JP5123936B2 - 認知症の検出および治療 - Google Patents

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Description

連邦政府による委託研究に関する記述
本発明は、国立衛生研究所により取得されたＡＧ第０１６５７４号付与の国庫補助を受けて成されたものである。本発明において、政府は特定の権利を有する。
１．技術分野
本明細書は、認知症（例えば、前頭側頭型認知症）に関する変異の検出のための方法および材料、ならびにプログラニュリンの発現減少の検出のための方法および材料に関する。また、本明細書は、神経変性疾患（例えば、前頭側頭型認知症）を有するかまたは発症しやすい哺乳動物の治療のための方法および材料に関する。例えば、本明細書は、プログラニュリンポリペプチドをコードする核酸を使用する、またはプログラニュリンポリペプチドレベルを増加させ、神経変性疾患を有する哺乳動物（例えば、ヒト）を治療する薬剤を使用する方法および材料に関する。
２．背景情報
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、６５歳未満の人々において、認知症では２番目に一般的な原因である（前頭側頭型認知症における、臨床的、臨床病理学的な基準。Ｔｈｅ Ｌｕｎｄ ａｎｄ Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ Ｇｒｏｕｐｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，５７：４１６−８（１９９４）（非特許文献１））。ＦＴＤ患者の多く（３５〜５０％）は、該疾病に対して強く遺伝的な成分に一致した認知症の家族歴を有する（Ｃｈｏｗら，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ，５６：８１７−２２（１９９９）（非特許文献２）；Ｓｔｅｖｅｎｓら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５０：１５４１−５（１９９８）（非特許文献３）、およびＭａｎｎ，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，８：３２５−３８（１９９８）（非特許文献４））。タウタンパク質（ＭＡＰＴ）に関する微小管をコードする遺伝子中の変異は、１７ｑ２１染色体に関連するパーキンソニズムを有する家族性ＦＴＤを生じることが示されている（ＦＴＤＰ−１７；Ｈｕｔｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３９３：７０２−５（１９９８）（非特許文献５））。定義されたＭＡＰＴ変異を有する患者における、神経病理学は、過リン酸化タウから成る細胞質神経原線維封入体が存在しているという特徴がある（Ｈｕｔｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３９３：７０２−５（１９９８）（非特許文献５）、およびＧｈｅｔｔｉら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．，５０：４７１−２（１９９９）（非特許文献６））。
増大する１７ｑ２１染色体上の同一の領域への関連についての著しい証拠を有するＦＴＤファミリーにおいて、該疾病はＭＡＰＴの変異によって説明できず、また、患者はタウ免疫反応性封入体病状が一貫して欠けている（Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓら，Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，７：１０６４−７４（２００２）（非特許文献７）、Ｒｏｓｓｏら，Ｂｒａｉｎ，１２４：１９４８−５７（２００１）（非特許文献８）、Ｌｅｎｄｏｎら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５０：１５４６−５５（１９９８）（非特許文献９）、Ｋｅｒｔｅｓｚら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５４：８１８−２７（２０００）（非特許文献１０）、Ｆｒｏｅｌｉｃｈら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．，７４：３８０−５（１９９７）（非特許文献１１）、Ｂｉｒｄら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４８：９４９−５４（１９９７）（非特許文献１２）、およびＲａｄｅｍａｋｅｒｓら，（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｊ．Ｌ．ｅ．編）１１９−１３９（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，２００５）（非特許文献１３））。その一方、タウ陰性ＦＴＤ−１７患者は、ユビチキン免疫反応性（ｕｂ−ｉｒ）神経細胞封入体（ＮＣＩ）および特徴的なレンズ状のｕｂ−ｉｒ神経核内封入体を有する（ＮＩＩ；Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓら，（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｊ．Ｌ．ｅ．編）１１９−１３９（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，２００５）（非特許文献１３））。
Ｔｈｅ Ｌｕｎｄ ａｎｄ Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ Ｇｒｏｕｐｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，５７：４１６−８（１９９４） Ｃｈｏｗら，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ，５６：８１７−２２（１９９９） Ｓｔｅｖｅｎｓら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５０：１５４１−５（１９９８） Ｍａｎｎ，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，８：３２５−３８（１９９８） Ｈｕｔｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３９３：７０２−５（１９９８） Ｇｈｅｔｔｉら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．，５０：４７１−２（１９９９） Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓら，Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，７：１０６４−７４（２００２） Ｒｏｓｓｏら，Ｂｒａｉｎ，１２４：１９４８−５７（２００１） Ｌｅｎｄｏｎら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５０：１５４６−５５（１９９８） Ｋｅｒｔｅｓｚら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５４：８１８−２７（２０００） Ｆｒｏｅｌｉｃｈら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．，７４：３８０−５（１９９７） Ｂｉｒｄら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４８：９４９−５４（１９９７） Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓら，（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｊ．Ｌ．ｅ．編）１１９−１３９（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，２００５）
概要
本明細書は、認知症に関する変異を検出するための方法および材料に関する。本明細書に開示される該方法および材料は、一部分において、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）の核酸が認知症（例えば、ＦＴＤ）に関連するという発見に基づく。ヒトＰＧＲＮ遺伝子は、１７ｑ２１染色体に位置付けられており、そのコード配列はＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセス番号Ｍ７５１６１（ＧＬ：１８３６１２）で入手できる。また、ＰＧＲＮ遺伝子は、エピセリン前駆体、プロエピセリン、ＰＥＰＩ、アクログラニン、およびグラニュリンとして知られている。ＰＧＲＮ遺伝子は、分子量６８．５ｋＤＡを有するポリペプチドを共にコードできる１２エクソンを有することが可能である。グラニュリンは、システインに富むポリペプチドのファミリーを形成し、その中に増殖調節作用を有するものもある。造血細胞系からの細胞、および上皮組織中のＰＧＲＮ ｍＲＮＡの広範な発生は、これら組織内の機能を示唆する。少なくとも４つの異なるヒトのグラニュリンポリペプチドが、それぞれ１２の保存されているシステイン残基を含有する７．５の繰り返し単位を含む単一のＰＧＲＮ前駆体からプロセシングされ得る。ＰＧＲＮ前駆体およびプロセシングされたＰＧＲＮポリペプチドは双方とも、生物活性を有することが可能である。本明細書に使用される「ＰＧＲＮポリペプチド」という用語は、ヒトＰＧＲＮポリペプチド（例えば、ＧＩ番号第１８３６１２号、第４５０４１５１号、および第７７４１６８６５号、に基づいてＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）に記載するヒトＰＧＲＮポリペプチド）、マウスＰＧＲＮポリペプチド（例えば、ＧＩ番号第６６８０１０７号に基づいてＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）に記載するマウスＰＧＲＮポリペプチド）、ゼブラフィッシュＰＧＲＮポリペプチド（例えば、ＧＩ番号第６６４７２８４８号、第７７７９７８３７号、第４７０８６５６９号、および第４７０８６５３７号に基づいてＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）に記載するゼブラフィッシュＰＧＲＮポリペプチド）、およびフィッシュＰＧＲＮポリペプチド（例えば、ＧＩ番号第１１３１７１５７８号、および第７３６６５５５１号に基づいてＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）に記載するモザンビークテラピアＰＧＲＮポリペプチド）、ならびにグラニュリンＡ，グラニュリンＢ、グラニュリンＣ、グラニュリンＤ、グラニュリンＥ、グラニュリンＦ、グラニュリンＧ、およびグラニュリンＰ等、長さが少なくとも４０アミノ酸長であるそれらのフラグメントを含むが、これらに限定されない。ヒトプログラニュリンプログラニュリンは、７回半繰り返されるコンセンサス配列を有する５９３アミノ酸グリコシル化ポリペプチドであってもよい。
本明細書は、認知症に関連し得る１つ以上の変異を含むＰＧＲＮ核酸を検出するための方法および材料を開示する。例えば、標準ＰＣＲ技術は、患者のＰＧＲＮ核酸のフラグメントを増幅するために使用することができる。増幅されたフラグメントは標準技術を配列、またはプローブして、フラグメントが切断変異等、１つ以上の変異を含んでいるかどうかを判断することが可能である。そのような変異を検出することによって、臨床医は患者の疾病リスクおよび該患者の治療計画オプションを評価することが可能となる。
また、本明細書は、ＰＧＲＮ発現のレベルを検出するための方法および材料を開示する。本明細書に記載されるように、ＰＧＲＮ ｍＲＮＡまたはＰＧＲＮポリペプチド発現のレベルが低い哺乳動物は、認知症を有するかまたは発症する可能性があるとして同定され得る。
また、本明細書は、神経変性疾患（例えば、認知症）を有するかまたは発症する可能性のある哺乳動物の治療のための方法および材料に関する。例えば、本明細書は、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドレベルを増加させるように、哺乳動物にＰＧＲＮポリペプチドをコードした核酸を投与することによって、哺乳動物の神経変性疾患を治療するための方法および材料に関する。また、本明細書は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）またはＰＰＡＲアゴニスト等の薬剤、あるいはそのような薬剤の組み合わせを使用した哺乳動物における、神経変性疾患の治療のための方法および材料に関する。いかなる特別な作用形態にも限定されないが、ＮＳＡＩＤまたはＰＰＡＲアゴニスト等の薬剤を哺乳動物へ投与すると、本明細書に記載されるように、哺乳動物中のプログラニュリン（ＰＧＲＮ）ポリペプチドのレベルを増加させることによって、神経変性を治療することが可能である。神経変性疾患を治療する能力を有することよって、臨床医は、そのような障害に関連する罹患率および死亡率を、大幅に減少させることができ、ヘルス・ケアの費用を削減することも可能である。神経変性疾患の治療に用いられる薬剤を同定するための方法および材料、ならびに認知症に関する非ヒトモデルも本明細書に開示する。
概して、本明細書の一側面は、認知症を有することが疑われる哺乳動物において、認知症を診断するための方法を説明する。該方法は、変異を含むＰＧＲＮ核酸を哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含むか、実質的にそれらで構成され、変異を含むＰＧＲＮ核酸の存在が、哺乳動物が認知症を有することを示す。哺乳動物はヒトであり得る。認知症は前頭側頭葉変性症であり得る。認知症は前頭側頭型認知症であり得る。ＰＧＲＮ核酸はＰＧＲＮポリペプチドの配列をコードすることができる。ＰＧＲＮ核酸は、ＰＧＲＮポリペプチドの発現を調整するシス作用性制御エレメントであり得る。変異は、ヌクレオチド付加であり得る。変異は、ヌクレオチド欠失であり得る。変異は、ヌクレオチド置換であり得る。変異は、哺乳動物において、ＰＧＲＮポリペプチドの発現を減少させ得る。該哺乳動物はヒトであってもよく、変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載するアミノ酸配列を有すると同時に該アミノ酸配列中に少なくとも１つの変異を含むＰＧＲＮポリペプチドの発現をもたらす。ＰＧＲＮポリペプチドは、長さが５９３アミノ酸残基より短くてもよい。変異は、哺乳動物に、切断型ＰＧＲＮポリペプチドを発現させ得る。
別の側面において、本明細書は、哺乳動物を、認知症を発症する危険性があるとして分類する方法を説明する。該方法は、変異を含むＰＧＲＮ核酸を哺乳動物が含むかどうかを判定するステップを含むか、実質的にそれらで構成され、変異を含むＰＧＲＮ核酸の存在が、該哺乳動物が認知症を発症する危険性があることを示す。哺乳動物はヒトであり得る。認知症は前頭側頭葉変性症であり得る。認知症は前頭側頭型認知症であり得る。ＰＧＲＮ核酸はＰＧＲＮポリペプチドの配列をコードすることができる。ＰＧＲＮ核酸は、ＰＧＲＮポリペプチドの発現を調整するシス作用性制御エレメントであり得る。変異は、ヌクレオチド付加であり得る。変異は、ヌクレオチド欠失であり得る。変異は、ヌクレオチド置換であり得る。変異は、哺乳動物に、ＰＧＲＮポリペプチドの発現を減少させ得る。該哺乳動物はヒトであってもよく、変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載するアミノ酸配列を有すると同時に該アミノ酸配列中に少なくとも１つの変異を含むＰＧＲＮポリペプチドの発現をもたらす。ＰＧＲＮポリペプチドは、長さが５９３アミノ酸残基より短くてもよい。変異は、哺乳動物に、切断型ＰＧＲＮポリペプチドを発現させ得る。
別の側面において、本明細書は、認知症を有することが疑われる哺乳動物において、認知症を診断するための方法を説明する。該方法は、ＰＧＲＮポリペプチドまたはＰＧＲＮ ｍＲＮＡの減少したレベルを該哺乳動物が含むかどうかを判定するステップを含むか、実質的にそれらで構成され、減少したレベルの存在が、哺乳動物が認知症を有することを示す。該哺乳動物はヒトであり得る。認知症は前頭側頭葉変性症であり得る。認知症は前頭側頭型認知症であり得る。該哺乳動物はヒトであってもよく、ＰＧＲＮポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載するアミノ酸配列を含み得る。該方法は、ＰＧＲＮポリペプチドの減少したレベルを該哺乳動物が含むかどうかを判定するステップを含むことができる。該方法は、ＰＧＲＮ ｍＲＮＡの減少したレベルを哺乳動物が含むかどうかを判定するステップを含む。
別の側面において、本明細書は、認知症を発症する危険性があるとして哺乳動物を分類する方法を説明する。該方法は、ＰＧＲＮポリペプチドまたはＰＧＲＮ ｍＲＮＡの減少したレベルを哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含むか、実質的にそれらで構成され、減少したレベルの存在が、哺乳動物が認知症を発症する危険性があることを示す。該哺乳動物はヒトであり得る。認知症は前頭側頭葉変性症であり得る。認知症は前頭側頭型認知症であり得る。該哺乳動物はヒトであってもよく、ＰＧＲＮポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載するアミノ酸配列を含み得る。該方法は、ＰＧＲＮポリペプチドの減少したレベルを哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含むことができる。該方法は、ＰＧＲＮ ｍＲＮＡの減少したレベルを哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含むことができる。
別の側面において、本明細書は、単離された核酸分子を説明する。該単離された核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の少なくとも１０個の連続したアミノ酸をコードする核酸配列を含むか、実質的にそれらで構成され、その少なくとも１０個の連続したアミノ酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載する配列に関して、少なくとも１つの変異を含むことを条件とし、単離された核酸分子は、長さが少なくとも３０ヌクレオチド長である。単離された核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応に起因し得る。単離された核酸分子はＤＮＡであり得る。該核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードでき、その少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載する配列に関して、少なくとも１つの変異を含むことを条件とする。該核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の少なくとも４０個の連続したアミノ酸をコードでき、その少なくとも４０個の連続したアミノ酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載する配列に関して、少なくとも１つの変異を含むことを条件とする。単離された核酸分子は、長さが少なくとも５０ヌクレオチド長であり得る。単離された核酸分子は、長さが少なくとも１００ヌクレオチド長であり得る。変異は、アミノ酸置換であってもよい。
別の側面において、本明細書は、単離された核酸分子を説明する。単離された核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有する核酸配列を含むか、実質的にそれらで構成され、その少なくとも１５個の連続したヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載する配列に関して、少なくとも１つの変異を含むことを条件とする。単離された核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応に起因し得る。単離された核酸分子はＤＮＡであり得る。該核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載の少なくとも２５個の連続したヌクレオチドを含むことができ、その少なくとも２５個の連続したヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２記載する配列に関して、少なくとも１つの変異を含むことを条件とする。該核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載の少なくとも５０個の連続したヌクレオチドを含むことができ、その少なくとも５０個の連続したヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載する配列に関して、少なくとも１つの変異を含むことを条件とする。単離された核酸分子は、長さが少なくとも５０ヌクレオチド長であり得る。単離された核酸分子は、長さが少なくとも１００ヌクレオチド長であり得る。変異は、ヌクレオチド付加でであり得る。変異は、ヌクレオチド欠失であり得る。変異は、ヌクレオチド置換であり得る。変異は、哺乳動物内の内因性ＰＧＲＮ核酸内に存在する場合、哺乳動物において、ＰＧＲＮポリペプチドの発現を減少させる。変異は、ヒトの内因性ＰＧＲＮ核酸内に存在する場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載するアミノ酸配列を有すると同時に該アミノ酸配列中に少なくとも１つの変異を含むＰＧＲＮポリペプチドの発現をもたらす。
別の側面において、本明細書は、神経変性疾患を有するかまたは神経変性疾患を発症することが疑われる哺乳動物を治療するための方法を説明する。該方法は、ＰＧＲＮポリペプチドまたは該ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸を、哺乳動物へ投与するステップを含むか、実質的にそれらで構成される。哺乳動物はヒトであり得る。哺乳動物は、神経変性疾患を有し得る。該ＰＧＲＮポリペプチドまたは核酸は、神経変性疾患の症状が改善するという条件の下で、哺乳動物へ投与することができる。該症状は、少なくとも２５パーセント改善できる。哺乳動物は、神経変性疾患を発症することが疑われるものであり得る。ＰＧＲＮポリペプチドまたは核酸は、神経変性疾患の症状の発症が遅延されるという条件の下で、哺乳動物へ投与することができる。該発症は、少なくとも５年間遅延できる。神経変性疾患は、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、および運動ニューロン疾患から成る群より選択することができる。該方法は、哺乳動物へＰＧＲＮポリペプチドを投与するステップを含むことができる。ＰＧＲＮポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載するアミノ酸配列を含むことができる。該方法は、哺乳動物へ核酸を投与するステップを含むことができる。核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載するヌクレオチド配列を含むことができる。ＰＧＲＮポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載するアミノ酸配列を含むことができる。核酸は、ウイルスベクターを用いて投与することができる。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびアデノウイルスベクターから成る群より選択することができる。
別の側面において、本明細書は、神経変性疾患を有するかまたは神経変性疾患を発症することが疑われる哺乳動物を治療するための方法を説明する。該方法は、（ａ）（ｉ）変異を有するＰＧＲＮ核酸または（ｉｉ）ＰＧＲＮポリペプチドまたはＰＧＲＮ ｍＲＮＡの減少したレベルを含む哺乳動物を取得するステップ、および（ｂ）該哺乳動物に対して、該哺乳動物におけるＰＧＲＮポリペプチドのレベルを増加させる薬剤を投与するステップを含むか、実質的にそれらで構成される。哺乳動物はヒトであり得る。哺乳動物は、神経変性疾患を有し得る。薬剤は、神経変性疾患の症状が改善するという条件の下で、哺乳動物へ投与することができる。該症状は、少なくとも２５パーセント改善できる。哺乳動物は、神経変性疾患を発症することが疑われるものであり得る。薬剤は、神経変性疾患の症状の発症が遅延されるという条件の下で、哺乳動物へ投与することができる。該発症は、少なくとも５年間遅延できる。神経変性疾患は、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、および運動ニューロン疾患から成る群より選択することができる。薬剤は、１７β−エストラジオール、エンドセリン、プロピオン酸テストステロン、リゾホスファチジン酸、ｃＡＭＰ、およびエチニルエストラジオールから成る群より選択することができる。薬剤は、非ステロイド性抗炎症薬であり得る。非ステロイド性抗炎症薬は、イブプロフェン、インドメタシン、ジクロフェナク、ナプロキセン、およびアスピリンから成る群より選択することができる。薬剤は、ＰＰＡＲアゴニストであり得る。ＰＰＡＲアゴニストは、ゲムフィブロジル、フェノフィブレート、クロフィブレート、ロサグリタゾン（ｒｏｓａｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ピオグリタゾン、トログリタゾン、シグリタゾン（ｃｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、およびＬ１６５，０４１から成る群より選択することができる。
別の側面において、本明細書は、哺乳動物における神経変性疾患の治療のための薬剤を同定するための方法を説明する。該方法は、（ａ）分裂したＰＧＲＮ配列に対してヘテロ接合またはホモ接合である体細胞および胚細胞を含む非ヒト哺乳動物に対して試験薬剤を投与するステップ、ならびに（ｂ）（ｉ）神経変性疾患の症状が前記非ヒト哺乳動物において改善したかどうか、または（ｉｉ）ＰＧＲＮポリペプチドまたはＰＧＲＮ ｍＲＮＡ発現のレベルが前記非ヒト哺乳動物で増加したかどうかを判別するステップを含むか、実質的にそれらで構成され、前記改善の存在または前記増加したレベルの存在は、前記試験薬剤が、神経変性疾患を治療するための薬剤であることを示す。非ヒト哺乳動物は、マウスであり得る。非ヒト哺乳動物は、微小管関連のタウタンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質４３、およびアミロイド前駆体タンパク質から成る群より選択されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含み得る。非ヒト哺乳動物は、体細胞および胚細胞に外因性核酸を含むトランスジェニックマウスであり得る。非ヒト哺乳動物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載するアミノ酸配列を有すると同時に該アミノ酸配列中に少なくとも１つの変異を含むポリペプチドをコードする外因性核酸を含み得る。非ヒト哺乳動物は、体細胞および胚細胞に外因性核酸を含むトランスジェニックマウスであり得る。非ヒト哺乳動物は、破壊されたＰＧＲＮ配列に対してホモ接合である体細胞および胚細胞を含み得る。
別に定義されない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明に関連する当業者にとって、共通して明らかであるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと類似、または等価である方法および材料は、本発明を実施するために使用され得るが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書に記載された公報、特許出願、特許、およびその他参考文献のすべては、参照することによりそれぞれ全体が組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先されるものとする。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみを目的とし、限定を意図するものではない。
本発明における１つ以上の実施形態の詳細は、添付図面および以下の明細書本文に記載される。本発明のその他説明、目的と効果は、明細書本文および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
[請求項101]
変異を含むPGRN核酸を哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含む、認知症を有することが疑われる哺乳動物において認知症を診断するための方法であって、変異を含む前記PGRN核酸の存在が、前記哺乳動物が認知症を有することを示す、方法。
[請求項102]
前記哺乳動物がヒトである、請求項101に記載の方法。
[請求項103]
前記認知症が前頭側頭葉変性症である、請求項101に記載の方法。
[請求項104]
前記認知症が前頭側頭型認知症である、請求項101に記載の方法。
[請求項105]
前記PGRN核酸がPGRNポリペプチドの配列をコードする、請求項101に記載の方法。
[請求項106]
前記PGRN核酸が、PGRNポリペプチドの発現を制御するシス作用性制御エレメントである、請求項101に記載の方法。
[請求項107]
前記変異がヌクレオチド付加である、請求項101に記載の方法。
[請求項108]
前記変異がヌクレオチド欠失である、請求項101に記載の方法。
[請求項109]
前記変異がヌクレオチド置換である、請求項101に記載の方法。
[請求項110]
前記変異が、前記哺乳動物においてPGRNポリペプチドの発現を減少させる、請求項101に記載の方法。
[請求項111]
前記哺乳動物がヒトであり、かつ前記変異が、SEQ ID NO:1に記載のアミノ酸配列を有する上に前記アミノ酸配列に少なくとも1つの変異を含むPGRNポリペプチドを発現させる、請求項101に記載の方法。
[請求項112]
前記PGRNポリペプチドが、593アミノ酸残基よりも短い長さである、請求項111に記載の方法。
[請求項113]
前記変異が、前記哺乳動物において切断型PGRNポリペプチドを発現させる、請求項101に記載の方法。
[請求項114]
変異を含むPGRN核酸を哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含む、認知症を発症する危険性があるとして哺乳動物を分類するための方法であって、変異を含む前記PGRN核酸の存在が、前記哺乳動物が認知症を発症する危険があることを示す、方法。
[請求項115]
前記哺乳動物がヒトである、請求項114に記載の方法。
[請求項116]
前記認知症が前頭側頭葉変性症である、請求項114に記載の方法。
[請求項117]
前記認知症が前頭側頭型認知症である、請求項114に記載の方法。
[請求項118]
前記PGRN核酸がPGRNポリペプチドの配列をコードする、請求項114に記載の方法。
[請求項119]
前記PGRN核酸が、PGRNポリペプチドの発現を制御するシス作用性制御エレメントである、請求項114に記載の方法。
[請求項120]
前記変異がヌクレオチド付加である、請求項114に記載の方法。
[請求項121]
前記変異がヌクレオチド欠失である、請求項114に記載の方法。
[請求項122]
前記変異がヌクレオチド置換である、請求項114に記載の方法。
[請求項123]
前記変異が、前記哺乳動物においてPGRNポリペプチドの発現を減少させる、請求項114に記載の方法。
[請求項124]
前記哺乳動物がヒトであり、かつ前記変異が、SEQ ID NO:1に記載のアミノ酸配列を有する上に前記アミノ酸配列に少なくとも1つの変異を含むPGRNポリペプチドを発現させる、請求項114に記載の方法。
[請求項125]
前記PGRNポリペプチドが、593アミノ酸残基よりも短い長さである、請求項124に記載の方法。
[請求項126]
前記変異が、前記哺乳動物において切断型PGRNポリペプチドを発現させる、請求項114に記載の方法。
[請求項127]
PGRNポリペプチドまたはPGRN mRNAの減少したレベルを哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含む、認知症を有することが疑われる哺乳動物において認知症を診断するための方法であって、前記減少したレベルの存在が、前記哺乳動物が認知症を有することを示す、方法。
[請求項128]
前記哺乳動物がヒトである、請求項127に記載の方法。
[請求項129]
前記認知症が前頭側頭葉変性症である、請求項127に記載の方法。
[請求項130]
前記認知症が前頭側頭型認知症である、請求項127に記載の方法。
[請求項131]
前記哺乳動物がヒトであり、かつ前記PGRNポリペプチドが、SEQ ID NO:1に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項127に記載の方法。
[請求項132]
PGRNポリペプチドの減少したレベルを前記哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含む、請求項127に記載の方法。
[請求項133]
PGRN mRNAの減少したレベルを前記哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含む、請求項127に記載の方法。
[請求項134]
PGRNポリペプチドまたはPGRN mRNAの減少したレベルを哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含む、認知症を発症する危険性があるとして哺乳動物を分類するための方法であって、前記減少したレベルの存在が、前記哺乳動物が認知症を発症する危険があることを示す、方法。
[請求項135]
前記哺乳動物がヒトである、請求項134に記載の方法。
[請求項136]
前記認知症が前頭側頭葉変性症である、請求項134に記載の方法。
[請求項137]
前記認知症が前頭側頭型認知症である、請求項134に記載の方法。
[請求項138]
前記哺乳動物がヒトであり、かつ前記PGRNポリペプチドが、SEQ ID NO:1に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項134に記載の方法。
[請求項139]
PGRNポリペプチドの減少したレベルを前記哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含む、請求項134に記載の方法。
[請求項140]
PGRN mRNAの減少したレベルを前記哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含む、請求項134に記載の方法。
[請求項141]
SEQ ID NO:1に記載された少なくとも10個の連続したアミノ酸をコードするが、ただし前記少なくとも10個の連続したアミノ酸が、SEQ ID NO:1に記載の配列に対して少なくとも1つの変異を含むことを条件とする核酸配列を含み、少なくとも30ヌクレオチド長である、単離された核酸分子。
[請求項142]
ポリメラーゼ連鎖反応に起因する、請求項141に記載の単離された核酸分子。
[請求項143]
DNAである、請求項141に記載の単離された核酸分子。
[請求項144]
前記核酸配列が、SEQ ID NO:1に記載された少なくとも20個の連続したアミノ酸をコードするが、ただし前記少なくとも20個の連続したアミノ酸は、SEQ ID NO:1に記載された前記配列に対して少なくとも1つの変異を含むことを条件とする、請求項141に記載の単離された核酸分子。
[請求項145]
前記核酸配列が、SEQ ID NO:1に記載された少なくとも40個の連続したアミノ酸をコードするが、ただし前記少なくとも40個の連続したアミノ酸は、SEQ ID NO:1に記載された前記配列に対して少なくとも1つの変異を含むことを条件とする、請求項141に記載の単離された核酸分子。
[請求項146]
少なくとも50ヌクレオチド長である、請求項141に記載の単離された核酸分子。
[請求項147]
少なくとも100ヌクレオチド長である、請求項141に記載の単離された核酸分子。
[請求項148]
前記変異がアミノ酸置換である、請求項141に記載の単離された核酸分子。
[請求項149]
SEQ ID NO:2に記載された少なくとも15個の連続したヌクレオチドを有するが、ただし前記少なくとも15個の連続したヌクレオチドが、SEQ ID NO:2に記載された前記配列に対して少なくとも1つの変異を含むことを条件とする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
[請求項150]
ポリメラーゼ連鎖反応に起因する、請求項149に記載の単離された核酸分子。
[請求項151]
DNAである、請求項149に記載の単離された核酸分子。
[請求項152]
前記核酸配列が、SEQ ID NO:2に記載された少なくとも25個の連続したヌクレオチドを含むが、ただし前記少なくとも25個の連続したアミノ酸は、SEQ ID NO:2に記載された前記配列に対して少なくとも1つの変異を含むことを条件とする、請求項149に記載の単離された核酸分子。
[請求項153]
前記核酸配列が、SEQ ID NO:2に記載された少なくとも50個の連続したヌクレオチドを含むが、ただし前記少なくとも50個の連続したアミノ酸は、SEQ ID NO:2に記載された前記配列に対して少なくとも1つの変異を含むことを条件とする、請求項149に記載の単離された核酸分子。
[請求項154]
少なくとも50ヌクレオチド長である、請求項149に記載の単離された核酸分子。
[請求項155]
少なくとも100ヌクレオチド長である、請求項149に記載の単離された核酸分子。
[請求項156]
前記変異がヌクレオチド付加である、請求項149に記載の単離された核酸分子。
[請求項157]
前記変異がヌクレオチド欠失である、請求項149に記載の単離された核酸分子。
[請求項158]
前記変異がヌクレオチド置換である、請求項149に記載の単離された核酸分子。
[請求項159]
前記変異が、哺乳動物内部の内因性PGRN核酸内に存在する場合、前記哺乳動物においてPGRNポリペプチドの発現を減少させる、請求項149に記載の単離された核酸分子。
[請求項160]
前記変異が、ヒト内部の内因性PGRN核酸内に存在する場合、SEQ ID NO:1に記載のアミノ酸配列を有する上に前記アミノ酸配列に少なくとも1つの変異を含むPGRNポリペプチドを発現させる、請求項149に記載の単離された核酸分子。
[請求項161]
PGRNポリペプチドまたは前記PGRNポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸を哺乳動物に投与するステップを含む、神経変性疾患を有するかまたは前記神経変性疾患を発症することが疑われる哺乳動物を治療するための方法。
[請求項162]
前記哺乳動物がヒトである、請求項161に記載の方法。
[請求項163]
前記哺乳動物が神経変性疾患を有する、請求項161に記載の方法。
[請求項164]
前記神経変性疾患の症状が改善するという条件の下、前記PGRNポリペプチドまたは前記核酸が前記哺乳動物に投与される、請求項163に記載の方法。
[請求項165]
前記症状が少なくとも25パーセント改善する、請求項164に記載の方法。
[請求項166]
前記哺乳動物が前記神経変性疾患を発症することが疑われる、請求項161に記載の方法。
[請求項167]
前記神経変性疾患の症状の発症が遅延されるという条件の下、前記PGRNポリペプチドまたは前記核酸が前記哺乳動物に投与される、請求項166に記載の方法。
[請求項168]
前記発症が少なくとも5年間遅延される、請求項167に記載の方法。
[請求項169]
前記神経変性疾患が、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、および運動ニューロン疾患から成る群より選択される、請求項161に記載の方法。
[請求項170]
前記PGRNポリペプチドを前記哺乳動物に投与するステップを含む、請求項161に記載の方法。
[請求項171]
前記PGRNポリペプチドが、SEQ ID NO:1に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項170に記載の方法。
[請求項172]
前記核酸を前記哺乳動物に投与するステップを含む、請求項161に記載の方法。
[請求項173]
前記核酸が、SEQ ID NO:2に記載されたヌクレオチド配列を含む、請求項172に記載の方法。
[請求項174]
前記PGRNポリペプチドが、SEQ ID NO:1に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項172に記載の方法。
[請求項175]
前記核酸が、ウイルスベクターを使用して投与される、請求項172に記載の方法。
[請求項176]
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびアデノウイルスベクターから成る群より選択される、請求項175に記載の方法。
[請求項177]
(a)(i)変異を有するPGRN核酸または(ii)PGRNポリペプチドまたはPGRN mRNAの減少したレベルを有する哺乳動物を取得するステップ、および
(b)前記哺乳動物におけるPGRNポリペプチドのレベルを増加させる薬剤を前記哺乳動物に投与するステップ
を含む、神経変性疾患を有するかまたは前記神経変性疾患を発症することが疑われる哺乳動物を治療するための方法。
[請求項178]
前記哺乳動物がヒトである、請求項177に記載の方法。
[請求項179]
前記哺乳動物が神経変性疾患を有する、請求項177に記載の方法。
[請求項180]
前記神経変性疾患の症状が改善するという条件の下、前記薬剤が前記哺乳動物に投与される、請求項179に記載の方法。
[請求項181]
前記症状が少なくとも25パーセント改善する、請求項180に記載の方法。
[請求項182]
前記哺乳動物が前記神経変性疾患を発症することが疑われる、請求項177に記載の方法。
[請求項183]
前記神経変性疾患の症状の発現が遅延されるという条件の下、前記薬剤が前記哺乳動物に投与される、請求項182に記載の方法。
[請求項184]
前記発症が少なくとも5年間遅延される、請求項183に記載の方法。
[請求項185]
前記神経変性疾患が、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、および運動ニューロン疾患から成る群より選択される、請求項177に記載の方法。
[請求項186]
前記薬剤が、17β-エストラジオール、エンドセリン、プロピオン酸テストステロン、リゾホスファチジン酸、cAMP、およびエチニルエストラジオールから成る群より選択される、請求項177に記載の方法。
[請求項187]
前記薬剤が非ステロイド性抗炎症薬である、請求項177に記載の方法。
[請求項188]
前記非ステロイド性抗炎症薬が、イブプロフェン、インドメタシン、ジクロフェナク、ナプロキセン、およびアスピリンから成る群より選択される、請求項187に記載の方法。
[請求項189]
前記薬剤がPPARアゴニストである、請求項177に記載の方法。
[請求項190]
前記PPARアゴニストが、ゲムフィブロジル、フェノフィブレート、クロフィブレート、ロサグリタゾン(rosaglitazone)、ピオグリタゾン、トログリタゾン、シグリタゾン(ciglitazone)、およびL165,041から成る群より選択される、請求項189に記載の方法。
[請求項191]
(a)分裂したPGRN配列に対してヘテロ接合またはホモ接合である体細胞および胚細胞を含む非ヒト哺乳動物に対して試験薬剤を投与するステップ、ならびに
(b)(i)神経変性疾患の症状が前記非ヒト哺乳動物において改善したかどうか、または(ii)PGRNポリペプチドまたはPGRN mRNA発現のレベルが前記非ヒト哺乳動物で増加したかどうかを判断するステップ
を含む、哺乳動物において神経変性疾患を治療するための薬剤を同定するための方法であって、
前記改善の存在または前記増加したレベルの存在が、前記試験薬剤が神経変性疾患を治療するための薬剤であることを示す、方法。
[請求項192]
前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項191に記載の方法。
[請求項193]
前記非ヒト哺乳動物が、微小管関連タンパク質タウ、TAR DNA結合タンパク質43、およびアミロイド前駆体タンパク質から成る群より選択されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含む、請求項191に記載の方法。
[請求項194]
前記非ヒト哺乳動物が、体細胞および胚細胞に前記外因性核酸を含むトランスジェニックマウスである、請求項193に記載の方法。
[請求項195]
前記非ヒト哺乳動物が、SEQ ID NO:1に記載のアミノ酸配列を有する上に前記アミノ酸配列に少なくとも1つの変異を含むポリペプチドをコードする外因性核酸を含む、請求項191に記載の方法。
[請求項196]
前記非ヒト哺乳動物が、体細胞および胚細胞に前記外因性核酸を含むトランスジェニックマウスである、請求項195に記載の方法。
[請求項197]
前記非ヒト哺乳動物が、前記分裂したPGRN配列に対してホモ接合である体細胞および胚細胞を含む、請求項191に記載の方法。
