CN106573153A - 用于诊断和治疗溶酶体贮积病的颗粒蛋白前体(pgrn)及其衍生物 - Google Patents

用于诊断和治疗溶酶体贮积病的颗粒蛋白前体(pgrn)及其衍生物 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于诊断和治疗溶酶体贮积病的组合物和方法及其诊断和治疗，包括戈谢病和泰‑萨二氏病，并且特别是其利用颗粒蛋白前体(PGRN)，或活性PGRN肽，包括atsttrin。本发明还提供基于或包括包含PGRN无效突变体和PGRN基因敲除的PGRN突变的溶酶体贮积病，包括戈谢病和泰‑萨二氏病的动物模型。

Description

用于诊断和治疗溶酶体贮积病的颗粒蛋白前体(PGRN)及其衍 生物
发明领域
本发明一般涉及溶酶体贮积病及其诊断和治疗，包括戈谢病(Gaucher’sDisease)，并且特别是涉及其利用颗粒蛋白前体(progranulin, PGRN)，或活性PGRN肽(包括atsttrin)的诊断和治疗方面。
发明背景
颗粒蛋白前体(PGRN)是一种多功能生长因子，也称为PC-细胞-衍生的生长因子(PCDGF)、acrogranin、颗粒体蛋白/上皮肽前体(GEP)、前上皮肽(PEPI)，或GP80，并首次作为一种来自条件组织培养基的生长因子被纯化(Wright WE et al (1989) Cell 56 (4):607-617；Zhou J et al (1993) J Biol Chem 268 (15): 10863-10869)。PGRN是一种593个氨基酸的分泌糖蛋白，具有88 kDa的表观分子量。PGRN包含按照顺序P-G-F-B-A-C-D-E的富含半胱氨酸基序的七个半重复序列(CX5-6CX5CCX8CCX6CCXDX2HCCPX4CX5-6C) (SEQ ID NO:1)，其中A-G是完全重复序列和P是半基序(图24)。值得注意的是，PGRN (GEP)经受蛋白水解处理，伴有小的、称为颗粒体蛋白(或上皮肽)的6-kDa重复单元的释放，其保留生物学活性(Davidson B et al (2004) Cancer 100(10):2139-2147))。这些肽在细胞生长测定中是有活性的并可能与炎症有关(Zanocco-Marani, T et al (1999) Cancer Res 59 (20):5331-5340；Lu R和Serrero G (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 (8): 3993-3998)。
PGRN在发育、伤口愈合、抗炎症、神经系统疾病，以及癌症中具有多种生理学和病理学功能。PGRN (GEP)在快速循环的上皮细胞中，在免疫系统的细胞中，和在神经元中大量表达(Baba T et al (1993) Mol Reprod Dev 34(3): 233-243；Daniel R et al (2000)Histochem Cytochem 48(7):999-1009)。高水平的GEP表达也在几种人类癌症中被发现并有助于在不同的癌症，包括乳腺癌、透明细胞性肾细胞癌，侵袭性卵巢癌、胶质母细胞瘤、脂肪细胞畸胎瘤，和多种骨髓瘤中的肿瘤发生(Davidson B et al (2004) Cancer 100(10): 2139-2147；Bateman A et al (1990) Biochem Biophys Res Comm 173 (3):1161-1168；Gonzales EM et al (2003) J Biol Chem 278 (40): 38113-38116；He A和Bateman A (2003) J Mol Med 81(10:600-612；Jones MB et al (2003) Gynecol Oncol88(1 pt2): S136-139；Wang W et al (2003) Clin Cancer Res 9(6):2221-2228)。虽然GEP主要作为分泌的生长因子起作用，它也被发现是位于细胞内并且直接调节细胞内活性(Daniel R et al (2000) Histochem Cytochem 48 (7): 999-1009；Hoque M et al(2003) Mol Cell Biol 23(5): 1688-1702)。两个小组在相同的时间发现PGRN的突变导致额颞叶小叶退化(FTLD) (Baker M et al (2006) Nature 442: 916-919；Cruts M et al(2006) Nature 442:920-924)。自最初的FTLD研究以来，已报道PGRN的70个致病性突变(由van Swieten综述(Van Sweiten JC et al (2008) Lancet Neurol 7(10): 965-974)引起FTLD。
