ヶ月毎、約２ヶ月毎、約３ヶ月毎、約４ヶ月毎、約５ヶ月毎、約６ヶ月毎、約７ヶ月毎、約８ヶ月毎、約９ヶ月毎、約１０ヶ月毎、約１１ヶ月毎、または約１２ヶ月毎であり得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、未治療の対照と比較して、治療された対象において測定される薬物動態および臨床有効性を示す。
特定の実施形態では、薬物動態有効性、臨床有効性、機能転帰、または臨床転帰は、以下のうちの１つ以上を介して測定され得る。（１）生存、（２）栄養チューブからの独立、（３）発作日記、例えば、発作の発生率、発症、頻度、長さ、および種類、（４）生活の質、例えばＰｅｄｓＱＬによって測定される、（５）神経認知発達および行動発達、（６）例えば血清またはＣＳＦにおけるβ－ｇａｌ酵素発現または活性、ならびに（７）本明細書に記載される他のパラメータ。ベイリー乳幼児発達およびヴァインランド尺度を使用して、適応行動、認知、言語、運動機能、および健康に関連する生活の質における発達および／または変化に対して組成物が及ぼす影響を定量化し得る。
特定の実施形態では、神経認知発達は、ベイリー乳幼児発達尺度の年齢に相当する認知、粗大運動、微細運動、受容的および表現的コミュニケーションスコアの変化、ヴァインランド適応行動尺度の各ドメインについての標準スコアの変化、ならびに小児の生活の質調査および小児の生活の質調査の乳児尺度（ＰｅｄｓＱＬおよびＰｅｄｓＱＬ－ＩＳ）に対する総スコアの変化による小児の生活の質のうちの１つ以上に基づく。
ＢＳＩＤ（ベイリー乳幼児発達）を主に使用して、１～４２ヶ月齢の乳児および幼児の発達を評価する（Ａｌｂｅｒｓ ａｎｄ Ｇｒｉｅｖｅ，２００７，Ｔｅｓｔ Ｒｅｖｉｅｗ：Ｂａｙｌｅｙ，Ｎ．（２００６）．Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ－Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ：Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｓｙｃｈｏｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．２５（２）：１８０－１９０）。これは、標準化された一連の発達遊びタスクで構成され、うまく完了したアイテムの生のスコアを、スコアと複合スコアに変換し、スコアを、典型的には同じ年齢の発達している子供から得られた標準と比較することによって、発達指数を導き出す。Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩには、以下の３つの主なサブテストがある。見慣れている物体と見慣れていない物体への注意、落とした物体を探すこと、および遊んでいるふり、などの項目が含まれる認知スケール、言語の理解および表現を評価する（例えば、指示に従う能力および物体に名前を付ける能力）言語スケール、ならびに粗大運動スキルと微細運動スキル（例えば、掴むこと、座ること、ブロックを積み重ねること、階段を登ること）を測定する運動スケール。最新バージョンは、ＢＳＩＤ－ＩＩＩである。
Ｖｉｎｅｌａｎｄ：コミュニケーション、日常生活スキル、社会性、運動スキル、不適応行動の５つの領域にわたって、誕生から成人（０～９０歳）までの適応行動を評価する。最新バージョンは、Ｖｉｎｅｌａｎｄ ＩＩＩである。Ｖｉｎｅｌａｎｄ－ＩＩからＶｉｎｅｌａｎｄ－ＩＩＩへの改善には、発達障害をよりよく理解することができるような質問が組み込まれている。
ＢＳＩＤおよびＶｉｎｅｌａｎｄは、乳児ＧＭ１ガングリオシドーシス患者の前向き研究のみからのデータに基づいて選択される（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ－Ｐｉｅｒｒｉ ａｎｄ Ｓｃａｇｌｉａ，２００８，ＧＭ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ：Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．９４（４）：３９１－３９６）。ＢＳＩＤ－ＩＩＩの年齢等価スコアは、認知および粗大運動のドメインの両方について２８ヶ月齢までに試験尺度の床への低下を示し、Ｖｉｎｅｌａｎｄ－ＩＩ適応行動尺度のスコアは、２８ヶ月齢までには、正常をはるかに下回るものの、測定可能なままであった。これらのツールは床効果（ｆｌｏｏｒ ｅｆｆｅｃｔ）を示しているが、この重度の障害のある集団の発達変化を測定するための適切な尺度であることが示され、尺度の交差文化的妥当性により、国際的な研究に適している。
ＰｅｄｓＱＬおよびＰｅｄｓＱＬ－ＩＳ：重度の小児疾患の場合と同様に、疾患の家族への負担は著しい。小児の生活の質調査（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ（商標））は、子供とその親の生活の質を評価するための検証されたツールである（親の代理人レポートによる）。このことは、健康な小児および青少年で検証され、様々な小児疾患で使用されてきた（Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｔｈｅ ＰｅｄｓＱＬ ｉｎ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ：ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ，ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｖａｌｉｄｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｃｏｒｅ Ｓｃａｌｅｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｍｏｄｕｌｅ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ＮＭＤ．１９（１２）：８０５－８１２、Ａｂｓｏｕｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ ＵＫ ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｓｔｕｄｙ （ＰＵＤＤＬＳ）．”ＢＭＣ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．１１（１）：６８、およびＣｏｎｓｏｌａｒｏ ａｎｄ Ｒａｖｅｌｌｉ，２０１６，Ｃｈａｐｔｅｒ ５－Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｔｏｏｌｓ ｉｎ Ｊｕｖｅｎｉｌｅ Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｒ． Ｃｉｍａｚ ａｎｄ Ｔ．Ｌｅｈｍａｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．１１：１０７－１２７）。したがって、ＰｅｄｓＱＬは、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１が患者およびその家族の生活の質に及ぼす影響を評価するために含まれている。これは、２歳以上の子供の親に適用することができ、したがって、５年間のフォローアップ期間にわたる子供の年齢として有益であり得る。小児の生活の質調査の乳児尺度（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ（商標） Ｉｎｆａｎｔ Ｓｃａｌｅ）（Ｖａｒｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，”Ｔｈｅ ＰｅｄｓＱＬ（商標）Ｉｎｆａｎｔ Ｓｃａｌｅｓ：ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ，ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｖａｌｉｄｉｔｙ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ａｎｄ ｉｌｌ ｉｎｆａｎｔｓ．”Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０（１）：４５－５５）は、親によって記入された検証済みモジュラー手段であり、特に１～２４ヶ月齢の健康な乳児および病気の乳児のための健康関連の生活の質の手段を測定するように設計されている。
標的集団における疾患の重症度を考慮すると、対象は、登録までに運動スキルを達成したか、他の運動マイルストーンが発達し、その後に失われたか、または運動マイルストーンの発達の徴候がまだ示されていない場合がある。評価は、すべてのマイルストーンについて、達成時年齢と喪失時年齢を追跡する。運動マイルストーンの達成度は、セクションＩのＧＭ１および治療ＧＬＢ１遺伝子の下で本明細書に提供される表に概説されるＷＨＯ基準に基づいて６つの粗大マイルストーンに定義されている。乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する対象は、生後数ヶ月以内に症状を発症する可能性があり、第１のＷＨＯ運動マイルストーン（支えなしに座る）の獲得は、典型的には、４ヶ月齢より前には現れないことを考慮すると（中央値：５．９ヶ月齢）、このエンドポイントは、特に治療時により明らかな症状を有していた対象において、治療的利益の程度を評価するための感度を欠く場合がある。（Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅｓ．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｖ．３７（１）：２５－３７；ｑｕｉｚ ３８，４７）。１つの欠点は、公開されたツールは、臨床医および保護者が使用することを意図しており、通常の範囲を参照せずにマイルストーン獲得の典型的な年齢を中心としたスキルを整理することである。しかしながら、データは、乳児ＧＭ１疾患を有する未治療の子供または定型発達の子供における典型的な獲得時間と比較して、経時的な発達マイルストーンの保持、獲得、または喪失を要約するために有益であり得る。
疾患が進行すると、小児は、発作を起こす可能性がある。発作活動の開始により、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１による治療が、発作の発症を予防もしくは遅延させるか、またはこの集団における発作事象の頻度を減少させるかのいずれかを決定することが可能になる。保護者は、発作の発症、頻度、長さ、および種類を追跡する、発作日記をつけるように求められる。
また、特定の実施形態では、薬物動態有効性、臨床有効性、機能転帰、または臨床転帰は、疾患のＣＮＳ症状、例えば、経時的にＭＲＩで測定される体積変化を含んでもよい。すべてのガングリオシドーシスの乳児の表現型は、脳組織体積（大脳皮質および他のより小構造）および脳室体積の両方で、巨頭症および頭蓋内ＭＲＩ体積の急速な増加と一貫したパターンを有することが示された。加えて、脳梁、尾状核、および被殻、ならびに小脳皮質を含む様々な小さな脳の下部構造は、疾患の進行に伴って一般的にサイズが減少する（Ｒｅｇｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｓ、およびＮｅｓｔｒａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８、本明細書で引用）。ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１による治療は、ＣＮＳ疾患の症状の進行を遅らせるか、または停止させることができ、萎縮および体積変化における安定化の証拠を伴う。視床および基底核におけるＴ１／Ｔ２シグナル強度の変化（正常／異常）は、ＧＭ１およびＧＭ２ガングリオシドーシス患者における視床構造の変化に関する報告された証拠に基づいて、含まれることもある（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｋａｓｈｉｍａ，１９９４，Ｔｈａｌａｍｉｃ ｈｙｐｅｒｄｅｎｓｉｔｙ ｏｎ ＣＴ ｉｎ ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ＧＭ１－ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ．”Ｂｒａｉｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１６（６）：４７２－４７４）。特定の実施形態では、薬物動態有効性、臨床有効性、機能転帰、または臨床転帰は、ＭＲＩによって測定される総脳体積、脳下部構造体積、および側室体積の変化、ならびに／または視床および基底核の活性におけるＴ１／Ｔ２シグナル強度の変化を含み得る。
代替的に、または追加的に、薬力学的有効性、臨床有効性、機能転帰、または臨床転帰は、バイオマーカー、例えば、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の薬力学および生物学的活性、ＣＳＦおよび血清中で測定され得るβ－ｇａｌ酵素活性、ＣＳＦ ＧＭ１濃度、血清および尿のケラタン硫酸レベル、ヘキソサミニダーゼ活性の低下、ならびに乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスにおいて一貫した急速な萎縮を示す脳ＭＲＩを含み得る（Ｒｅｇｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ、本明細書で引用）。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、疾患の進行を遅らせるのに有用であり、例えば、達成時の年齢、喪失時の年齢、ならびに（世界保健機関（ＷＨＯ）基準によって定義される）年齢に適した発達および運動のマイルストーンを維持または獲得する小児の割合によって評価される。
特定の実施形態では、薬物動態有効性、臨床有効性、機能転帰、または臨床転帰は、肝臓および脾臓体積、ならびに／またはＥＥＧおよび視覚誘発電位（ＶＥＰ）を含み得る。
ＶＩ．脳脊髄液への薬学的組成物の送達のための装置および方法
一態様では、本明細書に提供されるｒＡＡＶまたは組成物は、このセクションで提供され、かつＷＯ２０１８／１６０５８２（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法および／またはデバイスを介して髄腔内投与され得る。別の適切なデバイスは、２０２０年１月３１日に出願された「Ｍｉｃｒｏｃａｔｈｅｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｄ／ｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ Ｓｐａｃｅ」という名称のＰＣＴ／ＵＳ２０／１４４０２に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。代替的に、他のデバイスおよび方法が選択され得る。
特定の実施形態では、本方法は、脊髄針を介する、患者の大槽内へのＣＴガイド下の後頭下注射のステップを含む。本明細書で使用される場合、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）という用語は、軸に沿って作成された一連の平面断面画像から、コンピュータによって身体構造の三次元画像が構築される放射線撮影を指す。
治療日に、適切な濃度のｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を調製する。適切な濃度で適切な体積（例えば、３．６ｍＬ、４．６ｍＬ、または５．６ｍＬ）のｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を含有するシリンジを、処置室に送る。治験薬投与には、以下の担当者が同席する：処置を行う介入医、麻酔科医および呼吸器技師、看護師および医師助手、ＣＴ（または手術室）技師、施設研究コーディネーター。薬物投与の前に、腰椎穿刺を実施して、所定の体積のＣＳＦ（例えば、約５ｍＬ）を除去し、次いで、大槽の関連する解剖学的構造の可視化を補助するために、ヨード造影剤を髄腔内（ＩＴ）に注射する。静脈内（ＩＶ）造影剤は、髄腔内造影剤の添加物として、針穿刺の前またはその間に投与され得る。対象は、麻酔され、挿管され、処置テーブルに配置される。滅菌技術を使用して、注射部位を準備し、覆布をかける。透視ガイド下、脊髄針（例えば、３ヶ月齢～１８歳の対象について２インチまたは３インチの２５Ｇ脊髄針）を大槽内に進める。より大きなイントロデューサ針を使用して、針の配置を補助し得る。針の配置を確認した後、エクステンションセットを脊椎針に取り付け、ＣＳＦで充填する。介入医の裁量で、造影材料を含有するシリンジをエクステンションセットに接続し、少量を注射して、大槽における針の配置を確認してもよい。ＣＴガイダンス＋／－造影剤注射によって針の配置を確認した後、適切な体積のｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を含有するシリンジをエクステンションセットに接続する。シリンジの内容物を、注射中にシリンジプランジャーに過度の力を加えることなく、ゆっくりと（例えば、約１～２分かけて）注射する。合計３ｍＬ、４ｍＬ、または５ｍＬのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を注射し、０．６ｍＬのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１が装置内に残る。針、エクステンションチューブ、およびシリンジを対象からゆっくりと取り出し、適切なバイオハザード廃棄物容器に廃棄するために手術トレイに置かれる。出血またはＣＳＦ漏出の徴候について針挿入部位を調べ、術者によって示されるように治療する。示されるように、ガーゼ、手術用テープ、および／または透明な創傷被覆材（例えば、Ｔｅｇａｄｅｒｍ）を使用して、部位を手当てする。包帯を配置した後、対象は、少なくとも２０分間、伏臥位のままである。対象は、ＣＴスキャナから出され、ストレッチャーの上に仰臥位で置かれる。輸送および位置決めの間に、対象の安全性を確保するために、十分な人数のスタッフが存在する必要がある。麻酔を中止し、対象は、麻酔後ケアのための施設ガイドラインに従って回復する。該当する場合は、神経生理学的機器を取り外す。ストレッチャーのヘッドは、およそ１時間の回復期間中、およそ２０～３０度まで下げられる。施設ガイドラインに従って、対象は、好適な麻酔後ケアユニットに輸送される。
本明細書に記載される髄腔内方法への追加的または代替的な投与経路は、例えば、全身、経口、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与を含む。
一実施形態では、用量は、脳質量によってスケール変更され、ＣＳＦ区画のサイズの近似値を提供する。さらなる実施形態では、用量変換は、成体マウスでは０．４ｇ、幼若アカゲザルでは９０ｇ、４～１８ヶ月齢の小児では８００ｇの脳室量に基づく。以下の表は、マウスＭＥＤ研究、ＮＨＰ毒性試験、および同等のヒト用量の例示的な用量を提供する。
Figure 2023513487000009
特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１は、単回用量で対象に投与される。特定の実施形態では、複数回の用量（例えば、２用量）が所望され得る。例えば、６ヶ月齢未満の乳児の場合、数日、数週間、または数ヶ月間隔での複数回の用量が望ましい場合がある。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、約１×１０９ＧＣ／ｇ脳質量～約５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、約１×１０９ＧＣ／ｇ脳質量～約３×１０１１ＧＣである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、約１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の用量は、１×１０１０ＧＣ／脳質量～約３．３３×１０１１ＧＣ／脳質量である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の用量は、１×１０１１ＧＣ／脳質量～約３．３３×１０１１ＧＣ／脳質量である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、１．１１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～３．３３×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～３．４×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、３．４×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～３．４×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、１．０×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量～３．４×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、約１．１×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、少なくとも１．１１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。他の実施形態では、異なる用量が選択され得る。
好ましい実施形態では、対象は、ヒト患者である。この場合、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、約１×１０１２ＧＣ～約３×１０１４ＧＣである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、９×１０１２ＧＣ～３×１０１４ＧＣである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の用量は、５×１０１３ＧＣ～３×１０１４ＧＣである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、８．９０×１０１３ＧＣ～２．７０×１０１４ＧＣである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、患者当たり８×１０１２ゲノムコピー（ＧＣ）～患者当たり３×１０１４ＧＣである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、患者当たり２×１０１３ＧＣ～患者当たり３×１０１４ＧＣである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、患者当たり８×１０１３ＧＣ～患者当たり３×１０１４ＧＣである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、患者当たり約９×１０１３ＧＣである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、少なくとも８．９０×１０１３ＧＣである。他の実施形態では、異なる用量が選択され得る。
組成物は、（体重７０ｋｇの平均対象を治療するために）約１×１０９ゲノムコピー（ＧＣ）～約５×１０１４ＧＣの範囲の量のＡＡＶを含有する投薬量単位で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、１×１０９ゲノムコピー（ＧＣ）～５×１０１３ＧＣ、１×１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）～５×１０１４ＧＣ、１×１０１１ＧＣ～５×１０１４ＧＣ、１×１０１２ＧＣ～５×１０１４ＧＣ、１×１０１３ＧＣ～５×１０１４ＧＣ、８．９×１０１３ＧＣ～５×１０１４ＧＣ、または８．９×１０１３ＧＣ～２．７×１０１４ＧＣの範囲の量のＡＡＶを含有するような投薬量単位で製剤化される。特定の実施形態では、組成物は、少なくとも１×１０１３ＧＣ、２．７×１０１３ＧＣ、または８．９×１０１３ＧＣの量のＡＡＶを含有するような投薬量単位で製剤化される。
一実施形態では、脊椎穿刺が行われ、約１５ｍＬ（以下）～約４０ｍＬのＣＳＦが除去され、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１がＣＳＦと混合され、かつ／または適合性の担体に懸濁され、対象に送達される。一例では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１濃度は、１×１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）～５×１０１４ＧＣ、１×１０１１ＧＣ～５×１０１４ＧＣ、１×１０１２ＧＣ～５×１０１４ＧＣ、１×１０１３ＧＣ～５×１０１４ＧＣ、８．９×１０１３ＧＣ～５×１０１４ＧＣ、または８．９×１０１３ＧＣ～２．７×１０１４ＧＣであるが、約１×１０９ＧＣ、約５×１０９ＧＣ、約１×１０１０ＧＣ、約５×１０１０ＧＣ、約１×１０１１ＧＣ、約５×１０１１ＧＣ、約１×１０１２ＧＣ、約５×１０１２ＧＣ、約１．０×１０１３ＧＣ、約５×１０１３ＧＣ、約１．０×１０１４ＧＣ、または約５×１０１４ＧＣなどの他の量である。特定の実施形態では、ＧＣ中の濃度は、脊椎穿刺当たりのＧＣとして示される。特定の実施形態では、ＣＧ中の濃度は、ｍＬ当たりＧＣとして示される。
併用療法は、本明細書で提供されるｒＡＡＶ．ＧＬＢ１組成物とともに送達され得る。本出願で先に記載したような併用療法は、参照により本明細書に組み込まれる。
そのような併用療法の１つは、免疫調節剤であり得る。かかる併用療法のための免疫抑制剤としては、限定されないが、グルココルチコイド、ステロイド、抗代謝剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシンまたはラパログ）、および細胞分裂阻害剤（アルキル化剤、抗代謝剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、またはイムノフィリンに対して活性な薬剤を含む）が挙げられる。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）特異的抗体またはＣＤ３特異的抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、またはＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）結合剤を含み得る。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子治療投与の前に開始され得る。かかる療法は、同じ日に２つ以上の薬物（例えば、プレドニゾロン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）および／またはシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の併用投与を伴い得る。これらの薬物のうちの１つ以上が、遺伝子療法投与後に、同じ用量または調整された用量で継続され得る。かかる療法は、必要に応じて、約１週間、約１５日間、約３０日間、約４５日間、６０日間、またはそれ以上であり得る。
例えば、ＧＭ１において栄養が懸念される場合、胃瘻管の配置が適切である。呼吸機能が悪化すると、気管切開または非侵襲性呼吸補助が提供される。パワーチェアおよび他の機器は、生活の質を向上させることができる。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という語句、およびその変形は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。明細書中の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言語を使用して提示されるが、他の状況下では、関連する実施形態は、「～からなる」または「～から本質的になる」という言語を使用して解釈され、記載されることも意図している。
「発現」という用語は、その最も広い意味で本明細書で使用され、ＲＮＡの産物、またはＲＮＡおよびタンパク質の産物を含む。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、特に、ペプチドまたはタンパク質の産生に関する。発現は、一過性のものであってもよく、または安定したものであってもよい。