図１Ａは、１７番染色体の略図である。ＰＧＲＮは、ＭＡＰＴから１．７Ｍｂに位置し、ＦＴＤＰ−１７中で変異される。図１Ｂは、示されるタウ陰性ＦＴＤ−１７変異の位置を有する、ＰＧＲＮポリペプチドをコードしたＰＧＲＮ遺伝子およびｍＲＮＡの略図である。文字つきの枠は、個々のグラニュリンシステイニル繰り返し単位を示す。図１Ｃは、ＰＧＲＮ ＲＮＡにおけるこの群の変異により作成された、中途終止コドンの位置の図解である。短縮されたＲＮＡは、ヌル対立遺伝子を生じるナンセンス変異による崩壊の影響を受ける可能性があり、それによってＰＧＲＮ変異の少なくとも１つの病理学的機構を表す。ＩＶＳ８＋１Ｇ＞変異（＊）は、エクソン８の飛び越しおよびフレームシフト（Ｖ２７９ＧｆｓＸ４）を予測するが、この変異の効果を確認するためのＲＮＡはなかった。 図２Ａは、非罹患者、あるいは、Ｃ３１ ＬｆｓＸ３４（ＵＢＣ １７）またはＲ４１８Ｘ（ＵＢＣ １５）を持つ患者の、リンパ芽球様細胞のＰＧＲＮ ｍＲＮＡレベルを描画した棒グラフである。ＰＧＲＮ ＲＮＡレベルは、非罹患者の細胞に対する、レベルのパーセントとして示す。図２Ｂは、指示時間数の間、ＮＭＤ阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ，５００μＭ）を用いて治療された、指示細胞のＰＧＲＮ ｍＲＮＡレベルを描画したグラフである。２時間および８時間、ＣＨＸを用いたＣ３１ ＬｆｓＸ３４細胞の治療は、ＰＧＲＮ ＲＮＡ総量の、漸進的な増加をもたらした。図２Ｃは、Ｃ３１ ＬｆｓＸ３４変異のある患者からのリンパ芽球様細胞（１−５）および脳（６）の、ＲＴ−ＰＣＲフラグメント分析の追跡を含み、変異ＲＮＡ（１９６ｂｐ）が事実上欠けていることを明示している。ＣＨＸを用いた治療は、Ｃ３ １ＬｆｓＸ３４変異ＲＮＡレベルの選択的増加をもたらすが、対照（影響の受けていない）のリンパ芽球のＰＧＲＮ ＲＮＡにおける効果はない。図２Ｄは、リンパ芽球からのポリペプチド抽出物の分析における、いくつかの写真および棒グラフを含む。変異（Ｃ３ １ＬｆｓＸ３４およびＲ４１８Ｘ）保持者のリンパ芽球における野生型ＰＧＲＮポリペプチドレベルは、影響を受けていない親族に対して、減少する（平均減少率３４％、ｐ＝０．０１、ｔ−ｔｅｓｔ）。Ｃ３ １ＬｆｓＸ３４（ＵＢＣ１７）およびＲ４１８Ｘ（ＵＢＣ１５）変異ポリペプチドは検出されない。矢印は野生型ＰＧＲＮおよびＲ４１８Ｘ変異ポリペプチドの予測位置を示す。ＨｅＬａ細胞（左側のパネル）中に発現した、イントロンを含まないｃＤＮＡ構成（ナンセンス変異による崩壊の影響を受けない）から生成されたＲ４１８Ｘ ＰＧＲＮは、変異ポリペプチドが（生成される場合には）安定していることを示すために含められる。 図３は、ＵＢＣ１７（Ａ）および１０８３（Ｂ）の各家系において、疾病のあるＰＧＲＮ変異Ｃ３１ＬｆｓＸ３４およびＱ１２５Ｘの分離を明らかにする家系図を含む。罹患者は塗りつぶしてある菱形、または部分的に塗りつぶしてある菱形により示される。変異の存在（＋）または不在（−）は、利用可能なＤＮＡについて各患者に対して示す。最も若い世代の罹患家系員のみが、家系の同一性を保護していることを示す。 図４は、ＰＧＲＮポリペプチドをコードしたＰＧＲＮ遺伝子およびｍＲＮＡの略図であり、同定されたＰＧＲＮ変異を示す。ＰＧＲＮ ｍＲＮＡの文字つきの枠は、個々のグラニュリン繰り返し単位を示す。変異には、最大ＰＧＲＮ転写物（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２０８７．２；ＧＬ６０４９８９９３）に対して番号がつけられる。 図５は、８つのＦＴＬＤ家系において、疾病のあるＰＧＲＮ変異の分離を明らかにする家系図を含む。各患者の同一性を保護するため、すべての患者を、菱形で表す。菱形内の数字は、個々の家系員の数を表す。白色の記号は非罹患者を表し、黒色の記号は、ＦＴＬＤの臨床診断または病理学的診断を用いた患者を示し、灰色の記号はＰＤ患者を示す。患者記号の下にある最初の番号は、発症年齢（歳）を示し、死亡の年齢（歳）が続く。矢印は発端者を示す。患者に対して、ＰＧＲＮ変異の存在は、記号の右上に「＋」を用いて示す。 図６は、ＰＧＲＮ変異保持者の易罹病性曲線である。ＰＧＲＮ変異保持者における、年齢と関連付けられた浸透率の分布を示す。疾病の浸透率は、３０歳から８５歳までの、５歳毎の年齢のグループで計算された。影響を受けた計６９人のＰＧＲＮ変異保持者、および影響を受けていない計１６人のＰＧＲＮ変異保持者が、分析に含められた。 図７は、患者ＮＡ０５−０６４（Ｃ．Ｌ３８＋ｌＧ＞Ａ、レーン２）およびＵＢＣ１４−９（Ｃ．４６３−ｌＧ＞Ａ、レーン４）の、前頭葉から作成された、第１鎖ｃＤＮＡから得た、ＰＧＲＮ ＰＣＲ単位複製配列の電気泳動後の、アガロースゲルの画像を含む。対照患者の分析は、予期されるＰＧＲＮ ｃＤＮＡエクソン０−２（４１３ｂｐ、レーン１）およびＰＧＲＮ ｃＤＮＡエクソン４−８（５８７ｂｐ、レーン３）の転写物の長さを示すために含められる。各ＰＧＲＮのスプライス部位の変異における、変異ＰＧＲＮ転写物の予測スプライシングの概略図を示す。変異の位置、およびＰＣＲプライマー（矢印）の位置を示す。 図８は、条件付きＰＧＲＮノックアウト動物を作成するための、標的核酸構築物を表す概略図である。 図９は、ＰＧＲＮノックアウト動物を作成するための、標的核酸構築物を表す概略図である。 図１０は、ヒトＰＧＲＮポリペプチドのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、およびヒトＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含む。 図１１Ａは、以下のＰＧＲＮポリペプチドの個々のグラニュリン・ドメインにおける、アミノ酸配列の配列である。Ｎ末端（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）、パラグラニュリン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）、グラニュリンＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）、グラニュリンＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）、グラニュリンＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）、グラニュリンＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、グラニュリンＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）、グラニュリンＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）、およびグラニュリンＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）。保存されているＣｙｓ残基には濃く陰影を付け、ならびにその他の保存されているアミノ酸には薄く陰影を付ける。ＰＧＲＮミスセンス変異は、陰影を付けた円を用いて示す。図１１Ｂはグラニュリン範囲の分子モデルである。グラニュリン・ドメインの完全な構造は、グラニュリンＡのＮ末端モジュールの結晶構造（ＰＤＢ Ｉｇ２６；Ｔｏｌｋａｔｃｈｅｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９：２８７８−２８８６（２０００））、およびジスルフィドで占められた構造の固有対称性に基づいて再編成された。該構造は、６つのジスルフィド結合を含み、３つの自己相似性重複モジュールへ分割できる。グラニュリン・ドメイン中に位置する２つのミスセンス変異は、再編成モデル上に位置付けられた。 図１２は、１０の異なる分岐を示すＤＲ８家系起源の系図を含む。世代Ｈ−ＩおよびＨ−ＩＩは、仮定上の世代である。黒色の四角は患者、灰色にされた四角は、影響状況が不明である個人を表す。ＤＮＡが利用可能な患者は、星印で示す。ＤＲ番号で表された患者は、臨床的および／または病理学的情報が利用可能な患者である（表２１）。系図の各分岐の指標患者は、くさび形を用いて示す。 図１３は、家系ＤＲ２５における、ＤＲ８ハプロタイプの起源の分離を示す系図である。発端者は、くさび型を用いて示す。塗りつぶされた記号は、ＡＤ（灰色）またはＦＴＬＤ（黒色）を有する個人を表す。対立遺伝子の長さは、塩基対で示す。 図１４は、次の２−ＳＮＰハプロタイプと、対立遺伝子の頻度＞０．０５である、すべての一般的なＰＧＲＮ変異に対する発症年齢との間の関係を試験した、統計値の全体的ｐ値の−ｌｏｇ１０を描画したグラフである。ｙ軸は、−ｌｏｇ１０ｐ値を提供し、ｘ軸は、位置順に一般的な変異型を表す。 図１５は、ＩＶＳ２＋２１Ｇ＞Ａ遺伝子型による疾病発症後の生存を描画したグラフである。野生型ＧＧに対してホモ接合性の患者（点線）、およびＡ対立遺伝子の保持者（破線）に対する、累積生存率を与える。ｙ軸は、累積生存を示し、ｘ軸は、疾病発症後の生存時間を月の単位で提供する（ｔ＝０）。最後の試験時にまだ生存している患者は削除した。 図１６Ａは、ＭＡＱプログラムで作成された、患者ＤＲ１８４．１（左）およびＤＲ１５．１（右）のＭＡＱ結果を含む。上側のパネルには、患者および対照のサンプルを含むクロマトグラムを含む。試験（ａｍｐ）および参照単位複製配列（ｃｏｎｔｒ）は、ピークの上に示される。ｘ軸は、単位複製配列の長さを塩基対で示し、ｙ軸は、ピークの高さを示す。下側のパネルには、参照（左側）および試験単位複製配列（右側）に対する、ＤＱ値を示す用量のプロットを含む。ＤＱ値が０．７５未満の試験単位複製配列は、黒色の棒で示す。灰色の区域は、通常変異（ＤＱ＝０．８−１．２）を表す。患者ＤＲ１８４において、試験単位複製配列すべてのピーク領域は、対照と比較すると、明らかに減少し、試験単位複製配列すべてに対して０．７５未満のＤＱ値という結果となっている。患者ＤＲ１５．１は、試験単位複製配列３から６においてのみ、減少したＤＱを示す。図１６Ｂは、示されるＭＡＱ試験単位複製配列を有する、ＰＧＲＮ遺伝子およびフランキング領域の略図である。ＰＧＲＮコード領域は濃い灰色で示し、非コード領域は薄い灰色で示す。図１６Ｃは、患者ＤＲ１８４．１、ＤＲ１５．１、およびＤＲ１８８．１についての、１３ＰＧＲＮエクソンすべてのｑＰＣＲ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの結果に対するグラフである。該プロットは、ｘ軸上に示される各ＰＧＲＮエクソンにおけるＤＱ値を標準誤差とともに示す。各ＤＱ値は、重複測定されたハウスキーピング遺伝子ｈＢ２ＭおよびｈＵＢＣに関して得た、ＤＱ値の平均値を表す。ＤＲ１８４において、すべてのＰＧＲＮエクソンは、０．７５より低いＤＱを示し、それに対して、患者ＤＲ１５．１および１８８．１においては、ＤＲ１ ８８．１のエクソン０は、若干増加するが、１から１２のエクソンのみが削除される。 図１７の上側のパネルは、ＰＧＲＮの略図であり、ＰｓｔＩ制限酵素認識部位は、垂直の点線で示される。１．４ｋｂの制限断片にハイブリダイズするＰＧＲＮプローブは、ＰＧＲＮ３’ＵＴＲおよび下流配列の部分を含む。下側のパネルは、ＰＧＲＮプローブおよび基準プローブがハイブリダイズした、患者ＤＲ１８４．１および２人の対照個人からのサンプルのサザンブロットである。ＰＧＲＮプローブおよび基準プローブから生じたバンドを示す。ＰＧＲＮフラグメント（１．４ｋｂ）のシグナル強度は、２人の対照個人と比較して、患者において、参照フラグメント（１．９ｋｂ）のシグナル強度よりも低い。その他の大きさのバンドは観測できない。 図１８は、患者ＤＲ１８４．１および対照における、ＰＧＲＮ内および隣接の選択した試験フラグメントならびに参照フラグメントを用いた共増幅を示すアガロースゲルを含む。結果として生じたバンドは、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｔａｔｉｏｎ４４０で定量化された。下側のパネルのグラフは、各フラグメントに関して得たＤＱ値を示し、ｘ軸上に示される。０．７５未満のＤＱ値は、欠失を示す。１７ｑ２１染色体のゲノム分節は、縦棒で示された増幅した試験フラグメントの位置と共にグラフの下に示す。低下したＤＱを有する２つの領域である、ＰＧＲＮを含む欠失およびＰＧＲＮのより上流の欠失が観測でき、ＣＮＶであると考える。最小欠失領域は、灰色の線で示し、切断点領域は、黒色の線で示す。マーカーＤ１７Ｓ１８６０を示すが、それは、マーカーＤ１７Ｓ１８６０が、ＰＧＲＮを含む欠失の切断点領域をさらに減少するために使用されたからである。 図１９は、同定された欠失を含む、１７ｑ２１ゲノム領域の遺伝子地図を含み、遺伝子アノテーション、ＳＴＲマーカー、ＳＮＰ、ＰＧＲＮのＰｓｔＩ制限酵素認識部位、ＢＡＣ ＲＰ１１−７６５Ｈ１１の位置、および多重マッピングパネルで使用したＭＡＱ単位複製配列ならびにフラグメントの位置を示す。各患者に対して、最小欠失領域は、濃い灰色で示し、切断点領域は薄い灰色で示す。ＰＧＲＮコード配列は、薄い灰色の縦棒で示され、それが、３つの最小欠失領域のそれぞれに含まれていることを示す。患者ＤＲ１５．１およびＤＲ１８８．１の点がある棒は、これらの患者において、テロメア切断点領域が定義されないことを示す。 図２０は、ＤＭＳＯ処理細胞と比較した、クロフィブレートで処理したＭ１７細胞培養物の、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドレベルと分泌ＰＧＲＮポリペプチドレベルをプロットしたグラフである。細胞内とは、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味し、および分泌とは、無血清培地に検出されたＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味する。示される結果は、重複して実施された２つまたは３つの実験の平均である。 図２１は、ＤＭＳＯ処理細胞と比較した、クロフィブレートで処理したリンパ芽球細胞培養物の、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドレベルと分泌ＰＧＲＮポリペプチドレベルをプロットしたグラフである。細胞内とは、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味し、および分泌とは、無血清培地に検出されたＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味する。示される結果は、重複して実施された２つまたは３つの実験の平均である。 図２２の左側パネルは、シグリタゾンの示される濃度で処理されたＭ１７細胞からの細胞溶解物（細胞内）および培養上清（分泌された）のＰＧＲＮポリペプチドレベルをプロットしたグラフである。ＰＧＲＮポリペプチドレベルは、ＤＭＳＯで処理されたＭ１７細胞からの細胞溶解物または培養上清における対照レベルに対する割合（パーセント）として描画する。図２２の右側パネルは、シグリタゾンの示される濃度で処理されたＭ１７細胞からの細胞溶解物（ＬＹＳ）および培養上清（ＳＦＭ）の、ＰＧＲＮポリペプチド発現を分析したウエスタンブロットを含む（上から２列）。また、図２２の右側パネルも、シグリタゾンの示される濃度で処理されたＭ１７細胞からの細胞溶解物中のＧＡＰＤＨ（ＧＡＰ）ポリペプチド発現を分析したウエスタンブロットを含む（一番下の列）。 図２３は、ＤＭＳＯ処理細胞と比較した、シグリタゾンで処理したヒトリンパ芽球細胞培養物の、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドレベルと分泌ＰＧＲＮポリペプチドレベルをプロットしたグラフである。細胞内とは、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味し、および分泌とは、無血清培地に検出されたＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味する。示される結果は、重複して実施された２つまたは３つの実験の平均である。 図２４の左側パネルは、Ｌ １６５，０４１の示される濃度で処理されたヒトリンパ芽球細胞からの細胞溶解物（細胞内）および培養上清（分泌された）のＰＧＲＮポリペプチドレベルをプロットしたグラフである。ＰＧＲＮポリペプチドレベルは、ＤＭＳＯで処理されたヒトリンパ芽球細胞からの細胞溶解物または培養上清の対照レベルに対する割合（パーセント）として描画する。図２４の右側パネルは、Ｌ １６５，０４１の示される濃度で処理されたヒトリンパ芽球細胞からの細胞溶解物（ＬＹＳ）および培養上清（ＳＦＭ）の、ＰＧＲＮポリペプチド発現を分析したウエスタンブロットを含む（上から２列）。また、図２４の右側パネルは、Ｌ １６５，０４１の示される濃度で処理されたヒトリンパ芽球細胞からの細胞溶解物中のＧＡＰＤＨ（ＧＡＰ）ポリペプチド発現を分析したウエスタンブロットを含む（一番下の列）。 図２５は、ＤＭＳＯ処理細胞と比較した、Ｌ １６５，０４１で処理したＭ１７細胞培養物の、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドレベルと分泌ＰＧＲＮポリペプチドレベルをプロットしたグラフである。細胞内とは、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味し、および分泌とは、無血清培地に検出されたＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味する。示される結果は、重複して実施された２つまたは３つの実験の平均である。 図２６は、イブプロフェンの示される濃度で処理されたＨｅＬａ細胞からの細胞溶解物（細胞内）および培養上清（分泌された）のＰＧＲＮポリペプチドレベルをプロットしたグラフである。ＰＧＲＮポリペプチドレベルは、ＤＭＳＯで処理されたＨｅＬａ細胞からの細胞溶解物または培養上清における対照レベルに対する割合（パーセント）としてプロットする。４つの実験結果の平均をプロットする。 図２７は、インドメタシンの示される濃度で処理されたＨｅＬａ細胞からの細胞溶解物および培養上清のＰＧＲＮポリペプチドレベルをプロットしたグラフである。ＰＧＲＮポリペプチドレベルは、ＤＭＳＯで処理されたＨｅＬａ細胞からの細胞溶解物または培養上清における対照レベルに対する割合（パーセント）として描画する。細胞内とは、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味し、および分泌とは、無血清培地に検出されたＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味する。 図２８は、ナプロキセンの示される濃度で処理されたＨｅＬａ細胞からの細胞溶解物および培養上清のＰＧＲＮポリペプチドレベルをプロットしたグラフである。ＰＧＲＮポリペプチドレベルは、ＤＭＳＯで処理されたＨｅＬａ細胞からの細胞溶解物または培養上清における対照レベルに対する割合（パーセント）としてプロットする。細胞内とは、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味し、および分泌とは、無血清培地に検出されたＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味する。 図２９は、メクロフェナム酸の示される濃度で処理されたＨｅＬａ細胞からの細胞溶解物および培養上清のＰＧＲＮポリペプチドレベルをプロットしたグラフである。ＰＧＲＮポリペプチドレベルは、ＤＭＳＯで処理されたＨｅＬａ細胞からの細胞溶解物または培養上清における対照レベルに対する割合（パーセント）としてプロットする。細胞内とは、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味し、および分泌とは、無血清培地に検出されたＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味する。 図３０は、アセチルサリチル酸の示される濃度で処理されたＨｅＬａ細胞からの細胞溶解物および培養上清のＰＧＲＮポリペプチドレベルをプロットしたグラフである。ＰＧＲＮポリペプチドレベルは、ＤＭＳＯで処理されたＨｅＬａ細胞からの細胞溶解物または培養上清における対照レベルに対する割合（パーセント）としてプロットする。細胞内とは、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味し、および分泌とは、無血清培地に検出されたＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味する。 図３１は、レスベラトロールの示される濃度で処理されたＭ１７細胞からの細胞溶解物および培養上清のＰＧＲＮポリペプチドレベルをプロットしたグラフである。ＰＧＲＮポリペプチドレベルは、ＤＭＳＯで処理されたＭ１７細胞からの相当する細胞溶解物または培養上清における対照レベルに対する割合（パーセント）としてプロットする。細胞内とは、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味し、および分泌とは、無血清培地に検出されたＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味する。 図３２は、クルクミンの示される濃度で処理されたＭ１７細胞からの細胞溶解物および培養上清のＰＧＲＮポリペプチドレベルをプロットしたグラフである。ＰＧＲＮポリペプチドレベルは、ＤＭＳＯで処理されたＭ１７細胞からの対応する細胞溶解物または培養上清における対照レベルに対する割合（パーセント）としてプロットする。細胞内とは、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味し、および分泌とは、無血清培地に検出されたＰＧＲＮポリペプチドレベルを意味する。 図３３は、示された時点での、Ｍ１７およびＮ２Ａ細胞により分泌された、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルをプロットしたグラフである。グラフは、分泌されたポリペプチドが両細胞系に２２時間にわたって、直線的に蓄積することを示す。
詳細な説明
本明細書は、ＰＧＲＮ核酸における１つ以上の変異を検出することに関する方法および材料を開示する。例えば、本明細書は、コード配列の中途終止をもたらす変異等の変異があるＰＧＲＮ核酸を哺乳動物が含むかどうかを検出するための方法および材料を開示する。また、本明細書は、ＰＧＲＮ発現のレベルを検出するための方法および材料を開示する。例えば、本明細書は、哺乳動物が、減少したＰＧＲＮ ｍＲＮＡまたはＰＧＲＮポリペプチド発現のレベルを有するかどうかを検出する方法および材料を開示する。本明細書に記載されるように、ＰＧＲＮ ｍＲＮＡまたはＰＧＲＮポリペプチドの発現減少を有する哺乳動物は、認知症を有するかまたは発症する可能性があるとして同定することができる。
哺乳動物には、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、サル、またはヒト、いずれの哺乳動物も挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「ＰＧＲＮ核酸」という用語は、ＰＧＲＮ ｍＲＮＡの転写開始部位の５ｋｂ上流から、ＰＧＲＮ ｍＲＮＡの転写終結部位の５ｋｂ下流まで広がる核酸を称す。場合によっては、ＰＧＲＮ核酸は、（１）ＰＧＲＮポリペプチドをコードするいかなる核酸、（２）ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸のいかなるフラグメント、（３）ＰＧＲＮポリペプチドの一部をコードするエクソン配列間に位置するいかなるイントロン配列、（４）ＰＧＲＮ ｍＲＮＡの転写開始部位から５ｋｂ内のいかなる５’フランキング配列、（５）ＰＧＲＮ ｍＲＮＡの転写終結部位から５ｋｂ内のいかなる３’フランキング配列、（６）ＰＧＲＮ ｍＲＮＡの転写開始部位と、ＰＧＲＮポリペプチドの一部分をコードする最初のエクソンとの間に位置するいかなる配列、（７）ＰＧＲＮポリペプチドの一部をコードする最終のエクソンと、ＰＧＲＮ ｍＲＮＡの転写終結部位との間に位置するいかなる配列、または（８）ＰＧＲＮ ｍＲＮＡのいかなるシス作用性調節塩基配列であり得る。例えば、ＰＧＲＮポリペプチドをコードするＰＧＲＮ核酸は、ＰＧＲＮ ｍＲＮＡまたはＰＧＲＮ ｃＤＮＡであり得る。場合によっては、ＰＧＲＮ核酸は、ＰＧＲＮのエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、またはエクソン１２であり得る。場合によっては、ＰＧＲＮ核酸は、ＰＧＲＮエクソン、ＰＧＲＮイントロン、ＰＧＲＮ５’ＵＴＲ、ＰＧＲＮ３’ＵＴＲ、およびＰＧＲＮプロモーター配列、ならびにＰＧＲＮ ｍＲＮＡ発現に対して、転写開始部位から４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．８ｋｂ、０．５ｋｂ、０．３ｋｂ、または０．１ｋｂ上流、およびＰＧＲＮ ｍＲＮＡ発現に対して、転写終結部位から４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．８ｋｂ、０．５ｋｂ、０．３ｋｂ、または０．１ｋｂ下流を網羅した配列を含み得る。ＰＧＲＮ核酸の例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載する核酸配列、およびＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号Ｍ７５１６１（ＧＩ：１８３６１２）に記載する核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される方法および材料は、哺乳動物（例えば、ヒト）のＰＧＲＮ核酸が、変異または変異の組み合わせ（例えば、本明細書で特定される１つ以上の変異）を含むかどうかを判断するために使用することができる。場合によっては、本明細書に開示される方法および材料は、哺乳動物のＰＧＲＮ核酸を含んだ対立遺伝子の両方ともが、ＰＧＲＮ核酸に１つ以上の変異を含むのか（例えば、両方の対立遺伝子中に同一の変異、または各対立遺伝子中に別々の変異、のいずれか）、あるいは哺乳動物のＰＧＲＮ核酸を含む単一の対立遺伝子のみが、１つ以上のＰＧＲＮ変異を含むのかを判断するために使用することができる。対立遺伝子中の１つ以上のＰＧＲＮ変異（例えば、表１に記載する１つ以上の変異）の識別は、一般的には、神経変性障害の既知の臨床症状も存在する場合、哺乳動物における認知症の診断のために使用することができる。１つの対立遺伝子のみにおけるＰＧＲＮ変異の識別は、当該哺乳動物が保持者であることを示す。
変異ＰＧＲＮ核酸とは、特定の種において、野生型ＰＧＲＮ核酸と比較して、変異を含む、あらゆるＰＧＲＮ核酸である。例えば、変異ヒトＰＧＲＮ核酸は、配列に少なくとも１つの変異を含むという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載するヌクレオチド配列を有する核酸であり得る。核酸に関して本明細書で使用される「変異」という用語には、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、ヌクレオチド置換、およびそれらの組み合わせが挙げられ、コード領域ならびに非コード領域（例えば、エクソン、イントロン、非翻訳配列、ＰＧＲＮ ｍＲＮＡの転写開始部位から上流の配列、およびＰＧＲＮ ｍＲＮＡの転写終結部位から下流の配列）中に発生する変異を含む。例えば、ＰＧＲＮ核酸の変異は、ＰＧＲＮ発現の低下をもたらし得る（例えば、ナンセンス変異によるＰＧＲＮ ｍＲＮＡの崩壊のため）。場合によっては、ＰＧＲＮ核酸の変異は、終止コドンの導入によるコード配列の中途終止をもたらし得る。場合によっては、変異は、フレームシフト変異であり得る。例えば、核酸は、コードされたポリペプチドが、ＰＧＲＮポリペプチドのアミノ酸配列から開始し、次にＰＧＲＮポリペプチド中で発見されたものとは異なるアミノ酸配列へ切り替える等の、リーティングフレームを変更する変異（例えば、挿入、欠失）を含み得る。場合によっては、ＰＧＲＮ核酸の変異は、コードされたポリペプチドの誤った折り畳みまたは異常なプロセシングをもたらす。ＰＧＲＮ核酸における変異の例には、表１に記載された変異が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書では、ヌクレオチドは一文字の基準記号表示（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）によって参照される。ＰＧＲＮ核酸のその他の変異は、本明細書に記載するように特定することができる。場合によっては、認知症を生じ得ない、認知症と関連づけられない、またはＰＧＲＮポリペプチドレベル減少の原因とならない、ＰＧＲＮ核酸の非コード領域中の変異は、認知症を実際にもたらす、認知症に関連する、あるいはＰＧＲＮポリペプチドレベル減少の原因となる、１つ以上の変異とコセグレゲート（ｃｏ−ｓｅｇｒｅｇａｔｅ）できる。当然のことながら、そのようなコセグレゲート変異は、認知症を実際にもたらす、認知症に関連する、またはＰＧＲＮポリペプチドレベル減少の原因となる、１つ以上の変異に対するマーカーとして使用することができる。
変異ＰＧＲＮポリペプチドとは、特定の種において、野生型ＰＧＲＮポリペプチドと比較して、変異を含む、あらゆるＰＧＲＮポリペプチドである。例えば、変異ヒトＰＧＲＮポリペプチドは、配列には少なくとも１つの変異を含むという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載するアミノ酸配列を有するポリペプチドであり得る。場合によっては、変異ＰＧＲＮポリペプチドは、特定の種において、野生型ＰＧＲＮポリペプチドよりも、少数のアミノ酸を含むポリペプチド（例えば、切断型ＰＧＲＮポリペプチド）、または特定の種において、野生型ＰＧＲＮポリペプチドと異なる少なくとも１つのアミノ酸を含むポリペプチドであり得る。
（表１）認知症、ＦＴＬＤ、ＡＤ、ＰＤ、およびＡＬＳに関連するＰＧＲＮ変異
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いずれの適切な方法もＰＧＲＮ核酸における変異を検出するために使用することができる。例えば、ｃＤＮＡ、エクソン、イントロン、または非翻訳配列の配列決定、変性高性能液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ、Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，７：９９６−１００５（１９９７））、対立遺伝子特異的なハイブリダイゼーション（Ｓｔｏｎｅｋｉｎｇら、Ａｍ Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ，４８：３７０−３８２（１９９１）およびＰｒｉｎｃｅら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，１１（１）：１５２−１６２（２００１））、対立遺伝子特異的な制限消化、変異特異的なポリメラーゼ連鎖反応、一本鎖高次構造多型による検出（Ｓｃｈａｆｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：３３−３９（１９９８））、赤外線マトリックス支援レーザー離脱イオン化質量分析（ＷＯ９９／５７３１８）、および前記方法の組み合わせによって、変異を検出することができる。
場合によっては、ゲノムＤＮＡは、ＰＧＲＮ核酸における１つ以上の変異を検出するために使用することができる。ゲノムＤＮＡは、一般的に抹消血標本等の生体サンプルから抽出されるが、組織（例えば、口腔粘膜、腎組織、または肝組織からの粘膜剥離物）を含むその他の生体サンプルから抽出することができる。例えば、フェノール抽出を含む、いずれの適切な方法も、血液または組織サンプルからゲノムＤＮＡを抽出するために使用することができる。場合によっては、ゲノムＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ ＤＮＡ単離システム（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、またはＡ．Ｓ．Ａ．Ｐ．３ ゲノムＤＮＡ単離キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）等のキットを使用して抽出することができる。
増幅措置は、該検出方法を進める前に実行することができる。例えば、ＰＧＲＮ核酸のエクソンまたはイントロンは、増幅され、そして直接配列決定されてもよい。色素プライマー配列は、ヘテロ接合サンプルの精度を増加させるために使用することができる。
ＰＧＲＮ核酸における変異は、例えば、ＰＧＲＮ核酸のＤＨＰＬＣ分析によって検出することができる。ゲノムＤＮＡは、哺乳動物（例えば、ヒト）から単離することができ、ＰＧＲＮ核酸の１つ以上の領域の配列は、オリゴヌクレオチドプライマーのペアを使用して（例えば、ＰＣＲによって）増幅させることができる。例えば、表２に記載されたプライマーのペアを、ヒトＰＧＲＮ核酸の配列を増幅させるために使用することができる。増幅後、ＰＣＲ産物は、変異を含む対立遺伝子が野生型対立遺伝子と再アニールしてヘテロ二本鎖（すなわち、１つ以上の位置に不適合のある二本鎖核酸）を形成するように変性および再アニールしてもよい。再アニールした生成物は、不適合を含まないヘテロ二本鎖と比較して変更された融解温度に基づいてヘテロ二本鎖を検出するＤＨＰＬＣに供することができる。ヘテロ二本鎖を含むサンプルは、変異ヌクレオチドを識別するために標準方法によって配列決定されてもよい。特定のＰＧＲＮ変異の例は、表１に提供されている。
対立遺伝子特異的なハイブリダイゼーションは、哺乳動物の完全ハプロタイプを含むＰＧＲＮ核酸における変異を検出するためにも使用することができる。例えば、１つ以上の哺乳動物からのＤＮＡサンプルまたはＲＮＡサンプルは、プライマーのペアを使用して増幅することができ、増幅産物は基質に（例えば、不連領域に）固定化されてもよい。ハイブリダイゼーション条件は、核酸プローブが該当する配列（例えば、特定の変異を含むＰＧＲＮ核酸）と特異的に結合するように選択されてもよい。ヌクレオチド変異によっては単一ヌクレオチド相違のみを含む場合があるため、そのようなハイブリダイゼーションは一般的に高ストリンジェンシーの下で実行される。高ストリンジェンシーの条件は、低イオン強度溶液、および洗浄のための高温度の使用を含み得る。例えば、核酸分子は、４２℃で２Ｘ ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ／０．０３Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））でハイブリダイズさせ、６５℃で０．１％ＳＤＳを含む０．１Ｘ ＳＳＣ（０．０１５Ｍ ＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム）で洗浄することができる。ハイブリダイゼーション条件は、長さや配列構成を含む核酸分子の独自の特徴に応じて調整することができる。プローブは、検出を促進するために標識（例えば、蛍光で）されてもよい。場合によっては、増幅反応において使用されるプライマーの１つは、ビオチニル化することができ（例えば、リバースプライマーの５’末端）、生じたビオチニル化増幅産物は、アビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされた基質に固定化されてもよい。
対立遺伝子に対する特異的な制限消化は、以下の方法で実行されてもよい。制限酵素認識部位をＰＧＲＮ核酸へ導入する変異においては、特定の制限酵素を伴う制限消化によって対立遺伝子を認識することができる。
その他の方法もＰＧＲＮ変異を検出するために使用することができる。例えば、塩基対変化を視覚化するために従来型電気泳動法および電場反転電気泳動法が使用されてもよい。さらに、大きな欠失（例えば、７４．３ｋｂ、６９．１ｋｂ、６２．９ｋｂ、２９．６ｋｂ、１１．５ｋｂ、または３．６ｋｂ）等の大きな再編成を検出するためにサザンブロット法およびハイブリダイゼーションが使用されてもよい。場合によっては、ＰＧＲＮ核酸における欠失または重複変異を検出するために、ＰＧＲＮエクソン（例えば、すべてのＰＧＲＮエクソン）のゲノムコピー数の定量ＰＣＲ分析が使用されてもよい。
哺乳動物のＰＧＲＮ核酸における変異は、哺乳動物からのサンプルにおけるＰＧＲＮポリペプチド分析によって検出することもできる。ＰＧＲＮポリペプチド分析には、以下に限定されないが免疫学的方法、クロマトグラフ法、分光法を含むいずれの適切な方法も使用され得る。例えば、変異ＰＧＲＮポリペプチドの発現をもたらすＰＧＲＮ核酸における変異は、変異ＰＧＲＮポリペプチドを認識するが野生型ＰＧＲＮポリペプチドは認識しない抗体を使用して哺乳動物からのサンプルにおいて検出することができる。そのような抗体は、例えば、野生型ＰＧＲＮポリペプチドを認識せずに、１つ以上のアミノ酸残基の差によって野生型ＰＧＲＮポリペプチドと異なる切断型ＰＧＲＮポリペプチドまたは変異ＰＧＲＮポリペプチドを認識することができる。切断型ＰＧＲＮポリペプチドを発現させるＰＧＲＮ核酸における変異は、切断型ＰＧＲＮポリペプチド、ならびに野生型ＰＧＲＮポリペプチドを認識する抗体を使用して検出されてもよい。例えば、そのような抗体は、ウエスタンブロット法によって哺乳動物からのサンプルにおけるＰＧＲＮポリペプチドを分析するために使用することでき、それにより、短縮された野生型ＰＧＲＮポリペプチドをサイズによって区別することができる。限定されないが抹消血リンパ球のサンプルを含む哺乳動物からのいずれの適切なサンプルを使用してもＰＧＲＮポリペプチドを分析することができる。
本明細書に記載されるように、哺乳動物（例えば、ヒト）において１つ以上の変異（例えば、表１に記載された変異のうち１つ以上）を含むＰＧＲＮ核酸の存在は該哺乳動物が認知症を有することを示し得る。場合によっては、ヒトにおいて１つ以上の変異を含むＰＧＲＮ核酸の存在は、特に該ヒトが３５歳から７５歳の間で、認知症の家系を有しおよび／または認知症の症状が存在する場合には、該ヒトには認知症があることを示し得る。認知症の症状は、衝動的、反復的、強制的、またはさらには、犯罪行為をもたらす変化等の行動における変化を含む場合がある。例えば、食生活および個人衛生における変化は認知症の症状である場合がある。認知症の症状は言語機能障害を含む場合があり、正しい言葉を使用すること、物の名前をつけること、または自己を表現することの問題等の、言語表現における問題として現れることがある。読み書きの困難も発症することがある。場合によっては、哺乳動物における１つ以上の変異を含むＰＧＲＮ核酸の存在は、他の診断テストの肯定的な結果と共に、該哺乳動物が認知症であることを示し得る。例えば、ＰＧＲＮ核酸における変異の存在は、神経学的診察、神経生理学テスト、認識力テストおよび／または脳撮像の結果と共に、哺乳動物が認知症であることを示し得る。他の診断テストは、ＭＡＰＴおよび／またはアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）核酸における変異テストを含み得るが、それらに限定されない。場合によっては、哺乳動物において１つ以上の変異を含むＰＧＲＮ核酸の存在は、該哺乳動物が神経障害（例えば、新皮質および線条体内のｕｂ−ｉｒレンズ状神経細胞核内封入体（ＮＩＩ）、新皮質内の中等度から重度の表在性層状海綿状態（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｌａｍｉｎａｒ ｓｐｏｎｇｉｏｓｉｓ）、新皮質内の慢性退行性変化、新皮質内のｕｂ−ｉｒ神経突起、新皮質内の明確なｕｂ−ｉｒ神経細胞質内封入体（ＮＣＩ）、線条体内の多数のｕｂ−ｉｒ神経突起、海馬状隆起内の粒状ＮＣＩ、またそれらの任意の組み合わせを有することを示す場合がある（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅら、Ｂｒａｉｎ，１２９（Ｐｔ１１）：３０８１−９０（２００６））。
場合によっては、ＰＧＲＮ核酸における変異を含むすべての哺乳動物を、認知症発症の増大した危険性があるものとして分類してもよい。例えば、１つ以上のＰＧＲＮ核酸（例えば、表１に記載されている変異のうち１つ以上）を有するヒトは、該ヒトがいかなる年齢でも（例えば、６５、６０、５５、５０、４５、４０、または３５歳未満）、認知症の症状が見られる場合でもまたは見られない場合でも、あるいは、認知症診断テストで陽性の場合でもまたは陰性の場合でも、認知症発症の増大した危険性があるものとして分類されてもよい。場合によっては、１つ以上のＰＧＲＮ核酸を持つヒトは、該ヒトがＭＡＰＴまたはＡＰＯＥ核酸において１つ以上の変異を持ち、例えば、３５歳未満または認知症の症状が見られない場合も認知症発症の増大した危険性があるものとして分類されてもよい。
ＰＧＲＮ核酸またはＰＧＲＮポリペプチドの変異を分析することによって哺乳動物が認知症を有するかまたは認知症発症の増大した危険性を有すると同定するための方法および材料を開示することに加えて、本明細書は、ＰＧＲＮ発現のレベル（例えば、ＰＧＲＮ ＲＮＡまたはＰＧＲＮポリペプチドのレベル）を測定することによって哺乳動物が認知症を有するかまたは認知症発症の増大した危険性を有すると同定するための方法および材料を開示する。例えば、ＰＧＲＮ発現の減少したレベルを有すると同定される哺乳動物は、認知症を有すると同定するか、または認知症発症の増大した危険性を有すると同定することができる。哺乳動物からのサンプル（例えば、血液サンプル、血漿試料、脳脊髄液サンプル、または皮膚生検等の組織生検サンプル）におけるＰＧＲＮ発現のレベルは、野生型ＰＧＲＮポリペプチド、変異ＰＧＲＮポリペプチド、または野生型あるいは変異ＰＧＲＮポリペプチドのいずれのフラグメントのレベルの測定によって判断されてもよい。野生型ＰＧＲＮポリペプチドの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されているアミノ酸配列を有するヒトＰＧＲＮポリペプチドを含むが、それに限定されない。場合によっては、ＰＧＲＮ発現のレベルは、野生型ＰＧＲＮポリペプチド、変異ＰＧＲＮポリペプチド、または野生型もしくは変異ＰＧＲＮポリペプチドのフラグメントをコードするＲＮＡレベルの測定によって判断されてもよい。
ＰＧＲＮ発現のレベル（例えば、野生型ＰＧＲＮ ＲＮＡまたはポリペプチドのレベル）は、ＰＧＲＮ ＲＮＡあるいはＰＧＲＮポリペプチドのわずかな発現をもたらす、または発現なしをもたらすＰＧＲＮ核酸における変異によって減少され得る。場合によっては、ＰＧＲＮ発現のレベルは、ナンセンス変異による崩壊の影響を受けやすい変異ＰＧＲＮ ｍＲＮＡの発現をもたらすＰＧＲＮ核酸における変異によって減少されることがある。場合によっては、野生型ＰＧＲＮポリペプチド発現レベルは、変異ＰＧＲＮポリペプチドの発現をもたらすＰＧＲＮ核酸における変異によって減少されることがある。１つのＰＧＲＮ対立遺伝子のみにおける前述の変異の存在は、一般的に両方のＰＧＲＮ対立遺伝子が野生型である場合に見られる野生型ＰＧＲＮポリペプチドのレベルと、一般的に両方の対立遺伝子が変異を含む場合に見られるレベルとの中間に位置する野生型ＰＧＲＮポリペプチドのレベルをもたらし得る。
ＰＧＲＮ発現のレベルに関して本明細書で使用される「減少したレベル」という用語は、ホモ接合の野生型対立遺伝子を有する哺乳動物の任意集団（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００またはそれ以上の哺乳動物の任意集団）における野生型ＰＧＲＮポリペプチドの中間レベル未満のすべてのＰＧＲＮ発現のレベル、またはすべてのＰＧＲＮ ＲＮＡ発現レベルである。場合によっては、ＰＧＲＮ発現の「減少したレベル」は、認知症があると診断されていない各哺乳動物の任意集団（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００またはそれ以上の哺乳動物の任意集団）におけるそれぞれ野生型ＰＧＲＮポリペプチドまたはＲＮＡ発現の中間レベル未満の、野生型ＰＧＲＮポリペプチドまたはＰＧＲＮ ＲＮＡ発現のいかなるレベルであってもよい。場合によっては、ＰＧＲＮ発現の減少したレベルは、哺乳動物の任意集団（例えば、ホモ接合の野生型ＰＧＲＮ対立遺伝子を有する、および／または認知症の診断を受けたことがない集団）における野生型ＰＧＲＮ発現の平均レベルより、少なくとも１（例えば、少なくとも１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、または２．２）標準偏差低い野生型ＰＧＲＮ発現のレベルであってもよい。
場合によっては、ＰＧＲＮ発現の減少したレベルは、評価される該哺乳動物に対して年齢を適合させたおよび／またはヒトの場合においては人種を適合させた哺乳動物の任意集団（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００またはそれ以上の哺乳動物の任意集団）における野生型ＰＧＲＮ発現の中間レベル未満の野生型ＰＧＲＮ発現のレベルであってもよい。年齢を適合させた哺乳動物は、同一の年齢、または同一の年齢範囲であってよい（例えば、１５から３５歳、３５から７５歳、７５から１００歳、３５から４５歳、６０から８０歳、２０から３５歳、または４０から５０歳）。場合によっては、ＰＧＲＮ発現の減少したレベルは、評価される該哺乳動物に対して年齢を適合させたおよび／またはヒトの場合においては人種を適合させたホモ接合の野生型ＰＧＲＮ対立遺伝子を有する哺乳動物の任意集団（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００またはそれ以上の哺乳動物の任意集団）における野生型ＰＧＲＮ発現の中間レベル未満の野生型ＰＧＲＮ発現のレベルであってもよい。場合によっては、ＰＧＲＮ発現の減少したレベルは、ごくわずかな野生型ＰＧＲＮ発現のレベルであっても、または検出可能な野生型ＰＧＲＮの発現がないことであってもよい。
当然のことながら、特定のＰＧＲＮ発現レベルが減少したレベルであるか否かを決定する場合に、比較できるサンプル（例えば、血液サンプル）からのＰＧＲＮ発現レベルが使用される。例えば、特定の種の哺乳動物からの皮膚生検におけるＰＧＲＮ発現のｍＲＮＡレベルは、哺乳動物の任意集団（例えば、ホモ接合の野生型ＰＧＲＮ対立遺伝子を有する、および／または認知症の診断を受けたことがない）からの皮膚生検におけるＰＧＲＮ発現の中間ｍＲＮＡレベルと比較される。さらに、ＰＧＲＮ発現レベルは同一のまたは類似の方法を使用して測定された中間ＰＧＲＮ発現レベルと比較される。
いずれの適切な方法もＰＧＲＮ発現レベルを判断するために使用することができる。例えば、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、または定量ＰＣＲを、野生型ＰＧＲＮポリペプチドをコードするＲＮＡ分子のレベルを判断するために使用してもよい。場合によっては、質量分析法が野生型ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを判断するために使用されることがある。場合によっては、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを、抗ＰＧＲＮポリペプチド抗体に依存した方法を使用して検出してもよい。そのような方法は、ＦＡＣＳ、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学および免疫沈降を含むが、これらに限定されない。抗体系アッセイ（例えば、サンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法）は、ＰＧＲＮポリペプチドまたはそのフラグメントのアミノ末端、中央、カルボキシ末端のうち一つ以上の部分に結合する抗体の組み合わせの使用を含むことがある。抗ＰＧＲＮポリペプチド抗体は、検出のために標識されてもよい。例えば、抗ＰＧＲＮポリペプチド抗体は、放射性分子、蛍光性分子、または生物発光分子によって標識されてもよい。ＰＧＲＮポリペプチドは、ＰＧＲＮポリペプチドと結合する抗ＰＧＲＮポリペプチド抗体と結合する標識された抗体を使用して間接的に検出することもできる。
抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または一本鎖抗体、あるいはＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリによって生成されたフラグメント、ＶＬまたはＶＨドメインから成るフラグメント、または上記のいずれかのエピトープ結合フラグメント等の、結合活性を有する抗体フラグメントであってもよいが、これらに限定されない。抗体は、いかなる種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＡ２）、またはサブクラスであってもよい。さらに、抗体は鳥類および哺乳類を含むいかなる動物からであってもよい。例えば、抗体は、ヒト、ウサギ、ヒツジ、またはヤギの抗体であってもよい。抗体は、天然、組み換え型、または合成型であってもよい。抗体は、当技術分野で既知のすべての適切な方法を使用して作成され、精製されてもよい。例えば、単クローン抗体は、ハイブリドーマ、組み換え型、またはファージ提示法技術、あるいは該技術の組み合わせを使用して製造されてもよい。場合によっては、抗体フラグメントは一部の抗体配列をコードする遺伝子から合成的にまたは組み換えで生成されてもよい。抗ＰＧＲＮポリペプチド抗体は少なくとも１０４ｍｏｌ−１（例えば、少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、または１０１２ｍｏｌ−１）の親和性でＰＧＲＮポリペプチドに結合し得る。
本明細書に開示された抗ＰＧＲＮポリペプチド抗体はいずれの適切な方法を使用しても製造されてもよい。例えば、実質的に純粋ないかなるＰＧＲＮポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、変異を含むＰＧＲＮ核酸によってコードされ、切断型ＰＧＲＮポリペプチド）は、特定の抗体が製造されるように動物において免疫反応を引き出す免疫原として使用されてもよい。従って、ヒトＰＧＲＮポリペプチドまたはそれのフラグメントを免疫抗原として使用することができる。さらに、動物に免疫を与えるために使用される免疫原は、化学的に合成されるか、または翻訳ｃＤＮＡに由来してもよい。さらに、免疫原は、所望に応じて、担体ポリペプチドと複合させてもよい。通常使用される、化学的に免疫ポリペプチドと結合する担体は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および破傷風トキソイドを含むが、これらに限定されない。
ポリクローナル抗体の作成は、当業者にはよく知られている。例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ，ｉｎ ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ（Ｍａｎｓｏｎ編），１〜５ページ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９２）およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ，Ｒａｔｓ，Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｈａｍｓｔｅｒｓ，ｉｎ ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ｓｅｃｔｉｏｎ ２．４．１（１９９２）を参照のこと。さらに、当業者には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製と濃度に関する免疫学技術において一般的であるさまざまな技術が知られている（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｕｎｉｔ ９，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４）。
モノクローナル抗体の作成も当業者にはよく知られている。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）、Ｃｏｌｉｇａｎら、ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．５．１ ２．６．７、およびＨａｒｌｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、７２６ページ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８８発行）を参照のこと。簡単に説明すると、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウスに注射し、血清試料分析によって抗体生産の有無を確認し、脾臓を取り出してＢリンパ球を採取し、Ｂリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを生産し、ハイブリドーマをクローン化し、抗原に対して抗体を生産する陽性クローンを選択し、抗体をハイブリドーマ培養から単離することによって採取することができる。モノクローナル抗体は、さまざまな十分に確立した技術を使用してハイブリドーマ培養から単離して精製することができる。そのような単離技術は、プロテインＡセファロースを用いた親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーを含む。例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ ７９−１０４（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９２）のＣｏｌｉｇａｎら、ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．７．１ ２．７．１２およびｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．９．１ ２．９．３、Ｂａｒｎｅｓら、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ）を参照のこと。
該当する抗原（例えば、変異を含むＰＧＲＮポリペプチド）に対して抗体を生産するハイブリドーマクローンが選択されると、特定の特異性を有する抗体を生産するクローンに対してさらなる選択を実行することができる。例えば、全長の野生型ポリペプチドであるＰＧＲＮポリペプチドよりも短縮されたＰＧＲＮポリペプチドに選択的に結合する抗体を生産するクローンを選択してもよい。そのような抗体は、例えば、ＰＧＲＮポリペプチドの短縮された領域ではさらされるが、全長の野生型ポリペプチドでは接近できないエピトープを認識する。場合によっては、野生型ＰＧＲＮポリペプチドに結合する親和性よりも高い親和性で、１つ以上のアミノ酸の差によって対応する野生型ＰＧＲＮポリペプチドとは異なるＰＧＲＮポリペプチドに結合する抗体を生産するハイブリドーマクローンが選択されてもよい。
本明細書に記載される抗体は実質的に純粋であってもよい。抗体に関して本明細書で使用される「実質的に純粋」という用語は、抗体が、本来自然では伴う他のポリペプチド、脂質、炭水化物、核酸を実質的に含んでいないことである。つまり、実質的に純粋な抗体とは、自然環境から取り出されて少なくとも６０％純粋であるあらゆる抗体のことである。実質的に純粋な抗体は、少なくとも約６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９％純粋であり得る。
本明細書は、本明細書に提供される（例えば、ＰＧＲＮ核酸が変異を含むかどうかを判断するための）方法を実行するために使用できるキットも提供する。そのようなキットは、核酸分子（例えば、プライマーのペアまたはプローブ）、抗体（例えば、抗ＰＧＲＮポリペプチド抗体）、二次抗体、対照核酸分子（例えば、変異を含むまたは含まないＰＧＲＮ核酸）、対照ポリペプチド（例えば、野生型または変異ＰＧＲＮポリペプチド）、ＤＮＡアプタマー、マイクロアレイ、ＥＬＩＳＡプレート、またはデータ分析ソフトウェアを、任意として、本明細書に記載される方法を実行するための他のいかなる適切な試薬、ツール、または指示と共に含んでもよい。適切な情報材料は説明的、教育用、マーケティング関係の材料であっても、あるいは本明細書に記載される方法および／または本明細書に記載される方法に用いる試薬の使用に関する他の材料であってもよい。例えば、情報材料は、ヒトの遺伝分析を実行すること、その後に該ヒトが認知症を発症する危険性がある（またはない）と診断すること、および／または生存可能時間、治療に反応する可能性、あるいは生活の質に関する該ヒトの予後診断を報告することに関するものであってもよい。さらに、または代わりとなるものとしては、キットの使用者が遺伝分析の実行および結果の解釈（特にそれらが、ヒトが認知症を発症する可能性およびその後の予後診断に適用される際）に関する実質的な情報を得ることができるように、キットの情報材料は、例えば住所、Ｅメールアドレス、ウェブサイト、あるいは電話番号等の連絡先であってもよい。
キットの情報材料はいかなる形であってもよい。多くの場合では、例えば指示等の情報材料は、例えばラベルまたは印刷用紙等の、例えば印刷文字、図表および／または写真等の印刷物として提供されてもよい。情報材料は点字、コンピュータ可読の材料、録画、または録音等のその他のフォーマットで提供されてもよい。キットの情報材料はいかなるフォーマットの組み合わせとして提供されてもよい。
キットは、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、ＣＧＨ、または本明細書に記載されるその他の方法を実行するための試薬等の、遺伝分析を実行するための試薬の容器を１つ以上含んでもよい。キットは、試薬および情報材料用に個別の容器、分配器、または区画を含んでもよい。容器は、認知症の現象ならびに治療に関する、ヒトの診断および／または予後診断での使用のために標識されてもよい。
本明細書は、哺乳動物のＰＧＲＮ核酸変異の有無判定において、医学または研究の専門家を支援するための方法および材料も提供する。医学の専門家とは、例えば、医師、看護士、臨床検査室の科学技術者、薬剤師であってもよい。研究の専門家とは、例えば、主任調査官、研究技術者、博士研究員、大学院生であってもよい。専門家は、（１）サンプル中のＰＧＲＮ核酸変異の有無の判定、および（２）該変異の有無に関する情報の該専門家への通信によって、支援されてもよい。
いずれの適切な方法もその他のヒト（例えば、専門家）に情報を通信するために使用してもよい。例えば、情報は専門家に直接または間接的に提供されてもよい。さらに、いかなる通信の種類を使用して情報を通信してもよい。例えば、郵便、Ｅメール、電話、対面相互対話が使用されてもよい。情報は、専門家にとって電子的に利用可能になることによって専門家に通信されてもよい。例えば、専門家が情報にアクセスできるように情報をコンピュータのデータベースに置くことによって専門家に情報を通信してもよい。さらに、情報は、専門家の代理である病院、診療所、または研究施設に通信されてもよい。
本明細書は、ＰＧＲＮ核酸（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載される核酸配列を有するＰＧＲＮ核酸）からの少なくとも約２０個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、３００、５００つ以上のヌクレオチド）のヌクレオチド配列を有する単離された核酸も提供する。場合によっては、本明細書に提供される単離された核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載される核酸配列と比較して１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）多くの変異を含むと同時に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載される核酸配列を有するＰＧＲＮ核酸からの少なくとも約２０個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、３００、５００つ以上のヌクレオチド）のヌクレオチド配列を有し得る。そのような変異は、表１に記載されるものでもよい。例えば、単離された核酸は、表１に記載される変異を１つ有する、ヒトＰＧＲＮ核酸の３０個のヌクレオチドを含んでもよい。場合によっては、本明細書に記載されるＰＧＲＮ核酸は、短縮されたポリペプチドの発現をもたらす変異を含んでもよい。場合によっては、本明細書に提供されるＰＧＲＮ核酸は、ＰＧＲＮ核酸の第一イントロンであるイントロン０の抜き出しを阻止することによって核の保持および変異型転写物の分解をもたらす変異を含んでもよい。場合によっては、本明細書に提供されるＰＧＲＮ核酸は、ＰＧＲＮ核酸の転写を阻止する、または減少させる変異を含んでもよい。
