CN102724993A - 靶向tnf家族受体并拮抗tnf作用的肽、组合物、方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供TNF的调节剂,尤其肽及其衍生物,尤其GEP肽,其拮抗TNF和TNF介导的反应、活性或信号转导。本发明提供拮抗TNF和调节TNF介导的疾病或反应的方法,其中所述TNF介导的疾病或反应包括炎性疾病和病症。本发明提供GEP肽的组合物,包括与其他炎症介质组合的组合物。本发明提供治疗、减轻或预防TNF介导的疾病和炎性病症的方法,其中所述TNF介导的疾病和炎性病症包括类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、牛皮癣、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、炎性肺病、慢性阻塞性肺病。
Description
政府支持
本发明是由政府支持在美国国家卫生研究院国家关节炎和肌肉骨骼和皮肤病研究所(National Institute of Health,National Institute ofArthritis and Musculoskeletal and Skin Disease)授予的NIH/NIAMS 1KO1 AR053210和NIH/NIA 1 R03 AG029388下完成的。政府在本发明中具有特定权利。
发明领域
本发明通常涉及TNF/TNFR的调节剂,特别是拮抗TNF和TNF/TNFR介导的反应、活性或信号转导的肽及其衍生物。本发明亦涉及拮抗TNF和调节TNF介导的疾病或反应的方法,所述TNF介导的疾病或反应包括炎性疾病和病症。
发明背景
在关节炎的进展中,滑膜、软骨和骨都是生长因子、细胞因子和炎症介质的产生增多的位点,所述生长因子、细胞因子和炎症介质被认为是有助于发病[1,2]。虽然骨和滑膜均在关节炎的发病中具有重要作用[1,3],但是在开发疾病改善治疗中大多数的努力集中于软骨内的分子事件。关节炎软骨细胞经历一些列的复杂变化,包括增殖、分解代谢改变和最后死亡。在不同疾病阶段的这些表型改变的调节在密集研究中,并集中于调节每个这些分立的软骨细胞反应的生物力学和生物化学信号[2,4]。在该调节级联中,软骨细胞它们自身是主要主角—不只是外来生物力学和生物化学刺激的靶标,而且它们自身是促进关节软骨的恶化的细胞因子、蛋白酶和炎症介质的来源[1,2]。由关节炎软骨细胞产生的致病分子包括肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-1(IL-1)、IL-6、IL-8、基质金属蛋白酶(MMP)、ADAMTS、一氧化氮、前列腺素和白三烯[2,4]。亦有证据:关节炎软骨细胞表现增加的合成代谢活性,包括生长因子的释放增加和II型胶原、蛋白聚糖和其他细胞外基质蛋白合成增加,以及与软骨祖细胞肥大表型相关基因的表达增加[5-7]。
以开发特定的治疗价值的拮抗剂的目的,在过去的二十年期间在风湿病学中大量的研究集中于鉴定在类风湿性关节炎(RA)中导致炎性和退化过程的细胞因子和介质。在所有的因子中,TNF-α受到最大的关注,因为它的位置在促炎细胞因子级联的顶点,以及在RA的发病中它的统治地位。许多证据支持该理论,包括:(1)TNF-α在来自RA患者的发炎的滑膜和软骨中高水平表达;(2)抗-TNF-α抑制其他包括IL-I在内的促炎细胞因子的产生;和(3)TNF-α可诱发关节炎症、通过诱导金属蛋白酶引发软骨破坏以及刺激破骨细胞生成和骨再吸收。最重要地,用于RA的抗-TNF治疗通过降低炎症、改善患者机能和活力以及减弱软骨和骨侵蚀已经显示显著的结果。现在有三种通过靶向TNF配体的抗-TNF治疗,依那西普(恩利(Enbrel),一种可溶性TNFR2-lgG1融合蛋白)、英利昔单抗(类克(Remicade),一种针对TNF-α的嵌合单克隆抗体)和阿达木单抗(一种针对TNF-α的人源化单克隆抗体),它们已在临床上用于治疗多种炎性疾病,包括类风湿性关节炎。工程蛋白/肽现在提供新的一波治疗产品。实际上,设计蛋白/肽治疗药现在超过和胜过FDA每年批准的新小分子药物的数量。直接靶向细胞因子用于其系统移除(配体腐蚀(ablation))的抗体和免疫黏附素已成为有效的治疗策略(例如,依那西普、阿达木单抗和英利昔单抗),并在一些适应症中,细胞因子受体(例如阿那白滞素)的选择性靶向可实现高度有效临床结果。
颗粒体蛋白/上皮肽前体(GEP),亦被称为PC细胞衍生的生长因子(PCDGF)、acrogranin、前颗粒体蛋白(PGRN)、前上皮肽(PEPI)或G80,首先作为生长因子从条件组织培养基中纯化[8,9,65,66,67]。GEP是一种有80kDa的表观分子量的593-氨基酸分泌性糖蛋白[10,14],其起自分泌生长因子的作用。GEP包含富半胱氨酸InOtJf(CX5- 6CX5CCX8CCX6CCXDX2HCCPX4CX5-6C)(SEQ ID NO:9)的七个半重复,依P-G-F-B-A-C-D-E的次序,其中所述A-G是全长重复而P是半个模体(图1)。共有序列的C末端包含保守序列CCXDX2HCCP(SEQ ID NO:10),并被认为具有金属结合位点以及参与调节功能[15]。特别地,GEP经历蛋白水解加工,伴随释放称为颗粒体蛋白(或上皮肽)的小的6-kDa重复单位,其保留生物学活性[16]:肽在细胞生长测定中是有活性的[13],并可能与炎症有关[17]。
GEP在快速循环上皮细胞中、在免疫系统的细胞中和在神经元中大量表达[10-12,17]。高水平的GEP表达亦发现于一些人类癌症中,并在多种癌症中促进肿瘤生成,癌症包括乳腺癌、透明细胞肾癌、侵袭性卵巢癌、成胶质细胞瘤、脂肪细胞性畸胎瘤和多发性骨髓瘤[16,18-24]。虽然GEP主要作为分泌性生长因子起作用,但是亦发现它定位于细胞内侧并直接调节细胞内活性[12,25-27]。GEP在细胞增殖调控中的作用已使用源自带胰岛素样生长因子受体(IGF-IR)基因定向缺失的小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(R-细胞)充分表征。这些细胞不能够响应于前进通过细胞周期必需的IGF-I和其他生长因子(EGF和PDGF)增殖[28]。与此相反,GEP是唯一已知的能够绕开IGF-IR需求的生长因子,因此促进R细胞的细胞生长[13,29]。愈来愈多的证据亦表明GEP在分化、发育和病理过程中的调节。它作为差异表达基因已经从间皮分化[30]、大脑的性分化[31]、巨噬细胞发育[32],和类风湿性关节炎及骨关节炎的滑膜[33]中分离得到。GEP亦显示为创伤反应和组织修复的重要介质[21,34]。据报道GEP中的突变导致与染色体17相关联的tau阴性额颞痴呆[35-38]。GEP的作用模式大部分仍未知。已报道一些GEP相关蛋白在多种过程中影响GEP作用。一个实例是分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)。弹性蛋白酶专门消化在颗粒体蛋白间接头中的GEP,导致颗粒体蛋白肽的产生,表明该蛋白酶可能为重要的GEP转化酶。SLPI通过直接与弹性蛋白酶结合或者通过将颗粒体蛋白肽与酶隔绝来阻断该蛋白水解作用[34]。GEP可通过与人细胞周期蛋白T1[26]和Tat-P-TEFb[25]相互作用调节转录活性。亦发现GEP与串珠蛋白聚糖相互作用,串珠蛋白聚糖是一种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖;无串珠蛋白聚糖小鼠表现严重骨骼缺陷[19,39-41]。
细胞因子的肿瘤坏死因子(TNF)家族在多种生物学功能中起着重要的作用,生物学功能包括炎症、器官发生、宿主防御、自身免疫和细胞凋亡。这些有力的生物学介质的作用通过受体-配体相互作用实现,导致细胞内的信号转导和细胞表型改变。配体通过形成三聚体并与它们的相应受体结合来发挥它们的功能。随后受体寡聚化导致受体细胞内结构域的构象改变,其于是使衔接蛋白的TNF受体相关因子(TRAF)家族成员能够结合并开始信号级联放大。TNFR2、TNFR1、TrkA、NGFR、CD 40、CD 30、OX-40、DR5、DR3、DR4和RANK包括与不同的TRAF分子相互作用的一些TNF受体超家族成员(包括1-6)(Lewit-Bentley,A.,等,J.MoI.Biol.199:389-392(1988),Banner,D.W.,等,CeI.73:431-445(1993),Karpusas,M.,等,Structure.3:1031-1039(1995),Hymowitz,S.G.,等,MoI.Cell.4:563-571(1999),Mongkilsapaya,J.,等,Nat.Struc.Biol.6:-1048-1053(1999),Cha,S.S.,等,J.Biol.Chem.275:31171-31177(2000))。
两种TNF受体(TNFR1和TNFR2)都在细胞中遍在表达并与它们的关联配体(TNFα,一种重要的促炎细胞因子)相互作用[42-44]。人们普遍认为TNFα在病理生理学中起着非常重要功能,是强烈干扰细胞生长、分化和死亡的因子。TNF似乎不仅协调对感染和免疫损伤的急性反应,而且似乎作为生理稳态重建和调节所需的平衡因子起作用[45]。已发现TNFα影响骨骼发育:在大多数已知的影响儿童纵向生长的炎性疾病中,它的水平增加[46,47],且用TNF拮抗剂依那西普(恩利)治疗难治的青少年特发性关节炎,在儿童中显示追赶(catch-up)生长[46,47];TNFα在跖骨器官培养物中调节生长板软骨细胞并阻抑纵向生长[48]。
关节炎是一种退行性关节疾病,主要在老年群体中发生,在美国其目前影响超过46,000,000人。通常临床症状是疼痛和强直,尤其是长时间活动后。在工业化社会里,关节炎是身体残疾的首要原因,增加卫生保健使用,并损害生活的质量。在未来十年随着人口增加和老龄化,关节炎病症的影响预期上升。尽管关节炎疾病的盛行,但是它们精确的病因学、发病学和进展仍然超出我们的理解。积累的证据证明炎性细胞因子和生长因子在关节炎的病理过程中的重要性。关节连接中关节软骨和骨的细胞外基质的破坏被认为是通过过多的细胞因子活性以及炎性细胞因子和它们的生理拮抗剂间的不平衡介导。调节软骨细胞和关节炎的生长因子和拮抗细胞因子的作用的抑制剂的分离因此从病理生理学和治疗学两者的角度看均极为重要。我们之前已鉴定颗粒体蛋白/上皮肽前体(GEP)为一种新的软骨形成生长因子,其在软骨形成中起着重要的作用(Xu,K等(2007)JBiol Chem 282(15):11347-1 1355;WO 2008/094687 A2)。
在本领域仍需要更好和更彻底理解炎性疾病和病症的过程,并由此干预炎性疾病和病症,特别是TNF家族成员介导的过程和病症。因此,本发明的目的是延伸我们对生长因子和细胞因子控制软骨发育和关节炎的分子机制的理解,及其用于开发用于各种TNF相关疾病(包括炎性关节炎)的新的抗-TNF/TNFR治疗干预的介质。
本文引用的参考文献不应理解为承认它们是本发明的现有技术。
发明概述
考虑到GEP的生物学性质,假设GEP可通过“经典”细胞膜受体作用,如其他已知生长因子一样。到目前为止,尚未鉴定功能受体。本文所述的我们的功能基因筛查导致作为新的GEP结合受体的TNF受体的分离。我们的研究证明GEP(颗粒体蛋白/上皮肽前体)是第一个直接靶向TNF受体(TNFR)的生长因子。因此GEP及其衍生肽代表新的通过作用于细胞因子受体的抗-TNF/TNFR信号转导阻断剂。
本文所述的研究证明GEP是新的TNF/TNFR信号转导的拮抗剂。本发明显示:1)GEP以剂量依赖方式与TNF受体直接结合;2)通过中和抗体或重组细胞外结构域阻断TNF受体废除了GEP在细胞增殖的刺激中的功能;3)GEP有力激活Erk1/2信号转导,并适度激活Akt途径;4)GEP激活已知是TGFβ亚家族的下游分子的基因,包括BMP2;另外,GEP介导的这些基因表达的诱导依赖于TNF受体;5)GEP是关节炎反应基因并且在关节炎患者中它的水平是显著升高的;6)GEP作为TNFα的拮抗剂,显著减少由TNFα诱导的炎症反应和细胞凋亡;和7);重要地,GEP比恩利和类克表现出更好(至少一样好)地抑制TNF刺激的炎症,恩利和类克已在临床上用于治疗多种炎性疾病和病症,包括类风湿性关节炎。这些发现揭示:GEP是通过直接靶向TNF受体的TNF/TNFR信号转导的新的天然存在的拮抗剂。
本发明提供GEP和GEP肽(特别包括表示为atsttrin的肽),其作为TNF/TNFR活性和信号转导的调节剂,尤其抑制或阻断TNF介导的信号转导或反应,特别地作为TNF/TNFR的拮抗剂。
本发明提供这样的肽,其拮抗TNF家族成员受体(尤其TNFR),并阻断、抑制、降低或预防TNF家族成员信号转导,包括TNF/TNFR信号转导。本发明提供这样的肽,其拮抗TNF家族成员受体(尤其RANK),并阻断、抑制、降低或预防TNF家族成员信号转导,包括RANK/RANKL信号转导。
在一个具体实施方案中,本发明涉及本文公开的GEP肽和atsttrin家族的所有成员,其能够调节、尤其拮抗TNF家族/受体信号转导和反应,尤其TNF/TNFR信号转导和反应。肽家族包括片段或部分,包括GEP序列和半单位的混合部分,尤其包括一个或多个颗粒体蛋白单位和一个或多个GEP的接头单位。在一个方面,肽包含两个以上的颗粒体蛋白单位的半单位和一个或多个GEP的接头单位。
在本发明一个具体方面,GEP肽包含肽atsttrin,其包含颗粒体蛋白单位A、C和F的半单位与接头单位P3、P4和P5组合的组合。在一个具体方面,GEP肽包含颗粒体蛋白单位的半单位和接头单位的组合,其中至少一个半单位是1/2F,接头单位尤其为至少两个接头单位。在另一个具体方面,atsttrin具有图24所示的氨基酸序列,并且包含颗粒体蛋白单位和接头单位1/2F-P3-P4-1/2A-P5-!/_C,其包含如SEQ ID NO:2中所示。
本发明自然预期用于制备本发明的GEP肽和/或atsttrin的一些方法,包括如本文举例说明的方法和/或使用已知的重组技术,并且本发明因此旨在在其范围内涵盖这种合成制备。本文公开的拮抗剂氨基酸序列的测定有助于通过任何各种合成方法或任何已知技术再生产,并且因此本发明延伸到用于通过重组DNA技术在宿主系统中表达的表达载体和所产生的转化宿主,其中所述表达载体包含编码本发明的肽的核酸。
本发明亦涉及重组DNA分子、重组核酸或克隆基因或者其简并变体(优选核酸分子,特别是重组DNA分子或克隆基因),其编码示于图24的一种或多种GEP肽或其变体的氨基酸。在一个具体实施方案中,重组DNA分子、重组核酸或其简并变体(优选核酸分子)编码能够拮抗TNF/TNFR的GEP肽,其包含图1和图23的GEP序列中所示的一个或多个颗粒体蛋白单位和一个或多个GEP的接头单位。在另一个具体实施方案中,重组DNA分子、重组核酸或其简并变体(优选核酸分子)编码如图24所示的能够拮抗TNF/TNFR的GEP肽atsttrin,其包含颗粒体蛋白单位和接头单位1/2F-P3-P4-1/2A-P5-!/2C(SEQ ID NO:2)。