本明細書で使用される場合、「ＮＡｂ力価」という用語は、その標的化されたエピトープ（例えば、ＡＡＶ）の生理学的効果を中和する中和抗体（例えば、抗ＡＡＶ Ｎａｂ）がどれだけ産生されるかの測定値である。抗ＡＡＶ ＮＡｂ力価は、例えば、Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００９．１９９（３）：ｐ．３８１－３９０に記載されているように測定されてもよく、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ＡＡＶまたは組成物の投与は、ＧＭ１ガングリオシドーシスの症状、またはＧＭ１ガングリオシドーシスの神経学的症状を改善する。一部の実施形態では、処置後、患者は、平均寿命の増加、栄養管の必要性の減少、発作の発生率および頻度の減少、神経認知低下への進行の減少、ならびに／または神経認知発達の改善のうちの１つ以上を有する。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、コード配列、プロモーターを含む核酸分子を指し、それらのための他の調節配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、２つ以上の発現カセットを含み得る。他の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、「発現カセット」と互換的に使用され得る。典型的には、ウイルスベクターを生成するためのこのような発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載の遺伝子産物のためのコード配列と、本明細書に記載されるものなどの他の発現制御配列と、を含有する。
タンパク質または核酸を参照して使用される場合、「異種性」という用語は、タンパク質または核酸が、天然における互いの関係と同じ関係で見出されない、２つ以上の配列または下位配列を含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するために配置された関連のない遺伝子からの２つ以上の配列を有する核酸は、典型的に、組換えにより産生される。例えば、一実施形態では、核酸は、ある遺伝子由来のプロモーターを有し、異なる遺伝子由来のコード配列の発現を指令するように配置される。したがって、コード配列を参照すると、プロモーターは、異種性である。
「複製欠損性ウイルス」または「ウイルスベクター」は、目的の遺伝子（例えば、ＧＬＢ１）を含有する発現カセットを含むベクターゲノムが、ウイルスカプシド（例えば、ＡＡＶまたはボカウイルス）またはエンベロープ中にパッケージングされ、さらにウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージングされた任意のウイルスゲノム配列が、複製欠陥性である、すなわち、それらは、後代ビリオンを生成することができないが、標的細胞に感染する能力を保持することができる、合成または人工ウイルス粒子を指す。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムは、人工ゲノムの増幅およびパッケージングに必要とされるシグナルに隣接する目的の遺伝子のみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、後代ビリオンによる複製および感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。
本明細書で使用される場合、「有効量」は、標的細胞において、ベクターゲノムからのゲノム産物の量を送達し、発現するｒＡＡＶ組成物の量を指す。有効量は、ヒト患者ではなく、むしろ動物モデルに基づいて決定され得る。好適なマウスまたはＮＨＰモデルの例は、本明細書に記載されている。
「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「エンハンサー（ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ）」は、１つ以上のエンハンサーを表すことに留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
上述のように、「約」という用語は、別段の指定がない限り、数値を修正するために使用される場合、±１０％の変動を意味する。
上に記載したとおり、「増加する」、「低下する」、「減少する」、「改善する」、「向上する」、「遅延する」、「早期」、「遅らせる」、「停止させる」、またはその任意の文法的変形、または任意の類似の用語は、変化を示し、別途指定されない限り、対応する参照（例えば、未治療の対照、対応するレベルのＧＭ１患者もしくは特定の段階でのＧＭ１患者、またはＧＭ１を有しない健常な対象もしくは健常なヒト）と比較して、約５倍、約２倍、約１倍、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％の変動を意味する。
本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」は、哺乳動物を指し、ヒト、獣医学用動物または農業用動物、家庭用動物または愛玩動物、ならびに通常臨床研究に使用される動物が含まれる。一実施形態では、これらの方法および組成物の対象は、ヒトである。特定の実施形態では、患者は、ＧＭ１を有する。
本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、当業者によって、および本明細書で使用される多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する、公開された文献を参照することによって、一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
以下の実施例は、単なる例示であり、本発明を限定することを意図していない。
実施例１：ＡＡＶｈｕ６８＋脱アミド化
ＡＡＶｈｕ６８を、修飾について分析した。簡潔にいうと、ＡＡＶｈｕ６８は、この研究に関連していないベクターゲノムを使用して産生され、各々は、２９３細胞における従来の三重トランスフェクション方法を使用して産生された。これらの技術の一般的な説明については、例えば、Ｂｅｌｌ ＣＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＡＡＶ９ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｌｕｎｇ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１１；１２１：２４２７－２４３５を参照されたい。簡潔にいうと、例えば、ＡＡＶ２逆位末端反復に隣接する、パッケージングされる配列をコードするプラスミド（ニワトリβ－アクチンプロモーターから発現される導入遺伝子、イントロン、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）後期遺伝子に由来するポリＡ）を、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドと、アデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＡｄΔＦ６）とを用いたＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションによってパッケージングした。得られたＡＡＶウイルス粒子は、ＣｓＣｌ勾配遠心分離を使用して精製し、濃縮し、後で使用するために凍結させることができる。
変性およびアルキル化：解凍したウイルス調製物（タンパク質溶液）１００μｇに、２μｌの１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）および２μｌの８Ｍ塩酸グアニジン（ＧｎｄＨＣｌ）を添加し、９０℃で１０分間インキュベートする。溶液を室温まで冷却し、次いで、新たに調製した１Ｍヨードアセトアミド（ＩＡＭ）５μｌを添加し、暗所で、室温で３０分間インキュベートする。３０分後、１μｌの１Ｍ ＤＴＴを添加することによって、アルキル化反応をクエンチする。
消化：最終ＧｎｄＨＣｌ濃度を８００ｍＭになるまで希釈する体積で、変性タンパク質溶液にｐＨ７．５～８の２０ｍＭ重炭酸アンモニウムを添加する。トリプシンとタンパク質との比率が１：２０になるようにトリプシン溶液を加え、３７℃で一晩インキュベートする。消化後、ＴＦＡを最終濃度が０．５％になるように添加し、消化反応をクエンチした。
質量分析：およそ１マイクログラムの組み合わせた消化混合物を、ＵＨＰＬＣ－ＭＳ／Ｍｓにより分析する。ＬＣは、ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行われる。移動相Ａは、０．１％ギ酸を含むＭｉｌｌｉＱ水である。移動相Ｂは、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルである。１５分間にわたって４％Ｂから６％Ｂへ、次いで、２５分間（合計４０分間）で１０％Ｂへ、その後４６分間（合計８６分間）で３０％ＢへとＬＣ勾配を実行する。試料をカラムに直接ロードする。カラムサイズは、７５ｃｍ×１５ｕｍの内径であり、２ミクロンのＣ１８媒体（Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ）が充填される。ＬＣは、ソースを使用したＮａｎｏｆｌｅｘエレクトロスプレーイオン化を介して、四重極－オービトラップ質量分析器（Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にインターフェースされる。カラムを３５℃まで加熱し、２．２ｋＶのエレクトロスプレー電圧を印加する。質量分析器は、上位２０個のイオンからタンデム質量スペクトルを取得するようにプログラムされている。最大ＭＳ分解能は１２０，０００、ＭＳ／ＭＳ分解能は３０，０００。正規化された衝突エネルギーは３０、自動ゲイン制御は１ｅ５、最大充填ＭＳは１００ｍｓ、最大充填ＭＳ／ＭＳは５０ｍｓに設定されている。
データ処理：質量分析器の生データファイルをＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ １．０ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析した。簡潔には、すべての検索は、１０ｐｐｍの前駆体質量許容差（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍａｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、５ｐｐｍの断片質量許容差（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｍａｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、トリプシン切断（ｔｒｙｐｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ）、最大１個の未切断（ｍｉｓｓｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ）、システインアルキル化の固定修飾（ｆｉｘｅｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、メチオニン／トリプトファンの酸化、アスパラギン／グルタミンの脱アミド化、リン酸化、メチル化、およびアミド化の可変修飾（ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を必要とした。
以下の表では、Ｔは、トリプシンを指し、Ｃは、キモトリプシンを指す。
Figure 2023513487000010
Figure 2023513487000011
Figure 2023513487000012
ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質の場合、４個の残基（Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、Ｎ５１２）は、７０％を超える脱アミド化レベルを日常的に示し、様々なロットにわたって、ほとんどの場合９０％を超える。さらなるアスパラギン残基（Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７、およびＱ５９９）も、様々なロットにわたって最大約２０％の脱アミド化レベルを示す。脱アミド化レベルは、最初にトリプシン消化を使用して特定され、キモトリプシン消化で検証された。
したがって、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質を含むＡＡＶは、ＡＡＶが、異なるレベルの脱アミド化を示すＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質を含有することができるため、カプシドタンパク質の異種集団を含み得る。様々なレベルの脱アミド化を有するＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質の異種集団は、配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号１から産生されるｖｐ１タンパク質、または配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質であり得る。様々なレベルの脱アミド化を有するＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質の異種集団は、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、または配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質であり得る。様々なレベルの脱アミド化を有するＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質の異種集団は、配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ３、配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、または配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質であり得る。
成体アカゲザルに、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ（３．００×１０１３ＧＣ）をＩＣＭ投与し、２８日後に剖検して、ベクターの形質導入を評価した。脳の広範な領域でＡＡＶｈｕ６８の形質導入が観察された（データは示さず）。したがって、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＣＮＳにおけるクロスコレクション（ｃｒｏｓｓ－ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）の可能性を提供する。
実施例２：製造－構成要素および材料
ベクターは、ＡＡＶ２逆位末端反復に隣接する、サイトメガロウイルスエンハンサー（ＣＢ７）を有するニワトリベータアクチンプロモーター［配列番号１０］、ヒト伸長開始因子１アルファプロモーター（ＥＦ１ａ）［配列番号１１］、またはヒトユビキチンＣプロモーター（ＵｂＣ）［配列番号９］（１２２９ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｄ６３７９１．１）］から発現されるヒトＧＬＢ１のコード配列を含有するシスプラスミドから構築される。ヒトＧＬＢ１の様々なコード配列［配列番号４のａａ配列］が構築される。野生型配列は、配列番号５で再現される。様々な操作されたＧＬＢ１コード配列を生成し、配列番号６、７、または８に提供される。
ベクターは、接着性ＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションによってＡＡＶ血清型ｈｕ６８カプシドにパッケージングされ、Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ，Ｓｉｍｐｌｅ，ａｎｄ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ Ｓｃａｌｅ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１，１２５９－１２７１（２０１０）に既に記載されているように、イオジキサノール勾配遠心分離によって精製される。ＡＡＶ血清型Ｈｕ６８カプシドは、ＷＯ２０１８／１６０５８２に記載される（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
より具体的には、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１は、１）ＡＡＶシスベクターゲノムプラスミド、２）ＡＡＶ２複製酵素（ｒｅｐ）およびＡＡＶｈｕ６８カプシド（ｃａｐ）をコードするｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲと称されるＡＡＶトランスプラスミド、および３）ｐＡｄΔＦ６．ＫａｎＲと称されるヘルパーアデノウイルスプラスミドによるヒトＨＥＫ２９３ＷＣＢ細胞の三重プラスミドトランスフェクションによって産生される。
ＡＡＶシスベクターゲノムプラスミドの配列エレメントの説明：
・逆位末端反復（ＩＴＲ）：ＩＴＲは、ベクターゲノムのすべての構成要素に隣接するＡＡＶ２（１３０ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＣ００１４０１）に由来する同一の逆相補配列である。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶおよびアデノウイルスヘルパー機能がトランスで提供される場合、ベクターＤＮＡ複製起点およびベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能する。したがって、ＩＴＲ配列は、ベクターゲノム複製およびパッケージングに必要な唯一のシス配列を表す。
・プロモーター：ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターに由来する調節エレメント：この遍在性プロモーター（１２２９ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｄ６３７９１．１）を選択して、任意のＣＮＳ細胞型における導入遺伝子の発現を駆動した。
・コード配列：ＧＬＢ１遺伝子は、ベータ－ガラクトシダーゼをコードし、最大化されたヒトコドン使用に基づく。ＧＬＢ１酵素は、ガングリオシドからのβ結合ガラクトースの加水分解を触媒する（６７７ａａについての２０３４ｂｐポリヌクレオチドおよび終止コドン、Ｇｅｎｂａｎｋ ＃ＡＡＡ５１８１９．１，ＥＣ３．２．１．２３）。
・キメライントロン（ＣＩ）－ヒトβ－グロビンスプライスドナーおよび免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）スプライスアクセプターエレメントからなるハイブリッドイントロン。
・ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（２３２ｂｐ）：ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、シスで遺伝子ｍＲＮＡの効率的なポリアデニル化を促進する。このエレメントは、転写終結、新生転写物の３’末端における特異的切断事象、および長鎖ポリアデニル尾部の付加のためのシグナルとして機能する。
ＡＡＶｈｕ６８トランスプラスミド：ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲ
ＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスプラスミドｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲは、ペンシルベニア大学のＤｒ．Ｊａｍｅｓ Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎの研究室内で構築された。ＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスプラスミドは、ＡＡＶベクターゲノムの複製およびパッケージングに必要とされる４つの野生型（ＷＴ）ＡＡＶ２複製酵素（Ｒｅｐ）タンパク質をコードする。また、ＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスプラスミドは、ＡＡＶベクターゲノムを収容するためにＡＡＶ血清型ｈｕ６８のビリオンシェルに組み立てられる３つのＷＴ ＡＡＶｈｕ６８ビリオンタンパク質カプシド（Ｃａｐ）タンパク質をコードする。ＡＡＶｈｕ６８配列は、ヒト心臓組織ＤＮＡから入手した。
ＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスプラスミドを作製するために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳベクターに由来するプラスミド骨格上の野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドｐＡＡＶ２／９ｎ由来のＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子を除去し、ＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ遺伝子と置き換えた。アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）遺伝子も、カナマイシン耐性（ＫａｎＲ）遺伝子で置き換え、ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲを得た。通常ｒｅｐ発現を駆動するＡＡＶ ｐ５プロモーターを、ｒｅｐの５’末端からキャップの３’末端へと移動し、ｒｅｐの上流の切断ｐ５プロモーターを残す。この切断プロモーターは、ｒｅｐの発現を下方制御し、結果として、ベクター産生を最大化する役割を果たす（図１Ｃ）。プラスミドのすべての構成要素部分は、直接配列決定によって確認されている。
ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）アデノウイルスヘルパープラスミド：
プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）は、サイズが１５，７７４ｂｐである。このプラスミドには、ＡＡＶ複製に重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわちＥ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡが含まれている（アデノウイルスＥ１機能は、ＨＥＫ２９３細胞によって提供される）が、他のアデノウイルスの複製遺伝子または構造遺伝子は含まれていない。プラスミドは、アデノウイルス逆位末端反復などの複製のために重大なシスエレメントを含有しておらず、したがって、感染性のアデノウイルスが生成することは予想されない。プラスミドは、Ａｄ５のＥ１、Ｅ３欠失分子クローン（ｐＢＨＧ１０、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド）に由来した。Ａｄ５ ＤＮＡに欠失を導入して、不要なアデノウイルス遺伝子の発現を除去し、アデノウイルスＤＮＡの量を３２ｋｂから１２ｋｂに低減した。最後に、アンピシリン耐性遺伝子を、カナマイシン耐性遺伝子によって置き換え、ｐＡｄｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）を生成した。このプラスミドに残るＥ２、Ｅ４、およびＶＡＩのアデノウイルス遺伝子、ならびにＨＥＫ２９３細胞に存在するＥ１は、ＡＡＶベクター産生に必要である。
ＡＡＶｈｕ６８．ＧＭ１は、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクション、続いて、下流の精製によって製造される。図１２Ａ～１２Ｂに、製造プロセスのフロー図を示す。産物の調製に入る主要な試薬は、図の左側に示され、プロセス内の品質評価は図の右側に示される。各産生および精製ステップの説明も提供されている。
細胞培養および回収：細胞培養および回収物製造プロセスは、４つの主要な製造ステップ：細胞の播種および増殖、一過性トランスフェクション、ベクター回収、およびベクターの清澄化を含む（図１２Ａ）。
細胞の播種および増殖：完全に特徴付けられたＨＥＫ２９３細胞株が、産生プロセスに使用される。
一過性トランスフェクション：約４日間の増殖後（ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ）、細胞培養培地を新鮮な無血清ＤＭＥＭ培地に交換し、細胞を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ベースのトランスフェクション方法を使用して、３つの産生プラスミドでトランスフェクションする。最初、シス（ベクターゲノム）プラスミド、トランス（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）プラスミド、およびヘルパープラスミドを含有するＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を、ＧＭＰグレードのＰＥＩ（ＰＥＩＰｒｏ ＨＱ、ＰｏｌｙＰｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡ）との比率で調製する。このプラスミド比は、小規模最適化研究におけるＡＡＶ産生に最適であると判断された。よく混合した後、溶液を室温で最大２５分間静置し、次いで無血清培地に添加して反応をクエンチし、最終的にｉＣＥＬＬｉｓバイオリアクターに添加する。反応器は、温度および溶存酸素（ＤＯ）が調節され、細胞は、５日間インキュベートされる。
ベクター回収：形質転換した細胞および培地は、バイオリアクターから培地を無菌的に汲み出すことによって、使い捨てバイオプロセスバッグを使用して、ＰＡＬＬ ｉＣＥＬＬｉｓバイオリアクターから回収される。回収後、洗剤、エンドヌクレアーゼ、およびＭｇＣｌ２（エンドヌクレアーゼの補因子）を添加してベクターを遊離させ、パッケージングされていないＤＮＡを消化する。生成物（使い捨てバイオプロセスバッグ内）を、温度制御された単回使用のミキサー中で３７℃で２時間インキュベートして、トランスフェクション手順の結果として得られた回収物中に存在する残留細胞およびプラスミドＤＮＡの酵素消化に十分な時間を提供する。このステップは、最終的なベクター製剤（ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ、ＤＰ）中の残留ＤＮＡの量を最小限に抑えるために行われる。インキュベーション後、ＮａＣｌを最終濃度が５００ｍＭになるように添加し、濾過および下流接線流濾過（ＴＦＦ）中の生成物の回収を補助する。
ベクターの清澄化：蠕動ポンプによって駆動される滅菌された密封チューブおよびバッグセットとして直列に接続されたプレフィルターおよびデプスフィルターカプセル（１．２／０．２２μｍ）を使用して、細胞および細胞デブリを生成物から除去する。清澄化は、下流のフィルターおよびクロマトグラフィーカラムを汚損から保護されることを保証し、生物負荷（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を低減する濾過は、フィルタートレイン（ｆｉｌｔｅｒ ｔｒａｉｎ）の終わりに、上流の産生プロセス中に導入される可能性のある任意の生物負荷が、下流の精製の前に除去されることを保証する。
精製プロセス：精製プロセスは、ＴＦＦによる濃縮および緩衝液交換、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、ならびにＴＦＦによる濃縮および緩衝液交換の４つの主要な製造ステップを含む。これらのプロセスステップは、概要プロセス図（図１２Ｂ）に示されている。これらのプロセスの各々についての一般的な説明を以下に提供する。
大規模接線流濾過：清澄化された生成物の体積低減（２０倍）は、カスタムの滅菌された閉鎖バイオプロセスチューブ、バッグ、および膜セットを使用して、ＴＦＦによって達成される。ＴＦＦの原理は、好適な多孔度（１００ｋＤａ）の膜に平行な圧力下で溶液を流すことである。圧力差は、膜孔よりも大きな分子を保持しながら、より小さいサイズの分子を、膜を通して効果的に廃棄流路に駆動する。溶液を再循環させることで、平行流が膜表面を押し流し、膜への結合による膜孔汚れおよび生成物の損失を防ぐ。適切な膜孔径および表面積を選択することによって、液体試料は、所望の分子を保持および濃縮しながら体積を急速に減少させ得る。ＴＦＦ用途における透析濾過は、液体が膜を通して、廃棄流路に通過するのと同じ速度で再循環試料に新鮮な緩衝液を添加することを伴う。透析濾過の体積の増加に伴う、小分子の量の増加は、再循環試料から除去される。この透析濾過は、清澄化された生成物の適度な精製をもたらすが、その後のアフィニティーカラムクロマトグラフィーステップと適合性の緩衝液交換も達成する。したがって、本発明者らは、濃縮のために１００ｋＤａのＰＥＳ膜を利用し、最小の４透析濾過体積の２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）および４００ｍＭのＮａＣｌからなる緩衝液で透析濾過する。次いで、透析濾過された生成物を１．２／０．２２μｍのデプスフィルターカプセルでさらに清澄化して、沈殿した材料をすべて除去する。