核酸に関して本明細書に使用される「単離した」という用語は、由来する生物体の天然のゲノムにおける直接連続する両方の配列（５’末端の１つと３’末端の１つ）と直接連続していない、天然の核酸のことである。例えば、単離された核酸は、これに限定されないが、通常天然のゲノムにおける該組み換えＤＮＡ分子に直接隣接する核酸配列の１つが取り除かれているまたは欠けている限り、いかなる長さの組み換えＤＮＡ分子であってもよい。従って、単離された核酸は、別の配列と無関係である個別の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生産されたｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡフラグメント）として存在する組み換えＤＮＡ、およびベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）、または原核生物あるいは真核生物のゲノムＤＮＡに取り込まれる組み換えＤＮＡを含むが、これらに限定されない。さらに、単離された核酸は、ハイブリッドまたは融合核酸配列の一部である組み換えＤＮＡ分子を含んでもよい。
非天然の核酸配列は自然界では見られず、天然のゲノムにおける直接連続する配列が存在しないため、核酸に関して本明細書に使用される「単離された」という用語は、いかなる非天然の核酸も含む。例えば、改変核酸等の非天然の核酸は単離された核酸とされる。改変核酸は、一般的な分子クローニング技術または化学核酸合成技術を使用して作成することができる。単離された非天然の核酸は別の配列と無関係であってもよく、またはベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）、または原核生物あるいは真核生物のゲノムＤＮＡに取り込まれていてもよい。さらに、非天然の核酸は、ハイブリッドまたは融合核酸配列の一部である核酸分子を含んでもよい。
例えばｃＤＮＡまたはゲノムライブラリ、あるいはゲノムＤＮＡ制限消化を含むゲルスライス内で他の何百〜何百万もの核酸分子と共に存在する核酸が、単離された核酸とされないことは当業者には明らかであろう。
通常は、本明細書に提供される単離された核酸分子は、長さが少なくとも約２０ヌクレオチド長である。例えば、核酸は、長さが約２０〜３０（例えば、長さ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長）、２０〜５０、５０〜１００ヌクレオチド、または１００ヌクレオチド長を超える（例えば、長さ１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、または１０００ヌクレオチド長を超える）。本明細書に提供される単離された核酸は、センス配向であってもまたはアンチセンス配向であってもよく、一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよく、ＰＧＲＮ核酸配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）に対して相補的であってもよく、およびＤＮＡ、ＲＮＡ、または核酸類似体であってもよい。核酸類似体は塩基部分、糖成分、またはリン酸骨格が修飾されることにより、例えば核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善することができる。
単離された核酸は、一般的な分子クローニング技術または化学核酸合成技術を限定なく含む標準技術によって生産されてもよい。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応技術を使用して、１つ以上の変異を有するＰＧＲＮ核酸のフラグメントを含む単離された核酸を採取することができる。
本明細書に提供される単離された核酸は、診断目的で使用することができる。例えば、ＰＧＲＮ核酸の一部を含む単離された核酸（例えば、本明細書に提供される変異を１つ以上含むＰＣＲ単位複製配列）を、ＤＨＰＬＣまたは対立遺伝子特異的なハイブリダイゼーション分析において、使用してもよい。変異を含む単離された核酸は、長さ約２０ヌクレオチド長であるＰＣＲプライマーの形でも使用することができ、変異を含むＰＧＲＮ核酸の領域を増幅させることができる。さらに、変異を含む単離された核酸を（例えば、蛍光標識を使用して）標識して、変異を含むＰＧＲＮ核酸を検出するために使用してもよい。
本明細書に提供される単離された核酸は、特定の抗体が生産されるように動物において免疫反応を引き出す免疫原を生産するために使用されてもよい。例えば、切断型ＰＧＲＮポリペプチドを発現させる変異を含むＰＧＲＮ核酸を発現ベクターにクローニングし、ベクターを細胞（例えば、昆虫細胞または細菌性細胞）に導入することによって短縮されたポリペプチドを発現させてもよい。その後、短縮されたポリペプチドを細胞抽出物から精製し、ウサギ等の動物に免疫を与えるために使用することができる。その後、動物からの血清にポリクローナル抗体があるかを検査し、本明細書に記載されるようにモノクローナル抗体を採取することができる。
本明細書は、認知症等の神経変性疾患を有するかまたは発症する可能性のある（例えば、発症の増大した危険性がある）哺乳動物（例えば、ヒト）の治療に関する方法および材料も提供する。哺乳動物において、本明細書に記載される変異等の変異が１つ以上含まれると判断された場合、該哺乳動物を神経変性疾患（例えば、前頭側頭型認知症）を有するかまたは発症する可能性があるとして同定することができる。神経変性疾患とは、ニューロンが損傷を受けているいかなる状態であってもよい。神経変性疾患の例としては、アルツハイマー病、認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、パーキンソン病、ハンチントン病、卒中、運動ニューロン疾患を含むが、これらに限定されない。
本明細書に記載されるように、神経変性疾患を有するかまたは発症しやすいと同定された哺乳動物においては、該哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルが上昇するように該哺乳動物にＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸を投与することによって治療することができる。さらに、神経変性疾患を有するかまたは発症しやすいと同定された哺乳動物は、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させる薬剤、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させる薬剤の組み合わせ、またはＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸とＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させる１つ以上の薬剤との組み合わせを使用して治療することができる。
神経変性疾患を有するかまたは発症しやすい哺乳動物において、該哺乳動物にＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸を投与することによってＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる。そのような核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列を有するヒトＰＧＲＮポリペプチド等の全長ＰＧＲＮポリペプチド、またはＰＧＲＮポリペプチドの生物活性フラグメント（例えば、グラニュリンＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、グラニュリンＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）、グラニュリンＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）、グラニュリンＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）、グラニュリンＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）、グラニュリンＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）、グラニュリンＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）、またはグラニュリンＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７））をコードすることができる。ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸は、任意の適切な方法を使用して哺乳動物に投与することができる。例えば、ウイルスベクター等のベクターを使用して哺乳動物に核酸を投与することができる。
哺乳動物に核酸（例えば、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸）を投与するためのベクターは当技術分野において既知であり、標準材料（例えば、パッケージング細胞系、ヘルパーウイルス、ベクター構築物）を使用して製造することができる。例えば、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｒ．Ｍｏｒｇａｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００２）およびＶｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃｕｒｔｉｓ Ａ．Ｍａｃｈｉｄａ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００３）を参照のこと。ウイルスベースの核酸運搬ベクターは通常、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、乳頭腫ウイルス等の動物ウイルスに由来する。
レンチウイルスとは、神経細胞および非分裂細胞を感染させるために使用される、レトロウイルスの属である。アデノウイルスは、ウイルスが正常な溶菌サイクルで複製する能力を不活性化するように操作することのできる、線状二本鎖ＤＮＡを含む。アデノウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞を感染させるために使用することができる。アデノウイルスベクターは脳脊髄液内および脳内で導入および効率よく発現させることができる。アデノ随伴ウイルスも非分裂細胞を感染させるために使用することができる。筋肉細胞およびニューロンは、アデノ随伴ウイルスによる核酸運搬の効率の良い標的となり得る。ウイルスベクターとして使用できるウイルスのさらなる例としては、単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）がある。ＨＳＶ−１はニューロン遺伝子運搬ベクターとして使用することによってニューロンにおいて生涯潜伏感染を確立することができる。ＨＳＶＩ−１は大量の外来ＤＮＡ（最高３０〜４０ｋｂ）をパッケージすることができる。ＨＳＶの潜伏関連のプロモーターを使用することによって、ウイルス潜伏性期中に高レベルの核酸発現を実現することができる。
核酸運搬のベクターは、ウイルスの病原性が変化または除去されるように遺伝子を組み換えることができる。ウイルスのゲノムは、修飾することによって、感染性を上昇させおよび／またはＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸等の核酸のパッケージ化に対応させることができる。ウイルスベクターは複製可能であってもまたは複製欠損であってもよく、対応する野生型ウイルスよりも少ない数のウイルス遺伝子を含むか、またはウイルス遺伝子が全くない場合がある。
ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸に加えて、ウイルスベクターは、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸に機能的に結合された調節要素を含むことができる。そのような調節要素は、核酸の発現（例えば、転写または翻訳）を調節するプロモーター配列、エンハンサー配列、応答要素、シグナルペプチド、内部リボソーム侵入配列、ポリアデニル化シグナル、ターミネータ、または誘導要素を含むことができる。ウイルスベクターに含むことのできる要素の選択は、誘発性、標的、所望の発現レベルを限定なく含むさまざまな要因に依存する。例えば、ウイルスベクターにプロモーターを含むことによってＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸の転写を促進することができる。プロモーターは（例えばテトラサイクリンの存在下で）構造性または誘導性であってもよく、全般的または組織特異的に、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸の発現に影響を及ぼし得る。組織特異性のプロモーターは、エノラーゼプロモーター、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）プロモーター、チロシン・ヒドロキシラーゼ・プロモーターを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「機能的に結合」という用語は、調節要素を核酸に対して、コードされたポリペプチドの発現を許可または促進するように位置付けることである。例えば、ウイルスベクターは、神経細胞に特異的なエノラーゼプロモーターおよびＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸を含み得る。この場合は、エノラーゼプロモーターは、神経組織内での転写を駆動するように、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸に機能的に結合される。
ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸は、非ウイルスベクターを使用して哺乳動物に投与することができる。核酸運搬用の、非ウイルスベクターの使用の方法が当業者に既知である。例えばＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｒ．Ｍｏｒｇａｎ編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００２）を参照のこと。例えば、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸は、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸を含む核酸分子（例えば、プラスミド）の直接注入、または脂質、ポリマー、もしくはナノスフェアと錯体を形成した核酸分子の投与によって哺乳動物に投与されてもよい。
ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸は、一般的な分子クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、化学核酸合成技術、およびそのような技術の組み合わせを限定なく含む標準技術を使用して生産することができる。例えば、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲを、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸（例えば、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ）を増幅させるように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーと共に使用することができる。
場合によっては、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸は、健常な哺乳動物、神経変性疾患を有する哺乳動物、または神経変性疾患を発症しやすい哺乳動物から単離してもよい。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で記載されるアミノ酸配列を有するＰＧＲＮポリペプチド等の野生型ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸は、そのような核酸に対してホモ接合またはヘテロ接合である哺乳動物から単離してもよい。当該単離された核酸は、次いで、例えば哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルが上昇するように該哺乳動物に投与され得るウイルスベクターの作成に使用されてもよい。場合によっては、１つ以上の変異を含むＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸を哺乳動物から単離し、該１つ以上の変異を部位特異的突然変異誘発法によって変化させることにより、哺乳動物に該核酸を投与する前に該変異を除去することができる。
本明細書には、神経変性疾患を有するかまたは発症しやすい哺乳動物を、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させる薬剤を使用して治療するための方法および材料も提供される。いかなる適切な、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させる薬剤を使用しても、神経変性疾患を有するかまたは発症しやすい哺乳動物を治療することができる。適切な薬剤とは、化合物、化合物の混合物、ポリペプチド、脂質、糖質、アミノ酸類似体、核酸類似体、および細菌、植物、真菌、または動物から単離した抽出物を含む。哺乳動物においてＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤の例としては、エストロゲン、１７β−エストラジオール（Ｅ２）、エチニルエストラジオール、アンドロゲン、プロピオン酸テストステロン、エンドセリン（ＥＴ−Ｉ）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、ｃＡＭＰがある（ＬｕおよびＳｅｒｒｅｒｏ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９７（８）：３９９３−８（２０００）、ＬｕおよびＳｅｒｒｅｒｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２５６（ｌ）：２０４−７（１９９９）、Ｊｏｎｅｓら、Ｊ Ｓｏｃ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ，１３（４）：３０４−ｌ １（２００６）、Ｌｅｅら、Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ（２００６）、Ｏｎｇら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ ｌｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２９１（６）：Ｒ１６０２−１２（２００６）、ＬｕおよびＳｅｒｒｅｒｏ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９８（１）：１４２−７（２００１）、Ｓｕｚｕｋｉら、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｅｈａｖ，６８（５）：７０７−１３（２０００）、ＳｕｚｕｋｉおよびＮｉｓｈｉａｈａｒａ，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ，７５（ｌ）：３１−７（２００２）、Ｓｕｚｕｋｉら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，２９７（３）：１９９−２０２（２００１）；Ｓｕｚｕｋｉら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，２４２（３）：１２７−３０（１９９８）、Ｗａｎｇら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１２（ｌ）：４９−５６（２００６）、Ｋａｍｒａｖａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２４（４７）：７０８４−９３（２００５））。場合によっては、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤は、哺乳動物細胞内のゴルジ体の活性を上昇させることができる薬剤であり得る。
哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤は、シクロオキシゲナーゼ酵素を標的とする（例えば、抑制する）非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ＮＳＡＩＤ誘導体、ＮＳＡＩＤ類似体も含む。例えば、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤はアリールプロピオン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アミノカルボン酸誘導体を含む。場合によっては、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤は、イブプロフェン、フルフェナム酸、インドメタシン、ジクロフェナク、ナプロキセン、またはアスピリン等のサリチル酸塩であってもよい。
ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤は、ＰＰＡＲα受容体、ＰＰＡＲβ（別名ＰＰＡＲδ）受容体および／またはＰＰＡＲγ受容体を活性化させる薬剤であり得る（Ｈｅｎｅｋａら、Ｂｒａｉｎ，１２８：１４４２−１４５３（２００５））。ＰＰＡＲα受容体、ＰＰＡＲβ受容体、ＰＰＡＲγ受容体サブタイプに対して特異的であるさまざまなＰＰＡＲアゴニストが報告されている。そのような薬剤の例としては、ＰＰＡＲαフィブレート化合物（例えば、ゲムフィブロジル、クロフィブレート、フェノフィブレート、ＧＷ７６４７）、チアゾリジンジオン（例えば、ロサグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、シグリタゾン、ＧＷ１９２９）等のＰＰＡＲγ化合物、Ｌ−１６５，０４１およびＧＷ５０１５１６等のＰＰＡＲδアゴニスト、ＬＹ１７１８８３等の全ＰＰＡＲアゴニストがあるが、これらに限定されない。
ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤は、ＰＰＡＲ受容体経路内の細胞成分の活性を変化させることができる天然分子または合成分子であってもよい。そのような薬剤は、例えば、ＰＰＡＲアゴニストを直接または間接的に介して、ＰＰＡＲ受容体の活性を上昇させることができる。場合によっては、薬剤は、１つ以上のＰＰＡＲ受容体サブタイプのレベルを上昇させることによって、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる。場合によっては、薬剤は、ＰＰＡＲ受容体コファクターとしての機能を果たすこと、またはＰＰＡＲ受容体コファクターの活性を変化させることによってＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる。ＰＰＡＲ活性に影響を及ぼすことができる薬剤の例としては、レチノイン酸および（レチノイン酸の前駆体である）ビタミンＡ等の化合物、ならびにＰＰＡＲγコアクチベータ１α（ＰＣＧ−ｌα）およびＰＰＡＲγコアクチベータ１β（ＰＣＧ− １β、ＦｉｎｃｋおよびＫｅｌｌｙ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１１６：６１５−６２２（２００６））等のポリペプチド・コファクターがある。特定の作用機序に限定されず、レチノイン酸およびビタミンＡ等の薬剤は、レチノイン酸活性化受容体（例えば、ＲＡＲおよびＲＸＲ）に結合して活性化させることによって、ＰＰＡＲ活性を増強することができ、ＰＰＡＲ受容体の活性を促進するようにＰＰＡＲ受容体とヘテロ二量体化し得る。場合によっては、ＰＣＧ−１αまたはＰＣＧ−１βの発現を上昇させることによって、ＰＧＲＮポリペプチド等のＰＰＡＲ標的の発現を促進することができる。コファクター活性は、薬理作用のある物質または核酸を投与することによって上方制御してもよい。例えば、ＰＰＡＲ受容体またはＰＰＡＲ受容体コアクチベータをコードする配列を含む、本明細書に記載されるアデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスベクター等のウイルスベクターを使用して、哺乳動物に組み換えウイルス粒子を（例えば、注射で）投与することによって受容体またはコアクチベータを過剰に発現させることができる。場合によっては、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルは、ＰＧＲＮポリペプチド（例えば、１つ以上の生物活性ＰＧＲＮポリペプチドのフラグメントまたは合成ＰＧＲＮポリペプチド）の直接投与によって上昇させることができる。例えば、神経変性疾患を有するかまたは神経変性疾患発症の増大した危険性のある哺乳動物（例えば、ヒト）は、ＰＧＲＮポリペプチド、またはさまざまなＰＧＲＮポリペプチドのカクテルを用いて治療することができる。そのようなカクテルには、以下から２つ以上のものを含み得る。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４に記載されるアミノ酸分裂を有するＰＧＲＮポリペプチド。
ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤は、天然物か、または既存化合物に由来するものあるいは既存化合物から合成されたものでもよい。例えば、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤は、産物がペルオキシゾーム増殖活性化受容体経路に対して活性を持つことが知られている天然物ライブラリまたは合成物ライブラリに由来してもよい。これらの産物はＰＰＡＲ受容体を活性化させるか、または１つ以上のＰＰＡＲ受容体の発現を増加させることができる。ＰＰＡＲ受容体を活性化させるか、または発現を増加させることができる天然物の例としては、ターメリック中のクルクミノイドおよびセスキテルペノイド、ブドウ抽出物中のオメガ３脂肪酸、レスベラトロールおよびアントシアニン、ニンジンからのジンセノサイド、サラシア・オブロンガ根の抽出物、サジオモダカ（ｚｅ ｘｉｅ／ｅｕｒｏｐｅａｎ ｗａｔｅｒｐｌａｎｔａｉｎ）の抽出物、ニチニチソウ（ｍａｄａｇａｓｃａｒ ｐｅｒｉｗｉｎｋｌｅ）の抽出物、ショウブ（ｓｗｅｅｔ ｃａｌａｍｕｓ）の抽出物、ユーフォルビア・バルサムキリン（ｂａｌｓａｍ ｓｐｕｒｇｅ）の抽出物、ナンヨウアブラギリ（ｂａｒｂａｄｏｓ ｎｕｔ）の抽出物、マジョラム（ｍａｒｊｏｒａｍ）の抽出物、トウモロコシ（ｃｏｒｎ ｓｉｌｋ）の抽出物、トウガラシ（ｃｈｉｌｉ）の抽出物、キンポウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）の抽出物、セイヨウイラクサ（ｓｔｉｎｇｉｎｇ ｎｅｔｔｌｅ）の抽出物がある。例えば、Ｒａｕら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，６１：９５２−９５６（２００６）、Ｌｅｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，３３９：１９６−２０３（２００６）、Ｌｉら、Ｊ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，１０４：１３８−１４３（２００６）、Ｎｉｓｈｉｙａｍａら、Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，５３：９５９−９６３（２００５）、Ｈｕａｎｇら、Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２１０：７８−８５（２００６）、Ｘｉａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８０：３６７９２−３６８０１（２００５）、Ｕｌｒｉｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６６：７３４８−７３５４（２００６）を参照のこと。
ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤は、いかなる適切な商業的供給源から取得してもよい。例えば、ＰＰＡＲ活性剤、ＮＳＡＩＤ、ＮＳＡＩＤ誘導体、ＮＳＡＩＤ類似体、１７β−エストラジオール（Ｅ２）、リゾホスファチジン酸、ＥＴ−１，ｃＡＭＰ、およびそれらからなるさまざまな類似体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｂｉｏｍｏｌ（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）、またはＣｈｅｍｎａｖｉｇａｔｏｒウェブサイトから取得することができる。ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤は、当業者に既知の方法で化学合成することができる。例えば、ＮＳＡＩＤ、ＮＳＡＩＤ誘導体、ＮＳＡＩＤ類似体は、標準方法を使用して化学合成することができる。ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤は、コンピュータ内でのモデル、およびＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させるその他の薬剤の化学構造を使用して設計することもできる。細胞内のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができると同定された薬剤を、効能、選択性、薬物速度論的特性等の特性について（例えば、当業者に既知の方法を使用して薬剤の変異を合成させることによって）最適化することができる。例えば、ＣＯＸ−１受容体およびＣＯＸ−２受容体に対して改変された効能を持つＮＳＡＩＤ、ＮＳＡＩＤ誘導体、ＮＳＡＩＤ類似体を合成することができる。
細胞内のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤は、候補薬剤（例えば、合成化合物ライブラリおよび／または天然物ライブラリからのもの）を検査することにより同定することが可能である。候補薬剤を適当な商業的供給源から入手、および当業者に知られた方法により化学的に合成することができる。候補薬剤は、生体外細胞系アッセイ、無細胞系アッセイおよび／または生体内動物モデルを使用して検査し特徴づけることができる。
例えば、細胞培養を異なる量の候補薬剤（例えば、合成薬剤または天然薬剤、天然薬剤を含む抽出物あるいはそのような抽出物の活性画分）と接触させることができる。細胞を候補薬剤と接触させる前に、候補薬剤を、水、ジメチルスルホキシド、エタノール、酢酸エチル等の、生体外細胞培養研究に適切な賦形剤に溶解することができる。細胞内または細胞から分泌される、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメント（またはそれらの組み合わせ）を有するＰＧＲＮポリペプチドのレベルであり得るＰＧＲＮポリペプチドのレベルを監視し、候補薬剤を使用した治療によってＰＧＲＮポリペプチドのレベルが上昇しているかどうかを判断することができる。例えば、候補薬剤で処理された培養細胞内のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを、未処理の細胞または賦形剤のみで処理された細胞内のＰＧＲＮポリペプチドのレベルと比較することができ、かつさまざまな時点で比較することができる。候補薬剤の有効濃度も決定することができる。薬剤の有効濃度は、細胞内または細胞から分泌されたＰＧＲＮポリペプチドのレベルを、薬剤で処理されていない細胞内または細胞から分泌された対応するレベルに比較して、少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）上昇させる濃度であり得る。
ＰＧＲＮポリペプチドのレベルは、免疫沈降、ウエスタンハイブリダイゼーション、サンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）等の、適当な標準の抗体系アッセイを使用して検出することができる。抗体系アッセイは、ＰＧＲＮポリペプチドまたはそのフラグメントのアミノ末端、中央、カルボキシ末端のうち一つ以上の部分に結合する抗体の組み合わせを使用することができる。質量分析法によって、異なる形態のＰＧＲＮポリペプチドも検出することができる。ノーザンブロット法、定量ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ分析、またはインサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション等の適切な方法を使用してＰＧＲＮ ＲＮＡを測定してＰＧＲＮポリペプチドのレベルを判断することもできる。
場合によっては、神経変性疾患を有するかまたは発症しやすい哺乳動物からのリンパ芽球等の細胞を使用して、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させる候補薬剤を同定および／または特徴付けすることができる。場合によっては、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸が発現する（例えば、過剰に発現する）細胞またはＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸が過小発現する細胞を使用して、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させる薬剤を同定または特徴付けすることができる。例えば、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸を含むベクター（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列を有する、変異しているまたはしていないヒトＰＧＲＮポリペプチド）を使用して、細胞内でポリペプチドを安定的または一時的に発現させることができ（例えば、通常ＰＧＲＮポリペプチドが発現するまたはしないヒト細胞あるいは非ヒト哺乳動物細胞で）、その後、当該細胞を使用してＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させる薬剤を同定および特徴付けすることができる。場合によっては、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸またはＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸の調節領域を標的とする干渉ＲＮＡをコードする核酸を含むベクターを使用して、細胞内のＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸の発現レベルを減少させることができる。ＰＧＲＮポリペプチドが過小発現する細胞を使用して、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤を同定および特徴付けすることができる。
適当な細胞型を使用して、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤を同定および特徴付けすることができる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、線維芽細胞、神経細胞、リンパ芽球細胞、または神経膠腫細胞等の哺乳動物細胞を使用することができる。哺乳動物細胞は、ＰＧＲＮポリペプチドの天然の生産、プロセシング、または異化を行うあるいは行わないものであり得る。
細胞内のＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸の発現を発現または抑制するために使用できるベクターの例としては、アデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルスベクター等の非ウイルス・ベクターおよびウイルスベクターがあるが、これらに限定されない。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）のＧＩ番号６６８０１０７に記載のアミノ酸配列を有するマウスＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸は、ｐＡＡＶ ＮＥＷベクターの多重クローニング部位（ＭＣＳ）にクローニングすることができる。記載のいかなる血清型のヘルパーＡＡＶシステムを使用しても、ｐＡＡＶベクターをパッケージし、十分な力価の感染粒子を使用して、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸を細胞に形質導入することができる。場合によっては、ＰＧＲＮポリペプチドの生物活性に干渉しない生物学的タグを、ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に追加し、導入遺伝子の発現を監視することができる。よく使用されるタグの例としては、ｍｙｃ、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧ、ＧＦＰがある。
ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤は、ＰＧＲＮ経路中のさまざまの段階で効果を及ぼすことができる。ＰＧＲＮポリペプチドのレベルは、その生産だけでなく、除去に用いられる機構にもよる。特定の機構に限定されることなく、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルの上昇は、ＰＧＲＮポリペプチドを隔離するポリペプチドを結合する活動、またはＰＧＲＮポリペプチドの転写増加、翻訳増加、分泌増加、あるいは異化低下等のその他の細胞機構を原因としても良い。一例として、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルには、細胞内（例えば、ＰＧＲＮポリペプチドの産生部位および／または分泌経路内での作用）および細胞外（例えば、細胞表面、分泌、エンドソーム、および／またはリソソーム）のプロテアーゼ媒介の分解が関与する。
ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤は、無細胞系アッセイを使用して同定および特徴付けすることができる。例えば、無細胞系アッセイを使用して、ＰＧＲＮポリペプチドのプロセシング（例えば、ＰＧＲＮポリペプチドを生物活性フラグメント等のさまざまな形態にプロセシングする）または異化を変化させることができる薬剤を同定および特徴付けすることができる。そのような無細胞系アッセイは、精製あるいは部分的に精製された酵素製剤、またはＰＧＲＮポリペプチドを異化するかＰＲＧＮポリペプチドをフラグメントにプロセシングすることができる細胞からなる溶解物を使用して実施することができる。細胞溶解物は、例えば超音波処理または洗剤溶解等の既知の方法を使用して製造することができる。ＰＧＲＮポリペプチドを異化するまたはＰＧＲＮポリペプチドをプロセシングすることができる無細胞生体サンプル（例えば、酵素製剤または細胞溶解物等）は、基質ＰＧＲＮポリペプチドが異化またはプロセシングされる条件下で基質ＰＧＲＮポリペプチドと共にインキュベートさせてもよい。ＰＧＲＮポリペプチドのレベル上昇のための候補薬剤が、ＰＧＲＮポリペプチドのプロセシングまたは異化に効果を及ぼすかどうかを判定するために、２つの反応を比較することができる。１つの反応では、候補薬剤をプロセシングまたは異化の反応に含ませ、２つ目の反応では、候補薬剤をプロセシングまたは異化の反応に含ませないことができる。候補薬剤を含む反応でのポリペプチドのレベルを、候補薬剤を含まない反応でのレベルとを比較し、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルが上昇したかどうかを判定することができる。
ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤は、非ヒト哺乳動物（例えば、ＰＧＲＮトランスジェニックまたはＰＧＲＮノックアウト非ヒト哺乳動物）内の候補薬剤（例えば、合成化合物ライブラリからのもの）を検査して同定することができる。例えば、薬剤の存在下で上記の非ヒト哺乳動物からなる第１群でのＰＧＲＮポリペプチドのレベルを評価し、薬剤が不在の対応する対照群でのＰＧＲＮポリペプチドのレベルと比較して、薬剤投与によってＰＧＲＮポリペプチドのレベルが上昇するかどうかを判定することができる。
非ヒト哺乳動物は、例として、ラット、モルモット、マウス等の齧歯類、およびブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の家畜を含む。非ヒト哺乳動物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で記載のアミノ酸配列を有する変異しているまたはしていないヒトＰＧＲＮポリペプチドをコードする外因性核酸を含むように設計されてもよい。
すべての細胞において特定の遺伝子（例えば、ＰＧＲＮ遺伝子）が不活性化された非ヒト哺乳動物を作成するためには、所望の種の胚細胞（精子または卵子、すなわち「生殖細胞系」）にノックアウト構築物を導入することができる。ノックアウト非ヒト哺乳動物の生産に使用する核酸構築物は、標的とされる内因性核酸の領域と、一般的に相同的組み換えによる標的とされるエクソン部位の中断に使用される、選択可能なマーカーをコードする核酸配列とを含んでもよい。通常は、選択可能なマーカーの側面には、所望の挿入部位に隣接する配列と相同の配列が配置される。フランキング配列は、所望の挿入部位に直接隣接する必要はない。正の薬剤選択に適切なマーカーは、例えば、ジェネティシン（アミノグリコシド系抗生物質のＧ４１８）に抵抗性を与えるアミノグリコシド系３Ｎホスホトランスフェラーゼ遺伝子、およびハイグロマイシン抵抗性を与えるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子等のその他の抗生物質抵抗性マーカーを含む。他の選択系として、単純疱疹ウイルスからのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子等の負の選択マーカーがある。正の薬剤選択および負の薬剤選択を両方使用する構築物も使用することができる。例えば、構築物はアミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ遺伝子およびＴＫ遺伝子を含んでもよい。この系では、Ｇ４１８に耐性を示し、ガンシクロビルに対して感受性である細胞が選択される。
ＰＧＲＮノックアウト動物を作成するために使用できる標的構築物の一例として、ｌｏｘＰで囲んだ（ｆｌｏｘｅｄ）ネオマイシン耐性（ＮＥＯ）遺伝子の側面に逆配向で位置する５’相同の４．８ｋｂのフラグメントおよび３’相同の１．９ｋｂのフラグメントを含む構築物がある（図９）。標的ベクターは、Ｐｖｕ Ｉ制限消化を用いて線状化することができる。相同は、初期標的でエクソン１〜３が除去され、ｌｏｘＰで囲んだＮＥＯ（図９）と置き換えられるように配置される。ｌｏｘＰ部位は、Ｃｒｅ発現後、ＮＥＯカセットの含有が近くの遺伝子に効果を及ぼしている場合、ＮＥＯカセットを取り出せるように配置される（図９）。
条件付きＰＧＲＮノックアウト動物を作成するために使用できる標的構築物の一例として、０．８ｋｂのコード配列（エクソン１〜３）および側面に５’相同の４．８ｋｂのフラグメントと３’相同の１．９ｋｂのフラグメントが配置されるｌｏｘＰで囲んだネオマイシン耐性（ＮＥＯ）遺伝子を含む構築物がある（図８）。ＮＥＯ遺伝子は、エクソン３のイントロン下流で逆配向で置かれてもよい。この特定の配向によって、ｌｏｘＰで囲んだ染色体内のＮＥＯ遺伝子が正常の遺伝子機能に干渉したり、ＮＥＯ開始部位が起源である異常転写物をもたらしたりする可能性を低めることができる。その場所は、選択したイントロンの比較的大きいサイズによって望まれる場合がある。標的ベクターは、Ｐｖｕ Ｉ制限消化を用いて線状化することができる。ｌｏｘＰで囲んだ染色体内から生産されるＰＧＲＮポリペプチドは、通常の組成および機能性をもつように設計することができる。ｌｏｘＰで囲んだエクソン１〜３およびネオマイシンカセットをｌｏｘＰ部位のＣｒｅを介した組み換え後に除去することができ、開始部位を欠き、非機能的と予測される部分的ＰＧＲＮ遺伝子を残す（図８）。
ノックアウト非ヒト哺乳動物の生産に使用する核酸構築物は、マイクロインジェクションを用いて受精卵の前核に導入することができる。接合子が胚内のすべての細胞の分裂前駆であるため、前核融合後、発生中の胚は導入された核酸をすべての体細胞および胚細胞に持つことができる。ノックアウト構築物の標的挿入は比較的希少な事象であるため、このような取り組みを使用する際には、多数の動物を作成して検査することが望ましい。そのため、大きな細胞集団および培養細胞系の特徴を示す選択基準を使用することが有利な場合がある。培養細胞の初期集団からノックアウト動物を生産するためには、所望のノックアウト構築物を含む培養細胞によって動物全体が作成できるということが必要である。これは通常、細胞を成長中の胚の環境に置くことによって遂行される。
少なくともいくつかの細胞型を生じさせることができる細胞は「多能性」である。胚細胞を含む、胚のすべての細胞型を生じさせることができる多能性細胞は、以下「全能性」という。全能性マウス細胞株（胚性幹細胞または「ＥＳ」細胞）は、早期の胚に由来する細胞（胚盤胞）の培養を用いて単離されている。このような細胞は、胚へ取り込まれると、胚細胞を含むすべての細胞型に分化することができ、内因性ＰＧＲＮ核酸を欠く動物または部分的ＰＧＲＮ核酸を含む動物の作成に使用することができる。すなわち、培養ＥＳ細胞はノックアウト構築物を用いて形質転換することができ、ＰＧＲＮ核酸が不活性化された細胞を選択することができる。
核酸構築物は、例えばエレクトロポレーションまたはその他の標準的な方法を用いてＥＳ細胞に導入することができる。選択した細胞に遺伝子標的の事象があるかを検査することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、導入遺伝子の存在を確認するために使用することができる。
ＥＳ細胞をさらに特徴づけし、標的事象の数を判断することができる。例えば、ゲノムＤＮＡをＥＳ細胞から収集してサザン分析に使用することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（１９８９）のセクション９．３７〜９．５２を参照のこと。
ノックアウト動物を作成するには、少なくとも１つの不活性化ＰＧＲＮ対立遺伝子を含むＥＳ細胞が発生中の胚に取り込まれる。これは、マウス胚盤胞期胚の胚盤胞腔への注入、桑実胚期胚への注入、ＥＳ細胞と桑実胚期胚との共培養、またはＥＳ細胞と除核接合子との融合によって遂行することができる。得られた胚を性成熟まで育てて繁殖させ、不活性化ＰＧＲＮ対立遺伝子を持つ細胞（胚細胞を含む）からなる動物を採取することができる。元のＥＳ細胞が不活性化ＰＧＲＮ対立遺伝子に対してヘテロ接合である場合、それらの動物をいくつかお互いに繁殖させて、不活性化ＰＧＲＮ対立遺伝子に対してホモ接合である動物を作成することができる。
卵子へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを使用して、培養細胞を動物にするために必要な操作を避けることができる。受精卵は全能性であり、すなわち、代理母への着床以外のさらなる重要操作なしで成体へ成長することができる。卵子へノックアウト構築物を直接的に注入する際の相同的組み換えの可能性を増すために、少なくとも約６ｋｂの相同ＤＮＡを標的構築物に組み込むことが有用である。ノックアウト構築物を同系ＤＮＡから調製することも有用である。
マイクロインジェクション済みの卵子に由来する胚は、いくつかの方法で相同的組み換え事象の検査をすることができる。例えば、標的とされる核酸が、検出可能な（例えば、蛍光性の）遺伝子産物を生産するコーディング領域によって中断された場合、注入された卵子を胞胚期まで培養して指示薬ポリペプチドの有無に関して分析することができる。蛍光細胞を有する胚を、例えば、代理母へ着床させて出産まで成長させることができる。注入された卵子を成長させ、得られた子供からのＤＮＡは、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲを用いて相同的組み換えの証拠を分析することができる。
非ヒト哺乳動物の作成に核移植も使用することができる。例えば、胎児線維芽細胞が不活性化された内因性ＰＧＲＮ核酸を含ませるために、遺伝子を組み換えて、除核卵母細胞と融合させることができる。卵母細胞の活性化後、卵子を胞胚期まで培養して受容体へ着床させることができる。Ｃｉｂｅｌｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９８）２８０：１２５６−１２５８を参照のこと。例えば卵丘細胞および乳腺細胞を含む成体の体細胞は、それぞれマウスおよびヒツジ等の動物を生産するために使用することができる。例えばＷａｋａｙａｍａら、Ｎａｔｕｒｅ，（１９９８）３９４（６６９１）：３６９−３７４およびＷｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ，（１９９７）３８５（６６１９）：８１０−８１３を参照のこと。遺伝子組み換えの成体の体細胞から細胞核を取り出し、除核卵母細胞へ移植することができる。活性化後、卵子を２〜８細胞期または胞胚期まで培養して、適切な受容体へ着床させることができる。上記、Ｗａｋａｙａｍａら、１９９８を参照のこと。
ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤は、本明細書に記載される非ヒト哺乳動物とその他の同種の非ヒト哺乳動物との交雑からなる産物である非ヒト哺乳動物を使用して、同定または特徴付けすることができる。例えば、トランスジェニック非ヒト哺乳動物と本明細書に記載されるノックアウト非ヒト哺乳動物との交雑により、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤を同定または特徴づけするために使用できる非ヒト哺乳動物を作成することができる。トランスジェニック非ヒト哺乳動物と本明細書に記載されるノックアウト非ヒト哺乳動物との交雑によって得られる非ヒト哺乳動物は、脳機能へのＰＧＲＮ枯渇の効果およびさまざまな神経変性症状へのＰＧＲＮ枯渇の影響を調べるために使用することができる。
場合によっては、タウトランスジェニック（例えば、ＪＮＰＬ３）マウスとＰＧＲＮノックアウト（−／−）マウスとの戻し交配を実行して（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ＋／−）および（ＪＮＰＬＳ）（ＰＧＲＮ−／−）マウスを生産して、タウ症状に関する神経変性の現象へのＰＧＲＮ枯渇の影響、またはＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤の同定あるいは特徴付けに使用することができる。マウスを同じ背景系統（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６）で維持し、遺伝的差異を最小限に抑えることができる。第１回の繁殖で、半接合のＪＮＰＬマウスをＰＧＲＮヌルマウスと繁殖させ、結果として５０％半接合（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ＋／−）のマウスと５０％ＰＧＲＮ＋／−のマウスを得ることができる。半接合の子孫（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ＋／−）をＰＧＲＮ−／−系へ戻し交配し、２５％（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ−／−）、２５％（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ＋／−）、２５％ＰＧＲＮ−／−、および２５％ＰＧＲＮ＋／−のマウスを作成することができる。ＪＮＰＬ３マウスをＰＧＲＮ＋／＋マウスを交雑させ、（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ＋／＋）マウスを作成することができる。（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ＋／−）マウス、（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ−／−）マウスおよび／または（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ＋／＋）マウスに候補薬剤または賦形剤のみを投与し、各マウスのＰＧＲＮポリペプチドのレベルを測定し、レベルを比較して候補薬剤の投与によってＰＧＲＮポリペプチドのレベルが上昇するかどうかを判定して、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤を同定または特徴づけすることができる。