本发明的目的是提供用于治疗方法的药物组合物,其包含或者基于GEP肽和/或atsttrin。药物组合物包含一种或多种具有TNF拮抗活性的GEP肽和/或atsttrin的组合。药物组合物包含一种或多种具有TNF拮抗活性的GEP肽和/或atsttrin以及一种或多种炎症介质的组合。炎症介质包括和可选自非甾体抗炎剂(NSAID)、类固醇、糖皮质激素、其他TNF拮抗剂(例如依那西普、阿达木单抗和英利昔单抗)和细胞因子受体拮抗剂(例如阿那白滞素)。药物组合物包含一种或多种具有TNF拮抗活性的GEP肽和/或atsttrin以及一种或多种炎症介质、免疫调节(immunododulatory)剂、或抗癌剂的组合。
在另一个实施方案中,本发明涉及特定治疗方法,其基于GEP、GEP肽和/或atsttrin或者其活性片段的TNF/TNFR拮抗活性,或者基于确定为具有相同活性的物质或其他药物。因此,本发明提供预防和/或治疗以下疾病的方法:由TNF/TNFR活性介导的疾病和/或由TNF家族配体/受体活性促进或诱导的疾病和/或由炎症表征的疾病。本发明提供治疗、减轻或预防TNF介导的疾病和炎性病症或免疫病症的方法,所述疾病或病症包括类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、牛皮癣、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、炎性肺病、慢性阻塞性肺病。
在一个方面,本发明提供用于治疗、减轻或预防由GEP、TNF、GEP/TNFR和/或TNF/TNFR介导的肿瘤或癌症的方法。因此,预期以下肿瘤、癌性病症或癌前病症可能对本发明的TNF/GEP拮抗剂肽敏感:其中肿瘤或者癌细胞/癌前细胞的生长和/或增殖依赖于或由GEP、TNF、GEP/TNFR和/或TNF/TNFR活性或信号转导促进。本发明还预期GEP肽(特别包括atsttrin)抑制或阻断GEP介导的癌症或细胞增殖的用途和应用。
更具体而言,治疗方法提供用于治疗、预防或减轻由TNF/TNFR活性介导的疾病和/或由TNF家族配体/受体活性促进或诱导的疾病和/或由炎症表征的疾病的方法,所述方法是通过给予包含有效量的基于GEP、GEP肽和/或atsttrin或者其亚基的TNF拮抗剂的药物组合物,或者例如本发明另一个方面制备和使用的通过药物筛查测定开发的其他等效药物。在一个具体方面,可给予GEP、GEP肽和/或atsttrin来治疗、减轻或预防TNF/TNFR介导的疾病或病症或者炎性疾病或病症。
在另一个方面,GEP、GEP肽和/或atsttrin或其亚基可用于调节、预防、治疗或减轻免疫损伤的方法,免疫损伤包括变态反应、自身免疫疾病和其他这样的免疫病症,尤其是其中涉及或牵连TNF/TNFR的免疫损伤。因此,在自身免疫、变态反应或其他这样的免疫病症中的免疫和/或炎性反应可由GEP、GEP肽和/或atsttrin或其亚基调节。在一个这样的方面,自身免疫疾病(例如狼疮和多发性硬化)可由GEP、GEP肽和/或atsttrin或其亚基调节、减轻或治疗。
特别地,本发明的GEP、GEP肽、atsttrin肽(包括如本文所述的和本文图23和24提供的),它们的抗体、激动剂、模拟物或其活性片段,在以下情况下可制备成用于给药的药物制剂:其中抗-TNF或TNF/TNFR家族拮抗剂活性和/或治疗是适当的,例如为了治疗或减轻TNF或TNF/TNFR介导的病症或炎症。GEP、GEP肽和atstrrin肽包括在SEQ ID NO:1和8中所示的例示性GEP和在SEQ ID NO:2和3-7中所示的GEP肽或atsttrin肽,以及其变体或亚基。本文GEP肽和/或atsttrin的特异性使其可更好地处理目前抗-TNF和/或抗炎治疗的后效,并且由此使其可作为通用的抗-TNF和/或抗-TNF家族剂广泛应用。
本发明包括用于筛查潜在药物或化合物的测定系统,所述药物或化合物通过模拟GEP肽的活性而有效调节靶哺乳动物细胞的TNF/TNFR活性。该方面包括用于筛查以与GEP和atstrrin肽相似的方式有效调节TNF/TNFR活性的另外的活性GEP片段、颗粒体蛋白/接头单位组合、衍生物、变体和氨基酸修饰。在一个实例中,将测试药物或化合物给予含有TNFα以激活TNF/TNFR活性的细胞样品,以通过与对照比较来确定测试药物或化合物对TNFα活性的影响,包括其中对照是GEP、活性GEP肽、atsttrin的情况。
在测定中,可制备对照量的GEP、GEP肽、atsttrin、TNFα、TNFR或其抗体等,并用酶、特异性结合伙伴和/或放射性元件标记,并可接着引入到细胞样品中。在标记的材料或其结合伙伴)具有与样品内的位点反应的机会后,可通过已知的技术检测所得质量,这可随连接的标记性质而不同。在使用放射性标记例如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、1251、131I和186Re的情况中,可利用已知当前可用的计算方法。在标记是酶的情况中,可通过任何本领域已知的当前使用的比色技术、分光光度技术、荧光分光光度技术、电流分析技术或气体定量分析技术完成检测。
回顾参照以下阐述性附图进行的下文描述,其他目的和优点对本领域技术人员将变得显而易见。
附图简述
图1描述GEP生长因子的结构。对于单位共有序列,C代表半胱氨酸、D代表天冬氨酸、P代表脯氨酸、T代表苏氨酸、G代表甘氨酸、H代表组氨酸;圆点代表任何氨基酸。
图2(A)酵母中GEP与TNFR的结合。将所示每对质粒共转化到酵母株MAV203中。在SD-leu7trp″/his-/ura′/3AT+平板上筛选酵母转化体,并测试β-半乳糖苷酶活性。使用已知相互作用的c-Jun和c-Fos作为阳性对照,而使用不存在相互作用的Rb和核纤层蛋白作为阴性对照。(B)软骨细胞中GEP与TNFR2缔合。将制备自人软骨细胞的细胞提取物与对照IgG、抗-TNFR2抗体一起孵育,然后与蛋白A琼脂糖一起孵育。通过用抗-GEP抗体的免疫印迹来检测免疫沉淀的蛋白复合物和细胞提取物(泳道1,阳性对照)。
图3描述TNFR1细胞外结构域(TNFR1ECD)和TNFR2细胞外结构域(TNFR2ECD)与包被在微量滴定板上的重组GEP的固相结合。
图4(A)用于绘制其片段与GEP结合的TNFR2构建体的示意图。(B)β-半乳糖苷酶测定。
图5描述MTT测定。在不存在(CTR)或存在50ng/ml GEP(GEP)或者GEP加1ug/ml抗-TNFR1(GEP+TNFR1 ab)、抗TNFR2(GEP+TNFR2 ab)或1ug/ml的抗-IGFIR(GEP+TGF1R ab,用作对照)的条件下培养人软骨细胞,并使用MTT测定分析细胞增殖。
图6.GEP在人C28I2软骨细胞中激活Akt和Erk1/2途径。注意存在胶片的长时间(5分钟,左图)和短时间(30秒,右图)的曝光。
图7描述对于在50ng/ml GEP存在下培养的原代野生型(B6)、TNFR1-/-和TNFR2-/-MLE细胞,使用实时PCR得到的基因Gadd45b、JunB、KLF2、Smad7、Sox4和Tcf8不同时间点的表达概况分析。
图8描述用于举例说明包括信号转导和靶基因表达在内的细胞内事件的模型。
图9(左)用于绘制其片段与TNFR结合的GEP构建体的示意图。(右)β-半乳糖苷酶测定。
图10(左)GEP构建体的示意图。(右)β-半乳糖苷酶测定。
图11(左)GEP构建体的示意图。(右)β-半乳糖苷酶测定。
图12(左)用于绘制其片段与TNFR结合的GEP构建体的示意图。(右)β-半乳糖苷酶测定。
图13(左)用于绘制其片段与TNFR结合的GEP构建体的示意图。(右)β-半乳糖苷酶测定。
图14(左)用于绘制其片段与TNFR结合的GEP构建体的示意图。(右)β-半乳糖苷酶测定。
图15(左)用于绘制其片段与TNFR结合的GEP构建体的示意图。(右)β-半乳糖苷酶测定。
图16(A)Atsttrin以剂量依赖方式抑制由TNF引发的呼吸爆发;(B)Atsttrin、类克和恩利对TNF引发的呼吸爆发的作用。结果为一式三份培养物中由1.5×104细胞/孔产生的nmol H2O2的平均值。
图17描述TUNEL染色测定。使大鼠软骨肉瘤(RCS)细胞和人C28I2软骨细胞血清饥饿24小时,以除去外源生长因子和细胞因子的影响。之后,用0.02%BSA(CTR)、50ng/ml的GEP(GEP)、10ng/ml的TNF-α或GEP加TNF-α刺激细胞36小时。通过使用TUNEL测定试剂盒测量细胞凋亡。
图18显示GEP抑制TNFα诱导的金属蛋白酶。在不存在或存在任一种补充所示不同量的GEP的5ng/ml的TNFα的条件下,在无血清培养基中培养人软骨外植块1天并进行实时PCR。单位是任意的并且在每组中最左边的条表示相对水平为1。
图19用于解释Atsttrin、恩利和类克的抗炎机制的建议模型。Atsttrin通过直接与TNF受体结合阻断TNF/TNFR信号转导,而恩利和类克通过靶向TNF配体干扰信号转导。
图20显示Atsttrin中和GEP刺激的癌细胞的细胞生长(MTT测定)。在不存在(CTR)或存在GEP(200ng/l)且有或没有所示不同量的Atsttrin的条件下,培养RCS软骨肉瘤(左图)和Saos-2骨肉瘤(右图),并使用MTT测定分析细胞增殖。
图21描述来自气囊急性炎症模型的小鼠的无细胞溢泌物中IL-6和IL-13水平。描述对照(CTR)和给予类克(10μg/g)、GEP(10μg/g)和Atsttrin(10μg/g)的动物的IL-6和IL-13水平。
图22描述通过TRAP染色评价的RANKL诱导的破骨细胞发生。在RANKL单独或者与不同量的GEP或atsttrin存在下孵育Raw264.7巨噬细胞4天。
图23提供593个氨基酸的人GEP(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。
图24描述atsttrin肽的序列(SEQ ID NO:2),和多种其他测试肽的序列(分别是SEQ ID NO:3-7)。
图25A和25B描述小鼠GEP的(A)结构和(B)氨基酸序列(SEQID NO:8)。在(B)中,颗粒体蛋白单位GrnA、GrnC、GrnD和GrnE有下划线并在每个单位中指出。
图26显示GEP除TNFR外还与RANK和FAS缔合,而Atsttrin特异结合TNFR(酵母双杂交测定)。将所示各对质粒共转化到酵母株MAV203中。在SD-leu7trp′/his-/ura-/3AT+平板上筛选酵母转化体,并测试β-半乳糖苷酶活性。使用无相互作用的Rb和核纤层蛋白作为阴性对照(Neg.CTR)。
图27提供GEP(PGRN)和TNFα与TNFR1(R1)和TNFR2(R2)的结合的FastStepTM动力学测定。
图28A、28B和28C提供(A)重组Atsttrin的表征。与谷胱甘肽琼脂糖树脂缀合的GST-Atsttrin和通过Xa因子释放的Atsttrin通过SDS-PAGE分离,并用考马斯亮蓝R-250对蛋白质染色。(B)和(C)提供Atsttrin和TNFα与TNFR1(R1)和TNFR2(R2)结合的FastStepTM动力学测定。
图29描述使用GEP、Atsttrin和GEP+Atsttrin针对p-AKT、p-ERK和微管蛋白对照进行的PathScan多重蛋白质印迹结果。GEP激活Akt和Erk1/2途径二者,但Atsttrin不是。在联合研究中,Atsttrin阻断GEP介导的致癌p-AKT和p-ERK途径的激活。
图30A和30B描述用PBS(n=10)、Atsttrin(n=10)或恩利(n=10)治疗的CIA小鼠中关节炎的严重性(A)(通过临床评分)和发病率(B)。
图31提供用PBS、Atsttrin或恩利治疗的正常小鼠和CIA小鼠的前爪(顶部)和后爪(底部)的照片。
图32A和32B描述(A)用所示H&E或Safranin-0染色的PBS治疗动物和Atsttrin治疗动物的各踝关节的切片。在H&E图中,箭头分别指示组织破坏和细胞浸润。在Sarfanin-0图中,箭头指示基质染色失败。(B)显示PBS治疗动物和Atsttrin治疗动物的踝关节的MicroCT图。
图33提供在PBS治疗动物和Atsttrin治疗动物中的TRAP染色图。在PBS治疗动物中TRAP+破骨细胞示为红染色,但在Atsttrin治疗动物中几乎不能检测到。为了视觉鲜明示出不同的放大倍数。
图34描述与对照PBS(阴性对照)和恩利(阳性对照)相比,Atsttrin对促炎细胞因子IL-1β和IL-6以及抗炎细胞因子IL-10和IL-13的影响。*、**和***分别表示p<0.05、p<0.01和p<0.001。
图35提供在胶原免疫以诱导关节炎后25天开始,在用PBS、恩利或Atsttrin治疗的CIA动物中的临床评分数据。
图36描述GEP和Atsttrin对TNF诱导的亚硝酸盐产生的影响。向RAW264.7细胞中加入TNFα并伴随加入所示0.3nM、1.5nM或7.5nM的GEP、Atstrrin或恩利,并测量μM亚硝酸盐。
图37在TNF-α、TNF-α和GEP或者TNF-α和Atsttrin存在下,通过RAW264.7细胞的免疫荧光评价TNF诱导的NF-κB的核积累。与核DAPI染色相比,对于NF-κB p65是对细胞染色,合并(merge)两种染色。在GEP或Atsttrin存在下,NF-κB染色保持胞质的。
图38显示在仅TNF-α或者联合增加浓度的GEP或Atsttrin存在下TNF激活的NFKB报道基因的倍数诱导。GEP和Atsttrin抑制TNF-α介导的NFKB报道基因的激活。
详述
根据本发明,可使用本领域技术中的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术在文献中有充分描述。参见例如Sambrook等″Molecular Cloning:A Laboratory Manual″(1989);″CurrentProtocols in Molecular Biology″第I-III卷[Ausubel,R.M.,主编(1994)];″Cell Biology:A Laboratory Handbook″第I-III卷[J.E.Celis,主编(1994))];″Current Protocols in Immunology″第I-III卷[Coligan,J.E.,主编(1994)];″Oligonucleotide Synthesis″(MJ.Gait主编1984);″NucleicAcid Hybridization″[B.D.Hames和S.J.Higgins主编(1985)];″Transcription And Translation″[B.D.Hames和S.J.Higgins,主编(1984)];″Animal Cell Culture″[R.I.Freshney,主编(1986)];″Immobilized Cells And Enzymes″[IRL Press,(1986)];B.Perbal,″APractical Guide To Molecular Cloning″(1984)。
因此,如果本文出现,下列术语应具有下文所示定义。