已报道几个PGRN-相关的配偶体并发现在各个过程中影响PGRN作用。一个实例是分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)。弹性蛋白酶只在颗粒体蛋白间(intergranulin)接头处消化PGRN，伴有颗粒体蛋白肽生成。SLPI或者通过直接结合于弹性蛋白酶或通过螯合来自酶的颗粒体蛋白肽阻断这种蛋白水解(Zhu J et al (2002) Cell 111(6):867-878)。PGRN也被发现结合于选蛋白并介导神经突生长(Hu F et al (2010) Neuron 68:654-667)。
最近，PGRN和PGRN肽，特别是包括表示为atsttrin的肽，被鉴定为TNF/TNFR活性和信号传导的调节剂，并表明抑制或阻断TNF-介导的信号传导或响应，包括TNF-α-诱导的炎性关节炎(Tang W et al (2011) Science 332: 478-484；WO 2010120374)。Atsttrin是一种PGRN-衍生的基因工程蛋白(经由靶向TNF受体的TNF/TNFR信号传导拮抗剂)，包含PGRN单元A、C和F的半单元的组合与接头单元P3、P4和P5的组合(美国专利8,362,218；WO2010120374)。Atsttrin提供一种PGRN-衍生的活性肽，其具有与全长PGRN分子重叠的活性和能力。美国专利8,362,218和PCT公布号WO 2010120374描述PGRN-衍生的肽，其包含颗粒蛋白前体(progranin)的半单元/颗粒体蛋白单元(其中至少一半单元是½ F)和接头单元，特别是至少二个接头单元的组合。PGRN，和PGRN-衍生的肽的氨基酸序列，包括attstrin，描述于图49和50中。
溶酶体贮积病
溶酶体是负责细胞成分生理周转的亚细胞的细胞器。它们含有分解代谢酶，其需要低的pH环境以便最佳化发挥功能。溶酶体贮积病(LSD)描述不同种类的一组由未消化的或部分消化的大分子的积聚为特征的几十种罕见遗传性疾病，其最终导致细胞功能障碍和临床异常。LSDs由一种或多种溶酶体酶的基因突变引起，导致酶底物在溶酶体中的积聚。可导致器官巨大症(Organomegaly)，结缔组织和眼病变，和中枢神经系统功能障碍。典型地，溶酶体贮积病包括溶酶体水解酶的酶缺陷。最近，溶酶体贮积病的概念已扩大至包括为溶酶体酶的正常翻译后修饰所必需的蛋白、激活剂蛋白，或对溶酶体和其它细胞内隔室之间的适当的细胞内运输重要的蛋白的缺乏或缺陷。
已描述超过50种溶酶体贮积病。起病的年龄和临床表现可在患有特定的溶酶体贮积病的患者中有很大的不同，并且携带相同突变的家庭成员之间的显著表型异质性已有报道。溶酶体贮积病通常是由积聚的底物分类并包括神经鞘脂贮积病、寡糖贮积病、粘脂贮积病、黏多糖贮积病(MPSs)、脂蛋白贮积病、溶酶体转运缺陷、神经元蜡样脂褐质沉积症等。图1描述鞘糖脂的途径并指出改变的与不同溶酶体贮积病相关的代谢酶。
最常见的LSDs是戈谢病，其涉及神经鞘脂的功能障碍性代谢并由酶葡糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase)的遗传性缺陷引起。葡糖脑苷脂酶作用于脂肪酸葡糖苷脂酰鞘氨醇且当该酶缺陷时，葡糖苷脂酰鞘氨醇特别积聚在白细胞，最常见是在巨噬细胞中。葡糖脑苷脂酶(glycocerebrosidase)编码基因GBA1的超过300个独特的突变已在戈谢病中鉴定出来(Beutler E和Grabowski GA (2001)戈谢病，遗传性疾病的代谢和分子基础(GaucherDisease. in The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease). CRScriver et al eds. McGraw Hill, NY pp3635-3668；Grabowski GA (2008) Lancet 372(9645): 1263-1271；Zhao et al (2003) Clin Genet 64 (1): 57-64)。葡糖苷脂酰鞘氨醇可在脾、肝、肾、肺、脑和骨髓中收集。
