JP5822822B2 - Tnfファミリー受容体を標的とし、tnf作用を拮抗するペプチド、その組成物、方法および使用 - Google Patents
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Description
本発明は、国立衛生研究所(National Institute of Health)、国立関節炎、骨格筋、皮膚疾患研究所(National Institute
of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)が交付するNIH/NIAMS 1 K01 AR053210およびNIH/NIA 1 R03 AG029388による政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
性TNFR2−IgG1融合タンパク質)、インフリキシマブ(レミケード、TNF−αに対するキメラモノクローナル抗体)、およびアダリムマブ(TNF−αに対するヒト型モノクローナル抗体)の3種類があり、関節リウマチなど様々な種類の炎症性疾患の処置に臨床的に使用されている。ここに来て、操作されたタンパク質/ペプチドが、治療製品の新しい傾向になっている。実際、設計されたタンパク質/ペプチド治療薬は現在、FDAにより毎年承認される新規な低分子薬剤の数を上回り、これを凌いでいる。サイトカインを直接標的としてこれを全身性に除去(リガンド除去)する抗体およびイムノアドヘシンは、効果的な治療戦略(たとえばエタネルセプト、アダリムマブおよびインフリキシマブ)になっており、一部の適応症では、サイトカイン受容体の選択的標的化(たとえばアナキンラ)により、非常に効果的な臨床結果が実現できる。
〜6CX5CCX8CCX6CCXDX2HCCPX4CX5〜6C)(配列番号9)を含む(図1)。コンセンサス配列のC末端領域は、保存された配列CCXDX2HCCP(配列番
号10)を含んでおり、金属結合部位を持ち、かつ調節機能に関与していることが示唆される[15]。目を引くのは、GEPが、生物活性を保持するグラニュリン(またはエピテリン)として知られる6kDaの小さな反復単位を遊離するタンパク質プロセシングを受け[16]、ペプチドが、細胞増殖アッセイにおいて活性であり[13]、炎症に関係している可能性があることである[17]。
酵素から隔離することにより、このタンパク質分解を遮断する[34]。GEPは、ヒトサイクリンT1[26]およびTat−P−TEFb[25]と相互作用することにより転写活性を調節することができる。GEPはさらに、ヘパラン硫酸プロテオグリカンのパールカンと相互作用することも明らかになった。パールカン−ヌルマウスは、重度の骨格異常を呈する[19、39〜41]。
を果たす新規な軟骨形成増殖因子としてグラニュリン/エピテリン前駆体(GEP)を同定した(Xu,K et al(2007)J Biol Chem 282(15):1 1347−1 1355;国際公開第2008/094687A2号パンフレット)。
ミリーメンバー受容体、特にRANKを拮抗し、RANK/RANKLシグナル伝達などのTNFファミリーメンバーのシグナル伝達を遮断したり、阻害したり、低下させたり、あるいは予防したりするペプチドを提供する。
たとえばエタネルセプト、アダリムマブおよびインフリキシマブ)、およびサイトカイン受容体アンタゴニスト(たとえばアナキンラ)を含み、これらから選択してもよい。医薬組成物は、TNFアンタゴニスト活性を持つ1つまたは複数のGEPペプチドおよび/またはatsttrinと、1つまたは複数の炎症性メディエーター、免疫調節薬(immunododulatory agent)または抗癌剤との組み合わせを含む。
または炎症を処置または緩和するためなど、抗TNFまたはTNF/TNFRファミリーアンタゴニストの活性および/または治療が適切である場合に投与する医薬製剤として調製してもよい。GEP、GEPペプチドおよびatsttrinペプチドは、配列番号1および8に記載されるような例示的なGEP、ならびに配列番号2および3〜7に記載するようなGEPペプチドまたはatsttrinペプチド、およびそれらの変異体またはサブユニットを含む。本明細書のGEPペプチドおよび/またはatsttrinの特異性により、現在の抗TNFおよび/または抗炎症性治療剤の後遺症を管理しやすくすることができ、それにより一般的な抗TNFおよび/または抗TNFファミリー剤として広く適用することが可能になると考えられる。
l、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131Iおよび186Reなどの放射性
標識を使用する場合、現在利用できる公知の計数手順を利用してもよい。標識が酵素である場合、検出は、当該技術分野において公知の現在利用されている比色アッセイ法、分光光度法、蛍光分光光度法、電流測定法またはガス定量法のいずれかにより達成してもよい。
Press,(1986)];B.Perbal,「A Practical Guide To Molecular Cloning」(1984)を参照されたい。
とは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基をいう。標準的なポリペプチド命名法であるJ.Biol.Chem.,243:3552−59(1969)に従い、アミノ酸残基の略語を以下の対応表に示す:
対応表
記号 アミノ酸
1文字 3文字
Y Tyr チロシン
G Gly グリシン
F Phe フェニルアラニン
M Met メチオニン
A Ala アラニン
S Ser セリン
I Ile イソロイシン
L Leu ロイシン
T Thr トレオニン
V Val バリン
P Pro プロリン
K Lys リジン
H His ヒスチジン
Q Gln グルタミン
E Glu グルタミン酸
W Trp トリプトファン
R Arg アルギニン
D Asp アスパラギン酸
N Asn アスパラギン
C Cys システイン
り決定される。コード配列は、以下に限定されるものではないが、原核生物配列、真核生物mRNA由来のcDNA、真核生物(たとえば、哺乳動物)DNA由来のゲノムDNA配列、さらには合成DNA配列を含んでもよい。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は通常、コード配列の3’側に位置する。
える検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流(51方向)に伸びている。プロモーター配列内には、転写開始部位(ヌクレ
アーゼS1によるマッピングで決定すると都合がよい)、およびRNAポリメラーゼの結合に関わるタンパク質結合ドメイン(コンセンサス配列)が見られる。真核生物プロモー