术语“Atsttrin”、“通过靶向TNF受体的TNF/TNFR信号转导的拮抗剂”、“atsttrin肽”、“TNF拮抗剂肽”和未具体列出的任何变体在本文中可互换使用,并如贯穿本申请和权利要求所用,指包括单个或多个蛋白的肽,特别是源自或是GEP的片段的那些,并延伸至这些蛋白质:其具有本文所述且在图24中示出且还在图15中图示的氨基酸序列数据,和具有本文描述和示出并在权利要求书中提供的活性和能力特征。本文中包括和提供活性GEP肽,其具有作为TNF/TNFR信号转导拮抗剂的活性并能够结合一种或多种TNF受体,例如TNFα。人GEP的全长序列在图23中提供。小鼠GEP的全长序列在图25中提供。因此,本文涵盖源自GEP序列或包含GEP序列并具有TNF和/或TNF家族拮抗剂活性的TNF拮抗剂肽。这些atsttrin肽包括和涵盖肽的片段、变体和衍生物。因此,同样预期显示基本上等价活性的蛋白及其修饰物。这些修饰可为有意的,例如,例如通过定点诱变获得的修饰,或可为偶然的,例如在是复合物或其指定亚基的生产者的宿主中通过突变获得的修饰。另外预期与人atsttrin及活性GEP肽序列相应的小鼠或其他物种或直向同源物GEP序列。同样,术语“Atsttrin”、“通过靶向TNF受体的TNF/TNFR信号转导的拮抗剂”、“atsttrin肽”、“TNF拮抗剂肽”旨在在其范围内包括本文具体叙述的蛋白以及所有基本上同源的类似物和等位变体。
本文所述的氨基酸残基优选为“L”异构形式。然而,“D”异构形式的残基可置换为任何L-氨基酸残基,只要所需的结合免疫球蛋白的功能性质由多肽保留。NH2指位于多肽氨基端的游离氨基。COOH指位于多肽羧基端的游离羧基。与J.Biol.Chem.,243:3552-59(1969)标准多肽命名法一致,氨基酸残基的缩写示于下列对应表中:
对应表
应当注意,本文通过分子式表示所有氨基酸残基序列,该分子式的左右方位是氨基端到羧基端的常规方向。此外,应当注意,在氨基酸残基序列的开始或末端的短线表示与一个或多个氨基酸残基的另外序列连接的肽键。示出上表将可能在本文中交替出现的3-字母符号和l-字母符号相关联。
“复制子”是任何遗传元件(例如质粒、染色体、病毒),其在体内作为DNA复制的自主单位起作用,即能够在它自己的控制下复制。
“载体”是复制子,例如质粒、噬菌体或黏粒,其可连接有另外的DNA区段以引起连接区段的复制。
“DNA分子”指其单链形式或双链螺旋形式的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)聚合形式。该术语只指分子的一级和二级结构,并不限制它到任何特定的三级形式。因此,该术语包括尤其在线性DNA分子(例如限制片段)、病毒、质粒和染色体中存在的双链DNA。在论述特定双链DNA分子的结构时,序列在本文中可根据通常惯例描述,通常惯例是仅沿DNA的非转录链(即具有与mRNA同源的序列的链)给出5’-3’方向的序列。
“复制起点”指参与DNA合成的那些DNA序列。
DNA“编码序列”是双链DNA序列,当置于合适调节序列的控制下时,其被体内转录和翻译成多肽。编码序列的边界由位于5’(氨基)端的起始密码子和位于3’(羧基)端的翻译终止密码子决定。编码序列可包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列以及甚至合成的DNA序列。多腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3’。
转录和翻译控制序列是DNA调节序列,例如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、终止子等,其在宿主细胞中提供编码序列的表达。
“启动子序列”是能够在细胞中结合RNA聚合酶并起始下游(3’方向)编码序列的转录的DNA调节区。为了阐述本发明的目的,启动子序列在其3’端通过转录起始位点被结合,并向上游(5’方向)延伸至包括以高于本底的可检测水平起始转录所必需的最小数量的碱基或元件。启动子序列内存在转录起始位点(合宜地通过与核酸酶S1作图定义)和负责结合RNA聚合酶的蛋白结合结构域(共有序列)。真核启动子将通常但不是总是包含“TATA”框和“CAT”框。原核启动子除-10和-35共有序列外还包含SD序列。
“表达控制序列”是控制和调节另外的DNA序列的转录和翻译的DNA序列。当RNA聚合酶将编码序列转录为mRNA,mRNA然后被翻译成由编码序列编码的蛋白时,编码序列在细胞中是在转录和翻译控制序列的“控制下”。
在编码序列前可包含“信号序列”。该序列编码多肽N末端的信号肽,其与宿主细胞交流以将多肽导向细胞表面或将多肽分泌到培养基中,并且该信号肽在蛋白离开细胞前由宿主细胞切下。可发现信号序列与许多天然的真核生物和原核生物蛋白质相连。
本文用于指本发明探针的术语“寡核苷酸”定义为包含两个以上(优选多于三个)核糖核苷酸的分子。它的确切大小将取决于许多因素,这些因素继而取决于寡核苷酸的最终功能和用途。
本文所用的术语“引物”指寡核苷酸,不管是在纯化的限制酶切消化中天然存在还是以合成方法产生,当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时,其能够作为合成起始的点起作用,所述条件即在核苷酸和诱导剂(例如DNA聚合酶)存在下并在合适的温度和pH下。引物可为单链的或双链的并且必须足够长以在诱导剂存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素,包括温度、引物的来源和方法的使用。例如,对于诊断应用,取决于靶序列的复杂性,寡核苷酸引物通常包含15-25个或更多的核苷酸,但是它可包含更少的核苷酸。
本文选择与特定靶DNA序列的不同链“基本上”互补的引物。这意味着引物必须足够互补以与它们各自的链杂交。因此,引物序列无须反映模板的确切序列。例如,可将非互补核苷酸片段与引物的5’端连接,其中剩余的引物序列与链互补。备选地,非互补碱基或较长的序列可散在于引物中,条件是引物序列与链序列具有足够互补性以与之杂交并藉此形成用于合成延伸产物的模板。
如本文所用,术语“限制性内切核酸酶”和“限制酶”指细菌酶,每个酶在或靠近特异性核苷酸序列处切割双链DNA。
当外源或异源DNA已被引入到细胞内部时,细胞已被外源或异源DNA“转化”。转化DNA可以或可以不整合(共价连接)到组成细胞基因组的染色体DNA中。例如在原核生物、酵母和哺乳动物细胞中,转化DNA可维持在游离元件上,例如质粒上。关于真核生物细胞,稳定转化细胞是这样的细胞:其中转化DNA已经整合到染色体中,使得其通过染色体复制为子细胞所继承。该稳定性通过真核生物细胞建立细胞系或克隆的能力证明,所述细胞系或克隆包含含转化DNA的子细胞群。“克隆”是通过有丝分裂来源于单个细胞或共同祖先的细胞群。“细胞系”是能够在体外稳定生长许多代的原代细胞的克隆。
DNA构建体的“异源”区是较大DNA分子内不与该较大分子相联地天然存在的可鉴定DNA区段。因此,当异源区编码哺乳动物基因时,该基因的侧翼通常为不在源生物体的基因组中位于哺乳动物基因组DNA侧翼的DNA。异源编码序列的另一个实例是构建体,其中编码序列自身非天然存在(例如,其中基因组编码序列包含内含子的cDNA,或具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。等位变异或天然存在的突变事件不产生本文定义的异源DNA区。
当在规定长度的DNA序列上至少约75%(优选至少约80%和最优选至少约90或95%)的核苷酸匹配时,两条DNA序列是“基本上同源的”。基本上同源的序列可通过使用序列数据库中可得的标准软件比较序列鉴定,或通过在例如为特定系统所限定的严格条件下进行的DNA杂交实验中比较序列鉴定。限定合适的杂交条件在本领域技术内。参见例如Maniatis等,同上;DNA Cloning,第I和II卷,同上;Nucleic Acid Hybridization,同上。应当认识到,编码如SEQ IDNO:的相同氨基酸序列但与SEQ ID NO:简并的DNA序列亦在本发明的范围内。“与...简并”意味着不同的3-字母密码子用于指定特定氨基酸。本领域公知特定密码子可互换使用以编码每个特定氨基酸。例如且不受限制,亮氨酸(Leu或L)可通过UUA或UUG或CUU或CUC或CUA或CUG中的任一个编码,而丝氨酸(Ser或S)可通过UCU或UCC或UCA或UCG或AGU或AGC中的任一个编码。应该理解这些例示性特定密码子是用于RNA序列。相应的DNA密码子具有代替U的T。
当表达控制序列控制和调节某DNA序列的转录和翻译时,该DNA序列与表达控制序列“有效连接”。术语“有效连接”包括:在待表达DNA序列前具有合适的起始信号(例如ATG),和维持正确阅读框以使在表达控制序列控制下的DNA序列能够表达和由DNA序列编码的所需产物能够产生。如果需要插入到重组DNA分子中的基因不包含合适的起始信号,那么可将这种起始信号插入到该基因的前面。
术语“标准杂交条件”指用于杂交和洗涤两者的与5x SSC和65℃基本上等价的盐和温度条件。然而,本领域的技术人员将理解,这种“标准杂交条件”取决于特定的条件,包括缓冲液中钠和镁的浓度、核苷酸序列长度和浓度、错配百分比、甲酰胺百分比等。在“标准杂交条件”的确定中同样重要的是杂交的两条序列是否为RNA-RNA、DNA-DNA或RNA-DNA。本领域的技术人员根据公知的公式容易确定这种标准杂交条件,其中视需要杂交通常10-20NC低于预期的或测定的Tn,伴随较高严格性的洗涤。
如本文所用,“pg”指皮克,“ng”指纳克,“ug”或“μg”指微克,“mg”指毫克,“ul”或“μl”指微升,“ml”指毫升,“l”指升。
可在GEP、GEP肽和/或atsttrin中进行突变,使得氨基酸被置换或修饰,或者使得特定密码子变成编码不同氨基酸的密码子。这种突变通常通过作出可能的最少的核苷酸改变进行。可以以下列方式作出该种置换突变以改变所得蛋白的氨基酸:非保守方式(即通过将属于一组具有特定大小或特性的氨基酸的氨基酸的密码子改变为属于另一组的氨基酸)或保守方式(即通过将属于一组具有特定大小或特性的氨基酸的氨基酸的密码子改变为属于相同组的氨基酸)。这种保守改变通常导致所得蛋白在结构和功能上的较少改变。非保守改变更可能改变所得蛋白的结构、活性或功能。应当考虑到,本发明包括含有不显著改变所得蛋白或肽的活性或结合特性的保守改变的序列。应当考虑到,本发明包括含有不显著改变所得蛋白或肽的活性或结合特性的保守和/或非保守改变的序列。
以下是不同氨基酸分组的一个实例。
具有非极性R基团的氨基酸:丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸
具有不带电极性R基团的氨基酸:甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺
具有带电极性R基团的氨基酸(在Ph 6.0时带负电):天冬氨酸、谷氨酸
碱性氨基酸(在pH 6.0时带正电):赖氨酸、精氨酸、组氨酸(在pH 6.0时)
另一组可为那些具有苯基的氨基酸:苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸
另一种分组可根据分子量(即R基的大小)
特别优选的置换为:
-Lys置换Arg,和反之亦然,使得可维持正电荷;
-Glu置换Asp,和反之亦然,使得可维持负电荷;
-Ser置换Thr,使得可维持游离-OH;和
-Gln置换Asn,使得可维持游离NH2。
亦可引入氨基酸置换以置换为有特定优选特性的氨基酸。例如,可在潜在用于与另一个Cys形成二硫桥的位点引入Cys。可引入His作为特别“催化”的位点(即His可作为酸或碱起作用并且是在生化催化中最常见的氨基酸)。可引入Pro,因为它有在蛋白结构中诱导转角的特别平的结构。
当至少约70%的氨基酸残基(优选至少约80%,并最优选至少约90或95%)是一致的或代表保守置换时,两条氨基酸序列是“基本上同源的”。
“抗体”是结合特异性表位的任何免疫球蛋白,包括抗体及其片段。该术语涵盖多克隆、单克隆和嵌合抗体,最后提及的在美国专利号4,816,397和4,816,567中另外详细描述。
“抗体结合位点”是由特异结合抗原的重链和轻链可变区和超变区组成的抗体分子结构部分。
本文使用的多种语法形式的短语“抗体分子”预期完整免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。
例示性抗体分子是完整免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和那些包含抗原互补位的免疫球蛋白分子的部分,包括本领域公知的那些部分如Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v),所述部分优选在本文所述的治疗方法中使用。
抗体分子的Fab和F(ab′)2部分通过公知的方法分别通过木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对基本上完整的抗体分子的蛋白水解作用制备。参见例如Theofilopolous等的美国专利号4,342,566。Fab′抗体分子部分亦是公知的,并从F(ab′)2开始,经过如用巯基乙醇将连接两条重链部分的二硫键还原,并接着用例如碘乙酰胺等试剂烷基化所得蛋白硫醇来制备。本文优选包含完整抗体分子的抗体。
多种语法形式的短语“单克隆抗体”指仅具有一种能够与特定抗原免疫反应的抗体结合位点的抗体。因此,单克隆抗体通常对其与之免疫反应的任何抗原展示单一的结合亲和力。单克隆抗体可因此包含具有多个抗体结合位点的抗体分子,每个抗体结合位点对于不同抗原免疫特异;例如双特异(嵌合)单克隆抗体。
短语“药学上可接受”指当给予于人时,分子实体和组合物是生理上可耐受的,且通常不产生变态反应或类似不利反应,例如胃不适、眩晕等。
术语“治疗有效量”意指将引起受试者的生物学反应或医学反应的药物、化合物、肽或药剂的量,所述反应是医学博士或其他临床医生所寻求的。本文使用的“治疗有效量”包括这样的量:其足以预防和优选减少至少约30%、更优选至少50%、最优选至少90%的靶细胞或细胞团的S期活性的临床显著改变或其他病理学特征,例如可伴随其存在和活性的血压升高、发烧或白细胞计数。
术语“预防”指在受试者中获得或发展疾病或病症的风险降低(即引起疾病的至少一种临床病症不发展),受试者可能暴露于引起疾病的物质或在发病前易患有疾病。
术语“预防(prophylaxis)”涉及并涵盖术语“预防(prevention)”,并指其目的是预防而非治疗或治愈疾病的方法或程序。预防方法的非限制性实例可包括给予疫苗;将低分子量肝素给予由于例如制动而处在血栓形成风险中的住院患者;和在去疟疾是地方病或者接触疟疾的风险高的地区之前给予抗疟疾药,例如氯喹。
术语“溶剂化物”意指本发明中有用的化合物与一个或多个溶剂分子的物理缔合。该物理缔合包括氢键键合。在特定情况中,溶剂化物能够分离,例如在一个或多个溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时。“溶剂化物”涵盖溶液相和可分离的溶剂化物二者。代表性的溶剂化物包括水合物、乙醇合物和甲醇合物。
术语“受试者”包括人和其他哺乳动物。
在一个实施方案中,任何疾病或病症的术语“治疗”指改善疾病或病症(即阻止疾病或降低其至少一种临床症状的表现、程度或严重性)。在另一实施方案中,“治疗”指改善至少一种物理参数,其可能不被受试者辨别出。在又一个实施方案中,“治疗”指调节疾病或病症,调节为物理上的(例如,稳定可辨别症状)、生理上的(例如,稳定物理参数)或两者。在另一个实施方案中,“治疗”指减缓疾病的进展。
术语“由炎症表征的疾病”、“炎性疾病”指涉及、至少部分起因于或包括炎症的疾病。术语包括但不限于选自以下的例示性疾病:类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、青少年特发性关节炎、牛皮癣、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、炎性肺病、慢性阻塞性肺病。