戈谢病(GD)分为三个亚型，具有不同的病理和严重程度。I型(或非神经病型)是该病的最常见形式，其发病率在有德系犹太人遗传(Ashkenazi Jewish heritage)的活产婴儿中为1/50,000。I型患者具有肝脾肿大。脑一般不受病理影响，而取决于疾病发作和严重性，1型患者可很好地活着进入成年。许多患者具有轻微形式的疾病或可能不显示任何症状。I型在遗传学上与GBA1基因突变N370S纯合子相关。II型(或急性婴儿神经病性戈谢病)，在出生6个月内开始并在活产婴儿中具有大约1/100,000的发病率。II型患者具有肿大的肝和脾、广泛性和渐进性脑损伤、眼运动障碍、痉挛、颠痫发作、肢体强直，和吮吸和吞咽能力差。II型患者患有严重的抽搐、肌张力增高，精神发育迟滞和呼吸暂停。受影响的儿童通常到2岁时就死亡。II型GD与GBA1突变等位基因(包括GBA1突变L444P)有关。III型GD，一种慢性神经病性形式，可在儿童期或甚至在成年期的任何时间开始，并以大约每100,000个活产婴儿1例的比例发生。其特征与急性或II型GD比较，为缓慢渐进但较轻微的神经系统症状。主要的症状包括扩大的脾和/或肝、癫痫发作、协调性差、骨骼不规则、眼运动障碍、血液疾病包括贫血和呼吸系统问题。III型患者患有称为肌阵挛的肌肉抽搐、惊厥、痴呆和眼部肌肉失用。患者往往活着直至其青少年早期和成年期。与III型GD相关的遗传学和任何特定GBA1突变尚不清楚。
对于戈谢病的诊断指标包括增加的碱性磷酸酶(ALP)、血管紧张素转换酶(ACE)和免疫球蛋白水平。作为选择或另外地，显示“卷缩纸(crinkled paper)”细胞质和糖脂-装载的巨噬细胞，其也称为“戈谢细胞(Gaucher’s cell)”的细胞分析是GD的细胞标志。在GBA1基因中的突变也被评估，特别是已知与该疾病和上述分型有关的那些突变。GBA1突变的分析可能是有价值的，特别是在由于家族史而处于GD风险中或是GBA1突变携带者的家庭中。
对于LSDs的疗法包括酶替代疗法以替代疾病突变型酶。酶替代疗法(ERT)和底物还原疗法(SRT)可适用于患有戈谢病I和III型、法布里病、粘多糖贮积病I (赫尔勒、赫尔勒-沙伊，和沙伊综合征)、粘多糖贮积病II (亨特综合征)、粘多糖贮积病VI (Maroteaux-Lamy综合征)，和庞贝氏病的患者的外周表现。开发用于几种其它障碍的酶替代选项的努力正在进行中。表1提供正在评估或被批准用于治疗某些LSDs的ERTs。用于戈谢病的示例性疗法，包括ERT被列于表2中。到目前为止，ERT在改善溶酶体贮积病的中枢神经系统的表现中在很大程度上是不成功的，可能是由于穿透血脑屏障的困难。这已导致积极的临床试验来评估鞘内酶递送在几种溶酶体贮积病中的安全性和有效性。同样，对酶替代疗法蛋白的免疫响应已有报道并可能具有不利的影响并且改变ERT的安全性和有效性(Brooks DA(1999) Molec Genet Metab 68(2):268-275)。
表1
用于溶酶体贮积病(LSD)的酶替代疗法(ERT)
表2
戈谢病中包括ERT的疗法
因此，鉴于使用现有技术中评估、改善和治疗溶酶体贮积病(包括戈谢病)的方法伴随的上述缺陷，显然本领域仍存在对溶酶体贮积病(包括戈谢病)的备选疗法、另外的药物，和改进的和更多相关的诊断的需求。本发明提供颗粒蛋白前体(PGRN)及其肽衍生物(包括atsttrin)的新活性、用途和应用，包括溶酶体贮积病，包括戈谢病的诊断、改善和治疗。
本文引用的参考文献不应视为承认它们是本发明的现有技术。
发明概述
根据本发明，已发现基因编码颗粒蛋白前体(PGRN)中的突变，包括通过基因敲除的PGRN的缺失，导致戈谢病，一种先前已知仅由葡糖脑苷脂酶基因(GBA1)突变引起或与葡糖脑苷脂酶基因(GBA1)突变相关的遗传性疾病。因此，PGRN及其编码基因提供一种新的与GD相关的并能够在动物中生成GD的基因，除了葡糖脑苷脂酶GBA1基因外或代替葡糖脑苷脂酶GBA1基因。本文提供的实施例和研究还证实PGRN敲除(KO) (无效突变体)的小鼠发展成戈谢病，包括戈谢细胞的典型的病理学外观，其在电子显微镜下被诊断为溶酶体贮积病。PGRNKO小鼠的脂质分析表明葡糖脑苷脂酶酶底物葡糖苷脂酰鞘氨醇(表示为β-GlcCer)积聚在巨噬细胞中。