ターは、必ずではないが多くの場合、「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを含む。原核生物のプロモーターは、−10コンセンサス配列および−35コンセンサス配列に加えてシャインダルガノ配列を含む。
は染色体の複製により娘細胞に遺伝する細胞である。この安定性は、真核細胞が、形質転換DNAを含む娘細胞の集団からなる細胞株またはクローンを樹立する能力により明らかにされる。「クローン」は、単細胞または有糸分裂による共通の祖先に由来する細胞集団である。「細胞株」は、多くの世代にわたってインビトロで安定な増殖が可能な初代細胞のクローンである。
NAであるかどうかも重要である。こうした標準的なハイブリダイゼーション条件は、当業者により公知の式に従い容易に決定され、ハイブリダイゼーションは典型的には予想されるまたは測定されたTmより10〜20℃低く、洗浄は、必要に応じて、よりストリン
ジェントにする。
無極性R基を持つアミノ酸:アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン
非電荷極性R基を持つアミノ酸:グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン
電荷極性R基を持つアミノ酸(pH6.0で負電荷を持つ):アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性アミノ酸(pH6.0で正電荷を持つ):リジン、アルギニン、ヒスチジン(pH6.0)
別の群には、フェニル基を持つアミノ酸があり得る:フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン。
グリシン 75
アラニン 89
セリン 105
プロリン 115
バリン 117
トレオニン 119
システイン 121
ロイシン 131
イソロイシン 131
アスパラギン 132
アスパラギン酸 133
グルタミン 146
リジン 146
グルタミン酸 147
メチオニン 149
ヒスチジン(pH6.0) 155
フェニルアラニン 165
アルギニン 174
チロシン 181
トリプトファン 204
−正電荷を維持できるようなArgからLysへの置換およびその逆;
−負電荷を維持できるようなAspからGluへの置換およびその逆;
−遊離−OHを維持できるようなThrからSerへの置換;および
−遊離NH2を維持できるようなAsnからGlnへの置換。
(v)として公知の部分を含むパラトープを含む、それらの免疫グロブリン分子の各部分(これらの部分は、本明細書に記載の治療方法に使用するのに好ましい)とがある。
質的にインタクトな抗体分子に対するパパインおよびペプシンのタンパク質分解反応により調製する。たとえば、Theofilopolousらへの米国特許第4,342,566号明細書を参照されたい。また、Fab’の抗体分子部分もよく知られており、F(ab’)2部分を作製し、続いてメルカプトエタノールなどで2つの重鎖部分を結合する
ジスルフィド結合を還元し、続いて結果得られるタンパク質メルカプタンをヨードアセトアミドなどの試薬でアルキル化する。本明細書では、インタクトな抗体分子を含む抗体が
好ましい。
延させることに関する。
ゾレシチン誘導性など)、関節炎モデル、アレルギー性喘息モデル、気道炎症モデル、乾癬モデルおよび急性炎症モデルがあるが、これに限定されるものではない。多発性硬化症のEAE動物モデルは、急性もしくは慢性で再発を繰り返す、後天性の炎症性および脱髄性自己免疫疾患を提供する。アレルギーモデルは、免疫学的傷害および状態のモデルとして利用してもよい。変形性関節症モデルとしては、たとえばウサギの膝前十字靭帯を切除して誘導した実験的変形性関節症、およびラットの内側側副靭帯を断裂して誘導した実験的変形性関節症がある。適切な骨疾患、骨損傷、および/または骨粗鬆症モデルも当業者に知られており、入手可能である。
Techniques」(1980);Hammerling et al., 「Monoclonal Antibodies And T−cell Hybridomas」(1981);Kennett et al.,「Monoclonal Antibodies」(1980)を参照されたい。さらに米国特許第4,341,761号明細書;同第4,399,121号明細書;同第4,427,783号明細書;同第4,444,887号明細書;同第4,451,570号明細書;同第4,466,917号明細書;同第4,472,500号明細書;同第4,491,632号明細書;同第4,493,890号明細書も参照されたい。
マウスGEP配列を示す。様々な動物のGEP配列は、公知であり、開示されており、本発明の方法および組成物と、それらに対応し、関連する、本明細書のGEPペプチドの変異体として評価および使用するのに好適なアミノ酸との評価および判定に使用することができるであろう。GEP配列は、入手可能であり、以下のとおり参照によって本明細書に援用する:ラット(GenBank受託番号AAA16903.1、CAA44198.1)、マウス(GenBank受託番号P28798.2、BAE35389.1、NP_032201.2)、スマトラオランウータン(GenBank受託番号NP_001
126689.1)、カニクイザル(crab−eating macague)(GenBank受託番号BAE01796.1)、ウマ(GenBank受託番号XP_001489791.1)、ウシ(GenBank受託番号NP_001070482.1)、ウサギ(GenBank受託番号XP_002719228.1)、ブタ(GenBank受託番号NP_001038043.1)、チンパンジー(GenBank受託番号XP_511549.2)およびオポッサム(GenBank受託番号XP_00 1374870.1)。
クルを望ましいように含む投薬単位製剤で非経口的に投与してもよい。
ピレンオキシドから得られるものなど、それらの一部は、市販されている。ヒドロゲルは、たとえば外科的介入中に、処置される組織の表面に直接付着させてもよい。
期およびクリアランス速度に応じて3〜4日ごとに投与しても、毎週投与しても、または2週に1回投与してもよい。
む。アデノウイルスの後期タンパク質、たとえばアデノウイルス線維タンパク質は、好ましくは、ある種の細胞をビヒクルが標的とするために、または細胞へのビヒクルの送達を増強するために使用する。好ましくは、アデノウイルスに由来する核酸は、本質的にすべてのアデノウイルスの後期タンパク質をコードし、アデノウイルスのカプシド全体、またはその機能的部分、アナログ、および/または誘導体の形成を可能にする。好ましくは、アデノウイルスに由来する核酸は、アデノウイルスE2A、またはその機能的部分、誘導体、および/またはアナログをコードする核酸含む。好ましくは、アデノウイルスに由来する核酸は、少なくとも部分的に、細胞内のアデノウイルス由来の核酸の複製を促進する少なくとも1つのE4領域タンパク質、またはその機能的部分、誘導体、および/またはアナログをコードする核酸を含む。本出願の例に使用するアデノウイルスベクターは、処置発明の本方法に有用なベクターの例示である。