术语“炎症介质”指增强、起始或促进炎性反应或炎性应答的介质,并可选自下述:细胞因子(例如TNFα、IL3、IL4、IL5、IL13、GM-CSF)、趋化因子(例如MDC、CCL19、CCL20、CCL21、MIP-Iα)、前列腺素(例如PGD2)、白三烯(例如LTB4、LTC4、LTD4)、金属蛋白酶、糜蛋白酶、类胰蛋白酶、生长因子(例如VEGF)。
尽管关节炎疾病的流行,但是它们精确的病因学、发病和进展仍超出我们的理解。积累中的证据证实炎性细胞因子和生长因子在关节炎的病理过程中的重要性。因此,调节软骨细胞和关节炎的生长因子以及拮抗细胞因子作用的抑制剂的分离,从病理生理学和治疗的角度看均非常重要。以前已认识到颗粒体蛋白/上皮肽前体(GEP)为在软骨形成中起重要作用的新的软骨形成生长因子,包括如在WO2008/094687 A2中以及Liu及同事(Xu,K等(2007)J Biol Chem282(15):1 1347-1 1355)所述。
本发明证实,生长因子GEP直接与TNF受体缔合,并作为天然存在的TNFα拮抗剂起作用,TNFα为关节炎中重要的炎性细胞因子。因此,本发明的目的是延伸对生长因子和细胞因子控制软骨发育和关节炎的分子机制的理解,和提供作为新的抗-TNF/TNFR调节剂的GEP,特别是它的衍生肽和活性肽,尤其atsttrin和/或其衍生物或变体。本文证实atsttrin结合和拮抗TNF,并改变TNF/TNFR信号转导。本文证实GEP结合TNF家族成员RNAK。因此,GEP、GEP肽和/或atsttrin可适用和可用于治疗干预多种TNF相关疾病,包括炎性病症(例如关节炎)、骨疾病和癌症病症(例如骨关节炎、骨质疏松症和骨肉瘤)。
本领域的技术人员可利用TNF/TNFR家族介导的疾病或病症的体内动物模型来进一步或另外评价、评估、筛查和/或证实本发明的GEP、GEP肽和/或atsttrin,或者本发明中鉴定的或本发明的物质或化合物,包括在体内进一步评估TNF/TNFR调节。可容易获得动物模型,以证实重组GEP和GEP衍生肽、atsttrin在介导、减轻或控制以下疾病的发展和进展中的可应用性:TNF/TNFR介导的疾病或病症、炎性病症、免疫疾病或病症(包括变态反应,一种自身免疫疾病)、骨疾病或病症或者其他可能靶向病症。动物模型或研究包括那些在本文中和实施例中描述和详述的。TNFα转基因小鼠发展关节炎,并为评价用于类风湿性关节炎的新治疗策略的功效提供有用工具。动物模型包括但不限于溃疡性结肠炎模型、多发性硬化模型(包括EAE,溶血卵磷脂诱导的)、关节炎模型、变应性哮喘模型、气道炎症模型、牛皮癣模型和急性炎症模型。多发性硬化的EAE动物模型提供急性或慢性复发、获得的、炎性疾病和脱髓鞘自身免疫疾病。可利用变态反应模型作为免疫学损伤和病症的模型。骨关节炎模型包括例如在切开膝前十字韧带后在兔子中诱导的实验性骨关节炎和在撕裂内侧副韧带后在大鼠中诱导的实验性骨关节炎。合适的骨疾病、骨损伤和/或骨质疏松症模型亦是本领域技术人员已知和可得的。
本发明包括GEP、GEP肽、atsttrin和/或其衍生物用于预防、治疗或减轻类风湿性关节炎和骨关节炎的用途和应用。本发明包括GEP、GEP肽、atsttrin和/或其衍生物用于预防、治疗或减轻TNF相关疾病(包括炎性病症)、免疫病症(包括自身免疫疾病)、骨疾病和癌症的用途和应用。TNF相关疾病包括类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、牛皮癣、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、炎性肺病、慢性阻塞性肺病、多发性硬化、骨质疏松症、骨肉瘤。本发明包括GEP、GEP肽、atsttrin和/或其衍生物用于通过精确地递送所需的抗-TNF/TNFR效果来预防、治疗或减轻和/或特异治疗干预炎性病症的用途和应用。本发明包括GEP、GEP肽、atsttrin和/或其衍生物用于促进或介导组织修复的用途和应用。本发明包括GEP、GEP肽、atsttrin和/或其衍生物用于预防、治疗或减轻免疫损伤和病症的用途和应用,免疫损伤和病症包括变态反应和自身免疫疾病,例如狼疮和多发性硬化。本发明包括GEP、GEP肽、atsttrin和/或其衍生物用于预防、治疗或减轻癌症和肿瘤或癌细胞生长的用途和应用,包括用于GEP和/或TNF/TNFR介导的癌症或其他这样的过增殖病症。
诊断和治疗两者由TNF拮抗剂肽(包括本文所述的GEP、GEP肽和/或atsrrin)的存在所引起的可能性,源自肽参与与TNF的直接和间接的蛋白-蛋白相互作用并起阻断、抑制、拮抗、干扰TNF/TNFR活性和/或信号转导作用的事实。因此,本发明预期药物干预TNF/TNFR和/或TNF家族/TNF家族R牵连其中的反应级联,以调节活性、信号和/或由此起始、促进或介导的病症,包括但不限于炎性疾病和病症。
本文所述的GEP、GEP肽和/或atsttrin或其他配体或物质表现出与此模拟或相关的TNF拮抗作用,可与合适的载体并以用于通过多种方法给予正经历与TNF/TNFR信号转导相关的有害医学病症(包括炎性病症或疾病)的患者的有效强度制备到药物组合物中。可利用多种给药技术,尤其胃肠外技术,例如皮下、静脉内和腹膜内注射、导管插入术等。本文所述的GEP、GEP肽和/或atsttrin或者它们的亚基的平均量可不同,并特别地应该基于有资格的医师或兽医的推荐和处方。
同样,调节本文所述的GEP、GEP肽和/或atsttrin和/或它们的亚基的制备或活性的抗体(包括多克隆和单克隆抗体)和药物可具有特定诊断应用,并可例如用于检测和/或测量病症的目的,病症例如TNF介导的疾病、炎性病症、感染、癌症等。例如,GEP肽和/或atsttrin可用于通过已知的技术在多种细胞培养基中产生它们的多克隆和单克隆抗体,所述技术例如杂交瘤技术,利用例如小鼠脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞。同样地,可发现或合成模拟或拮抗本发明的本文所述的GEP、GEP肽和/或atsttrin活性的小分子,并可在诊断和/或治疗方案中使用。
用于通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是公知的。无限繁殖的抗体产生细胞系亦可通过除了融合以外的技术产生,例如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞或用Epstein-Barr病毒转染。参见例如,M.Schreier等,″Hybridoma Techniques″(1980);Hammerling等,″Monoclonal Antibodies And T-cell Hybridomas″(1981);Kennett等,″Monoclonal Antibodies″(1980);亦参见美国专利号4,341,761、4,399,121、4,427,783、4,444,887、4,451,570、4,466,917、4,472,500、4,491,632、4,493,890。
优选地,在本发明的诊断方法中使用的抗-GEP、GEP肽和/或atsttrin抗体是亲和纯化的多克隆抗体。更优选地,抗体是单克隆抗体(mAb)。另外,本文使用的抗-GEP、GEP肽和/或atsttrin抗体分子优选为完整抗体分子的Fab、Fab1、F(ab′)2或F(v)部分的形式。
本发明另外预期在实施本发明的治疗方法中有用的治疗组合物。治疗组合物包括生物学上相容的组合物。主题治疗组合物包含,药学上可接受的赋形剂(载体)和作为活性成分的本文所述一种或多种GEP、GEP肽和/或atsttrin、其多肽类似物或其片段的混合物。在一个优选的实施方案中,组合物包含本发明GEP、GEP肽和/或atsttrin,并可包括下列组合物:其包含一种或多种GEP颗粒体蛋白和一种或多种接头单位,或任意一种或多种GEP肽或atsttrin,包括如在本文附图(包括图23和24)中所示的以及如在SEQ ID NO:1-8中所提供的。
本发明的肽和组合物包含这些GEP肽(包括atsttrin),其基于人GEP序列,包括如在图23和24中所示以及具有一个或多个或一些或许多置换的其变体,其中当与atsttrin GEP肽比较时,变体的结合和活性特征保留。在已知如此之多来自各种动物或哺乳动物(包括人)的GEP肽中,这些序列提供潜在用于本发明的组合物和方法的备选氨基酸序列和变体,包括通过置换一些atsttrin人肽氨基酸。小鼠GEP序列本文在图25提供。多种动物的GEP序列是公众已知的和公开的,并在本发明的方法和组合物中用于评估和评价是可得的,且它们的相应的和相关的氨基酸适合作为本文GEP肽的变体用于评价和使用。GEP肽是可得的,并通过如下引用结合到本文中:大鼠(Genbank登录号AAA16903.1、CAA44198.1)、小鼠(Genbank登录号P28798.2、BAE35389.1、NP_032201.2)、苏门答腊猩猩(Genbank登录号NP_001126689.1)、食蟹猕猴(Genbank登录号BAEO1796.1)、马(Genbank登录号XP_001489791.1)、牛(Genbank登录号NP_001070482.1)、兔(Genbank登录号XP_002719228.1)、猪(Genbank登录号NP_001038043.1)、黑猩猩(Genbank登录号XP_511549.2)和负鼠(Genbank登录号XPJ)01374870.1)。
肽、类似物或活性片段可配制成作为中和的药学上可接受的盐形式的治疗组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与多肽或抗体分子的游离氨基形成),酸加成盐例如用无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。从游离羧基形成的盐亦可源自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)或有机碱(例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等)。
包含治疗肽、类似物或活性片段的组合物常规静脉内给药,如通过单位剂量的注射。当用于本发明的治疗组合物时,术语“单位剂量”指适合作为用于人的单位剂量的物理离散单位,每单位包含计算用于产生所需治疗效果的预定量活性材料联合所需的稀释剂(即载体或媒介)。
以与给药制剂相容的方式和治疗有效量给予组合物。给予的量取决于待治疗的受试者、受试者的免疫系统利用活性成分的能力和所需的TNF/TNFR活性抑制或中和程度。给予所需的活性成分的精确量取决于执业医生的判断,并且为每个个体所特有。然而,合适的剂量可从约0.1到20,优选约0.5-约10,并更优选1到数毫克活性成分/千克个体体重/天,并取决于给药途径。用于初始给药和加强注射的合适方案亦是可变的,但通常是初始给药后以一个或多个小时的间隔通过后续注射或其他给药重复剂量。备选地,预期足以在血液中维持浓度通常为纳摩尔到10微摩尔的连续静脉内输注。
一种特定的生物学上相容的组合物是水溶液,其使用例如包含盐离子的Tris、磷酸盐或HEPES缓冲液缓冲。通常盐离子的浓度与生理水平类似。生物学上相容的溶液可包含稳定剂和防腐剂。在一个更优选的实施方案中,生物相容的组合物是药学上可接受的组合物。这种组合物可配制用于通过局部途径、口服途径、胃肠外途径、鼻内途径、皮下途径和眼内途径给予。胃肠外给药意指包括静脉内注射、肌内注射、动脉内注射或输注技术。可以剂量单位制剂胃肠外给予组合物,剂量单位制剂包含标准的、公知的非毒性生理上可接受的载体、佐剂和溶媒。
本发明组合物的一个特定实施方案是包含与药学上可接受的载体混合的治疗有效量的前文所述GEP、GEP肽和/或atsttrin的药物组合物。另一个特定的实施方案是用于治疗或预防由TNF/TNFR活性表征的疾病或对所述疾病的易感性的药物组合物,所述疾病包括感染、同种移植物反应、炎症、变应性疾病和自身免疫疾病以及癌症,该药物组合物包含与药学上可接受的载体混合的有效量的GEP、GEP肽和/或atsttrin、它的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或其前药。另一个特定实施方案是用于治疗或预防包含炎症的疾病或对该病症的易感性的药物组合物,包含与药学上可接受的载体混合的有效量的GEP、GEP肽和/或atsttrin、它的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或其前药。
本发明的组合物可包括GEP、GEP肽、atsttrin和/或其衍生物与一种或多种适合于减轻、预防或治疗炎症、免疫病症、过增殖病症和/或癌症的药物的组合。本发明的组合物可包括GEP、GEP肽、atsttrin和/或其衍生物与一种或多种抗炎剂、抗癌剂或免疫调节剂的组合。这些抗癌剂更普遍地可为酪氨酸激酶抑制剂或磷酸化级联抑制剂、翻译后调节剂、细胞生长或分裂抑制剂(例如,抗有丝分裂剂)、抑制剂或信号转导抑制剂。其他治疗或疗法可包括给予合适剂量的止痛药例如非甾体抗炎药(例如阿司匹林、扑热息痛、布洛芬或酮洛芬)或阿片制剂(例如吗啡)或止吐药。另外,组合物可掺入或与免疫调节剂(例如白细胞介素)、肿瘤坏死因子(TNF)或其他生长因子、集落刺激因子、细胞因子或激素一起给予。
用于口服给药的药物组合物可使用本领域公知的药学上可接受的载体配制成适合用于口服给药的剂量。这样的载体使药物组合物能配制成片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊剂、液体制剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂(slurry)、混悬剂等,用于患者摄食。用于口服用途的药物组合物可通过以下步骤制备:混合活性化合物与固体赋形剂,任选研磨所得混合物,和在视需要加入合适的佐剂后加工颗粒混合物以获得片剂或糖锭剂芯。合适的赋形剂是碳水化合物或蛋白填料,例如糖(包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇);来自玉米、小麦、水稻、马铃薯或其他植物的淀粉;纤维素,例如甲基纤维素、羟丙甲基纤维素或羧甲基纤维素钠;树胶,包括阿拉伯树胶和黄蓍胶;和蛋白,例如明胶和胶原。视需要,可加入崩解剂或增溶剂,例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐,例如海藻酸钠。糖锭剂芯可与合适的包衣(例如浓缩的糖溶液)结合使用,包衣亦可包括阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、紫胶漆(lacquer)溶液以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加入到片剂或糖锭剂包衣中用于产品鉴定,或表征活性化合物的量,即剂量。
可口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推入配合(push-fit)胶囊,以及由明胶和包衣(例如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊。推入配合胶囊可包含与活性成分混合的填料或粘合剂(例如乳糖或淀粉)、润滑剂(例如滑石粉或硬脂酸镁)和任选稳定剂。在软胶囊中,活性化合物可溶解或混悬在合适的液体中,例如脂肪油、液体或者含或不含稳定剂的液体聚乙二醇。