アフィニティークロマトグラフィー：透析濾過された生成物を、ＡＡＶｈｕ６８血清型を効率的に捕捉するＰｏｒｏｓ（商標）Ｃａｐｔｕｒｅ－Ｓｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶアフィニティー樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用する。これらのイオン性条件下、残留細胞ＤＮＡおよびタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は、効率的に捕捉される。適用後、カラムを５体積の低塩エンドヌクレアーゼ溶液（２５０Ｕ／ｍＬのエンドヌクレアーゼ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）および４０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）で処理して、残存する宿主細胞およびプラスミド核酸を除去する。カラムを洗浄して、追加の供給不純物を除去し、続いて低ｐＨ段階溶出液（４００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ２．５）で洗浄して、これを直ちに１／１０体積の中和緩衝液（２００ｍＭのＢｉｓ Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ、ｐＨ１０．２）中に回収することによって中和する。
アニオン交換クロマトグラフィー：空のＡＡＶ粒子を含むプロセス内不純物のさらなる低減を達成するために、Ｐｏｒｏｓ ＡＡＶ溶出プールを５０倍に希釈して（２０ｍＭのビストリスプロパン、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、ｐＨ１０．２）、イオン強度を低下させ、ＣＩＭｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡモノリスマトリックス（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）への結合を可能にする。低塩洗浄後、ベクター生成物を、６０カラム体積（ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ、ＣＶ）のＮａＣｌ直線塩勾配（１０～１８０ｍＭのＮａＣｌ）を使用して溶出する。この浅い塩勾配は、ベクターゲノムを含まないカプシド粒子（空の粒子）を、ベクターゲノムを含有する粒子（完全粒子）から効果的に分離し、完全粒子について濃縮された調製物が得られる。完全粒子のピーク溶出液を回収し、中和し、２０ｍＭのビストリスプロパン、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ｐＨ１０．２）で２０倍に希釈し、その場で洗浄された同じカラムに再適用する。１０～１８０ｍＭのＮａＣｌ塩勾配を再適用し、適切な完全粒子ピークを回収する。ピーク面積を評価し、おおよそのベクター収率を決定するために、以前のデータと比較する。
中空線維接線流濾過による濃縮および緩衝液交換：プールされたアニオン交換中間体を濃縮し、ＴＦＦを使用して緩衝液を交換する。この工程では、１００ｋＤａの膜中空線維ＴＦＦ膜が使用される。このステップの間、生成物を標的濃度にして、次いで緩衝液を、髄腔内最終製剤緩衝液（ＩＴＦＦＢ、すなわち、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８を含む人工ＣＳＦ）に交換する。生成物を滅菌濾過し（０．２２μｍ）、滅菌容器に保管し、最終充填のために放出されるまで、隔離場所に－６０℃以下で冷凍する。
最終充填：凍結生成物を解凍し、プールし、最終製剤緩衝液を使用して標的濃度に調整する（ＴＦＦを介した希釈または濃縮ステップ）。この生成物を、最終的に０．２２μｍフィルターを通して濾過し、滅菌されたＷｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ’ｓ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｚｅｎｉｔｈ（環状オレフィンポリマー）バイアルおよび圧着シール付きストッパーに、決定される充填体積で充填する。バイアルには個別にラベルが貼られる。ラベルが貼られたバイアルは、６０℃以下で保管される。
実施例３
ヒトβ－ｇａｌを発現するＡＡＶベクターを開発し、マウス疾患モデルを使用して、脳酵素活性、リソソーム蓄積病変、および神経学的徴候に対するベクターのＣＳＦへの投与の影響を評価した。神経学的評価は、ＧＭ１マウスモデルの以前の研究［Ｉｃｈｉｎｏｍｙａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｄｅｖ ２００７；２９：２１０－２１６］から適合させた。これらの評価は、このモデルに特徴的な神経学的徴候を反映するように選択された。盲検者は、歩行、前肢の位置、後肢の位置、体幹の位置、尾の位置、回避反応、横転、垂直立ち直り反射、パラシュート反射の９つの異なるパラメータを評価した。個々の試験項目には、以下の４つのスコアのうちの１つが割り当てられた。０（正常）、１（わずかに異常）、２（中等度の異常）、３（きわめて異常）。各パラメータのスコアを追加して、合計スコアを計算した。
Ａ．材料および方法
動物手順：動物手順はすべて、ペンシルベニア大学の施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。ＧＬＢ１ノックアウトマウスは、理化学研究所バイオリソース研究センターから入手した。マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ背景でヘテロ接合担体として維持した。ＩＣＶ注射のために、ベクターを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ）で体積５μＬまで希釈し、特注の気密シリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）およびセメント加工された１０ｍｍの２７ゲージ針を使用して、針の基部にプラスチックチューブを装着して穿通を深さ３ｍｍに制限しつつ、イソフルラン麻酔マウスに対してフリーハンドで注射した。イソフルラン麻酔マウスに対して、顎下の血液採取を実施した。血清分離管に血液を採取し、凝固させ、遠心分離によって分離した後、アリコートに分け、－６０℃以下で凍結させた。剖検の際、マウスをケタミンおよびキシラジンで鎮静させ、ポリエチレンチューブに接続した３２ゲージ針を使用して、後頭下穿刺によってＣＳＦを採取した。安楽死は頚椎脱臼によって行った。ＣＳＦ、心臓、肺、肝臓、および脾臓をドライアイス上で直ちに凍結し、－６０℃以下で保管した。脳を除去し、前頭葉の冠状切片を回収し、生化学試験のために凍結させた。残りの脳は、組織学的分析に使用した。
実施例１および２に記載されるように、ベクターを生成した。
空：完全粒子比：ベクター試料を、１２ｍｍの光路長を有する２チャネルのチャコール－エポンセンターピースを有するセルにロードする。供給された希釈緩衝液を、各細胞の参照チャネルにロードする。次いで、ロードされた細胞を、ＡＮ－６０Ｔｉ分析ローターに配置し、吸光度およびＲＩ検出器の両方を備えたＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＸＬ－Ｉ分析超遠心分離器にロードする。２０℃で完全に温度平衡化した後、ローターを、１２，０００ｒｐｍの最終実行速度にする。２８０ｎｍスキャンにおける吸光度は、おおよそ３分毎に約５．５時間記録される（各試料について１１０回の総スキャン）。生データを、ｃ（ｓ）メソッドを使用して分析し、分析プログラムＳＥＤＦＩＴに実装する。得られたサイズ分布をグラフ化し、ピークを統合する。各ピークに関連付けられたパーセンテージ値は、すべてのピーク下の総面積のピーク面積分率を表し、２８０ｎｍで生成された生データに基づく。多くの研究室では、これらの値を使用して空：完全粒子比を計算している。しかしながら、空の粒子と完全粒子は、この波長で異なる吸光係数を有するため、それに応じて生データを調整することができる。吸光係数調整の前後の両方の空の粒子および完全モノマーピーク値の比を使用して、空の粒子：完全な粒子比を決定する。
複製能のあるＡＡＶのアッセイ：試料は、産生プロセス中に生じる可能性がある複製能のあるＡＡＶ２／ｈｕ６８（ｒｃＡＡＶ）の存在について分析される。細胞ベースの成分は、試験試料および野生型（ＷＴ）ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）の希釈物をＨＥＫ２９３細胞（Ｐ１）の単層に接種することからなる。試験した生成物の最大量は、１．０×１０１０ＧＣのベクター生成物である。アデノウイルスの存在により、ｒｃＡＡＶは細胞培養物中で増幅する。２日後、細胞溶解物を生成し、Ａｄ５を熱不活性化する。次いで、清澄化された溶解物を２回目の細胞（Ｐ２）に継代し、感度を増強する（再度、Ａｄ５の存在下で）。２日後、細胞溶解物を生成し、Ａｄ５を熱不活性化する。次いで、清澄化された溶解物を３回目の細胞（Ｐ３）に継代し、感度を増強する（再度、Ａｄ５の存在下で）。２日後、細胞を溶解してＤＮＡを遊離し、次いで、ｑＰＣＲに供して、ＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ配列を検出する。ＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ配列がＡｄ５依存的な様式で増幅することで、ｒｃＡＡＶの存在が示される。ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶ２／ｈｕ６８代替陽性対照を使用すると、アッセイの検出限界を決定することが可能になる（０．１、１、１０、および１００ＩＵ）。ｒＡＡＶ（１．０×１０１０、１．０×１０９、１．０×１０８、および１．０×１０７ＧＣ）の段階希釈を使用して、試験試料中に存在するｒｃＡＡＶのおおよその量を定量することができる。
インビトロ効力：ｄｄＰＣＲ ＧＣ力価を遺伝子発現に関連付けるために、インビトロの相対効力バイオアッセイを行う。簡潔にいうと、細胞を９６ウェルプレートに播種し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。翌日、細胞を、段階希釈されたＡＡＶベクターで感染させ、３７℃／５％ＣＯ２で最大３日間インキュベートする。細胞上清を回収し、蛍光発生基質の切断に基づいてβ－ｇａｌ活性について分析する。
総タンパク質、カプシドタンパク質、タンパク質純度、およびカプシドタンパク質比：ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを使用して、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質の標準曲線に対して、ベクター試料を最初に総タンパク質について定量する。決定は、等量の試料を、キットで提供されるＭｉｃｒｏ－ＢＣＡ試薬と混合することによって行われる。ＢＳＡ標準の希釈も、同じ手順を適用する。混合物は６０℃でインキュベートし、吸光度を５６２ｎｍで測定する。４パラメータ適合を使用して、既知の濃度の標準吸光度から、標準曲線を生成する。未知の試料を４パラメータ回帰に従って定量する。ｒＡＡＶ純度の半定量的決定を提供するために、試料を、ゲノム力価について正規化し、５．０×１０９ＧＣを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって還元条件下で分離する。次いで、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ色素で染色する。不純物バンドはすべて、濃度測定によって定量する。３つのＡＡＶ特異的タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）に加えて現れる染色されたバンドは、タンパク質不純物とみなされる。混入物バンドの不純物質量パーセントならびにおおよその分子量が報告される。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質を定量し、それらの比率を決定するためにも使用される。
酵素活性アッセイ：組織を、スチールビーズホモジナイザー（ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ，Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、０．９％ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）中でホモジナイズした。３回の凍結解凍サイクル後、サンプルを遠心分離によって清澄化し、タンパク質含有量をビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）アッセイによって定量化した。血清試料を酵素アッセイに直接使用した。β－ｇａｌ活性アッセイのために、１μＬの試料を、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５８）中の９９μＬの０．５ｍＭの４－メチルウンベリフェリルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ Ｍ１６３３）と組み合わせた。反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで１５０μＬの２９０ｍＭグリシン、１８０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ１０．９）を添加することによって停止させた。蛍光を４ＭＵの標準希釈物と比較した。β－ｇａｌ活性は、タンパク質（組織）１ｍｇ当たり、または血清もしくはＣＳＦ１ｍｌ当たり、１時間当たり遊離された４ＭＵのｎｍｏｌとして表される。１ｍＭの４－メチルウンベリフェリルＮ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミニド（Ｓｉｇｍａ Ｍ２１３３）を基質として、組織溶解物の場合は１μＬの試料体積を、血清の場合は２μＬの試料体積を使用して、β－ｇａｌ活性アッセイと同じ様式で、ＨＥＸアッセイを行った。
組織学：ノックアウトマウスモデルに加えて、剖検後のｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１治療ＧＬＢ１－／－マウスを、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスおよびＧＬＢ１＋／－対照マウスの両方と比較する組織学的解析も行った。リソソーム関連膜タンパク質１の免疫染色だけでなく、ＧＭ１ガングリオシドに結合する蛍光分子であるフィリピンで脳切片を染色することによって、リソソーム蓄積症を評価した。フィリピン染色は、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスの皮質、海馬、および視床のニューロンにおける顕著なＧＭ１ガングリオシドの蓄積を明らかにし、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１で治療したＧＬＢ１－／－マウスにおいて、正常化した。免疫組織化学は、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスの皮質および視床におけるリソソーム膜染色の増加を示し、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１治療ＧＬＢ１－／－マウスにおいて、ＧＬＢ１＋／－対照マウスと同様に減少した。脳を、４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、１５％および３０％スクロース中で平衡化し、次いで、ＯＣＴ包埋培体中で凍結した。凍結切片をフィリピン（Ｓｉｇｍａ、１０μｇ／ｍＬ）、またはＧＦＡＰもしくはＬＡＭＰ１に対する抗体で染色した。
抗β－ｇａｌ抗体ＥＬＩＳＡ：高結合ポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬの濃度で１ウェル当たり１００μＬの組換えヒトβ－ｇａｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で一晩かけてコーティングした。プレートを洗浄し、ＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミンで、室温で２時間ブロッキングした。重複ウェルを、ＰＢＳ中で１：１，０００に希釈された血清試料とともに、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ブロッキング溶液中で１：５，０００に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体とともに１時間インキュベートし、ＴＭＢ基質を使用して現像した。
神経機能に対する治療効果の評価
ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１治療ＧＬＢ１－／－マウスにおける神経学的機能を評価するために、４ヶ月齢（ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１またはビヒクル投与後３ヶ月）で、製造業者の指示に従って、マウスにおける運動性能の一般的に使用される評価であるＣａｔＷａｌｋ ＸＴ歩行分析システム（Ｎｏｌｄｕｓ）を用いて、２日間連続して歩行分析を行った。マウスを２日連続で試験した。各試験日に、各動物について少なくとも３回の完全な試行を実施した。５秒を超える試行、または動物が装置の全長を横断せずに停止もしくは反転した試行は、分析から除外した。少なくとも３回の評価にわたって、試験の２日目に、各動物について、平均歩行速度および後肢の足跡長を定量化した。速度が遅く、足跡長が細長いほど、運動性能が損なわれていることを示す。以下の図に示すように、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１治療ＧＬＢ１－／－マウスにおいて、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスと比較して、歩行速度および足跡長が有意に改善され、ＧＬＢ１＋／－対照マウスと同様であった。例えば、図７Ｃおよび７Ｄを参照されたい。
生涯評価には、生存のモニタリング、神経学的検査、歩行分析、および血清導入遺伝子発現（β－ｇａｌ活性）の評価が含まれていた。未治療ＧＬＢ１－／－マウスおよび正常ＧＬＢ１＋／－マウスについて、投薬日（１日目）に剖検を実施し、ベースライン脳蓄積病変の重症度を評価した。ビヒクル治療マウスおよびベクター治療マウスは、１５０日目および３００日目に剖検した。
１５０日目のコホートにおいて、すべてのマウスは、１匹のビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスを除き、予定された剖検まで生存した（図１３）。この動物は、ＩＣＶ注射手技に起因する可能性が高い頭蓋内出血に起因して、ベクター投与から２日後に死亡した。
３００日目のコホートでは、予定された試験エンドポイントの前に、１２匹すべてのビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスを、試験定義の安楽死基準に従って安楽死させた。マウスは、疾患の進行の結果として、神経学的徴候（すなわち、運動失調、振戦、および／または手足の衰弱）を示した。ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスの生存期間中央値は、２６８日（１８５～２８３日の範囲）であった。最小用量群（４．４×１０９ＧＣ）では、５／１２匹（４１．７％）の動物を、２６８～２９７日の範囲の生存期間で、疾患の進行に起因して安楽死させた。１．３×１０１０ＧＣ用量コホートの１匹の動物（１／１２匹［８．３％］）を、治療後２９０日目の疾患の進行に起因して安楽死させた。４．４×１０１０ＧＣまたは１．３×１０１１ＧＣのベクター用量を受けたすべての動物は、試験エンドポイントまで生存した。
歩行分析は、ベースライン（－７日目～０日目）で、また、２４０日目まで６０日毎に、ビヒクル治療マウスおよびベクター治療マウスの歩幅長および後肢の足跡長を評価した。歩行分析は、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスにおける進行性の異常を明らかにし、一方、２つの最高ベクター用量（１．３×１０１１ＧＣおよび４．４×１０１０ＧＣ）で治療したＧＬＢ１－／－マウスは、両方の歩行パラメータにおいて一貫した改善を示した。
ベースラインでは、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスの平均の歩幅長は、正常ＧＬＢ１＋／－対照の歩幅長よりも有意に短く、この異常は２４０日目まで持続した。歩幅長の異常は、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１治療ＧＬＢ１－／－マウスにおいて部分的に救済され、６０日目までに、すべての用量において、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスと比較して、平均歩幅長の統計的に有意な増加を示した。しかしながら、２つの最大用量群（１．３×１０１１ＧＣおよび４．４×１０１０ＧＣ）のみが、２４０日目まで、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスと比較して有意に長い平均歩幅長を維持した。
６０日目に、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスの平均の後肢の足跡長は、正常ＧＬＢ１＋／－対照の後肢の足跡長よりも有意に短く、この異常は２４０日目まで持続した。後肢の足跡長の異常は、３つの最大用量（１．３×１０１１ＧＣ、４．４×１０１０ＧＣ、１．３×１０１０ＧＣ）でＧＬＢ１－／－マウスにおけるｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１投与によって部分的に救済され、２４０日目まで、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスのものと比較して、統計的に有意な平均後肢の足跡長の減少をもたらした。
用量範囲薬理学試験
ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１のＩＣＶ投与後のＧＭ１のＧＬＢ１ノックアウトマウスモデルにおける最小有効用量（またはＭＥＤ）、およびβ－ｇａｌ発現レベルを評価するために、薬理学試験を実施した。この試験では、ＧＬＢ１－／－マウスに、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１を４つの別々の用量レベルでＩＣＶ投与した。ＧＬＢ１－／－マウスおよびヘテロ接合ＧＬＢ１マウス、またはＨＥＴマウスに、ビヒクルをＩＣＶ投与した。この試験において、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１をＩＣＶ投与すると、脳および末梢臓器における導入遺伝子産物発現の安定した用量依存的増加、脳リソソーム蓄積病変の分解、神経表現型の改善、ならびにＧＬＢ１－／－マウスの生存率の増加をもたらした。評価された最小用量は、生存率、神経学的検査スコア、および脳蓄積病変における統計的に有意な改善に基づいて、ＭＥＤとみなされる。
Ｂ．結果
サイトメガロウイルスエンハンサー（ＣＢ７）、ヒト伸長開始因子１アルファプロモーター（ＥＦ１ａ）またはヒトユビキチンＣプロモーター（ＵｂＣ）とともにニワトリベータアクチンプロモーターによって駆動されるヒトＧＬＢ１ ｃＤＮＡからなる、導入遺伝子カセットが設計された。各カセットをＡＡＶｈｕ６８カプシドにパッケージングし、１０１１個のゲノムコピー（ＧＣ）の単回用量を、野生型マウスに脳室内（ＩＣＶ）注射によって投与した。注射の２週間後、脳およびＣＳＦにおいてβ－ｇａｌ活性を測定した（図２Ａ～２Ｂ）。ＵｂＣプロモーターを有するベクターでは、脳およびＣＳＦの両方で、統計的に有意なβ－ｇａｌ活性の上昇が得られ、酵素活性は、未処置の野生型マウスの活性よりも、脳でほぼ２倍、ＣＳＦで１０倍大きかった。したがって、さらなる研究のために、ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１ベクターを選択した。
最適化ベクターの有効性を、ＧＬＢ１－／－マウスモデルで評価した。ＧＭ１ガングリオシドーシスのマウスモデルは、ＧＬＢ１遺伝子の６番目および／または１５番目のエキソンにネオマイシン耐性カセットを標的化挿入することによって開発されている。Ｈａｈｎ，Ｃ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ＣＮＳ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｍａｓｓｉｖｅ ＧＭ１－ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ａｃｉｄ ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６，２０５－２１１（１９９７）、およびＭａｔｓｕｄａ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｏｕｓｅ ａｓ ａｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ＧＭ１－ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｊｏｕｒｎａｌ １４，７２９－７３６（１９９７）。乳児ＧＭ１ガングリオシドーシス患者と同様に、これらのマウスは機能的なβ－ｇａｌを発現せず、脳内にＧＭ１ガングリオシドの急速な蓄積を示す。脳のＧＭ１蓄積は、生後１週間で既に明らかであり、３ヶ月齢までに、ＧＬＢ１－／－マウスは、８ヶ月齢の乳児ＧＭ１患者と同程度のＧＭ１蓄積を脳内に有する（Ｈａｈｎ １９９７、上で引用）。ＧＬＢ１－／－マウスの臨床表現型は、乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスの臨床表現型を最も密接にモデリングしており、４ヶ月齢までに運動異常が現れ、１０ヶ月齢までに安楽死が必要なほどの重度の神経学的症状（例えば、運動失調または運動麻痺）を有する（Ｈａｈｎ １９９７、Ｍａｔｓｕｄａ １９９７、上で引用）。ＧＬＢ１－／－マウスモデルは、いかなる末梢臓器の関与も示さず、しばしば骨変形および肝脾腫を発症する乳児ＧＭ１患者とは異なる（Ｈａｈｎ １９９７、Ｍａｔｓｕｄａ １９９７、上で引用）。したがって、ＧＬＢ１－／－マウスは、乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスの神経学的特徴の代表的なモデルであるが、全身疾患の徴候のモデルではない。
ＧＬＢ１－／－マウスを、１ヶ月齢で治療し、４ヶ月齢まで観察し、このときに、典型的には、進行性疾患を有する乳児ＧＭ１ガングリオシドーシス患者と同様の脳ＧＭ１レベルに関連する顕著な歩行異常を発症するであろう（Ｍａｔｓｕｄａ １９９７、上で引用）。ＧＬＢ１－／－マウスを、１．０×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）のＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１（ｎ＝１５）またはビヒクル（ｎ＝１５）の単回ＩＣＶ注射で治療した。ビヒクル（ｎ＝１５）で治療されたヘテロ接合（ＧＬＢ１＋／－）マウスの群は、正常対照として機能した。注射日（０日目）、ならびに１０、２８、６０、および９０日目に血清を採取した。治療の９０日後、ＣａｔＷａｌｋ ＸＴ歩行分析システム（Ｎｏｌｄｕｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して運動機能を評価し、その後、動物を安楽死させ、組織学的分析および生化学的分析のために組織を採取した。ＣａｔＷａｌｋ ＸＴは、ガラス板を横切って歩くマウスの足跡を追跡する。このシステムは、各足跡の寸法を定量化し、動物の速度および歩行の他の特徴を統計的に分析する。この評価を実施するため、試験開始前に、ＣａｔＷａｌｋ ＸＴを、適切な幅の歩道セットで較正した。動物を室内に入れ、ＣａｔＷａｌｋ ＸＴを実行する前に、少なくとも３０分間、暗闇で適応させた。適応が完了したら、動物を選択し、歩道の入り口に配置した。研究者は、取得ソフトウェアを開始し、動物に歩道を歩かせた。動物のホームケージは、鼓舞するために歩道の終わりに配置された。動物が、割り当てられた制限時間内にキャットウォークの終わりまで首尾良く歩いたら、実行は終了した。それ以外の場合、実行を繰り返した。動物は、最小持続時間０．５０秒、最大持続時間５．００秒で、３回の試行を実施した。試行が終了したとみなされるためには、３回の成功した実行が必要であった。動物が、１０分間の試験後に３回の実行を終了することができなかった場合、終了した実行のみを分析に使用した。この分析は、動物ＩＤおよび治療群に対して盲検の評価者により実施された。Ｃａｔｗａｌｋ ＸＴソフトウェアを使用して、実行を自動的に分類し、その後、足跡の精度および適切なラベル付けを確認した。足跡以外のデータは、手動で削除された。平均速度、歩幅長、および後肢の足跡長は、プログラムによって自動的に測定された。左右の後肢の足跡長の平均値を計算し、各群について分析した。各々の足から測定した歩幅長の平均値を計算し、各群について分析した。Ｐｒｉｓｍ ７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて分析を行った。神経学的検査スコアおよび歩行分析パラメータ（歩行速度および後肢の足跡長）を、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、各時点での群間で比較した。生存曲線を、対数ランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を用いて、群間で比較した。脳ＬＡＭＰ１データを、一元ＡＮＯＶＡ、続いて、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定を用いて、対数変換し、比較した。