場合によっては、ＰＧＲＮ−／−非ヒト哺乳動物と、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）ポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物とを交雑させ、ＰＧＲＮ変異患者およびＦＴＬＤまたはＡＬＳ患者で見られるＴＤＰ−４３ポリペプチドを含む神経ポリペプチド封入体の形成とＰＧＲＮ枯渇との相互作用の研究に有用な非ヒト哺乳動物を作成することができる。ＰＧＲＮ−／−非ヒト哺乳動物と、ＴＤＰ−４３ポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物との交雑で得られる非ヒト哺乳動物は、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇することができる薬剤の同定または特徴づけにも使用することができる。場合によっては、ＰＧＲＮ−／−非ヒト哺乳動物と、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ；米国特許第５，８７７，３９９号参照）を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物とを交雑させ、アミロイド沈着へのＰＧＲＮ枯渇の影響の研究または哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤の同定あるいは特徴づけに有用な、非ヒト哺乳動物を作成することができる。
場合によっては、本明細書に記載されるウイルスベクター等のベクターの使用によりＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸の発現が減少した非ヒト哺乳動物を使用して、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤を同定または特徴づけることができる。例えば、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする内因性核酸または内因性核酸の調節領域を標的とするアンチセンスあるいは干渉ＲＮＡをコードする核酸を含むウイルスベクターを、非ヒト哺乳動物に投与し、ＰＧＲＮポリペプチドの発現を減少させることができる（例えば、十分な力価の組み換えウイルス粒子を哺乳動物に注入することによって）。ＰＧＲＮポリペプチドの発現レベルが低下した非ヒト哺乳動物に、候補薬剤または賦形剤のみを投与し、分析して、候補薬剤の投与によってＰＧＲＮポリペプチドのレベルが上昇するかどうかを判断することができる。場合によっては、変異を有する、あるいは有さないＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸が発現する（例えば、過剰に発現する）非ヒト哺乳動物を使用して、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤を同定または特徴づけることができる。変異を有する、または有さないＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸は、（例えば、トランスジェニック非ヒト哺乳動物における）導入遺伝子であってもよい。または、本明細書に記載されるウイルスベクター等のベクターを使用して非ヒト哺乳動物に送達されてもよい。例えば、ＰＧＲＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを使用して、非ヒト哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチド（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で記載のアミノ酸配列を有するヒトＰＧＲＮポリペプチド）を発現させ、非ヒト哺乳動物を使用して、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤を同定または特徴づけすることができる。
本明細書は非哺乳動物のＰＧＲＮノックアウト動物も提供する。それらの動物としては、少なくとも１つの不活性化ＰＧＲＮ対立遺伝子を有するシー・エレガンスおよびゼブラフィッシュを含んでもよい。非哺乳動物のＰＧＲＮノックアウト動物を使用して、ＰＧＲＮ枯渇の生物学的効果を調べる、またはＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤を同定あるいは特徴付けすることができる。
ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤、ＰＧＲＮポリペプチド（例えば、生物活性ＰＧＲＮポリペプチド）、またはそれらの任意の組み合わせを、神経変性疾患を有すると同定された哺乳動物に投与して、障害の症状の重症度または障害の悪化を軽減することができる。本明細書に提供する方法および材料と共に組み合わせて使用できる認知症治療のさらなる例としては、抗精神病薬（例えば、ドーパミンの効果を阻害できる薬）、精神安定剤、および言語障害に即応して新しいコミュニケーションの取り方を覚えるための言語療法があるが、これらに限定されない。
認知症発症の増大した危険性があると同定された哺乳動物は、本明細書に提供される方法等の適切な診断法、または本明細書に提供されるいずれの方法の組み合わせを使用して、認知症症状を監視し、定期的に認知症の有無を評価することができる。さらに、哺乳動物に認知症が発生する前に、認知症発症の増大した危険性がある哺乳動物に対して、介護の計画を立てることができる。認知症発症の増大した危険性があると同定されたヒトは、カウンセリングを受け、認知症について教育を受けることができる。認知症発症の増大した危険性がある哺乳動物が、認知症症状を持つようになると、哺乳動物の治療、例えば症状の管理が行われ得る。場合によっては、認知症を発症する危険性がある哺乳動物を、例えば本明細書に記載の１つ以上の治療法を使用して、予防的に治療することができる。例えば、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤、ＰＧＲＮポリペプチド（例えば、生物活性ＰＧＲＮポリペプチド）、またはそれらの任意の組み合わせを、神経変性疾患を発症しやすいと同定された哺乳動物に投与して、神経変性疾患またはその１つ以上の症状の発症を予防あるいは遅延させることができる。
場合によっては、ＰＰＡＲアゴニスト、ＮＳＡＩＤ、またはそれらの任意の組み合わせを、神経変性疾患を有するかまたは発症しやすい哺乳動物に投与することができる。場合によっては、ウイルスベクターを使用して、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸を、神経変性疾患を有するかまたは神経変性疾患を発症しやすい哺乳動物に投与することができる。場合によっては、治療を必要とする哺乳動物にＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸を、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる１つまたは２つ以上の薬剤と共に投与することができる。場合によっては、治療を必要とする哺乳動物に、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる１つまたは２つ以上の薬剤をＰＧＲＮポリペプチドと共に投与することができる。場合によっては、ＰＧＲＮポリペプチド（例えば、生物活性ＰＧＲＮポリペプチド）を、神経変性疾患を有するかまたは神経変性疾患を発症しやすい哺乳動物に投与することができる。
ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤、またはＰＧＲＮポリペプチド（例えば、生物活性ＰＧＲＮポリペプチド）を、個別にまたは組み合わせて投与することができる。例えば、それぞれがＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤の組み合わせを含む組成物を、神経変性疾患の治療を必要とする哺乳動物に投与することができる。そのような組成物は、ＮＳＡＩＤおよびＰＰＡＲアゴニストを含んでもよいが、これらに限定されない。薬剤の組み合わせを含む組成物は、薬学的に許可される賦形剤等の付加成分を含んでもよいが、これに限定されない。薬学的に許可される賦形剤とは、例えば、生理食塩水、水、乳酸、またはマンニトールであり得る。
核酸、薬剤、ＰＧＲＮポリペプチド（例えば、生物活性ＰＧＲＮポリペプチド）は、経腸的投与（例えば、経口投与）、非経口的投与（例えば、皮下投与、静脈内投与、皮内投与、筋内投与、または腹腔内投与）、脳内投与（例えば、脳室内投与、くも膜下投与、または嚢内投与）、または鼻内投与（例えば、鼻内吸入）等の適切な経路を通して哺乳動物に投与されてもよい。投与経路の１つとして哺乳動物の脳内への直接投与があるが、ウイルスベクター、薬剤、またはＰＧＲＮポリペプチドは、例えば、脳を標的として静脈内投与するか、または血液脳関門を通過するように改変されてもよい。
いかなる適切な方法を使用してウイルスベクターに脳内を標的とさせることもできる。例えば、アデノウイルスの繊維ノブまたはレンチウイルスの外膜タンパク質は、脳特異的またはニューロン特異的な受容体を認識するリガンド（例えば、抗体または抗体のフラグメント）を付着させて修飾することができる。分子による血液脳関門の通過を助長する方法を使用し、（例えば、カプリン酸ナトリウムを使用した）受動拡散または受容体を介した飲食作用（例えば、ウイルス粒子の、例えば、抗トランスフェリン抗体またはプトレッシンへの付着）を活用することができる。ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸を持つウイルスベクターの発現を、脳に対して特異的あるいはニューロンに対して特異的なプロモーターおよび／または転写調節要素を使用して脳を標的とすることもできる（例えば、米国特許５，９７６，８７２号または第６，０６６，７２６号参照）。ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸の神経細胞特異的な発現に有用なプロモーターの一例として、プリオン・プロモーターがある。
組み換えウイルスおよびＰＧＲＮポリペプチドは、生物活性を安定させる薬剤が存在するまたは存在しない状態で投与することができる。例えば、組み換えウイルスまたはＰＧＲＮポリペプチドはペグ化、アセチル化、または双方に行ってもよい。場合によっては、ＰＧＲＮポリペプチドは、経口投与を可能とするまたは複合ポリペプチドの薬物動態プロファイルあるいは薬理学的プロファイルを改善する短い両親媒性オリゴマー等のオリゴマーに共有結合することができる。オリゴマーとしては、水溶性ポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）および脂溶性アルキル（低級脂肪酸ポリマー）を含み得る。例えば、国際特許出願公開番号第ＷＯ ２００４／０４７８７１号を参照のこと。
ウイルスベクター（例えば、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸を含むもの）、薬剤（例えば、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる候補薬剤または薬剤）、ＰＧＲＮポリペプチド（例えば、生物活性ＰＧＲＮポリペプチド）、またはそれらの任意の組み合わせを含む組成を、非経口的投与または脳内投与用に、無菌の水性担体または非水性担体を含む液体（例えば、溶液、溶媒、懸濁液、乳液）として製造することができる。水性担体としては、水、アルコール、生理食塩水、緩衝液があるが、これらに限定されない。非水性担体としては、プロピレングリコール、植物油、注射用有機エステルがあるが、これらに限定されない。例えば、抗菌剤、抗酸化物質、キレート剤、不活性ガス等の保存料およびその他の添加物も存在してもよい。薬学的に許可される静脈内投与用の担体としては、薬学的に許可される塩または糖類を含む溶液がある。薬剤、核酸、ポリペプチドは、固形（例えば、凍結乾燥製剤）として製造されてもよく、これは、生理食塩水希釈液（例えば、０．４％または０．９％塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）等の適切な希釈剤を追加して、非経口的にまたは脳内に投与するためのものである。
経口投与に適切な剤形は、結合剤（例えば、予備ゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、賦形剤（例えば、乳糖、結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）、滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）あるいは湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）等の薬剤的に容認できる賦形剤を用いて、常法で製造された錠剤またはカプセルを含んでもよい。錠剤は技術的に既知の方法でコーティングすることができる。経口投与用の製剤は、薬剤の制御放出のために形成することができる。
鼻内製剤は液体（例えば、点鼻薬または煙霧質）または乾燥製品（例えば、粉末）とすることができる。液状および乾燥の点鼻剤のどちらも適切な吸入装置を使用して投与できる。霧状化された水性懸濁液または溶液は、適切なｐＨおよび／または張度調整の有無にかかわらず製造することができる。
ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤、ＰＧＲＮポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを、所望の結果を得るため（例えば、神経変性疾患の症状を軽減させるため）に、任意の量、頻度、期間で投与することができる。場合によっては、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤、ＰＧＲＮポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせは、神経変性疾患の症状を５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、またはそれ以上軽減させるために投与することができる。神経変性疾患の症状が軽減されているかどうかを判断するために、いかなる適切な方法を使用してもよい。例えば、認識機能障害の試験（例えば、短縮されたメンタルテストの得点（ＡＭＴＳ）またはミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ））を使用して神経変性疾患の症状（例えば、認知症）が軽減されているかどうかを判定することができる。場合によっては、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤、ＰＧＲＮポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを投与して神経変性疾患の発症を予防あるいは遅延させることができる。神経変性疾患の発症が予防または遅延されるかどうかを判断するために、いかなる適切な方法も使用することができる。例えば、神経変性疾患を発症した場合、発症年齢を、同種で同一のＰＧＲＮ遺伝子型または表現型の哺乳動物の発症年齢中央値と比較して、発症が遅延されたかどうかを判定することができる。場合によっては、発症年齢を、神経変性障害症状の発症前神経変性疾患の治療を受けていない同一の種、性別、ＰＧＲＮ遺伝子型、ＰＧＲＮ表現型、そしてヒトの場合は人種の哺乳動物の発症年齢中央値と比較することができる。
ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤、ＰＧＲＮポリペプチド（例えば、生物活性ＰＧＲＮポリペプチド）、またはそれらの任意の組み合わせの有効量は、哺乳動物に有意な毒性を引き起こさずに神経変性疾患の症状を軽減または予防することができる任意の量であり得る。通常は、薬剤の有効量は、投与後、哺乳動物に有意な毒性を引き起こさない限り、約５０μｇ以上のいかなる量であってもよい。場合によっては、薬剤またはＰＧＲＮポリペプチドの有効量は１００〜５００μｇ、１ｍｇ〜１０ｍｇ、５ｍｇ〜２０ｍｇ、１０ｍｇ〜３０ｍｇ、５０ｍｇ〜１００ｍｇ、２００〜５００ｍｇ、２００〜８００ｍｇ、または１５０〜９００ｍｇであってもよい。場合によっては、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸の有効量は、核酸を含む組み換えウイルス粒子またはプラーク形成単位（ｐｆｕ）１０３〜１０１２（例えば、約１０８）であってもよい。特定の哺乳動物が特定の量に反応しない場合、量を、例えば、２倍に増加することができる。より高い濃度を受けてから、哺乳動物の治療に対する反応性および毒性症状を監視し、それに応じて調整をすることができる。有効量はそのままであっても、または哺乳動物の治療に対する反応（例えば、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルまたは哺乳動物の認識状態）に応じてスライディング・スケールあるいは異なる量として調整してもよい。
特定用途に使用される実際の有効量はさまざまな要因に影響される得る。例えば、投与頻度、治療期間、複数の治療薬剤の使用、投与経路、障害の重症度は、実際に投与される有効量の増加または減少を必要とする場合がある。
ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤、ＰＧＲＮポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせの投与頻度は、哺乳動物に有意な毒性を引き起こさずに神経変性疾患の症状を軽減または予防することができるいかなる頻度であってもよい。例えば、投与頻度は１日に約３回〜月に約２回、週に約１回〜月に約１回、２日に約１回〜週に約１回、月に約１回〜年に２回、年に約４回〜５年に１回、または年に約１回〜一生に１回であってもよい。治療期間の投与頻度は一定であっても、変動してもよい。例えば、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを調節する薬剤は１日１回、１日２回、週５回、または週３回投与することができる。薬剤は５日間、１０日間、３週間、４週間、８週間、４８週間、１年間、１８ヶ月間、２年間、３年間、または５年間投与され得る。場合によっては、必要に応じてウイルスベクターを投与することができる。治療過程は休止期間を含んでもよい。例えば、薬剤を５日間投与してから９日間の休止期間を設定し、そのような投与計画を複数回繰り返してもよい。有効量と同様に、特定用途に使用される実際の投与頻度はさまざまな要因に影響され得る。例えば、有効量、治療期間、複数の治療薬剤の使用、投与経路、障害の重症度は、投与頻度の増加または減少を必要とする場合がある。
本明細書に提供される薬剤投与の効果的期間とは、哺乳動物に有意な毒性を引き起こさずに、神経変性疾患の症状を軽減または予防する、または特定のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを得るいかなる期間であってもよい。従って、効果的期間は数日間から数週間、数ヶ月間、または数年間までさまざまであり得る。一般的に、障害の治療の効果的期間は、数日間から数ヶ月間までの期間であり得る。場合によっては、効果的期間は個々の哺乳動物の一生であり得る。特定用途に使用される実際の効果的期間は複数の要因に影響される得る。例えば、効果的期間は投与頻度、有効量、複数の治療薬剤の使用、投与経路、障害の重症度に伴って変化する場合がある。
ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤、ＰＧＲＮポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを哺乳動物に投与する前に、哺乳動物を評価して、哺乳動物が神経変性疾患を有するかどうかまたは発症しやすいかどうかを判断することが可能である。例えば、本明細書に記載されるように哺乳動物を評価することにより、哺乳動物にＰＧＲＮ核酸の変異（例えば、本明細書に提供される変異）があるかどうか、または哺乳動物がＰＧＲＮ ＲＮＡまたはポリペプチド発現の減少したレベルを有するかどうかを判定することが可能である。ＰＧＲＮ ＲＮＡおよびポリペプチドのレベルを検出するための本明細書に記載されるアッセイは、ＰＧＲＮ発現のレベルが減少し前頭側頭型認知症またはその他の神経変性疾患を発症する危険性がある個々の哺乳動物を、検査して同定するために使用することができる。例えば、前頭側頭型認知症を有する家系員をもつ患者のリンパ芽球に対し、ＥＬＩＳＡ等の１つのアッセイまたはＥＬＩＳＡ、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット法等の一連の生物学的アッセイを使用してＰＧＲＮポリペプチドのレベルを検査することができる。哺乳動物においてＡｐｏＥ４をコードする核酸の有無を判定する試験（例えば、米国特許第５，５０８，１６７号を参照）等の他の遺伝子検査を使用して哺乳動物に神経変性疾患があるかを評価することができる。哺乳動物に神経変性疾患があるかを評価するために使用できる診断テストのさらなる例としては、神経学的診察、神経生理学テスト、認識力テスト、脳撮像があるが、これらに限定されない。本明細書に記載されるテストの組み合わせ等の適切な診断テストの組み合わせを使用して、哺乳動物に神経変性疾患があるかを評価することも可能である。
ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤、ＰＧＲＮポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを、神経変性疾患を有する哺乳動物に投与後、哺乳動物を監視して障害が治療されたかどうかを判定することが可能である。例えば、神経変性疾患を有する哺乳動物を治療前および治療後に評価することにより、障害の症状（例えば、認識機能障害）が軽減されたか（例えば、治っているか）を判定することが可能である。本明細書に記載されるように、任意の適切な方法を使用し、神経変性疾患の症状を評価することが可能である。例えば、認識力テストを治療前および治療後に実行することにより、治療によって認識機能が上昇、低下、または変化なしかどうかを判定することが可能である。画像化（例えば、ＭＲＩ）を治療前および治療後に実行することにより、治療によって例えば脳傷害の進行が減少したかどうかを判定することも可能である。治療前および治療後のＭＲＩ脳スキャンを使用して、脳容積の変化をマップすることによって神経変性疾患の進行を監視することも可能である。哺乳動物の思考、記憶、日常機能、社会的行動、社会的抑制および／または性格を治療前、治療中、治療後に観察することにより、神経変性障害の症状が改善されたか、または症状の進行が軽減されたかを判定することが可能である。
神経変性疾患を有する哺乳動物の治療によって哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルが上昇したかどうかを判定することにより、本明細書に記載される神経変性疾患の治療（例えば、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させるための薬剤または核酸の投与）の有効性を評価することも可能である。哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルは、本明細書に記載される方法等のいかなる適切な方法を使用して測定することができる。例えば、哺乳動物からの抹消血リンパ球または脳脊髄液のサンプル内のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを神経変性疾患の治療前および治療後にＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定することにより、治療によってレベルが上昇したかどうかを判定することが可能である。哺乳動物のウイルスベクターの位置または量の監視方法は知られており、例えばＰＥＴ、放射性映像、ＭＲ、または光学的画像等の技術的に既知の方法を使用した、マーカー（例えば、フルオロフォア）、レポーター遺伝子の産物（例えば、ＧＦＰ）、またはラジオアイソトープ（例えば、９９Ｔｃ）の画像化を含み得る。哺乳動物のＰＧＲＮ ＲＮＡまたはポリペプチドのレベルを測定することにより、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸を運ぶウイルスベクターの発現レベルを監視することが可能である。
場合によっては、神経変性疾患を発症する危険性がある哺乳動物を、ＰＧＲＮポリペプチドをコードする核酸、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤、ＰＧＲＮポリペプチド（例えば、生物活性ＰＧＲＮポリペプチド）、またはそれらの任意の組み合わせを用いた治療の間および治療後に評価することによって、神経変性疾患の症状の発症が（例えば、同種で、例えば同一のＰＧＲＮ遺伝子型または表現型の、障害の症状の兆候前に治療を受けていない哺乳動物の、平均発症年齢と比較して）遅延したかどうかを判断することが可能である。神経変性疾患を発症する危険性がある哺乳動物は、治療前および治療後に評価することにより、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルが上昇したかどうかを判定することも可能である。
本明細書には、哺乳動物のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることによって、精神変性疾患を有するかまたは発症しやすい哺乳動物の治療に使用できる薬剤を同定するための方法および材料も提供される。例えば、本明細書に記載される認知症の動物モデルを、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させることができる薬剤の同定に使用することができる。場合によっては、ＰＧＲＮ−／−またはＰＧＲＮ＋／−マウスとＪＮＰＬ３またはｒＴｇ４５１０トランスジェニックマウスとの交雑で作成される動物（Ｓａｎｔａｃｒｕｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９（５７３３）：４７６−８１（２００５）；Ｌｅｗｉｓら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２５（４）：４０２−５（２０００））を使用することができる。場合によっては、ＰＧＲＮ−／−またはＰＧＲＮ＋／−マウスとＳＯＤ１マウスとの交雑で作成される動物（Ｈａｌｌら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ，５３（１）：６６−７７（１９９８））を使用することができる。場合によっては、ＰＧＲＮ−／−またはＰＧＲＮ＋／−マウスとＰＳ１（Ｍ１４６Ｖ）、ＡＰＰ（Ｓｗｅ）、タウ（Ｐ３０１Ｌ）ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む三重トランスジェニックマウスとの交雑で作成される動物（Ｏｄｄｏら、Ｎｅｕｒｏｎ，３９（３）：４０９−２１（２００３））を使用することができる。神経変性疾患の治療に有用な薬剤は、本明細書に記載されるその他の非ヒト哺乳動物、またはそれらの哺乳動物を交尾させて繁殖させることによって得られる任意の哺乳動物を使用して同定することができる。例えば、ＰＧＲＮ−／−、ＰＧＲＮ＋／−、（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ−／−）および／または（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ＋／−）の非ヒト哺乳動物を使用してもよい。
通常は、非ヒト哺乳動物に神経変性障害の症状が１つ以上発現してから、哺乳動物は、ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させる候補薬剤の治療を受ける。ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを上昇させるための候補薬剤は、非ヒト哺乳動物に投与される前に適切な賦形剤に溶解することができる。賦形剤とは、薬剤が投与用に溶解される不活性溶媒であり得る。任意の薬剤において、非ヒト哺乳動物に対して適切な賦形剤が、ヒトの治療に使用される賦形剤とは異なる場合があることが認識されている。適切な賦形剤の例としては、水、ジメチルスルホキシド、エタノール、酢酸エチルがある。テストされる薬剤の濃度は、薬剤の種類および生体外でのデータに基づいて決定することができる。
本明細書に記載されるように、候補薬剤はさまざまな方法で哺乳動物に投与することができる。例えば、候補薬剤は適切な賦形剤に溶解してから、薬点滴器または注射によって直接投与することができる。候補薬剤は飲用水または飼料の成分として投与されてもよい。
非ヒト哺乳動物を候補薬剤で治療してから、哺乳動物に発現する１つ以上の神経変性疾患の症状を、治療済みおよび未治療の哺乳動物の間で比較することにより、薬剤が神経変性疾患の治療に有効かどうか（例えば、薬剤が神経変性疾患の症状の重症度を軽減させるかどうか）を判定することができる。例えば、水迷路または物体認識試験等の認識力テストを使用して治療済みおよび未治療の哺乳動物を比較することにより、治療済みの哺乳動物の認識機能が、未治療の哺乳動物に比較して改善されているかどうかを判定することができる。
候補薬剤の有効性は、治療済みおよび未治療の哺乳動物の血漿中、ＣＳＦ中および／または脳内のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを比較して評価することもできる。血漿中、脳脊髄液（ＣＳＦ）中、リンパ球中、脳内のＰＧＲＮポリペプチドのレベルは、本明細書に記載される方法等のいかなる適切な方法を使用しても判定することができる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡまたは質量分析法を内部標準または較正曲線と組み合わせて使用してＰＧＲＮポリペプチドのレベルを測定することができる。血漿およびＣＳＦは、標準方法によって哺乳動物から採取することができる。例えば、リンパ球および血漿は遠心分離によって血中から採取し、ＣＳＦは大槽をタッピングして収集し、脳組織は屠殺動物から採取することができる。
本発明は、以下の実施例でさらに説明されるが、これらの実施例は、特許請求の範囲で記載される発明の範囲を限定しない。
実施例
実施例１−１７番染色体に関連するタウ陰性前頭側頭型認知症を発生させるＰＧＲＮの変異
方法
ＰＧＲＮ遺伝子配列決定：
各研究対象家族のメンバーからのゲノムＤＮＡは、標準プロトコルを使用して全血または脳組織から単離した。ＰＧＲＮ遺伝子のすべてのコーディングエクソンは、フランキングイントロン配列に設計されたプライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅された（表２）。反応物は、最終濃度が０．８μＭおよび１０％Ｑ溶液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で各プライマーを含んだ。また、５８〜４８℃のタッチダウンプロトコルを使用して、サイクルを行った。得られたＰＣＲ生成物は、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で精製され、製造会社のプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に従ってＰＣＲプライマーおよびＢｉｇＤｙｅ精製試薬を使用して、ＡＢＩ ３７３０機器にて両方向の配列が決定された。
（表２）ＰＧＲＮ配列決定およびＰＣＲプライマー配列
Figure 0005123936
変異検証および対照スクリーニング：
Ｃ３１ＬｆｓＸ３４ ４ｂｐ挿入変異は、ＦＡＭで標識付けされたフォワードプライマー
Figure 0005123936
および標識付けされていないリバースプライマー
Figure 0005123936
を使用して、ＰＣＲ／Ｇｅｎｅｓｃａｎ分析で検証した。４００ＨＤ Ｒｏｘ標準（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に対して実施した生成物は、３６８ｂｐ（ｗｔ対立遺伝子）と３７２ｂｐ（変異）の２つのピークを認めた。ＵＢＣ１７家族と５５０人の北米の対照個人のすべての可能なサンプルが、次に同じ分析でスクリーニングされた。残りの家族の分離比分析は、疾病による変異の発生を確認するために、各家族の関連エクソンの配列決定によって実行された。すべてのＰＧＲＮコーディングエクソンの配列分析も、２００人の北米の高齢対照個人のすべての残りの変異をスクリーニングするために使用された。配列分析は、１５０人のオランダおよび９５人の英国の対照個人のＱ１２５Ｘ（オランダの家族１０８３）およびＱ４６８Ｘ（英国の家族Ｆ５３）の変異をそれぞれスクリーニングするためにも使用された。
免疫組織化学的方法：
１例はアルツハイマー病でＰＧＲＮ変異（ＵＢＣ−１７およびＵＢＣ−１５）が証明された家族、および１例は同年齢の神経学的に正常な対照個人１人、２例の家族性ＦＴＤからの前頭葉および海馬のホルマリン固定、パラフィン包埋組織薄片に対して、免疫組織化学試験が実施された。薄片（５μｍ）は、ｐＨ６．０のクエン酸バッファーで、抗原回復するために、パラフィンを取り除き、電子レンジ加熱された。ユビキチン免疫組織化学試験が、Ｖｅｎｔａｎａ ＥＳ自動染色システム（Ｖｅｎｔａｎａ，Ｔｕｓｃａｎ，ＡＺ）を使用して、ユビキチン一次抗原（抗ユビキチン、ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ；１：５００）を用いて実施されて、アミノエチルカーバゾールを使用して発色させた。ＰＧＲＮ免疫組織化学試験では、薄片は、２．５％ウマ血清で固定され（１０分間）、２．５％固定血清に希釈された一次抗体（Ｎ末端アクログラニンＮ１９；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ；１：１００；Ｃ末端アクログラニン、Ｓ−１５；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：１００；抗ＰＣＤＧＦ；Ｚｙｍｅｄ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；１：１００；純粋ヒトＰＧＲＮポリペプチド、抗ヒトプログラニュリン；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；１：５００）とともに、室温で１時間インキュベートされた。薄片は、次に、５％のビオチン化ユニバーサル二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ；１０分間）とともにインキュベートし、その後、ストレプトアビジン／ペルオキシダーゼ錯体作用溶液（５分間）ともにインキュベートして、ジアミノベンジジンを使用して発色させた（５分間）。すべてのセクションは、ヘマトキシリンで対比染色された。
リンパ芽球様細胞株におけるＰＧＲＮポリペプチドの分析：
患者および発病していない親族からのリンパ芽球様細胞が、５分間５Ｋｇで遠心分離により採取された。沈殿物は、免疫共沈降バッファーで（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１００ ｍＭ ＮａＣｌ、１５ ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ ＳＤＳ、およびプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤）再懸濁され、５分間１００℃で煮沸されて、１５秒間超音波で分解された。ウエスタンブロット分析では、同量の総タンパク量（４０μｇ）が１０％トリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上で分離されて、０．４５μｍＰＶＤＦ膜上に移された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔの５％無脂肪乳液で固定され、ヒトＰＧＲＮ（Ｎ末端、アクログラニンＮ−１９；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ；１：２００）に対する一次抗体、次にＨＲＰ共役二次抗体と混成されて、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＥＣＬ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｌｄ，ＩＬ）によって視覚化された。ＰＧＲＮレベルは、ＧＡＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ単クローン抗体；Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｃｏ，ＭＥ；１：３０００）に標準化された。直線範囲内で露出したフィルムからのバンド密度は、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅソフトウェアパッケージ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を使用して測定された。
Ｒ４１８Ｘ変異ポリペプチドの生成：
販売業者の指示に従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、野生型ＰＧＲＮ ｃＤＮＡ（イントロンを含まない）構造（ＭＧＣクローンＩＤ ２８２１８１０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で部位特定的突然変異誘発法が実施された。野生型および変異ＰＧＲＮ ｃＤＮＡ構築物は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＨｅＬａ細胞に導入された。２４時間後、細胞を取り出して、リンパ芽球細胞で説明したようにタンパク質抽出物が生成された。
ＰＧＲＮ ＲＮＡの分析：
リンパ芽球細胞および脳（小脳）のサンプルからＲＮＡが単離されて、他で（Ｏｏｓｔｈｕｙｓｅら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２８：１３１−８（２００１））説明されているように、ＳＹＢＲグリーンを使用するｑＲＴ−ＰＣＲによって分析された。小脳領域は、ＦＴＤ−１７に影響を受けないので、神経細胞の消失や小膠細胞症がＰＧＲＮ ＲＮＡレベルに影響を与えにくくなるために、小脳が使用された。ＤＮＡ汚染が検出されたシグナルに影響を与えないようにするために、ＰＧＲＮのプライマーは、イントロン１に及ぶように設計された：
Figure 0005123936
（フォワード、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）および
Figure 0005123936
（リバース、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、単位複製配列のサイズ＝１７４ｂｐ）。ＰＧＲＮ ｍＲＮＡの質量値は、２８ＳリボソームのＲＮＡ質量値に標準化されてから、発現の折畳変化を決定するように、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡによって分割された。値は、対照個人のパーセントとして表された。Ｃ３１ＬｆｓＸ３４（ＵＢＣ１７）リンパ芽球細胞および脳組織の変異と野生型ＰＧＲＮ ＲＮＡの相対レベルを決定するために、ＲＴ−ＰＣＲフラグメント分析が使用された。ＲＴ−ＰＣＲは、５’ＦＡＭ標識した
Figure 0005123936
（フォワード、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、および
Figure 0005123936
（リバース、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）プライマーで実施された。ＡＢＩ３１００ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で単位複製配列サイズが分析された。変異Ｃ３１ＬｆｓＸ３４ ＲＮＡは、野生型ＲＮＡより４ｂｐ長い生成物（１９６ｂｐ）を生成した。ＲＴ−ＰＣＲ生成物の配列分析（表２のプライマー）は、親族の脳組織およびリンパ芽球細胞の野生型に比較してＣ３ｌＬｆｓＸ３４とＲ４１８Ｘ変異ＲＮＡのレベルを分析するために使用された。Ｃ３１ＬｆｓＸ３４（ＵＢＣ１７）およびＲ４１８Ｘ（ＵＢＣ１５）の家族からのリンパ芽球細胞のＰＧＲＮ ＲＮＡレベルは、ナンセンス媒介崩壊（ＮＭＤ）阻害剤である、シクロヘキシミド処置（５００μＭ、２〜８時間）を使用する場合と使用しない場合で分析された。
ＦＴＤ−１７および正常な脳組織からの界面活性剤およびギ酸可溶性および不溶性タンパク質画分の単離：
Ｒ４１８Ｘ（ＵＢＣ １５）およびＣ３１ＬｆｓＸ３４（ＵＢＣ １７）変異のある患者の凍結された前頭葉および小脳のＰＲＧＮ種の存在および可溶性を調べるために、脳組織は、１：１００希釈のＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ、ＰＭＳＦおよびＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌｓ ＩおよびＩＩ（すべてＳｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから取得）を含む１ｍＬ／２５０ｍｇＴＮＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ Ｎａｃｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）で均質化された。対照として、発病していない対照個人であるＡＤ患者およびＰＳＰ患者からの脳ホモジネートが含まれた。均質化された抽出物の一部は、１％ＳＤＳを追加、および１５秒間超音波で溶解されて、総ＳＤＳ可溶性タンパク質として使用された。残りの均質液は、バッファー可溶性タンパク質を取得するために、４℃で３０分間１００Ｋｇで遠心分離された。沈殿物は、０．５％ＮＰ４０を含むＴＮＥで再均質化されて、界面活性剤可溶性の上澄みと不溶性の沈殿画分を取得するために、４℃で３０分間１００Ｋｇで遠心分離された。沈殿物は、さらに、１％ＳＤＳを含むＴＮＥバッファーでさらに溶解されて、４℃で３０分間１００Ｋｇで遠心分離された。不溶性ＳＤＳ沈殿物は、Ｌａｅｍｍｌｉローディングバッファーに再懸濁された。患者の凍結された前頭葉は、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む１ｍＬ／１５０ｍｇＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．５％デオキシコール酸塩、および０．１％ＳＤＳ）で均質化されて、ＲＩＰＡ溶解画分を生成するために、４℃で６０分間１００Ｋｇで遠心分離された。ＲＩＰＡ不溶性沈殿物は、７０％ギ酸で再抽出されて、超音波をかけて、４℃で６０分間１００Ｋｇで遠心分離された。水性の層が集められて、ｓｐｅｅｄｖａｃ（スピードバック）で粉状にし、１Ｘ Ｌａｅｍｍｌｉローディングバッファーで再懸濁された。次に、全体の界面活性剤とギ酸（可溶性と不溶性）の画分は、リンパ芽球様細胞株で説明したように、ウエスタンブロッティングすることによって分析された。
結果
報告された家族（Ｄ１７Ｓ１７８７−Ｄ１７Ｓ８０６）のハプロタイプ分析によって画定された３．５３ｃＭ（６．１９Ｍｂ）の臨界領域内の候補遺伝子が検査された。候補遺伝子のコーディングエクソンは、まず、ＵＢＣ１７（表３）、１７ｑ２１染色体（２ポイントＬＯＤ３．６５）への連鎖に関して非常に顕著な証拠のあるカナダのタウ陰性ＦＴＤ−１７の大家族の発病したメンバーおよび発病していないメンバーにおいて配列が決定された。８０を超える遺伝子（領域内の約１６５のうち）の分析は、病原性変異を特定することができなかった。しかしながら、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）の配列が決定されると、４ｂｐ挿入変異がエクソン１（ｃ．９０＿９１ｉｎｓＣＴＧＣ）で検出されて、３４残基（Ｃ３１ＬｆｓＸ３４）を読み取り後、コードされたポリペプチドの切断になることが予想される、コドン３１でフレームシフトを発生させた。ＰＧＲＮは、１２システイングラニュリンモチーフの７．５のタンデム反復を構成する５９３アミノ酸（６８．５ｋＤＡ）多機能成長因子である。対照的に、変異（Ｃ３１ＬｆｓＸ３４）ＰＧＲＮポリペプチドは、シグナルペプチド（アミノ酸１〜１７）を含めて長さが６５残基だけであることが予想され、原型のシステイン反復を１つも含まないことが予想される（図１）。Ｃ３１ＬｆｘＸ３４変異は、ＵＢＣ１７家族では疾病から分離され（表３、図３）、５５０人の北米の対照個人には見られなかった。これらの結果は、この変異が病原性である可能性を示した。
（表３）ＰＧＲＮに中途終止のある家族
Figure 0005123936
＃１７番染色体への連鎖がこれまでに公表されている家族。＾ＮＩＩ病理学、確認はカッコ内。＊ＩＶＳ８＋１Ｇ＞Ａ変異の予想される影響。
ＰＧＲＮの配列は、タウ陰性ＦＴＤと一貫性のある臨床および病理学特徴のある追加の４１家族の発病した個人において決定された。家族は、カナダ（７家族）、米国（８家族）、英国（１７家族）、オランダ（１家族）およびスカンジナビア（８家族）で確認された。この分析は、４１家族のうち８家族において（表３）追加の７つのＰＧＲＮ変異を特定した。それぞれの変異は、コーディング配列の中途終止を発生させることが予想される（図１）。これらの変異は、４つのナンセンス変異（Ｑ１２５Ｘ、Ｗ３８６Ｘ、Ｒ４１８ＸおよびＱ４６８Ｘ）、２つのフレームシフト変異（Ｑ１３０ＳｆｓＸ１２４およびＴ３８２ＳｆｓＸ２９）およびエクソン８の５’スプライス部位における変異（ＩＶＳ８＋１Ｇ＞Ａ）を含む。エクソン８スプライス部位変異（ＵＢＣ１９）は、ＰＧＲＮ ｍＲＮＡからエクソン８をスキップすることにつながりやすく、フレームシフト（Ｖ２７９ＧｆｓＸ４）となる。Ｑ１３０ＳｆｓＸ１２４変異は、カナダ（ＵＢＣ１１）および英国（Ｆ５３）に独立して確認された２つのＦＴＤ家族に発見された。すべての７つの変異は関連家族の疾病と分離され（表３、図３）、２００人の北米の対照個人には見られなかった。さらに、Ｑ１２５Ｘ変異（オランダの家族１０８３）は、オランダの１５０人の対照個人には見られず、Ｑ４６８Ｘ変異（イギリスの家族Ｆ３３７）は、９５人の英国の対照には見られなかった。
１７ｑ２１染色体への連鎖に対する証拠がこれまでに報告されている２つのＦＴＤ家族（ＵＢＣ１７および１０８３）は、どちらも、ＰＧＲＮの中途終止を発生させる変異を持つことが発見された（図１）。有意に、ＰＧＲＮ変異のある９家族すべては、ｕｂ−ｉｒ ＮＩＩを含む神経病理学的な所見も有した。
変異の病理学的メカニズムを調べるために、ＰＧＲＮがＰＧＲＮ変異のあるＦＴＤ患者の脳内のｕｂ−ｉｒ封入体（ＮＣＩおよびＮＩＩ）に蓄積するかどうかを決定するために免疫組織化学を使用した。ユビキチン免疫組織化学は、前頭葉の層ＩＩに神経突起およびニューロン細胞質封入体（ＮＣＩ）、海馬の歯状回顆粒細胞にＮＣＩ、および大脳新皮質にニューロン核内封入体（ＮＩＩ）を示した。ＰＧＲＮ変異（ＵＢＣ１７、ＵＢＣ１５、およびＦＴＤ１２９）のある複数のＦＴＤ家族の患者、および高齢の対照者において、ＰＧＲＮ免疫活性が皮質ニューロンのサブセットに観察された。ＰＧＲＮ免疫組織化学試験は、一部の大脳新皮質で陽性であったが、層ＩＩの大脳皮質ではＮＣＩまたはＮＩＩを染色しなかった。活性化ミクログリアは、ＦＴＤの病変領域およびアルツハイマー病の対照患者の老人斑周囲で強いＰＧＲＮ発現を示した。ＰＧＲＮポリペプチドのすべての領域を認識する抗体のパネルを使用しているにもかかわらず、ＦＴＤ−１７症例のｕｂ−ｉｒ ＮＣＩおよびＮＩＩはＰＧＲＮに対して陰性であった。しかも、切断された変異ＰＧＲＮ種のＲ４１８Ｘ（ＵＢＣ１５）およびＣ３１ＬｆｓＸ３４（ＵＢＣ１７）は、ＦＴＤ−１７患者からの脳およびリンパ芽球細胞の総タンパク質抽出では検出されなかった（図２Ｃ）。また、不溶性ＰＧＲＮ種が患者の脳組織からの界面活性剤またはギ酸の抽出画分に蓄積しているという証拠もなかった。これらの結果を考え合わせると、変異は、変異または野生型ＰＧＲＮポリペプチドの凝集をおそらく発生させていないことを示唆する。
各変異によって生成された中途終止コドン（ＰＴＣ）の場所がＮＭＤを誘発することが予想されたので、ＰＧＲＮコーディング配列の中途終止が変異ＲＮＡのナンセンス媒介崩壊（ＮＭＤ）となったのかどうかを判断するための実験が実施された。Ｒ４１８Ｘ（ＵＢＣ１５）およびＣ３１ＬｆｓＸ３４（ＵＢＣ１７）変異を保持する患者のリンパ芽球細胞から抽出されたＲＮＡの定量的ＰＣＲ分析によって、どちらも、発病していない個人からのリンパ芽球細胞に対して、総ＰＧＲＮ ＲＮＡの約５０％減少を伴うことが明らかになった（図２Ａ）。さらに、両方の家族からのＰＧＲＮ ＲＮＡは、ほとんどすべて野生型ＲＮＡを含み、変異ＲＮＡは、ほとんど検出されなかった（図２Ｂ）。ＮＭＤの阻害剤として知られているシクロヘキシミドで患者のリンパ芽球細胞を処置することによって、Ｒ４１８ＸおよびＣ３１ＬｆｓＸ３４変異ＲＮＡの選択的増加と関連付けられる（図２Ｂ）総ＰＧＲＮ ＲＮＡ（図２Ａ）のレベルが増加した。
同様の結果は、Ｃ３１ＬｆｓＸ３４（ＵＢＣ１７）およびＲ４１８Ｘ（ＵＢＣ１５）を含むリンパ芽球細胞からのＰＧＲＮ ＲＮＡの配列分析によって取得された。リンパ芽球細胞からのＲＴ−ＰＣＲ生成物の配列分析は、変異部位上で単一のピークを見せて、ＲＮＡは大部分が野生型種から構成されていることを示した。リンパ芽球細胞をシクロヘキシミド（５００μＭで８時間）で処理後、２つの変異ＲＮＡ種の増加したレベルに対応する追加配列ピークが明確に見られ、変異ＲＮＡ（Ｃ３１ＬｆｓＸ３４およびＲ４１８Ｘ）は、通常、ナンセンス媒介崩壊を引き起こすこと示す。さらに、ウエスタンブロット分析によって、野生型ＰＧＲＮポリペプチドは、発病していない親族からの抽出物に比べて、Ｒ４１８ＸおよびＣ３１ＬｆｓＸ３４リンパ芽球細胞（平均減少３４％ｐ＝０．０１、ｔテスト）からの抽出物において減少することが明らかになった（図２Ｃ）。これらの結果は、ＰＧＲＮの観察された中途終止は、ヌル対立遺伝子を作成することによって、タウ陰性ＦＴＤ−１７を発生させ、変異ＲＮＡはおそらくＮＭＤによって分解することを示唆する。これによって、機能性ＰＧＲＮの消失（ハプロ不全）となり、各変異は、ヌル対立遺伝子の作成という、同様な効果を持つために、変異の場所と臨床的表現型との間の相関関係の欠落を説明することができる。
２つのさらなる変異、Ｑ４１５ＸおよびＶ４５２ＷｆｓＸ３８が、上記のようにＰＧＲＮ遺伝子に特定された。両方の変異は、ＰＧＲＮ遺伝子のエクソン１０に位置し、両方が英国のＦＴＬＤの症例で発見された。
ここで提供される結果は、ＰＧＲＮはニューロンの生存に重要であること、およびＰＧＲＮが部分的に消失しても神経変性をまねく可能性があることを示唆する。ＰＧＲＮの変異の同定は、１０年来難問であった、つまり、１７番染色体に関係するＦＴＤの遺伝子ベースを解決し、この領域に関係する複数の家族にＭＡＰＴ変異が欠落する理由を説明する。ＰＧＲＮは、ＭＡＰＴの２Ｍｂ以内に配置されているが、両方の遺伝子の変異が、独立して、区別ができない臨床的表現型を生じさせるという事実は、推定上、特別な偶然である。
ＭＮＤのある患者では、別の分泌因子であるアンジオゲニン（ＡＮＧ）に影響を与える、機能消失が推定される変異が発見された。タウ陰性ＦＴＤおよびＭＮＤは密接に関係した条件である。３０％までのＭＮＤ患者は、前頭葉欠損を発現し、同様な割合の新しく診断されたＦＴＤ患者は、ＭＮＤの所見診断または示唆を有する。２つの疾病は、同じ家族に共存することが多く、どちらの条件も類似のｕｂ−ｉｒ病理学を有する。さらに、ＰＧＲＮとＡＮＧはどちらも、血管形成の強力な誘発剤で、腫瘍形成に関係する。これらの機能的に関連した成長因子のレベルの減少は、これらの２つの疾病の主要またはサブグループにおいて、神経変性の共通メカニズムを表すと思われる。さらに、提供された結果は、これらの因子の置換が、両方の壊滅的な状態において新しい治療計画として使用できることを示唆する。