ウイルス前初期プロモーター、レトロウイルスのLTRプロモーター、メタロチオネインプロモーター、SV−40プロモーター、E1aプロモーター、およびMLPプロモーターが挙げられる。本発明の実施に使用してもよい別のプロモーターとして、樹状細胞において活性であり、および/または発現するプロモーターが挙げられる。
TNF/TNFRを阻害または拮抗することができる別のペプチドまたは作用物質を調製することも想定している。別の実施形態では、還元型ペプチド結合、すなわち、R1−C
H2−NH−R2(式中、R1およびR2はアミノ酸残基または配列である)を組み込んだペプチドを作製してもよい。還元型ペプチド結合は、ジペプチドサブユニットとして導入してもよい。こうした分子は、ペプチド結合の加水分解、たとえば、プロテアーゼ活性に耐性があると考えられる。こうしたペプチドは、代謝分解またはプロテアーゼ活性に対する耐性によるインビボでの半減期の延長など、独特の機能および活性を持つアンタゴニストになると考えられる。さらに、ある種の系では、規制されたペプチドが高い機能活性を示すこともよく知られている(Hruby,1982,Life Sciences 31:189−199;Hruby et al.,1990,Biochem J.268:249−262。
of Arizona);ヒドロキシ−1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−カルボキシラート(Miyake et al.,1989,J.TakedaRes.Labs.43:53−76);β−カルボリン(DおよびL)(Kazmierski,1988,Ph.D.Thesis,University of Arizon
a);HIC(ヒスチジンイソキノリンカルボン酸)(Zechel et al.,1991,Int.J.Pep.Protein Res.43);ならびにHIC(ヒスチジン環状尿素)(Dharanipragada)。
et al.,1989,J.Org.Chem.54:109:115);および以下の参考文献により提供されるアナログ:Nagai and Sato,1985,Tetrahedron Lett.26:647 650;DiMaio et al.,1989,J.Chem.Soc.Perkin Trans,p.1687;さらにGly−Alaターンアナログ(Kahn et al.,1989,Tetrahedron Lett.30:2317);アミド結合イソスター(Jones et al.,1988,Tetrahedron Lett.29:3853−3856);トレトラゾール(Zabrocki et al.,1988,J.Am.Chem.Soc.110:5875−5880);DTC(Samanen et al.,1990,Int.J.Protein Pep.Res.35:501:509);ならびにOlson et al.,1990,J.Am.Chem.Sci.112:323−333およびGarvey et al.,1990,J.Org.Chem.56:436に教示されたアナログ。βターンおよびβバルジのコンフォメーション(Conformational Iy)を固定した模倣体、ならびにそれらを含むペプチドについては、1995年8月8日にKahnに発行された米国特許第5,440,013号明細書に記載されている。
酸をペプチドに組み込んでもよい。このペプチド−脂肪酸コンジュゲート、および本発明に使用するのに好適な他のペプチド−脂肪酸コンジュゲートについては、英国特許第8809162.4号明細書、国際出願PCT/AU89/00166号パンフレットおよび上掲の参考文献5に開示されている。タンパク質の安定性およびインビボでの活性など生物学的および物理的性質の向上などのため、炭水化物部分の付加、ならびに本発明のペプチドのグリコシル化アナログの調製および使用も、意図している。
体は、TNF/TNFRと相互作用する、TNF/TNFRまたは発現細胞を標的とする、あるいは抗炎症活性を持つことが分かっている部分または分子の結合を含む。化学部分は、本発明のペプチドのN末端に結合しても、またはC末端に結合してもよい。誘導体化に好適な化学部分は、たとえば、水溶性ポリマーの中から選択してもよい。選択されたポリマーは、ポリマーが結合する成分が生理的環境などの水性環境で沈殿しないような水溶性であってもよい。好ましくは、最終産物の調製物を治療に使用するため、ポリマーは、薬学的に許容されるものである。ポリマーは、分枝でも、または非分枝でもよい。当業者は、ポリマー/成分コンジュゲートを治療に使用するどうか、使用する場合には、所望の投与量、循環時間、タンパク質分解に対する耐性といった考慮すべき事項、および他の考慮すべき事項に基づき、所望のポリマーを選択することができる。本成分の場合、これらの考慮すべき事項は、本明細書に記載するアッセイを用いて確認することができる。
et al.,1992,Exp.Hematol.20:1028−1035(トレシルクロリドを用いたGM−CSFのペグ化を報告)も参照されたい。たとえば、ポリエチレングリコールは、遊離アミノ基またはカルボキシル基などの反応基を介してアミノ酸残基に共有結合させてもよい。反応基とは、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合できる基である。遊離アミノ基を持つアミノ酸残基には、リジン残基および末端のア
ミノ酸残基があり、遊離カルボキシル基を持つアミノ酸残基には、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびC末端のアミノ酸残基がある。ポリエチレングリコール分子を結合する反応基としては、スルフヒドリル基を使用してもよい。治療目的に好ましいのは、N末端またはリジン基での結合などアミノ基での結合である。
いて作製することができる。二量体または多量体のDNA配列はさらに、細菌または哺乳動物細胞の系など発現系に挿入してもよい。これにより、(Met−FLHTRLFV)x(式中、x=2、3、4、...等)などの分子が産生される。その有効性を高めるた
めペプチドまたはペプチド模倣物の間に短くてフレキシブルなスペーサー(Gly−Gly−Gly−Gly−Ser)3を含ませることが必要な場合がある。二量体および多量