ＩＣＶ注射手技中に、ＡＡＶで治療したマウス１匹が死亡した。他のすべてのマウスは、９０日間の試験エンドポイントまで生存した。ＣＳＦへのＡＡＶ送達は、末梢血におけるベクター分布および有意な肝臓の形質導入をもたらすことが示されている（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｃｏｒｒｅｃｔｓ ＣＮＳ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ａ ｆｅｌｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ Ｉ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２，２０１８－２０２７（２０１４）、Ｇｒａｙ，Ｓ．Ｊ．，Ｎａｇａｂｈｕｓｈａｎ Ｋａｌｂｕｒｇｉ，Ｓ．，ＭｃＣｏｗｎ，Ｔ．Ｊ．＆ Ｊｕｄｅ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｇｌｏｂａｌ ＣＮＳ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｖａｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ＡＡＶ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ＡＡＶ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ２０，４５０－４５９（２０１３）、Ｈａｕｒｉｇｏｔ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ ＩＩＩＡ ｂｙ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（２０１３）、Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １，１４０５１ （２０１４）、Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｉｎｔｒａ－Ｃｉｓｔｅｒｎａ Ｍａｇｎａ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ ９ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｌｐｈａ－Ｌ－Ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｉｎ Ｒｈｅｓｕｓ Ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０，７９－８８（２０１８））。ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１で治療したＧＬＢ１－／－マウスは、ベクター投与の１０日後、ヘテロ接合（ＧＬＢ１＋／－）対照よりも高い血清β－ｇａｌ活性を示した（図３Ａ）。ヒトβ－ｇａｌに対する血清抗体は、９０日目までにＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１で処置された５／１５マウスにおいて検出可能であった。２匹のマウスを除くすべてのマウスについて、血清β－ｇａｌ活性の上昇が試験全体を通して持続し、両方ともヒトβ－ｇａｌに対する抗体を発現した（図６）。心臓、肺、肝臓、および脾臓を含む末梢臓器もまた、β－ｇａｌ活性の上昇を示した（図３Ｂ～３Ｅ）。ヒト導入遺伝子産物に対する抗体を発現した一部の動物は、末梢臓器においてより低いβ－ｇａｌ活性を有した。
剖検時に採取されたＣＳＦは、ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１で治療したＧＬＢ１－／－マウスにおけるヘテロ接合対照の活性を上回るβ－ｇａｌ活性を示した（図４Ｂ）。ベクター治療マウスの脳におけるβ－ｇａｌ活性は、ヘテロ接合対照と類似していた（図４Ａ）。抗β－ｇａｌ抗体は、脳またはＣＳＦのβ－ｇａｌレベルに影響を与えているようには見えない。
脳の異常の修正は、生化学的および組織学的アッセイを使用して評価した。リソソーム酵素は、リソソーム蓄積の状況で頻繁に上方制御され、この観察結果は、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者において確認されている（Ｖａｎ Ｈｏｏｆ，Ｆ．＆ Ｈｅｒｓ，Ｈ．Ｇ．Ｔｈｅ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７，３４－４４（１９６８））。したがって、リソソーム酵素であるヘキソサミニダーゼ（ＨＥＸ）の活性を、脳溶解物で測定した。ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウス由来の脳試料において、ＨＥＸ活性が上昇し、ベクター治療動物では、正常化された（図５）。
リソソーム蓄積病変の伸長を評価するために、脳切片を、ＧＭ１ガングリオシドに結合する蛍光分子であるフィリピンでリソソーム膜タンパク質ＬＡＭＰ１について染色し、ならびにリソソーム関連膜１（タンパク質ＬＡＭＰ１）の免疫染色を行った。フィリピンはまた、非エステル化コレステロールに結合するが、以前の研究は、フィリピン染色が主に、ＧＬＢ１－／－マウスにおけるＧＭ１蓄積を反映することを実証している（Ａｒｔｈｕｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｈｅｉｎｅｃｋｅ，Ｋ．Ａ．＆ Ｓｅｙｆｒｉｅｄ，Ｔ．Ｎ．Ｆｉｌｉｐｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｂｏｔｈ ＧＭ１ ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ ＧＭ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２，１３４５－１３５１（２０１１））。フィリピン染色は、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスの皮質、海馬、および視床のニューロンにおける顕著なＧＭ１の蓄積を明らかにし、ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１で治療したマウスにおいて、正常化した（データは示さず）。ＬＡＭＰ１免疫組織化学は、ＧＬＢ１－／－マウスの皮質および視床におけるリソソーム膜染色の増加を示し、ベクター治療マウスにおいて減少した（データは示さず）。グリオーシスは、星状細胞マーカー、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）について染色することによって評価された。ベクター治療ＧＬＢ１－／－マウスは、ビヒクル治療対照と比較して、視床におけるアストログリオーシスの顕著な低下を示した（データは示さず）。
ベクター治療ＧＬＢ１－／－マウスにおける神経学的機能を評価するために、４ヶ月齢（ベクターまたはビヒクル投与後３ヶ月）で歩行分析を行った。未治療のＧＬＢ１－／－マウスは、３～４ヶ月齢までに臨床的に明らかな歩行異常を示すことが以前から指摘されていた。未治療ＧＬＢ１－／－マウスおよび正常な対照のコホートに対して、ＣａｔＷａｌｋシステムを使用して実施された定量的な歩行評価から、様々な異常が明らかになり、より遅い自発的な歩行速度、歩幅長の差、ならびにステップ周期のいくつかの段階の持続時間が含まれた（図７Ｃおよび７Ｄ）。ＧＬＢ１－／－マウスの歩行速度が著しく遅いことに起因して、これらの明らかな違いの多くの解釈は、ほとんどの歩行パラメータの速度依存性によって複雑化された（図８Ａおよび８Ｂ）（Ｂａｔｋａ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｓｐｅｅｄ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔ ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓ．Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ ｒｅｃｏｒｄ（Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．：２００７）２９７，１８３９－１８６４（２０１４））。ＧＬＢ１－／－マウスは、後肢の配置にも一貫した異常を示し、これは後肢の足跡長の増加として測定することができた（図７Ｄ）。この異常は、以前の報告（Ｂａｔｋａ，ｅｔ ａｌ、上で引用）と一致して、歩行速度とは無関係であることが見出され、このことは、ＧＬＢ１－／－マウスにおける速度に依存しない歩行機能障害を評価するのに有用な歩行シグネチャとなった（図８Ａおよび８Ｂ）。２日連続して同じコホートのマウスを使用して実施された試験では、より遅い自発的な歩行速度および後肢の足跡長の増加が、未治療ＧＬＢ１－／－マウスにおいて再現可能な観察結果であることを明らかにした（図７Ａおよび７Ｂ）。ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスは、未治療動物において以前に特定されたものと同様の歩行異常を示した（図７Ａ～７Ｇ）。歩行速度および足跡長は、ベクター治療ＧＬＢ１－／－マウスにおいて正常化された（図７Ａ～７Ｇ）。
生存データ：図１３は、３００日目までの試験における各コホートの生存データを示す。ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウス１２匹はすべて、運動失調、振戦、および手足の衰弱によって特徴付けられる神経学的徴候を伴う疾患進行に起因して、予定された試験エンドポイントの前に、試験定義の安楽死基準に従って安楽死させた。この群の生存期間中央値は、２６８日であった。最小用量群では、５／１２匹の動物を、疾患の進行に起因して安楽死させた。２番目に低い用量コホートでは、１／１２匹を、疾患の進行に起因して安楽死させた。２つの最大用量コホート中のすべての動物は、試験エンドポイントまで生存した。
神経学的検査：標準化された神経学的検査は、６０日毎に２４０日まで盲検化された様式で実施され、平均総重症度スコアが得られた。図１４Ｃは、各評価期間での各コホートの平均総重症度スコアを示す。１２０日目の評価から開始して、ビヒクルまたは最小用量のベクター（４．４×１０９ＧＣ）のいずれかを投与されたＧｌｂ１－／－マウスは、神経学的徴候の重症度の増加を示す、より高い総重症度スコアを漸進的に示した。しかしながら、最小用量を投与されたＧｌｂ１－／－マウスの総重症度スコアは、ビヒクル治療Ｇｌｂ１－／－マウスよりも有意に低く、このことは、この用量（４．４×１０９ＧＣ）が神経学的表現型を部分的に救済したことを示唆している。その次の最大用量（１．３×１０１０ＧＣ）では、２４０日目の評価で、７／１２匹（５８．３％）の動物で最小限の異常が検出可能であり、このことは、神経学的表現型の実質的な救済を示唆している。２つの最高ベクター用量（１．３×１０１１ＧＣおよび４．４×１０１０ＧＣ）では、神経学的異常は明らかではなく、これらの群の総重症度スコアは、各時点で正常なビヒクル治療Ｇｌｂ１＋／－対照と同様であり、このことは、神経学的表現型の完全な救済を示唆している。
ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスの結果は、１２０日目の評価から始まる進行性神経学的徴候を示す、より高い総重症度スコアを斬新的に示した。最小用量のｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１では、総重症度スコアは、同時点のビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスよりも有意に低かったが、１２０日目の評価までに総重症度スコアの漸進的な増加も観察された。第２の最小ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１用量では、２４０日目の評価では、７／１２匹の動物において最小限の異常が検出可能であった。２つの最大用量のｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１では、神経学的異常は明らかではなく、これらの群の総重症度スコアは、正常なビヒクル治療ＧＬＢ１＋／－時点のものと同様であった。
組織学的分析：ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１治療ＧＬＢ１－／－マウス、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウス、およびビヒクル治療ＧＬＢ１＋／－対照マウスの脳切片を、ベースライン、１５０日目および３００日目で比較する組織学的分析も行った。脳凍結切片を、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ１）に対する抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ４１７０）で、４℃で一晩染色した。翌日、スライドを洗浄し、抗ウサギＩｇＧ ＴｒｉｔＣコンジュゲート二次抗体とともに、室温で１時間インキュベートした。スライドを洗浄し、カバースリップを適用した。ＶｉｓｉｏＰｈａｒｍ画像解析ソフトウェアを使用して、１つの冠状脳切片からの大脳皮質全体の視野当たりの陽性細胞としてＬＡＭＰ１染色を定量化した。ＬＡＭＰ１について陽性の皮質細胞（すなわち、リソソーム拡張を示す細胞）を、自動プログラムを使用してスキャンした切片で定量化した。予定されていた３００日目の剖検まで、疾患進行に起因して生存しなかった動物については、安楽死時に脳が採取され、データは、３００日目のコホートの一部として提示される。１日目に剖検された未治療ＧＬＢ１－／－ベースラインマウスは、正常な未治療ＧＬＢ１＋／－ベースライン対照と比較して、脳内のＬＡＭＰ１陽性細胞の割合が高いことを示した。１５０日目および３００日目の両方で、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１治療マウスは、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－対照と比較して、ＬＡＭＰ１陽性細胞の割合の用量依存的低下を示した。２つの最大用量のｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１では、ＬＡＭＰ１陽性細胞の割合は、正常なビヒクル治療ＧＬＢ１＋／－対照と同様のレベルまで低下した。
β－ｇａｌ活性：β－ｇａｌ活性は、投薬日に血清において測定され、その後２４０日目まで６０日毎に測定された。剖検時に、脳および末梢臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺および腎臓）においてβ－ｇａｌ活性を測定した。図９Ｃに示すように、最大用量の試験ｈＡＡＶ．ｈＧＬＢ１（１．３×１０１１ＧＣ）を投与されたＧＬＢ１－／－マウスの血清における平均β－ｇａｌ活性は、正常なビヒクル治療ＧＬＢ１＋／－対照のものよりも約１０倍大きかった。２番目に高い用量の試験ｈＡＡＶ．ｈＧＬＢ１（４．４×１０１０ＧＣ）で、ＧＬＢ１－／－マウスにおける血清β－ｇａｌ活性は、正常なビヒクル治療ＧＬＢ１＋／－対照のものと類似していた。すべての他のｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１用量のＧＬＢ１－／－マウスにおける血清β－ｇａｌ活性は、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－対照のものと類似していた。
調べた各組織型について、各群内の平均β－ｇａｌ活性レベルは、両方の時点（１５０日目および３００日目）で類似していた（図１７Ａ～Ｌ）。脳において、ベクター治療Ｇｌｂ１－／－マウスにおいて、β－ｇａｌ活性は、用量依存的に増加した。すべての用量群の平均β－ｇａｌ活性は、ビヒクル治療Ｇｌｂ１－／－対照よりも高かった。しかしながら、２つの最大用量群（１．３×１０１１ＧＣおよび４．４×１０１０ＧＣ）のみが、両方の時点で、正常なビヒクル治療Ｇｌｂ１＋／－対照よりも高い平均β－ｇａｌ活性を示した。いくつかの末梢臓器（例えば、肝臓および脾臓）は、すべての臓器ではないが（例えば、肺および腎臓）、ベクター投与後のβ－ｇａｌ活性の増加を示した（図１７Ａ～Ｌ）。特に注記すべきことに、心臓は、β－ｇａｌ活性において用量依存的な増加を示し、すべての用量において、ビヒクル治療Ｇｌｂ１－／－マウスよりも高い平均レベルをもたらした。しかしながら、２つの最大用量（１．３×１０１１ＧＣおよび４．４×１０１０ＧＣ）のみが、両方の時点で、β－ｇａｌ活性を、正常なビヒクル治療Ｇｌｂ１＋／－対照と同等またはそれより高いレベルに回復させた。
β－ｇａｌ活性は、予定された剖検まで生存した３００日目のコホート内のすべての動物のＣＳＦにおいて測定された。ビヒクル治療Ｇｌｂ１－／－動物はいずれも、疾患進行に起因して３００日目まで生存しなかったため、ベクター治療マウスのβ－ｇａｌ活性レベルは、正常なビヒクル治療Ｇｌｂ１＋／－対照のものと比較された（図１６Ｃ）。β－ｇａｌ活性は、予定された剖検まで生存した３００日目のコホート内のすべての動物のＣＳＦにおいて測定された。ビヒクル治療Ｇｌｂ１－／－動物はいずれも、疾患進行に起因して３００日目まで生存しなかったため、ベクター治療マウスのβ－ｇａｌ活性レベルは、正常なビヒクル治療Ｇｌｂ１＋／－対照のものと比較された（図１６Ｃ）。図１６Ｃに示すように、β－ｇａｌ活性は、評価したすべてのマウスのＣＳＦにおいて検出可能であった。２つの最大用量の試験ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１（１．３×１０１１ＧＣおよび４．４×１０１０ＧＣ）を投与されたＧＬＢ１－／－マウスは、正常なビヒクル治療ＧＬＢ１＋／－対照のものを上回る平均ＣＳＦ β－ｇａｌ活性レベルを示した。ＣＳＦにおけるβ－ｇａｌ活性は、一般に用量依存的であったが、２つの最小用量群（１．３×１０１０ＧＣおよび４．４×１０９ＧＣ）におけるβ－ｇａｌ活性は、ビヒクル治療Ｇｌｂ１＋／－のものと類似しているようであった。２つの最小用量においてβ－ｇａｌ活性レベルが類似している理由は、最小ベクター用量（４．４×１０９ＧＣ）を投与された動物からのＣＳＦ試料の数に関連する可能性があり、この群の高い死亡率によって制限された。この群において生存した動物は、生存しなかった他の動物よりも高いβ－ｇａｌ発現を有していた可能性がある。すべての群において、β－ｇａｌ活性レベルは、過去の対照ビヒクル治療Ｇｌｂ１－／－マウスからのＣＳＦについて観察された範囲を超えた。
図１７Ａ～Ｌは、剖検後の脳、心臓、および肝臓におけるβ－ｇａｌ活性を示す。脳において、試験ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１治療ＧＬＢ１－／－マウスにおいて、β－ｇａｌ活性は、用量依存的に増加した。すべての用量群の平均β－ｇａｌ活性は、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－対照よりも高かった。しかしながら、２つの最大用量群のみが、両方の時点で、正常なビヒクル治療ＧＬＢ１＋／－対照よりも高い平均β－ｇａｌ活性を示した。いくつかの末梢臓器はまた、試験ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１投与後にβ－ｇａｌ活性において用量依存的な増加を示した。心臓は、β－ｇａｌ活性において用量依存的な増加を示し、すべての用量において、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスよりも高い平均レベルをもたらした。しかしながら、２つの最大用量のみが、両方の時点で、β－ｇａｌ活性を、正常なビヒクル治療ＧＬＢ１＋／－対照と同等またはそれより高いレベルに回復させた。肝臓は、試験ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１投与後にβ－ｇａｌ活性において用量依存的な増加を示した。最小用量を除くすべての用量において、両時点における平均β－ｇａｌ活性レベルは、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスのものよりも高く、かつ正常なビヒクル治療ＧＬＢ１＋／－対照のものと類似であるか、またはそれより高かった。
Ｃ．考察
これらの結果は、ＣＳＦへのｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＬＢ１の投与が、脳β－ｇａｌ活性を増加させ、ニューロンのリソソーム蓄積病変を減少させ、神経学的低下を防止し、遺伝子導入が、脳内のＧＭ１蓄積を防止し、かつ元に戻し得ることを示す。
この試験は、このモデルで顕著な脳蓄積病変が既に存在している場合に、４週齢でＡＡＶベクターで治療されたＧｌｂ１－／－マウスにおけるニューロン蓄積病変が存在しないことを実証した。これらの結果は、遺伝子導入が、脳内のＧＭ１の蓄積を防止し、かつ元に戻し得ることを示唆している。乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する患者は、１～２年以内に必然的に続く急速な発達回帰の開始前の生後６ヶ月に現れる微妙な神経学的所見に基づいて頻繁に診断されるため、ＡＡＶ遺伝子治療に好適な集団である。
実施例４：動物モデル
Ａ．ＧＬＢ１－／－マウスモデルにおけるＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１の最小有効用量（ＭＥＤ）の特定
異なる用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１の影響を、ＧＬＢ１－／－マウスモデルにおけるＣＮＳ病変および神経学的徴候について評価した。有効性は、血清酵素活性、脳病変の低減、自動歩行分析によって測定される神経学的徴候（例えば、ＣａｔＷａｌｋシステムを介して）、および盲検再評価者によって実施される標準化された神経学的検査（例えば、姿勢、運動機能、感覚および反射の９点評価）、ならびに生存率によって評価した。安全性分析（採血および分析を含む）も実施した。４週齢のＧＬＢ１－／－マウスは、ＩＣＶ注射によって、４つの用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１（１．３×１０１１ＧＣ、４．４×１０１０ＧＣ、１．３×１０１０ＧＣまたは４．４×１０９ＧＣ）またはビヒクルのうちの１つを受けた（群当たりｎ＝２４）。ビヒクル（ｎ＝２４）で治療されたヘテロ接合同腹子は、正常対照として機能した。
血清β－ｇａｌ酵素活性、歩行分析、および神経学的検査を、６０日毎に各群の動物のうちの半分について行い、一方、体重を、１２０日の観察期間で少なくとも３０日毎に測定した。結果を、図９Ａ～９Ｆとしてプロットし、以下に簡潔に説明する。
治療されたマウスはすべて健康に見え、正常な体重増加を示した。観察期間中、群間の体重に有意な差は検出されなかった（図９Ｂ）。
血清の酵素発現は、実施例３で考察されている試験と一致した。図９Ａに示すように、ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウス（陰性対照として機能する）のβ－ｇａｌ酵素活性は、ほぼ１０ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間のままであり、陽性対照群（ビヒクル治療ＧＬＢ１＋／－マウスである）は、約１００ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間の酵素活性を示した。マウス１匹当たり４．４×１０１０ＧＣの用量でｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１により治療すると、β－ｇａｌ酵素活性は、６０日目および１２０日目の両方で、陰性対照と比較して有意に増加した。マウス１匹当たり１．３×１０１１ＧＣのより高い用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１は、６０日目に、陽性対照よりも高いβ－ｇａｌ酵素活性をもたらし、１２０日目にはさらなる上昇がもたらされた。
ＧＭ１マウスの歩行表現型も、実施例３に示される以前の結果と一致した。神経学的検査スコア、後肢の足跡長、後肢のスイング時間、および後肢の歩幅長を取得し、結果を、図９Ｃ～９Ｆにプロットする。４つすべてのプロットされたパラメータについて、陰性対照と陽性対照との間に有意な統計的差があり、このことは、これらのパラメータが、有効性を評価するための良好な指標として機能し得ることを示している。ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスと比較して、４．４×１０１０ＧＣのｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１で治療されたマウスは、後肢の足跡長、後肢のスイング時間、および後肢の歩幅長において有意な改善を示した。１．３×１０１１ＧＣのより高い用量では、後肢のスイング時間の増加およびより長い歩幅長を提供し、修正が成功したことを示している。神経学的検査は、歩行分析と比較して感度が高い。図９Ｃに示すように、用量の増加に伴って減少した神経学的スコアによって示される、用量依存的な改善が観察されたが、１．３×１０１０ＧＣのｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１による治療は、陰性対照のものと比較して、総スコアで統計的有意性を示した。表現型修正の証拠は、マウス１匹当たりわずか１．３×１０１０ＧＣの用量で観察された。
すべての未治療動物が生存したままであると予想される場合、同じセットのパラメータは、この動物コホート内で少なくともさらに１５０日間、採取を継続する。未治療ＧＬＢ１－／－マウスと比較した生存率の変化を評価する。
上で考察した動物のうちの半分を、治療から２７０日後に安楽死させる。残りの半分の動物を、治療１５０日後に安楽死させる。別の２４匹のマウスが、ベースライン剖検対照として提供される。すべての安楽死させた動物について、組織学的および生化学的な比較は、治療動物と未治療動物との間で行われる。剖検後、脳を切片化し、ＬＡＭＰ１について染色して、リソソーム蓄積病変を評価し、これを自動イメージングシステムを使用して定量化する。β－ｇａｌ活性は、脳、血清、および末梢臓器において測定される。安全性分析の場合、全血球数および血清化学パネルのために、剖検時に採血し、委員会認定の獣医病理学者による組織病理学の評価のために、脳、脊髄、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、および性腺を採取する。ビヒクル治療ＧＬＢ１－／－マウスと比較して脳蓄積病変の有意な低下を達成するｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１の最小用量を、最小有効用量（ＭＥＤ）として選択する。
結果：４週齢のＧＬＢ１－／－マウスにおける４．４０×１０９ゲノムコピー（ＧＣ）～１．３０×１０１１ＧＣの範囲の用量レベルでのｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１の単回脳室内（ＩＣＶ）投与は、脳内で測定されたβ－ガラクトシダーゼ活性の増加と裏付けられる脳蓄積病変の分解をもたらした。自動歩行分析および標準化された神経学的検査によって測定される生存、脳蓄積病変の分解、および神経学的機能は、用量依存的な方法で改善された。ｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１治療マウスにおける肝形質導入および血清β－ガラクトシダーゼ活性は、ヘテロ接合対照（Ｇｌｂ＋／－マウス）の肝形質導入および血清β－ガラクトシダーゼ活性を有意に上回った。末梢臓器における生化学的修正は、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１治療で観察され、単回のＩＣＶ投与で中心性疾患および末梢疾患の両方を治療する可能性が示された。評価された最小用量（４．４×１０９ＧＣ）は、生存率、神経学的検査スコア、および脳蓄積病変における統計的に有意な改善に基づいて、ＭＥＤとみなされた。