本文提供的实施例和研究证实PGRN结合葡糖脑苷脂酶(GBA1)，并且GBA1酶向溶酶体的递送在PGRN KO小鼠中受到损害。一种用来治疗戈谢病的临床药物伊米苷酶(imuglucerase)救济PGRN KO小鼠的戈谢病表型。
此外，15%戈谢病患者具有显著减少水平的PGRN蛋白并且超过70%的GD患者具有PGRN基因突变。这些结果揭示PGRN在溶酶体和运输蛋白至溶酶体中具有重要的功能，以及PGRN基因的突变与溶酶体贮积病(LSD)相关。PGRN，或PGRN-衍生的肽包括atsttrin，提供用于预防和治疗LSDs，包括戈谢病的新蛋白治疗剂。
本发明提供PGRN和PGRN肽，特别是包括表示为atsttrin的肽，作为溶酶体贮积病和溶酶体运输的调节剂。特别是，本发明提供PGRN和PGRN肽，包括atsttrin，作为溶酶体酶运输至溶酶体的促进剂。在一特定的实施方案中，本发明涉及本文公开的PGRN肽和atsttrin家族的所有成员，其能够促进酶递送至溶酶体，和/或与溶酶体酶如葡糖脑苷脂酶(GBA)，或与选蛋白和/或HSP70结合或复合。肽家族包括片段或部分，包括PGRN序列和半单元的混合部分，特别是包含一种或多种颗粒体蛋白单元和PGRN的一个或多个接头单元。在一个方面，所述肽包含颗粒体蛋白单元的两个或更多个半单元和PGRN的一个或多个接头单元。在本发明的一个特定的方面，PGRN肽包含肽atsttrin，包含颗粒体蛋白单元A、C和F的半单元的组合与接头单元P3、P4和P5的组合。在一个特定的方面，GEP肽包颗粒体蛋白单元的半单元(其中至少一个半单元是½ F)和接头单元(特别是至少二个接头单元)的组合。在一个更加特定的方面，atsttrin具有在图50中示出的氨基酸序列(SEQ ID NO: 4)并包含如在本文示出的颗粒体蛋白单元和接头单元½F-P3-P4-½A-P5-½ C。
本发明的目的是提供用于治疗方法的药用组合物，其包含PGRN肽和/或atsttrin或以PGRN肽和/或atsttrin为基础。本发明的目的是提供用于治疗方法的药用组合物，其包含PGRN肽和/或atsttrin或以PGRN肽和/或atsttrin为基础，包括包含在SEQ ID NOs: 2、3和4-9的任何一个中示出的肽序列，特别是包含SEQ ID NO: 2、3、4。药用组合物包含一种或多种PGRN肽和/或atsttrin的组合，其能够促进酶递送至溶酶体，和/或与溶酶体酶如葡糖脑苷脂酶(GBA)，或与选蛋白和/或HSP70结合或复合，和/或能够减少溶酶体底物，如β-GlcCer，在溶酶体或巨噬细胞中的积聚。药用组合物包含一种或多种PGRN肽和/或具有如本文提供的活性的atsttrin和一种或多种溶酶体酶或溶酶体底物还原剂的组合。溶酶体酶或溶酶体底物还原剂包括并可选自葡糖脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-氨基己糖苷酶和神经鞘磷脂酶的一种或多种。药用组合物包含一种或多种具有GBA结合活性的PGRN肽和/或atsttrin以及一种或多种伊米苷酶、重组葡萄糖苷酯酶α、它利罗酶(Taliglucerase) α、美格鲁特和酒石酸异桑叶生物碱(Isofagomine tartrate)的组合。
因此，本发明提供一种用于治疗或减轻溶酶体贮积病的组合物，其包含分离的PGRN，或其活性片段包括atsttrin，其中所述PGRN或活性片段包含如图49或50的任何一个中所示的氨基酸序列，包括如在SEQ ID NOS: 2、3和4-9的任何一个中所示的。组合物还可包含用于溶酶体贮积病的酶替代治疗剂或底物还原治疗剂，包括葡糖脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-氨基己糖苷酶和神经鞘磷脂酶的一种或多种。在一个这样的方面，本发明提供一种包含用于治疗或减轻戈谢病的与葡糖脑苷脂酶组合的PGRN或atsttrin的组合物。在一方面，本发明的组合物还可包含一种或多种分子伴侣或溶酶体递送蛋白，包括HSP70和/或选蛋白。本发明的组合物包括药用组合物，其还包含药学上可接受的载体、媒介、稀释剂或赋形剂。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及某些治疗方法，其将基于PGRN、PGRN肽和/或atsttrin，或其活性片段的活性，以促进酶递送至溶酶体，和/或与溶酶体酶如葡糖脑苷脂酶(GBA)，或与选蛋白和/或HSP70结合或复合，和/或能够减少溶酶体底物，如β-GlcCer在溶酶体或巨噬细胞中的积聚。