体はさらに、ジスクシンイミジルスベラート(DSS)またはジチオビス(スクシニミジルプロピオネート)(DSP)などの架橋試薬を用いて作製してもよい。これらの試薬は、アミノ基と反応し、アルギニン残基の遊離アミン基、およびN末端の遊離アミン基を介してペプチドに架橋することができる。二量体および多量体はさらに、ビオチンとアビジンとの間、JunとFosとの間、およびFc領域の抗体間の親和性相互作用を用いて形成してもよい。精製されたペプチドは、ビオチン化し、強いタンパク質間相互作用を形成することが知られている因子と混合すればよい。ペプチドまたはペプチド模倣物は、上述したような架橋剤を用いて、あるいは、ペプチド−Jun/Fos分子を形成する分子技法を用いて、二量体の形成に関わるJunおよびFosの領域に結合してもよい。JunとFosとのペプチドのハイブリッドを混合すると、二量体の形成が起こるであろう。さらに、ペプチド−Fcハイブリッドの産生物を産生してもよい。哺乳動物細胞に発現させる場合、Fc領域のシステインを介して共有結合性のジスルフィド結合が形成され、二量体の形成が起こるであろう。ペプチドのヘテロ二量体およびヘテロ多量体を形成してもよい。これにより、全分子の各部分が、抗TNF作用および/または抗炎症(anit−inflammatory)作用および/または細胞増殖調節作用など多くの作用の発現を担う多機能であり得る分子が作製されるであろう。これらの多機能分子を作製するには、上述と同じ科学技術を使用してもよい。DNAレベルで糖鎖エピトープ模倣ペプチドをタンパク質に挿入する分子技法を使用してもよい。この挿入は、タンパク質分子のN末端もしくはC末端で行っても、または中程で行ってもよい。ヘテロ二量体は、ペプチド/Fcまたはペプチド/JunもしくはFosのハイブリッド分子を用いて形成してもよい。他のFcまたはJun/Fosを含むハイブリッドと混合すると、二量体の形成が起こり、ヘテロ二量体が産生されるであろう。ペプチドをヘテロ二量体に結合するにはさらに、架橋試薬を使用してもよい。最後に、他の分子のビオチン化と共にペプチドのビオチン化を用いて、多量体を作製してもよい。これらの成分をアビジンと混合すると、アビジン分子の4つのビオチン結合部位それぞれに異なるビオチン化分子が結合する大きな多機能複合体を作製することができる。
乾癬、炎症性腸疾患、クローン病(Chrohn’s disease)、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、炎症性肺疾患および慢性閉塞性肺疾患から選択される。
GEPは、TNFα受容体(TNFR)に結合し、拮抗する。
タンパク質間相互作用の網羅的解析、その後の生物的評価の現在の方法は、特定の疾患または臓器系の発生病理とこれまで無関係であった新規なタンパク質を同定する強力な手段となった。機能遺伝子のスクリーニングにより、我々は今回、GEP、すなわちTNFRに関連する軟骨形成および関節炎の新規なメディエーターを発見した。このことは、軟骨の生物学における増殖因子およびサイトカインの作用と、それらの軟骨障害および関節炎の状態の処置への応用とに関する我々の理解を広げるものである。特に、我々の研究は、中心的なプロ炎症性サイトカインTNFαの天然のアンタゴニストを明らかにし、関節炎の障害の患者に起こる分解現象に関連する洞察を提供するものである。間葉系幹細胞の軟骨形成能を制御し、中心的なプロ炎症性サイトカインの阻害剤として働く増殖因子を同定および操作すれば、それを使用して、軟骨障害および結合組織障害の治療への応用を最適化することができる。この研究の重要な長期的目標は、(1)骨格の生物学および関連する疾患の制御におけるGEP、TNFαの役割、ならびにそれらの相互作用および機能連関を明らかにすること;および(2)GEP、特にGEP誘導ペプチドを集めて(recruit)、関節炎など様々な種類のTNF関連疾患に対して新規な抗TNF/TNFRによる治療介入法を開発することである。
GEPの生物学的特性を考慮に入れて、GEPは、他の既知の増殖因子と同様に「古典的」膜受容体を介して作用し得るとの仮説が立てられている。これまでのところ、機能的受容体は同定されていない。GEP関連タンパク質を調査する中で、我々は、GEP欠損シグナルペプチドをコードするコンストラクトpDBleu−GEP(a.a.2 1−588)をベイトとして用いて酵母ツーハイブリッド(Y2H)用cDNAライブラリーをスクリーニングし、24個の陽性クローンを単離した。これらのクローンのシーケンシングデータにより、そのうちの2個が細胞表面TNFR2(TNFRSF IB/CD120b;受託番号NM_130426)であることが示された。
酵母内のGEPとTNFR2と間の相互作用を確認するため、GaWDBDに結合したGEPをコードするプラスミド、およびVP 16ADと融合した、TNFR2のN末端切断型ミュータント(a.a.26−567)をコードするプラスミドを、酵母細胞に同
時形質転換した。相互作用することが知られており、陽性対照として使用されるc−Jun/c−Fos対と同様に、我々のアッセイにより、β−ガラクトシダーゼの活性に基づきCOMPが酵母内でGEPと相互作用することが示された(図2(A))。これらの2つのタンパク質が初代ヒト軟骨細胞内で相互作用するかどうかを判定するため、免疫共沈降(Co−IP)アッセイを行った(図2(B))。簡単に説明すると、単離されたヒト軟骨細胞から調製した細胞抽出物を、抗TNFR2抗体または対照IgGのどちらかとインキュベートし、免疫沈降した複合体を還元SDS−PAGEにかけ、抗GEP抗体を用いて検出した。抗TNFR2で沈降させた免疫沈降複合体には、特異的なGEPバンドが存在した(レーン3)。しかしながら、対照IgG(レーン2)抗体で沈降させた免疫沈降複合体には、特異的なGEPバンドが存在しなかったことから、初代ヒト軟骨細胞においてGEPはTNFR2に特異的に結合することが明らかになった。
TNFR1およびTNFR2の細胞外ドメイン間に著しいアミノ酸類似性があるため、我々は次に、組換えGEPと、TNFR1およびTNFR2の細胞外ドメイン(R & D System)とを用いた固相結合アッセイにより、GEPがTNFR1およびTNFR2に直接結合するかどうかを判定した(図3)。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートを、500ngの精製されたGEPを含むTBS緩衝液(50mM トリス/HCl、150mM NaCl、pH7.4)100μlでコートとした。ブロッキング後、各ウェル、様々な量(5〜500ng)のTNFR1の細胞外ドメイン(TNFR1ECD、左パネル)またはTNFR2の細胞外ドメイン(TNFR2ECD、右パネル)を加え、液相から結合したタンパク質を、TNFR1またはTNFR2に対する抗体、続いて西洋わさびペルオキシダーゼとコンジュゲートされた二次抗体で検出した。図3に示すように、GEPは、液相TNFR1ECDおよびTNFR2ECDに対して用量依存的結合および飽和を示した。
TNFR2の様々な欠失ミュータントを作製し、GEPと相互作用する能力について酵母ツーハイブリッドアッセイで試験した。これらすべてのミュータントに関するフィルターベースのβ−ガラクトシダーゼアッセイの結果(図4)を図4(A)にまとめてある。この一連の実験からの我々の結論は、TNFR2のCRD(すなわちCRD1、CRD2、CRD3またはCRD4)はそれぞれ、GEPとの相互作用を行うのに十分である。