Ｂ．非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における毒性試験
アカゲザルは、患者集団（４～１８ヶ月齢の乳児）のサイズおよびＣＮＳ解剖学的構造を最もよく再現し、臨床投与経路（ＲＯＡ）を使用して治療することができるため、毒性試験のために選択された。幼若動物を、小児治験集団を代表するように選択した。一実施形態では、幼若アカゲザルは、１５～２０ヶ月齢である。サイズ、解剖学的構造、およびＲＯＡの類似性は、代表的なベクター分布および形質導入プロファイルをもたらし、毒性の正確な評価を可能にする。加えて、げっ歯類モデルよりもＮＨＰにおいてより厳密な神経学的評価が行われ、より敏感なＣＮＳ毒性の検出を可能にする。
ＩＣＭ投与後のＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１の毒性を調査するために、１２０日間のＧＬＰ準拠安全性試験を、幼若アカゲザルで実施した。ＩＣＭのＡＡＶ投与後、分泌された導入遺伝子産物が安定した定常レベルに到達するのに十分な時間を与えるために、１２０日間の評価期間を選択した。試験設計を以下の表に概説する。アカゲザルは、以下の３つの用量レベルのうちの１つを受ける：合計で３．０×１０１２ＧＣ、合計で１．０×１０１３ＧＣ、または合計で３．０×１０１３ＧＣ（ｎ＝６／用量）またはビヒクル（ｎ＝４）。用量レベルは、脳質量によってスケールされた場合、最小有効用量（ＭＥＤ）の試験で評価されたものと同等であるように選択された（マウスでは０．４ｇ、アカゲザルでは９０ｇを想定）。ベースラインの神経学的検査、臨床病理学（鑑別を伴う細胞数、臨床化学、および凝固パネル）、ＣＳＦ化学、およびＣＳＦ細胞学が行われた。ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１またはビヒクル投与後、動物を苦痛および異常行動の徴候について毎日モニタリングした。
血液およびＣＳＦ臨床病理評価ならびに神経学的検査は、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１またはビヒクル投与後３０日間毎週、およびその後３０日間毎に実施した。ベースラインおよびその後の各３０日間の時点で、ＡＡＶｈｕ６８に対する中和抗体、ならびにＡＡＶｈｕ６８およびＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１導入遺伝子産物に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）の酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイによって評価した。
アカゲザルのＧｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＬＰ）毒性試験
Figure 2023513487000013
ｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１またはビヒクルのいずれかの投与後、動物の半数を６０日目に安楽死させ、半数を１２０日目に安楽死させる。包括的な顕微鏡組織病理学的検査のために、組織が採取された。組織病理学的検査は、中枢神経系組織（脳、脊髄、および背側根神経節）および肝臓に焦点を当てた。なぜなら、これらはＡＡＶｈｕ６８ベクターのＩＣＭ投与後に最も重度に形質導入された組織であるからである。加えて、リンパ球は、剖検時にこれらの臓器内のカプシドおよび導入遺伝子産物の両方に反応するＴ細胞の存在を評価するために、脾臓および骨髄から採取された。
ベクターの生体内分布は、組織試料中の定量的ＰＣＲによって評価された。血清およびＣＳＦ試料において、ベクターゲノムを定量化した。
結果：
ＩＣＭ投与後のベクターの安全性、耐容性、ならびに生体内分布および排泄（脱落）プロファイルを評価するために、１２０日間の優良試験所基準（ｇｏｏｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒａｃｔｉｃｅ）、またはＧＬＰに準拠した毒性試験をＮＨＰで実施した。幼若の雄および雌のアカゲザルは、ビヒクルの単一のＩＣＭ投与、またはｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１の３つの用量レベルのうちの１つを受けた。各コホートからの動物は、投与の６０日後または１２０日後のいずれかに安楽死させた。
生涯評価には、毎日実施される臨床観察、複数の予定された身体検査、標準化された神経学的モニタリング、感覚神経伝導試験、またはＮＣＳ、体重、血液およびＣＳＦの臨床病理、血清循環中和抗体の評価、およびベクター薬物動態およびベクター排泄の評価が含まれていた。
動物を剖検し、組織を回収して、包括的な組織病理学的検査、Ｔ細胞応答の測定、および生体内分布分析を行った。
Ｃ．非臨床ＡＡＶ試験における感覚ニューロン毒性
ＡＡＶの全身投与および髄腔内（ＩＴ）投与を評価する非臨床試験は、一貫して、背側根神経節（ＤＲＧ）内の感覚ニューロンの効率的な形質導入、およびある場合は、これらの細胞を伴う毒性の証拠を実証した。髄腔内投与は、それらの中心軸索がＣＳＦに曝されるため、感覚ニューロン形質導入を可能にし得るか、またはＤＲＧが脊髄ＣＳＦに曝されるため、ｒＡＡＶが細胞体に直接到達し得る。非臨床試験の結果は、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する１～２４ヶ月齢の対象におけるｒＡＡＶ．ｈＧＬＢのＩＣＭ投与が、中心性ベータ－ガラクトシダーゼレベルを増加させ、疾患の進行を防止することを示唆する。非臨床毒性データは、末梢神経安全性モニタリングに加えて、他のＡＡＶ遺伝子療法に典型的に利用される評価から臨床安全性モニタリングが構成されるべきであることを示す。
ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ投与の前に、およびその後毎月、すべての動物について感覚神経伝導試験を行い、両側正中神経感覚活動電位振幅および伝導速度を測定した。動物を、ケタミン／デクスメデトミジンの組み合わせで鎮静させた。体温を維持するために、鎮静した動物を、ヒートパックを備えた処置台に対して横向きまたは背殿位で配置した。電気信号取得に干渉する可能性があるため、電子加温デバイスは使用しなかった。
Ｎｉｃｏｌｅｔ ＥＤＸ（登録商標）システム（Ｎａｔｕｓ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）およびＶｉｋｉｎｇ（登録商標）分析ソフトウェアを使用して、感覚神経伝導試験（ＮＣＳ）を実施した。簡潔にいうと、刺激プローブは、記録部位に最も近いカソードで、正中神経の上に配置された。２つの針電極を、遠位指骨（参照電極）および近位指骨（記録電極）のレベルで第２指の皮下に挿入し、一方、接地電極を刺激プローブ（陰極）の近位に配置した。ＷＲ５０Ｃｏｍｆｏｒｔ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｂｅ小児刺激装置（Ｎａｔｕｓ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）を使用した。励起された応答を、差動増幅させ、モニターに表示させた。バックグラウンド電気シグナルがないことを確認するために、初期取得刺激強度を０．０ｍＡに設定した。最適刺激位置を見つけるために、刺激強度を１０．０ｍＡまで増加させ、連発刺激を生成しつつ、最大の明確な波形によって決定される最大位置が見つかるまで、正中神経に沿ってプローブを移動させた。プローブを最適位置に保ちつつ、ピーク振幅応答が増加しなくなるまで、刺激強度を段階的に１０．０ｍＡまで増加させた。各刺激応答を記録し、ソフトウェアに保存した。最大１０の最大刺激応答を平均し、正中神経について報告した。記録部位から刺激カソードまでの距離（ｃｍ）を測定し、ソフトウェアに入力した。伝導速度は、応答の開始潜時および距離（ｃｍ）を使用して計算した。伝導速度および感覚神経活動電位（ＳＮＡＰ）振幅の平均を報告した。正中神経を両側試験した。この装置によって生成したすべての生データを、試験ファイルの一部として保持した。
ＳＮＡＰ振幅については、動物間および動物内の変動は明らかであったが、値は、典型的には、ベースライン測定の範囲内に留まっていた（図２１Ａ～２１Ｂ）。中用量を投与された１匹の動物（動物１７－２２６［１．０×１０１３ＧＣ、群７］）および高用量を投与された１匹の動物（動物１７－２０５［３．０×１０１３ＧＣ、群８］）は、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ投与の２８日後に両側正中神経感覚振幅の顕著な減少を示し、これは、剖検時まで持続した（図２１Ａ～２１Ｂ）。これらの動物では、異常な臨床知見は存在しなかったが、末梢神経の組織病理学知見と相関していた。ＳＮＡＰの顕著な減少を呈する動物（動物１７－２２６［１．０×１０１３ＧＣ、群７］および動物１７－２０５［３．０×１０１３ＧＣ、群８］）では、開始潜時を決定することができなかったため、伝導速度の測定が妨げられた。他のすべての動物について、試験全体を通して、正中神経伝導速度の有意な変化は観察されなかった（図２１Ａ～２１Ｂ）。
組織病理学的初見
Ａ．組織病理を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色またはトリクローム染色によって評価した。
ヘマトキシリンおよびエオシン染色：すべての組織および任意の全般的病変は、ＳＯＰ４０１９に従って採取され、ラベル付けされた。予めラベル付けしておいたカセット中の試料を、ＳＯＰ４００３に従って、１０％中性緩衝液ホルマリン、改変デビッドソン溶液（眼）、またはデビッドソン溶液（精巣）に固定した。すべての濡れた組織を、組織処理、包埋、切片化、およびヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のためにＨｉｓｔｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに送った。組織病理学的評価のために、組織病理学スライドを、最初に、一次試験病理学者によって評価し、組織学的評価、全身剖検所見、関連する臨床病理学的結果、および組織病理学的所見の解釈に役立つ任意の裏付けデータに基づいて予備的な病理学報告書を作成した。一次レビューが完了すると、病理報告書の草稿、スライド、および報告書の草稿作成に使用された任意の裏付け資料は、ピアレビューのためにピアレビュー病理学者に提出された。病理学ピアレビューメモは、ピアレビュー病理学者によって作成され、署名され、日付が入れられた。メモには、ピアレビュープロセスの材料、方法、および実施に関する文書、ならびに一次試験病理学者の病理学報告書に対するピアレビュー病理学者の一般的な合意が含まれていた。一次試験病理学者とピアレビュー病理学者との間に差がある場合には、それを調整し、ピアレビューが完了したら、最終報告書を作成した。最終試験報告書は、ピアレビュー報告書からの入力を組み込み、ＧＴＰの品質保証ユニット（ＱＡＵ）によって品質保証のためにレビューされた。
トリクローム染色の場合：試験病理学者の裁量で、マッソントリクローム染色組織科学染色を使用して、Ｈ＆Ｅ染色によって特定された目的の初見（すなわち、軸索周囲線維症）をさらに評価した。Ｍａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号２５０８８－１）を使用して、左右の近位正中神経のスライドを染色した。組織病理学的評価のために、スライドを光顕微鏡によって調べ、Ｈ＆Ｅ染色スライドに使用されているのと同じ半定量的スコアリングシステムを使用して、盲検化された様式で一次試験病理学者によってスコアリングした。また、スライドを、Ａｐｅｒｉｏ ＶＥＲＳＡ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してデジタルスキャンし、ＶＩＳ画像解析ソフトウェ（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ、Ｈｏｅｒｓｈｏｌｍ、Ｄｅｎｍａｒｋ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ２０１９．０７．０．６３２８）を使用して定量化した。
Ｂ．病理組織学的所見
試験物品に関連する所見は、主にＤＲＧ、三叉神経節（ＴＲＧ）、脊髄白質後索、および末梢神経内で観察された。これらの初見は、ＤＲＧ／ＴＲＧ内のニューロン変性、ならびに脊髄白質後索および末梢神経内の軸索変性（すなわち、軸索変性症）からなっていた。全体として、これらの所見は、すべてのＧＴＰ－２０３治療群にわたって観察されたが、しかしながら、発生率および重症度は、両方の時点で、中用量（１．０×１０１３ＧＣ）群および高用量（３．０×１０１３ＧＣ）群からの個々の動物において高くなる傾向があった。他の試験物品に関連する所見には、一般に、注射部位の骨格筋および脂肪組織における単核細胞浸潤に加えて、脳の様々な核および白質路におけるグリオーシスの小さな病巣が含まれていた。
６０日目および１２０日目の時点ですべての用量群にわたって観察された試験物品に関連する組織病理学的所見は、ＤＲＧにおける単核細胞浸潤を伴うニューロン細胞体の変性からなっており、軸索が脊髄白質後索内へ中央に向かって突出し、末梢神経に対して末梢方向に突出する。同様の所見は、ＴＲＧにおいても観察された。６０日目の時点で、ＤＲＧ／ＴＲＧ変性の発生率および重症度は、低用量群（なし～最小［３．０×１０１２ＧＣ、群２、１／３動物］）において、中用量群（１．０×１０１３ＧＣ、群３、３／３動物）および高用量群（３．０×１０１３ＧＣ、群４、２／３動物）（なし～中程度）の両方の群と比較してわずかに低く、このことは、用量依存的応答を示唆している。１２０日目の時点で、ＤＲＧ／ＴＲＧ変性の重症度は、低用量群（なし～最小［３．０×１０１２ＧＣ、群６、２／３動物］）において最も低く、中用量群（なし～軽度［１．０×１０１３ＧＣ、群７、３／３動物］）から高用量群（なし～中程度［３．０×１０１３ＧＣ、群８、３／３動物］）へと増加し、これも用量依存的応答を示している。時点間で比較すると、ＤＲＧ／ＴＲＧニューロン変性の発生率および重症度は、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１治療群間で比較的類似しており、このことは、時間依存的応答が存在しないことを示唆している。時間依存的応答がないことは、ＤＲＧ／ＴＲＧニューロン変性のさらなる進行が６０日目から１２０日目の時点で生じないことを示唆する。
ＤＲＧ変性は、脊髄白質後索および末梢神経の軸索変性を引き起こし、このことは、軸索変性と顕微鏡的に一致していた。６０日目の時点で、すべてのｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１治療群において全体的な発現率および重症度（な用量依存的応答し～軽度）が類似していたため、用量依存的応答は、白質後索軸索変性症に関して観察されなかった。１２０日目の時点で、低用量群（最小［３．０×１０１２ＧＣ、群６、２／３動物］）において、中用量群（１．０×１０１３ＧＣ、群７、３／３動物）および高用量群（３．０×１０１３ＧＣ、群８、３／３動物）の両方の群（最小～中程度）の場合と比較して、白質後索軸索変性症の発生率および重症度が最も低かったことから、用量依存的応答が観察された。時点間で比較すると、６０日目～１２０日目の時点で、中用量（１．０×１０１３ＧＣ）および高用量（３．０×１０１３ＧＣ）群の両方で、白質後索軸索変性症の重症度が、およびより少ない程度で、発生率が増加し、このことは、時間依存的応答および所見の進行を示している。しかしながら、この結論に対する重要な注意点は、１２０日目の時点で、中用量群の１／３匹の動物（動物１７－２２６［１．０×１０１３ＧＣ、群７］）および高用量群の１／３匹の動物（動物１７－２０５［３．０×１０１３ＧＣ、群８］）は、両群の他の動物よりも有意に重症度が高く、これらの結果の解釈に影響を及ぼすことである。対照的に、発現率および重症度は、６０日目から１２０日目までの低用量群（３．０×１０１２ＧＣ）において低下し、この用量では、白質後索軸索変性症が進行しなかったことを示す。６０日目の時点での末梢神経軸索変性症に関して、高用量群で観察された重症度（最小～中程度［３．０×１０１３ＧＣ、第４群、２０／２４神経、３／３動物］）と比較して、低用量（３．０×１０１２ＧＣ、第２群、２０／２４神経、３／３動物）および中用量（１．０×１０１３ＧＣ、第３群、２２／２４神経、３／３動物）群（最小～軽度）において重症度が最も低かったことから、用量依存的応答が観察された。１２０日目の時点で、末梢神経軸索変性症の重症度は、中用量（１．０×１０１３ＧＣ、第７群、３０／３０神経、３／３動物）および高用量（３．０×１０１３ＧＣ、第８群、３０／３０神経、３／３動物）群（最小～顕著）において、低用量（３．０×１０１２ＧＣ、第６群、２９／３０神経、３／３動物）およびビヒクル治療（ＩＴＦＦＢ、第５群、３０／３０神経、２／２動物）群（最小）において観察された重症度と比較して高く、用量依存的応答を示している。１２０日目の時点でのビヒクル治療動物（ＩＴＦＦＢ、群５、３０／３０神経、３／３動物）は、最小限の軸索変性症を示し、このことは、末梢神経ならびにＤＲＧ軸索で観察された。これらのビヒクル治療動物で観察された軸索変性症の程度は、１２０日目の時点で、低用量群（３．０×１０１２ＧＣ、群６）の３／３動物および中用量群（１．０×１０１３ＧＣ、群７）の１／３動物におけるほとんどの末梢神経およびＤＲＧ軸索の程度と同等であった。複数時点にわたる末梢神経軸索変性症を比較すると、すべての群で、６０日目から１２０日目にかけて発症率および重症度が増加し、このことは、時間依存的応答を示しているが、その差は、中用量（１．０×１０１３ＧＣ）で最も劇的であった。
６０日目の時点と比較した１２０日目の時点での末梢神経所見における優位な差は、中用量群（１．０×１０１３ＧＣ、群７、２／３動物）および高用量群（３．０×１０１３ＧＣ、群８、３／３動物）においてのみ観察された、軸索周囲線維症（最小限～顕著）の存在であった。軸索周囲線維症において用量依存的応答が観察されたが、中用量群（１．０×１０１３ＧＣ、群７）において最も重症度が高かった。６０日目の時点で軸索周囲線維症がないことを考慮すると、時間依存的応答が観察された。
Ｈ＆Ｅ染色によって観察される末梢神経軸索周囲線維症をさらに評価するために、マッソントリクローム染色が実施された。この染色は、周囲の筋肉および他の組織からの線維性結合組織を強調するものである。左右の正中神経の近位部分は、その大きな円周に起因して、トリクローム染色のために選択され、追加の再切断を可能にした。６０日目にすべての動物に軸索周囲線維症が存在しなかったため、１２０日目にすべての動物に対してトリクローム染色を行った。盲検評価者によるトリクローム染色の半定量的スコアリングは、中用量群（１．０×１０１３ＧＣ、群７、２／３匹）および高用量群（３．０×１０１３ＧＣ、群８、３／３匹）における用量依存的な軸索周囲線維症の存在を確認した。重症度は、中用量群（１．０×１０１３ＧＣ、群７、３／３動物）では、なし～顕著であり、高用量群（３．０×１０１３ＧＣ、群８、３／３動物）では、最小限から顕著の範囲であった。Ｈ＆Ｅに基づく所見と一致して、最高重症度の軸索周囲線維症（中等度から顕著）は、中用量では１／３動物（動物１７－２２６、１．０×１０１３ＧＣ、第７群）、高用量では１／３動物（動物１７－２０５、３．０×１０１３ＧＣ、第８群）で発生し、このことは、２８日目から１２０日目までに観察されたこれらの動物におけるＳＮＡＰ振幅の顕著な減少と相関があった。さらに、ＶＩＳ画像解析ソフトウェアを使用したトリクローム染色の定量化により、低用量（３．０×１０１２ＧＣ、群６）およびビヒクル治療群（ＩＴＦＦＢ、群５）と比較した場合、中用量（１．０×１０１３ＧＣ、群７）および高用量群（３．０×１０１３ＧＣ、群８）について、神経組織体積の用量依存的減少および組織切片内の白色空間の用量依存的増加が明らかになった。これらの所見は、中用量群（１．０×１０１３ＧＣ、群７）および高用量群（３．０×１０１３ＧＣ、群８）における軸索損失を示すものであった。
ＣＮＳにおける他の試験物品に関連する所見には、高用量を投与された１匹の動物（動物１７－２１６［３．０×１０１３ＧＣ、群４］）の６０日目の腰椎脊髄の腹側角における軽度のグリオーシスおよび衛星病変が含まれていた。衛星病変の有無にかかわらず、最小限のグリオーシスが、両方の時点ですべてのｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１治療群にわたって、動物の脳で散発的に観察された。６０日目の時点で、特に動物１７－２１３において、高用量群（３．０×１０１３ＧＣ、群４、２／３動物）において、低用量群（３．０×１０１２ＧＣ、群２、１／３動物）および中用量群（１．０×１０１３ＧＣ、群３、１／３動物）と比較して、衛星病変の有無にかかわらずグリオーシスの発生率がわずかに高い。１２０日目の時点で、すべてのｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１治療群にわたって、最小限の血管周囲浸潤および小さなグリオーシスの病巣が散発的に観察されたが、これらの所見の発生率は、６０日目の時点と比較して１２０日目の時点で低下し、これは、分解を示唆している。
ＩＣＭ／ＣＳＦ採取部位にわたる骨格筋および脂肪組織内の局所的な注射部位所見は、６０日目の時点で、ビヒクル治療動物（ＩＴＦＦＢ、群１）を含むすべての群にわたって観察された。しかしながら、６０日目の時点で、浸潤物の組成は変化し、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１治療動物では重症度が増加した。６０日目のビヒクル治療群（ＩＴＦＦＢ、群１、１／２動物）における浸潤物は、ほとんどが組織球（最小限）で構成され、一方、ＧＴＰ－２０３治療動物は、最小限～軽度の筋線維変化を伴うか、または伴わず、主にリンパ球および形質細胞（最小～中程度）を有していた。変性および萎縮を含む筋繊維変化は、高用量群において、６０日目にのみ見られた（３．０×１０１３ＧＣ、群４、１／３動物）。１２０日目の時点で、すべてのｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１治療動物は、低用量（３．０×１０１２ＧＣ、群６、３／３動物）での最小限から、中用量（１．０×１０１３ＧＣ、群７、３／３動物）および高用量（３．０×１０１３ＧＣ、群８、３／３動物）での最小限～軽度までの範囲の骨格筋および／または脂肪組織内に単核細胞浸潤を示し、これはおそらく用量依存的応答を示唆している。１２０日目の注射部位所見の重症度（最小限～軽度）は、６０日目に観察された重症度（筋繊維変化を伴い、最小限～中程度）と比較して低下し、これは、分解を示し、時間依存的応答を示唆する。これらの所見は、反復的なＣＳＦ採取からの寄与の可能性のある初期注射に起因する可能性が高いが、試験物品に対する局所的な応答に起因する構成要素が存在した可能性がある。
ベクター薬物動態および排泄
ＩＣＭ投与後、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１ベクターＤＮＡは、ＣＳＦおよび末梢血において検出可能であり、ＣＳＦ中のピーク濃度は、用量と相関していた。ＣＳＦ中のｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１の濃度は、評価された最初の時点（７日目）の後に急速に下がり、高用量群における１匹の動物（動物１７－２１２［３．０×１０１３ＧＣ、群８］）を除いて、ほとんどの動物において、６０日目までには検出されなかった。６０日目の剖検時に、ＣＳＦ中のｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１ベクターＤＮＡ濃度は低下傾向にあった。血液中のｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１ベクターＤＮＡ濃度は、これよりゆっくりと下がり、これは末梢血細胞の形質導入に起因する可能性がある。
０日目に、高用量群中の２匹の動物（動物１７－１９７および１７－２０５［３．０×１０１３ＧＣ、群８］）のＣＳＦにおいて、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１ベクターＤＮＡが検出されたが、血液中では検出されなかった。０日目に、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１陽性のＣＳＦ試料を再試験し、結果を確認した。０日目のＣＳＦにおけるｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１ベクターＤＮＡの検出は、ＩＣＭ投与手技中のＣＳＦ試料汚染に起因する可能性が高い。
ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１ベクターＤＮＡは、ベクター投与の５日目に、尿および糞便において検出可能であった。ピークレベルは、一般に、投与される用量に比例していた。ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１ベクターＤＮＡは、ベクター投与後の６０日目までに、すべての動物の尿および糞便において検出することができなかった。
導入遺伝子発現の評価
ヒトβ－ｇａｌ活性を、ＣＳＦおよび血清において測定した。簡潔にいうと、１～１０μＬのＣＳＦまたは血清のいずれかを、９６ウェルの黒色プラスチックアッセイプレート中で、９９μＬの反応混合物（０．５ｍＭの４－メチルウンベリフェリルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド［Ｓｉｇｍａ Ｍ１６３３］、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、および０．１Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５８）と混合する。プレートを密封し、３７℃で３０分間インキュベートし、１５０μＬの停止溶液（２９０ｍＭグリシンおよび１８０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ１０．９）を添加することにより、反応を停止させる。反応生成物からの蛍光は、３６５ｎｍでの励起時に４５０ｎｍの発光波長で測定される。
主要臓器における導入遺伝子産物発現（β－ｇａｌ活性）は、正常なＮＨＰにおける内因性アカゲザルβ－ｇａｌ酵素活性が高レベルであることに起因して、評価することができなかった。より低いレベルの内因性アカゲザルβ－ｇａｌ酵素が、ＣＳＦおよび血清中に存在し、０日目、７日目、１４日目、２８日目、６０日目、９０日目、および１２０日目のＣＳＦ、ならびにベースラインおよび１４日目、２８日目、６０日目、９０日目、および１２０日目の血清の導入遺伝子発現解析を可能にする。しかしながら、ＮＨＰのＣＳＦおよび血清中の導入遺伝子産物活性の分析は、アッセイの性質によって制限され、ヒトβ－ｇａｌ酵素と内因性アカゲザルβ－ｇａｌ酵素とを区別することができなかったことに留意されたい。この限定された感度、および分析のために各動物のベースライン内因性β－ｇａｌ活性レベルの使用を必要とした（図２２Ａ～図２２Ｄにおいて、破線によって示される）。１４日目以降の導入遺伝子産物活性の急速な喪失は、ヒト導入遺伝子産物に対する抗体応答に起因する可能性が高いため、分析も複雑であった（図２２Ａ）。
これらの注意事項にもかかわらず、ＣＳＦおよび血清中のβ－ｇａｌ活性は、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ１投与の１４日後に、すべての用量群からの動物においてベースラインレベルを超えて検出された（図２２Ｂ）。ＣＳＦにおいて、２つのより高い用量（１．０×１０１３ＧＣ［１．１×１０１１ＧＣ／ｇ脳］または３．０×１０１３ＧＣ［３．３×１０１１ＧＣ／ｇ脳］）を受ける動物は、ビヒクル治療対照のレベルよりもそれぞれおよそ２倍および４倍高いβ－ｇａｌ活性レベルを示した。さらに、ＣＳＦにおける発現は、ベクターカプシドに対する既存のＮＡｂの存在に影響されず、このことは、ＮＡｂステータスにかかわらず、乳児／後期乳児ＧＭ１患者における標的臓器系（ＣＮＳ）における治療活性を達成する可能性を裏付けている。
血清中において、ベクターカプシドに対する既存のＮＡｂを欠く動物（図２２Ｂにおいて、白抜きの形状によって示される）は、ビヒクル治療対照、またはベクターカプシドに対する既存のＮＡｂについて陽性の動物（図２２Ｂにおいて、黒色の形状によって示される）のいずれかと比較して、β－ｇａｌ酵素活性がより高くなる傾向があった。この結果は、ＮＡｂ陰性乳児／後期乳児ＧＭ１患者の末梢臓器における治療活性の可能性を示唆する。