因此，本发明提供促进蛋白或酶在动物中的溶酶体递送的方法，其包括给予所述动物分离的PGRN，或其活性片段包括atsttrin。在其一个方面，所述PGRN或活性片段包含如图49或50的任何一个中所示的氨基酸序列，包括包含如在SEQ ID NOS: 2、3和4-9的任何一个中示出的。在本发明的一个方面，提供一种在患有戈谢病的患者中促进递送葡糖脑苷脂酶(glycocerebrisidase) (GBA)的方法，其包括给予所述患者分离的PGRN，或其活性片段包括atsttrin，其中所述PGRN或活性片段包含如图49或50的任何一个中所示的氨基酸序列，包括包含如在SEQ ID NOS: 2、3和4-9的任何一个中示出的。
本发明提供在动物中治疗或减轻溶酶体贮积病的方法，其包括给予所述动物分离的PGRN，或其活性片段包括atsttrin，其中所述PGRN或活性片段包含如图49或50的任何一个中所示的氨基酸序列。本发明提供在动物中治疗或减轻溶酶体贮积病的方法，其包括给予所述动物分离的PGRN，或其活性片段包括atsttrin，其中所述PGRN或活性片段包含含有如在SEQ ID NOS: 2、3和4-9的任何一个中示出的氨基酸序列。在这些方法的一个方面，所述方法包括另外给予一种或多种溶酶体酶，其在溶酶体贮积病中是减少、缺乏、突变或改变的。溶酶体酶可选自葡糖脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-氨基己糖苷酶和神经鞘磷脂酶中的一种或多种。
本发明方法的溶酶体贮积病可选自戈谢病(GD)、泰-萨二氏病(Tay-SachsDisease)、法布里病(Fabry Disease)、法韦尔病(Farber disease)、桑德霍夫病(SandhoffDisease)、GM1神经节苷脂贮积病、克拉伯病(Krabbe disease)、尼曼-皮克病(Niemann-PickDisease) (A型、B型、C型)、庞贝氏病(Pompe Disease)、II型粘脂贮积病(亨特综合征(Hunter syndrome))、IIIA型粘脂贮积病、婴儿游离唾液酸贮积病(ISSD)、溶酶体酸脂酶缺乏症、青少年氨基己糖苷酶A缺乏症、沃尔曼病(Wollman Disease)和扎拉病(SallaDisease)。在一方面，本发明方法的溶酶体贮积病可选自戈谢病(Gaucher's Disease)(GD)、泰-萨二氏病(TSD)、粘脂质贮积病(ML)、粘多糖贮积病(MPS)、异染性脑白质营养不良(MLD)、法韦尔病(FD)和克拉伯病(KD)。在一个方面，本发明方法的溶酶体贮积病可选自戈谢病(GD)包括GD I、II或III型、泰-萨二氏病(TSD)、粘脂质贮积病(ML)包括ML III、粘多糖贮积病(MPS)包括MPS II、III、VI、异染性脑白质营养不良(MLD)、法韦尔病(FD)和克拉伯病(KD)。在本发明方法的一个特别优选的方面，溶酶体贮积病(LSD)是戈谢病(GD)。在本发明的方法的一个方面，该方法包括另外给予溶酶体酶葡糖脑苷脂酶(GBA)或其活性片段或重组形式，用于治疗或减轻戈谢病。在本发明方法的一个特别优选的方面，溶酶体贮积病(LSD)是泰-萨二氏病。
本发明提供用于诊断或评估动物的溶酶体贮积病的方法和测定，其包括在所述动物中测定PGRN的表达或活性或检测基因组DNA或编码PGRN的基因中的一个或多个突变。
任何这样的方法或测定可包括在所述动物中另外测定一种或多种溶酶体酶的表达或活性或检测基因组DNA或编码一种或多种溶酶体酶的基因中的一个或多个突变。在一个特定的方面，提供诊断或评估动物的戈谢病的方法或测定。在这个方面，所述方法或测定可包括在所述动物中另外测定GBA的表达或活性或检测基因组DNA或编码GBA的基因中的一个或多个突变。
根据本发明，现在已经认识到并确定溶酶体贮积病患者可并且确实经常携带PGRN基因或蛋白突变。特别普遍的PGRN基因变化包括4个SNP位点rs4792937、rs850713、rs78403836、rs5848，和3个点突变、p.C315S、p,E316Q和p.P365A。本发明的诊断方法和测定特别包括其中本文提供的一个或多个PGRN突变被评估或确定。方法、测定和试剂盒被提供，其中选自rs4792937、rs850713、rs78403836、rs5848，和3个点突变、p.C315S、p,E316Q和p.P365A的一个或多个PGRN突变被测定。