优选的无菌注射制剂可为在无毒胃肠外可接受的溶剂或稀释剂中的溶液剂或混悬剂。药学上可接受的载体的实例是盐水、缓冲盐水、等渗盐水(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠;氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁;或这些盐的混合物)、林格氏溶液、葡萄糖、水、无菌水、甘油、乙醇及其组合。合宜地使用1,3-丁二醇和无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。可使用任何无刺激的固定油,包括合成的甘油单酸酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸也在注射制剂中得到应用。
本发明的物质或组合物可结合或包埋在聚合物载体、生物可降解基质或仿生基质或支架中用于给药。载体、基质或支架可为任何材料,所述材料使组合物能够被掺入和表达,并与细胞的加入或在细胞的存在下是相容的。特别地,载体、基质或支架是显著无免疫原性的和是生物可降解的。生物可降解材料的实例包括但不限于聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、透明质酸、肠线材料、明胶、纤维素、硝化纤维素、胶原、白蛋白、纤维蛋白、藻酸盐、棉花或其他天然存在的生物可降解材料。可优选在给予或植入前将基质或支架材料灭菌,例如通过环氧乙烷处理或通过伽马辐照或用电子束辐照。另外,可使用许多其他材料形成支架或框架结构,包括但不限于:尼龙(聚酰胺)、涤纶(聚酯)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯化合物(例如聚氯乙烯)、聚碳酸酯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE,teflon)、thermanox(TPX)、羟酸的聚合物(例如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA))、聚原酸酯、聚酐、聚磷腈和各种聚羟烷酸酯及其组合。合适的基质包括聚合物网状物或海绵状物和聚合物水凝胶。在特定的实施方案中,基质在少于一年的一段时间内是生物可降解的,更特别是少于六个月,最特别是在二到十周内。聚合物组合物以及制备方法可用于确定降解速率。例如,混合增加量的聚乳酸与聚乙醇酸减少降解时间。可使用的聚乙醇酸网状物可经商业途径获得,例如从外科供应公司(例如Ethicon,NJ)获得。通常,这些聚合物至少部分可溶于水溶液,例如水、缓冲盐溶液或具有带电侧基或其单价离子盐的水性醇溶液。
组合物介质亦可为水凝胶,其制备自任何生物相容的或非细胞毒的同聚物或杂聚物,例如可作为药物吸收海绵起作用的亲水性聚丙烯酸聚合物。它们中的某些,例如尤其获自环氧乙烷和/或环氧丙烷的那些是市售可得的。水凝胶可直接沉积在待治疗组织表面上,例如在外科手术期间。
活性表达抑制剂亦可包封在例如通过界面聚合制备的微胶囊中,例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊,分别在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳状液中。这种技术公开于Remington′sPharmaceutical Sciences(1980)第16版,Osol,A.主编。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括包含抗体的半渗透性固体疏水聚合物基质,该基质为成形物品的形式,例如薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟乙基酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物(例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙立德组成的注射用微球))和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物例如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使分子能够释放超过100天,但特定的水凝胶在较短的时间期间内释放蛋白。当包封的抗体长时间保留在体内时,由于在37℃暴露于水分,它们可变性或聚集,导致生物学活性的丧失和免疫原性的可能改变。可取决于所涉及的机制设计合理的策略用于稳定化。例如,如果发现聚集机制为通过巯基-二硫键互换形成分子间S-S键,可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制水分含量、使用合适的添加剂和开发特异聚合物基质组合物实现稳定化。
如上所定义,治疗有效剂量意指改善症状或病症的蛋白、多核苷酸、肽、或其抗体、激动剂或拮抗剂的量。这种化合物的治疗功效和毒性可通过标准药物步骤在细胞培养物或实验动物中测定,例如ED50(50%群体的治疗有效剂量)和LD50(50%群体的致死剂量)。毒性和治疗效果的剂量比为治疗指数,它并可表示为LD50/ED50比。优选表现大治疗指数的药物组合物。使用从细胞培养物测定和动物研究获得的数据配制用于人使用的一系列剂量。这种化合物的剂量优选位于包括具有很少毒性或无毒性的ED50的一系列循环浓度内。取决于使用的剂型、患者的敏感性和给药途径,剂量在该范围内变化。
对于任何化合物,治疗有效剂量可最初在细胞培养物测定或在动物模型(通常小鼠、兔、狗或猪)中评估。动物模型亦用于得到所需的浓度范围和给药途径。然后这样的信息可用于确定可用于人给药的剂量和途径。确切剂量由每位医生鉴于待治疗患者选择。调整剂量和给药以提供足够的活性部分的水平或维持所需的效果。可考虑的另外的因素包括患者的疾病状态严重性、年龄、体重和性别;饮食、所需的治疗持续时间、给药方法、给药时间和频率、药物组合、反应敏感性和治疗耐受性/反应。长效药物组合物可每3-4天、每周或每两周一次给予,视具体制剂的半衰期和清除率而定。
本发明药物组合物可通过多种方法给予受试者。可直接将它们加入到靶组织中、与阳离子脂质复合、包装在脂质体内或通过本领域公知的其他方法递送至靶细胞。可通过直接注射、经皮吸收、导管、输注泵或支架完成所需组织的局部给药。可将DNA、DNA/溶媒复合物或重组病毒颗粒局部给予治疗位点。备选递送途径包括但不限于静脉内注射、肌内注射、皮下注射、气溶胶吸入、口服(片剂或丸剂形式)、局部、全身、眼睛、腹膜内和/或鞘内递送。
备选地或此外,编码GEP、GEP肽和/或atsttrin的多核苷酸可特别包含在载体内。多核苷酸可与使核酸序列能够表达的信号有效连接,并使用优选重组载体构建体引入细胞中,一旦将载体引入细胞中,重组载体构建体将表达反义核酸。许多基于病毒的系统是可得的,包括腺病毒载体系统、逆转录病毒载体系统、腺相关病毒载体系统、慢病毒载体系统、单纯疱疹病毒载体系统或仙台病毒载体系统,并且全部可用于引入和表达用于表达抑制剂的多核苷酸序列或在靶细胞中表达靶多肽的多核苷酸。
特别地,在本发明的方法中使用的病毒载体是复制缺陷型。这种复制缺陷型载体通常缺少(pack)至少一个为病毒在感染细胞中复制所必需的区。这些区可通过本领域技术人员已知的任何公知技术消除(全部或部分)或变成无功能的。这些技术包括总体移除、置换、部分缺失或添加必要(用于复制)区的一个或多个碱基。这样的技术可在体外(在分离的DNA上)或在原位进行,使用遗传操作技术或通过用诱变剂处理。优选地,复制缺陷型病毒保留其对于病毒颗粒包壳所必需的基因组序列。
在一个优选的实施方案中,病毒元件源自腺病毒。优选地,载体包括包装到腺病毒壳体中的腺病毒载体或其功能部分、衍生物和/或类似物。腺病毒生物学亦在分子水平上相当公知。用于腺病毒载体的许多工具已被开发并在继续开发,因此使腺病毒壳体成为用于掺入本发明文库中的优选载体。腺病毒能够感染多种细胞。然而,不同腺病毒血清型具有不同细胞优选。在一个优选实施方案中,为了结合和扩大本发明的腺病毒壳体可进入的靶细胞群,载体包括来自至少两种腺病毒的腺病毒纤维蛋白。优选的腺病毒纤维蛋白序列是血清型17、45和51。这些嵌合载体的构建和表达技术公开于通过引用结合到本文中的US 2003/0180258和US 2004/0071660。
在一个优选的实施方案中,源自腺病毒的核酸包含编码腺病毒晚期蛋白或其功能部分、衍生物和/或类似物的核酸。可有利地使用腺病毒晚期蛋白,例如腺病毒纤维蛋白,以将载体靶向到特定细胞中或诱导增强载体到细胞中的递送。优选地,源自腺病毒的核酸编码基本上所有的腺病毒晚期蛋白,使整个腺病毒壳体或其功能部分、类似物和/或衍生物能够形成。优选地,源自腺病毒的核酸包含编码腺病毒E2A或其功能部分、衍生物和/或类似物的核酸。优选地,源自腺病毒的核酸包含编码至少一种E4区蛋白或其功能部分、衍生物和/或类似物的核酸,其至少部分促进腺病毒衍生核酸在细胞中的复制。在本申请的实施例中使用的腺病毒载体是在本发明治疗方法中有用的例示性载体。
本发明特定的实施方案中使用逆转录病毒载体系统。逆转录病毒是感染分裂细胞的整合病毒,并且它们的构建是本领域公知的。逆转录病毒载体可从不同类型的逆转录病毒构建,例如MoMuLV(“鼠莫洛尼白血病病毒”)、MSV(“鼠莫洛尼肉瘤病毒”)、HaSV(“哈维肉瘤病毒”)、SNV(“脾坏死病毒”)、RSV(“劳斯肉瘤病毒”)和Friend病毒。亦可在本发明的实践中使用慢病毒载体系统。
在本发明的其他实施方案中,利用腺相关病毒(“AAV”)。AAV病毒是大小相对小的DNA病毒,其以稳定和位点特异的方式整合到感染细胞的基因组中。它们能够感染宽范围的细胞而不诱导对细胞生长、形态或分化的任何影响,并且它们似乎不参与人病理学。
在载体构建中,本发明的多核苷酸物质可与一个或多个调节区连接。合适调节区的选择是常规的事情,在本领域普通技术人员的水平内。调节区包括启动子,并可包括增强子、阻抑子等。
在本发明的表达载体中可使用的启动子包括组成型启动子和调节型(诱导型)启动子。取决于宿主,启动子可为原核生物的或真核生物的。在可用于实施本发明的原核生物(包括噬菌体)启动子中,有lac、lacZ、T3、T7、λPr、P1和trp启动子。在可用于实施本发明的真核生物(包括病毒)启动子中,有遍在启动子(例如HPRT、波形蛋白、肌动蛋白、微管蛋白);治疗基因启动子(例如MDR型、CFTR、VIII因子);组织特异性启动子(包括动物转录控制区),其表现组织特异性并已在转基因动物中利用,例如在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl,等(1984)Cell 38:647-58;Adames,等(1985)Nature 318:533-8;Alexander,等(1987)MoI.Cell.Biol.7:1436-44);和在睾丸细胞、乳腺细胞、淋巴样细胞和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder,等(1986)Cell 45:485-95)。
在本发明的实践中可使用的其他启动子包括在分裂细胞中优先激活的启动子、响应于刺激(例如类固醇激素受体、视黄酸受体)的启动子、四环素调节的转录调节剂启动子、巨细胞病毒及时早期启动子、逆转录病毒LTR启动子、金属硫蛋白启动子、SV-40启动子、EIa启动子和MLP启动子。在本发明的实践中可使用的另外的启动子包括在树突细胞中有活性和/或表达的启动子。
另外的载体系统包括有助于多核苷酸物质引入患者中的非病毒系统。例如,编码所需序列的DNA载体可通过脂质转染法体内引入。设计为减少脂质体介导的转染遇到的困难的合成阳离子脂质,可用于制备用于编码标记的基因的体内转染的脂质体(Feigner,等(1987)Proc.Natl.Acad Sci.USA 84:7413-7);参见Mackey,等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8027-31;Ulmer,等(1993)Science259:1745-8)。阳离子脂质的使用可促进带负电核酸的包封,并且亦促进与带负电细胞膜的融合(Feigner和Ringold,(1989)Nature 337:387-8)。用于核酸转移的特别有用的脂质化合物和组合物参见国际专利公布说明书WO 95/18863和WO 96/17823和美国专利号5,459,127。使用脂质转染法将外源基因体内引入特定的器官中具有特定的实用优点,并且将转染导向特定细胞类型在具有细胞异质性的组织中特别有利,例如胰腺、肝脏、肾和脑。可将脂质与用于靶向目的的其他分子化学偶联。靶向的肽(例如激素或神经递质)和蛋白(例如抗体)或非肽分子可与脂质体化学偶联。其他分子亦可用于促进核酸体内转染,例如阳离子寡肽(例如,国际专利公布说明书WO 95/21931)、源自DNA结合蛋白的肽(例如,国际专利公布说明书WO 96/25508)或阳离子聚合物(例如,国际专利公布说明书WO 95/21931)。
将DNA载体作为裸DNA质粒体内引入亦是可能的(参见美国专利号5,693,622、5,589,466和5,580,859)。用于治疗目的的裸DNA载体可通过本领域已知的方法引入到所需的宿主细胞中,例如转染、电穿孔、微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、使用基因枪或者使用DNA载体转运蛋白(参见例如,Wilson,等(1992)J.Biol.Chem.267:963-7;Wu和Wu,(1988)J.Biol.Chem.263:14621-4;Hartmut,等的加拿大专利申请号2,012,311,1990年3月15日提交;Williams,等(1991).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2726-30)。亦可使用受体介导的DNA递送途径(Curiel,等(1992)Hum.Gene Ther.3:147-54;Wu和Wu,(1987)J.Biol.Chem.262:4429-32)。
另外,本发明预见制备具有独特或不同结构性质或序列性质的GEP肽和/或atsttrin肽,和使用肽模拟物和肽模拟物键(例如酯键)来制备具有GEP肽和/或atsttrin性质(即能够抑制或拮抗TNF和TNF/TNFR)的另外的肽或物质。在另一个实施方案中,可产生掺入还原肽键的肽,还原肽键即R1-CH2-NH-R2,其中R1和R2为氨基酸残基或序列。可作为二肽亚基引入还原肽键。这样的分子将抗肽键水解,例如蛋白酶活性。这样的肽将提供具有独特功能和活性(例如由于对代谢分解或蛋白酶活性的抗性而延长的体内半衰期)的拮抗剂。此外公知的是,在特定系统中约束肽(constrained peptide)显示增强的功能活性(Hruby,1982,Life Sciences 3\Λ%9-\99;Hruby等,1990,Biochem J.268:249-262。