生体内分布：剖検時に、組織を、生体内分布のために採取し、ラベル付けされたバイアル中のドライアイス上に置き、分析前に－６０℃以下で保存した。ＤＮＡは、訓練された施術者によって組織から抽出され、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ反応を、ＳＯＰ３００１に従うことによって行った。簡潔にいうと、組織を機械的に均質化し、プロテイナーゼＫで消化した。試料をＲＮＡｓｅＡで処理し、細胞を、緩衝液ＡＬ（カタログ番号＃１９０７５、ＱＩＡＧＥＮ）中、７０℃で１時間インキュベートすることによって溶解させた。ＤＮＡを抽出し、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム上で精製した。９０ｎｇ／μｌ以上、１１０ｎｇ／μｌ以下の濃度まで希釈した後、ベクター特異的プライマーおよび／または導入遺伝子特異的プライマーを使用して、ｑＰＣＲ反応を二重に行った。シグナルを、同じ試験からのナイーブまたは陰性対照動物由来の既知の濃度のＤＮＡのバックグラウンドにおける洗浄プラスミドＤＮＡの標準曲線と比較した。１マイクログラムのＤＮＡ当たりのゲノムコピーを計算した。ＰＣＲ反応における交差汚染および試料干渉を除外するために、追加の対照を利用した。生データは、Ｃｔ値について事前に定義された合格基準に基づいて分析され、各実行について定量限界が決定された。すべてのデータは、バッチ記録フォームに含まれ、および／またはバッチ記録フォームに添付された。
ベクターゲノムは、６０日目（図２３）および１２０日目（図２４）に、脳、脊髄、ＤＲＧ、肝臓、および脾臓において高レベルで検出され、これは、ＩＣＭ ＡＡＶ投与の以前の試験と一致する。ＣＮＳ組織で検出されたベクターゲノムの量は、一般に、用量依存的であることが観察された。ＣＮＳ組織中のベクターゲノムは、投与後６０～１２０日の間に安定しているようであった。１２０日目に、中用量群（１．０×１０１３ＧＣ、群７）に登録された３匹の動物はすべて、ＡＡＶｈｕ６８に対するベースラインＮＡｂを有しており、これは、肝臓への非常に低いベクター分布と相関していた。ビヒクル治療された２匹の対照動物（動物１７－１９９［群１］および１７－２０４［群５］）からのいくつかの試料において、ベクターゲノムを検出した。これらの試料を２回試験して、ベクターゲノムの存在を確認した。
結論：
ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢのＩＣＭ投与は、評価されたすべての用量で十分に耐容性であった。ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢは、臨床および行動徴候、体重、または神経学的および身体的検査に有害な影響を生じなかった。いくつかの動物において、ＣＳＦ白血球の軽度の一過性の増加を除いて、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ投与に関連する血液およびＣＳＦの臨床病理の異常は存在しなかった。
ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ投与は、ＴＲＧおよびＤＲＧ感覚ニューロン、ならびにそれらに関連する中心軸索および末梢軸索の無症状性変性を引き起こした。これらの病変の重症度は、典型的には、最小限～軽度であった。これらの所見は、中用量群（１．０×１０１３ＧＣ）および高用量群（３．０×１０１３ＧＣ）において、より重度の病変の傾向を有し、用量依存的であった。
感覚ニューロン細胞体の変性は、６０日目よりも１２０日目の方が重症ではなかった。この結果は、これらの病変は進行性ではないことを示したが、その後の軸索変性および線維化は、数ヶ月にわたって進行し続ける可能性がある。これらの所見と一致して、１２０日目に剖検時に最も重度の軸索損失および正中神経の線維化を示した２匹の動物（動物１７－２２６および１７－２０５）は、２８日目までに正中神経感覚活動電位振幅の低下を示したが、その後の進行はなかった。すべての投与群に無症候性感覚ニューロン病変が存在するため、ＮＯＡＥＬは定義されなかった。評価した最大用量（３．０×１０１３ＧＣ）をＭＴＤとみなした。感覚神経活動電位が低下した、最も重度の軸索損失および線維症を示した２匹の動物が、矢印で示されている。（図１８Ａ～１８Ｂ、１９Ａ～１９Ｂ。図２０Ａ～２０Ｂは、マイクロボルト単位での正中感覚活動電位によって測定されるような、試験中の各測定点における正中感覚神経伝導の変化を示す。
ＣＳＦおよび血清における導入遺伝子発現（すなわち、β－ｇａｌ酵素活性）は、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢのＩＣＭ投与の１４日後に、すべての用量群からの動物においてベースラインレベルを超えて検出可能であった。ＣＳＦにおいて、２つのより高い用量（１．０×１０１３ＧＣまたは３．０×１０１３ＧＣ）を受ける動物は、ビヒクル治療対照のレベルよりもそれぞれおよそ２倍および４倍高いβ－ｇａｌ活性レベルを示した。ＣＳＦにおける発現は、ベクターカプシドに対する既存のＮＡｂの存在に影響されず、このことは、ＮＡｂステータスにかかわらず、乳児／後期乳児ＧＭ１患者における標的臓器系（ＣＮＳ）における治療活性を達成する可能性を裏付けている。
ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢのＩＣＭ投与は、ＣＳＦにおけるベクター分布、ならびに脳、脊髄、およびＤＲＧへの高レベルの遺伝子導入を引き起こした。ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢはまた、末梢血および肝臓において有意な濃度に達した。
ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ ＤＮＡ排泄の評価は、投与から５日後に尿および糞便において検出可能なベクターＤＮＡを示し、６０日以内に検出不可能なレベルに達した。
ベクターカプシドおよび／またはヒト導入遺伝子産物に対するＴ細胞応答は、ｒＡＡＶ．ｈＧＬＢ治療動物の大部分において、ＰＢＭＣおよび／または組織リンパ球（肝臓、脾臓、骨髄）において検出可能であった。Ｔ細胞の応答は、一般に、いかなる異常な臨床的または組織学的所見とも関連していなかった。
ベクターカプシドに対する既存のＮＡｂは、いくつかの動物において検出可能であり、脳および脊髄への遺伝子導入に影響を及ぼさないように思われたが、既存のＮＡｂの存在は、肝臓遺伝子導入の著しい低下と相関していた。
実施例５：乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する小児対象の大槽（ＩＣＭ）に送達されたｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の単回用量の安全性および耐容性を評価するための第１／２相非盲検多施設用量漸増試験
最初の１８ヶ月に症状が発症した最大２４ヶ月齢のＧＭ１対象を登録する。これには、１型（乳児）ＧＭ１および２ａ型（後期乳児）ＧＭ１を有する対象が含まれる。１型（乳児）の対象は、出生時に症状を示すことがある。したがって、治療は、潜在的な利益を最大化するために可能な限り早期に開始されるべきであり、この試験には、少なくとも１ヶ月齢の対象が含まれる。下限の年齢を選択する際のもう１つの考慮事項は、ＩＣＭ手技を安全に実行することができるようにすることである。提案されているＩＣＭ手技には、術前の脳のＭＲＩおよびＭＲ血管造影およびＣＴ／ＣＴＡガイドＩＣＭ注射が含まれる。１ヶ月齢を超える乳児にＩＣＭ投与を行うことには、年齢に特有の安全性の懸念はない。
ＩＣＭベクター投与は、ＣＮＳ区画内の即時ベクター分布をもたらす。したがって、臨床用量は、脳質量によるスケール変更によって決定され、ＣＮＳ区画のサイズの近似値を提供する。有効性および毒性の両方が、ＣＮＳベクター曝露に関連することが予想される。用量変換は、幼若成体マウスでは０．４ｇ、幼若および成体アカゲザルおよび成体アカゲザル（Ｈｅｒｎｄｏｎ １９９８）では９０ｇ、ならびに０～３０ヶ月齢のヒト乳児（Ｄｅｋａｂａｎ，１９７８）では３７０ｇ～１０８０ｇの範囲の脳質量に基づく。非臨床および相当するヒト用量を以下の表に示す。
Figure 2023513487000014
脳重量が異なる（例えば、新生児と２歳の対象との間に、およそ３倍の差がある）ことを考慮すると、スライド尺度を使用して、２４ヶ月齢までの乳児および小児の公開された平均脳重量に基づいて、ＦＩＨ研究の個々の対象に投与される薬剤製品の量（遺伝子コピー［ＧＣ］の単位で）を決定する。このようにして、対象に、遺伝子コピー／脳重量の推定グラムにおける、意図した用量に最も近い体積の薬物製品を投与する。
Figure 2023513487000015
Figure 2023513487000016
Figure 2023513487000017
本試験は、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の第１／２相非盲検用量漸増試験であり、乳児形態のＧＭ１（１型）または乳児後期（２ａ型）を有する小児対象の大槽（ＩＣＭ）に送達されたＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の単回投与後の、安全性、耐容性、および探索的有効性のエンドポイントを評価する。この試験では、最大２４人の小児対象が登録され、対象は、単回用量のＩＣＭ投与ＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を受ける。
１型（乳児）ＧＭ１
・症状が出る前のＧＭ１対象（６ヶ月齢以下、変異が確認され、血清β－ｇａｌ活性が低下した）は、出生前スクリーニング、または同じ遺伝子型を有するＧＭ１ガングリオシドーシスの確認された診断を有する年上の兄弟姉妹の家族歴によって特定された。兄弟姉妹は、６ヶ月齢以下の時点で症状を発症していなければならない。
・症候性ＧＭ１対象（変異が確認され、血清β－ｇａｌ活性が低下した）は、筋緊張低下、またはＧＭ１ガングリオシドーシスと一致する何らかの文書化された症状、かつ投薬時に少なくとも７０％の年齢修正された予想される運動発達（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）を有し、６ヶ月齢以下での発症の医療記録文書を有していなければならない。
２型（後期幼児）ＧＭ１
・発症が６ヶ月齢を超え、１８ヶ月齢以下であり、筋緊張低下、またはさらなる発達マイルストーンを達成する際のプラトー状態または遅れを示したＧＭ１ガングリオシドーシスと一致する何らかの文書化された症状、かつ少なくとも７０％の年齢修正された予想される運動発達（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）を有する、症候性対象。
２つの用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を、対象の交互順次投与で評価する。ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１用量レベルは、マウスＭＥＤ試験およびＧＬＰ ＮＨＰ毒性試験のデータに基づいて決定され、低用量（コホート１に投与）および高用量（コホート２に投与）からなる。高用量は、同等のヒト用量にスケールされたＮＨＰ毒性試験における最大耐容用量（ＭＴＤ）に基づいている。ヒト対象のために選択される高用量が等価ヒト用量の３分の１～半分であるように、安全域（ｓａｆｅｔｙ ｍａｒｇｉｎ）が適用される。低用量は、動物試験において等価スケール化されたＭＥＤを超える用量である限り、典型的には、選択された高用量よりも２～３倍低い。これにより、両方の用量レベルが治療上の利益を与える可能性を有することが保証され、耐容されれば、より高い用量が有利であることが期待されることを理解する。低用量、続いて高用量の順次評価は、試験された２回の用量の最大耐容用量（ＭＴＤ）の特定を可能にする。最後に、拡大コホート（コホート３）は、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１のＭＴＤを受容する。コホート３（ＭＴＤ）の６名の対象を時間差投与（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｄｏｓｉｎｇ）なしで同時に登録する。コホート３は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）とｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１による併用療法を受けてもよい。耐容されれば、より高い用量が有利であることが期待される。
この試験の主な焦点は、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の安全性および耐容性を評価することである。ＩＣＭ ＡＡＶｈｕ６８送達のＮＨＰ研究では、一部の動物においてＤＲＧ感覚ニューロンの最小から軽度の無症状性の変性が実証されているため、感覚神経毒性を評価するために詳細な検査を実施し、本治験で感覚神経伝導検査を利用して、無症状性の感覚ニューロンの病変をモニタリングする。注目すべきことに、感覚ニューロンの機能喪失（潜在的な背側根神経節毒性に起因する）は、３０日、３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月で、およびその後は毎年の間隔で実施される感覚神経伝導検査によって評価される。非臨床ＮＨＰ試験で、ＡＡＶ投与後２～４週間以内に感覚ニューロンの病変が現れることを考慮すると、治療後３ヶ月間を通してより頻繁に評価することで、ヒトにおける同様の事象の評価を可能にし、毒性動態の潜在的な変動の評価を可能にする。この試験を通して経過観察を実施することにより、ヒトにおける時間経過が異なる場合、または臨床的続発症が観察された場合の遅延効果の評価を可能にし、それらがどのくらい持続し、経時的に改善されるか、安定した状態に維持されるか、または悪化するかを評価する。
この試験では、薬物動態および有効性のエンドポイントも評価され、この集団において有意義な機能転帰および臨床転帰を示す可能性について選択された。エンドポイントは、鎮静および／またはＬＰを必要とするものを除いて、３０日、９０日、６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月で測定され、その後は、最大５年間の経過観察期間に毎年測定される。長期経過観察段階では、測定頻度は１２ヶ月毎に１回に減らされる。これらの時点を選択して、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の安全性および耐容性の完全な評価を容易にした。未治療の乳児ＧＭ１患者における疾患進行の急速な速度を考慮して、早期の時点および６ヶ月間隔も選択した。このアプローチにより、未治療比較データが存在し、未治療の患者が著しい減少を示すことが予想される経過観察期間にわたって、治療された対象における薬物動態および臨床有効性の測定値の完全な評価が可能になる。
二次的および探索的な有効性のエンドポイントには、生存、栄養チューブからの独立、発作の発生率および頻度、ＰｅｄｓＱＬによって測定される生活の質、ならびに神経認知発達および行動発達が含まれる。ベイリー乳幼児発達およびヴァインランド尺度を使用して、適応行動、認知、言語、運動機能、および健康に関連する生活の質における発達および／または変化に対してｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１が及ぼす影響を定量化する。各測定値は、ＧＭ１疾患の集団または関連する集団のいずれかで使用され、親および家族からの入力に基づいてさらに洗練され、それらにとって最も有意義かつ影響力のある測定値を選択する。評価を標準化するために、治験に参加する現地では、経験豊富な神経心理学者によって様々な尺度の投与について訓練される。
標的集団における疾患の重症度を考慮すると、対象は、登録までに運動スキルを達成したか、他の運動マイルストーンが発達し、その後に失われたか、または運動マイルストーンの発達の徴候がまだ示されていない場合がある。評価は、すべてのマイルストーンについて、達成時年齢と喪失時年齢を追跡する。運動マイルストーンの達成度は、ＷＨＯ基準に基づいて６つの粗大マイルストーンに定義されている。
乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する対象は、生後数ヶ月以内に症状を発症する可能性があり、第１のＷＨＯ運動マイルストーン（支えなしに座る）の獲得は、典型的には、４ヶ月齢より前には現れないことを考慮すると（中央値：５．９ヶ月齢）、このエンドポイントは、特に治療時により明らかな症状を有していた対象において、治療的利益の程度を評価するための感度を欠く場合がある。このため、乳児に適用され得る年齢に適した発達マイルストーンの評価も含まれる（Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅｓ．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｖ．３７（１）：２５－３７；ｑｕｉｚ ３８，４７）。これらのデータは、乳児ＧＭ１疾患を有する未治療の子供または定型発達の子供における典型的な獲得時間と比較して、経時的な発達マイルストーンの保持、獲得、または喪失を要約するために有益であり得る。
疾患が進行するにつれて、小児は、発作を起こす可能性がある。発作活動の開始により、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１による治療が、発作の発症を予防もしくは遅延させるか、またはこの集団における発作事象の頻度を減少させるかのいずれかを決定することが可能になる。保護者は、発作の発症、頻度、長さ、および種類を追跡する、発作日記をつけるように求められる。これらのエントリは、各々の訪問時に、臨床医とともに考察され、臨床医によって解釈される。
ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の疾患体積変化のＣＮＳ徴候に対する効果を評価するために、経時的にＭＲＩで測定する。すべてのガングリオシドーシスの乳児の表現型は、脳組織体積（大脳皮質および他のより小構造）および脳室体積の両方で、巨頭症および頭蓋内ＭＲＩ体積の急速な増加と一貫したパターンを有することが示された。加えて、脳梁、尾状核、および被殻、ならびに小脳皮質を含む様々な小さな脳の下部構造は、疾患の進行に伴って一般的にサイズが減少する（Ｒｅｇｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６、およびＮｅｓｔｒａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８、本明細書で引用）。ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１による治療は、ＣＮＳ疾患の症状の進行を遅らせるか、または停止させることが期待され、萎縮および体積変化における安定化の証拠を伴う。視床および基底核におけるＴ１／Ｔ２シグナル強度の変化（正常／異常）を評価する探索的エンドポイントは、ＧＭ１およびＧＭ２ガングリオシドーシスを有する患者における視床構造の変化に関する報告された証拠に基づいている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｋａｓｈｉｍａ，１９９４，Ｔｈａｌａｍｉｃ ｈｙｐｅｒｄｅｎｓｉｔｙ ｏｎ ＣＴ ｉｎ ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ＧＭ１－ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ．Ｂｒａｉｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１６（６）：４７２－４７４）。
治験のためのバイオマーカーとしては、ＣＳＦおよび血清中で測定され得るβ－ｇａｌ酵素（ＧＬＢ１）活性、ならびに乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスにおいて一貫した急速な萎縮を示す脳ＭＲＩが挙げられる（Ｒｅｇｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ、本明細書で引用）。追加のバイオマーカーを、回収された試料由来のＣＳＦおよび血清において、調査する。
Ａ．主要目的：
・大槽（ＩＣＭ）への単回用量の投与後２年間にわたるｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の安全性および耐容性を評価するために、有害事象、神経学的検査、感覚神経伝導試験、全Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ Ｓｃｏｒｅ－Ｎｕｒｓｅ、血液学、血清化学、肝機能検査、凝固（ＰＴ、ａＰＴＴ、ＩＮＲ）、トロポニン－Ｉｆ、ＣＳＦ抗ＡＡＶｈｕ６８ ｎＡｂ、ベクター脱落、尿検査、発作日記、身体検査、バイタルサイン、ＥＣＧ、脳ＭＲＩ、およびＣＳＦ細胞診および化学（細胞数、タンパク質、グルコース）を５年間にわたって評価する。
・大槽への単回用量の投与後のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の有効性を評価すること。主な二次エンドポイント＊は、２年目および５年間にわたって評価される。
●ヴァインランド適応行動尺度、第２版
●他の二次エンドポイントは、２年目および５年間にわたって評価される。
●ベイリー乳幼児発達尺度、第３版
●ＷＨＯ多施設成長参照研究性能基準
●発達マイルストーン評価
●ハマースミス乳幼児神経学的検査
●臨床医および介護者の重症度と変化のグローバルインプレッション
●インタービューを終了する
＊目的に適した臨床転帰評価は、ＧＭ１ガングリオシドーシスについては存在しない。したがって、この試験の実施と並行して、治験依頼者は、臨床専門家および親／介護者からデータを収集して、コホート３の主要有効性エンドポイントの特定、および必要に応じて、上記の尺度に由来する複合エンドポイントの計画、既存のＣＯＡの修正、または患者中心のＧＭ１固有の補足項目または尺度の開発を含む転帰測定戦略を開発するために、対象の専門家と協力している。詳細については、統計分析セクションを参照されたい。
Ｂ．二次目的：
・大槽への単回用量後の２４ヶ月にわたって、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の薬物動態および生物学的活性を評価すること。評価：ＣＳＦバイオマーカー：β－ガラクトシダーゼ活性、ヘキソサミニダーゼ活性、ＧＭ１ガングリオシドレベル、血清バイオマーカー：β－ガラクトシダーゼ活性、ヘキソサミニダーゼ活性、尿バイオマーカー：ケラタン硫酸レベル；いずれも、３０日目および５年間にわたって評価される。
・疾患の進行に対する大槽への単回用量の投与後のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の効果を評価すること。評価：ＭＲＩによって測定された脳総容積、脳下部構造の容積、および心室の体積ならびにＴ１／Ｔ２シグナル強度、側脊髄Ｘ線によって測定された骨格の異常、心臓超音波で測定された心筋症、腹部超音波で測定された肝脾腫、連続脳波で測定された脳機能およびびまん性遅延変化、機械的換気なし生存率の評価、栄養チューブの配置および使用の必要性による栄養状態の評価、すべてが５年間にわたって評価される。
生活の質および医療資源の利用に対する、大槽への単回用量の投与後のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の効果を評価すること。評価：生活の質：小児の生活の質調査／小児の生活の質調査の乳児尺度、医療資源の利用：診療日のチャートレビュー、ＥＲ来院、ＩＣＵ入院、手術、ヒアリングおよび視覚補助の必要性、すべてが５年間にわたって評価される。
Ｃ．試験設計：
ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の多施設、非盲検、単群、用量漸増試験（以下の表）。乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する合計１２名の小児対象は、２用量コホートに登録され、ＩＣＭ注射によって投与されるｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の単回用量を受ける。安全性および耐容性を２年間にわたって評価し、すべての対象をｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の投与後５年間にわたって追跡し、安全性および耐容性、薬物動態（導入遺伝子の発現の耐久性）、ならびに臨床転帰の耐久性の長期評価を行う。
Figure 2023513487000018
ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１は、ＩＴＦＦＢ（髄腔内最終製剤緩衝液）中の滅菌溶液として凍結させて（－６０℃以下）供給される。対象の用量レベルおよび年齢帯に応じて、投与前に、ＩＴＦＦＢＤ０１（試験薬希釈剤）でのＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１ ＤＰの希釈を必要とする場合がある。ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１ ＤＰおよびＩＴＦＦＢＤ０１製剤は、１ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭの塩化カリウム、１．４ｍＭの塩化カルシウム、０．８ｍＭの塩化マグネシウム、０．００１％のポロキサマー１８８、ｐＨ７．２で構成される。
可能性のある対象は、投薬前３５日目から投薬前１日目までにスクリーニングされ、試験に対する適格性が判断される。１型（乳児）および２ａ型（乳児後期）ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する最大２４名の小児対象は、本試験に登録される。適格／除外基準（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ／ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ）を満たす対象は、１日目の朝または施設の診療に従って入院する。対象は、１日目に単回ＩＣＭ用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を受け、観察のために投薬後、少なくとも２４時間病院に留まる。その後の評価は、投与の７日後、１４日後、および３０日後、次いで、１年目は６０日毎、および２年目は９０日毎に行われる。ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の安全性および耐容性は、有害事象（ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔ、ＡＥ）および重篤な有害事象（ｓｅｒｉｏｕｓ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔ、ＳＡＥ）の評価、バイタルサイン、身体検査、感覚神経伝導検査、および臨床検査（化学、血液学、凝固試験、ＣＳＦ分析）を通じてモニタリングされる。ＡＡＶおよび導入遺伝子産物の免疫原性も評価される。有効性評価には、生存率、認知、運動および社会発達の測定、視覚機能および脳波（ＥＥＧ）の変化、肝臓および脾臓の体積の変化、ならびにＣＳＦ、血清、および尿におけるバイオマーカーが含まれる。
本試験は、単回ＩＣＭ注射として、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１が投与された以下の３つのコホートからなる。
・コホート１（低用量）：３人の適格な対象（対象＃１～＃３）を登録し、第１の対象と第２の対象との間に４週間の安全性観察期間を伴って、低用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を投与する。安全性審査トリガー（ｓａｆｅｔｙ ｒｅｖｉｅｗ ｔｒｉｇｇｅｒ、ＳＲＴ）が観察されない場合、すべての利用可能な安全性データは、コホート１の第３の対象がｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を投与された４週間後に、独立した安全委員会（ｓａｆｅｔｙ ｂｏａｒｄ）によって評価される。
・コホート２（高用量）：進行が決定された場合、３人の適格な対象（対象＃４～＃６）が登録され、高用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１が、第４の対象と第５の対象との間に４週間の安全性観察期間を伴って投与される。ＳＲＴが観察されない場合、独立した安全委員会は、コホート２の第３の対象がｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を投与された４週間後に、コホート１の対象からの安全性データを含む利用可能なすべての安全性データを評価する。