特别的此类方法或试剂盒是其中选自rs4792937、rs850713、rs78403836、rs5848的一个或多个PGRN突变被测定。在本发明的一个方面，4个PGRN SNP位点通过Taqman基因分型方法确定。在一个这样的方面，所述方法或试剂盒利用示例性引物，其包括：rs4792937正向引物, 5’-TGTCCTGGAAACCATCCTTC-3’ (SEQ ID NO: 11)、反向引物5’-CTCCCAAAGCGATTCTCCTA-3’ (SEQ ID NO: 12)，和Taqman标签序列5’-TCAGTAGCTCACA[T/C]TTGTAA-3’(SEQ ID NO: 13)；rs850713正向引物5’-CCTTCCCTGAGTGGGCTGGTA-3’ (SEQ IDNO: 14)、反向引物5’-AGTGCACCCTGTCTTCACAGC-3’(SEQ ID NO: 15)，和Taqman标签序列5’-AGGTACAAATCTGGGGGAGATGGGG[A/G]TATGTGGAGGGAAGTGGG GGCAGAG-3’ (SEQ ID NO:16)；rs78403836正向引物5’-CTGTCCTCTCCCATGGCTAC-3’ (SEQ ID NO: 17)、反向引物5’-GCGGACCTGTAAGCATGAAT-3’ (SEQ ID NO: 18)，和Tagman标签序列5’-AGGAAGAC[G/C]TGATTTT-3’ (SEQ ID NO: 19)；rs5848正向引物5’-CCAGGGGTACCAAGTGTTTG-3’ (SEQ IDNO: 20)、反向引物5’-CACAGGGTCCACTGAAACG-3’ (SEQ ID NO: 21)，和Taqman标签序列TCTGCTCAGGCCTCCCTAGCACCTC[C/T]CCCTAACCAAATTCTCCCTGGACCC (SEQ ID NO: 22)。p.C315S、p,E316Q，和p.P365A的点突变可通过公认的方法，包括PCR扩增，并可利用示例性引物包括正向引物5’-GGTGGTGTAAGCGGTACCCT-3’ (SEQ ID NO: 23)、反向引物5’-ACCTGCCCAGGCCAAGATGC-3’ (SEQ ID NO: 24)，接着是测序。
本发明包括通过检测PGRN的存在或活性和量，诊断或评估动物的溶酶体贮积病的试剂盒，其包含：(a) 预定量的PGRN的可检测标记的、特异性结合的配偶体或针对PGRN的抗体；(b)其它试剂；和(c) 所述试剂盒的使用说明。
在一方面，本发明包括通过检测PGRN突变在所述动物中的存在，诊断或评估动物的溶酶体贮积病的试剂盒，其包含：(a) 对PGRN基因或编码DNA具有特异性的或针对PGRN基因或编码DNA的一种或多种核酸探针或引物；(b)其它试剂；和(c) 所述试剂盒的使用说明。提供试剂盒的一方面，其中一种或多种核酸引物或探针对检测或测定PGRN突变rs4792937、rs850713、rs78403836、rs5848，和点突变，p.C315S、p.E316Q，和p.P365A的一种或多种是特异性的或适合于检测或测定PGRN突变rs4792937、rs850713、rs78403836、rs5848，和点突变，p.C315S、p.E316Q，和p.P365A的一种或多种。
本发明的试剂盒还可包含针对GBA的抗体的可检测标记的特异性结合配偶体或针对GBA的抗体，或对GBA基因或者编码DNA有特异性或针对GBA基因或者编码DNA的一种或多种核酸探针或引物。
在本发明的测定、诊断方法或试剂盒中，控制量的PGRN、PGRN肽、atsttrin、GBA，或其抗体等可制备并用酶、特异性结合配偶体和/或放射性元素标记，然后可引入细胞样品中。在标记的材料或其结合配偶体有机会与样品内的位点反应后，由此产生的质量可通过已知技术检查，其可随着所附标记的性质变化。在使用放射性标记，例如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I，和186Re的情况下，目前已知的可获得的计数程序可以被利用。在其中标记是酶的情况下，检测可通过本领域已知的任何目前使用的比色法、分光光度法、荧光分光光度法、电流测量技术或气体定量分析技术完成。