可合成制备约束肽、环肽或硬化肽(rigidizid peptide),条件是在肽序列中的至少两个位置中插入以下氨基酸或氨基酸类似物:其提供能够交联以约束、环化或硬化肽的化学官能团,以在处理后形成交联。当掺入诱导转角氨基酸时,环化将是有利的。能够交联肽的氨基酸的实例为形成二硫键的半胱氨酸、形成内酯或乳糖酶的天冬氨酸和螯合过渡金属并形成交联的螯合剂,例如γ-羧基-谷氨酸(GIa)(Bachem)。可通过改良Zee-Cheng和Olson所述的合成制备受保护的γ-羧基-谷氨酸(1980,Biophys.Biochem.Res.Commun.94:1128-1132)。可处理其中肽序列包含至少两个能够交联的氨基酸的肽,例如通过氧化半胱氨酸残基以形成二硫键或加入金属离子以形成螯合物,以便交联肽并形成约束肽、环肽或硬化肽。
本发明预期系统制备交联的策略。例如,如果四个半胱氨酸残基掺入到肽序列中,那么可使用不同的保护基团(Hiskey,1981,载于The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,第3卷,Gross和Meienhofer,主编,Academic Press:New York,第137-167页;Ponsanti等,1990,Tetrahedron 46:8255-8266)。可将第一对半胱氨酸脱保护和氧化,然后可将第二组脱保护和氧化。以这种方式,可形成规定组的二硫键交联。备选地,可掺入一对半胱氨酸和一对整理(collating)氨基酸类似物,使得交联具有不同化学性质。
为了引入特定构象模体,可在肽中掺入以下非典型氨基酸:1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸酯(Kazmierski等,1991,J.Am.Chem.Soc.113:2275-2283);(2S,3S)-甲基苯丙氨酸、(2S,3R)-甲基苯丙氨酸、(2R,3S)-甲基苯丙氨酸和(2R,3R)-甲基苯丙氨酸(Kazmierski和Hruby,1991,Tetrahedron Lett.);2-氨基四氢萘-2-甲酸(Landis,1989,博士论文,University of Arizona);羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸酯(Miyake等,1989,J.TakedaRes.Labs.43:53-76);β-咔啉(D和L)(Kazmierski,1988,博士论文,University of Arizona);HIC(组氨酸异喹啉羧酸)(Zechel等,1991,Int.J.Pep.Protein Res.43);和HIC(组氨酸环脲)(Dharanipragada)。
为了诱导或利于特定二级结构,可掺入以下氨基酸类似物和肽模拟物:LL-Acp(LL-3-氨基-2-propenidone-6-甲酸)、诱导β-转角的二肽类似物(Kemp等,1985,J.Org.Chem.50:5834-5838);诱导β-折叠的类似物(Kemp等,1988,Tetrahedron Lett.29:5081-5082);诱导β-转角的类似物(Kemp等,1988,Tetrahedron Lett.29:5057-5060);诱导α-螺旋的类似物(Kemp等,1988,Tetrahedron Lett.29:4935-4938);诱导γ-转角的类似物(Kemp等,1989,J.Org.Chem.54:109:115);和以下参考文献提供的类似物:Nagai和Sato,1985,Tetrahedron Lett.26:647-650;DiMaio等,1989,J.Chem.Soc.Perkin Trans,第1687页;以及Gly-Ala转角类似物(Kahn等,1989,Tetrahedron Lett.30:2317);酰胺键等构物(Jones等,1988,Tetrahedron Lett.29:3853-3856);四唑(Zabrocki等,1988,J.Am.Chem.Soc.110:5875-5880);DTC(Samanen等,1990,Int.J.Protein Pep.Res.35:501:509);和在Olson等,1990,J.Am.Chem.Sci.112:323-333和Garvey等,1990,J.Org.Chem.56:436中教导的类似物。β-转角和β-突起的构象限制模拟物和包含它们的肽参见1995年8月8日授权予Kahn的美国专利号5,440,013。
本发明另外提供本发明的多肽或肽的修饰或衍生。这些修饰可用于改变或增加本发明的多肽或肽的稳定性、活性、半衰期。肽的修饰是普通技术人员公知的,包括磷酸化、羧甲基化和酰化。可通过化学或酶促方法进行修饰。在另一个方面,可制备糖基化或脂酰化肽衍生物。糖基化或脂酰化肽的制备是本领域公知的。亦可制备脂酰基肽衍生物。例如且不作为限制,可酰化游离氨基基团(N末端或赖氨酰),例如肉豆蔻酰化。在另一个实施方案中,可将包含结构-(CH2)nCH3的脂肪族侧链的氨基酸掺入肽中。适合用于本发明的该和其他肽-脂肪酸缀合物公开于英国专利GB-8809162.4、国际专利申请PCT/AU89/00166和参考文献5,同上。亦预期加入碳水化合物部分和制备并使用本发明肽的糖基化类似物,包括用于改进生物学和物理学性质,例如蛋白水解稳定性和体内活性。
用于衍生的化学部分。另外提供本发明肽的衍生物(包括其变体、类似物和活性片段)。这样的衍生物涵盖和包括增强活性、溶解性、有效治疗浓度和跨越血脑屏障的转运的衍生物。另外涵盖的衍生物包括已知与TNF/TNFR相互作用、靶向TNF/TNFR或表达细胞或者具有抗炎活性的部分或分子的连接物。化学部分可在N末端或C末端与本发明肽连接。适合于衍生的化学部分可例如选自水溶性聚合物。选择的聚合物可为水溶性的,使得其所连接的组分在水性环境中不沉淀,例如生理环境。优选地,为了终产物制备的治疗用途,聚合物是药学上可接受的。聚合物可为支化或未支化的。本领域的技术人员将能够基于以下考虑选择所需的聚合物:例如聚合物/组分缀合物是否是治疗上使用的,并且如果这样,所需的剂量、循环时间、蛋白水解抗性和其他考虑。对于本发明组分,可使用本文提供的测定确定它们。
水溶性聚合物可选自,例如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧杂环戊烷、聚1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇和聚乙烯醇。聚乙二醇丙醛(propionaldenhyde)由于其在水中的溶解性可在生产中具有优势。
聚乙二醇可为任何合适的分子量,并可为支化或未支化的。对于聚乙二醇,优选的分子量在约2kDa和约100kDa(术语“约”指在聚乙二醇的制备中,一些分子将比所称的分子量较重,一些较轻)之间,以便于处理和制备。可使用其他大小,视所需的治疗特征而定(例如,所需缓释的持续时间、可能存在的对生物学活性的影响、处理容易性、抗原性的程度或缺乏以及聚乙二醇对治疗蛋白或类似物的其他已知影响)。
如此连接的聚合物分子的数量可不同,并且本领域的技术人员将能够确定对功能的影响。使用相同或不同化学部分(例如聚合物,例如不同重量的聚乙二醇),可提供单衍生物,或可提供二、三、四衍生或衍生的一些组合。聚合物分子与组分的比例将不同,它们在反应混合物中的浓度亦是如此。通常,最佳比率(就反应效率而言,不存在过量的未反应组分和聚合物)将由例如以下因素决定:所需衍生程度(例如单、二、三等)、选择的聚合物的分子量、聚合物支化抑或未支化和反应条件。
聚乙二醇分子(或其他化学部分)应当在考虑对蛋白的功能结构域或抗原性结构域的影响的条件下与组分连接。存在许多本领域技术人员可利用的连接方法,例如通过引用结合到本文中的EP 0 401 384(PEG与G-CSF偶联),亦参见Malik等,1992,Exp.Hematol.20:1028-1035(报道使用tresyl氯的GM-CSF聚乙二醇化)。例如,可通过氨基酸残基经由活性基团共价结合聚乙二醇,活性基团例如游离氨基或羧基基团。活性基团是那些激活的聚乙二醇分子可结合的基团。具有游离氨基的氨基酸残基包括赖氨酸残基和末端氨基酸残基;具有游离羧基的氨基酸残基包括天冬氨酸残基、谷氨酸残基和C-末端氨基酸残基。亦可使用巯基作为活性基团用于连接聚乙二醇分子。优选对于治疗目的,在氨基处连接,例如在N-末端或赖氨酸基团处连接。
更加特别地,本发明提供衍生物,其为包含本发明的肽或其片段的融合蛋白。本发明的肽及其片段因此可为“修饰的”,即置于嵌合肽或蛋白的融合体中,或为标记的,例如以具有N-末端FLAG标签。在一个特定的实施方案中,肽可通过与标记蛋白键合或连接得到修饰,标记蛋白例如1997年4月29日提交的美国专利号5,625,048和1999年7月24日公布的WO 97/26333中所述的绿色荧光蛋白(每一篇特此通过引用以其整体结合到本文中)。在一个这样的实施方案中,可制备嵌合肽,例如谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白、麦芽糖结合(MPB)蛋白融合蛋白或聚组氨酸标签的融合蛋白,用于在真核生物细胞中表达。本发明肽作为融合蛋白的表达可促进稳定表达,或使得能够基于融合伙伴的性质纯化。例如,GST结合与固体支持基质缀合的谷胱甘肽,MBP与麦芽糖基质结合,和聚组氨酸与Ni螯合支持基质螯合。用合适的缓冲液可将融合蛋白从特定基质上洗脱,或通过用对通常在肽和融合伙伴(例如GST、MBP或聚His)间改造的切割位点特异的蛋白酶处理。备选地,嵌合肽可包含绿色荧光蛋白,并可用于测定肽在细胞中的细胞内定位。
本发明亦包括衍生物,其中至少一个连接的化学部分为具有用于肽连接的多个位点并能够同时结合至少两个所述肽以产生多聚体肽结构的分子。该衍生物具有增加本发明碳水化合物表位模拟肽的可用局部浓度的作用。备选地或另外,这样的部分可在提供稳定支架以便为活性将肽保持在适当位置方面起作用,藉此减少或预防扩散或降解。更加特别地,这样的分子选自BSA、卵清蛋白、人血清白蛋白、聚丙烯酰胺、珠和合成纤维(生物可降解的和不可生物降解的)。
可制备本发明的碳水化合物表位模拟肽,并作为单体、二聚体、多聚体、异二聚体、异多聚体等利用。多聚体形式肽的呈递或给药可导致增加的活性或另外增加由肽介导的活性的调节,包括TNF拮抗活性和/或抑制TNF/TNFR信号转导和活性。可以许多方式产生肽单体。本发明的肽可使用蛋白合成器并利用本领域公知的以及在上文所述的方法合成,掺入氨基酸修饰、类似物等,如在上文所述。另外,可将肽的DNA序列插入到表达载体例如pSE(Invitrogen)或pCDNA3(Invitrogen)中,用于在细菌或哺乳动物细胞表达系统中产生。亦可使用昆虫或酵母表达系统。通过加入标签序列,例如与Nickel-NTA树脂结合的6-组氨酸标签,可促进肽的纯化。这些标签序列通常易于通过在标签之后加入蛋白酶特异性序列除去。可使用本领域的多种方法产生肽的二聚体和多聚体。亦可将二聚体或多聚体的DNA序列插入到表达系统中,例如细菌或哺乳动物细胞系统。这可产生分子,例如Met-FLHTRLFV)x,其中x=2、3、4、...等。在肽或肽模拟物之间包含短的柔性间隔区(Gly-Gly-Gly-Ser)3以增加其有效性可能是必要的。亦可使用交联剂例如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯(DSS)或Dithoiobis(丙酸琥珀酰亚胺基酯)(DSP)产生二聚体或多聚体。这些试剂易与氨基反应,并可通过在精氨酸残基上的游离氨基和在N-末端的游离氨基交联肽。亦可使用生物素和抗生物素蛋白、Jun和Fos以及抗体的Fc区间的亲和相互作用形成二聚体或多聚体。纯化的肽可被生物素化,并与已知形成强蛋白-蛋白相互作用的因子混合。可使用例如那些上面提及的交联剂或使用产生肽-Jun/Fos分子的分子技术将肽或肽模拟物与负责二聚体形成的Jun和Fos中的区连接。当混合Jun和Fos肽杂合体时,可导致二聚体形成。另外,亦可制备肽-Fc杂合产物。当在哺乳动物细胞中表达时,共价二硫键通过Fc区中的半胱氨酸形成,并将导致二聚体形成。亦可制备肽的异二聚体和异多聚体。这将产生可能的多功能分子,其中完整分子的部分负责产生多种作用,例如抗-TNF和/或抗炎性和/或细胞生长调节作用。上文列出的那些相同技术可用于产生这些多功能分子。可使用分子技术将碳水化合物表位模拟肽在DNA水平上插入到蛋白中。该插入可发生在蛋白分子的N末端或C末端或中间。可使用肽/Fc或肽/June或Fos杂合分子形成异二聚体。当与其他含Fc或Jun/Fos的杂合体混合时,二聚体形成导致产生异二聚体。亦可使用交联试剂将肽与异二聚体连接。最后,肽的生物素化以及其他分子的生物素化可用于产生多聚体。这些组分与抗生物素蛋白的混合可产生大的多功能复合物,其中抗生物素分子的四个生物素结合位点各由不同的生物素化分子占据。
在一个方面,本发明提供一种预防和/或治疗由TNF/TNFR活性和/或信号转导表征、介导或促进的疾病和/或由炎症、免疫损伤和癌症表征的疾病的方法,所述方法包括将治疗有效量的本文公开的TNF拮抗剂肽给予受试者。在一个特定的实施方案中,肽选自GEP、GEP肽和/或atsttrin。在一个特定的实施方案中,疾病选自类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、牛皮癣、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、炎性肺病和慢性阻塞性肺病。在一个实施方案中,疾病可为免疫疾病或病症,包括变态反应和自身免疫疾病,例如狼疮和多发性硬化。在一个方面,疾病可为癌症,包括GEP介导的癌症或TNF/TNFR介导的癌症。
本发明亦涉及如上和本文所述的肽用于制备药物的用途,所述药物用于治疗或预防由TNF/TNFR活性和/或信号转导表征、介导或促进的疾病和/或由炎症和癌症表征的疾病。在一个特定的实施方案中,疾病由炎症表征。在本发明一个特定实施方案中,疾病选自类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、牛皮癣、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、炎性肺病和慢性阻塞性肺病。
通过参考下述非限制性实施例可更好地理解本发明,实施例作为本发明的例证提供。呈现下述实施例是为了更全面阐述本发明优选的实施方案,但是绝不应该解释为限制本发明的宽范围。
实施例1
GEP结合并拮抗TNFα受体(TNFR)
蛋白-蛋白相互作用的全局分析之后生物学评价的现代方法已导致鉴定先前不与特定疾病或器官系统的发病相关的新蛋白的有力方法。通过功能性遗传筛查,我们现在已经发现,一种在软骨形成和关节炎中的新介质GEP与TNFR缔合。这延伸我们对生长因子和细胞因子在软骨生物学中的作用和它们治疗软骨疾病和关节炎病症的应用的理解。尤其,我们的研究阐明关键促炎细胞因子TNFα的天然存在的拮抗剂,并提供对发生在关节炎病症患者中的退行事件的理解。调节间充质干细胞的软骨形成潜能并作为关键促炎细胞因子的抑制剂起作用的生长因子的鉴定和操作,可用于优化在软骨病症和结缔组织病症中的治疗应用。该工作的重要长期目标是:(1)阐明GEP、TNFα的作用,以及它们在调节骨骼生物学以及相关疾病中的相互作用和功能相互影响;和(2)募集GEP,特别是GEP衍生肽,以便开发新的抗-TNF/TNFR治疗干预用于多种TNF相关疾病,包括关节炎。