実施例２−ユビキチン陽性前頭側頭葉変性症の原因であるＰＧＲＮの変異
患者および方法
ＰＧＲＮ変異スクリーニングのためのＦＴＬＤ患者と対照シリーズ：
Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ ＦＴＬＤシリーズは、２１０人の臨床的に診断されたＦＴＬＤ患者と１６８人の病理的に確認されたＦＴＬＤ患者の３７８患者を対象とした。認知症の平均発症年齢は、６０±１１歳（範囲３２〜８３）であった。１６８人の死亡患者では、死亡時平均年齢は、７０±１２歳（範囲３９〜９７）であった。主な症候群の臨床的診断は、ＦＴＤとＰＰＡで、まれにＳＤ、ＣＢＳおよびＦＴＤ−ＭＮＤが発生した。病理解剖された患者のうち、ＦＴＬＤ−Ｕが主な神経病理学的サブタイプ（Ｎ＝１０５、６２．５％）であった。全体的なＭａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ ＦＴＬＤシリーズには３つの患者のサブグループがあった。Ｏｌｍｓｔｅｄ Ｃｏｕｎｔｒｙコミュニティベースの認知症シリーズからの１５ＦＴＬＤ患者、ＮＩＨ支援のアルツハイマー病リサーチセンター（ＡＤＲＣ−ＦＴＬＤ委託シリーズ）へ報告された１６７人のＦＴＬＤ患者、および複数の地域委託センターから確認された１９６人の患者である。
オルムステッド（Ｏｌｍｓｔｅｄ）郡コミュニティベースの認知症シリーズ：
このシリーズは、米国ミネソタ州オルムステッド郡で集められた臨床的認知症の６４９人の患者の中から１５人のＦＴＬＤ患者（７臨床、８病理学）を含んだ。また、このシリーズは、ＡＤの可能性または推定される５３６人の患者、血管性痴呆の１０人の患者、レビー小体型認知症（ＬＢＤ）の３６人の患者およびその他の神経変性の認知症の５２人の患者も含んだ。すべてのＦＴＬＤ患者（１３人のＦＴＤと２人のＰＰＡ）は、変異スクリーニングに含められた。ＦＴＬＤ患者の発病時の平均年齢は、６５±１１歳（範囲５０〜８１歳）、死亡時平均年齢は７９±１２歳（範囲５４〜９６歳）で、６７％（１０／１５）は認知症の家族歴があった。臨床所見と画像に基づいて診断された。
ＡＤＲＣ−ＦＴＬＤ患者委託シリーズ：
このシリーズは、５つのＮＩＨ ＡＤＲＣ支援センターへの委託によって確認された１６７人のＦＴＬＤ患者がいた。このシリーズにおける認知症発病の平均年齢は、５９±１０歳（範囲３２〜８３歳）で、３８％が認知症の陽性家族歴があった。主な臨床診断は、ＦＴＤ、ＰＰＡ、ＡＤ、ＣＢＳ、ＦＴＤ−ＭＮＤ、後頭部葉萎縮および未特定の認知症を含んだ。１６７人の患者のうち２８人に病理学検証が実施され、このグループの死亡時平均年齢は７１±９歳（範囲３９〜８４歳）であった。ＦＴＬＤ−Ｕ病理学的サブタイプは、２１人の患者（７５％）で観察された。さらに、３人の患者は、後で、病理学的にＣＢＳと診断され、２人はＡＤ、および１人は、非定型進行性核上麻痺（ＰＳＰ）／ＬＢＤと診断された。ＰＧＲＮ変異スクリーニングに含まれた１６７人の患者はすべてＦＴＬＤの臨床的診断を受けた。
三次委託シリーズ：
全部で１９６人のＦＴＬＤ（６４人臨床、１３２病理）患者が、複数の三次委託センターによって確認された。ほとんどの（Ｎ＝１１２）の患者は、米国内の９つの脳バンクを介して得た。残りの８４人のＦＴＬＤ患者は海外で確認された。
対照個人：
全部で２００人の対照個人（平均年齢７６±１０歳）は、フロリダ州ジャクソンビルおよびアリゾナ州スコッツデールのＭａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃを介して確認された。
ＰＧＲＮ変異スクリーニングのためのＡＬＳ患者シリーズ：
ＡＬＳ患者シリーズは、４８人の患者から構成され、そのうちの２７人は病理学的に確認された。ＡＬＳ患者は、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｃｌｉｎｉｃ、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｊａｃｋｓｏｎｖｉｌｌｅ（Ｎ＝１７）を介して、および海外（Ｎ＝４）で集められた。病理学的に確認されたＡＬＳ患者は、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｒｅ、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｊａｃｋｓｏｎｖｉｌｌｅ（Ｎ＝１７）、Ｈａｒｖａｒｄ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ（Ｎ＝６）、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｆｅｉｎｂｅｒｇ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｎ＝１）およびＳｕｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｎ＝３）から得た。ＡＬＳの発病時の平均年齢は５７歳（範囲３０〜７５歳）で、患者の４０％にＡＬＳの家族歴が存在した。
ＰＧＲＮ遺伝子配列：
ＰＧＲＮの１２のコーディングエクソンが、他で説明されている（Ｂａｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４４２：９１６−９１９（２００６））プライマーおよびプロトコルを使用してＰＣＲによって増幅された。さらに、単一のフラグメントで３つまでのＰＧＲＮエクソンを増幅するように、ＰＧＲＮ ＰＣＲおよび配列決定プライマーが設計され、さらに高い処理分析が可能になった（表４）。非コーディングエクソン０とＰＧＲＮの３’ＵＴＲに隣接するＰＣＲプライマーも生成された（表４）。最終濃度がそれぞれ０．８μＭのＰＧＲＮエクソン１〜３および７〜９のためのＱ溶液（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）およびプライマーを追加したＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ生成物を使用して、標準の２５μＬＰＣＲ反応が実施された。ＰＧＲＮエクソン１〜３および７〜９のアニール温度は６６℃で、ＰＧＲＮエクソン４〜６および１０〜１２のアニール温度は６４℃であった。ＰＧＲＮエクソン０および３’ＵＴＲフラグメントは、それぞれ、７０〜５５℃および５８〜４８℃にてタッチダウンプロトコルを使用して、サイクルを行った。ＰＣＲ生成物は、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で精製され、製造会社のプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に従ってＢｉｇＤｙｅ精製試薬を使用して、ＡＢＩ ３７３０機器にて両方向の配列が決定された。
（表４）ＰＧＲＮ配列およびＰＣＲプライマー
Figure 0005123936
ＰＧＲＮのゲノム特性記述：
Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、単一フラグメントの完全な４ｋｂ ＰＧＲＮコーディング配列の長距離ＰＣＲによって、および代わりに、３つの重なり合う２ｋｂ ＰＧＲＮコーディング配列フラグメントのＰＣＲによって、内部ＰＧＲＮ遺伝子挿入／欠失または再編成が分析された。長距離ＰＣＲ反応は、標準のＰＣＲプロトコル（バッファー１）を使用するプライマーＧＲＮ１−３ＦおよびＧＲＮ１０−１２Ｒ（表４）およびＥｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲキットの製造会社によって推奨されるサイクル条件によって、実施された。ＰｖｕＩＩ制限酵素消化が４ｋｂＰＣＲ生成物で実施され、容易に大きさを決定することが可能な９つのフラグメント（１４６３、６０８、４７４、４４５、２７５、２７１、１８２、１４２および６３ｂｐ）になった。エクソン１〜６、エクソン４〜９およびエクソン７〜１２に及ぶ小さいほうの２ｋｂ ＰＧＲＮコーディング配列フラグメントは、高性能配列のために開発されたＧＲＮ ＰＣＲプライマー（ＧＲＮ１−３Ｆ／ＧＲＮ４−６Ｒ；ＧＲＮ７−９Ｆ／ＧＲＮ１０−１２Ｒ；ＧＲＮ４−６Ｆ／ＧＲＮ７−９Ｒ；表４）を使用して増幅された。標準の２５μＬ ＰＣＲ反応は、Ｑ溶液でＱｉａｇｅｎ ＰＲＣ生成物およびすべてのプライマーセットに対して６６〜６１℃タッチダウンプロトコルを使用して実施され、後で、ＲｓａＩ（エクソン１〜６：７２７、５８８、４６７、７９および６６ｂｐ；エクソン４〜９：８２３、３１６、２３３、２０７、１５３および９０ｂｐ；エクソン７〜１２：１１０８、２６６、２０７、１５３、１２４、９０および８３ｂｐ）で制限酵素消化される。遺伝子異常の存在を示唆する場合がある異常なバンド形成パターンを検出するためにＰｖｕＩＩおよびＲｓａＩ消化後のフラグメント（２％ゲル）および未消化（１％ゲル）ＰＣＲ生成物でアガロースゲル電気泳動が実施された。異常なパターンが検出されると、確認のためにＰＣＲ反応が繰り返され、上記のように内部ＰＧＲＮプライマーで配列分析が実施された。
ＰＧＲＮコピー数解析：
ＰＧＲＮ遺伝子の５’または３’末端またはＰＧＲＮ遺伝子全体に影響を与える変異の複製または欠失を検出するために、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）の２つの内因性遺伝子に対して、ＰＧＲＮのエクソン１および１２の遺伝子コピー数の半定量的評価が行われた。多重ＰＣＲ反応は、単一反応で４つの生成物を増幅するように設計された蛍光標識されたプライマー（表５）を含んだ。これによって、直線位相ＰＣＲで相対ピークの高さを測定することができた。２つの内因性単位複製配列のピークの高さを互いに比較することは、品質管理として機能する一方で、エクソン１と１２のＧＡＰＤＨおよびβ２Ｍ両方に対する比率は、ＰＧＲＮの相対的コピー数を決定するために使用された。６５℃のアニール温度で、２５サイクルで、２５μＬ中の５０ｎｇのＤＮＡを使用して、ＰＣＲ反応が実施された。Ｑ溶液および０．４μＭの最終プライマー濃度でＱｉａｇｅｎ試薬（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）が使用された。各サンプルは、２つの別々のＰＣＲ反応で独立して評価された。１つはサイクルあたり３０秒間の延長時間を使用して、もう一方はサイクルあたり２分間を使用した。蛍光単位複製配列は、ＧＥＮＥＭＡＰＰＥＲおよびＧＥＮＥＳＣＡＮ／ＧＥＮＯＴＹＰＥＲソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＡＢＩ３１００とＡＢＩ３７３０遺伝子分析装置で２回分析された。
（表５）ＰＧＲＮコピー数分析用のプライマー
Figure 0005123936
ハプロタイプ共有研究：
７つの異なるＰＧＲＮ変異（ｃ．２６Ｃ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ９Ａｓｐ）；ｃ．１０２ｄｅｌＣ（ｐ．Ｇｌｙ３５ＧｌｕｆｓＸ１９）；ｃ．１５４ｄｅｌＡ（ｐ．Ｔｈｒ５２ＨｉｓｆｓＸ２）；ｃ．２３４＿２３５ｄｅｌＡＧ（ｐ．Ｇｌｙ７９ＡｓｐｆｓＸ３９）；ｃ．６７５＿６７６ｄｅｌＣＡ（ｐ．Ｓｅｒ２２６ＴｒｐｆｓＸ２８）；ｃ．１２５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４１８Ｘ）およびＣ．１４７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９３Ｘ））は、複数の独立して確認された患者において特定された。同じＰＧＲＮ変異のあるＦＴＬＤ患者が共通の創始細胞を共有している可能性があるかどうかを確認するために、１７ｑ２１染色体上でＰＧＲＮ遺伝子に隣接している７．５Ｍｂの領域に及ぶ７つのＳＴＲマーカーが類型付けられた。すべてのマーカーは、１つの蛍光標識プライマーで増幅され、ＰＣＲフラグメントは自動ＡＢＩ３１００ＤＮＡ分析装置で分析された。対立遺伝子は、ＧＥＮＯＴＹＰＥＲソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してスコアされた。６つのマーカー（Ｄ１７Ｓ１８１４、Ｄ１７Ｓ１２９９、Ｄ１７Ｓ９５１、Ｄ１７Ｓ９３４、Ｄ１７Ｓ９５０およびＤ１７Ｓ８０６）に対して、対照個人（ＣＥＰＨ遺伝子型データベース；ウェブサイトｃｅｐｈｂ．ｆｒ／ｃｅｐｈｄｂ／）における共有対立遺伝子の対立遺伝子頻度を推算するために、ＣＥＰＨ対立遺伝子の頻度が使用された。マーカーＴＡＵＰＲＯＭは、
Figure 0005123936
および
Figure 0005123936
を使用して増幅されたＰＣＲであり、対立遺伝子頻度は、１８０人の関係のない対照個人の集団で推算された。
ＰＧＲＮ変異保持者におけるＡＰＯＥおよびＭＡＰＴの遺伝子型決定：
ＰＧＲＮ変異保持者は、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１４：３２８１−３２９２（２００５））上でＴａｑｍａｎ ＳＮＰ遺伝子型分析を使用するＨ２変異体ｒｓ１０５２５５３に基づいて、拡張Ｈ１およびＨ２ＭＡＰＴハプロタイプに対して遺伝子型が決定された。遺伝子型細胞は、ＳＤＳ ｖ２．２ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して作成された。ＡＰＯＥ対立遺伝子は、他で説明されるように（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，３２４：７７−７９（２００２））決定された。
ＰＧＲＮ ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析：
ＰＧＲＮの特定の新しい変異がＮＭＤまたは同様なメカニズムによって変異の消失を発生させたかどうかを決定するために、凍結脳組織が利用可能な場合、ＰＧＲＮ ＲＮＡが分析された。患者ＮＡ０５−０６４（ｃ．ｌ３８＋ｌＧ＞Ａ；ＩＶＳ１＋１Ｇ＞Ａ）、ＮＡ９９−１７５（ｃ．２６Ｃ＞Ａ；ｐ．Ａｌａ９Ａｓｐ）、ＵＢＣ１４−９（ｃ．４６３−ｌＧ＞Ａ；ＩＶＳ４−１Ｇ＞Ａ）およびＡ０２−８３（ｃ．７０８Ｃ＞Ｔ；ｐ．Ａｓｎ２３６Ａｓｎ）の前頭脳組織が均質化されて、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、総ＲＮＡが単離された。第１鎖ｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ランダム六量体およびオリゴｄＴプライマーによって、総ＲＮＡから開始して合成された。患者の変異ｃ．１３８＋１Ｇ＞Ａ（ＩＶＳ１＋１Ｇ＞Ａ）およびｃ．２６Ｃ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ９Ａｓｐ）ＰＣＲがあるエクソン１にわたるプライマーを使用して、脳のｃＤＮＡ上でＰＣＲが実施された。以下のプライマーが使用された：
Figure 0005123936
および
Figure 0005123936
さらには、サイレントｃ．７０８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｓｎ２３６Ａｓｎ）変異のある患者Ａ０２−８３のエクソン６に及ぶプライマー（
Figure 0005123936
および
Figure 0005123936
）。同じｃＥＸ４ＦとｃＥＸ８Ｒのプライマーは、イントロン４にｃ．４６３−１Ｇ＞Ａ（ＩＶＳ４−１Ｇ＞Ａ）変異がある、患者ＵＢＣ１４−９のｃＤＮＡ分析で使用された。さらに、ｃ．１２９７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４３３Ｔｒｐ）ミスセンス変異の存在に基づいて、転写された対立遺伝子の数を決定するために、エクソン１０に及ぶプライマーで、患者ＵＢＣ１４−９の脳ｃＤＮＡにＰＣＲが実施された：
Figure 0005123936
および
Figure 0005123936
。ＲＴ−ＰＣＲ生成物は、２％アガロースゲルで分析され、野生型と変異ｍＲＮＡの相対的量を決定するために配列が決定された。
結果
ＦＴＬＤおよびＡＬＳ患者シリーズにおけるＰＧＲＮ配列決定解析：
１２のすべてのコーディングエクソン、非コーディングエクソン０、コアプロモーターおよび完全な３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の直接的な配列決定により、ＦＴＬＤおよび筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者シリーズにおいてＰＧＲＮの系統的なスクリーニングが実施された。Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ ＦＴＬＤシリーズ（Ｎ＝３７８）全体で、合計で２３の異なる病原性の変異が特定され、他で説明されている変異（Ｎｅａｒｙら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５１：１５４６−１５５４（１９９８）、およびＲａｔｎａｖａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５８：１６１５−１６２１（２００２））と一致した機能性ＰＧＲＮポリペプチドの消失に明確につながる変異として画定された。１８の病原性変異がＰＧＲＮコーディング配列で発見され、５つのイントロン変異が、エクソンスプライス部位を破壊すると予想された（表６）。さらに、おそらく、非疾病関連多型を表すであろう、１３のコーディング配列変異体（７つのミスセンスおよび６つのサイレンス変異）が特定された（表７）。ＡＬＳ患者では、病原性変異は観察されなかった。さらに８つの非病原性イントロン配列変異体が特定された（表８）。
（表６）病原性ＰＧＲＮ変異のあるＦＴＬＤ家族における臨床病理所見
Figure 0005123936
Figure 0005123936
ａ †＝ＦＴＬＤ−ＡＤＲＣ委託シリーズ；††＝Ｏｌｍｓｔｅｄ−Ｃｏｕｎｔｙコミュニティベースの認知症シリーズ。
ｂＦＴＬＤＵ（ＮＩＩ）＝ユビキチン−陽性核内封入体を伴う前頭側頭葉変性症；ＮＤ＝記載なし；Ｎ／Ａ＝該当なし。
ｃＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセス番号ＡＣ００３０４３．１の逆相補体に対する番号で、ヌクレオチド１から開始。
ｄＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセス番号ＮＭ＿００２０８７．２による番号で、翻訳開始コドンから開始。
ｅＧｅｎＰｅｐｔ（登録商標）アクセス番号ＮＰ＿００２０７８．１による番号
ｆユビキチン染色は実施されなかった。
（表７）未知の有意性のＰＧＲＮコーディング配列変異体
Figure 0005123936
ａＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセス番号ＡＣ００３０４３．１の逆相補体に対する番号で、ヌクレオチド１から開始。
ｂＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセス番号ＮＭ＿００２０８７．２による番号で、翻訳開始コドンから開始。
ｃＧｅｎＰｅｐｔ（登録商標）アクセス番号ＮＰ＿００２０７８．１による番号。
（表８）ＦＴＬＤ患者および対照個人に特定されたイントロンＰＧＲＮ配列変異体のリスト
Figure 0005123936
ａＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセス番号ＡＣ００３０４３．１の逆相補体に対する番号で、ヌクレオチド１から開始。
ｂＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセス番号ＮＭ＿００２０８７．２による番号で、翻訳開始コドンから開始。
２３の病原性変異は、合計で２０の、ＰＧＲＮコーディング配列の中途終止となることが予想される変異を含んだ。このグループの変異は、ナンセンス（Ｎ＝４）、フレームシフト（Ｎ＝１２）およびスプライス部位（Ｎ＝４）変異を含んだ。切断変異は、９つの異なるエクソンのＰＧＲＮ遺伝子にわたって広がって特定されたが、エクソン１１またはエクソン１２の３’末端にはなかった（図４）。エクソン１に配置されている２つとエクソン１の５’スプライス部位に配置されている１つの３つの追加の変異は、コーディング配列の簡単な切断を発生させないと特定されたが、それにもかかわらず、病原性であることがほとんど確信される。変異ｃ．１３８＋１Ｇ＞Ａ（ＩＶＳ１＋１Ｇ＞Ａ）は、エクソン１をスプライスしないことにつながることが予想されるので、それにより、Ｍｅｔ１コドンおよび関連付けられたすべてのコザック（Ｋｏｚａｃ）配列を削除するが、その一方、ｃ．２Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｍｅｔ？）がＭｅｔ１コドンを変異させることによって正常なコザック配列を直接破壊する。第３の変異（ｃ．２６Ｃ＞Ａ；ｐ．Ａｌａ９Ａｓｐ）は、シグナルペプチド配列の疎水性コアに影響を与える。２３の病原性コーディングおよびスプライス部位の変異のどれも、配列分析によっては、２００人の無関係な対照個人において観察されなかった。家族の中で少なくとももう１人が発病していて、遺伝子テストを受けることができるＦＴＬＤ家族において、８つの異なる変異の分離分析が実施された。この分析は、すべての分析対象家族において、疾病のＰＧＲＮ変異の分離を示した（図５）。これらの家族のＦＴＬＤ患者全員に関連のＰＧＲＮ変異を認めたが、３つの異なる家族からの５人には、病原性ＰＧＲＮ変異があるが、７３歳で症状のない１人を含めて、６０歳まで疾病を発病していない。
病原性変異と対照的に、未知の疾病症状の１３のコーディング変異体のうち４つが、どちらもＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰデータベース（ウェブサイトｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ、表７）に報告されている、エクソン４のサイレント変異ｃ．３８４Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ａｓｐｌ２８Ａｓｐ；ｒｓ２５６４６）およびエクソン１１のミスセンス変異ｃ．ｌ５４４Ｇ＞Ｃ（ｐ．Ｇｌｙ５１５Ａｌａ；ｒｓ２５６４７）を含めて、対照個人において観察された。さらに、別の病原性ＰＧＲＮ変異によって既に発病している患者において、３つの変異体が検出された（表７）。ミスセンス変異ｃ．３１３Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｃｙｓ１０５Ａｒｇ）は、ＦＴＬＤ家族ＵＢＤ２０の発端者において特定された。しかしながら、４つの発病および６つの未発病の親類の配列分析は、この家族のＦＴＬＤ表現型のあるこの変異の分離を除外し、希少良性の変異体であることを示唆している。
ＰＧＲＮ領域におけるゲノム再編成の検出：
ＦＴＬＤにおける全体的なＰＧＲＮ変異頻度に対する大型ゲノム挿入／欠失変異の寄与の可能性を評価するために、１００人のＡＤＲＣ−ＦＴＬＤ委託シリーズの患者およびオルムステッド郡コミュニティベースの認知症シリーズのすべてのＦＴＬＤ患者（Ｎ＝１５）が調査された。大型の内部ＰＧＲＮ変異を検出するために、単一の４ｋｂフラグメントまたは３つの２ｋｂ重複ＰＣＲフラグメントのいずれかで、完全なＰＧＲＮコーディング領域におよぶこれらの患者の長距離ＰＣＲ分析が実施された。どちらの患者シリーズにも、ＰＧＲＮ遺伝子において大型の内部ゲノム再編成の証拠は発見されなかった。
さらに、完全なＦＴＬＤ母集団で、エクソン１および１２の半定量的ＰＣＲベース分析が実施された。これらの分析は、ＰＧＲＮ遺伝子または遺伝子全体の５’または３’末端に影響を与えるゲノム欠失または増加と一致するＰＧＲＮコピー数変化の証拠を示さなかった。
ＦＴＬＤ患者シリーズにおけるＰＧＲＮ変異の頻度：
ＰＧＲＮ遺伝子における病原性変異は、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ ＦＴＬＤシリーズの３９人の患者すなわち１０．５％に検出された（Ｎ＝３７８，表９）。同様な認知症の陽性家族歴のあるＦＴＬＤ患者のサブグループ内で（Ｎ＝１４４）、ＰＧＲＮ変異の頻度は、これよりかなり高かった（表９）。Ｍａｙｏ ＦＴＬＤシリーズの家族患者の５分の１以上（１４４人の分析患者のうち３２人または２２．２％）は、ＰＧＲＮ遺伝子の変異によって説明することが可能であった。家族歴は５つのＰＧＲＮ変異保持者で記載されていないが、ＦＴＤ表現型は、２人の患者で特発性と考えられた（表６）。シグナルペプチドに変異ｃ．２６Ｃ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ９Ａｓｐ）がある患者ＮＡ９９−１７５は、４８歳の早期に認知症の初発症状を示したが、この患者の両親は、認知症の兆候なく、６６歳および７０歳で死亡した。５６歳で発症した患者Ａ０３−５２（ｃ．６７５＿６７６ｄｅｌＣＡ；ｐ．Ｓｅｒ２２６ＴｒｐｆｓＸ２８）の場合は、１人の親は無関係な病気によって５６歳で死亡しているが、これは、陽性家族歴の欠落を説明することができる。ＦＴＬＤ診断の病理学的確認は、３０人のＰＧＲＮ変異保持者で行われた。免疫組織化学的データがある変異保持者のすべてにおいて（Ｎ＝２６）、神経病理学的所見は、ＮＩＩのあるＦＴＬＤ−Ｕと一致しており、ＦＴＬＤ−Ｕ患者の部分母集団において全体で２４．７％のＰＧＲＮ変異頻度となる。
（表９）Ｍａｙｏ ＦＴＬＤ患者シリーズにおけるＰＧＲＮ変異のタイプと頻度
Figure 0005123936
ＦＨ＋＝認知症の陽性家族歴。
Ｕｂ＋＝ユビキチン陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症の病理学的診断。
オルムステッド郡（米国ミネソタ州）で集められたコミュニティベースの認知症母集団から派生した１５人のＦＴＬＤ患者において、２つの異なるＰＧＲＮ変異が全部で３人のＦＴＬＤ患者において検出された。同じｃ．ｌ５４ｄｅｌＡ（ｐ．Ｔｈｒ５２ＨｉｓｆｓＸ２）変異のある２人の患者は、独立して確認された。しかしながら、系統学的調査によって、Ｆ１４２の大家族からの第二度近親であることが明らかになった（図５）。オルムステッド郡からのこの小規模のＦＴＬＤサブグループにおいて取得されたデータは、６４９人の患者のコミュニティベースの認知症シリーズ全体に推定することが可能であるので、すべてのタイプの認知症において、約０．５％のＰＧＲＮ変異頻度となった。ＡＤＲＣ−ＦＴＬＤシリーズでは、それぞれ異なる変異のある８人のＦＴＬＤ患者（１６７人の４．８％）に変異が特定された（表９）。重要な点は、このＡＤＲＣ−ＦＴＬＤシリーズにおいて、患者は、家族歴または神経病理学的サブタイプに基づいて選択されなかった点である。
ＰＧＲＮ変異の創始者効果：
Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ ＦＴＬＤシリーズから独立して確認された３９人の家族において、全部で２３の異なる病原性変異が特定された。最も頻繁に観察された変異は、エクソン１１に配置されるｃ．１４７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９３Ｘ）であったが、独立して確認された８人のＦＴＬＤ患者において特定された。他５つの変異が２度以上確認された。ｃ．２６Ｃ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ９Ａｓｐ）、ｃ．１５４ｄｅｌＡ（ｐ．Ｔｈｒ５２ＨｉｓｆｓＸ２）およびｃ．６７５＿６７６ｄｅｌＣＡ（ｐ．Ｓｅｒ２２６ＴｒｐｆｓＸ２８）が３人の患者において特定され、ｃ．１０２ｄｅｌＣ（ｐ．Ｇｌｙ３５ＧｌｕｆｓＸ１９）、ｃ．２３４＿２３５ｄｅｌＡＧ（ｐ．Ｇｌｙ７９ＡｓｐｆｓＸ３９）およびｃ．１２５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４１８Ｘ）は、それぞれ２人の患者において特定された（表６）。患者が共通の創始者を持っていた可能性がある同じ変異を持っているかどうかを決定するために、ＰＧＲＮ遺伝子周囲で７．５Ｍｂ領域に及ぶ７つのＳＴＲマーカーによってハプロタイプ分析が実施された。共通の１４７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９３Ｘ）変異は、家族ＰＰＡ３に特定され、さらにＤＮＡに影響を受けた１人と影響を受けていない１人がいたので、この家族において、疾病のハプロタイプが明確に再編成される。このハプロタイプをｃ．１４７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９３Ｘ）変異のある７人の追加の家族の個別の遺伝子型データと比較すると、Ｄ１７Ｓ１２９９とＴＡＵＰＲＯＭとの間の５．１Ｍｂ領域に及ぶ５つの連続的ＳＴＲマーカーに対して、すべての患者間で共有対立遺伝子が観察された（表１０）。また、共有ハプロタイプ分析は、複数の独立的に確認されたＦＴＬＤ患者において観察されたその他６つのＰＧＲＮ変異それぞれに対して、共通の遺伝的原因も裏付けた。
（表１０）８つのＦＴＬＤ家族におけるＰＧＲＮｐ．Ａｒｇ４９３Ｘ変異に対する共有ハプロタイプ分析
Figure 0005123936
ＮＤ＝未判定。
ＰＧＲＮ変異保持者の表現型：
ＰＧＲＮに病原性変異のあるＦＴＬＤ患者において、認知症の発症平均年齢は、５９±７歳（Ｎ＝３８）で、死亡平均年齢は、６５±８歳であった（Ｎ＝２９、表６）。臨床所見は、死亡年齢（７０±１２歳）は非保持者においてやや遅いが、ＰＧＲＮ変異のない患者の母集団に類似した。１７番染色体に関連付けられる常染色体優性ＦＴＬＤ−Ｕ患者から予想されるように（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅら、Ｂｒａｉｎ，１２９：８５３−８６７（２００６）、Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓら、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，７：１０６４−１０７４（２００２）、およびｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅら、Ｂｒａｉｎ，１２９：８４１−８５２（２００６））、広範囲な年齢が認知症の発症（４８〜８３歳）および死亡年齢（５３〜８７歳）の両方で観察された。初発の臨床的症状の発症とＰＧＲＮの各変異の場所との間には、明確な相関関係は見られなかった。事実、さまざまな発症年齢は、同一のＰＧＲＮ変異のある患者で観察され、ｃ．ｌ４７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９３Ｘ）変異の保持者では、発症年齢は４８から６９歳の範囲、ｃ．２６Ｃ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ９Ａｓｐ）変異では４８から６３歳の範囲であった。６８人の発症および１６人の無症状ＰＧＲＮ変異保持者に関する情報を使用して、ＰＧＲＮ変異の年齢が関係する疾病浸透率を強調する易罹病性曲線が生成され、変異保持者の５０％だけが６０歳までに発症したが、保持者の９０％以上は７０歳で発症していることを示した（図６）。臨床的に、ＦＴＤ（Ｎ＝１７）およびＰＰＡ（Ｎ＝７）は、最も頻繁に観察された診断で、言語の機能不全が、変異保持者の２４％において主に現れた症状で、これに比べてＰＧＲＮ変異のない患者ではわずか１２％であった。とりわけ、１人の患者（生存者）は、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＳ）と臨床的に診断された。２人の患者は、発作のあるアルツハイマー病（ＡＤ）の臨床診断を受け、７人の患者には、運動性疾患（パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソニズムまたはＦＴＤ−ＭＮＤ）があった。しかしながら、これらの９人の患者に対する神経病理解剖の所見は、ＦＴＬＤ−Ｕと一致した。臨床的ＦＴＬＤ診断の病理学的確認は、変異保持者の大部分に対して行われ（３０／３９、７７％）、免疫組織化学的データがある患者（２６／３０、８７％）において、細胞質性および核内性封入体両方を伴うＦＴＬＤ−Ｕ病理学を示した。
多数のＰＧＲＮ変異で観察された認知症の発症年齢のばらつき、およびＰＧＲＮ ＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃ変異に関連付けられる未完熟浸透の可能性は、ベルギーのＦＴＤ母集団で報告され（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６））、ＰＧＲＮ変異保持者におけるＦＴＬＤの臨床発現における変更因子の潜在的な影響を強調している。従って、この研究で特定されたすべての変異保持者において、ＦＴＬＤの臨床所見におけるアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）の遺伝子型およびＭＡＰＴのＨ１およびＨ２のＭＡＰＴハプロタイプ拡張の影響が分析された。拡張ＦＴＬＤ家族内またはＰＧＲＮにヌル変異のあるすべてのＦＴＬＤ患者を分析に含めたいずれの場合にも、ＭＡＰＴハプロタイプに対する、発症年齢または死亡年齢における明確な効果は観察されなかった（Ｈ１／Ｈ１保持者の発症平均年齢は５９±８歳、およびＨ１／Ｈ２保持者は５９±７歳であった）。意外なことに、少なくとも１つのＡＰＯＥε４対立遺伝子のある患者は、ＡＰＯＥε３ε３保持者（５７±７歳、Ｎ＝２９；ｐ＝０．０１対応のないｔ−検定）と比較すると、疾病発症がかなり遅い（６３±７歳、Ｎ＝１０）。
新しいＰＧＲＮ変異の機構的分析：
５人のＦＴＬＤ患者で、ＰＧＲＮのスプライス部位に影響を与える変異が特定された。これらの変異は、影響を受けたエクソンを飛ばすことにつながると予想され、コーディング配列のフレームシフトや中途終止となる。エクソン１の５’スプライス部位（ｃ．１３８＋１Ｇ＞Ａ；ＩＶＳ１＋１Ｇ＞Ａ）およびエクソン５の３’スプライス部位（ｃ．４６３−１Ｇ＞Ａ；ＩＶＳ４−１Ｇ＞Ａ）に影響を与える変異の場合、これらの変異の影響を研究するために、患者の前頭葉のｍＲＮＡを使用した。ｃ．１３８＋１Ｇ＞Ａ変異のあるＮＡ０５−０６４のＲＴ−ＰＣＲ転写物解析は、野生型転写物（４１３ｂｐ、図７）に加えて、エクソン１（２６８ｂｐ）のスキッピングに対応する異常生成物の証拠を見せた。開始メチオニン子ドンを含むエクソン１がＰＧＲＮ ｍＲＮＡに含まれていないことにより、ＰＧＲＮポリペプチドの生成を阻害することが予想され、機能的にヌルな対立遺伝子を作成する。対照的に、ｃ．４６３−ｌＧ＞Ａ（ＩＶＳ４−１Ｇ＞Ａ；図７）のある患者ＵＢＣ１４−９では、異常転写物が特定されなかった。この変異はおそらく、ＰＧＲＮ ｍＲＮＡからエクソン５のスキッピングにつながり、エクソン６（ｐ．Ａｌａｌ５５ＴｒｐｆｓＸ５６；図７）のフレームシフトおよび中途終止コドン（ＰＴＣ）となる。この変異の異常転写物の欠落が変異ＲＮＡの特定の分解（例えば、ＮＭＤによる）につながるかどうかを決定するために、この患者の脳ＲＮＡが両方のＰＧＲＮ対立遺伝子から派生したかどうかが決定された。患者ＵＢＣ１４−９からの脳ｍＲＮＡは、反対側の染色体上で発生したエクソン１０における配列変異ｃ．ｌ２９７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４３３Ｔｒｐ）の存在が確認された。患者ＵＢＣ１４−９からのゲノムＤＮＡは、疾病のハプロタイプ上でＣ−対立遺伝子分離によって、この変異に対してヘテロ接合であった。患者ＵＢＣ１４−９の前頭葉から準備されたゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡにおけるＰＧＲＮエクソン１０の配列追跡の比較によって、変異ＲＮＡ（Ｃ対立遺伝子）がないことが確認された。この研究で特定された３つの追加のスプライス部位変異は、すべて、コーディング配列のフレームシフトや中途終止を発生させることが予想され、従って、変異ＲＮＡの分解によってヌル対立遺伝子を作り出す可能性が高い。スプライス部位変異のこのグループでは、ｃ．７０８＋１Ｇ＞Ｃ（ＩＶＳ６＋１Ｇ＞Ｃ）は、エクソン６のスキッピングになることが予想され、エクソン７（Ｖａｌ２００ＧｌｙｆｓＸ１８）のフレームシフトおよびＰＴＣになるが、変異ｃ．８３６−１Ｇ＞Ｃ（ＩＶＳ７−１Ｇ＞Ｃ）およびｃ．９３３＋ｌＧ＞Ａ（ＩＶＳ８＋１０Ａ）は、どちらも、エクソン８のスキッピングになることが予想され、エクソン９（Ｖａｌ２７９ＧｌｙｆｓＸ５）の翻訳のフレームシフトおよび中途終止になる。
ミスセンス変異ｃ．２６Ｃ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ９Ａｓｐ）は、３人の独立して確認されたＦＴＬＤ患者で特定され、ＰＧＲＮシグナルペプチドの疎水性コアに存在する。変異したＰＧＲＮシグナルペプチド配列が機能的にヌルな対立遺伝子になったかどうかを決定するために、ｐ．Ａｌａ９Ａｓｐのある患者ＮＡ９９−１７５のＰＧＲＮエクソン１のゲノムＤＮＡおよび脳ｃＤＮＡ配列追跡が比較された。驚くべきことに、野生型ＲＮＡ（Ｃ対立遺伝子）に比較すると、変異ＲＮＡ（Ａ−対立遺伝子）の量にかなりの減少が検出された。
実施例３−１７ｑ２１染色体に関係するユビキチン陽性前頭側頭型認知症の原因であるＰＧＲＮの変異
患者および方法
患者：
ベルギー人の患者は純粋なＦＴＤで、標準プロトコルおよび確立された臨床条件を使用して診断された（Ｎｅａｒｙら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５１：１５４６−４５５４（１９９８）、Ｅｎｇｅｌｂｏｒｇｈｓら、Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，７４：１１４８−１１５１（２００３））。１０３人の患者のシリーズにおいて、１０人の患者は、ＦＴＤＵと確実に診断され、２人は特有な組織病理学（ＤＬＤＨ）を欠く認知症で、１人はピック病であった。変異分析は、３人の患者、Ｇｌｙ２７３Ａｒｇ、Ｓｅｒ３０５ＳｅｒおよびＡｒｇ４０６ＴｒｐにＭＡＰＴ変異を特定して、ピックの病状のある患者において１人にプレセニリン１（ＰＳＥＮ１）変異、Ｇｌｙ１８３Ｖａｌを特定した（Ｄｅｒｍａｕｔら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５５：６１７−６２６（２００４））。サンプル全体で、平均発症年齢は、６３．８±９．１歳（範囲４０〜９０歳）であった。５０人の女性と５３人の男性で、４３人の患者は、少なくとも１人の１親等が発病した陽性の家族歴があった。ＦＴＤシリーズは、１７ｑ２１で同じハプロタイプを共有する８つの発端者を含み、共通の創始者を示唆した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅら、Ｂｒａｉｎ，１２９：８４１−８５２（２００６））。
ＰＧＲＮ遺伝子配列：
非コーディングエクソン０とコーディングエクソン１〜１２の配列は、１０３人のベルギーのＦＴＤ患者および１９０人の神経学的に健康な対照で決定された（平均年齢５２．４±１３．３歳、範囲３７〜８５歳）。ＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃ変異を含むＰＧＲＮエクソン０フラグメントについて、追加で２４６人の対照（平均年齢６７．０±１２．８歳、範囲４０〜９２歳）の配列が決定された。ゲノムＤＮＡすべては、標準手順に従って、末梢血から準備された。プライマー３を使用して設計されたプライマーで、エクソン−イントロン境界を含むエクソンを増幅するために、ゲノムＤＮＡにおける標準の２０μＬポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅が実施された（ＲｏｚｅｎおよびＳｋａｌｅｔｓｋｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１３２：３６５−３８６（２０００）、Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６））。増幅生成物は、１ＵのＡｎｔａｒｃｔｉｃ１ホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）および１ＵのエクソヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で精製され、ＡＢＩ３７３０自動シーケンサ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）にてＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、両方向の配列が決定された。配列は、Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ＮｏｖｏＳＮＰで分析された（Ｗｅｃｋｘら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１５：４３６−４４２（２００５））。
ＰＧＲＮ ｍＲＮＡおよびポリペプチドの分析：
Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）転換リンパ芽球細胞が培養され、ｍＲＮＡはＣｈｅｍａｇｉｃ ｍＲＮＡ Ｄｉｒｅｃｔ Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍａｇｅｎ，Ｂａｅｓｗｅｉｌｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して単離された。患者の前頭脳組織が均質化され、総ＲＮＡがＲｉｂｏ Ｐｕｒｅ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｘ）を使用して抽出された。第１鎖ｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ランダム六量体プライマーによって、ｍＲＮＡまたは総ＲＮＡから開始して合成された。リンパ芽球細胞と脳両方のｃＤＮＡ上で、ＰＧＲＮ転写物の完全なコーディング領域を増幅するプライマーと、転写物をコードするエクソン５−６の部分から３’非翻訳配列（ＵＴＳ）まで増幅するプライマーを使用して、ＰＣＲが実施された。プライマー配列は、他で提供されている（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６））。得られたＰＣＲ生成物は、異常転写物を検出するためと、ＳＮＰ ｒｓ５８４８の存在に基づいて転写された対立遺伝子の数を決定するために、配列が決定された。
リンパ芽球細胞は、２５０ｇで遠心分離して、均質化バッファーで溶解することによって集められた。サンプルは、超音波がかけられ、２０，０００ｇで除去された。タンパク質の等量が、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｎｕｐａｇｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離され、Ｈｙｂｏｎｄ Ｐ 二フッ化ポリビニル膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に電気ブロットされた。膜は、抗ＰＧＲＮ抗体（ａｃｒｏｇｒａｎｉｎ Ｎ−１９およびＳ−１５）で免疫ブロットされて、二次抗体およびＥＣＬプラス化学発光検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いてＫｏｄａｋ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｔａｔｉｏｎ４４０（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）にて定量化されるバンドで検出された。定量データは、βアクチンで取得されたシグナルに正規化された（クローンＡＣ−１５、Ｓｉｇｍａ）。
結果
ベルギーのＦＴＤＵ−１７創始者家族ＤＲ８の患者では、第１の非コーディングエクソン０（ＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃ、表１１、ＩＶＳが介在配列を示唆する）に対して＋５の位置でＰＧＲＮのイントロン０においてＧからＣの塩基転換が特定され、病気で分離された（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６））。ベルギーの創始者家族は、１家族における最終的１７ｑ２１連鎖（ＤＲ８、ＬＯＤ ａｔ Ｄ１７Ｓ９３１において、スコアー３．４９、ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅら、Ｂｒａｉｎ，１２９：８４１−８５２（２００６））、および７人の明らかに家族に関連性のないＦＴＤ患者における以降のハプロタイプ共有（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６））に基づいて特定され、距離のある共通の祖先を示唆する（ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅ，Ｂｒａｉｎ，１２９：８４１−８５２（２００６））。１０３人のベルギーのＦＴＤ患者におけるＰＧＲＮの変異分析は、４３６人の対照個人にはなく、ベルギーの創始者家族の異なる家系に属する８つの発端者においてＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃ変異を特定した。１０８３とＤＲ８のどちらの家族においても、病理は、側頭および前頭葉に特性ユビキチン免疫反応性ニューロン細胞質性および核封入体を示した（Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓら、Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，７：１０６４−１０７４（２００２）、ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅら、Ｂｒａｉｎ，１２９：８４１−８５２（２００６）、Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６））。まれに、封入体は、グリア細胞にも関与したが、どれもテストされた約３０の可能性のあるポリペプチドから、特筆すべきポリペプチドの存在を示さなかった（Ｐｉｒｉｃｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６５：２８９−３０１（２００６））。両方の家族の患者は、ＦＴＤの臨床条件を満たし（Ｆｏｒｍａｎら、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，５９：９５２−９６２（２００６）、ＭｃＫａｎｎら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ，５８：１８０３−１８０９（２００１））、運動神経疾病に関連付けられる兆候はなかった（Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓら、Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，７：１０６４−１０７４（２００２）、ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅら、Ｂｒａｉｎ，１２９：８４１−８５２（２００６））。
（表１１）ベルギーのＦＴＤ家族において特定されたＰＧＲＮ変異
Figure 0005123936
＊１９０人の対照におけるＰＧＲＮの１３すべてのエクソンの配列決定は、これらまたはその他のナンセンスまたはフレームシフト変異を特定しなかった。
追加の２４６人の対照におけるエクソン０の配列決定は、ＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃ変異がないことを示した。
† ＦＴＤＵは、解剖脳の病理学診断。
‡ ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセス番号ＡＣ００３０４３の逆相補体に対する番号で、ヌクレオチド１から開始。
§ 最大ＰＧＲＮ転写物（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセス番号ＮＭ＿００２０８７．２）による番号で、翻訳開始コドンから開始。
|| 最大ＰＧＲＮイソ型による番号（ＧｅｎＰｅｐｔ（登録商標）アクセス番号ＮＰ ００２０７８．１）。
¶ Ｍｅｔ１翻訳開始コドンの変異。
ＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃ変異は、非コーディングエクソン０の次の第１のＰＧＲＮイントロン（イントロン０）のスプライスドナー側にある（表１１および図４）。コンピュータ内分析は、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ錯体の結合効率に著しい低下を予想した。さらに、発端者ＤＲ８（ＩＩＩ−２８）およびＤＲ２７（ＩＩＩ−４）のリンパ芽球細胞および脳の完全な長さのＰＧＲＮ補完ＤＮＡの分析は、異常な転写物を識別しなかった。しかし、３’非翻訳配列（ＵＴＳ）にある単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）ｒｓ５８４８に対してヘテロ接合Ｃ／Ｔであり、疾病のハプロタイプを分離するＣ対立遺伝子のあるＤＲ８ ＩＩＩ−２８およびＤＲ２７ ＩＩＩ−４のリンパ芽球細胞および／または脳ＰＧＲＮｃＤＮＡの配列を決定すると、Ｔ対立遺伝子だけを示した（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６））。対照的に、発病していない親族は、ゲノムおよびｃＤＮＡ配列の両方でｒｓ５８４８のヘテロ接合であった。これらのデータは、おそらく、イントロン０の完全な読み取りのために、変異ＰＧＲＮ ｍＲＮＡ転写物がないことをサポートする。未スプライスの転写物に残る核保持シグナルは、転写物が核を残すことを阻止し、核分解を発生させる（Ｖｉｎｃｉｇｕｅｒｒａ ａｎｄ Ｓｔｕｔｚ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１６：２８５−２９２（２００４））。発端者ＤＲ８ＩＩＩ−２８およびＤＲ２７ＩＩＩ−４からのリンパ芽球細胞タンパク質抽出物のウエスタンブロット分析は、これらのデータをサポートして、ＰＧＲＮポリペプチドレベルの減少を示した（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６））。これらのデータは、合わせて、ＤＲ８創始者のハプロタイプがポリペプチドを生成しないＰＧＲＮヌル対立遺伝子を持っていることを示した。患者ＤＲ８ＩＩＩ−２８では、皮質ニューロンのサブセットに、強力なＰＧＲＮ免疫活性が観察された（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６））。しかしながら、ＰＧＲＮポリペプチドのすべての領域を認識する抗体のパネルを使用しているにもかかわらず、ニューロン封入体はＰＧＲＮに対して陰性であった。
ベルギーのＦＴＤＵ−１７創始者家族の８つの発端者におけるＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃ変異に加えて、ＰＧＲＮのすべての１３のエクソンおよび隣接しているイントロン領域のゲノム配列を決定することによって、ベルギーのＦＴＤシリーズの３つの家族の患者において、その他３つのＰＧＲＮ変異が特定された（表１１）。６２歳で発病した１人のＦＴＤ患者、および６４歳で死亡した認知症を発病していた１人の姉妹において、Ｍｅｔ１翻訳開始コドン（ｃ．３Ｇ＞Ａ）周囲のＫｏｚａｋ配列を破壊したエクソン１でＧ＞Ａの変化が特定された。別のＭｅｔ１変異（上記のｃ．２Ｔ＞Ｃ）がある米国の患者は、変異転写物対立遺伝子の発現レベルにおいて顕著な減少を示した（Ｂａｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９１６−９１９（２００６））。他の２人の家族患者においては、異なるフレームシフト変異によって、カルボキシ末端切断ポリペプチド、Ｐｒｏ１２７ＡｒｇｆｓＸ２とＡｌａ２３７ＴｒｐｆｓＸ４が予想されたので、イントロン７スプライスドナー側に影響を与える、エクソン４のジヌクレオチド欠失と４つのヌクレオチド挿入となり、エクソン７のスキップが予想される（表１１）。上記のように、ＰＧＲＮフレームシフト変異は、変異ｍＲＮＡ転写物のナンセンス媒介崩壊によって、ヌル対立遺伝子も生成して、ＰＧＲＮポリペプチドレベルを低下させる（Ｂａｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９１６−９１９（２００６））。これらのＰＧＲＮ変異データは、合わせて、ベルギーの患者シリーズにおいて、ＦＴＤの遺伝子病因の１０．７％（１０３のうち１１）および家族ＦＴＤの２５．６％（４３のうち１１）を説明した。同じグループで、ＭＡＰＴ変異頻度は、全体で２．９％（１０３のうちの３）および家族ＦＴＤでは７％（４３のうちの３）であり、ベルギー患者において、ＰＧＲＮ変異は、約３．５倍頻度が高いＦＴＤの原因であることを示唆する。