・コホート３（ＭＴＤ）：安全委員会による肯定的推奨が未決定である場合、最大６名の追加の対象を登録し、ＭＴＤで単回ＩＣＭ用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を投与する。このコホート内の対象についての投与は、対象間の４週間の安全性観察期間とずれることなく、このコホート内の最初の３人の対象の投与後に、安全性委員会の審査が必要である。
Ｄ．組み入れ基準：
１．登録時に１ヶ月齢以上、２４ヶ月齢未満、１型（６ヶ月以下で発症）または２ａ型（６ヶ月を超えて１８ヶ月以下で発症）を有する。
ａ．１型乳児ＧＭ１
・ｉ．症状が出る前の対象（６ヶ月齢以下、変異が確認され、血清β－ｇａｌ活性が低下した）は、出生前スクリーニング、または同じ遺伝子型を有するＧＭ１ガングリオシドーシスの確認された診断を有する年上の兄弟姉妹の家族歴によって特定された。兄弟姉妹は、６ヶ月齢以下の時点で症状を発症していなければならない。
あるいは
・ｉｉ．症候性対象（変異が確認され、血清β－ｇａｌ活性が低下した）は、筋緊張低下、またはＧＭ１ガングリオシドーシスと一致する何らかの文書化された症状、かつ投薬時に少なくとも７０％の年齢修正された予想される運動発達（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）を有し、６ヶ月齢以下での発症の医療記録文書を有していなければならない。
ｂ．２ａ後期幼児ＧＭ１：
ｉ．発症が６ヶ月齢を超え、１８ヶ月齢以下であり、筋緊張低下、またはさらなる発達マイルストーンを達成する際のプラトー状態または遅れを示したＧＭ１ガングリオシドーシスと一致する何らかの文書化された症状、かつ少なくとも７０％の年齢修正された予想される運動発達（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）を有する、症候性対象。
２．対象が、ＧＬＢ１遺伝子欠失もしくは変異、ならびにβ－ｇａｌ活性の低下（白血球における下側正常値の２０％以下）のためにホモ接合性であるか、または複合ヘテロ接合性であることが文書化されている。
Ｅ．除外基準：
１．ＧＭ１ガングリオシドーシスに起因しない何らかの臨床的に有意な神経認知欠損、または治験責任医師の見解において、試験結果の解釈を混同する可能性のある任意の他の状態。
２．登録から３０日以内に入院が必要な急性の疾病がある対象がいる場合、対象の登録を許可する前に、その病歴を治験委託者の医療モニターに相談しなければならない。
３．換気補助呼吸支援の履歴、または気管切開の必要性。
４．てんかん状態のエピソードがあったか、または治験薬の投与前３０日以内に入院が必要な発作があったと定義される、難治性発作または制御されていないてんかん。
５．透視イメージングおよび麻酔に対する禁忌を含む、ＩＣＭ投与手技に対する何らかの禁忌。
６．ＭＲＩまたはＬＰに対する何らかの禁忌。
７．以前の遺伝子療法。
８．治験薬投与前４８時間以内のミグルスタットの使用。
９．治験薬投与前の５半減期以内の酵素補充療法または他の治験薬療法の使用。
１０．治験責任医師の見解において、手技中に対象を不当なリスクに曝す、または治験薬の評価を妨げる、または対象の安全性もしくは試験結果の解釈を妨げる可能性がある何らかの状態（例えば、疾患の病歴、現在の疾患の証拠、身体検査時の所見、または何らかの実験室の異常）。これには以下が含まれる。
ａ．治験責任医師が臨床的に有意であると判断した異常な検査値
ｂ．以下のように定義される、成長の失敗スクリーニングの３ヶ月前／ベースラインにおける体重の２０パーセンタイル（２０／１００）の低下
ｃ．免疫機能の根本的な欠陥
ｄ．複数の重度の生命を脅かす感染症の病歴
Ｆ．投与経路および手技
ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１は、単回用量として、１日目に、大槽内へのＣＴガイド下の後頭下注射を介して対象に投与される。
１日目に、適切な濃度のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を、試験に関連する治験薬剤部によって調製する。適切な濃度で５．６ｍＬのｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を含有するシリンジを、処置室に送る。治験薬投与には、以下の担当者が同席する：処置を行う介入医、麻酔科医および呼吸器技師、看護師および医師助手、ＣＴ（または手術室）技師、施設研究コーディネーター。
試験薬物投与の前に、腰椎穿刺を実施して、所定の体積のＣＳＦを除去し、次いで、大槽の関連する解剖学的構造の可視化を補助するために、ヨード造影剤を髄腔内（ＩＴ）に注射する。静脈内（ＩＶ）造影剤は、髄腔内造影剤の代替物として、針穿刺の前またはその間に投与され得る。ＩＶまたはＩＴ造影剤を使用するかどうかは、介入医の判断に委ねられる。対象は、麻酔され、挿管され、処置テーブルに配置される。滅菌技術を使用して、注射部位を調製し、覆布をかける。透視ガイド下、脊髄針（２２～２５Ｇ）を大槽内に進める。より大きなイントロデューサ針を使用して、針の配置を補助し得る。針の配置の確認の後、エクステンションセットを脊髄針に接続し、ＣＳＦで充填する。介入医の裁量で、造影材料を含有するシリンジをエクステンションセットに接続し、少量を注射して、大槽における針の配置を確認してもよい。ＣＴガイダンス＋／－造影剤注射によって針の配置を確認した後、５．６ｍＬのｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を含有するシリンジをエクステンションセットに接続する。シリンジの内容物を１～２分かけてゆっくりと注射し、５．０ｍＬの体積を送達する。注射針は、対象からゆっくりと取り出される。
ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の大槽内（ＩＣＭ）への単回用量は、投与後５年間を通して安全であり、かつ耐容性である。
ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の大槽（ＩＣＭ）への単回用量は、生存率を改善し、２４ヶ月齢での栄養チューブへの依存の確率を減少させ、かつ／または達成時の年齢、喪失時の年齢、ならびに年齢に適した発達および運動マイルストーンを維持もしくは獲得する小児の割合によって評価される疾患進行を減少させる。
治療は、神経認知機能の喪失を遅らせる。
肝毒性などの潜在的な免疫媒介性傷害の予防として、対象は全身性コルチコステロイドを受ける。ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１投与の１日前から開始し、１日当たり１ｍｇ／体重ｋｇの経口プレドニゾロンに相当する全身コルチコステロイドを、およそ３０日間（または、予定された１ヶ月のフォローアップ来院までのいずれか早い方までに）投与する。この来院の間に、評価スケジュールに従って臨床検査および実験室内検査を実施する必要がある。顕著でない所見を有する患者について、治験責任医師は、臨床的判断に従って、次の２１日間にわたってコルチコステロイド用量を減少させる必要がある。５週目の間の１日用量は０．７５ｍｇ／ｋｇから開始し、６週目の間の１日用量は０．５ｍｇ／ｋｇ、その後、７週目の間の１日用量は０．２５ｍｇ／ｋｇである。患者が１ｍｇ／ｋｇ／日のレジメンの当量に十分に応答しない場合は、専門家に相談する。治験責任医師の見解において、対象が潜在的な免疫媒介性毒性の臨床症状または臨床／実験室徴候を発現した場合、免疫抑制の用量、種類、スケジュールを変更し、研究責任医師に通知する必要がある。対象がステロイド治療を受けている間にワクチンのタイミングを調整するための推奨事項を含む、定期的なワクチンスケジュールおよび地域のガイドラインを遵守する必要がある。
実施例６：乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する小児対象の大槽（ＩＣＭ）に送達されたｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の単回用量の安全性および耐容性を評価するための第１／２相非盲検多施設用量漸増試験
最初の１８ヶ月に症状が発症した最大２４ヶ月齢のＧＭ１対象を登録する。これには、１型（乳児）ＧＭ１および２ａ型（後期乳児）ＧＭ１を有する対象が含まれる。１型（乳児）の対象は、出生時に症状を示すことがある。したがって、治療は、潜在的な利益を最大化するために可能な限り早期に開始されるべきであり、この試験には、少なくとも１ヶ月齢の対象が含まれる。下限の年齢を選択する際のもう１つの考慮事項は、ＩＣＭ手技を安全に実行することができるようにすることである。提案されているＩＣＭ手技には、術前の脳のＭＲＩおよびＭＲ血管造影およびＣＴ／ＣＴＡガイドＩＣＭ注射が含まれる。１ヶ月齢を超える乳児にＩＣＭ投与を行うことには、年齢に特有の安全性の懸念はない。
ＩＣＭベクター投与は、ＣＮＳ
区画内の即時ベクター分布をもたらす。したがって、臨床用量は、脳質量に従ってスケール変更することによって決定され、
ＣＮＳ区画のサイズの近似値を提供する。有効性および
毒性の両方が、ＣＮＳベクター曝露に関連することが予想される。用量変換は、幼若成体マウスでは０．４ｇ、幼若および成体アカゲザルおよび成体アカゲザル（Ｈｅｒｎｄｏｎ １９９８）では９０ｇ、ならびに０～３０ヶ月齢のヒト乳児（Ｄｅｋａｂａｎ，１９７８）では３７０ｇ～１０８０ｇの範囲の脳質量に基づく。非臨床および相当するヒト用量を以下の表に示す。
Figure 2023513487000019
脳重量が異なる（例えば、新生児と２歳の対象との間に、およそ３倍の差がある）ことを考慮すると、スライド尺度を使用して、２４ヶ月齢までの乳児および小児の公開された平均脳重量に基づいて、ＦＩＨ研究の個々の対象に投与される薬剤製品の量（遺伝子コピー［ＧＣ］の単位で）を決定する。このようにして、対象に、遺伝子コピー／脳重量の推定グラムにおける、意図した用量に最も近い体積の薬物製品を投与する。
Figure 2023513487000020
Figure 2023513487000021
Figure 2023513487000022
本試験は、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の第１／２相非盲検用量漸増試験であり、乳児形態のＧＭ１（１型）または乳児後期（２ａ型）を有する小児対象の大槽（ＩＣＭ）に送達されたＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の単回投与後の、安全性、耐容性、および探索的有効性のエンドポイントを評価する。この試験では、最大２８人の小児対象が登録され、対象は、単回用量のＩＣＭ投与ＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を受ける。
組み入れ基準：この試験は、ＧＬＢ１変異が確認され（ＧＬＢ１遺伝子欠失もしくは変異のためにホモ接合性であるか、または複合ヘテロ接合性である）、かつβ－ｇａｌ活性の低下（白血球における下側正常値の２０％以下）、登録時に４ヶ月齢以上、２４ヶ月齢未満、早期発症（６ヶ月以下）、急速な進行を予測することを特徴とする、１型（幼児）ＧＭ１、または後期発症提示（６ヶ月を超え、１８ヶ月以下）、進行がより遅いことを特徴とする、２ａ型（後期幼児）ＧＭ１のいずれかを有する、幼児を含み得る。
１型（乳児）ＧＭ１
●（ａ）同じ遺伝子型を有し、６ヶ月未満での発症歴を有する、ＧＭ１の確認された診断を有する、年上の兄弟姉妹の出生前スクリーニングまたは家族歴、または（ｂ）出生前ＧＭ１疾患の徴候、例えば、子宮内発育遅延、胎児水腫、または胎盤空胞形成の徴候によって特定される、症状が出る前の対象。
●６ヶ月齢以下での症状発症の医療記録文書を有し、筋緊張低下および／または発達の遅れおよび／またはＧＭ１と一致する他の徴候（例えば、肝脾腫大、骨格異形成、桜実紅斑、心筋症、および粗な顔の特徴）を有し、かつ施設の検査官によって確認／観察された過去１週間以内の以下の残りの発達スキルのうちの少なくとも１つを有する必要がある、症候性対象。
－腕および脚を意図的に動かす能力を示す。
－少なくとも３秒間連続して目的の物体を見る。
－介護者の胸に対してしっかりと保持される場合に、頭部を片方の側からもう一方の側に転がすことができる（例えば、小児が、介護者の肩に左耳をつけて横になっている場合、補助または位置替えを行うことなく、介護者の肩に右耳をつけて横になるように切り替えることができる）。
－特定の心情を声に出す。
－喉の痛み、うめき声、鼻音を伴うコミュニケーション。
－－介護者の視線を少なくとも２秒間連続で固定する。
２型（後期幼児）ＧＭ１
●（ａ）同じ遺伝子型を有し、６～１８ヶ月齢での発症歴を有する、ＧＭ１の確認された診断を有する、年上の兄弟姉妹の出生前スクリーニングまたは家族歴、または（ｂ）子宮内発育遅延、胎児水腫、または胎盤空胞形成の徴候を含む、出生前ＧＭ１疾患の徴候によって特定される、症状が出る前の対象。
●発症が６ヶ月齢を超え、１８ヶ月齢以下であり、筋緊張低下、および／またはさらなる発達マイルストーンを達成する際のプラトー状態または遅れ、および／またはＧＭ１と一致する何らかの他の文書化された徴候（例えば、肝脾腫大、骨格異形成、桜実紅斑、心筋症、および粗な顔の特徴）を有し、かつ以下の症候性後期幼児ＧＭ１のための年齢依存的発達基準を満たさなければならない、症候性対象。
－１２ヶ月齢未満の症候性対象は、施設の検査官によって確認／観察された過去１週間以内の以下の表に列挙される年齢に適した粗大運動、微細運動、言語／認知または社会発達マイルストーンのうちの１つを有していなければならない。
－１２ヶ月を超え、２４ヶ月未満の症候性対象は、施設の検査官によって確認／観察された過去１週間以内の、その年齢の小児５０％について（以下の表を参照）４つの発達マイルストーンの少なくとも２つを有していなければならない。例えば、１６ヶ月齢の小児は、８ヶ月齢の小児について少なくとも２つの発達マイルストーンを有している必要がある。
２つの用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を、対象の交互順次投与で評価する。ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１用量レベルは、マウスＭＥＤ試験およびＧＬＰ ＮＨＰ毒性試験のデータに基づいて決定され、低用量（コホート１および３に投与）および高用量（コホート２および４に投与）からなる。高用量は、同等のヒト用量にスケールされたＮＨＰ毒性試験における最大耐容用量（ＭＴＤ）に基づいている。ヒト対象のために選択される高用量が等価ヒト用量の３分の１～半分であるように、安全域（ｓａｆｅｔｙ ｍａｒｇｉｎ）が適用される。低用量は、動物試験において等価スケール化されたＭＥＤを超える用量である限り、典型的には、選択された高用量よりも２～３倍低い。これにより、両方の用量レベルが治療上の利益を与える可能性を有することが保証され、耐容されれば、より高い用量が有利であることが期待されることを理解する。低用量、続いて高用量の順次評価は、試験された２回の用量の最大耐容用量（ＭＴＤ）の特定を可能にする。
Figure 2023513487000023
最後に、拡大コホート（コホート５および６）は、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の安全性および有効性を確認するために、単回用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を受ける。
Figure 2023513487000024
この試験の主な焦点は、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の安全性および耐容性を評価することである。ＩＣＭ ＡＡＶｈｕ６８送達のＮＨＰ研究では、一部の動物においてＤＲＧ感覚ニューロンの最小から軽度の無症状性の変性が実証されているため、感覚神経毒性を評価するために詳細な検査を実施し、本治験で感覚神経伝導検査を利用して、無症状性の感覚ニューロンの病変をモニタリングする。注目すべきことに、感覚ニューロンの機能喪失（潜在的な背側根神経節毒性に起因する）は、３０日、３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月で、およびその後は毎年の間隔で実施される感覚神経伝導検査によって評価される。非臨床ＮＨＰ試験で、ＡＡＶ投与後２～４週間以内に感覚ニューロンの病変が現れることを考慮すると、治療後３ヶ月間を通してより頻繁に評価することで、ヒトにおける同様の事象の評価を可能にし、毒性動態の潜在的な変動の評価を可能にする。この試験を通して経過観察を実施することにより、ヒトにおける時間経過が異なる場合、または臨床的続発症が観察された場合の遅延効果の評価を可能にし、それらがどのくらい持続し、経時的に改善されるか、安定した状態に維持されるか、または悪化するかを評価する。
この試験では、薬物動態および有効性のエンドポイントも評価され、この集団において有意義な機能転帰および臨床転帰を示す可能性について選択された。エンドポイントは、鎮静および／またはＬＰを必要とするものを除いて、３０日、９０日、６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月で測定され、その後は、最大５年間の経過観察期間に毎年測定される。長期経過観察段階では、測定頻度は１２ヶ月毎に１回に減らされる。これらの時点を選択して、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の安全性および耐容性の完全な評価を容易にした。未治療の乳児ＧＭ１患者における疾患進行の急速な速度を考慮して、早期の時点および６ヶ月間隔も選択した。このアプローチにより、未治療比較データが存在し、未治療の患者が著しい減少を示すことが予想される経過観察期間にわたって、治療された対象における薬物動態および臨床有効性の測定値の完全な評価が可能になる。
二次的および探索的な有効性のエンドポイントには、生存、栄養チューブからの独立、発作の発生率および頻度、ＰｅｄｓＱＬによって測定される生活の質、ならびに神経認知発達および行動発達が含まれる。ベイリー乳幼児発達およびヴァインランド尺度を使用して、適応行動、認知、言語、運動機能、および健康に関連する生活の質における発達および／または変化に対してｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１が及ぼす影響を定量化する。各測定値は、ＧＭ１疾患の集団または関連する集団のいずれかで使用され、親および家族からの入力に基づいてさらに洗練され、それらにとって最も有意義かつ影響力のある測定値を選択する。評価を標準化するために、治験に参加する現地では、経験豊富な神経心理学者によって様々な尺度の投与について訓練される。
標的集団における疾患の重症度を考慮すると、対象は、登録までに運動スキルを達成したか、他の運動マイルストーンが発達し、その後に失われたか、または運動マイルストーンの発達の徴候がまだ示されていない場合がある。評価は、すべてのマイルストーンについて、達成時年齢と喪失時年齢を追跡する。運動マイルストーンの達成度は、ＷＨＯ基準に基づいて６つの粗大マイルストーンに定義されている。
乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する対象は、生後数ヶ月以内に症状を発症する可能性があり、第１のＷＨＯ運動マイルストーン（支えなしに座る）の獲得は、典型的には、４ヶ月齢より前には現れないことを考慮すると（中央値：５．９ヶ月齢）、このエンドポイントは、特に治療時により明らかな症状を有していた対象において、治療的利益の程度を評価するための感度を欠く場合がある。このため、乳児に適用され得る年齢に適した発達マイルストーンの評価も含まれる（Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅｓ．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｖ．３７（１）：２５－３７；ｑｕｉｚ ３８，４７）。これらのデータは、乳児ＧＭ１疾患を有する未治療の子供または定型発達の子供における典型的な獲得時間と比較して、経時的な発達マイルストーンの保持、獲得、または喪失を要約するために有益であり得る。
疾患が進行するにつれて、小児は、発作を起こす可能性がある。発作活動の開始により、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１による治療が、発作の発症を予防もしくは遅延させるか、またはこの集団における発作事象の頻度を減少させるかのいずれかを決定することが可能になる。保護者は、発作の発症、頻度、長さ、および種類を追跡する、発作日記をつけるように求められる。これらのエントリは、各々の訪問時に、臨床医とともに考察され、臨床医によって解釈される。
ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の疾患体積変化のＣＮＳ徴候に対する効果を評価するために、経時的にＭＲＩで測定する。すべてのガングリオシドーシスの乳児の表現型は、脳組織体積（大脳皮質および他のより小構造）および脳室体積の両方で、巨頭症および頭蓋内ＭＲＩ体積の急速な増加と一貫したパターンを有することが示された。加えて、脳梁、尾状核、および被殻、ならびに小脳皮質を含む様々な小さな脳の下部構造は、疾患の進行に伴って一般的にサイズが減少する（Ｒｅｇｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６、およびＮｅｓｔｒａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８、本明細書で引用）。ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１による治療は、ＣＮＳ疾患の症状の進行を遅らせるか、または停止させることが期待され、萎縮および体積変化における安定化の証拠を伴う。視床および基底核におけるＴ１／Ｔ２シグナル強度の変化（正常／異常）を評価する探索的エンドポイントは、ＧＭ１およびＧＭ２ガングリオシドーシスを有する患者における視床構造の変化に関する報告された証拠に基づいている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｋａｓｈｉｍａ，１９９４，Ｔｈａｌａｍｉｃ ｈｙｐｅｒｄｅｎｓｉｔｙ ｏｎ ＣＴ ｉｎ ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ＧＭ１－ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ．Ｂｒａｉｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１６（６）：４７２－４７４）。
治験のためのバイオマーカーとしては、ＣＳＦおよび血清中で測定され得るβ－ｇａｌ酵素（ＧＬＢ１）活性、ならびに乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスにおいて一貫した急速な萎縮を示す脳ＭＲＩが挙げられる（Ｒｅｇｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ、本明細書で引用）。追加のバイオマーカーを、回収された試料由来のＣＳＦおよび血清において、調査する。
Ａ．主要目的：
・大槽（ＩＣＭ）への単回用量の投与後２年間にわたるｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の安全性および耐容性を評価するために、有害事象、神経学的検査、感覚神経伝導試験、全Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ Ｓｃｏｒｅ－Ｎｕｒｓｅ、血液学、血清化学、肝機能検査、凝固（ＰＴ、ａＰＴＴ、ＩＮＲ）、トロポニン－Ｉｆ、ＣＳＦ抗ＡＡＶｈｕ６８ ｎＡｂ、ベクター脱落、尿検査、発作日記、身体検査、バイタルサイン、ＥＣＧ、脳ＭＲＩ、およびＣＳＦ細胞診および化学（細胞数、タンパク質、グルコース）を５年間にわたって評価する。
・大槽への単回用量の投与後のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の有効性を評価すること。主な二次エンドポイント＊は、２年目および５年間にわたって評価される。
●Ｖｉｎｅｌａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｓｃａｌｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ
●他の二次エンドポイントは、２年目および５年間にわたって評価される。
●Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ
●ＷＨＯ多施設成長参照研究性能基準
●発達マイルストーン評価
●ハマースミス乳幼児神経学的検査
●臨床医および介護者の重症度と変化のグローバルインプレッション
●インタービューを終了する
＊目的に適した臨床転帰評価は、ＧＭ１ガングリオシドーシスについては存在しない。したがって、この試験の実施と並行して、治験依頼者は、臨床専門家および親／介護者からデータを収集して、コホート３の主要有効性エンドポイントの特定、および必要に応じて、上記の尺度に由来する複合エンドポイントの計画、既存のＣＯＡの修正、または患者中心のＧＭ１固有の補足項目または尺度の開発を含む転帰測定戦略を開発するために、対象の専門家と協力している。詳細については、統計分析セクションを参照されたい。
Ｂ．二次目的：
・大槽への単回用量後の２４ヶ月にわたって、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の薬物動態および生物学的活性を評価すること。評価：ＣＳＦバイオマーカー：β－ガラクトシダーゼ活性、ヘキソサミニダーゼ活性、ＧＭ１ガングリオシドレベル、血清バイオマーカー：β－ガラクトシダーゼ活性、ヘキソサミニダーゼ活性、尿バイオマーカー：ケラタン硫酸レベル；いずれも、３０日目および５年間にわたって評価される。
・疾患の進行に対する大槽への単回用量の投与後のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の効果を評価すること。評価：ＭＲＩによって測定された脳総容積、脳下部構造の容積、および心室の体積ならびにＴ１／Ｔ２シグナル強度、側脊髄Ｘ線によって測定された骨格の異常、心臓超音波で測定された心筋症、腹部超音波で測定された肝脾腫、連続脳波で測定された脳機能およびびまん性遅延変化、機械的換気なし生存率の評価、栄養チューブの配置および使用の必要性による栄養状態の評価、すべてが５年間にわたって評価される。
生活の質および医療資源の利用に対する、大槽への単回用量の投与後のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の効果を評価すること。評価：生活の質：小児の生活の質調査／小児の生活の質調査の乳児尺度、医療資源の利用：診療日のチャートレビュー、ＥＲ来院、ＩＣＵ入院、手術、ヒアリングおよび視覚補助の必要性、すべてが５年間にわたって評価される。
Ｃ．試験設計：
ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の多施設、非盲検、単群、用量漸増試験（以下の表）。乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する合計２８名の小児対象は、４用量コホートに登録され、ＩＣＭ注射によって投与されるｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の単回用量を受ける。安全性および耐容性を２年間にわたって評価し、すべての対象をｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の投与後５年間にわたって追跡し、安全性および耐容性、薬物動態（導入遺伝子の発現の耐久性）、ならびに臨床転帰の耐久性の長期評価を行う。
Figure 2023513487000025
ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１は、ＩＴＦＦＢ（髄腔内最終製剤緩衝液）中の滅菌溶液として凍結させて（－６０℃以下）供給される。対象の用量レベルおよび年齢帯に応じて、投与前に、ＩＴＦＦＢＤ０１（試験薬希釈剤）でのＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１ ＤＰの希釈を必要とする場合がある。ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１ ＤＰおよびＩＴＦＦＢＤ０１製剤は、１ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭの塩化カリウム、１．４ｍＭの塩化カルシウム、０．８ｍＭの塩化マグネシウム、０．００１％のポロキサマー１８８、ｐＨ７．２で構成される。