我们的全局筛查导致一些新的GEP结合伙伴的分离,并且其中TNF受体(TNFR)受到我们的极大关注。随后的研究显示GEP与TNFR的细胞外结构域直接结合,并且在软骨细胞中GEP刺激的信号转导和靶基因表达严格依赖于TNFR。GEP和TNFα两者均与TNFR结合的事实产生的可能性是,GEP与TNFR结合可能阻断TNFα与其受体的缔合,即GEP可能作为天然存在的TNFα拮抗剂起作用。实际上,GEP显著抑制TNFα诱导的炎症反应和软骨细胞凋亡。
鉴定为GEP缔合受体的TNFR2:
考虑到GEP的生物学性质,已假设GEP可通过“经典”膜受体起作用,如其他已知的生长因子一样。到现在为止,尚未鉴定功能受体。在GEP缔合蛋白的探查中,我们使用编码缺失信号肽的GEP的构建体pDBleu-GEP(氨基酸21-588)作为诱饵筛查酵母双杂交(Y2H)cDNA文库,并分离24个阳性克隆。来自这些克隆的测序数据显示它们中的两个为细胞表面TNFR2(TNFRSF IB/CD 120b;登记号#NM_130426)。
在酵母和软骨细胞中GEP与TNFR2结合:
为了在酵母中证实GEP和TNFR2间的相互作用,将编码与GaWDBD连接的GEP的质粒和编码与VP16AD融合的TNFR2的N-末端截短突变体(氨基酸26-567)的质粒共转化到酵母细胞中。类似于已知相互作用并用作阳性对照的c-Jun/c-Fos对,我们的测定显示在酵母中COMP与GEP基于β-半乳糖苷酶的活性相互作用(图2A)。为了确定这两个蛋白是否在原代人软骨细胞中相互作用,进行免疫共沉淀(Co-IP)测定(图2B)。简言之,将从分离的人软骨细胞制备的细胞提取物与抗-TNFR2抗体或对照IgG一起孵育,对免疫沉淀的复合物进行还原SDS-PAGE,并用抗-GEP抗体检测。特异性GEP条带呈现在由抗-TNFR2(泳道3)而非对照IgG抗体(泳道2)沉降的免疫沉淀的复合物中,证明GEP在原代人软骨细胞中与TNFR2特异结合。
GEP与TNFR1和TNFR2的细胞外结构域的直接结合:
由于TNFR1和TNFR2的细胞外结构域之间存在显著的氨基酸相似性,所以我们接下来使用固相结合测定以重组GEP以及TNFR1和TNFR2的细胞外结构域(R&D System)确定GEP是否与TNFR1和TNFR2直接结合(图3)。简言之,用在100μl的TBS缓冲液(50mMTris/HCl,150mM NaCl,pH7.4)中的500ng纯化GEP包被微量滴定板。封闭后,向每孔中加入不同量(5-500ng)的TNFR1的细胞外结构域(TNFR1ECD,左图)或TNFR2的细胞外结构域(TNFR2ECD,右图),并且通过针对TNFR1或TNFR2的抗体接着与辣根过氧化物酶缀合的二抗检测来自液相的结合蛋白。如图3所示,GEP显示与液相TNFR1ECD和TNFR2ECD的剂量-依赖性结合和饱和。
TNFR2的富半胱氨酸结构域(CRD)足以与GEP结合:
产生TNFR2的不同缺失突变体,并在酵母双杂交测定中测试其与GEP相互作用的能力。所有这些突变体的基于过滤器的β-半乳糖苷酶测定(图4)的结果汇于图4A。从这组试验,我们的结论是TNFR2的每个CRD(即CRD1、CRD2、CRD3或CRD4)对其与GEP相互作用足够。
抗-TNFR特异阻断抗体或TNFR的重组细胞外结构域废除GEP刺激的软骨细胞增殖:GEP与TNRf结合的发现以及我们最近的GEP具有对人软骨细胞的有力促有丝分裂作用的报道[49],引导我们确定GEP刺激的软骨细胞增殖是否依赖于TNFR。在以下物质不存在(CTR)或存在下培养人软骨细胞:50ng/ml GEP(GEP)或GEP加1ug/ml抗-TNFR1(GEP+TNFR1 ab;SC-7895针对TNFR1的细胞外结构域)、抗-TNFR2(GEP+TNFR2 ab;SC-12751针对TNFR2的细胞外结构域)或1ug/ml抗-IGFIR(GEP+TGF IR ab,用作对照),并且使用MTT测定分析细胞增殖(图5左图)。如所预期的,GEP有力刺激软骨细胞增殖,并且该GEP刺激的细胞增殖主要由抗-TNFR1或抗-TNFR2抗体阻断,然而抗-IGFIR不显示对GEP作用的任何阻断效果。
由于GEP与TNFR的细胞外结构域直接缔合,所以我们接下来检查TNFR的重组细胞外结构域是否将通过和内源TNFR竞争与GEP相互作用而影响GEP在软骨细胞增殖中的作用。如图5的右图所示,通过50ng/ml GEP诱导的软骨细胞增殖被TNFR1(R1ECD,25ng/ml)或TNFR2(R2ECD,25ng/ml)的重组细胞外结构域完全废除。总之,这些结果表明GEP介导的软骨细胞增殖严格依赖于TNFR活性。
GEP在软骨细胞中激活Akt和Erk1/2途径:
我们接下来试图使用PathScanMultiplex Western CocktailI(CellSignaling)分析软骨细胞中GEP激活的信号转导,其使我们能够在单个膜上同时检测磷-p90RSK、磷-Akt、磷44/42MAPK(Erk1/2)和磷-S6核糖体蛋白的水平。将人C28I2软骨细胞(由Mary B.Goldring博士提供)饥饿24小时,用50ng/ml的GEP处理持续不同时间点,并使用PathScanMultiplex Western Cocktail I分析细胞裂解物。如图6所示,GEP在软骨细胞中特异激活Akt和p44/p42(Erk1/2)途径。
GEP介导的靶基因激活依赖于TNFR:
为了鉴定GEP下游分子,我们进行全基因组DNA芯片分析。从用50ng/ml的GEP处理持续不同时间点的人C28I2软骨细胞中分离总RNA,并通过微阵列分析(Affymetrix,Santa Clara,CA)分析。在GEP处理后,确定大约40个基因被上调(超过2倍),如通过等级聚类确定[53]。引人关注地,同样已知GEP可诱导的基因(包括Gadd45β、JunB、KLF2、Samd7、Sox4和Tcf8)受TGFβ亚家族激活[54-56]。我们接下来确定这些基因通过GEP的激活是否依赖于TNFR,用在50ng/ml GEP存在下培养持续不同时间点的原代野生型(B6)、TNFR1-/-和TNFR2-/-MLE细胞,使用实时PCR检查这些基因的表达概况(图7)。GEP在野生型MLE细胞中明显激活这些基因;然而,GEP在TNFR1-/-或TNFR2-/-细胞中很大程度上丧失这些诱导,表明GEP对其靶基因的诱导依赖于TNFR1和TNFR2。引人关注地,TNFR1和TNFR2似乎对GEP刺激的基因表达均重要。
用于阐明TNFα和GEP诱导的细胞内事件的建议模型:GEP与TNFR的CRD结合(图4),TNFα亦如是[57]。因此,在GEP和TNFα之间存在与TNFR结合的相互抑制。一个引人关注的问题是为什么使用相同受体TNFR的GEP和TNFα诱导相反的反应。如图8所示,TNFα三聚体与TNF受体的细胞外结构域结合,并诱导1)应激相关JNK的强列激活和p38的适度反应,和2)NF-kB途径的激活[58],而GEP有力激活Erk1/2并适度激活Akt信号转导(图6和图8)。许多GEP激活基因(包括Sox4、Smad7、JunB、Gadd45β、Tcf8)也受TGFβ亚家族激活,并且GEP介导的基因激活依赖于TNFR(图7)。
实施例2
发现Atsttrin(通过靶向TNF受体的TNF/TNFR信号转导拮抗剂)
为了鉴定与TNF受体结合所需的GEP肽,在酵母表达质粒中表达一系列GEP突变体(即C-末端缺失、N-末端缺失、单个颗粒体蛋白单位、单个接头以及不同组合)。简言之,通过PCR扩增编码该系列GEP突变体的cDNA区段,并框内克隆到pDBleu(LifeTechnologies)酵母表达载体的Sall/Notl位点中。将产生的质粒和编码TNFR1/R2的细胞外结构域的pPC86-TNFR共转化到包含3个报道基因(His+、Ura+和LacZ(Life Technologies))的酵母MaV203株中,并且检查转化子的β-半乳糖苷酶。所有这些突变体的基于过滤器的β-半乳糖苷酶测定(图9-图15的右图)的结果汇于这些图的左板。如图9中所揭示,来自一系列C-末端缺失的结果表明,来自GEP的C-末端的缺失降低与TNFR的结合亲和力,并最终完全丧失结合活性。这对于N-末端缺失突变体也是正确的(图10)。
单个颗粒体蛋白单位(A、B、C、D、E、F或G;图11)和单个接头单位(P1、P2、P3、P4、P5、P6或P7;图12)两者都不能与TNFR结合,表明GEP的结合区可跨越一个或多个颗粒体蛋白单位和接头。为了检查该假设,我们首先将每个颗粒体蛋白单位与其3’-接头相连接,发现颗粒体蛋白单位F加上接头P3表现弱的与TNFR的结合(图13)。接着,我们将每个颗粒体蛋白单位与其5’-接头相连接,发现P4加上颗粒体蛋白单位A显示弱的与TNFR的结合,还发现P5加上单位C显示弱的与TNFR的结合(图14)。这些发现引导我们测试A、C和F的半单位加上P3、P4和P5的不同组合与TNFR的结合。如图15中所揭示,1/2A+P3+P4+1/2C+P5+1/2F显示与TNFR强力结合。该GEP衍生肽现在称为Atsttrin。
实施例3
GEP拮抗TNFα作用
Atsttrin拮抗TNFα-诱导的炎症反应:我们接下来确定Atsttrin是否抑制TNF介导的炎症。嗜中性粒细胞由炎性刺激如TNFα引发,以产生大量活性氧物类,其有助于嗜中性粒细胞激活和炎性过程的发展[59]。因此,我们测试Atsttrin对TNFα诱导的嗜中性粒细胞激活的影响。如图16A所示,Atsttrin呈剂量依赖地抑制由TNFα引发的嗜中性粒细胞激活。重要且显著地,Atsttrin表现的抑制比得上(至少一样好)恩利和类克(图16B),它们已在临床上用于治疗多种炎性疾病,尤其包括类风湿性关节炎[60]。
GEP抑制TNFα诱导的细胞死亡:TNF-α已经显示在软骨细胞培养物中诱导细胞凋亡[61-63]。我们接下来确定GEP是否在软骨细胞中影响TNF-α诱导的细胞凋亡。简言之,将大鼠软骨肉瘤细胞和人C28I2软骨细胞血清饥饿24小时,以除去外源生长因子和细胞因子的影响。其后,用0.02%BSA(CTR,对照)、100ng/ml的GEP(GEP)、100ng/ml的TNF-α或者GEP加TNF-α刺激细胞36小时。通过使用TUNEL测定试剂盒(Promega)测量细胞凋亡。如图17所示,TNF-α在RCS和C28I2软骨细胞两者中诱导显著的细胞死亡,而GEP在软骨细胞中显著抑制TNF-α诱导的凋亡。
GEP抑制TNFα诱导的金属蛋白酶:我们最近已经报道TNFα诱导ADAMTS家族中的两种金属蛋白酶ADAMTS-7和ADAMTS-12的表达[64]。我们接下来确定GEP是否抑制TNFα对ADAMTS的诱导。简言之,在不同量的GEP不存在或存在下,用TNFα处理人C28I2软骨细胞或软骨外植块48小时,并使用实时PCR用它们的特异引物确定ADAMTS-7和ADAMTS-12的表达。与我们先前报道结果[64]一致,TNFα明显降低ADAMTS-7和ADAMTS-12表达(图18)。GEP显示在软骨细胞或软骨外植块中呈剂量依赖地抑制TNFα介导的金属蛋白酶的诱导。
GEP和Atsttrin的主要特征的简单概述:相比目前可得的抗炎症工程抗体或重组蛋白阻断剂,包括依那西普(恩利,一种可溶的TNFR2-IgG1融合蛋白)、英利昔单抗(类克,一种针对TNF-α的嵌合单克隆抗体)和阿达木单抗(一种针对TNF-α的人源化单克隆抗体)),GEP及其衍生的Atsttrin具有如下特征:
i)独特的抗-TNF/TNFR性质:直接靶向细胞因子用于它们的系统移除(配体腐蚀)的抗体和免疫黏附素已经变成有效的治疗策略(例如依那西普、阿达木单抗和英利昔单抗),并且在一些适应症中细胞因子受体(例如阿那白滞素)的选择性靶向可提供更高效的临床结果。我们的研究证明GEP是第一个已知的直接靶向TNF受体(TNFR)的生长因子,因此GEP及其衍生肽代表第一种通过作用于细胞因子受体的抗-TNF/TNFR信号转导阻断剂,类似于靶向IL-1受体的阿那白滞素的作用(参见图19,其用于比较GEP/Atsttrin和恩利/类克间的不同抗炎症机制)。由于其独特抗-TNF/TNFR信号转导活性,Atsttrin亦可适用于不响应目前TNFα阻断剂(例如类克)的患者群体。
ii)低毒性:由于Atsttrin是源自已经存在于体液中的天然存在的GEP因子,所以预期GEP和Atsttrin将不会引起免疫问题或反应,并且当与其他工程重组蛋白比较时将表现无毒性或较少的毒性。
iii)多重功能:除了它的抗炎活性之外,GEP亦具有有效的组织修复功能,因此一方面预期GEP和Atsttrin阻断炎症反应,并且亦通过炎症反应修复损伤组织。与此相反,所有目前的抗-TNF阻断剂(包括恩利和类克)不具有组织修复活性。另外,我们的初步研究表明Atsttrin具有肿瘤阻抑活性,其代表Atsttrin的另一个应用。
实施例4
Atsttrin抑制GEP刺激的肿瘤细胞增殖
高水平的GEP表达存在于一些人癌症中,并在不同的癌症中有助于肿瘤发生,包括乳腺癌、透明细胞肾癌、侵袭性卵巢癌、成胶质细胞瘤、脂肪细胞性畸胎瘤和多发性骨髓瘤[16,18-24]。Atsttrin通过阻断TNF与TNFR的结合来抑制TNF介导的炎症,并且预期Atsttrin亦可通过阻断GEP与TNFR的结合来抑制肿瘤细胞生长。为了测试该假设,我们检查了Atsttrin对GEP刺激的癌症细胞的细胞增殖的影响。如图20所揭示,Atsttrin呈剂量依赖地抑制GEP刺激的测试癌细胞的细胞增殖。
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实施例5
急性炎症气囊模型研究
在气囊诱导的急性炎症动物模型中测试GEP和Atsttrin的抗炎活性。为了诱导气囊,在背部用3ml的空气皮下注射10-15周龄雄性小鼠。在2天后,再用1.5ml的空气对气囊充气。在第6天,通过向气囊中注射1ml的角叉菜聚糖悬浮液(2%重量/体积,在不含钙和镁的磷酸缓冲盐溶液[PBS]中)诱导炎症。在诱导炎症前1小时,将类克(10ug/g)、GEP(10ug/g)和Atsttrin(10ug/g)给予到气囊中。在4小时后,通过CO2麻醉杀死小鼠,用2ml的PBS冲洗气囊,并收获溢泌物。离心(1,000g,10分钟)后,收集无细胞溢泌物。根据制造商的说明书,通过酶联免疫吸附测定(R&D Systems,Minneapolis,MM)定量一式两份溢泌物中的IL6和IL13浓度。如图21所示,GEP及其衍生Atstrrin两者都有效降低两种主要炎症介质IL-6和IL-13的水平。注意,在该模型中GEP和Atsttrin两者都表现比类克更有效的抗炎作用(降低IL-13浓度大约80%)。
实施例6
慢性炎症动物模型研究
在类风湿性关节炎动物模型中确定GEP活性。在该研究中使用雌性BALB/cJ小鼠。以三至四只每笼的密度安置动物,并允许适应一周。静脉内给予意义明确的胶原II的表位的四种不同单克隆抗体的组合(单克隆抗体:C1Ib、JI、D3和U1)(在第0天)。三天后(第3天),用腹膜内给予的脂多糖攻击小鼠(LPS,25μg/小鼠)。在第三天LPS攻击后1小时开始,根据研究设计给予测试化合物和溶媒。在第1、4、7、10和11天测量爪水肿。在第1、3、5、7和10天视觉检查关节炎症体征的小鼠关节炎评分。当获得关节炎评分后,每天测定体重。在尸检时抽血并加工成血清或血浆。在第11天获得最后的卡尺测量后对小鼠实施安乐死。取下后肢并固定用于组织病理学分析。