本发明提供一种用于戈谢病的动物模型，其中动物包含改变的PGRN，其中PGRN是无效、缺乏或突变的和溶酶体底物β-GlcCer在巨噬细胞中是增加的。动物模型可另外包含与戈谢病相关的GBA突变或其中GBA是无效或缺乏的。
本发明包括通过模拟PGRN或PGRN肽的活性，筛选有效调节溶酶体酶运输和/或溶酶体底物积聚的潜在药物或化合物的测定系统。这个方面包括以与PGRN和atsttrin肽类似的方式，筛选有效调节溶酶体酶运输和/或溶酶体底物积聚的另外的活性PGRN片段、颗粒体蛋白/接头单元组合、衍生物、变体和氨基酸修饰的测定。在一个例子中，将试验药物或化合物给予含有GBA的细胞样品，以通过与对照(包括其中对照是PGRN、活性PGRN肽、atsttrin)的比较，测定试验药物或化合物对β-GlcCer积聚的影响。
其它目的和优点在本领域技术人员考查参考以下说明性附图进行的以下描述后将变得显而易见。
附图简述
图1描述涉及溶酶体贮积病(LSD)的鞘糖脂的途径。鞘糖脂代谢是由多种酶介导的过程。酶功能不全导致相应的底物在溶酶体中的积聚。戈谢病，最常见的LSD，由葡糖脑苷脂酶(GBA)突变引起。GBA的突变导致GBA底物，β-葡糖苷脂酰鞘氨醇(β-GlcCer)在巨噬细胞中的积聚。
图2A-2D. OVA-攻击的PGRN KO小鼠发展为戈谢病。WT和PGRN KO小鼠在第1和15天接受I.P.注射OVA，接着在第29天经1% OVA鼻内攻击，1周3次，持续4周。(A) H&E染色在雄性和雌性PGRN KO小鼠的肺中均显示巨大戈谢细胞，特别是在OVA处理后(n=10，每组5只雄性和5只雌性)。(B) 戈谢细胞在WT和PGRN KO小鼠(对照和OVA攻击的)中的定量. (C) 得自WT和PGRN KO小鼠(对照和OVA攻击的)肺的PAS染色。结果表明糖脂在PGRN KO小鼠的戈谢细胞中积聚。(D) 从得自WT和PGRN KO小鼠(对照和OVA攻击的)支气管肺泡灌洗液分离的细胞的流式细胞术。在OVA处理后的PGRN KO小鼠中存在巨大巨噬细胞亚群，如由CD11b +FSC高所证实的。
图3. 经透射电子显微镜(EM)测定，来自PGRN KO小鼠的巨噬细胞比WT小鼠的巨噬细胞大得多，且溶酶体变成管状形状，而不是规则的圆形形状(左上和左下：2650 X；右上：11500 X，右下：7100 X)。
图4. β-GlcCer积聚在PGRN KO小鼠中。使来自WT和PGRN KO小鼠的肺组织，有或没有OVA攻击，进行细胞溶解并将每个样品的1mg蛋白用于脂质组成分析。对具有不同碳链长度的β-GlcCer的水平(pmol/m蛋白)作图，如所指明的。
图5A-5D. (A) 伊米苷酶减轻脂质在PGRN KO小鼠中的积聚。OVA-攻击的PGRN KO小鼠用伊米苷酶(60u/kg)治疗，1周1次，从第一次用1% OVA鼻内攻击的那一周开始。肺组织的H&E和PAS染色(对于每组n=6). (B) 伊米苷酶治疗减少β-GlcCer在OVA-攻击的PGRN KO小鼠中的积聚。对得自用媒介(OVA)或伊米苷酶(Imig.)治疗的OVA-未攻击的(Ctrl)、OVA-攻击的PGRN KO小鼠的肺组织进行处理并如在图4中所述分析。(C) 在用或未用伊米苷酶治疗的PGRN KO小鼠中戈谢细胞的定量. (D) 由OVA攻击诱导的, 用或未用伊米苷酶治疗的PGRN KO小鼠的肝和脾大小。肝和脾二者在伊米苷酶治疗后显著减小。采用单因素ANOVA检验以比较各组间的均值(* p<0.05；** p<0.01，双侧)。
图6A-6C. 年老的PGRN裸鼠自发地发展为戈谢病。处死无任何攻击的1岁龄的WT和PGRN KO小鼠并收集肺、脾、肝，和骨髓以供组织学分析。(A) 年老的PGRN KO小鼠产生肝脾肿大。肝和脾重量除以动物总体重对WT和KO小鼠(每组n=8)作图。(B) 肺、脾和骨髓的组织学。戈谢细胞被发现于PGRN KO小鼠的肺、脾，和骨髓中，但不在WT小鼠中。(C) 骨髓的PAS染色表明戈谢细胞中的糖脂贮积。
图7A-7B. (A) WT和PGRN KO小鼠的骨髓的组织学，BM在PGRN KO中被脂肪组织替代，但不在WT小鼠中。(B) 在EM下的戈谢细胞。典型的管状溶酶体被发现在PGRN KO小鼠的肺和骨髓中。采用非-配对学生T-检验以比较WT和PGRN KO小鼠之间的肝尺寸和脾尺寸(* p<0.05)。