増殖におけるGEP作用に影響を与えるかどうかを調べた。図5の右パネルに示すように、50ng/mlのGEPにより誘導された軟骨細胞の増殖は、TNFR1(R1ECD、25ng/ml)またはTNFR2(R2ECD、25ng/ml)の組換え細胞外ドメインのいずれによっても完全に止められた。以上のように、これらの結果から、GEPにより介在される軟骨細胞の増殖は、TNFR活性厳密に依存することが示される。
我々は次に、PathScan(登録商標)Multiplex Western Cocktail I(Cell Signaling)を用いて、軟骨細胞のGEP活性化シグナル伝達を解析しようとした。PathScan(登録商標)Multiplex
Western Cocktail I(Cell Signaling)により、単一膜上でホスホ−p90RSK、ホスホ−Akt、ホスホp44/42MAPK(Erk1/2)およびホスホ−S6リボソームタンパク質のレベルを同時に検出することができる。ヒトC28I2軟骨細胞(Dr.Mary B.Goldringから提供)を24時間飢餓状態にし、様々な時点で50ng/mlのGEPで処理し、PathScan(登録商標)Multiplex Western Cocktail Iを用いて、細胞ライセートを解析した。図6に示すように、GEPは、軟骨細胞のAktおよびp44/p42(Erk1/2)経路を特異的に活性化する。
GEP下流の分子を同定するため、我々は、ゲノム全体のDNAチップ解析を行った。全RNAを、ヒトC28I2軟骨細胞から単離し、50ng/mlのGEPにより処理し、マイクロアレイ解析(Affymetrix,Santa Clara,CA)により様々な時点で解析した。階層的クラスタリングで測定したところ、GEP処理後に約40個の遺伝子が上方制御される(2倍超)と判定された[53]。興味深いことに、Gadd45β、JunB、KLF2、Smad7、Sox4およびTcf8などのGEP誘導性の遺伝子は、TGFβサブファミリーによっても活性化されることが知られている[54〜56]。我々は次に、GEPによるこれらの遺伝子の活性化が、TNFRに依存するかどうかを判定し、50ng/mlのGEPの存在下で培養した初代野生型(B6)、TNFR1−/−、およびTNFR2−/−MLE細胞を用いたリアルタイムPCRにより、これらの遺伝子の発現プロファイリングを様々な時点で調べた(図7)。GEPは野生型MLE細胞においては、明らかにこれらの遺伝子を活性化した。しかしながら、GEPはTNFR1−/−細胞またはTNFR2−/−細胞においては、それらの誘導の大部分を喪失したことから、GEPの標的遺伝子の誘導は、TNFR1およびTNFR2に依存することが示される。興味深いことに、TNFR1およびTNFR2はどちらも、GEP刺激性の遺伝子発現にとって重要であるようである。
GEPは、TNFαと同様にTNFRのCRDに結合する(図4)[57]。このため、TNFRに対するGEPとTNFαとの間の結合に、相反する阻害作用(reciprocal inhibition)が存在する。興味ある問題は、同じ受容体TNFRを使用するGEPおよびTNFαが、なぜ正反対の反応を誘導するかである。図8に示すように、TNFα三量体(trimmer)はTNF受容体の細胞外ドメインに結合し、1)ストレス関連JNKの強い活性化を誘導し、p38の反応を抑制し、2)NF−kB経路の活性化を誘導する[58]のに対し、GEPは、Erk1/2を強力に活性化し、中程度にAktシグナル伝達を活性化する(図6および図8)。Sox4、Smad7、JunB、Gadd45β、Tcf8など多くのGEP活性化遺伝子は、TGFβサブファミリーによっても活性化され、GEPにより介在される遺伝子の活性化は、TNFRに依存する(図7)。
Atsttrin(TNF受容体を標的としたTNF/TNFRシグナル伝達のアンタゴニスト)の発見
TNF受容体への結合に必要とされるGEPのペプチドを同定するため、酵母発現プラスミドを用いて、一連のGEPミュータント(すなわちC末端欠失、N末端欠失、個々のグラニュリンユニット、個々のリンカー、および様々な組み合わせ)を発現させた。簡単に説明すると、一連のGEPミュータントをコードするcDNAセグメントをPCRにより増幅し、pDBleu(Life Technologies)酵母発現ベクターのSall/Notl部位にインフレームでクローニングした。作製したプラスミド、およびTNFR1/R2の細胞外ドメインをコードするpPC86−TNFRを、3つのレポーター遺伝子、His+、Ura+およびLacZ(Life Technologies)を含む酵母MaV203株に同時形質転換し、形質転換体をβ−ガラクトシダーゼについて調べた。これらすべてのミュータントフィルターベースのβ−ガラクトシダーゼアッセイ(図9から図15の図の右パネル)の結果を、これらの図の左パネルにまとめてある。図9から明らかなように、一連のC末端欠失の結果から、GEPのC末端の欠失は、TNFRに対する結合親和性を低下させ、最終的に結合活性を完全に喪失することが示された。これは、一連のN末端欠失ミュータントにも当てはまる(図10)。
GEPはTNFαの作用を拮抗する
Atsttrinは、TNFα誘導性の炎症反応を拮抗する:我々は次に、Atsttrinが、TNFにより介在される炎症を阻害するかどうかを判定した。好中球は、TNFαのような炎症性刺激が引き金となり、好中球活性化および炎症プロセスの発生に関わる大量の反応性酸素種を発生する[59]。このため、我々は、TNFα誘導性の好中球活性化に対するAtsttrinの作用を試験した。図16(A)に示すように、Atsttrinは、TNFαが引き金となる好中球活性化を用量依存的に阻害する。重要かつ際立っているのは、Atsttrinが、様々な種類の炎症性疾患、特に関節リウマチなどの処置に臨床的に使用されているエンブレルおよびレミケード[60]に匹敵する(少なくとも同等の)阻害作用を示すことである(図16(B))。
胞を、0.02%BSA(CTR、対照)、100ng/mlのGEP(GEP)、100ng/mlのTNF−α、またはGEP+TNF−αで36時間刺激した。アポトーシスは、TUNELアッセイキット(Promega)を用いて測定した。図17に示すように、TNF−αは、RCSおよびC28I2の軟骨細胞の両方で顕著に細胞死を誘導したのに対し、GEPは、TNF−αによる軟骨細胞のアポトーシスの誘導を劇的に阻害した。
Atsttrinは、GEP刺激性の癌細胞増殖を阻害する
いくつかのヒト癌では、高レベルのGEP発現が認められており、これが乳癌、腎明細胞癌、浸潤性卵巣癌、膠芽細胞腫、脂肪細胞の奇形腫、および多発性骨髄腫など多様な癌における腫瘍形成に関与している[16、18−24]。Atsttrinは、TNFRへのTNFの結合を遮断することでTNFにより介在される炎症を阻害しており、さらに、Atsttrinは、TNFRへのGEPの結合を遮断することで腫瘍細胞の増殖も阻害すると予想される。この仮説を試験するため、我々は、癌細胞のGEP刺激性の細胞増殖に対するAtsttrinの作用を調べた。図20に明らかなように、Atsttrinは、試験対象の癌細胞のGEP刺激性の細胞増殖を用量依存的に阻害した。