实施例7
GEP和Atsttrin对TNFα转基因小鼠中关节炎进展的影响
用于人TNFα的转基因小鼠最初由George Kollias1博士实验室产生,其发展慢性炎症和破坏性多关节炎,具有在类风湿性关节炎患者中观察到的许多特征[55]。该小鼠模型的表型证实在类风湿性关节炎中TNFα是在促炎级联的顶端的理论,并预示已改变该疾病的有效管理的抗-TNFα治疗的显著成功。同样地,TNFα转基因小鼠是用于剖析致病过程的分子机制和评价类风湿性关节炎的新治疗策略的功效的非常有用的工具[115,138,139]。使用该模型进一步评估GEP(特别是它的衍生肽atsttrin)直接给予治疗类风湿性关节炎。简言之,将TNFα转基因小鼠(n=60,购自Taconic)分成6组,每组10只小鼠,并使其接受文献中描述为有效的剂量的GEP、GEP衍生肽和抗-TNFα抗体(作为对照)[140,141]。所有的治疗通过腹膜内注射给予。用磷酸缓冲盐水处理第1组并作为阴性对照。第2和3组(低剂量的GEP和GEP衍生肽)从第4周至第10周每周3次接受1mg/g的GEP或肽。第4和5组(高剂量)从第4周至第10周每周3次接受10mg/g的GEP或肽。第6组从第4周至第10周每周3次接受10mg/g抗-TNFα。在第10周通过颈脱位法处死所有动物,通过心穿刺术抽血,并使爪和胫骨脱位用于进一步分析。在出生后第4周开始,每周进行临床评价。在每组动物中评价关节炎。
实施例8
GEP和Atsttrin对RANKL诱导的破骨细胞发生的影响
破骨细胞为骨再吸收细胞,并且它们的过量活性导致骨质疏松症。RANKL是破骨细胞发生的关键受体并结合RANK。RANK和TNFR属于相同的TNFR家族,并且它们在序列中和特别在结构中共有显著的相似性。鉴于(1)破骨细胞发生的关键受体RANK属于TNFR亚家族,和(2)GEP及其衍生肽Atsttrin与TNFR结合并阻断TNFα作用,我们亦检验了GEP和Atsttrin是否影响破骨细胞发生。在GEP或肽atsttrin存在和不存在下,评估RANKL诱导的破骨细胞发生。简言之,我们在RANKL存在下培养Raw264.7巨噬细胞4天,并进行TRAP染色。如预期的,观察到RANKL诱导的强烈的破骨细胞发生和TRAP多核阳性细胞(图22,以箭头指示)。GEP和atsttrin显示对成骨细胞分化的剂量依赖性抑制(图22)。引人关注地,atsttrin似乎在阻断破骨细胞发生方面比GEP更有效。Atsttrin抑制破骨细胞发生的发现表明,除了多种炎性疾病(包括类风湿性关节炎)外,该肽亦具有治疗骨质疏松症的潜能。
实施例9
GEP和Atsttrin与TNF家族成员RANKL和FAS结合
检查GEP/Atsttrin和TNF受体(TNFR)亚家族中其他成员(包括RANK和FAS)之间的相互作用。为了评价结合,将多种质粒对共转化到酵母株MAV203中,并进行酵母双杂交测定(图26)。将GEP质粒与TNFR1、TNFR2、RANK和FAS质粒中的每个共转化。将Atsttrin质粒与TNFR1、TNFR2、RANK和FAS质粒中的每个共转化。在SD-leu′/trp′/his′/uraVSAT*平板上选择酵母转化体,并测试β-半乳糖苷酶活性。使用不存在相互作用的Rb和核纤层蛋白作为阴性对照。通过该双杂交测定,除了TNFR外,GEP还与RANK和FAS缔合,而Atsttrin与TNFR特异结合。
这些研究证明GEP亦与RANK和Fas结合,但是相互作用可能比与TNFR1和TNFR2的弱。相比之下,与GEP相比显示对TNF受体(TNFR1和TNFR2)的更高结合亲和力的Atsttrin不直接与RANK和FAS相互作用,如通过双杂交结合测定评估的。因此,由于它对TNFR的特异性,Atsttrin可比GEP具有较少或相异的副作用和毒性,因为GEP与TNFR家族的其他成员RANK缔合,并因此可影响多种病理生理学过程。
我们之前已经显示Atsttrin有效抑制RANKL诱导的破骨细胞发生(实施例8)。本实施例结果现在证明Atsttrin不与RANK结合。总的来说,这些数据表明Atsttrin介导的破骨细胞发生的抑制必须通过阻断TNF/TNFR途径。实际上,越来越多的证据证明TNF/TNFR信号转导对破骨细胞发生同样至关重要。
实施例10
GEP对TNFR表现出比对TNFα更高的结合亲和力
观察GEP和TNFα对TNFR的动力学结合研究,并使用带SensiQ Pioneer的Analytical Surface Plasmon Resonance(ICx Nomadics,Oklahoma City,OK 73104)分析。动力学结合示于图27,动力学常数汇于表1。显著地,当与TNFα相比时,GEP对TNF受体(尤其TNFR2)表现更高的亲和力(GEP对TNFα的KD:1.28x10-9M对7.64x10-7M)。与对TNFR1(KD 8.8x10-9M)比对TNFR2(KD 7.64x10-7M)显示高得多的亲和力的TNFα相比,GEP对TNFR2(KD 1.28x10-9M)比对TNFR1(KD 1.58x10-9M)表现略高的亲和力。
表1
动力学常数
分析物 | Ka(×104M-1S-1) | Kd(×10-4S-1) | KD(M) |
TNFα/TNFR1 | 8.25 | 7.27 | 8.80×10-9 |
GEP/TNFR1 | 51.6 | 8.14 | 1.58×10-9 |
TNFα/TNFR2 | 7.79 | 59.5 | 7.64×10-7 |
GEP/TNFR2 | 540 | 6.92 | 1.28×10-9 |
实施例11
Atsttrin和TNFR的结合研究
将atsttrin作为GST融合蛋白在细菌中表达,在谷胱甘肽琼脂糖树脂上纯化,并使用Xa因子洗脱(在GST和Atsttrin之间存在Xa因子切割位点)(图28A)。接着使用Xa Removal Resin(Qiagen)将Xa因子从洗脱液中除去。使用Limulus变形细胞裂解物测定分析纯化Atsttrin的内毒素,其表明内毒素水平与对照介质类似,低于制造商说明书的<1单位/μg许多倍。使用Analytical Surface PlasmonResonance Assay(图28B和C),我们兴奋地发现,与TNFα相比,Atsttrin对TNFR2表现出约为9倍高的结合亲和力(Atsttrin/TNFR2对TNFα/TNFR2的KZ:8.59x10-8M对7.64x10-7M),但对TNFR1表现出约为1/18的低亲和力(Atsttrin/TNFR1对TNFα/TNFR1的KZ:1.60x10-7M对8.80x10-9M),这表明Atsttrin可有效阻断TNFα/TNFR2途径,但可能不显著影响TNFα/TNFR1信号转导。
实施例12
Atsttrin不能激活Erk1/2和Akt信号转导以及抑制癌细胞增殖
使用PathScanMultiplex Western Cocktail I(Cell Signaling),其使得能够在单个膜上同时检测磷-p90RSK、磷-Akt、磷-p44/42 MAPK(Erk1/2)和磷-S6核糖体蛋白的水平,我们接下来试图比较在软骨细胞中GEP和Atsttrin激活的信号转导。将人C28I2软骨细胞(由Mary B.Goldring博士提供)饥饿24小时,用50ng/ml的GEP或Atsttrin处理持续多个时间点,并使用PathScanMultiplex Western Cocktail I分析细胞裂解物。如图29所示,GEP强力激活Erk1/2并适度激活Akt途径(Feng,J.,Guo,F.,Jiang,B.,Frenkel,S.,Zhang,Y.,Wang,D.,Liu,C.J.,GEP:A BMP2-Inducible Growth Factor that Activates Erk1/2Signaling and JunB Transcription Factor in Chondrogenesis(GEP:一种在软骨形成中激活Erk1/2信号转导和JunB转录因子的BMP2-可诱导的生长因子),FASEBJ.,2010年2月2日[印刷前的电子版])。然而,虽然保留GEP的TNFR结合活性(图28),但是Atsttrin丧失GEP的致癌信号转导。当组合测试GEP和Atsttrin时,Atsttrin阻断或阻抑GEP介导的p-AKT和p-ERK的激活(图29)。
实施例13
Atsttrin在胶原诱导的关节炎(CIA)模型中预防关节炎的发作
我们接下来在胶原诱导的关节炎(CIA)小鼠模型中检查Atsttrin,该小鼠模型表现出RA的许多临床和病理特征。简言之,在第0天鸡用在尾巴基部皮下给予的在改良完全弗氏佐剂中乳化的鸡胶原II攻击DBA/1小鼠(Chondrex单次免疫)。在第19天,将小鼠分为三组(每组n=10),并每隔一天如下处理直至第35天:第1组腹膜内接受10μg/g体重剂量的Atsttrin,第2组腹膜内接受10μg/g体重剂量的恩利(TNFR2的可溶性细胞外结构域)(作为阳性对照),和第3组接受相同体积的磷酸缓冲盐水(PBS,作为阴性对照)。每天监测小鼠的关节炎发病率、关节炎严重评分,并通过恒压卡尺测量爪厚度。如图30A和30B所示,Atsttrin和恩利两者都有效预防关节炎发展。Atsttrin在该模型中比恩利更有效,因为Atsttrin完全预防关节炎的发作。如在图31中代表性图中所见,用PBS处理的小鼠中CIA症状(肿胀、红斑、畸形)明显。相比之下,用Atsttrin和恩利处理的小鼠显示显著减少的病理学,并且Atsttrin处理的小鼠与正常小鼠相似。用PBS处理的CIA小鼠的踝关节表现出强烈的白细胞浸润和组织破坏(H&E染色)以及基质染色的丢失(Sarfranin-0染色)(图32A)。在Atsttrin处理的小鼠中不存在关节炎症状。MicroCT图(图32B)揭示在用PBS处理的CIA小鼠中明显的骨质侵蚀,但用Atsttrin的没有。另外,在用PBS处理的CIA小鼠中在侵蚀区周围明显看到TRAP+的骨再吸收破骨细胞;相比之下,在Atsttrin处理的CIA小鼠中几乎检测不到TRAP+破骨细胞(图33)。
我们评价Atsttrin对CIA小鼠血清中促炎和抗炎细胞因子水平的影响。在这些研究中,将Atsttrin与PBS和恩利相比。评价促炎细胞因子IL-1β和IL-6,并且评价抗炎细胞因子IL-10和IL-13。如图34所示,Atsttrin和恩利两者都显著降低促炎细胞因子IL-6的水平。恩利和Atsttrin对IL-1β的降低不太显著,但是Atsttrin比恩利降低更多的IL-1β。关于抗炎细胞因子,虽然恩利和Atsttrin两者都增加IL-10,但Atsttrin显示对IL-10水平更显著的影响。恩利和Atsttrin两者都增加抗炎细胞因子IL-13的量。
实施例14
Atsttrin对细胞中TNF诱导的活性的影响
利用RAW264.7细胞中的基于体外细胞的研究,以进一步评估和评价在细胞中Atsttrin对TNF反应的影响。评价GEP和Atsttrin对TNF诱导的亚硝酸盐产生的影响。在加入的TNF(500ng/ml)和增加量的GEP、Atsttrin或恩利(0.3、1.5和7.5nM)存在下,测定细胞中的亚硝酸盐产生。虽然GEP稍微降低亚硝酸盐产生,但是Atsttrin和恩利都更显著降低TNF诱导的亚硝酸盐产生(图36)。接下来,在细胞中评价TNF诱导的NFKB的核积累。如通过NFKB p65染色评估的,GEP和Atsttrin两者都阻断TNF诱导的NFKB的核积累(图37)。在增加浓度的TNFα和GEP或Atsttrin存在下,测定TNF激活的NFKB报道基因(带NFKB结合位点的PAK-I)的诱导(图38)。Atsttrin在较低浓度下比GEP更加显著地抑制报道基因的诱导。
在不偏离本发明精神或本质特征的情况下,本发明可按其他形式实施或按其他方式进行。因此,本公开应被认为在所有方面是阐述性而非限制性的,本发明的范围由所附权利要求书指明,并且所有落入等价含义和范围内的改变均旨在包括在其中。
贯穿该说明书,引用很多参考文献,每篇通过引用以其整体结合到本文中。
Claims (21)
1.一种分离肽,所述肽包含一个或多个颗粒体蛋白单位和一个或多个颗粒体蛋白/上皮肽前体(GEP)的接头单位,并能够拮抗TNF家族成员信号转导,所述肽包括其变体。
2.权利要求1的分离肽,所述肽包含图23的人GEP的一个或多个颗粒体蛋白单位和一个或多个接头单位,并能够拮抗TNF和TNF/TNFR信号转导。
3.权利要求1的分离肽,所述肽至少包含图23和/或图24所示GEP的1/2F、ViK和1/2C颗粒体蛋白单位以及图23和/或图24所示GEP的接头单位P3、P4和P5。
4.权利要求1的分离肽,所述肽包含图24所示的1/2F-P3-P4-1/2A-P5-!/2C(SEQ ID NO:2)。
5.权利要求1的分离肽,其中所述肽或变体能够与TNFR1和/或TNFR2结合。
6.一种组合物,所述组合物包含一种或多种权利要求1的肽以及一种或多种抗炎剂或化合物、抗癌剂或化合物和免疫调节剂。
7.权利要求6的组合物,所述组合物是治疗组合物或药物组合物,任选还包含药学上可接受的载体、溶媒或稀释剂。
8.一种药物组合物,所述组合物包含权利要求1的肽和药学上可接受的载体、溶媒或稀释剂。
9.一种分离核酸,所述核酸能够编码权利要求1-5中任一项的肽。
10.一种载体,所述载体包含权利要求9的核酸和用于表述所述核酸的工具。
11.权利要求10的载体,其中所述核酸与使所述核酸能够在细胞中表达的信号有效连接。
12.一种调节、阻断或者抑制哺乳动物细胞或受试者中TNF或TNF/TNFR活性或信号转导的方法,所述方法包括将包含GEP、GEP肽或atsttrin的组合物给予所述细胞或受试者。
13.一种调节、阻断或者抑制哺乳动物细胞或受试者中TNF活性或信号转导的方法,所述方法包括将权利要求8的组合物给予所述细胞或受试者。
14.一种预防、减轻和/或治疗受试者中由TNF/TNFR信号转导介导的疾病或病症的方法,所述方法包括将包含GEP、GEP肽或atsttrin的组合物给予所述受试者。
15.一种预防、减轻和/或治疗受试者中由TNF/TNFR信号转导介导的疾病或病症的方法,所述方法包括将权利要求8的组合物给予所述受试者。
16.权利要求14或15的方法,其中所述疾病或病症是炎性疾病或病症、免疫疾病或病症或者癌症。
17.权利要求16的方法,其中所述炎性疾病或病症选自类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、牛皮癣、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、炎性肺病和慢性阻塞性肺病。
18.权利要求16的方法,其中所述免疫疾病或病症选自变态反应和自身免疫疾病。
19.一种用于筛选有效拮抗或抑制TNF/TNFR活性的潜在药物或化合物的测定系统,所述系统包括将潜在药物或化合物给予含TNF以激活TNF/TNFR活性的细胞样品,并通过与对照比较来确定潜在药物或化合物对TNF活性的影响,其中所述对照是TNF的拮抗剂。
20.权利要求18的测定系统,其中所述TNF是TNFα,所述对照是权利要求1的肽。
21.权利要求18的测定系统,其中所述TNF是TNFα,所述对照是asttrin。
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