ベルギーの創始者家族では、ＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃ変異のある１６人の家族患者の発症年齢は、４５から７０歳の間でばらつきがあった（平均発症年齢６３．４±６．８歳、平均死亡年齢６８．３±４．４歳）。また、認知症の症状がなく死亡した家族ＤＲ８の世代ＩＩにも４つの偏性保持者があった。１人は若くして（ＩＩ−１、４１歳）、２人は発症年齢範囲（ＩＩ−８は４４歳、ＩＩ−９は５４歳）で、１人は８１歳で死亡した（ＩＩ−３、ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅ，Ｂｒａｉｎ，１２９：８４１−８５２（２００６））。これらの非常にばらつきがある発症年齢および疾病の潜在的に不完全な浸透率は、修正因子が、発症年齢を調整して、ＦＴＤＵ−１７のより複雑な遺伝子病因に貢献していることを示唆した。アポリポタンパク質Ｅ遺伝子（ＡＰＯＥ）の分析は、ＡＰＯＥ遺伝子型が発症年齢に何の影響も与えないことを示唆した。興味深いことに、ベルギーの創始者家族のＦＴＤＵ−１７患者は、疾病の顕著な特徴として、非流暢型失語症の症状があった（Ｃｒｕｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６）；ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅ，Ｂｒａｉｎ，１２９：８４１−８５２（２００６））。
ＰＧＲＮの変異データは、オランダ人の家族１０８３（Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓら、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，７：１０６４−１０７４（２００２））およびベルギーの創始者家族ＤＲ８（ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅら、Ｂｒａｉｎ，１２９：８４１−８５２（２００６））におけるＦＴＤＵ−１７の関連を説明した。ナンセンスおよびフレームシフト転写物の研究は、おそらく、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊による分解があることを示唆したが（Ｂａｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，９４２：９１６−９１９（２００６））、未検出の定量の切断されたポリペプチドが、優性阻害または機能獲得メカニズムによって病原性効果に影響を与えたことを完全に除外することはできなかった。イントロン０の対立遺伝子消失変異の特定（ＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃ）は、ＦＴＤＵ−１７の病原性メカニズムが確かに機能するＰＧＲＮの消失である（ハプロ不全）という有力な証拠を提供した。ＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃ変異は、第１のイントロンであるイントロン０のスプライスを妨げ、核の保持と変異転写物の分解を発生させるか、あるいは、変異対立遺伝子は転写されないかもしれない。いずれの場合でも、変異対立遺伝子は機能せず、結果は、ＰＧＲＮポリペプチドの減少である。
実施例４−前頭側頭型認知症におけるプログラニュリンの病原性消失を引き起こすヌル変異以外の変異
ベルギー（Ｎ＝１３６）およびフランス（Ｎ＝１９６）のＦＴＤ患者シリーズの２つの研究（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６）、Ｌｅ Ｂｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔ，ＰＭＩＤ：１７４３６２８９（２００７））において特定されたＰＧＲＮミスセンス変異との病原性性質および５’調節領域の配列変異を調べるための実験が、ＰＧＲＮ発現レベルとＰＧＲＮの生物的機能に与える効果を評価するために、コンピュータ上の、保存および構造分析を使用して、実施された。
対象：
ベルギーの患者サンプルは、他に記載される標準プロトコルおよび確立された臨床条件（Ｅｎｇｅｌｂｏｒｇｈｓら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，７４：１１４８−１１５１（２００３）、Ｎｅａｒｙら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５１：１５４６−１５５４（１９９８）、Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６）を使用して、診断された１３６人のＦＴＤ患者から構成された。フランスのシリーズでは、１９６人のＦＴＤのあるインデックス患者から、フランスの神経学者の研究ネットワークによってＤＮＡサンプルが収集された（Ｌｅ Ｂｅｒら、Ｂｒａｉｎ，１２９：３０５１−３０６５（２００６））。ＦＴＤは、他に記載されているように、ＬｕｎｄおよびＭａｎｃｈｅｓｔｅｒ条件（Ｔｈｅ Ｌｕｎｄ ａｎｄ Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ Ｇｒｏｕｐｓ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，５７：４１６−４１８（１９９４）、Ｌｅ Ｂｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔ，ＰＭＩＤ：１７４３６２８９（２００７））に基づいて診断された。変異分析は、３人のベルギー人および６人のフランス人ＦＴＤ患者においてＭＡＰＴ変異を、１人のベルギー人患者にプレセニリン１（ＰＳＥＮ１；ＭＩＭ＃１０４３１１）変異を特定した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅら、Ｂｒａｉｎ，１２９：８４１−８５２（２００６）、Ｄｅｒｍａｕｔら、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，５５：６１７−６２６（２００４）、Ｌｅ Ｂｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔ，ＰＭＩＤ：１７４３６２８９（２００７））。患者に加えて、４５９人の無関係な神経学的に健康なベルギー人と１８７人のフランス人の対照のＰＧＲＮ変異を分析した。ベルギーとフランスの研究母集団の説明は表１２にまとめられる。
（表１２）ベルギーとフランスの研究サンプルの説明
Figure 0005123936
１ＡＡＯ：発症時年齢±標準偏差；２陽性の家族歴は認知症またはＦＴＤのある少なくとも１人の１親等を持つと定義された；３ＡＡＩ：参加時年齢±標準偏差。
ＰＧＲＮ配列決定分析：
ＰＧＲＮ変異分析は、ＭＡＰＴ変異のない１３６人のベルギー人患者と１９０人のフランス人患者、および他に記述されているのフランス人およびベルギー人の対照で実施した（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６）、Ｌｅ Ｂｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔ，ＰＭＩＤ：１７４３６２８９（２００７））。非コーディングエクソン０とイントロン０の保存領域を含めて、すべてのＰＧＲＮエクソンおよびイントロンとエクソンの境界の配列が決定された（ｇ．９６２３７−ｇ．９６９８３；番号はＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＣ００３０４３の逆相補体に対して、番号付けられ、ｎｔ１から開始）。ゲノムＤＮＡすべては、標準手順に従って、末梢血から準備された。エクソンとイントロン０の一部は、他で記載のプライマー（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６））およびイントロン０に設定された追加のプライマー
Figure 0005123936
を使用して、ゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ）上でＰＣＲ増幅された。増幅生成物は、１Ｕのａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、ＵＳＡ）および１ＵのエクソヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で精製され、ＡＢＩ３７３０自動シーケンサ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）にてＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、両方向の配列が決定された。配列は、ｎｏｖｏＳＮＰソフトウエア・パッケージで分析された（Ｗｅｃｋｘら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１５：４３６−４４２（２００５））。
変異の命名法：
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）変異の番号は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＣ００３０４３．２の逆相補体に対して番号付けられ、ｎｔ１から始まる。相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）変異番号は、最大ＰＧＲＮ転写物（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２０８７．２）に対して与えられ、翻訳開始場所＋１から始まる。ポリペプチド変異の番号は、最大ＰＧＲＮイソ型による（ＧｅｎＰｅｐｔ（登録商標）アクセッション番号ＮＰ＿００２０７８．１）。
マイクロサテライト遺伝子型：
ベルギー人患者ＤＲ１２１．１とフランス人患者Ｆ９８／００１はどちらもＰＧＲＮｃ．１２９４Ｃ＞Ｔ、ｐ．Ａｒｇ４３２Ｃｙｓ変異があるが、ＰＧＲＮ周辺の８ｃＭ領域に及ぶ１４マイクロサテライト（ＳＴＲ）マーカーは、その他で記載のように（ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅら、Ｂｒａｉｎ，１２９：８４１−８５２（２００６））、対立遺伝子共有分析に対して遺伝子型が決定された。２０ｎｇのゲノムＤＮＡが、５８℃のアニール温度で、蛍光標識プライマーを使用してマルチプレックスＰＣＲで増幅された。ＰＣＲ生成物は、ＡＢＩ３７３０自動シーケンサ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にてサイズが測定され、遺伝子型は、カスタム遺伝子型決定ソフトウェアを使用して割り当てられた。
コンピュータ分析：
Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｉｎｔｏｌｅｒａｎｔ Ｆｒｏｍ Ｔｏｌｅｒａｎｔ（ＳＩＦＴ ｖ．２）ｐｒｏｇｒａｍ（ＮｇおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３１：３８１２−３８１４（２００３））を使用して、単一のヌクレオ進化的保存性分析を行い、相同配列の配置において変異した位置で進化的可用性プールとアミノ酸の多様性と比較して、単一のヌクレオチド多型（ＳＮＰ）によって発生するアミノ酸変異の程度を推定した。選択された相同およびその配置のさまざまな入力が使用された。ＢＬｉｎｋからの６１の未配置の配列（Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓｓ Ｒｅｓ，３２ Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ：Ｄ３５−Ｄ４０（２００４））、ＳＩＦＴ配列、距離１００％同一、ＢＬｉｎｋからの６１配列のＣｌｕｓｔａｌＸ（Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ，２３：４０３−４０５（１９９８））配置、距離１００％同一、Ｑｕｅｒｙ配列、ＳＩＦＴ発見相同および配置、距離１００％同一。０．０５より低いスコアが、ポリペプチド機能に効果を与えると予想され、０．０５以上のスコアは、許容されることが予想される（表１３）。
（表１３）ＦＴＤ患者におけるＰＧＲＮミスセンス変異
Figure 0005123936
６４６人の対照個人では、ミスセンス変異は存在しなかった。１ＥＸ：エクソン、エクソン番号は非コーディングの第１のエクソンＥＸＯから開始。２ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＣ００３０４３．２の逆相補体に対してに番号付けられ、ｎｔ１から開始。３番号は最大ＰＧＲＮ転写物（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２０８７．２）により、翻訳開始コドンから開始。４番号は最大ＰＧＲＮイソ型（ＧｅｎＰｅｐｔ（登録商標）アクセッション番号ＮＰ＿００２０７８．１）による。５陰性の家族歴は、認知症またはＦＴＤが報告された１親等がいないことを示唆。６ＳＩＦＴコンセンサス予想（ＮｇおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３１：３８１２−３８１４（２００３））：Ａ）ＢＬｉｎｋからの６１の未配置配列（Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３２ Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ：Ｄ３５−Ｄ４０（２００４））、ＳＩＦＴ配置、１００％同一を除く。Ｂ）ＣｌｕｓｔａｌＸ（Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ，２３：４０３−４０５（１９９８））はＢＬｉｎｋからの６１の配列の配置、１００％同一を除く。Ｃ）クエリー配列、ＳＩＦＴは相同と配置を発見し、１００％同一を除く。０．０５より低いスコアは、ポリペプチド機能（太字）に効果を与えることが予想され、０．０５以上のスコアは、許容されることが予想される。＊ＰＧＲＮｃ．ｌ２９４Ｃ＞Ｔ，ｐ．Ａｒｇ４３２Ｃｙｓはインデックス患者の発病した従兄弟にも検出された。
グラニュリンドメインの構造および安定性に対する変異の影響を評価するために、個別のグラニュリンドメインの完全構造は、ＳｗｉｓｓＰＤＢ−Ｖｉｅｗｅｒ（Ｇｕｅｘ ａｎｄ Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８：２７１４−２７２３（１９９７））、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ（ＦｉｓｅｒおよびＳａｌｉ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，３７４：４６１−４９１（２００３））、ＰｒｏＱ（ＷａｌｌｎｅｒおよびＥｌｏｆｓｓｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，１２：１０７３−１０８６（２００３））、およびＦｏｌｄＸ（Ｓｃｈｙｍｋｏｗｉｔｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３３：Ｗ３８２−Ｗ３８８（２００５）、図２）を使用して、ジスルフィド連結のベータヘアピンスタックモチーフ(ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ＰＤＢ １ｇ２６（Ｔｏｌｋａｔｃｈｅｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９：２８７８−２８８６（２０００））の繰り返し発生に基づいて、モデル化された。変異から生じるフリーエネルギーの差は、ジスルフィド結合を形成または分解するための追加のペナルティ以外、ＳＮＰｅｆｆｅｃｔ方法（Ｒｅｕｍｅｒｓら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２２：２１８３−２１８５（２００６））に対してＦｏｌｄＸアナログを使用して、推算された（Ｃｚａｐｌｅｗｓｋｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ，１７：２９−３６（２００４））。
想定される転写因子結合部位に対する５’調節領域の変異の効果を推算するために、Ｍａｔｌｎｓｐｅｃｔｏｒ分析を実施した。（ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅにおけるウエブサイト、Ｃａｒｔｈａｒｉｕｓら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２１：２９３３−２９４２（２００５））。コアの類似カットオフ値１と最適化マトリックス類似性−０．０５が使用された（表１４）。
（表１４）ＦＴＤ患者におけるＰＧＲＮ５’調節変異
Figure 0005123936
６４６人の対照個人では、プロモーター変異は存在しなかった。１ＥＸ：エクソン、ＩＶＳ：イントロン、エクソン番号は非コーディング第１エクソンＥＸ０から開始、２ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＣ００３０４３．２の相補体に対して番号付けられ、ｎｔ１から開始；３陰性の家族歴は、認知症またはＦＴＤを発病した１親等がいないことを示唆、４ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ分析（Ｃａｒｔｈａｒｉｕｓら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２１：２９３３−２９４２ （２００５））、コアの類似性カットオフ値には１、最適化マトリックス類似性には−０．０５が使用された。＊解剖時の神経病理学診断はＦＴＤＵに準じた。
結果
１３の報告されたヌル変異（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６）；Ｌｅ Ｂｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔ，ＰＭＩＤ：１７４３６２８９（２００７））とは別に、３３２人のＦＴＤ患者のＰＧＲＮの大規模な変異分析は、１１のエクソンおよび５つのイントロン変異、ならびにＰＧＲＮの５’調節領域に１０の変異、３’調節領域に２つの変異を特定した。３つのミスセンス変異（表１３、図１１）および５’調節領域（表１４）の３つの配列変異は患者だけに検出されて、１２９２の対照染色体にはなかった。また、３つのサイレント変異は、患者に固有であった（表１５）。残りの１９の変異は、患者および対照個人に存在して、１１の希少な多型（表１６）および８つの頻繁な多型（表１７）から構成された。
（表１５）ＦＴＤ患者におけるＰＧＲＮサイレント変異
Figure 0005123936
６４６人の対照個人では、サイレント変異は存在しなかった。１ＥＸ：エクソン、エクソン番号は非コーディング第１エクソンＥＸ０から開始。２ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＣ００３０４３．２の逆相補体に対して番号付けられ、ｎｔ１から開始。３番号は最大ＰＧＲＮ転写物（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２０８７．２）により、翻訳開始コドンから開始。４番号は最大ＰＧＲＮイソ型（ＧｅｎＰｅｐｔ（登録商標）アクセッション番号ＮＰ＿００２０７８．１）による。
（表１６）希少ＰＧＲＮ多型
Figure 0005123936
１ＥＸ：エクソン、ＩＶＳ：イントロン、ＵＴＲ：非翻訳領域、エクソン番号は非コーディング第１エクソンＥＸ０から開始。２ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＣ００３０４３．２の逆相補体に対して番号付けられ、ｎｔ１から開始。３番号は最大ＰＧＲＮ転写物（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２０８７．２）により、翻訳開始コドンから開始。４番号は最大ＰＧＲＮイソ型（ＧｅｎＰｅｐｔ（登録商標）アクセッション番号ＮＰ＿００２０７８．１）による。
（表１７）頻繁なＰＧＲＮ多型
Figure 0005123936
１ＥＸ：エクソン、ＩＶＳ：イントロン、ＵＴＲ：非翻訳領域、エクソン番号は非コーディング第１エクソンＥＸ０から開始。２ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＣ００３０４３．２の逆相補体に対して番号付けられ、ｎｔ１から開始。３番号は最大ＰＧＲＮ転写物（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２０８７．２）により、翻訳開始コドンから開始。４番号は最大ＰＧＲＮイソ型（ＧｅｎＰｅｐｔ（登録商標）アクセッション番号ＮＰ＿００２０７８．１）による。
ＰＧＲＮミスセンス変異：
ｃ．７４３Ｃ＞Ｔ，ｐ．Ｐｒｏ２４８Ｌｅｕ；ｃ．７７３Ｇ＞Ａ，ｐ．Ｓｅｒ２５８Ａｓｎ；およびｃ．１２９４Ｃ＞Ｔ，ｐ．Ａｒｇ４３２ＣｙｓのＰＧＲＮポリペプチド配列保存および構造に与える効果がコンピュータで調べられた（図１１、表１３）。ｐ．Ｐｒｏ２４８Ｌｅｕおよびｐ．Ａｒｇ４３２Ｃｙｓの２つのミスセンス変異は病原性であることが予想された。ＳＩＦＴ分析は、Ｐｒｏ２４８Ｌｅｕがポリペプチド機能を顕著に（ｐ＝０．００）混乱させることを予想したが、これは、構造モデルによるもので、グラニュリンドメイン上に６．２２±０．５４ｋｃａｌ／ｍｏｌの顕著な分解効果が明らかになった。グラニュリンドメイン構造では、Ｐｒｏ２４８は、鋭く固定した回転を制限するためにおそらく最も重要な２つのβ−ヘアピンを接続するループに存在する（図１１Ｂ）。さらに、Ｐｒｏ２４８は、７つのグラニュリンドメインの間で１００％保存される位置で、グラニュリンＢドメインの２つのＣｙｓ残基に隣接する。Ａｒｇ４２３Ｃｙｓは、グラニュリンドメインＣとＤの間に存在する（図１１Ａ）。使用されるパラメータに応じて、ＳＩＦＴ分析は、この変異はＰＧＲＮの生物的機能を混乱させると予想した（ｐ＝０．０２、表１３）。さらに、通常、グラニュリンドメインの間にＣｙｓ残基は観察されない。Ａｒｇ４２３Ｃｙｓは、１人のベルギー人（ＤＲ１２１．１、発症年齢６６歳）および１人のフランス人のＦＴＤ患者（Ｆ９８／００１、発症年齢６５歳）において検出された。ＰＧＲＮ内および周囲に配置されたマーカーを使用する対立遺伝子共有分析は、ＰＧＲＮの５．３６Ｍｂ動原体の領域の６つの連続ＳＴＲマーカーおよびすべての遺伝子内ＰＧＲＮ ＳＮＰが共有されることを示した。１０２人の対照個人では、ＥＭ推算は、この共有ハプロタイプも、観察されたこの対立遺伝子連結も明らかにできなかった。
グラニュリンドメインＢに存在するＳｅｒ２５８Ａｓｎは、グラニュリンドメインの間には保存されないが、オルソログにわたって保存されるアミノ酸残基に効果を与える。（図１１Ａ）。ＳＩＦＴ分析は、ポリペプチド機能におけるこの変異の中程度に顕著な効果を予想した（ｐ＝０．０３、表１３）。しかしながら、構造モデリングは、グラニュリンドメインの分解効果を示すことができなかった。
５’調節領域におけるＰＧＲＮ変異：
３つのプロモーター変異は、転写因子結合（ＴＦＢ）仕様を変更する可能性があるかどうかを評価するために、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒを使用して分析された（表１４）。ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ分析は、３つの変異すべてのＴＦＢ部位の取得および／または消失を予想した。１つのプロモーター変異ｇ．９６１７２Ｇ＞Ｔ（ＥＸ０＋１４８Ｇ＞Ｔ）は、ＣＤＰ部位の作成することと、ＣＤＥ部位の消失が予想された。ＣＤＰ（ＣＣＡＡＴ解離タンパク質）は、分化、成長および増殖を含めて、ほとんどの細胞プロセスに関与する多数のさまざまな細胞遺伝子の転写因子である（ＮｉｓｈｉｏおよびＷａｌｓｈ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０１：１１２５７−１１２６２（２００４））。また、ＣＤＥは、細胞サイクルに依存して、遺伝子転写を調節することができる。（Ｌａｎｇｅ−ｚｕら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，４８４：７７−８１（２０００））。ｇ．９６２８２Ｇ＞Ｔ（ＩＶＳ０＋４６Ｇ＞Ｔ）は、１つのＳｐ２ドメインの取得を予想した。Ｓｐ／ＸＫＬＦタンパク質は、細胞サイクル制御、腫瘍形成、および分化に関与する遺伝子の転写を調節することを示した（ＭｏｏｒｅｆｉｅｌｄらＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７９：１３９１１−１３９２４（２００４））。さらに、ｇ．９６４２５Ｃ＞Ｔ（ＩＶＳ０＋１８９Ｃ＞Ｔ）は１つのＥＧＲ１部位の消失と１つのＰＡＸ５部位の取得を予想した。ＥＧＲ１は、ジンクフィンガー転写因子の早期成長反応ファミリーに属し、成長、分化および傷の回復に関連する多数のプロセスに関与する（ＭｃＫｅｅら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，１０８８：１−１１（２００６））。ＰＡＸ５転写因子は、Ｂリンパ球と脳の両方の成長に重要な役割がある（Ｓｔｅｉｎｂａｃｈら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，９３：４５９−４６７（２００１））。
本書で説明されるように、３つのミスセンス変異、ｃ．７４３Ｃ＞Ｔ，ｐ．Ｐｒｏ２４８Ｌｅｕ、ｃ．７７３Ｇ＞Ａ，ｐ．Ｓｅｒ２５８Ａｓｎ、およびｃ．１２９４Ｃ＞Ｔ，ｐ．Ａｒｇ４３２Ｃｙｓは、４人の患者で特定され（４／３３２または１．２％）、１２９２人の対照染色体にはなかった。進化的保存および構造に基づくコンピュータの予想は、少なくとも２つの変異、ｐ．Ｐｒｏ２４８Ｌｅｕとｐ．Ａｒｇ４３２Ｃｙｓが、ポリペプチド構造と安定性に顕著に効果を与えるので、おそらく病原性であることを示唆した。グラニュリンドメインＢに存在するＰｒｏ２４８は、げっ歯類を含むＰＧＲＮオルソログおよびすべてのグラニュリンドメイン間で進化保存される。さらに、分子モデリングは、Ｐｒｏ２４８がグラニュリンＢのβヘアピンスタックのループに存在することを示唆した。
ｐ．Ａｒｇ４３２Ｃｙｓは、ベルギー（ＤＲ１２１．１）とフランス（Ｆ９８／００１）祖先の２人の独立的に確認されたＦＴＤ患者で観察された。これらの患者は、ＰＧＲＮ遺伝子座と１７ｑ２１で少なくとも５．３６Ｍｂの隣接している動原体領域とにわたる共通のハプロタイプを共有して、共通の創始者効果を示唆した。ＦＴＤＵ−１７の報告された最小候補領域と組み合わせると、これは、ＦＴＤＵ−１７の遺伝子座をＰＧＲＮの３．１８Ｍｂ動原体にまで縮小し、ＭＡＰＴを排除する。Ｆ９８／００１は、認知症の陽性家族歴があり、ｐ．Ａｒｇ４３２Ｃｙｓは、別の発病した従兄弟に検出され、さらに、変異の病原性性質を裏付ける。患者ＤＲ１２１．１には、家族の既往歴は報告されなかった。しかし、この患者は一人っ子であり、これは、ＦＴＤがこの家族で散発的に表現される理由を説明でき得る。
非常に保存されたヌクレオチドの３つの患者特有の配列変異（３／３３２または０．９％）が、ＰＧＲＮ遺伝子の５’調節領域に観察された。ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ分析は、３つすべての変異に対してＴＦＢ部位の変化を推定した。ｇ．９６１７２Ｇ＞Ｔ（ＥＸ０＋１４８Ｇ＞Ｔ）は、家族のＦＴＤおよび発症年齢５１歳で診断されたベルギー人患者で特定された。この患者は、５５歳で死亡し、脳解剖は、ｕｂ−ｉｒニューロン封入体（ＦＴＤＵ）のあるＦＴＤの診断を確認した。これらのデータは、ＰＧＲＮ転写活動の変更が、ＦＴＤのリスクに関連する可能性があることを示唆した。
患者に加えて、６４６人の対照のＰＧＲＮの変異分析は、対照だけに存在した２５の配列変異を明らかにした（表１８）。希少なＰＧＲＮ変異は、患者の１２．４％（４１／３３２）に対し、対照の１１．３％（７３／６４６）で検出された。観察は、ＰＧＲＮの自然的遺伝子変異性と、変異の病原性性質は、ポリペプチド構造と安定性における変異の影響に依存する可能性があることを示唆した。ｃ．４７３Ｇ＞Ａ，ｐ．Ｃｙｓ１５８Ｔｙｒ変異は、８２歳の対照に発見された。この変異は、疾病を発生させるのに不十分であるか、または非浸透性の例のいずれかの可能性がある。ＰＧＲＮヌル変異の非浸透性は、ＰＧＲＮ変異ｇ．９６２４１Ｇ＞Ｃ，ＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃを分離しているベルギー人の創始者家族ＤＲ８およびその他のアメリカのＦＴＤ家族において報告されている（Ｇａｓｓら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，１５：２９８８−３００１（２００６））。
（表１８）対照個人の希少ＰＧＲＮ変異
Figure 0005123936
１ＥＸ：エクソン、ＩＶＳ：イントロン、ＵＴＲ：非翻訳領域、エクソン番号は非コーディング第１エクソンＥＸ０から開始。２ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＣ００３０４３．２の逆相補体に対して番号付けられ、ｎｔ１から開始。３番号は最大ＰＧＲＮ転写物（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２０８７．２）により、翻訳開始コドンから開始。４番号は最大ＰＧＲＮイソ型（ＧｅｎＰｅｐｔ（登録商標）アクセッション番号ＮＰ＿００２０７８．１）による。
ＰＧＲＮ変異（ナンセンス、フレームシフト、ミスセンスおよびプロモーター変異）は、ＦＴＤ患者の８．４３％（２８／３３２）およびＦＴＤの家族歴が陽性な患者の１８．６９％（２０／１０７）を占める可能性がある。病理学的にＦＴＤが確認された患者のグループにおいて、ＰＧＲＮ変異頻度は５３．３３％（８／１５）で、ＦＴＤＵ診断患者の６６．６７％（８／１２）に上った。これらのＰＧＲＮ変異は、転写物の消失または転写の減少（ナンセンスまたはフレームシフト転写物およびプロモーター変異）、翻訳の消失（Ｍｅｔ１変異）またはポリペプチド機能の消失（ミスセンス変異）によって、おそらく、ＰＧＲＮポリペプチドレベルの減少によって、病原性効果の影響を最も及ぼす。
実施例５−ベルギーの拡大創始者家族における高い臨床的異質性を有するプログラニュリンヌル変異保持者の存在
ＰＧＲＮの変異分析は、大型でよく特徴つけられたベルギーのアルツハイマー病（ＡＤ）患者グループ、および２つの独立して確認されたベルギーのパーキンソン病（ＰＤ）集団で実施された。ＡＤ患者グループは、ベルギーのフランダースの神経変性および欠陥性痴呆の大型の予測研究に由来する６６６人のＡＤ患者から構成された（平均発症年齢７４．６±８．８歳、６５．５％が女性）（Ｅｎｇｅｌｂｏｒｇｈｓら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，７４：１１４８−５１（２００３）、Ｅｎｇｅｌｂｏｒｇｈｓら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ，２７：２８５−９２（２００６））。各患者は、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ；Ｆｏｌｓｔｅｉｎら、Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ Ｒｅｓ，１２：１８９−９８（１９７５））、脳のコンピュータ断層撮影（ＣＴ）および／または磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）および機能的神経画像（単光子放出コンピュータ断層造影（ＳＰＥＣＴ））から構成される構造的神経画像等、診断神経生理学的検査を受けた。ＡＤの可能性または疑いのコンセンサス診断は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ ／Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＩＮＣＤＳ／ＡＤＲＤＡ）基準（ＭｃＫｈａｎｎら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，３４：９３９−４４（１９８４））に基づいて、少なくとも２人の神経学者によって与えられた。ほとんどの患者は、疑われるＡＤの条件にあてはまり（Ｎ＝６２７）、少数の患者（Ｎ−＝３９）は、ＡＤの可能性ありと診断された。解剖された４８の疑われるＡＤ患者において、臨床診断が神経病理学的に確認された。２６．０％の患者において、疾病は、認知症を発病している少なくとも１人の１親等の発生に基づいて、家族性であると見なされた。脳脊髄液（ＣＳＦ）は、患者（Ｎ＝３６５）のサブセットで採取され、アミロイドβペプチド（Ａβ１−４２）、全タウ（Ｔ−ｔａｕ）、およびトレオニン１８１（Ｐ−ｔａｕ１８１Ｐ）でリン酸化されたタウのＣＳＦレベルが、一般的に販売されている単一のパラメータＥＬＩＳＡキットを使用して臨床データを知らされない技師により、二重に決定された（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ；Ｅｎｇｅｌｂｏｒｇｈｓら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ，ＰＭＩＤ：１７４２８５８１（２００７））。
ベルギー人のＰＤ患者（Ｎ＝２５５、平均発症年齢５９．４±１０．９歳、４３．１％女性）は、２つの独立した研究から得られた。８２人の患者が、ＡＤ患者として同じ予測研究から選択された（Ｅｎｇｅｌｂｏｒｇｈｓら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，７４：１１４８−５１（２００３））。一組の１７３人のＰＤ患者が、ＰＤにおける環境リスク因子の効果を評価するために確認された遡及的疫学研究から選択された（Ｐａｌｓら、Ｅｕｒ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，１８：１１３３−４２（２００３））。どちらの研究も、ＰＤの診断には、次の特徴の４つのうちの３つがあることを必要とした。（１）動作緩慢、（２）硬直、（３）震え、および（４）非対称の発症。レボドパへの反応があることも必要であった。少なくとも１人の１親等にパーキンソン病があれば、ＰＤの家族歴を陽性とした（３．５％）。
対照グループは、４５９人の無関係の健康なオランダ語を話すベルギー人から構成された（研究時５８．６±１６．０歳、５４．９％が女性）。対照グループは、神経学的または精神学的な家系のない、または中枢神経系に関与する器質性疾患のない神経学的な病状のある対象（Ｎ＝２７５）および遺伝子関連研究のために集められた神経学的疾病のある家族の個人と結婚した人の中から選択された対象（Ｎ＝１８４）を含んだ。
説明を受けて了解した後、遺伝子研究のために各発端者の血液サンプルが収集された。変異保持者の場合、ハプロタイプ位相測定および分離研究のために追加の親類が収集された。
ＰＧＲＮ配列決定：
患者と対照個人は、コーディングエクソン１から１２（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−４（２００６））および非コーディングエクソン０の変異が分析された。プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェア（Ｒｏｚｅｎ ａｎｄ Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１３２：３６５−８６（２０００））を使用して設計された。ゲノムＤＮＡの２０ｎｇは、個別に最適化された反応条件を使用してＰＣＲ増幅された。増幅生成物は、１Ｕのａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と１ＵのエクソヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して精製された。精製されたＰＣＲ生成物は、ＰＣＲプライマーまたは内部配列決定プライマー、およびＢｉｇ Ｄｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、両方向の配列を決定した。標識付けされた生成物は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ｘ１ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分離して、ＮｏｖｏＳＮＰ（Ｗｅｃｋｘら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，１５：４３６−４２（２００５））を使用して分析した。
ＰＧＲＮ転写物分析：
リンパ芽球細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｗｅｍｍｅｌ，ベルギー）を使用して全血から単離され、ｍＲＮＡは、Ｃｈｅｍａｇｉｃ ｍＲＮＡ Ｄｉｒｅｃｔ Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍａｇｅｎ，Ｂａｅｓｗｅｉｌｅｒ，ドイツ）を使用してリンパ芽球細胞から単離された。第１鎖ｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲキットとランダム六量体プライマーのためにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを使用して合成された。転写物（エクソン５−６から３’ＵＴＲ）の一部のＰＣＲ増幅後、変異位置の遺伝子型は、他で記述されているように（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−４（２００６））直接的な配列決定により生成された。
ＳＴＲ遺伝子型決定：
ＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃのある患者と追加の家族メンバーにおいて、ベルギーのＤＲ８創始者家族で観察された８ｃＭ祖先ＰＧＲＮハプロタイプにある１２ＳＴＲマーカーが、遺伝子型を決定した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅら、Ｂｒａｉｎ，１２９：８４１−５２（２００６））。２０ｎｇのゲノムＤＮＡは、４つの複合反応で増幅された（ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅら、Ｂｒａｉｎ，１２９：８４１−５２（２００６））。蛍光で標識を付けた生成物は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ｘ１ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で決定された。遺伝子型は、カスタムの遺伝子型決定ソフトウェアを使用して割り当てられた。各ＳＴＲマーカーの対立遺伝子頻度が１０２人の無関係なベルギー対照で推定された（ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅら、Ｂｒａｉｎ，１２９：８４１−５２（２００６））。
神経病理学：
患者ＤＲ２０５．１で脳の解剖が実施された。脳半球は緩衝化ホルマリンで固定されて、右と左の前頭および側頭葉、海馬、脳幹神経節、中脳、脳橋、延髄、および小脳の組織が、さらに、パラフィン埋め込みで処理された。１０μｍの厚さの薄片が切り取られ、ヘマトキシリンとエオシン、クリスタルバイオレット、ＢｏｄｉａｎとＧａｌｌｙａｓで染色された。５μｍの厚さの薄片も、すべての脳領域から切り取られて、以下の抗体で免疫組織化学が実施された。４Ｇ８（ａｎｔｉ−Ａβ；Ｓｅｎｅｔｅｋ，Ｎａｐａ，ＣＡ）、ＡＴ８（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ａｂｎｏｒｍａｌｌｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ＰＨＦ−ｔａｕ；Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｇｈｅｎｔ，ベルギー）、ユビキチン（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，デンマーク）、α−シヌクレイン（Ｄａｋｏ）、抗グリア繊維性産生タンパク質（ＧＦＡＰ、Ｄａｋｏ）およびウサギＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質−４３血清（ＴＤＰ−４３；Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）。Ａβ免疫組織化学のための抗原回収は、４Ｇ８、α−シヌクレイン、およびＴＤＰ−４３に対して、５分間室温で薄片を９８％のギ酸で処理することによって、また、ＧＦＡＰおよびユビキチンに対しては、クエン酸塩緩衝剤（ＰＨ６）で沸騰することによって、実施された。すべての希釈は、０．１％ウシ血清アルブミンで０．１Ｍ ＰＢＳにて作成された。染色は、他で記述されているように（Ｐｉｒｉｃｉら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ，６５：２８９−３０１（２００６））、適切な二次抗体とストレプトアビジン−ビオチン−ウマ−ダイコン−ペルオキシダーゼ（ＡＢＣ／ＨＲＰ）で、色原体３’３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ；Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施された。
結果
ＡＤおよびＰＤグループのＰＧＲＮ変異：
６６６人のＡＤ患者、２５５人のＰＤ患者および４５９人の対照個人におけるＰＧＲＮの直接ゲノム配列は、１人のＡＤ患者にナンセンス変異ｐ．Ａｒｇ５３５Ｘ、２人のＡＤ患者と１人のＰＤ患者にヌル変異ＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃを特定した（表１９）。
（表１９）ベルギー人のＡＤおよびＰＤ患者に特定されたＰＧＲＮヌル変異
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注：１＋：第１親等の認知症要請の家族歴、？：認知症の家族歴はわからない；２ＥＸ：エクソン、ＩＶＳ：イントロン、エクソン番号は非コーディング第１エクソンＥＸ０から開始。３ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＣ００３０４３の逆相補体に対して番号付けられ、ｎｔ１から開始。４番号は最大ＰＧＲＮ転写物（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２０８７．２）により、翻訳開始コドンから開始；５番号は最大ＰＧＲＮイソ型（ＧｅｎＰｅｐｔ（登録商標）アクセッション番号ＮＰ＿００２０７８．１）による。
ｐ．Ａｒｇ５３５Ｘナンセンス変異は、位置５３５で中途終止コドン（ＰＴＣ）の形成をもたらした（表１９）。この変異を含む核酸によってコードされた転写物がナンセンス媒介崩壊（ＮＭＤ）メカニズムによって分解されるかどうかを決定するために、患者のリンパ芽球細胞から準備されたｃＤＮＡ配列分析が実施され、結果を患者のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）から取得した配列と比較した。突然変異対立遺伝子は、ｇＤＮＡとｃＤＮＡ両方の配列に存在しており、これは、変異転写物は分解されないことを示し、変異転写物は５９Ｃ末端アミノ酸を欠落している切断ポリペプチドに変換されることを示唆する。
ＡＤおよびＰＤグループのＰＧＲＮ ＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃ変異保持者：
イントロン０のスプライスドナー部位の変異であるＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃが、２人のＡＤ患者（ＤＲ２５．１４およびＤＲ１４２．１）と１人のＰＤ患者（ＤＲ２０５．１；表１９）で検出された。ＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃ変異は、大型のベルギー人ＦＴＤＵ−１７創始者家族ＤＲ８の８つの発端者で特定された（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−４（２００６）、ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅら、Ｂｒａｉｎ，１２９：８４１−５２（２００６））。
３人の患者、ＤＲ２５．１４、ＤＲ１４２．１およびＤＲ２０５．１には、ＤＲ８連結疾病ハプロタイプの少なくとも一部があり、８．０ｃＭの創始者ハプロタイプを１．６１ｃＭにまで縮小し（表２０）、微小管に関連付けられたタンパク質タウをコードする遺伝子を除外した（ＭＡＰＴ）。家系についての調査は、変異保持者ＤＲ１４２．１とＤＲ２０５．１について、認知症のある変異の分離を示す生存中の発病している（第１または第２親等）親族はいないことを示した（図１２）。ＤＲ２５．１４は、認知症の家族歴が陽性で、母親と２人の母方の叔母２人が発症が遅い認知症を発病している。家系についての調査によって、この患者は、ベルギーのＤＲ８創始者家族の分岐、家族ＤＲ２５に近縁関係があること（図１２および１３）、つまり、発端者ＤＲ２５．１と彼女の兄弟ＤＲ２５．５は、ＤＲ２５．１４の第１従兄弟であることが明らかとなった。ＤＲ２５の拡大家族の疾病ハプロタイプの分離が図１３に示される。
（表２０）ＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃ変異保持者におけるＳＴＲマーカーのハプロタイプ共有
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関連対立遺伝子は太字；ａＤＲ８創始者家族で特定された祖先型ハプロタイプ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅら、Ｂｒａｉｎ，１２９：８４１−５２（２００６））；ｂ対立遺伝子頻度は９２人の対照染色体で計算された。ＳＴＲマーカーの遺伝子場所は、Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄ性平均マップから取得した。物理的場所は、ＮＣＢＩゲノムビルド３５に対する相対位置。
ＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃ保持者の臨床特徴は、表２１に要約する。両方のＡＤ患者（ＤＲ２５．１４とＤＲ１４２．１）は、健忘症の病状と症状があった。まず７６歳で最初に現れるようになった最近の記憶の重度の機能的障害に加えて、患者ＤＲ２５．１４は、長期の記憶の損失があった。無感動になり、決断に欠けるようになった。さらに、口頭の流暢さの減少が認められたが、名称には影響がなかった。患者は、時間と空間両方で混乱して、問題解決の機能障害を見せた。ＣＳＦバイオマーカープロファイルはＡＤ典型的に見られるものであって、Ａβ１−４２のレベルが減少して、全タウとＰ−ｔａｕ１８１Ｐのレベルが増加した。患者ＤＲ１４２．１においては、早期症状は、まず、合唱団のメンバーによって気づかれ、患者ＤＲ１４２．１が６６歳のときに、電話を繰り返しかけることや話を繰り返すことが報告された。空間の混乱によって、何回か道に迷うことがあった。疾病の最終段階に向かって、礼儀の欠落が明らかになった。死亡の一年前、自然な会話によるコミュニケーションはもはや可能ではなくなり、口頭および運動の常同行動を見せた。ＡＤの発症年齢は、両方の変異保持者（６６歳と７６歳）の間で顕著に異なり、家族ＤＲ８の発症年齢の広範囲に準じるものである（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−４（２００６）、ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅら、Ｂｒａｉｎ，１２９：８４１−５（２００６）；Ｔａｂｌｅ ２１）。両方の患者はＭｉｄｄｅｌｈｅｉｍ Ｆｒｏｎｔａｌｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ（ＭＦＳ）が４であった（Ｄｅ Ｄｅｙｎら、Ｉｎｔ Ｊ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２０：７０−９（２００５））。
（表２１）ＤＲ８創始者家族におけるＰＧＲＮ ＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃ保持者の臨床および行理学特性の要約
Figure 0005123936
Figure 0005123936
ＣＴ：コンピュータ断層撮影、ＭＲＩ：磁気共鳴撮像法、ＳＰＥＣＴ：単光子放出コンピュータ断層造影、ＰＥＴ：ポジトロン放出断層撮影法、ＰＮＦＡ：進行性非流暢型失語症、Ｒ：右、Ｌ：左、ＰＷＭＬ：脳室周囲白質損傷、ＨＰ：かん流低下、ＮＦＴ：神経原線維変化、ＳＰ：老人斑、ＺＮ：緻密帯、ＳＮ：黒質、ＮＡ：なし。
ＰＤ患者ＤＲ２０５．１は、症状の発症１年後の５６歳でＰＤと診断された。症状は、全身および歯車様固縮、無表情、寡動、ひきずり歩行、姿勢保持障害、および離散型安静時振戦を含んだ。患者は、レボドパ治療によく反応した。集中度の消失が報告されているので、発症１年後に神経心理学的検査が実施され、異常がないことが明らかになった。疾病の発症３年後、進行性の記憶障害が認められ、無気力、発生不全および語性の表現の減少を伴った。次に、動作観察および神経心理学テストによって、洞察力や判断力の消失、性活動の変化、感情制御障害、無言症および反響言語が明らかになり、記憶および空間機能は比較的保持された。これらの所見は、ＰＤに照らし合わせて、または前頭側頭型認知症による顕著な前頭機能障害に一致した。ＤＲ２０５．１は、ＭＳＦスコアが６であった。対象者のうち、ＤＲ２０５．１は、家族情報によれば、母親と２人の母方の叔母は発症が遅い認知症があるが、パーキンソン病の親類はいない。患者は６１歳で死亡し、解剖が実施された。
病理学的特長：
ＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃのある両方のＡＤ患者の臨床診断の病理学的確認は、両方の保持者の死亡時に解剖をしなかったため、取得できなかった。しかしながら、家族ＤＲ２５の発端者（ＤＲ２５．１）とその兄弟（ＤＲ２５．５）は、病理学的にＦＴＬＤ−Ｕが確認された（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−４（２００６）、表２１）。
ＤＲ２０５．１の場合、臨床的にＰＤと診断されて、解剖が実施された。肉眼での検査では、重度の皮質萎縮、特に、前頭葉の萎縮が特筆された。また、尾状核も萎縮しており、黒質および青斑核も重度に無着色であった。組織化学および免疫組織化学的データは、重度のニューロン欠損と、分析された新皮質領域の神経膠症、さらに、リポフスチンを含む多数の生存ニューロンを示した。抗ユビキチン免疫活性は、層ＩＩとＩＩＩおよびより深い皮質層および白質に鎖状封入体の大きな負担を見せた。脳幹、尾状核および時には皮質領域に、希少なレビー小体封入体が観察された。これらの封入体は、ユビキチンとα−シヌクレイン抗体で染色されたが、タウ抗体では染色されなかった。新皮質領域と脳幹神経節では、ユビキチン陽性およびタウおよびα−シヌクレイン陰性封入体が観察された。レンズ状で、ネコの目型の封入体は、特に、脳幹神経節には多量にあった。ＦＴＬＤ−Ｕ封入体ポリペプチドＴＡＲ ＤＮＡ−結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３、Ｎｅｕｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１４：１３０−３（２００６））の染色によって、ユビキチン−陽性封入体（Ｎｉｌ’ｓ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ （ＮＣＩ’ｓ））はＴＤＰ−４３を含むことを示した。正常な核染色は、影響のないニューロンで観察された。これらの所見に基づいて、患者は、広範性のレビー小体疾病とＦＴＬＤ−Ｕの混合病理を持つと診断された。興味深いことに、多数のＡβ染色密度コアプラークも、皮質および海馬領域に観察された。
ＤＲ８創始者家族：