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急性炎症空気嚢モデルの研究
空気嚢型急性炎症動物モデルを用いて、GEPおよびAtsttrinの抗炎症活性を試験した。空気嚢を誘導するため、10〜15週齢の雄マウスの背部皮下に、3mlの空気を注射した。2日後、嚢を1.5mlの空気で再膨張させた。6日目に、カラゲナンの懸濁液1ml(カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸塩緩衝生理食塩水溶液[PBS]中に2%重量/容量)を空気嚢に注射して、炎症を誘導した。空気嚢に炎症を誘導する1時間前に、レミケード(10ug/g)、GEP(10ug/g)およびAtsttrin(10ug/g)を投与した。4時間後、CO2ナルコーシスによりマウスを
屠殺し、嚢を2mlのPBSでフラッシュし、滲出液を採取した。遠心分離(1,000g、10分間)後、無細胞の滲出液を集めた。製造者の指示に従い酵素免疫測定法(R&D Systems,Minneapolis,MM)を用いて、滲出液中のIL−6およびIL−13の濃度を2回ずつ定量した。図21に示す(showed)ように、GEPおよびその誘導Atsttrinはどちらも、2つの主要な炎症性メディエーターIL−6およびIL−13のレベルを強力に低下させた。このモデルでは、GEPおよびAtsttrinがどちらも、レミケードより効果的な抗炎症作用(IL−13濃度が約80%低下)を示す点に留意されたい。
慢性炎症動物モデルの研究
関節リウマチ動物モデルを用いて、GEP活性を判定する。この研究では、BALB/cJ雌マウスを使用する。この動物を1ケージ当たり3〜4匹の密度で収容し、1週間馴化させる。コラーゲンIIの十分に解明されたエピトープに対する4種のモノクローナル抗体(mAb:C11b、J1、D3およびU1)の組み合わせをIV投与する(0日目)。3日後(3日目)、マウスに、IP投与でリポ多糖をチャレンジする(LPS、25μg/マウス)。3日目のLPSのチャレンジから1時間後に試験デザインに従い、被検化合物およびビヒクルを投与する。1日目、4日目、7日目、10日目および11日目に足の浮腫を判定する。1日目、3日目、5日目、7日目および10日目に関節の炎症の徴候について、マウスの関節炎スコアを視覚的に検討する。関節炎スコアを測定したすべての日に体重を測定する。剖検時に血液を採取し、血清または血漿へ処理する。11日目にカリパスで最終的な測定を行った後、マウスを安楽死させる。後肢を採取し、病理組織解析のために固定する。
TNFαトランスジェニックマウスにおける関節炎の進行に対するGEPおよびAtsttrinの作用
Dr.George Kollias1研究室が最初に作製したヒトTNFα遺伝子導
入トランスジェニックマウスは、関節リウマチ患者に観察される多くの特徴を持つ慢性炎症性および破壊性多発性関節炎を発症する[55]。このマウスモデルの表現型により、TNFαが関節リウマチのプロ炎症カスケードの最上流にあるという理論が検証され、さらに、この疾患の効果的な管理を変貌させてきた抗TNFα治療の顕著な成功が示唆された。このため、TNFαトランスジェニックマウスは、関節リウマチの発生過程の分子機構を分析し、新規な治療戦略の有効性を評価するための非常に有用な手段である[115、138、139]。このモデルを用いて、GEP、特にその誘導ペプチドatsttrin、関節リウマチを処置するための直接投与を詳細に評価する。簡単に説明すると、TNFαトランスジェニックマウス(n=60、Taconicから購入)をマウス10匹ずつの6群に分け、文献に効果的であると記載されている用量でGEP、GEP誘導ペプチド、および抗TNFα抗体(対照とする)を投与する[140、141]。処置剤はすべて腹腔内注射により投与する。群1は、リン酸塩緩衝生理食塩水で処置し、陰性対照とする。群2および3(低用量のGEPおよびGEP誘導ペプチド)には、4週目〜10週
目にかけて毎週3回1mg/gのGEPまたはペプチドを投与する。群4および5(高用量)には、4週目〜10週目にかけて毎週3回lOmg/gのGEPまたはペプチドを投与する。群6には、4週目〜10週目にかけて毎週3回10mg/gの抗TNFαを投与する。10週目に、動物をすべて頸椎脱臼で屠殺し、心臓穿刺により血液を採取し、より詳しい解析のため足および脛骨を脱臼させる。臨床評価は生後4週目から週1回行う。各群の動物の関節炎を評価する。
RANKL誘導性の破骨細胞形成に対するGEPおよびAtsttrinの作用
破骨細胞は骨吸収細胞であり、その過剰な活性は、骨粗鬆症を引き起こす。RANKLは、破骨細胞形成における重要な受容体であり、RANKに結合する。RANKおよびTNFRは、同じTNFRファミリーに属し、配列、特に構造が非常に類似している。(1)破骨細胞形における重要な受容体RANKが、TNFRサブファミリーに属すること、および(2)GEPおよびその誘導ペプチドAtsttrinがTNFRに結合し、TNFα作用を遮断することを踏まえて、我々はさらに、GEPおよびAtsttrinが破骨細胞形成に影響を与えるかどうかを調べた。GEPまたはペプチドatsttrinの存在下および非存在下で、RANKL誘導性の破骨細胞形成を判定した。簡単に説明すると、我々は、RANKLの存在下でマクロファージRaw 264.7を4日間培養し、TRAP染色を行った。予想どおり、RANKLは、確実に破骨細胞形成を誘導し、多核性のTRAP陽性細胞が観察された(図22、矢印で示す)。GEPおよびatsttrinは、用量依存的(does−dependent)に骨芽細胞の分化を阻害することが示された(図22)。興味深いことに(Interesting)、破骨細胞形成の遮断において、atsttrinは、GEPより強力であるように思われる。atsttrinが破骨細胞形成を阻害するという知見により、このペプチドが、関節リウマチなどの様々な種類の炎症性疾患だけでなく、骨粗鬆症も処置する作用があることが示される。
TNFファミリーメンバーRANKLおよびFASに対するGEPおよびAtsttrinの結合
GEP/Atsttrinと、RANKおよびFASなどTNF受容体(TNFR)サブファミリーの他のメンバーとの間の相互作用を調べた。結合を判定するため、様々なプラスミド対を、酵母菌株MAV203に同時形質転換し、酵母ツーハイブリッドアッセイを行った(図26)。GEPプラスミドは、TNFR1プラスミド、TNFR2プラスミド、RANKプラスミド、およびFASプラスミドとそれぞれ同時形質転換した。Atsttrinプラスミドは、TNFR1プラスミド、TNFR2プラスミド、RANKプラスミド、およびFASプラスミドとそれぞれ同時形質転換した。酵母形質転換体は、SD−leu−/trp−/his−/ura−/3AT+プレートで選択し、β−ガラクト