可能性のある対象は、投薬前３５日目から投薬前１日目までにスクリーニングされ、試験に対する適格性が判断される。１型（乳児）および２ａ型（乳児後期）ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する最大２８名の小児対象は、本試験に登録される。適格／除外基準（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ／ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ）を満たす対象は、１日目の朝または施設の診療に従って入院する。対象は、１日目に単回ＩＣＭ用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を受け、観察のために投薬後、少なくとも２４時間病院に留まる。その後の評価は、投与の７日後、１４日後、および３０日後、次いで、１年目は６０日毎、および２年目は９０日毎に行われる。ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の安全性および耐容性は、有害事象（ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔ、ＡＥ）および重篤な有害事象（ｓｅｒｉｏｕｓ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔ、ＳＡＥ）の評価、バイタルサイン、身体検査、感覚神経伝導検査、および臨床検査（化学、血液学、凝固試験、ＣＳＦ分析）を通じてモニタリングされる。ＡＡＶおよび導入遺伝子産物の免疫原性も評価される。有効性評価には、生存率、認知、運動および社会発達の測定、視覚機能および脳波（ＥＥＧ）の変化、肝臓および脾臓の体積の変化、ならびにＣＳＦ、血清、および尿におけるバイオマーカーが含まれる。
本試験は、単回ＩＣＭ注射として、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１が投与された以下の３つのコホートからなる。
Figure 2023513487000026
Ｄ．組み入れ基準：
１．登録時に４ヶ月齢以上、３６ヶ月齢未満、１型（６ヶ月以下で発症）または２ａ型（６ヶ月を超えて１８ヶ月以下で発症）を有する。
ａ．１型乳児ＧＭ１
・ｉ．症状が出る前の対象（６ヶ月齢以下、変異が確認され、血清β－ｇａｌ活性が低下した）は、同じ遺伝子型を有するＧＭ１ガングリオシドーシスの確認された診断を有する年上の兄弟姉妹の出生前スクリーニングまたは家族歴によって特定された。兄弟姉妹は、６ヶ月齢以下の時点で症状を発症していなければならない。
あるいは
・ｉｉ．症候性対象（変異が確認され、血清β－ｇａｌ活性が低下した）は、筋緊張低下、またはＧＭ１ガングリオシドーシスと一致する何らかの文書化された症状、かつ投薬時に少なくとも７０％の年齢修正された予想される運動発達（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）を有し、６ヶ月齢以下での発症の医療記録文書を有していなければならない。
ｂ．２ａ後期幼児ＧＭ１：
ｉ．発症が６ヶ月齢を超え、１８ヶ月齢以下であり、筋緊張低下、またはさらなる発達マイルストーンを達成する際のプラトー状態または遅れを示したＧＭ１ガングリオシドーシスと一致する何らかの文書化された症状、かつ少なくとも７０％の年齢修正された予想される運動発達（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）を有する、症候性対象。
２．対象が、ＧＬＢ１遺伝子欠失もしくは変異、ならびにβ－ｇａｌ活性の低下（白血球における下側正常値の２０％以下）のためにホモ接合性であるか、または複合ヘテロ接合性であることが文書化されている。
Ｅ．除外基準：
１．ＧＭ１ガングリオシドーシスに起因しない何らかの臨床的に有意な神経認知欠損、または治験責任医師の見解において、試験結果の解釈を混同する可能性のある任意の他の状態。
２．登録から３０日以内に入院が必要な急性の疾病がある対象がいる場合、対象の登録を許可する前に、その病歴を治験委託者の医療モニターに相談しなければならない。
３．換気補助呼吸支援の履歴、または気管切開の必要性。
４．てんかん状態のエピソードがあったか、または治験薬の投与前３０日以内に入院が必要な発作があったと定義される、難治性発作または制御されていないてんかん。
５．透視イメージングおよび麻酔に対する禁忌を含む、ＩＣＭ投与手技に対する何らかの禁忌。
６．ＭＲＩまたはＬＰに対する何らかの禁忌。
７．以前の遺伝子療法。
８．治験薬投与前４８時間以内のミグルスタットの使用。
９．治験薬投与前の５半減期以内の酵素補充療法または他の治験薬療法の使用。
１０．治験責任医師の見解において、手技中に対象を不当なリスクに曝す、または治験薬の評価を妨げる、または対象の安全性もしくは試験結果の解釈を妨げる可能性がある何らかの状態（例えば、疾患の病歴、現在の疾患の証拠、身体検査時の所見、または何らかの実験室の異常）。これには以下が含まれる。
ａ．治験責任医師が臨床的に有意であると判断した異常な検査値
ｂ．以下のように定義される、成長の失敗スクリーニングの３ヶ月前／ベースラインにおける体重の２０パーセンタイル（２０／１００）の低下
ｃ．免疫機能の根本的な欠陥
ｄ．複数の重度の生命を脅かす感染症の病歴
Ｆ．投与経路および手技
ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１は、単回用量として、１日目に、大槽内へのＣＴガイド下の後頭下注射を介して対象に投与される。
１日目に、適切な濃度のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を、試験に関連する治験薬剤部によって調製する。適切な濃度で５．６ｍＬのｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を含有するシリンジを、処置室に送る。治験薬投与には、以下の担当者が同席する：処置を行う介入医、麻酔科医および呼吸器技師、看護師および医師助手、ＣＴ（または手術室）技師、施設研究コーディネーター。
試験薬物投与の前に、腰椎穿刺を実施して、所定の体積のＣＳＦを除去し、次いで、大槽の関連する解剖学的構造の可視化を補助するために、ヨード造影剤を髄腔内（ＩＴ）に注射する。静脈内（ＩＶ）造影剤は、髄腔内造影剤の代替物として、針穿刺の前またはその間に投与され得る。ＩＶまたはＩＴ造影剤を使用するかどうかは、介入医の判断に委ねられる。対象は、麻酔され、挿管され、処置テーブルに配置される。滅菌技術を使用して、注射部位を調製し、覆布をかける。透視ガイド下、脊髄針（２２～２５Ｇ）を大槽内に進める。より大きなイントロデューサ針を使用して、針の配置を補助し得る。針の配置の確認の後、エクステンションセットを脊髄針に接続し、ＣＳＦで充填する。介入医の裁量で、造影材料を含有するシリンジをエクステンションセットに接続し、少量を注射して、大槽における針の配置を確認してもよい。ＣＴガイダンス＋／－造影剤注射によって針の配置を確認した後、５．６ｍＬのｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を含有するシリンジをエクステンションセットに接続する。シリンジの内容物を１～２分かけてゆっくりと注射し、５．０ｍＬの体積を送達する。注射針は、対象からゆっくりと取り出される。
ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の大槽内（ＩＣＭ）への単回用量は、投与後５年間を通して安全であり、かつ耐容性である。
ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の大槽（ＩＣＭ）への単回用量は、生存率を改善し、２４ヶ月齢での栄養チューブへの依存の確率を減少させ、かつ／または達成時の年齢、喪失時の年齢、ならびに年齢に適した発達および運動マイルストーンを維持もしくは獲得する小児の割合によって評価される疾患進行を減少させる。
治療は、神経認知機能の喪失を遅らせる。
肝毒性などの潜在的な免疫媒介性傷害の予防として、対象は全身性コルチコステロイドを受ける。ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１投与の１日前から開始し、１日当たり１ｍｇ／体重ｋｇの経口プレドニゾロンに相当する全身コルチコステロイドを、およそ３０日間（または、予定された１ヶ月のフォローアップ来院までのいずれか早い方までに）投与する。この来院の間に、評価スケジュールに従って臨床検査および実験室内検査を実施する必要がある。顕著でない所見を有する患者について、治験責任医師は、臨床的判断に従って、次の２１日間にわたってコルチコステロイド用量を減少させる必要がある。５週目の間の１日用量は０．７５ｍｇ／ｋｇから開始し、６週目の間の１日用量は０．５ｍｇ／ｋｇ、その後、７週目の間の１日用量は０．２５ｍｇ／ｋｇであり、８週目の間に、１日おきに０．２５ｍｇ／ｋｇである。患者が１ｍｇ／ｋｇ／日のレジメンの当量に十分に応答しない場合は、専門家に相談する。治験責任医師の見解において、対象が潜在的な免疫媒介性毒性の臨床症状または臨床／実験室徴候を発現した場合、免疫抑制の用量、種類、スケジュールを変更し、研究責任医師に通知する必要がある。対象がステロイド治療を受けている間にワクチンのタイミングを調整するための推奨事項を含む、定期的なワクチンスケジュールおよび地域のガイドラインを遵守する必要がある。
本明細書に引用されるすべての文書は、「２１－９５９５ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」とラベル付けされた配列表と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。また、２０２０年８月７日に出願された米国仮特許出願第６３／０６３，１１９号、２０２０年４月８日に出願された米国仮特許出願第６３／００７，２９７号、および２０２０年２月２日に出願された米国仮特許出願第６３／００７，２９７号が本明細書に参照により組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内に収まることが意図される。
（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、識別数字＜２２３＞の下でフリーテキストを含有する配列を提供する。
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Claims (73)

  1. ヒト患者のＧＭ１ガングリオシドーシスの治療に有用な治療レジメンであって、前記レジメンが、ＡＡＶカプシドと、標的細胞におけるその発現を指令する調節配列の制御下でヒトβ－ガラクトシダーゼをコードする配列を含むベクターゲノムと、を有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの投与を含み、前記投与が、
    （ｉ）前記患者が約１ヶ月齢～約４ヶ月齢である、約１．６×１０１３～約１．６×１０１４ＧＣ、
    （ｉｉ）前記患者が少なくとも約４ヶ月齢～８ヶ月齢未満である、約２．１×１０１３～約２．１×１０１４ＧＣ、
    （ｉｉｉ）前記患者が少なくとも８ヶ月齢～最大１２ヶ月齢である、約２．６×１０１３～約２．６×１０１４ＧＣ、または
    （ｉｖ）前記患者が少なくとも１２ヶ月齢である、約３．２×１０１３～約３．２×１０１４ＧＣを含む単回用量の大槽内（ＩＣＭ）注射を含む、治療レジメン。
  2. 前記ヒトβ－ガラクトシダーゼコード配列が、配列番号８、配列番号７、配列番号６、もしくは配列番号５に示されるヌクレオチド配列、または配列番号４のアミノ酸２４～６７７の成熟β－ガラクトシダーゼをコードする、配列番号８、配列番号７、配列番号６、もしくは配列番号５のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１に記載のレジメン。
  3. コードされる前記ヒトβ－ガラクトシダーゼが、
    （ａ）配列番号４の約アミノ酸１～６７７、および
    （ｂ）配列番号４の約アミノ酸２４～６７７に融合した異種リーダー配列を含む合成ヒト酵素から選択される配列を有する、請求項１または２に記載のレジメン。
  4. 前記ベクターゲノムが、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターに由来する調節エレメント、キメライントロン、ポリＡシグナル、および／または３’ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のレジメン。
  5. 前記患者が、１型（乳児）ＧＭ１または２ａ型（後期乳児）ＧＭ１を有すると特定されている、請求項１～４のいずれか一項に記載のレジメン。
  6. 前記ｒＡＡＶの送達の少なくとも１日前または当日の、少なくとも１つの免疫抑制性併用療法の前記患者への投与をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のレジメン。
  7. 前記免疫抑制性併用療法が、１つ以上のコルチコステロイドを含む、請求項６に記載のレジメン。
  8. 前記免疫抑制性併用療法が、経口プレドニゾロンを含む、請求項６または７に記載のレジメン。
  9. 前記経口プレドニゾロンが、約１ｍｇ／ｋｇ体重で投与される、請求項８に記載のレジメン。
  10. 前記少なくとも１つの免疫抑制性併用療法の投与が、前記ｒＡＡＶの投与後少なくとも３～４週間継続する、請求項５～９のいずれか一項に記載のレジメン。
  11. 前記治療の有効性が、発作の発症の遅れ、発作の頻度の低減、血清および／または脳脊髄液中のβ－ガラクトシダーゼ、ならびに磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって測定される脳組織の体積変化のうちの１つ以上によって評価される、請求項１～１０のいずれか一項に記載のレジメン。
  12. 組成物であって、ＡＡＶカプシドと、ヒトβ－ガラクトシダーゼコード配列を含むベクターゲノムと、標的細胞におけるその発現を指令する発現制御配列と、を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、それを必要とするヒト対象に、
    （ｉ）患者が約１ヶ月齢～約４ヶ月齢である、約１．６×１０１３～約１．６×１０１４ＧＣ、
    （ｉｉ）前記患者が少なくとも約４ヶ月齢～８ヶ月齢未満である、約２．１×１０１３～約２．１×１０１４ＧＣ、
    （ｉｉｉ）前記患者が少なくとも８ヶ月齢～最大１２ヶ月齢である、約２．６×１０１３～約２．６×１０１４ＧＣ、または
    （ｉｖ）前記患者が少なくとも１２ヶ月齢である、約３．２×１０１３～約３．２×１０１４ＧＣの用量を投与するための大槽内（ＩＣＭ）注射のために製剤化される、組成物。
  13. 前記ヒトβ－ガラクトシダーゼコード配列が、配列番号８、配列番号７、配列番号６、もしくは配列番号５に示されるヌクレオチド配列、または配列番号４のアミノ酸２４～６７７の成熟β－ガラクトシダーゼをコードする、配列番号８、配列番号７、配列番号６、もしくは配列番号５のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記ベクターゲノムが、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターに由来する調節エレメント、キメライントロン、ポリＡシグナル、および／または３’ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項１２または１３に記載の組成物。
  15. 前記ｒＡＡＶが、脳質量１グラム当たり３．３３×１０１０ＧＣ～脳質量１グラム当たり３．３３×１０１１ＧＣを送達するように懸濁液の状態で製剤化され、任意選択的に、投与用量の体積が、約３．０ｍＬ～約５．０ｍＬである、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記ｒＡＡＶが、６～９のｐＨを有する製剤緩衝液中にあり、任意選択的に、前記ｐＨが約７．２である、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記ｒＡＡＶの送達の少なくとも１日前または当日の、少なくとも１つの免疫抑制剤の前記患者への投与を含む併用療法に使用するための、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記免疫抑制剤が、コルチコステロイド、任意選択的に経口送達されるプレドニゾロンである、請求項１７に記載の組成物。
  19. ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する患者を治療する方法であって、前記方法が、単回用量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を前記患者に大槽内（ＩＣＭ）注射によって投与することを含み、
    前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドと、標的細胞におけるその発現を指令する調節配列の制御下でヒトβ－ガラクトシダーゼをコードする配列を含むベクターゲノムと、を含み、
    前記単回用量が、前記患者の推定脳質量１グラム当たり１×１０１０ＧＣ～３．４×１０１１ＧＣである、方法。
  20. 前記患者が、１８ヶ月齢以前にＧＭ１症状を発症する、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記患者が、６ヶ月齢以下でＧＭ１症状を発症する、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記患者が、６～１８ヶ月齢でＧＭ１症状を発症する、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記患者が、１型（乳児）ＧＭ１を有する、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記患者が、２ａ型（後期乳児）ＧＭ１を有する、請求項１９、２０、または２２のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記患者が、１型ＧＭ１または２ａ型ＧＭ１を有すると診断されている、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記対象が、少なくとも４ヶ月齢である、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記対象が、４～３６ヶ月齢である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記対象が、４～２４ヶ月齢のヒト患者である、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記患者が、６～３６ヶ月齢のヒト患者である、請求項２６に記載の方法。
  30. 前記患者が、６～２４ヶ月齢のヒト患者である、請求項２６に記載の方法。
  31. 前記患者が、１２～３６ヶ月齢のヒト患者である、請求項２６に記載の方法。
  32. 前記患者が、１２～２４ヶ月齢のヒト患者である、請求項２６に記載の方法。
  33. 前記単回用量が、前記患者の推定脳質量１グラム当たり３．３×１０１０ＧＣである、請求項１９～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記単回用量が、２．１×１０１３～２．５×１０１３ＧＣの前記ｒＡＡＶである、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記単回用量が、２．６×１０１３～３．１×１０１３ＧＣの前記ｒＡＡＶである、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記単回用量が、３．２×１０１３～４．５×１０１３ＧＣの前記ｒＡＡＶである、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記単回用量が、前記患者の推定脳質量１グラム当たり１．１１×１０１１ＧＣである、請求項１９～３２のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記単回用量が、６．８×１０１３～８．６×１０１３ＧＣの前記ｒＡＡＶである、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記単回用量が、８．７×１０１３～０．９×１０１４ＧＣの前記ｒＡＡＶである、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記単回用量が、１．０×１０１４～１．５×１０１４ＧＣの前記ｒＡＡＶである、請求項３７に記載の方法。
  41. 前記患者が、４～８ヶ月齢であり、前記単回用量が、２．１×１０１３ＧＣの前記ｒＡＡＶである、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記患者が、４～８ヶ月齢であり、前記単回用量が、６．８×１０１３ＧＣの前記ｒＡＡＶである、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記患者が、８～１２ヶ月齢であり、前記単回用量が、２．６×１０１３ＧＣの前記ｒＡＡＶである、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記患者が、８～１２ヶ月齢であり、前記単回用量が、８．７×１０１３ＧＣの前記ｒＡＡＶである、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記患者が、少なくとも１２ヶ月齢であり、前記単回用量が、３．２×１０１３ＧＣの前記ｒＡＡＶである、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記患者が、少なくとも１２ヶ月齢であり、前記単回用量が、１．０×１０１４ＧＣの前記ｒＡＡＶである、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 造血幹細胞移植のステップをさらに含む、請求項１９～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記患者にステロイドを投与するステップをさらに含む、請求項１９～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記ステロイドが、コルチコステロイドである、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記ステロイドが、少なくとも２１日間にわたって毎日全身投与される、請求項４８または４９に記載の方法。
  51. 前記ステロイドが、３０日間にわたって毎日全身投与される、請求項４８または４９に記載の方法。
  52. 前記ヒトβ－ガラクトシダーゼをコードする配列が、配列番号８、配列番号７、配列番号６、もしくは配列番号５に示されるヌクレオチド配列、または配列番号４のアミノ酸２４～６７７の成熟β－ガラクトシダーゼをコードする、配列番号８、配列番号７、配列番号６、もしくは配列番号５のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１９～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記ヒトβ－ガラクトシダーゼが、配列番号４のアミノ酸配列、またはその機能性断片を有する、請求項１９～５１のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記ベクターゲノムが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５から選択される配列を有する、請求項１９～５１のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記ベクターゲノムが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５と少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項１９～５１のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記ベクターゲノムが、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターに由来する調節エレメント、キメライントロン、ポリＡシグナル、および／または３’ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項１９～５１のいずれか一項に記載の方法。
  57. 単位剤形の薬学的組成物であって、
    緩衝液中に１×１０１３ＧＣ～５×１０１４の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含み、
    前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドと、標的細胞におけるその発現を指令する調節配列の制御下でヒトβ－ガラクトシダーゼをコードする配列を含むベクターゲノムと、を含む、薬学的組成物。
  58. 大槽内（ＩＣＭ）注射のために製剤化される、請求項５７に記載の薬学的組成物。
  59. 前記緩衝液が、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、およびポロキサマー１８８を含む、請求項５８に記載の薬学的組成物。
  60. 前記緩衝液が、１ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭの塩化カリウム、１．４ｍＭの塩化カルシウム、０．８ｍＭの塩化マグネシウム、および０．００１％のポロキサマー１８８を含む、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  61. 液体形態である、請求項５７～６０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  62. ３．０ｍＬ、４．０ｍＬ、または５．０ｍＬの体積を有する、請求項６１に記載の薬学的組成物。
  63. ２．１×１０１３～２．５×１０１３ＧＣの前記ｒＡＡＶを含む、請求項５７～６２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  64. ２．６×１０１３～３．１×１０１３ＧＣの前記ｒＡＡＶを含む、請求項５７～６２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  65. ３．２×１０１３～４．５×１０１３ＧＣの前記ｒＡＡＶを含む、請求項５７～６２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  66. ６．８×１０１３～８．６×１０１３ＧＣの前記ｒＡＡＶを含む、請求項５７～６２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  67. ８．７×１０１３～０．９×１０１４ＧＣの前記ｒＡＡＶを含む、請求項５７～６２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  68. １．０×１０１４～１．５×１０１４ＧＣの前記ｒＡＡＶを含む、請求項５７～６２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  69. 前記ヒトβ－ガラクトシダーゼをコードする配列が、配列番号８、配列番号７、配列番号６、もしくは配列番号５に示されるヌクレオチド配列、または配列番号４のアミノ酸２４～６７７の成熟β－ガラクトシダーゼをコードする、配列番号８、配列番号７、配列番号６、もしくは配列番号５のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項５７～６８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  70. 前記ヒトβ－ガラクトシダーゼが、配列番号４のアミノ酸配列、またはその機能性断片を有する、請求項５７～６８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  71. 前記ベクターゲノムが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５から選択される配列を有する、請求項５７～６８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  72. 前記ベクターゲノムが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５と少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項５７～６８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  73. 前記ベクターゲノムが、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターに由来する調節エレメント、キメライントロン、ポリＡシグナル、および／または３’ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項５７～６８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
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