３つの変異保持者、ＤＲ２５．１４、ＤＲ１４２．１およびＤＲ２０５．１を含めて、ＤＲ８創始者家族は、少なくとも７世代にわたって１０の異なる分岐を含み、少なくとも２５０人から構成される。２５０人のうち２３７人についての家系情報が利用可能である（図１２）。２３７人のうち、４４人が発病している。３９人の患者の発症年齢が分かっており、発症の平均年齢は、６４．４歳で４５歳から７８歳の範囲にわたる。３５％の患者が男性である。詳細な医学情報があった患者（Ｎ＝１６）では、診断は、２人の患者で疑われるＡＤ、１人の患者で、前頭障害または前頭側頭型認知症のＰＤ、１３人の患者で前頭側頭葉変性症、そのうち１１人は、進行性非流暢失語症（ＰＮＦＡ；４／１１）またはＦＴＤ（７／１１、ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅら、Ｂｒａｉｎ，１２９：８４１−５２（２００６）、表２１）の症状が現れて、他で報告された。これらの患者で主に現れる症状は、言語障害（ＰＮＦＡ、自然的な会話の減少）、および動作や性格の変化を含み、そのうち、無気力が最も頻繁に認められた（５／１１）。ＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃ変異のあるＤＲ８．１の第１従兄弟（ＤＲ８．１５）は、６３歳で一次進行性失語症を発病した。記憶や日常生活の動作には障害がないが、彼女の言語障害は、流暢が失われる失語症、会話や書く言語の過剰な音韻錯誤症、語性失行症や固執によって特徴付けられた。疾病発症の１年後、患者は、抑制されない笑いや舌やあごの典型的な不随意運動等、行動変化を示し始めた。
ＦＴＤ患者のサンプルのＰＧＲＮの変異分析によって、追加のＩＶＳ０＋５Ｇ＞Ｃ保持者が特定され（ＤＲｌ１９．１；Ｃｒｕｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−４（２００６））、創始者家族の別の分岐を画定した。この患者は、４５歳で言葉発見の困難や社会的離脱が現れた。記憶は保存された。会話は、文や音素錯語の短縮や単純化を特徴とし、ＰＮＦＡの診断につながった。患者の父親は、６５歳で、５年間の進行性言語障害と行動変化の後、死亡した。
ＦＴＬＤと診断された１３人の患者のうち３人において、記憶障害は早期症状であった。パーキンソン病は、一次進行性失語症の診断を受けた１人の患者（ＰＰＡ，ＤＲ２８．１）で観察され、抗精神薬の使用が原因であった。数人の兄弟は、家族の情報によれば、パーキンソン症状があったと報告された。
全部で８人の患者で解剖が実施され、すべての解剖でユビキチン免疫反応性ＮＩＩ’ｓを伴うＦＴＬＤ−Ｕの診断が確認され、ＤＲ２０５．１ではＰＤの診断が同時に行われ、ＤＲ２．３では早期ＡＤ（Ｂｒａａｋ段階Ａ−ＩＩ）の診断が同時に行われた（現れている症状：ＰＮＦＡおよび行動変化）。他の３つの脳では、希少なアミロイド沈着または神経原線維変化が観察され、ＤＲ３１．１および２５．１では海馬領域に限られていた。ＤＲ２０５．１以外の４人の患者では、青斑核の緻密帯の軽度〜著しいニューロン欠損が発見されて、３人の患者では、星状細胞質にメラニンがあった。希少レビー小体は、１人の患者だけに観察された。
ヌル変異に加えて、ＰＧＲＮポリペプチドの配列に影響を与える多数の変異が特定された（表２２）。（５／７）のみの患者に発見されたミスセンス変異体の多数は、顆粒ポリペプチドをコードする領域にあり、これらの変異は、脳の顆粒ポリペプチドの機能に障害を与える可能性を示唆する。ミスセンス変異は、ＦＴＬＤの診断を受けた患者に特定され（ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅら、Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ，２８：４１６（２００７））、３つのうち２つは（ｐ．Ｐｒｏ２４８Ｌｅｕおよびｐ．Ａｒｇ４３２Ｃｙｓ）、ＰＧＲＮポリペプチドの安定性に顕著な影響を持つことが予想された。３つのミスセンス変異、ｐ．Ｐｒｏ４５１Ｌｅｕ、ｐ．Ｃｙｓ１３９Ａｒｇおよびｐ．Ａｒｇ５６４Ｃｙｓは、ポリペプチド構造に同様な効果を持つ可能性があり、ｐ．Ｐｒｏ４５１Ｌｅｕは、非常に保存されたＰｒｏ残基を無効にして、ｐ．Ｃｙｓ１３９Ａｒｇとｐ．Ａｒｇ５６４Ｃｙｓは、Ｃｙｓ残基を作成または破壊する（表２２）。
（表２２）ＰＧＲＮポリペプチド配列に影響を与える変異
Figure 0005123936
１番号はＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＣ００３０４３の逆相補体に対して番号付けられ、ｎｔ１から開始。２最大ＰＧＲＮ転写物（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２０８７．２）により、翻訳開始コドンから開始。３番号は最大ＰＧＲＮイソ型（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２０８７．１）による。４ＥＸ：エクソン、ＩＶＳ：イントロン、エクソン番号は非コーディング第１エクソンＥＸ０から開始。
ＰＧＲＮ核酸内で特定されたさらなる変異は、表２３に記載する。ＰＧＲＮ核酸内で特定された多型は表２４に記載する。
（表２３）さらなるＰＧＲＮ変異
Figure 0005123936
１ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＣ００３０４３の逆相補体に対して番号付けられ、ｎｔ１から開始。２番号は最大ＰＧＲＮ転写物（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２０８７．２）により、翻訳開始コドンから開始。３番号は最大ＰＧＲＮイソ型（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２０８７．１）による。４ＥＸ：エクソン、ＩＶＳ：イントロン、ＵＴＲ：非翻訳領域、エクソン番号は非コーディング第１エクソンＥＸ０から開始。
（表２４）患者および／または対照個人のＰＧＲＮ多型
Figure 0005123936
１ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＣ００３０４３の逆相補体に対して番号付けられ、ｎｔ１から開始。２番号は最大ＰＧＲＮ転写物（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２０８７．２）により、翻訳開始コドンから開始。３番号は最大ＰＧＲＮイソ型（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２０８７．１）による。４ＥＸ：エクソン、ＩＶＳ：イントロン、エクソン番号は非コーディング第１エクソンＥＸ０から開始。
実施例６−プログラニュリン変更の発症年齢と筋萎縮性側索硬化症の生存期間
研究グループ：
確定、推定、または検査結果による推定ＡＬＳの診断を受けた（Ｅｌ Ｅｓｃｏｒｉａｌ基準による、ウェブサイトｗｆｈａｌｓ．ｏｒｇを参照）、全部で２３０人の特発性ＡＬＳ患者が、ベルギーのＬｅｕｖｅｎおよびＡｎｔｗｅｒｐｅｎの大学病院で集められた。発症の平均年齢は、５７．６±１２．３で、１４６人（６３％）の患者が男性であった。２１９人の患者のうち、脊髄または延髄発症は、それぞれ、１６７人と５２人の患者であった。第１の症状後平均生存期間は、３５±２３ヶ月であった（Ｎ＝１８３）。どの患者にもＳＯＤ１変異はなかった。対照グループは、４３６人の地域の１９２人の男性と２４４人の女性の対照で、神経学的に健康であり、ベルギー系であった。対照個人の検査時平均年齢は５８．７±１５．８歳であった。母集団のサブ構造の存在は、構造２．１の無作為に選択されたマイクロサテライトマーカーに基づいて排除された（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５５（２）：９４５−９５９（２０００））。ＤＮＡは、Ｅｌ Ｅｓｃｏｒｉａｌ基準に従って診断された３０８人のオランダのＡＬＳ患者から取得した。発症時の平均年齢は５７．９±１１．６で、６０．３％が男性であった。第１の症状後平均生存期間は、３２．５±２７．４ヶ月であった（Ｎ＝１３０）。オランダ人の対照サンプルは、３４５人から構成され、そのうち４５．８％が男性で、参加時の平均年齢は６０±１１．７歳であった。
ＰＧＲＮ配列決定：
ＰＧＲＮ非コーディングエクソン０、コーディングエクソン１から１２、およびイントロン０の保存された５’正常領域は、他で記載されるプライマーを使用して、２０ｎｇのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅された（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２（７１０５）：９２０−９２４（２００６））。プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェアを使用して設計された（Ｒｏｚｅｎ ａｎｄ Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１３２：３６５−３８６（２０００））。増幅生成物は、１Ｕのａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と１Ｕのエクソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して精製された。精製されたＰＣＲ生成物は、ＰＣＲプライマーまたは必要であれば内部配列決定プライマー、およびＢｉｇ Ｄｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、両方向の配列を決定した。標識を付けた生成物は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ｘ１ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分離された。
ＰＧＲＮ ＳＮＰ遺伝子型決定：
ＩＶＳ４＋２４Ｇ＞Ａ（ＩＶＳ３−４７−４６ｉｎｓＧＴＣAによって、ｒ２＝０．９８９）を除く単一のヌクレオチド多型（ＳＮＰ；マイナー対立遺伝子頻度＞５％）は、２つのＭａｓｓＡＲＲＡＹ ｉＰｌｅｘ分析の後、Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ−Ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析において複製セットで遺伝子型が決定された。ＰＣＲおよび伸長プライマーは、Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ ３．１ソフトウェア（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）を使用して設計された。短い時間、２０ｎｇのゲノムＤＮＡは、標準条件下でＴｉｔａｎｉｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用してＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ生成物は、未合体のｄＮＴＰを除去するために、２０分間、エビのアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）で処理された。Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）は、基本伸長反応のために使用された。プライマー伸長生成物は、洗浄されて、質量分析器（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ Ｎａｎｏｄｉｓｐｅｎｓｅｒ ａｎｄ ＭａｓｓＡＲＲＡＹ ｃｏｍｐａｃｔ ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）を使用して後でスキャンされるチップ上にスポットされた。スペクトル分析と遺伝子型スコアリングは、Ｔｙｐｅｒ３．３ソフトウェア（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）を使用して実施された。
対立遺伝子共有分析：
ＰＧＲＮ周囲の８ｃＭに及ぶ１４のマイクロサテライトマーカーが、ｐ．Ａｌａ３２４Ｔｈｒ変異のある２人のＡＬＳ患者およびアルツハイマー認知症の１人の患者において遺伝子型を決定した。２０ｎｇのゲノムＤＮＡは、他に記述されているように、４つの複合反応でＰＣＲ増幅された（ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅら、Ｂｒａｉｎ，１２９（Ｐｔ ４）：８４１−８５２（２００６））。蛍光で標識を付けた生成物は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ｘ１ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で溶解された。遺伝子型は、カスタムの遺伝子型決定ソフトウェアを使用して割り当てられた。
病原性のコンピュータ予想：
ポリペプチド機能に与えるミスセンス変異の影響は、アミノ酸の配列相同および物理的特性に基づいて、Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｉｎｔｏｌｅｒａｎｔ Ｆｒｏｍ Ｔｏｌｅｒａｎｔ（ＳＩＦＴ ｖ．２）プログラム（Ｎｇ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，１２（３）：４３６−４４６（２００２））を使用して、コンピュータで推定された。３つの異なる入力方法がテストされた。（１）自動ＳＩＦＴ同族体検索（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ４８．７とＴＲＥＭＢＬ３１．７データベースから）および配置手順の両方を使用（２）ＳＩＦＴ剪定と配置プロトコルをＮＣＢＩ’ｓ Ｂｌｉｎｋデータベースからの６１未配置同族体配列に適用（Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３４（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１７３−Ｄ１８０（２００６））および（３）６１ＢＬｉｎｋ配列のｃｕｒａｔｅｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ（Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ，２３（１０）：４０３−４０５（１９９８））配置を提供。各入力に対して、クエリーに１００％または９０％同一な配列が除去された。６つのテストの結果の平均スコアが０．０５より低いものは、ポリペプチド機能の効果を示唆すると考えられた。
グラニュリンドメインにある変異の構造モデルのために、グラニュリンドメインの完全構造が、ヒトグラニュリンＡのＮ末端モジュールの化粧構造に基づいて、ＳｗｉｓｓＰＤＢ−Ｖｉｅｗｅｒ（Ｇｕｅｘ ａｎｄ Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８（１５）：２７１４−２７２３（１９９７）），Ｍｏｄｅｌｌｅｒ（ＦｉｓｅｒおよびＳａｌｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，３７４：４６１−４９１（２００３）），ＰｒｏＱ（ＷａｌｌｎｅｒおよびＥｌｏｆｓｓｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，１２（５）：１０７３−１０８６（２００３））およびＦｏｌｄＸ（Ｓｃｈｙｍｋｏｗｉｔｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３３（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ３８２−Ｗ３８８（２００５））を使用して、再編成された。グラニュリンドメインの安定性に対する変異の効果は、ＦｏｌｄＸを使用して評価され、ジスルフィド結合を形成または分解するためのペナルティを導入した（Ｃｚａｐｌｅｗｓｋｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ，１７（ｌ）：２９−３６（２００４））。ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ分析（Ｃａｒｔｈａｒｉｕｓら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２１（１３）：２９３３−２９４２（２００５））は、推定転写因子結合部位における５’調節変異の効果を推定するために実施された。コアの類似性のカットオフ値には１が使用された。
統計的分析：
Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡（ＨＷＥ）からの逸脱は、ベルギーとオランダ両方のサンプルに対してＨＷＥプログラムを使用して排除された（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｏｔｔ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌｉｎｋａｇｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９４））。マイナー対立遺伝子頻度が５％に満たないＳＮＰについて、ＡＬＳの感受性に対する各検出された共通の変異の寄与を推算するために、年齢と性別に対して調整されたカイ二乗統計量とロジスティック回帰分析が、ＳＰＰＳ１２．０で実施された。遺伝子型と表現型の関係を研究するために、ＡＬＳの脊髄または延髄発症のある患者に対して追加の分析が実施された。患者における発症時年齢に対する多型の影響は、性別と発症の部位に対して調整された、単変量分散分析で評価された。第１の症状の発症後の生存期間に対する多型の影響は、Ｃｏｘ比例ハザードモデルでテストされた。ハザード比（ＨＲ）は、性別、第１の症状の部位、および第１の症状時の年齢に調整された９５％の信頼区間（９５％ＣＩ）で計算された。Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ（Ｂａｒｒｅｔｔら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２１（２）：２６３−２６５（２００５））で計算された対付加ＬＤは、２つのブロックのＬＤが増加していることを明らかにしたが、１つは５’調節領域に及び、２番目は、イントロン２から３’非翻訳領域に及んだ。ハプロタイプ頻度は、各対象に対してハプロタイプの可能性とハプロタイプの組の事後確率の両方の最大確率予想を計算する前進ＥＭ挿入アルゴリズムを使用して、これらのＬＤブロックで推算された。ハプロタイプの関連は、これらのハプロタイプ確率に基づいて、値統計で調査された。スライドウィンドウ分析は、２ＳＮＰウィンドウで実施された。ハプロタイプの予想と分析の両方は、Ｈａｐｌｏ Ｓｔａｔｓバージョン１．２．２で実施された（Ｓｃｈａｉｄら、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，７０（２）：４２５−４３４（２００２））。シミュレーションＰ値は、患者の１０００の無作為の順列とタイプＩ誤差率を制御する制御ラベルに基づいて計算された。
結果
ＰＧＲＮ配列決定：
ＰＧＲＮの系統的変異分析は、ＡＬＳと診断された一連の２３０人のベルギー患者および４３６人の対照個人においてエクソンとイントロンの境界、および５’および３’調節領域を含めたすべてのコーディングエクソンを直接配列決定することによって実施された。１７の希少な変異（マイナー対立遺伝子頻度＜５％）は、２９人の患者で特定された（９つのエクソン変異、４つのイントロン変異、３つの５’調節領域の変異、および１つの３’調節領域の変異）。これらの希少な変異のうち、１１は、８７２の対照染色体には見られなかった（表２５、２６および２７）。
（表２５）ＡＬＳにおけるＰＧＲＮミスセンス変異
Figure 0005123936
１ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＣ００３０４３の逆相補体に対して番号付けられ、ｎｔ１から開始。２番号は最大ＰＧＲＮ転写物（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２０８７．２）により、翻訳開始コドンから開始。３番号は最大ＰＧＲＮイソ型（ＧｅｎＰｅｐｔ（登録商標）アクセッション番号ＮＰ＿００２０８７．１）による。４ＥＸ：エクソン、エクソン番号は、非コーディング第１エクソンＥＸ０から開始。５患者の変異の頻度、４３６人の健常者には見られない。６０．０５より低い平均ＳＩＦＴスコアは、ポリペプチド機能に影響を与えることが予想される。
（表２６）ＰＧＲＮ５’調節領域の遺伝子変異
Figure 0005123936
１ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＣ００３０４３の逆相補体に対して番号付けられ、ｎｔ１で開始；２ＥＸ：エクソン、ＩＶＳ：イントロン、エクソン番号は非コーディング第１エクソンＥＸ０から開始。３ＴＦＢＳ：転写因子結合部位；ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ予想。
（表２７）希少なＰＧＲＮサイレントおよびイントロン変異
Figure 0005123936
１ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＣ００３０４３の逆相補体に対して番号付けられ、ｎｔ１から開始。２番号は最大ＰＧＲＮ転写物（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２０８７．２）により、翻訳開始コドンから開始。３番号は最大ＰＧＲＮイソ型（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＰ＿００２０７８．１）による。４ＥＸ：エクソン、ＩＶＳ：イントロン、エクソン番号は非コーディング第１エクソンＥＸ０から開始。
ミスセンス変異：
９つのエクソン配列変異は、ベルギー人の対照にはない４つのミスセンス変異、ｃ．３２９Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ１ １１０Ｇｌｎ）、ｃ．３７１Ｔ＞Ｃ（Ｉｌｅ１２４Ｔｈｒ）、ｃ．９７０Ｇ＞Ａ（Ａｌａ３２４Ｔｈｒ）およびｃ．１２５３Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ４１８Ｇｌｎ）を含んだ。すべての４つのミスセンス変異は、グラニュリンドメイン内または境界上に存在した。Ａｒｇ１１０Ｇｌｎは、グラニュリンＧドメインのＣ末端に存在するが、野生型残基は、グラニュリンドメイン間に保存されない。ＳＩＦＴ分析は、同族体配列の進化的保存に基づいて、Ａｒｇ１１０Ｇｌｎがおそらくポリペプチド機能に影響を与えないこと予想した（平均ＳＩＦＴスコア０．３９）。Ａｒｇ４１８ＧｌｎはグラニュリンＣのＣ末端境界に存在する。ＳＩＦＴ分析は、Ａｒｇ４１８Ｇｌｎがポリペプチド機能で容認される可能性があることを予想した（平均ＳＩＦＴスコア０．２７）。Ｉｌｅ１２４Ｔｈｒは、ＩｌｅまたはＶａｌのいずれかの残基を含む、グラニュリンドメイン間で保存される位置である、グラニュリンＦドメインのＮ末端境界に存在する。ＳＩＦＴ分析は、６つのテストのうち４つでＩｌｅ１２４Ｔｈｒがポリペプチド機能に影響を与えることを予想したが、６１同族体配列のＣｌｕｓｔａｌＸ配置をＢＬｉｎｋからＳＩＦＴに直接提供することは、Ｉｌｅ１２４Ｔｈｒが許容されると予想した。特にヒトＰＧＲＮについて検証されたＳＩＦＴ分析を１３の配列に制限することによって、ＳＩＦＴスコアは０．０１になり、非許容の変化を予測した。Ｉｌｅ１２４Ｔｈｒは、グラニュリンドメインの安定性に対して平均−０．３５±０．０３ｋｃａｌ／ｍｏｌで、弱い安定性効果があることが予想された。Ａｌａ３２４Ｔｈｒは、非保存位置のグラニュリンＡドメインに存在する。ＳＩＦＴ分析はＡｌａ３２４Ｔｈｒが許容されることを予測し、変異の構造モデリングによって、グラニュリンドメイン上に０．３６±０．０１ｋｃａｌ／ｍｏｌの弱い非安定効果が明らかになった。興味深いことに、Ａｌａ３２４Ｔｈｒは、アルツハイマー認知症のあるベルギー人の患者にも検出された。対立遺伝子共有によって、両方のＡＬＳ患者は、最大２．８Ｍｂの共有領域に広がるＰＧＲＮに隣接しているマイクロサテライトマーカーの対立遺伝子を共有していることが明らかになった。１人のＡＬＳ患者は、約６Ｍｂに広がる、アルツハイマー患者の７つの連続マーカーで対立遺伝子を共有した（表２８）。
（表２８）ｐ．Ａｌａ３２４Ｔｈｒ変異保持者における対立遺伝子共有分析
Figure 0005123936
共有対立遺伝子は、太字で表示；共有対立遺伝子の頻度は１０２人のベルギー人の対照に基づく。
調節変異：
３つの変異体は、５’調節領域で検出され、そのうち、非コーディングエクソン０の１つは、対照染色体にはなかった（表２６）。ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ分析は、この変異（ｇ．９６０６１Ａ＞Ｇ）がおそらくＥＶＩ１、ＰＡＸ２およびＩＳＲＥ転写因子結合部位を破壊して、ＮＦＡＴ結合部位を作成することを予想した。ｇ．９６７２１Ａ＞Ｇの転写因子結合部位には大きな変化がないことが予測されたが、ｇ．９６４７２Ｇ＞ＡはＥＬＫ１またはＡＬＭ３結合部位を作成する可能性がある。後者の２つの変異体は、それぞれ３人の患者（１．３％）および３人の対照個人（０．７％）に存在したので、これらの頻度は、患者と対照の間では顕著な差がなかった（ＯＲ１．９（９５％ ＣＩ０．４−９．５、ｐ値０．４））。
臨床発現型：
患者のみに特定されて、ポリペプチド機能または発現に影響を与える５つの変異のうち、４つは５人の女性に特定され、１つ（Ｉｌｅ１２４Ｔｈｒ）は男性に特定された。すべての女性には、疾病の脊髄発症があったが、男性患者には延髄発症があった。発症年齢は、患者によってばらつきがあり、５３歳（Ａｌａ３２４Ｔｈｒ）から７４歳（Ａｒｇ１１０Ｇｌｎ）までであった。同様に、疾病期間も１６ヶ月（Ｉｌｅ１２４Ｔｈｒ）から８８ヶ月超（Ａｌａ３２４Ｔｈｒ）とばらついた。Ａｌａ３２４Ｔｈｒのある２人の患者の間でも、発症年齢と疾病期間は大きくばらついた。１人の患者は、６２歳で第１の症状を示して、２８ヵ月後に死亡した。もう１人の患者は５３歳で第１の症状があり、８８ヵ月後まだ生存していた。２人の患者は、８６歳で推定アルツハイマー認知症と診断された男性と２．８Ｍｂハプロタイプを共有して、離れた共通の祖先を示唆する。
共通のＰＧＲＮ多型：
遺伝子関連分析のために、８つの頻繁なＳＮＰの遺伝子型データ（マイナー対立遺伝子頻度＞５％）が、ベルギー人患者とベルギー人対照の両方から取得された配列データから抽出された（表２９）。遺伝子型頻度は、個別のＳＮＰのいずれに対しても患者と対照の間では、未分析でも、ロジスティックス回帰解析に調整された年齢または性別でも差はみられなかった（表２９）。ハプロタイプベースの関連分析が、高いＬＤのあるＰＧＲＮの２つの個別のブロックで実施された。どちらのＬＤブロックでも、ＡＬＳ患者と対照の間では、統計的に顕著な全体的またはハプロタイプ特定の差は観察されなかった（全体Ｐ値は、それぞれ０．３４および０．６３）。
（表２９）ＡＬＳ患者と対照個人におけるＰＧＲＮ ＳＮＰの遺伝子型頻度
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１ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＣ００３０４３の逆相補体に対して番号付けられ、ｎｔ１で開始；２ＥＸ：エクソン、ＩＶＳ：イントロン、ＵＴＲ：非翻訳領域；エクソン番号は非コーディング第１エクソンＥＸ０から開始。
遺伝子型と表現型の相関関係：
ＡＬＳの臨床不均一性により、発症の部位（脊髄または延髄）、発症時年齢、および生存期間に対するＰＧＲＮ ＳＮＰの影響が評価された。単一のＳＮＰまたはハプロタイプと発症部位の間には関連が観察されなかった。しかし、発症時年齢は、希少対立遺伝子ＩＶＳ２＋２１Ｇ＞Ａの保持者においては有意に低くなり（平均差：７．７歳（９５％信頼区間：３．２−１２．１歳、ｐ＝０．００１））、さらに希少対立遺伝子ＩＶＳ３−４７−４６ｉｎｓＧＴＣＡとＩＶＳ４＋２４Ｇ＞Ａの保持者においては、少ない程度で、同様であった（ペアワイズｒ２＝０．９８９、平均差：４．１歳（９５％信頼区間：０．９−７．４歳、ｐ＝０．０１３）。ハプロタイプベースの設定では、スライディングウィンドウ分析は、ＩＶＳ２＋２１Ｇ＞ＡとＩＶＳ３−４７−４６ｉｎｓＧＴＣＡの２−ＳＮＰウィンドウが、発症時年齢と有意に関連付けられることを示唆した（ｐ＝０．００５、図１４）。さらに、ＩＶＳ２＋２１Ｇ＞Ａの希少対立遺伝子の保持者は、ＡＬＳの発症後有意に短い生存年数であった（ＨＲ１．７０（９５％信頼区間：１．１０−２．６４、ｐ＝０．０１７）、図１５）。有意ではないが、同様な規模のＨＲは、希少対立遺伝子ＩＶＳ３−４７−４６ｉｎｓＧＴＣＡおよびＩＶＳ４＋２４Ｇ＞Ａの保持者に観察された（ＨＲ １．８２（９５％信頼区間：０．８４−３．９５、ｐ＝０．１））。これらの発見を確認するために、ＤＬＳ患者と対照のオランダのサンプルにおいて、関連分析を再現した。ベルギーのサンプルと同様に、単一のＳＮＰまたはハプロタイプと疾病状況または発症の部位との間には統計的に有意な関連は観察されなかったが、ＩＶＳ３−４７−４６ｉｎｓＧＴＣＡでの希少対立遺伝子に対するホモ接合の患者は、ＡＬＳの発症後有意に短い生存年数であった（ＨＲ ２．２９（９５％信頼区間：１．１５−４．５５、ｐ＝０．０１８））。
実施例７−前頭側頭型認知症の頻繁な原因であるゲノムプログラニュリン欠失
ＦＴＤの病因に対するゲノムＰＧＲＮ欠失の寄与は、純粋なＦＴＤを有する１０３人の家族関係を持たないベルギー人の患者で評価された（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６））。４つのＰＧＲＮヌル変異が、他で記述されているように１０３人の患者のうち１１人で特定された（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６））。
ＰＧＲＮコピー数の変化を検出するために、ＦＴＤシリーズは、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎでスクリーニングされた（ＭＡＱ；Ｓｕｌｓら、Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ，２７：９１４−９２０（２００６））。ＭＡＱ技法は、１つの複合ＰＣＲ反応で取得された蛍光標識されたテストアンプリコンと参照アンプリコンの数の定量化が関与する。ＰＧＲＮ ＭＡＱ分析は、ＰＧＲＮ内および周囲に存在する６つのテストアンプリコンと、無作為に選択されたゲノム位置に存在する７つの参照アンプリコンを含んだ（図１６Ｂ）。これらの１３のフラグメントは、最適化反応条件で１つのＰＣＲ反応において、２０ｎｇのゲノムＤＮＡを使用して同時に増幅された。テストアンプリコンのピーク領域は、参照アンプリコンのピーク領域に標準化された。患者と対照の間でテストアンプリコンの標準化されたピーク領域を比較することによって、ＭＡＱソフトウェア（ＭＡＱｓ）パッケージ（ウェブサイトｖｉｂｇｅｎｅｔｉｃｓｅｒｖｉｃｅｆａｃｉｌｉｔｙ．ｂｅ／ＭＡＱ．ｈｔｍ）によって計算され、各テストアンプリコンに対する投与量（ＤＱ）が得られた。０．７５未満のＤＱ値は、欠失を示唆した。１０３人のＦＴＤ患者のＭＡＱ分析によって、２人のＦＴＤ患者において、２つ以上のテストアンプリコンの２つの欠失の存在が明らかになった（図１６Ａ）。患者ＤＲ１８４．１において、すべてのテストアンプリコンのＤＱは、０．７５未満に減少して、５’と３’のフランキング領域を含むＰＧＲＮのゲノム欠失を示唆した。患者ＤＲ１５．１において、３から６のテストアンプリコンだけが、０．７５未満のＤＱを示し、エクソン０を含まない遺伝子の部分的欠失、およびテロメア的にのみＰＧＲＮを超えることを示唆した（図１６Ａおよび１６Ｂ）。欠失は、ＭＡＱ分析を使用して、２６７人の神経学的に健康なベルギー人の対照（平均年齢５８．４±１６．０歳、範囲２５−９２歳）では除外された。
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上でＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ分析を使用して、ＰＧＲＮのコピー数を定量化するために、リアルタイムＰＣＲ対立遺伝子定量化（ｑＰＣＲ）が実施された。各ＰＧＲＮエクソンの１つのアンプリコンおよびヒトユビキチンＣ（ｈＵＢＣ）およびヒトβ２−ミクログロブリン（ｈＢ２Ｍ）の１つのアンプリコンに対するプライマーは、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で設計された。プライマー配列は表３０にリストされる。患者と対照からの２０ＮｇのゲノムＤＮＡは、他に記載のように（Ｓｌｅｅｇｅｒｓら、Ｂｒａｉｎ，１２９：２９７７−２９８３（２００６））ユニバーサル増幅プロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、二重に増幅された。ＤＱは、患者と対照の間の標準化された定量を比較することによって計算された。ＰＧＲＮエクソン１１のアンプリコンのｑＰＣＲは、ＦＴＤサンプル全体のｈＵＢＤおよびｈＢ２Ｍに比較されて、ＤＲ１８４．１とＤＲ１５．１を含めて、３３人の患者は、０．７５未満のＤＱがあることが特定された。これらの患者は、さらに、１２の残りのＰＧＲＮエクソンについて分析されて、３人の患者は大量のＰＧＲＮ欠失があることが特定された。ＤＲ１８４．１では、すべてのＰＧＲＮエクソンのＤＱは０．７５未満で、ＤＲ１５．１では、ＰＧＲＮエクソン１から１２のＤＱは０．７５未満であった（図１６Ｃ）。これらの結果は、ＭＡＱ結果と合致した。１人の追加の患者（ＤＲ１８８．１）は、ＤＲ１５．１の欠失に類似して、エクソン０を除くすべてのＰＧＲＮエクソンを含む領域で欠失があることが観察された（図１６Ｃ）。ｑＰＣＲデータは、さらに、ＰＧＲＮエクソン１１を増幅するように設計されたＴａｑＭａｎ分析を使用して確認された。領域配列は表３０に列挙される。
（表３０）ＰＧＲＮ ｑＰＣＲのプライマーおよび領域配列
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ＭＡＱおよびｑＰＣＲ結果を確認し、かつ欠失領域をさらにマッピングするために、患者ＤＲ１８４．１からのＤＮＡを使用して、制限マッピングが実施された。ＤＲ１８４．１および２人の対照からの１０μｇのＤＮＡが、３０ＵのＰｓｔＩで消化されて、サイズ標準として１ｋｂプラスＤＮＡラダーと共に０．７％アガロースゲル上で分離された（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。サザンブロット後、ＰＧＲＮ’３ＵＴＲおよび下流配列の一部を含むフラグメントは、標準化のための参照フラグメントと組み合わせて、他に記述のとおりハイブリダイズした（Ｃｒｕｔｓら、Ｈｕｍ ＭｏＩ Ｇｅｎｅｔ，１４：１７５３−１７６２（２００５））。ＰＧＲＮプローブとハイブリダイズした１．４ｋｂ ＰｓｔＩ制限フラグメントのシグナル密度は、対照と比較して、患者の参照プローブとハイブリダイズした１．９ｋｂ ＰｓｔＩ制限フラグメントよりも低かった（図１７）。バンドは、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｔａｔｉｏｎ ４４０（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を用い、患者からのサンプルとＰＧＲＮ対立遺伝子の１つの欠損が確認された対照との間で標準化されたバンドと比較して定量化された（図１７）。サイズが異なったバンドは観察されず、この領域の結合フラグメントがないことと、この技法で欠失のさらなるマッピングを妨げていることを示唆した。患者ＤＲ１８４．１の欠失のサイズを明確にするために、任意に選択された参照フラグメントと共増幅されたＰＧＲＮ内および隣接する選択したフラグメントの１００を超える半定量複合ＰＣＲから構成されるマッピングパネルが生成された。プライマーは表３１に列挙される。得られたバンドは、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｔａｔｉｏｎ ４４０（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）にて定量化され、ＤＱは、患者における標準化されたバンドの強度の、対照個人に対する比として計算された。この分析によって、最大領域の７４．３ｋｂに広がると共に、フラグメントｃｅｎ１４とｃｅｎ１５の間の１９．４ｋｂにセントロメア的かつｔｅｌ２とｔｅｌ３の間のフラグメントにテロメア的な、ブレイクポイント領域の微細マッピング内の欠失が明らかになった（図１８と１９）。フラグメントｃｅｎ１４とｃｅｎ１５の間に、ヘテロ接合のＳＴＲマーカーＤ１７Ｓ１８６０が位置することが見出され、これはさらに、セントロメアのブレイクポイント領域を１４．３ｋｂまで微細マッピングして、さらに減少できない６９．１ｋｂの最終最大欠失領域となる（図１８および１９）。ＰＧＲＮに加えて、この領域は、２つの他の知られている遺伝子、ＲＰＩＰ８とＳＬＣ２５Ａ３９を含み（ＮＣＢＩ Ｂｕｉｌｄ３５、ウェブサイト ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ？ｏｒｇ＝Ｈｕｍａｎ＆ｄｂ＝ｈｇｌ７、図１８と１９）、そのうち、５０％は、患者が特徴的なＦＴＤ特性以外の症状を示さなかったので、正常な機能を実行するのに十分な可能性がある。さらに、これらの２つの遺伝子の各々は、一つの遺伝子家族に属し、必要であれば、遺伝子欠損がその他の家族メンバーによって補完される可能性があることを示唆する。また、マッピングパネルは、ＰＧＲＮ欠失の約７７ｋｂ上流周囲で、ＤＲ１８４．１の第２の欠失領域も明らかにした（図１８および１９）。第２の欠失領域は、ＲｅｆＳｅｑ遺伝子ＨＤＡＣ５と、フラグメントｃｅｎ３とｃｅｎ４との間に約０．５ｋｂのセントロメアなブレイクポイント領域と、フラグメントｃｅｎ８とｃｅｎ９の間の２０．７ｋｂのテロメア的なブレイクポイント領域のあるＧ６ＰＣ３の一部を含む６２．９ｋｂの最大サイズにマッピングされた（図１８および１９）。欠失は、おそらく、９５人のうち８人の無関係な健常者のＢＡＣ配列ＣＧＨによって特定されたコピー数変異（ＣＮＶ）を発現し（Ｗｏｎｇら、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，８０：９１−１０４（２００７）、ウェブサイトｐｒｏｊｅｃｔｓ．ｔｃａｇ．ｃａ／ｖａｒｉａｔｉｏｎ／の遺伝子変異のデータベース）、これらの個人は２９．６ｋｂの欠失領域だけを共通して持つにもかかわらず、ＢＡＣ ＲＰ１１−７５６Ｈ１１（図１９）の欠損を暗示する。これは、ＣＮＶ境界を正確にマッピングするには低すぎる、ＢＡＣ配列ＣＧＨの分析によって、またはこの領域の異なるサイズのいくつかのＣＮＶの発生によって、説明できる。これらの２つの欠失のいずれも、ＤＲ１８４．１の発病していない兄弟では特定されなかった。さらに、１７ｑ２１の遺伝子型決定ＳＴＲマーカーは、２人の兄弟が１つのハプロタイプを共有することを示した。これらの２つの観察は、ＤＲ１８４．１の２つの削除領域がｃｉｓに存在することを示した。
（表３１）半定量的合成ＰＣＲマッピングパネルのプライマー配列
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イントロン０の５つの既知のＳＮＰ（ｒｓ３８５９２６８、ｒｓ２８７９０９６、ｒｓ３７８５８１７、ｒｓ４７９２９３８およびｒｓ４７９２９３９）は、ＭＡＱおよび／またはｑＰＣＲデータがＰＧＲＮエクソン０は欠失領域から除外されたので、遺伝子型が決定された。最も３’のＳＮＰ ｒｓ４７９２９３９だけが、ＤＲ１５．１でホモ接合であったので、さらに、イントロン０のｒｓ４７９２９３８とＭＡＱアンプリコン３の間の１．５ｋｂのブレイクポイント領域に対するセントロメア末端で欠失の区切りが可能になった（図１９）。対照的に、ＤＲ１８８．１の欠失のセントロメアのブレイクポイント領域は約４ｋｂのままで、エクソン０とエクソン１のｑＰＣＲアンプリコンによって画定された（図１９）。テロメアのブレイクポイント領域は、これら２人の患者のどちらでも特定されなかった。従って、欠失の最小サイズだけが、ＭＡＱアンプリコン３からＭＡＱアンプリコン６のＤＲ１５．１で約１１．５ｋｂ、およびｑＰＣＲエクソン１からｑＰＣＲエクソン１２までのＤＲ１８８．１で約３．６ｋｂと推定された（図１９）。推定された最小サイズに基づいて、欠失はＰＧＲＮ以外の遺伝子は含まなかった。しかしながら、ｑＰＣＲエクソン０のＤＱは０．７５をわずかに上回るだけであったので、ＤＲ１８８．１のセントロメアのブレイクポイントは、ＤＲ１８４．１のようにＰＧＲＮのもっと上流に存在する可能性を示唆するので、ＤＲ１８８．１の欠失の範囲が、推算したよりも大きい可能性はある。
ゲノムＰＧＲＮ欠失のある３人の患者には、言語障害を含めて典型的なＦＴＤ症状が現れた。これらの患者は、疾病の発症が遅く、疾病の４年後に死亡した患者ＤＲ１８４．１を除き、１０年を超える疾病期間であり、より大型領域の欠失がより重度な疾病症状を示唆する。認知症の家族歴陽性は、父親が発病した患者ＤＲ１５．１で記録された。３人の患者のいずれも、分離分析を実施する発病した親類はいなかった。
ゲノム欠失は、ベルギー人のサンプルにおいてＦＴＤの遺伝子病因の少なくとも２．９％と、家族性ＦＴＤの少なくとも２．３％を説明する。その他に記述された１１人の患者で特定されたヌル変異とあわせると（Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６））、ＰＧＲＮ変異は、すべてのＦＴＤ患者の約１３．６％、および家族歴陽性のＦＴＤ患者の約２７．９％を占め、潜在的なミスセンスおよびプロモーター変異も考慮するとそれぞれ、約１７．４％と３２．６％に上昇する（ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅら、Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ，２８：４１６（２００７））。
実施例８−ＰＧＲＮポリペプチドレベルを変更可能な化学物質の特定
全トランスレチノイン酸と炎症の事象は、ＰＧＲＮ発現の主な調節因子になることが観察された。（ＨｅおよびＢａｔｅｍａｎ，Ｊ ＭｏＩ Ｍｅｄ，８１：６００−６１２（２００３）、Ｈｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６２：５５９０−５５９６（２００２）、Ｏｎｇら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２９１：Ｒ１６０２−１６１２（２００６））。これらのデータは、これらの生化学経路に関連するある種類の薬剤（例えばＮＳＡＩＤやＰＰＡＲ複合物）が、ＰＧＲＮ生成に影響を与える可能性を示唆した。多様な細胞株やＮＳＡＩＤおよびＰＰＡＲ複合物族のいくつかの複合物を使用して、これらの薬剤が細胞培養系でＰＧＲＮポリペプチド生成を調整することができるかを調べるための研究が実施された。
材料および方法
細胞培養は、５％ウシ胎仔血清と１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンで補完された標準細胞培地で維持された（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。細胞培養は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒトＨｅＬａ細胞、ＢＥ（２）−Ｍ１７、ヒト神経芽細胞腫（Ｍ１７）、Ｎ２Ａ、マウス神経芽細胞腫およびヒトリンパ芽球細胞から構成された。
次のＮＳＡＩＤ、すなわち、イブプロフェン（Ｂｉｏｍｏｌ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）、インドメタシン（Ｂｉｏｍｏｌ）、ジクロフェナク（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、ナプロキセン（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）およびアスピリン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）は、賦形剤ＤＭＳＯに溶解された。細胞は、血清含有培地で培養され、２４時間、特定のＮＳＡＩＤを含む血清を含まない培地で処理された。ＮＳＡＩＤの毒性は、標準のＭＴＴ−分析（３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリルイル（ｔｈｉａｚｏｌｙｌｙｌ））−２，５−ジフェニル−２Ｈ−臭化テトラゾリウム）を使用して確認された。細胞毒性研究のために、細胞は、１００μＭまでの濃度でＮＳＡＩＤＳで処理された。
次のＰＰＡＲ活性剤、すなわち、シグリタゾン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、フェノフィブレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、クロフィブレート（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）およびＬ１６５０４１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）がＤＭＳＯに溶解された。細胞は、血清含有培地で培養され、２４時間、特定のＰＰＡＲアゴニストを含む血清を含まない培地で処理された。
クルクミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびレスベラトロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）がＤＭＳＯに溶解された。細胞は、血清含有培地で培養され、２４時間、クルクミンまたはレスベラトロールを含む血清を含まない培地で処理された。
使用された抗体は、全長のプログラニュリンポリペプチドに対するモノクローナルヒトプログラニュリン抗体（Ｚｙｍｅｄ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、全長のプログラニュリンポリペプチドに対するマウスプログラニュリン抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）および抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含んだ。
結果
細胞内および分泌ＰＧＲＮポリペプチドレベルを増加させるＰＰＡＲα活性剤：
細胞培養物は、ＰＰＡＲα活性剤クロフィブレートの濃度を増やして、またはＤＭＳＯで処理された。培養表面および細胞溶解物中のＰＧＲＮポリペプチドのレベルは、ウエスタンブロットを使用して分析された。細胞内および分泌されたＰＧＲＮポリペプチドのレベルは、クロフィブレートで処理されたＭ１７細胞培養物とＤＭＳＯ処理されたＭ１７細胞培養物で比較された（図２０）。クロフィブレートによる処理は、初期の増加と、次に２４時間後のＰＧＲＮポリペプチドの細胞内および分泌両方のＰＧＲＮポリペプチドのレベルの減少を発生させた。５μＭのクロフィブレートによって処理された細胞培養物は、分泌ＰＧＲＮポリペプチドのレベルで１４０％の増加を示した。ＧＡＰＤＨポリペプチド発現に対する有意な効果は観察されなかった。これらの結果は、クロフィブレートによるＭ１７細胞の処理が、選択的に、分泌ＰＧＲＮポリペプチドレベルを上昇させたことを示す。
また、細胞内および分泌されたＰＧＲＮポリペプチドのレベルは、クロフィブレートで処理されたヒトリンパ芽球細胞培養物とＤＭＳＯ処理されたヒトリンパ芽球細胞培養で比較された（図２１）。１１０μＭのクロフィブレートによって処理された細胞培養物は、分泌ＰＧＲＮポリペプチドのレベルで７００％の増加を示した。ＧＡＰＤＨポリペプチド発現に対する有意な効果は観察されなかった。これらの結果は、クロフィブレートによるヒトリンパ芽球細胞の処理が、用量依存的に、ＰＧＲＮポリペプチドレベルの分泌および細胞内ＰＧＲＮポリペプチドレベルを選択的に上昇させたことを示す。クロフィブレート処理では、細胞毒性は観察されなかった。
細胞間および分泌ＰＧＲＮポリペプチドレベルを増加させるＰＰＡＲγ活性剤：
細胞培養物は、ＰＰＡＲγ活性剤シグリタゾンの濃度を増加しつつ処理された。培養物の上清および細胞溶解物中のＰＧＲＮポリペプチドのレベルは、ウエスタンブロットを使用して分析された。シグリタゾンで処理されたＭ１７細胞の上清および細胞溶解物中のＰＧＲＮポリペプチドのレベルは、それぞれ、ＤＭＳＯで処理されたＭ１７細胞の表面および細胞溶解物中の対応するレベルと比較された（図２２）。１．５から２４μＭのシグリタゾンで処理した細胞培養は、分泌ＰＧＲＮポリペプチドのレベルで２００％から３５０％の増加と、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドのレベルでは約１１０％から１７０％の増加を示した。ＧＡＰＤＨポリペプチド発現に対する有意な効果は観察されなかった。これらの結果は、シグリタゾンによるＭ１７細胞の処理が、用量依存的に、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドおよび分泌ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを選択的に上昇させたことを示す。
シグリタゾンで処理されたヒトリンパ芽球細胞の上清および細胞溶解物中のＰＧＲＮポリペプチドのレベルは、それぞれ、ＤＭＳＯで処理されたヒトリンパ芽球細胞の表面および細胞溶解物中の対応するレベルと比較された（図２３）。１２μＭのシグリタゾンによって処理された細胞培養は、分泌ＰＧＲＮポリペプチドのレベルで５００％の増加を示した。ＧＡＰＤＨポリペプチド発現に対する有意な効果は観察されなかった。これらの結果は、クロフィブレートによるヒトリンパ芽球細胞の処理が、選択的に、分泌および細胞内ＰＧＲＮポリペプチドレベルを上昇させたことを示した。クロフィブレート処理では、細胞毒性は観察されなかった。
細胞間および分泌ＰＧＲＮポリペプチドレベルを増加させるＰＰＡＲδ活性剤：
細胞培養は、多様な濃度のＰＰＡＲδ活性剤Ｌ１６５，０４１で処理された。培養上清および細胞溶解物中のＰＧＲＮのレベルは、ウエスタンブロットを使用して分析された。多様な濃度のＬ１６５，０４１で処理されたヒトリンパ芽球細胞の細胞内および分泌ＰＧＲＮポリペプチドレベルは、ＤＭＳＯで処理されたヒトリンパ芽球細胞の対応するレベルと比較された（図２４）。３から１２ｎＭのＬ１６５，０４１でヒトリンパ芽球細胞の処理２４時間後、細胞内および分泌両方のＰＧＲＮポリペプチドの有意な増加が観察された。１２から４８ｎＭのＬ１６５，０４１で処理した細胞培養は、分泌ＰＧＲＮポリペプチドのレベルで約６００％の増加と、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドのレベルで約２００％の増加を示した。ＧＡＰＤＨポリペプチド発現に対す有意著な効果は観察されなかった。これらの結果は、Ｌ１６５，０４１によるヒトリンパ芽球細胞の処理が、用量依存的に、ＰＧＲＮポリペプチドレベルの細胞内および分泌ＰＧＲＮポリペプチドレベルを選択的に上昇させたことを示す。
多様な濃度のＬ１６５，０４１で処理されたＭ１７細胞の細胞培養上清および細胞溶解物質中のＰＧＲＮポリペプチドのレベルも、ＤＭＳＯで処理されたＭ１７細胞の対応するＰＧＲＮポリペプチドレベルと比較された（図２５）。３から２４ｎＭのＬ１６５，０４１によるＭ１７細胞の処理は、２４時間後、細胞内および分泌両方のＰＧＲＮポリペプチドレベルを有意に増加させた。４８ｎＭまでの濃度では、Ｌ１６５，０４１による処理後に細胞毒性が観察されなかった。
ＰＰＡＲδアゴニスト、ＧＷ５０１５１６も、Ｍ１７およびＮ２Ａ細胞株でＰＧＲＮポリペプチドレベルを上昇することが観察された。
細胞内および分泌ＰＧＲＮポリペプチドレベルを調整するＮＳＡＩＤ：
ＨｅＬａ細胞培養（すべての研究でＮ＝４）は、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン、メクロフェナム酸、およびアセチルサリチル酸を含めて、さまざまな濃度のＮＳＡＩＤで２４時間、血清を含まない培地で処理された。培養物上清および細胞溶解物中のＰＧＲＮポリペプチドのレベルは、ウエスタンブロットを使用して分析された。
処理済みおよび未処理のＨｅＬａ細胞は、免疫組織化学を使用して、ＰＧＲＮポリペプチド発現を分析した。ＰＧＲＮポリペプチドの核周辺発現が未処理の細胞で観察された。イブプロフェン（２．５μＭで２４時間）の処理は、ＨｅＬａ細胞のゴルジ体でＰＧＲＮポリペプチド発現を増加させた。多様な濃度のイブプロフェンで処理されたＨｅＬａ細胞の細胞の細胞培養物上清および細胞溶解物質中のＰＧＲＮポリペプチドのレベルは、ＤＭＳＯで処理されたＨｅＬａ細胞の対応するＰＧＲＮポリペプチドレベルと比較された（図２６）。１．２５から２０μＭのイブプロフェンで処理した細胞培養は、分泌ＰＧＲＮポリペプチドのレベルで約１５０％から２００％の増加と、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドのレベルでは約１５０％の増加を示した。ＧＡＰＤＨポリペプチド発現に対する有意な効果は観察されなかった。これらの結果は、イブプロフェンによるＨｅＬａ細胞の処理が、用量依存的に、細胞内および分泌ＰＧＲＮポリペプチドレベルを選択的に上昇させたことを示す。