シダーゼ活性について試験した。Rbとラミンとの間の相互作用がないものを陰性対照として使用した。このツーハイブリッドアッセイによれば、GEPは、TNFRだけでなく、RANKおよびFASとも結合するのに対し、Atsttrinは、TNFRに特異的に結合する。
的プロセスに影響を与え得るためである。
GEPは、TNFRに対してTNFαより高い結合親和性を示す
SensiQ Pioneer(ICx Nomadics,Oklahoma City,OK 73104)を用いた分析的表面プラズモン共鳴により、TNFRに対するGEPおよびTNFαの速度論的(kinetic)結合研究の観察および解析を行った。図27に速度論的(kinetic)結合を示し、表1に速度定数をまとめてある。GEPは、TNFαと比較してTNF受容体、特にTNFR2に対して著しく高い親和性を示す(GEPとTNFαとのKD:1.28×10-9Mと7.64×10-7M)。TNF
R2(KD7.64×10-7M)よりもTNFR1(KD8.8×10-9M)に対してよ
り高い親和性を示すTNFαと異なり、GEPは、TNFR1(KD)1.58×10-9M)よりもTNFR2(KD1.28×10-9M)に対して若干高い親和性を示す。
AtsttrinおよびTNFRの結合研究
AtsttrinをGST融合タンパク質として細菌に発現させ、グルタチオンアガロース樹脂で精製し、活性化血液凝固第X因子(Xa factor)を用いて溶出した(活性化血液凝固第X因子(Xa factor)の切断部位はGSTとAtsttrinとの間にある)(図28(A))。次いで活性化血液凝固第X因子(Xa factor)を、Xa Removal Resin(Qiagen)を用いて溶出液から除去した。精製されたAtsttrinを、Limulus血球抽出物を用いたアッセイによりエンドトキシンについて解析したところ、エンドトキシンレベルは対照培地と同等であり、製造者規格の<1単位/μgを何倍も下回ることが示された。分析的表面プラズモン共鳴アッセイ(図28(B)および(C))を用いて、我々は、AtsttrinはTNFαと比較して、TNFR2に対し約9倍高い結合親和性(Atsttrin/TNFR2とTNFα/TNFR2とのKD:8.59×10-8Mと7.64×10-7M)を示したけれども、TNFR1に対しては約18倍低い親和性(Atsttrin/TNFR1とTNFα/TNFR1とKD:1.60×10-7Mと8.80×10-9M)を示したことから、AtsttrinはTNFα/TNFR2経路を効果的に遮断できるものの、TNF
α/TNFR1シグナル伝達に大きな影響を与え得ないことを見出して気持ちが高ぶった。
Atsttrinは、Erk1/2およびAktシグナル伝達を活性化できずに、癌細胞増殖を阻害する
単一膜上でホスホ−p90RSK、ホスホ−Akt、ホスホ−p44/42 MAPK(Erk1/2)、およびホスホ−S6リボソームタンパク質のレベルを同時に検出することができるPathScan(登録商標)Multiplex Western Cocktail I(Cell Signaling)を用いて、我々は次に、軟骨細胞におけるGEP活性化シグナル伝達とAtsttrin活性化シグナル伝達とを比較しようとした。ヒトC28I2軟骨細胞(Dr.Mary B.Goldringから提供)を24時間飢餓状態にし、50ng/mlのGEPまたはAtsttrinを用いて処理し、PathScan(登録商標)Multiplex Western Cocktail Iを用いて細胞ライセートを様々な時点で解析した。図29に示すように、GEPは、Erk1/2を強く活性化し、Akt経路を中程度に活性化した(Feng,J.,Guo,F.,Jiang,B.,Frenkel,S.,Zhang,Y.,Wang,D.,Liu,C.J.,GEP:A BMP2−Inducible Growth Factor that Activates Erk1/2 Signaling and JunB Transcription Factor in Chondrogenesis,FASEB J.,2010 Feb.2[Epub ahead of
print])。しかしながら、Atsttrinは、GEPのTNFR結合活性を保持しつつ(図28)、GEPの発癌性シグナル伝達を破壊する。GEPおよびAtsttrinを組み合わせて試験すると、Atsttrinは、GEPにより介在されるp−AKTおよびp−ERKの活性化を遮断または抑制する(図29)。
コラーゲン誘導性の関節炎(CIA)モデルにおいてAtsttrinは、関節炎の発症を予防する
我々は次に、RAの多くの臨床的および病理学的特徴を示す、コラーゲン誘導性の関節炎(CLA)マウスモデルを用いてAtsttrinを調べた。簡単に説明すると、0日目にDBA/1マウスに、改変した完全フロイントアジュバントに乳化したニワトリのコラーゲンIIを、s.c.投与で尾基底部にチャレンジした(Chondrex Single Immunization)。19日目、マウスを3群(各々n=10)に分け、35日目まで1日おきに以下のとおり処置した:群1には、Atsttrinを10μg/g体重の用量でi.p.投与し、群2には、エンブレル(TNFR2の可溶性細胞外ドメイン)を10μg/g体重の用量でi.p.投与し(陽性対照とした)、群3には、等量のリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS、陰性対照とした)を投与した。関節炎の発生、関節炎の重症度スコア、および定圧カリパスで測定する足の厚さについて、マウスを毎日モニターした。図30(A)および30(B)に示すように、Atsttrinおよびエンブレルはどちらも、関節炎の発症を効果的に予防した。Atsttrinは関節炎の発症を完全に予防したため、このモデルではAtsttrinの方が、エンブレルより強力であった。図31の代表的なパネルに見られるように、PBSで処置したマウスでは、CIAの症状(腫脹、紅斑、変形)がはっきりと確認された。これに対し、Atsttrinおよびエンブレルで処置したマウスでは、病理学的変化が著しく低下し、Atsttrin処置マウスは、正常マウスと同等であった。PBSで処置したCIAマウスの足首は、白血球の強い浸潤および組織の破壊(H&E染色)、ならびにマトリックス染色(サフラニン(Sarfranin)0染色)の消失を示した(図32(A))。Atsttrin処置マウスでは、関節炎の症状がなかった。MicroCT画像(図32(B))からは、PBSで処置したCIAマウスで明瞭な骨糜爛が明らかになった。しかし、Ats
ttrinでは、明らかにならなかった。さらに、PBSで処置したCIAマウスの糜爛領域周囲には、TRAP+の骨吸収破骨細胞が明瞭に認められた。これに対し、Atsttrin処置CIAマウスでは、TRAP+破骨細胞がほとんど検出できなかった(図33)。
細胞内のTNF誘導性の活性に対するAtsttrinの作用
RAW264.7細胞を用いたインビトロでの細胞ベースの研究を利用して、細胞内のTNFの反応に対するAtsttrinの作用を詳細に判定し、評価した。GEPおよびAtsttrinについて、TNF誘導性のニトリット生成に対するその作用を評価した。添加したTNF(500ng/ml)の存在下で、GEP、Atsttrinまたはエンブレルのいずれかの量を増量しながら(0.3、1.5および7.5nM)、細胞内のニトリット生成を測定した。GEPは、ニトリット生成をやや低下させたのに対し、AtsttrinおよびエンブレルはそれぞれTNF誘導性のニトリット生成をより著しく低下させた(図36)。次に、細胞内のTNF誘導性のNFκBの核内蓄積を評価した。GEPおよびAtsttrinは、NFκB p65染色で判定したところ、どちらもTNF誘導性のNFκBの核内蓄積を遮断した(図37)。TNFαの存在下で、GEPまたはAtsttrinのどちらかの濃度を上げながら、TNF活性化NFκBレポーター遺伝子(NFκB結合部位を持つPAK−I)の誘導を測定した(図38)。Atsttrinは、GEPより(that)低濃度でレポーター遺伝子の誘導をより著しく阻害した。
Claims (19)
- 配列番号1のアミノ酸153〜178で表される、少なくとも1/2グラニュリンユニットF;配列番号1のアミノ酸179〜205で表されるリンカーユニットP3;配列番号1のアミノ酸262〜283で表されるリンカーユニットP4;配列番号1のアミノ酸284〜304で表される、少なくとも1/2グラニュリンユニットA;配列番号1のアミノ酸336〜365で表されるリンカーユニットP5;および配列番号1のアミノ酸366〜392で表される、少なくとも1/2グラニュリンユニットCを含み、かつTNFR1またはTNFR2シグナル伝達を拮抗でき、全長GEP配列の混合した部分からなる単離されたペプチド。
- 配列番号2で表されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離されたペプチド。
- 前記ペプチドは、TNFR1および/またはTNFR2に結合できる、請求項1に記載の単離されたペプチド。
- 請求項1に記載の1つまたは複数のペプチドと、抗炎症薬または化合物、抗癌剤または化合物、および免疫調節薬の1つまたは複数とを含む、組成物。
- 任意選択的に薬学的に許容されるキャリア、ビヒクルまたは希釈液をさらに含む治療用または医薬組成物である、請求項4に記載の組成物。
- 請求項1に記載のペプチド、および薬学的に許容されるキャリア、ビヒクルまたは希釈液を含む、医薬組成物。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のペプチドをコードすることができる、単離された核酸。
- 請求項7に記載の核酸、および前記核酸を発現するための手段を含む、ベクター。
- 前記核酸は細胞内で前記核酸の発現を可能にするシグナルに作動可能に連結される、請求項8に記載のベクター。
- その必要のある哺乳動物細胞または被検体においてTNFもしくはTNF/TNFRの活性またはシグナル伝達を調節、遮断、または阻害するための医薬を製造するための組成物の使用であって、該組成物が(a)配列番号1のアミノ酸153〜178で表される、少なくとも1/2グラニュリンユニットF;配列番号1のアミノ酸179〜205で表されるリンカーユニットP3;配列番号1のアミノ酸262〜283で表されるリンカーユニットP4;配列番号1のアミノ酸284〜304で表される、少なくとも1/2グラニュリンユニットA;配列番号1のアミノ酸336〜365で表されるリンカーユニットP5;および配列番号1のアミノ酸366〜392で表される、少なくとも1/2グラニュリンユニットCを含み、かつTNFR1またはTNFR2シグナル伝達を拮抗でき、全長GEP配列の混合した部分からなるGEPペプチドまたは(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む組成物であることを特徴とする使用。
- その必要のある哺乳動物細胞または被検体においてTNFの活性またはシグナル伝達を調節、遮断、または阻害するための医薬を製造するための請求項6の組成物の使用。
- その必要のある被検体においてTNF/TNFRシグナル伝達により介在される疾患または状態を予防、緩和、および/または処置するための医薬の製造のための組成物の使用であって、該組成物が(a)配列番号1のアミノ酸153〜178で表される、少なくとも1/2グラニュリンユニットF;配列番号1のアミノ酸179〜205で表されるリンカーユニットP3;配列番号1のアミノ酸262〜283で表されるリンカーユニットP4;配列番号1のアミノ酸284〜304で表される、少なくとも1/2グラニュリンユニットA;配列番号1のアミノ酸336〜365で表されるリンカーユニットP5;および配列番号1のアミノ酸366〜392で表される、少なくとも1/2グラニュリンユニットCを含み、かつTNFR1またはTNFR2シグナル伝達を拮抗でき、全長GEP配列の混合した部分からなるGEPペプチドまたは(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む組成物であることを特徴とする使用。
- その必要のある被検体においてTNF/TNFRシグナル伝達により介在される疾患または状態を予防、緩和、および/または処置するための医薬の製造のための請求項6に記載の組成物の使用。
- 前記疾患または状態は、炎症性疾患もしくは状態、免疫学的な疾患もしくは状態、または癌である、請求項12または13に記載の使用。
- 前記炎症性疾患または状態は、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、乾癬、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、炎症性肺疾患および慢性閉塞性肺疾患から選択される、請求項14に記載の使用。
- 前記免疫学的な疾患または状態は、アレルギーおよび自己免疫疾患から選択される、請求項14に記載の使用。
- TNF/TNFR活性を拮抗または阻害するのに効果的である可能性がある薬剤または化合物をスクリーニングするためのアッセイ系であって、可能性がある薬剤または化合物を、TNFを含む細胞サンプルに投与してTNF/TNFR活性を活性化すること、および対照剤との比較によりTNF活性時の前記可能性がある薬剤または化合物の前記効果を判定することを含み、前記対照剤は請求項1に記載のペプチドであることを特徴とするアッセイ系。
- 前記TNFはTNFαである、請求項17に記載のアッセイ系。
- 前記TNFはTNFαであり、前記対照剤は配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項17に記載のアッセイ系。
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