インドメタシン、ナプロキセン、メクロフェナム酸、およびアセチルサリチル酸を含めた他のＮＳＡＩＤの用量反応研究（図２７−３０）は、これらの薬剤が、同様に細胞内および／または分泌ＰＧＲＮポリペプチドレベルを上昇させることを示した。特に、インドメタシンの処理は、ＨｅＬａ細胞で細胞内および分泌ＰＧＲＮポリペプチドのレベルを増加させた（図２７）。ナプロキセンの処理もＨｅＬａ細胞の細胞内および分泌ＰＧＲＮポリペプチドレベルを増加させた（図２８）。メクロフェナム酸による処理も同様であった（図２９）。テストされた最高濃度のメクロフェナム酸の（１０μＭ）は、分泌ＰＧＲＮポリペプチドのレベルに有意な減少を引き起こした（図２９）。アセチルサリチル酸の処理は、ＨｅＬａ細胞で分泌ＰＧＲＮポリペプチドレベルを増加させることが観察された（図３０）。
Ｍ１７やＮ２Ａを含めて、イブプロフェンで処理された他の細胞株は、ＨｅＬａ細胞で観察されたものと類似の反応を示し、１から５μＭの範囲の濃度のイブプロフェンの処理後、６００％までＰＧＲＮポリペプチド発現が増加した。
細胞内および分泌ＰＧＲＮポリペプチドレベルを調整するクルクミンおよびレスベラトロール：
Ｍ１７細胞培養（Ｎ＝４）は、多様な濃度のクルクミンおよびレスベラトロールで２４時間、血清を含まない培地で処理された。培養物上清および細胞溶解物中のＰＧＲＮポリペプチドのレベルは、ウエスタンブロットを使用して分析された。多様な濃度のレスベラトロールで処理されたＭ１７細胞の細胞の細胞培養物上清および細胞溶解物質中のＰＧＲＮポリペプチドのレベルは、ＤＭＳＯで処理されたＭ１７細胞の対応するＰＧＲＮポリペプチドレベルと比較された（図３１）。３．１２５から５０μＭのレスベラトロールで処理した細胞培養は、分泌ＰＧＲＮポリペプチドのレベルで約１５０％から４５０％の増加と、細胞内ＰＧＲＮポリペプチドのレベルでは増加ないことを示した。ＧＡＰＤＨポリペプチド発現に対する有意な効果は観察されなかった。
多様な濃度のクルクミンで処理されたＭ１７細胞の細胞培養物上清および細胞溶解物質中のＰＧＲＮポリペプチドのレベルも、ＤＭＳＯで処理されたＭ１７細胞の対応するＰＧＲＮポリペプチドレベルと比較された（図３２）。０．１μＭのクルクミンによって処理された細胞培養は、分泌ＰＧＲＮポリペプチドのレベルで約１５０％の増加を示した。ＧＡＰＤＨポリペプチド発現に対する有意な効果は観察されなかった。
実施例９−ＰＧＲＮポリペプチド発現の分布の特徴
ヒトおよびマウスの脳におけるＰＧＲＮポリペプチドの分布の範囲を評価するために、多数の研究が実施された。ＰＧＲＮポリペプチドは、ヒトおよびマウスのＣＮＳ組織全体の全領域に遍在的に発現した。二重免疫蛍光研究は、ＰＧＲＮ発現が、ニューロンとミクログリアに限定されることを示した。二重免疫蛍光顕微鏡写真が、マウスの脳の海馬エンドプレートで撮影された。ＰＧＲＮポリペプチドは、ニューロンでは強力に発現したが、ＧＦＡＰで染色された星状膠細胞にはなかった。乏突起膠細胞とＰＧＲＮポリペプチドの間には、共局在化が欠けていた。ＰＧＲＮポリペプチドは、ミクログリアのマーカーＩＢＡ−１とともに強力に共局在化した。
ＰＧＲＮポリペプチドの細胞内分布は、細胞培養モデルを使用して評価された。Ｂｅ（２）−Ｍ１７（ヒト神経芽細胞腫）とＮ２Ａ（マウス神経芽細胞腫）細胞株を使用する二重免疫蛍光研究は、ＰＧＲＮポリペプチドは細胞全体に分散するが、各周辺区画内に顕著に集中することを示した。一連の抗体を使用する研究は、ＰＧＲＮポリペプチドが、主にゴルジ体で共局在化することを示した（抗体５８Ｋ）。二重免疫蛍光顕微鏡写真は、抗ＰＧＲＮポリペプチド抗体と抗５８Ｋ（ゴルジ体のマーカー）で染色したＢｅ（２）−Ｍ１７（ヒト）およびＮ２Ａ（マウス）神経芽細胞腫細胞株を撮影した。４０Ｘの倍率で、Ｂｅ（２）−Ｍ１７細胞ではＰＧＲＮポリペプチドと５８Ｋの間に高度な共局在化が観察された。また、Ｎ２Ａ細胞ではＰＧＲＮポリペプチドと５８Ｋの間に顕著な重なりも観察された。二重免疫蛍光研究は、ＰＧＲＮポリペプチドと、ペルオキシソーム（抗ＰＭＰ−７０）、リソソーム（抗ＬＡＭＰ１、抗ＬＡＭＰ２）または分泌小胞（抗シナプトブレビン２）との間に関連性を見つけることができなかった。
ＰＧＲＮポリペプチドの発現は、アルツハイマー病および前頭側頭型認知症で記述された特徴的病変を発病するヒトと遺伝子組み換えマウス両方のモデルで確認された。組織は、高リン酸化タウを検出するためにＣＰ−１３抗体を使用してＮＦＴが染色され、核はＤＡＰＩを使用して青に染色された。ＰＧＲＮポリペプチドは、ヒトの組織と遺伝子組み換え型両方のモデルで、アミロイド斑周囲に多く見られた。しかしながら、ＰＧＲＮポリペプチドとアミロイド斑との顕著な重なりとは対照的に、ヒトのアルツハイマー病と遺伝子組み換え型マウス両方の組織では、神経原線維変化の集合とＰＧＲＮポリペプチドの集合との間には顕著な解離が観察された。ＰＧＲＮポリペプチドは、神経原線維変化と直接共共存化していないが、タウ病変の発症によって強力に上昇した。これらの結果は、アルツハイマー病のヒトとマウスのモデルにおいて、斑周囲のジストロフィーニューロンと反応ミクログリアでは、ＰＧＲＮポリペプチドは、強力に上昇するが、ＰＧＲＮポリペプチド発現は、神経原線維変化病変のあるニューロンでは上昇することが見られなかったことを示す。また、これらの結果は、ＰＧＲＮポリペプチド発現の変化は、ヒトとマウスの両方の病変の発症で顕著であることも示す。
ＰＧＲＮポリペプチド発現は、ＪＮＰＬ３マウス株で実験された。一連の顕微鏡写真は、ＰＧＲＮポリペプチド発現が生後２から１０ヵ月後から増加することを示す非遺伝子組み換え型ＪＮＰＬ３同胞種からの組織で撮影された。一次抗体のない脊髄からの組織が対照として用いられた。２ヶ月のマウスの組織の顕微鏡写真は、軽度のＰＧＲＮポリペプチド陽性染色を示した。軽度の免疫活性があるように見えたが、分岐ミクログリアでは比較的薄い染色が観察された。１０ヶ月までに、神経網免疫活性に顕著な増加があった。ニューロンとミクログリアの両方は、検出可能なＰＧＲＮポリペプチド免疫活性があった。これらの実験の結果は、ＰＧＲＮポリペプチドレベルは、病変が存在しない場合でも、ミクログリアとニューロン両方の集団では、年齢と共に徐々に増加することを示す。
ＪＮＰＬ３マウスの研究は、運動障害の増加とタウ病変の増加に強力に相関するＰＧＲＮポリペプチド染色の増加があったことを示した。病変段階に従って、ＰＧＲＮポリペプチドが増加することを示す一連の顕微鏡写真が撮影された。発病していない２ヶ月のＪＮＰＬ３マウスの組織の顕微鏡写真は、１０ヶ月の非遺伝子組み換え型マウスでみられたよりもやや多いＰＧＲＮポリペプチド免疫活性があったことを示した。中程度の運動障害を持つ８ヶ月のマウスの組織の顕微鏡写真は、神経網染色が増加したことと、ＰＧＲＮポリペプチド陽性ミクログリアの数の増加を示した。中程度の運動障害を持つ１４ヶ月のマウスの組織の顕微鏡写真は、顕著なミクログリア活性と神経網染色の増加を示した。後期／最終段階病変を有する１０ヶ月のマウスの組織の顕微鏡写真は、ＰＧＲＮポリペプチド陽性活性化ミクログリアの数の増加と神経網染色の増加を示した。これらの研究の結果は、ＰＧＲＮポリペプチド発現が、タウオパシーのＪＮＰＬ３マウスモデルにおいて、ミクログリアとニューロンのＰＧＲＮポリペプチド発現の増加を含めて、神経変性表現型の発症時に顕著に上昇することを示す。
実施例１０−ＰＧＲＮポリペプチド発現を上昇させる生化学経路の特徴づけ
ＰＰＡＲアゴニストとＮＳＡＩＤがどのようにＰＧＲＮポリペプチド発現を調整するかを決定するための実験が実施された。この研究の仮説は、ＰＧＲＮポリペプチド発現が、ＰＰＡＲ核受容体経路内の活性と共因子に依存すること、ＰＰＡＲアゴニストとＮＳＡＩＤは同じ経路を標的とすることである。ＰＰＡＲアゴニストがＰＧＲＮペプチド発現を調整できることを示す研究に加えて、ＰＧＲＮ遺伝子のプロモーター領域の研究は、推定ＰＰＡＲ結合部位とＰＰＡＲ応答エレメントの存在を示唆した（Ｂｈａｎｄａｒｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３３：２６８２−２６８９（１９９３）；Ｂｈａｎｄａｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，３１９（Ｐｔ２）：４４１−４４７（１９９６））。骨髄細胞を使用した実験は、レチノイン酸受容体との関連性があり、ＰＰＡＲ受容体活性を顕著に改善する、オールトランスレチノイン酸は、ＰＧＲＮ ｍＲＮＡの上方制御になることを示した（Ｏｎｇら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２９１：Ｒ１６０２−１６１２（２００６））。ＮＳＡＩＤは、ＰＰＡＲアゴニストとしても機能することができる（Ｊａｒａｄａｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６２：１５８７−１５９５（（２００１）、Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７２：３４０６−３４１０（１９９７））。Ｋｏｊｏら（Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ，９３：３４７−３５５（２００３））は、イブプロフェンやその他のＮＳＡＩＤＳが、生体内分析において１ｘ１０ｅ−９Ｍ以上の濃度でＰＰＡＲ受容体活性を選択的に活性化することができることを示した。
ＰＧＲＮポリペプチド発現の増加は、ＰＰＡＲ複合体、および、ＰＰＡＲαではなく、ＰＰＡＲδやＰＰＡＲγ受容体を活性化すると思われる、イブプロフェン、インドメタシンおよびジクロフェナク等のＮＳＡＩＤ両方によるＰＰＡＲ受容体の活性化によって生じるという仮説である（Ｋｏｊｏら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ，９３：３４７−３５５（２００３））。活性化された受容体は、ＰＧＲＮプロモーター内のＰＰＡＲ応答エレメント（ＰＰＲＥ）に結合して、ｍＲＮＡ転写や翻訳の増加をもたらす。仮説は、２つの研究を使用してテストされる。１つの研究では、薬理的操作とＲＮＡ干渉の組み合わせを使用して、ＰＧＲＮポリペプチドの用量反応分析が実施される。別の研究では、機能的ペルオキシソーム増殖剤応答エレメントがヒトＧＲＮで特定される。
ＰＰＡＲ受容体の薬理的操作によってＰＧＲＮ ｍＲＮＡとポリペプチドの調節を検討する研究は、まず、一連のアゴニスト−アンタゴニスト用量反応研究で検討される。低ｎＭ範囲で活性がある高度に選択的なＰＰＡＲα（ＧＷ７６４７）、ＰＰＡＲδ（Ｌ１６５，０４１）およびＰＰＡＲγ（ＧＷ１９２９）アゴニストは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ等の商業業者から入手する。低ｎＭの範囲のＩＣ５０を有するＰＰＡＲγ受容体サブタイプに選択的な化合物を含めて、ＰＰＡＲアンタゴニストも取得される。さらに、ＧＷ９６６２（２−クロロ−５−ニトロ−Ｎ−フェニルベンズアミド）等の化合物を取得する。このような化合物は、低ｎＭ範囲のＰＰＡＲα受容体および低μＭ範囲のＰＰＡＲδ受容体をブロックでき、高い濃度で汎ＰＰＡＲ阻害剤として使用できる（（Ｌｅｅｓｎｉｔｚｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１：６６４０−６６５０（２００２））。
薬理的研究は、ＰＧＲＮ生成を上昇させるために、イブプロフェン、インドメタシンおよびジクロフェナクを含む、ＰＰＡＲアゴニストとＮＳＡＩＤの両方で実施される。ＧＷ９６６２は、ＰＰＡＲアゴニストとＮＳＡＩＤの両方が、ＰＰＡＲ核転写経路からＰＧＲＮ発現に対する機能的活性に影響を与えることを示すために、汎ＰＰＡＲ阻害剤として使用される。ＰＧＲＮのｍＲＮＡレベルを定量するために、ノーザンブロット分析とリアルタイムのＲＴ−ＰＣＲが使用される。細胞内および分泌ＰＧＲＮポリペプチドレベルを定量するためにウエスタンブロットが使用される。本分析を検証するために、ＮＳＡＩＤおよびＰＰＡＲアゴニストによって誘発されたＰＰＡＲ転写因子活性は、ＰＰＡＲα，δ，γ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用して、これらの実験において決定される。このキットは、ＰＰＡＲ−ＤＮＡ結合の定量的検出を可能にする。ＢＥ（２）−Ｍ１７ヒト神経芽細胞腫細胞株の事後研究は、ｓｉＲＮＡ手法を採用する。これらの研究は、ＰＧＲＮ発現の調節において各経路の詳細な分析が可能になるように、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲδ受容体を選択的に下降させるｓｉＲＮＡを使用する。ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲδ受容体に対して検証されたｓｉＲＮＡ配列は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である。
ＰＧＲＮプロモーターは、機能ＰＰＲＥを含むという仮説を検証するために、他で記述されたプロトコルを使用する（Ｃｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，３４７：８２１−８２６（２００６））。簡潔に述べると、ヒトＧＲＮプロモーター配列の５’フランキング領域のシリアル欠失を実施するために、短時間、ＰＣＲ増幅が使用される。シリアル消去されたプロモーター配列は、ルシフェラーゼ発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングされて、プロモーター−レポーター配列はＤＮＡ配列決定によって確認される。トランスフェクション１時間前に、Ｂｅ（２）−Ｍ１７細胞は、適切なＥＣ５０濃度で、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγまたはＰＰＡＲδアゴニストで準備される。Ｍ１７細胞株は、プロモーター−レポーターベクターで一時的にトランスフェクションされ、処理によるルシフェラーゼ発現が監視される。陽性対照として、ｐ−ＲＬ（ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクター）プラスミドがトランスフェクション効率対照として共トランスフェクションされる。トランスフェクションの４８時間後、ホタルとウミシイタケの両方のルシフェラーゼ活性は、デュアル・ルシフェラーゼレポーター分析システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して定量される。プロモーター−レポーターが陽性ヒット上のＰＰＡＲ受容体によって活性化されることを確認するために、有効なプロモーター−レポーター配列がＰＰＡＲγとＲＸＲα発現ベクターで一時的に共トランスフェクションされ、ＰＰＡＲアゴ二ストの有無でのルシフェラーゼ発現を示す。電気泳動運動位相分析を使用して、一時的にプロモーター−レポーターベクターでトランスフェクションされた細胞がＰＰＡＲアゴ二ストで処理されると、特定のポリペプチド−ＤＮＡ複合物が形成されるかどうかを決定する。この分析では、一時的にトランスフェクションされて処理された細胞の核抽出物が、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｋｉｔ （Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で準備される。ＥＭＳＡ競合分析で使用されるコンセンサスＰＰＲＥとＰＰＲＥ様の配列二重鎖のオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドキナーゼ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってγ−３２Ｐ−ＡＴＰで標識され、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５スピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して精製される。この実験で使用されたオリゴヌクレオチドプローブは、ＰＰＲＥ様のプローブ（有効なプロモーター−レポーターベクターから取得）およびすべてのＰＰＲＥエレメントに共通な競合的コンセンサスＰＰＲＥプローブに対応する（Ｓｃｈａｃｈｔｒｕｐら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，３８２：２３９−２４５（２００４））：
Figure 0005123936
。標識付けされていないプローブは、競合実験のために、１００倍の過剰濃度で使用される。一部の実験では、ＥＭＳＡ分析を実施するためにＬｉｇｈｔＳｈｉｆｔ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＥＭＳＡ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）が使用される。
ＰＧＲＮポリペプチド発現のウエスタンブロット分析を実施するために、細胞は、細胞破片を除去するために、プロテアーゼ阻害剤を含む軽度の洗浄バッファーに溶解され、超音波で分解されて遠心分離される。プログラニュリンレベルは、抗マウスＰＧＲＮ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した後、ヒツジ抗マウス二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によってプローブすることによって、脳組織内で評価される。ＧＡＰＤＨポリペプチド発現は、ポリペプチドレベルを標準化するマーカーとして使用される。
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）は、ＰＰＡＲ−ＤＮＡ結合を検出するために使用される。簡潔に述べると、処理された細胞から準備された核溶解物が、ＰＰＲＥを含むｄｓＤＮＡ配列でコーティングされた９６ウェルプレートに追加される。ＰＰＲＥエレメントへのＰＰＡＲが結合し、プレートは洗浄され、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲδ受容体は、一次および二次抗体を使用して検出される。
ＧＲＮ発現を測定するために、定量的リアルタイムＰＣＲ分析が使用される。全ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｍ１７細胞から抽出される。ＲＮＡは、ＲＱ１ Ｄｎａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理されてから、モロニーマウス白血病ウイルスＲＴ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、逆転写される。発現値は、βアクチン発現に標準化される。ＧＲＮ転写物に使用されるプライマーのペアは、
Figure 0005123936
（フォワードプライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２）および
Figure 0005123936
（リバースプライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）であり、β−アクチンのプライマーは
Figure 0005123936
（フォワードプライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）および
Figure 0005123936
（リバースプライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。増幅反応混合物は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｋｉｔの説明書（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｐｅｎｚｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って、それぞれの反応に０．５μＭの最終のプライマー濃度で準備される。増幅は、次の条件を使用して、重複して実施される。９５℃で１０分間のホットスタートステップ（変性）の後、９５℃で１０秒間、６６℃で１０秒間、および７２℃で１０秒間を４５サイクル。
ノーザンブロットを実施するために、全ＲＮＡは、ＴｒｉＺｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、１０７個の細胞から単離される。ＲＮＡサンプルは、１０または１５μｇで、５０℃で１時間グリオキサルで変性され、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７で１％アガロースゲルを使用して、電気泳動される。ＲＮＡは、ナイロンブロット膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に移されて、加熱により固定される。膜は、ＰＧＲＮの５’末端への放射性同位体で標識された補完配列を使用して、６５℃で、０．５ＭのＮａＨ２ＰＯ４中２４時間ハイブリダイズしてから、よく洗浄する。これらのブロットを、増感スクリーンでＸ−Ｏｍａｔフィルムに露光することによって、オートラジオグラムが取得される。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を使用して濃度測定が実施され、２８ＳリボソームのＲＮＡバンドに標準化される。統計分析はＡＮＯＶＡを用いて実施される。
実施例１１−ＰＧＲＮポリペプチドが生体内で神経変性を変化させるかどうかの決定
ＰＧＲＮポリペプチドのレベル変化が、タウオパシーモデルであるＪＮＰＬ３マウス株の神経変性をどのように調整できるかを決定するための研究が実施された。さまざまなレベルでのＰＧＲＮポリペプチドが神経変性の表現型を調整できるかどうかを試験するために、２つの異なる動物モデル（ＪＮＰＬ３とＰＧＲＮ−／−マウス）が使用される。ＰＧＲＮポリペプチド発現は、ＪＮＰＬ３株の神経病理学と正相関することが観察されたが、これが一次または二次反応であるかどうかはわからない。周辺組織における炎症プロセスに対するＰＧＲＮポリペプチドの調整役割を考慮して、ＰＧＲＮを欠損するＪＮＰＬ３マウスが増加した神経変性表現型を有するかどうかを決定する実験が実施される。また、上昇したＰＧＲＮレベルがＪＮＰＬ３マウスの神経変性表現型を遅延させることができるかどうかを決定する研究も実施される。
非遺伝子組み換え型同胞種におけるＰＧＲＮ発現の、年齢に関係した比較的軽度の増加と比較すると、ＪＮＰＬ３マウスの白質と灰質両方にはＰＧＲＮ発現の顕著な上方制御が存在する。若いＰＧＲＮ−／−マウス（下）の病理学に対しては軽度の証拠しかないが、ＰＧＲＮ発現の５０％減少は、ヒトの患者の完全なＦＴＤにつながる（Ｂａｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９１６−９１９（２００６）、Ｃｒｕｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０−９２４（２００６））。さらに、ＰＧＲＮは、外傷回復において重要な因子である（ＨｅおよびＢａｔｅｍａｎ，Ｊ ＭｏＩ Ｍｅｄ，８１：６００−６１２（２００３）、Ｈｅら、Ｎａｔ Ｍｅｄ，９：２２５−２２９（２００３）、Ｈｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６２：５５９０−５５９６（２００２））。ＰＧＲＮの欠損は、回復プロセスの障害となり、炎症を促進する可能性があり、ＪＮＰＬ３モデルにおいて、タウオパシーの加速化、高度なシナプス退化、増加したミクログリアの活性やグリオーシス、および寿命の短縮につながる。
ＪＮＰＬ３マウスとＰＧＲＮ−／−マウスの戻し交配は、（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ＋／−）と（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ−／−）マウスを作り出すために実施される。また、（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ＋／＋）マウスも比較研究のために作られる。各株について３０匹のマウスが、毎週行われる正式な運動テストによって評価され、「重度な」運動障害段階に達するまで育てられる。マウスは、この閾値に達すると、屠殺される。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線と生存時間の中央値が、このデータから生成され、グループ全体で比較される。脳と延髄は、安楽死させたマウスから採取され、高リン酸化タウ、ＰＧＲＮ、ミクログリア活性、グリオーシスおよび炎症マーカーのレベルの変化、およびいくつかのニューロン、グリアおよびオリゴデンドロサイトが評価される。ＰＧＲＮは、ニューロンに現れ、シナプス機能に影響を与えることができるおそらく重要な生存因子であるので、シナプス構築は、マウスの前角細胞を評価することによって特徴付けられる。ＪＮＰＬ３マウスは、タウ病変の発症と共にシナプスの数が変化したことを示す（Ｋａｔｓｕｓｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，４０９：９５−９９（２００６））。シナプスの数は、シナプス前後密度について二重免疫蛍光染色を使用して評価される。樹状突起棘の数は、ＤｉＯｌｉｓｔｉｃ標識（親油性色素のバリスティック送達）でニューロンを視覚化した後、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ画像システムで樹状突起や脊椎の定量によって特徴付けられる。これらのデータは、ＰＧＲＮが、進行中の病変の存在下で機能性ニューロンの接続を維持する助けとなるかどうかを示す。
ＪＮＰＬ３遺伝子組み換えマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドの家系にある。これらの動物は、ＭｏＰｒＰプロモーターによって発生する、エクソン１０のＰ３０１Ｌ変異で、０Ｎ４Ｒタウイソ型に対して半接合である（Ｌｅｗｉｓら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２５：４０２−４０５（２０００））。半接合における発現は、内因性のマウスタウの量にほとんど当量で、これらのマウスは、神経原繊維変化、ニューロン欠損および早くて６ヶ月までに運動障害を発現し、さらに、延髄の５０％までのニューロン欠損をもたらす。重度の神経変性の発症は、典型的に、生後１２〜１４ヶ月で開始する。これらのマウスでは、ニューロン細胞体の神経原繊維変化は、主に、直線のタウフィラメントから構成され、Ｐ３０１Ｌ動物の延髄、脳幹、および中脳の一部の領域に集中している。マウスの前変化は、さらにもっと広い分布を持つ。ヒトのタウオパシーに見られるものに類似した神経原繊維変化は、チオフラビンＳ、Ｃｏｎｇｏレッド、およびＧａｌｌｙａｓ、ＢｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙおよびＢｏｄｉａｎシルバー染色に陽性であり、タウ高リン酸化の多数の抗体で染色できる。
Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドの家系にあるＰＧＲＮノックアウトマウスのコロニーが（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）が確立された（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）。エクソン２からエクソン１３までのＰＧＲＮのゲノム領域のターゲット崩壊は、ＰＧＫ−Ｎｅｏ−ｐＡカセットで置換することによって実施された。ターゲット崩壊は、ＰＧＲＮゲノム遺伝子座の３．７ｋｂをノックアウトして、ＰＧＲＮの完全な欠失となる。半接合（＋／−）およびホモ接合（−／−）両方のマウスは生存能力があった。
生後１ヶ月と８ヶ月でＰＧＲＮ野生型（＋／＋）、ヘテロ接合（＋／−）およびホモ接合（−／−）ノックアウトマウスの初期の特性記述が実施された。ＰＧＲＮ発現は、野生型（ＷＴ）マウスで検出され、ＰＧＲＮ＋／−マウスでは程度が少ないことが観察され、ヌルマウスではまったく存在しなかった。野生型マウスでは、ＰＧＲＮ免疫活性は、海馬で最も現れた。また、発現は、小脳領域の皮質とプルキンエ細胞で高かった。ＧＦＡＰ免疫活性、すなわち星状膠細胞と星状グリオーシスのマーカーは、その他すべてのグループに比較して、８ヶ月のマウスＰＧＲＮ−／−で顕著に高かった。これらの結果は、マウスが、わずかな病変を持つ事を示唆する。
ＪＮＰＬ３株でヌルＰＧＲＮバックグラウンドを生成するために、ＪＮＰＬ３マウスは、２回の交配で、ＰＧＲＮ−／−バックグランドに戻し交配される。すべてのマウスは、グループ間で遺伝子差異を最小限にするために、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドの家系（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で維持される。最初の交配では、半接合ＪＮＰＬは、ＰＧＲＮヌルマウス（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ−／−）に交配されて、５０％の半接合（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ＋／−）と５０％のＰＧＲＮ＋／−になる。半接合の子（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ＋／−）はＰＧＲＮ−／−家系に戻し交配されて、２５％の（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ−／−）、２５％の（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ＋／−）、２５％のＰＧＲＮ−／−および２５％のＰＧＲＮ＋／−マウスが生まれる。野生型ＰＧＲＮバックグラウンドのＪＮＰＬ３マウスは、比較のために使用される。
シナプスと、樹状脊椎番号が評価される。タウオパシーに関連付けられた前シナプス小胞の変化は、シナプトフィジンに対する抗体を使用して検査される（ＳＴＮ ｃｌｏｎｅ ＳＹ３８，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）。さらに、シナプスの活性領域の変化は、前シナプスタンパク質（Ｂａｓｓｏｏｎ）および後シナプスタンパク質二重蛍光標識を使用して、検査される（ＳＡＰ−１０２；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，１２０：４２１−４３３（２００５）、Ｄｒｅｓｂａｃｈら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２３：２７９−２９１（２００３））。「ＤｉＯｌｉｓｔｉｃ」標識、または親油性色素の粒子媒介バリスティック送達（Ｇａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ，２７：２１９−２２５（２０００））は、ニューロン構築を調べるために、遺伝子組み換え型マウスの脳細胞を短時間で差別化して標識をつけるために使用される。ＤｉＩ（１，１−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチル−インドカルボシアニン過塩素酸塩）でコーティングされたタングステン粒子が、遺伝子銃（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して固定脳セクション（２００μｍ）に発射されて、細胞内で分散させられる。標識がつけられた樹状軸や軸策は、典型的に、何百マイクロンで見ることができる。例えば、ニューロンの画像はＤｉＯｌｉｓｔｉｃ標識後取得される。画像は、深さが５０μｍに及ぶ１００の共焦点平面の押しつぶした表示を現した。ＤｉＯｌｉｓｔｉｃ標識後の先端樹状突起の高倍率画像は、樹状脊椎を示した。これらの結果は、樹状脊椎の明確な標識がこの方法で可能であることを示す。各ニューロンに対して、少なくとも１０μｍの長さの５つの無作為に伸びた先端樹状突起にそった脊椎の数は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ自動定量ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して数えられる。脊椎の密度は、１０μｍセグメント長の脊椎の数の値に対して標準化することによって計算される。各実験グループで、動物あたり最低２，０００の脊椎が、遺伝子型を知らされていない調査者によって分析される。
免疫組織化学は、タウオパシー表現型を評価するために使用される。この研究で使用された標準のタウ抗体は、異常なタウリン酸化に対するＡＴ８とＰＨＦ−１、異常なタウ形成に対するＭＣ１を含む（Ｌｅｗｉｓら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．，２５：４０２−４０５（２０００））。さらに、次の抗体、すなわち、オリゴデンドロサイト（ＣＡＩＩ；Ｇｈａｎｄｏｕｒ）、ミクログリア（ＣＤ１１Ｂ；Ｓｅｒｏｔｅｃ／ＣＤ４５ Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）、アストロサイト（ＧＦＡＰ，Ａｓｔｒａｚｅｎｉｃａ）およびプログラニュリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、ニューロンを検出するために使用される（ＮｅｕＮ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）。延髄のニューロンの数は、バイアスのない立体的手法を使用して、定量される（単一薄片解剖法（ｓｉｎｇｌｅ ｓｅｃｔｉｎ ｄｉｓｓｅｃｔｏｒ ｍｅｔｈｏｄ）、Ｍｏｌｌｅｒら、Ｊ Ｍｉｃｒｏｓｃ，１５９（Ｐｔ１）：６１−７１（１９９０））。
異なる処理グループに存在するタウ種を特徴づけるために生科学を応用する。延髄、皮質および小脳の領域解剖は、処理グループで溶解および非溶解タウ種を分離する典型的なタウサルコシン分画プロトコルによって、順次抽出される（Ｒａｍｓｄｅｎら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２５：１０６３７−１０６４７（２００５））。脳組織は、プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤を含む１０容量（ｇ／ｍＬ）のＴＢＳに均質化されて、１時間、１００，０００ｇで回転される。ＴＢＳ上清は溶解性タウのために分析される。沈殿物は、１０％のスクロースと０．８Ｍのナトリウム塩化物を含むＴＢＳで再抽出される。スクロース上清は１％サルコシルに調整されて、３７℃で１時間培養される。サルコシル沈殿物は、１００，０００で２時間、スクロース上清を回転することによって収集される。沈殿物は、その後、Ｌａｅｍｍｌｉバッファーに溶解される。タンパク質は、電気泳動され、標準プロトコルによってウエスタンブロットされる。ウエスタンブロット上のポリペプチド負荷は、溶解画分（Ｓ１）のポリペプチド定量化によって、および非溶解画分（Ｐ３）の初期組織入力によって決定される。溶解性および非溶解性タウのウエスタンブロットは、ヒトのタウ（Ｅ１）、マウスおよびヒトのタウ（ＷＫＳ４６）およびリン酸化タウを認識する抗体によってプローブされる。多数のタウホスホエピトープに対してスクリーニングが実行される（例えば、ｐｈｏｓｐｈｏ−２０２／２０５、ｐｈｏｓｐｈｏ−２３１／２３５およびｐｈｏｓｐｈｏ−３９６／４０４）。ウエスタンブロットは、リン酸、および配座的に依存するエピトープ感受性があるタウ抗体、および抗マウスＰＧＲＮ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でプローブされる。
運動性は、遺伝子組み換えマウスで評価される。一次と二次スクリーニングから構成される基本的ＳＨＩＲＰＡプロトコルを使用して、マウスの運動行動を包括的に評価する（Ｒｏｇｅｒｓら、Ｍａｍｍ Ｇｅｎｏｍｅ，８：７１１−７１３（１９９７））。一連の簡単なテストは、物理的操作に最も感受性のある手順から開始する。追加のスクリーニングは、回転ロッド、ワイヤーぶら下がりテスト、および歩き方分析を使用する、感覚運動の評価を含む。運動機能は、ワイヤーぶら下がり、ビーム歩行および驚き反射テストによって週に２回監視される。運動障害が明らかになると、動物は毎日監視される。運動性に基づいて、動物は、「未発病」、「初期」、「中程度」、および「重度」の運動表現型に分類される。２日間連続して、少なくとも２つの運動テストに連続して失敗して、重度の表現型のスコアであった動物は屠殺される。グループ間の統計的有意差は、一元ＡＮＯＶＡと、その後のＦｉｓｈｅｒのポストホックテストにより、評価される。
一部の実験では、ｈｔａｕマウスのような確立されたタウ組み換え家系が使用される。
実施例１２−ＰＧＲＮポリペプチド発現を上昇させる薬剤が生体内で神経保護作用があるかどうかの決定
（１）細胞ベースと皮質スライスのスクリーニングを使用して、ＰＧＲＮポリペプチドレベルを上昇させ得る薬剤を特定し、および（２）（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ）マウス交配を使用して生体内の最適候補薬剤の神経変性効果を検証する、という２つの研究が実施される。スクリーニングは、ＰＰＡＲ上昇化合物として生体内で特定された抗炎症およびＰＰＡＲ薬剤に密接に関係する薬物を使用して実施される。皮質スライス培養でＰＧＲＮポリペプチドの強力な増加を見せた薬物は、遺伝子組み換えマウスでテストされる。
薬物は、生体内でＰＧＲＮポリペプチドの生産を上昇させ得る有効な候補を特定するためにスクリーニングされる（図３３）。スクリーニングされる薬物は、（ａ）非ステロイド性抗炎症薬（３０の化合物、ＣＯＸ−１とＣＯＸ−２阻害剤を含む）、（ｂ）ＰＰＡＲアゴニスト（１０の化合物）、（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（８つの化合物）、（ｄ）抗ヒスタミン剤（５つの化合物）、（ｅ）限定された２０種類の天然物と自然物の派生物で、クルクミン、ニンジン、イチョウ、レスベラトロール、緑茶抽出物（エピガロカテキンガレート、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピカテキンおよび没食子酸）およびアントシアニンを含む。スクリーニングされた薬物は、アルツハイマー病に保護効果があると報告された薬を含む（Ｖａｒｄｙら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒ，６：６９５−７０４（２００６））。化合物は、ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍやＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈを含む業者から購入される。ＰＧＲＮポリペプチドのスクリーニングシステムが薬物をテストするために開発された。スクリーニングシステムは、高い再現性結果を示し、薬候補の特定に使用された。薬物は、４回、６−指数濃度（１ｘ１０ｅ−９−１ｘ１０ｅ−５）にわたって、ＢＥ（２）−Ｍ１７（ヒト神経芽細胞腫）およびＮ２Ａ（マウス神経芽細胞腫）細胞でスクリーニングされた。媒体および溶解物は、ＰＧＲＮポリペプチドレベルの変化について、ウエスタンブロットによって収集および分析される。薬物は、毒性からの非特定効果を排除するために、標準ＭＴＴ分析も使用してスクリーニングされる。
細胞培養ベースのスクリーニングで活性を見せる薬物は、（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ＋／＋）器官皮質薄片でテストされ、体内研究を実施する前に、ニューロンとミクログリアのある比較的原型のニューロン構造を含むエクスビボ系でＰＧＲＮポリペプチド上昇活性を評価する。薄片は、出産後発病の４週間目にマウスの脳から準備され、１ヶ月以上の期間保存される（Ｇａｈｗｉｌｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０：４７１−４７７（１９９７））。スライスは、成体様特徴を保存した。また、薄片は、生体内で見られる接続器官の多く、およびシナプス可塑性（長期相乗効果）の可能性および病変傷に対する反応性もとどめている。長期の器官型薄片培養物は、タウ発現や薬治療に関連付けられる脳生理学の変化および病変を研究するためによく適している。器官型薄片は、血液脳関門から独立した多様な実験操作にアクセス可能で、したがって、ＰＧＲＮポリペプチド発現の調節のための潜在的薬物をスクリーニングするための良質のモデルシステムとなる。この研究では、主に、用量反応曲線を使用して、細胞内および分泌両方のＰＧＲＮポリペプチドレベルに対する短期薬剤治療の細胞培養効果を検証するために、皮質薄片が使用される。
皮質スライスでＰＧＲＮポリペプチドレベルを上昇させることが確認された２つの主な薬剤は、さらに神経変性プロセスと生存期間に対する効果を評価される。生体内スクリーニングの開始として、長期治療に最も優れた薬物を選択するために、初期の漸増用量反応試験設計を備えるパイロット研究を実施することによって、６つまでの潜在的な候補薬物が長期治療のために選択される。生後１ヶ月（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ＋／−）のマウスのグループは、用量漸増研究設計を使用して、短期（１週間）の研究において、経口投与によって治療される。各薬物に使用された実際の投与量は、皮質薄片システムで確認された用量反応に基づく。５つまでの異なる薬物がこの設計でテストされる。脳と脊髄組織が、ウエスタンブロットによって、ＰＧＲＮポリペプチドレベルを分析する。最大増加を示す２つの薬物が長期研究のために選択される。
マウスは、毎日の平均食物消費量（および組み込まれる薬物）を想定する食餌療法戦略を使用して、慢性的に治療される。薬物は、えさに均一的に組み込まれる。ＪＮＰＬ３マウスは、ＰＧＲＮ−／−家系に戻し交配されて、それぞれ、次の遺伝子型の３０匹のマウスのグループを３つ作り出す。すなわち、（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ＋／−）、（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ−／−）、および比較研究のための（ＪＮＰＬ３）（ＰＧＲＮ＋／＋）。マウスは、離乳後直ちに食餌療法が開始されて、毎週行われる正式な運動テストによって評価され、「重度な」運動障害段階に達するまで育てられる。マウスは、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線および生存時間の中央値を生成するために、この閾値に達すると屠殺される。脳と脊髄は、安楽死させたマウスから培養され、高リン酸タウ、内因性ＰＧＲＮレベル、ミクログリア活性、炎症マーカーおよびニューロン細胞数における変化を測定する免疫組織化学および生化学試験によって評価される。ＪＮＰＬ３家系のＰＧＲＮノックアウトバックグラウンドによって、一般的な神経保護効果のために、特定のＰＧＲＮ保護応答は、発生する応答から区別することができる。
器官型薄片培養物を、他で記述された変更プロトコル（Ｘｉａｎｇら、Ｊ ＮｅｕｒｏｓｃｉＭｅｔｈｏｄｓ，９８：１４５−１５４（２０００））を使用して準備する。生後２５〜３０日の遺伝子組み換えマウスからの脳は、無菌状態で取り除かれ、矢状に二等分される。各半脳は、ＭｃＩｌｌｗａｉｎ組織切断器（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を使用して、４００μｍの厚さの薄片に切断される。薄片は、高酸素の平衡塩溶液で１時間休ませることができる。次に、薄片は、６ウェルプレートの膜挿入（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）部分に置かれる（３薄片／ウェル）。培養物は、１ｍＬの上昇したカリウムスライス培地（２５％ウマ血清（ＧＩＢＣＯ−Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５０％ Ｂａｓａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ−Ｅａｇｌｅｓ、２５％ Ｅａｒｌｅの平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）、２５ｍＭ ＮａＨＥＰＥＳ、１ｍＭ グルタミン、２８ｍＭ グルコース、ｐＨ７．２）で維持され、５％ ＣＯ２大気中３２℃で培養される。３日後、培地は、生理学濃度のカリウム（２５％ウマ血清、５０％ Ｂａｓａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ−Ｅａｇｌｅｓ、およびカリウム濃度が２．６６ｍＭになるように修正されたＥＢＳＳ）に交換された。生体内の５日後、培養物は、減少した血清レベル（５％）を含む生理的カリウムスライス培地で維持され、温度を３５℃に上げる。スライスが、３日毎に培養物の下から供給される。実験的薬物は、培地に追加するか、培養物の表面に滴下して追加される。
マウスは、体重を測定して１週間の食糧消費が評価される。消費した飼料の量に基づいて（典型的に１日あたり体重の１０〜１４％）、ＰＧＲＮポリペプチドレベルを上昇させる候補の薬剤が、脳内のＰＧＲＮポリペプチドのレベルを評価するために示されている濃度で、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）によるＨａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ ７１０２飼料食に均一的に組み入れられる。慢性的な薬剤投与が実施され、飼料の消費と体重が毎週監視される。
神経変性表現型の発症における薬物治療の効果を評価するために、動物交配、生化学、免疫組織化学、運動性評価、および統計的分析が記載のとおりに実施される。
その他の実施形態
本発明は、詳細な説明と共に説明したが、前述の記述は、説明のためであって、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限することを意図しないことを理解されたい。その他の態様、利点および変形は添付の請求項の範囲内である。

Claims (40)

  1. 変異を含むＰＧＲＮ核酸を哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含む、認知症を有することが疑われる哺乳動物において認知症を検出するための方法であって、変異を含む前記ＰＧＲＮ核酸の存在が、前記哺乳動物が認知症を有することを示し、該変異が（a）フレームシフト変異、（b）終止コドンの導入によるＰＧＲＮポリペプチドのコード配列の中途終止をもたらす変異、または（c）哺乳動物においてＰＧＲＮポリペプチドの発現を減少させる変異である、方法。
  2. 前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記認知症が前頭側頭葉変性症である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記認知症が前頭側頭型認知症である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ＰＧＲＮ核酸がＰＧＲＮポリペプチドの配列をコードする、請求項１に記載の方法。
  6. 前記ＰＧＲＮ核酸が、ＰＧＲＮポリペプチドの発現を制御するシス作用性制御エレメントである、請求項１に記載の方法。
  7. 前記変異がヌクレオチド付加である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記変異がヌクレオチド欠失である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記変異がヌクレオチド置換である、請求項１に記載の方法。
  10. 前記変異が、前記哺乳動物においてＰＧＲＮポリペプチドの発現を減少させる変異である、請求項１に記載の方法。
  11. 前記哺乳動物がヒトであり、かつ前記変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列に少なくとも１つの変異を含むアミノ酸配列を有するＰＧＲＮポリペプチドを発現させる変異である、請求項１に記載の方法。
  12. 前記ＰＧＲＮポリペプチドが、５９３アミノ酸残基よりも短い長さである、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記変異が、前記哺乳動物において切断型ＰＧＲＮポリペプチドを発現させる変異である、請求項１に記載の方法。
  14. 変異を含むＰＧＲＮ核酸を哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含む、認知症を発症する危険性があるとして哺乳動物を分類するための方法であって、変異を含む前記ＰＧＲＮ核酸の存在が、前記哺乳動物が認知症を発症する危険があることを示し、該変異が（a）フレームシフト変異、（b）終止コドンの導入によるＰＧＲＮポリペプチドのコード配列の中途終止をもたらす変異、または（c）哺乳動物においてＰＧＲＮポリペプチドの発現を減少させる変異である、方法。
  15. 前記哺乳動物がヒトである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記認知症が前頭側頭葉変性症である、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記認知症が前頭側頭型認知症である、請求項１４に記載の方法。
  18. 前記ＰＧＲＮ核酸がＰＧＲＮポリペプチドの配列をコードする、請求項１４に記載の方法。
  19. 前記ＰＧＲＮ核酸が、ＰＧＲＮポリペプチドの発現を制御するシス作用性制御エレメントである、請求項１４に記載の方法。
  20. 前記変異がヌクレオチド付加である、請求項１４に記載の方法。
  21. 前記変異がヌクレオチド欠失である、請求項１４に記載の方法。
  22. 前記変異がヌクレオチド置換である、請求項１４に記載の方法。
  23. 前記変異が、前記哺乳動物においてＰＧＲＮポリペプチドの発現を減少させる変異である、請求項１４に記載の方法。
  24. 前記哺乳動物がヒトであり、かつ前記変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列に少なくとも１つの変異を含むアミノ酸配列を有するＰＧＲＮポリペプチドを発現させる変異である、請求項１４に記載の方法。
  25. 前記ＰＧＲＮポリペプチドが、５９３アミノ酸残基よりも短い長さである、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記変異が、前記哺乳動物において切断型ＰＧＲＮポリペプチドを発現させる変異である、請求項１４に記載の方法。
  27. ＰＧＲＮポリペプチドまたはＰＧＲＮ ｍＲＮＡの減少したレベルを哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含む、認知症を有することが疑われる哺乳動物において認知症を検出するための方法であって、前記減少したレベルの存在が、前記哺乳動物が認知症を有することを示す、方法。
  28. 前記哺乳動物がヒトである、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記認知症が前頭側頭葉変性症である、請求項２７に記載の方法。
  30. 前記認知症が前頭側頭型認知症である、請求項２７に記載の方法。
  31. 前記哺乳動物がヒトであり、かつ前記ＰＧＲＮポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。
  32. ＰＧＲＮポリペプチドの減少したレベルを前記哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含む、請求項２７に記載の方法。
  33. ＰＧＲＮ ｍＲＮＡの減少したレベルを前記哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含む、請求項２７に記載の方法。
  34. ＰＧＲＮポリペプチドまたはＰＧＲＮ ｍＲＮＡの減少したレベルを哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含む、認知症を発症する危険性があるとして哺乳動物を分類するための方法であって、前記減少したレベルの存在が、前記哺乳動物が認知症を発症する危険があることを示す、方法。
  35. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記認知症が前頭側頭葉変性症である、請求項３４に記載の方法。
  37. 前記認知症が前頭側頭型認知症である、請求項３４に記載の方法。
  38. 前記哺乳動物がヒトであり、かつ前記ＰＧＲＮポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の方法。
  39. ＰＧＲＮポリペプチドの減少したレベルを前記哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含む、請求項３４に記載の方法。
  40. ＰＧＲＮ ｍＲＮＡの減少したレベルを前記哺乳動物が含むかどうかを判断するステップを含む、請求項３４に記載の方法。
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