图8A-8C. rPGRN在体外和体内救济GD表型。(A) β-GlcCer积聚在PGRN-缺乏的BMDM中。得自WT和PGRN KO小鼠的BMDM用5和50µg/ml的脂质混合物处理10天。β-GlcCer的积聚通过免疫荧光染色，用针对β-GlcCer的特异性抗体检测并用共聚焦显微镜观察。(B)rPGRN以剂量依赖性方式防止β-GlcCer积聚在PGRN KO BMDM中。在各个量的PGRN存在下，如所指明的用脂质混合物，或伊米苷酶(Imig, 160mU/ml，用作阳性对照)处理来自PGRN KO小鼠的BMDM 10天。β-GlcCer经免疫荧光染色并呈现代表性图像。(C) β-GlcCer积聚的定量。选择10个单独的图，如在小图B中所示，并用图像J软件测量荧光强度。数据表示为从3次独立的实验获得的均值。
图9. rPGRN防止GBA聚集和β-GlcCer积聚在GD患者的成纤维细胞中。得自II型GD患者的成纤维细胞在rPGRN的存在或不存在下，用脂质混合物处理2天，而GBA (绿色)和β-GlcCer (红色)的水平通过免疫荧光染色，用它们的特异性抗体测量，核用DAPI染色，并用共聚焦显微镜获取图像。
图10A-10C.(A) rPGRN防止GD在OVA-攻击的PGRN裸鼠中发展。PGRN KO小鼠用OVA攻击，并用PBS或rPGRN (4mg/kg)治疗，1周1次，从第一次用OVA鼻内攻击的那一周开始(每组n=6)。肺组织的H&E染色揭示，rPGRN极大的降低戈谢细胞的形成。(B) 得自未处理的、OVA-处理的，和OVA+PGRN处理的PGRN KO小鼠的戈谢细胞数的定量. (C) 得自未处理的、OVA-处理的，和OVA+PGRN处理的PGRN KO小鼠的戈谢细胞大小的量化。采用单因素ANOVA以比较多个组间的均值(* p<0.05；** p<0.01；两侧)。
图11A-11C. 需要PGRN以递送GBA和LIMP2至溶酶体。(A) GBA酶活性在PGRN KO对比WT小鼠中未有变化。使得自WT和PGRN KO小鼠的肺组织在或者PBS或者OVA攻击后溶胞，并且GBA活性通过裂解其底物4 MUGP测量。(B) 在PBS和OVA攻击后，在KO对比WT小鼠中，GBA蛋白水平未降低，事实上还略有增加。肺组织被溶胞，而GBA的水平用蛋白质印迹法测量。(C)GBA的分布，而不是GLA的分布，在PGRN KO巨噬细胞中改变。石蜡-包埋的肺切片通过免疫组织化学，用GBA或GLA抗体染色。GBA在PGRN KO巨噬细胞中的聚集用箭头指示。
图12A-12C. (A) GBA的分布改变，伴有β-GlcCer在PGRN KO小鼠中的积聚。来自OVA-攻击的WT和PGRN KO小鼠的肺组织的冷冻切片通过免疫荧光，用GBA和β-GlcCer抗体染色。GBA的聚集用箭头指示。(B) GBA在PGRN无效的巨噬细胞的细胞质中的聚集，通过肺组织的免疫金标记测定。GBA在WT巨噬细胞的溶酶体中表达，用箭头指示(左小图53,000 X)，而GBA在管状溶酶体中缺乏，和GBA在PGRN KO小鼠的巨噬细胞中聚集(右小图，25,000 X)。更密集的免疫金标记的聚集区用虚线环绕。(C) 用基于活性的探针MDW933测定，未能在PGRN缺乏的巨噬细胞中检测到溶酶体GBA。得自用脂质混合物预刺激的的WT和PGRN KO小鼠的BMDMs用50nM MDW933标记2小时，接着固定并DAPI染色，在共聚焦显微镜下拍摄图像。
图13A-13D. (A) LIMP2和LAMP2在来自WT和PGRN KO小鼠的巨噬细胞中的表达。得自WT和PGRN KO小鼠的石蜡-包埋的肺切片通过免疫组织化学，用LIMP2和LAMP2染色。LIMP2在PGRN KO巨噬细胞中的聚集用箭头指示。(B) LIMP2用肺组织的免疫金标记测定，在溶酶体中未能检出，而在PGRN无效的巨噬细胞的细胞质中聚集。LIMP2在WT巨噬细胞的溶酶体中检出，用箭头指示(左小图，53,000X)，而它在PGRN无效的巨噬细胞的细胞质中聚集，但未在管状溶酶体中观察到(右小图31,000X)。更密集的免疫金标记的聚集区用虚线环绕。(C) 聚集的GBA和聚集的LIMP2共同定位于PGRN KO巨噬细胞中。WT和PGRN KO小鼠的肺组织的冷冻切片用GBA和LIMP2抗体染色，GBA和LIMP2的分布通过免疫荧光染色测定并用共聚焦显微镜摄像。聚集区用箭头指示。(D) 在不存在PGRN时，经免疫共沉淀法(Co-IP)测定的，GBA体内结合于LIMP2。使来自WT和PGRN KO两种小鼠的肺组织溶胞，而蛋白复合物用抗-GBA抗体免疫沉淀并用抗-LIMP2抗体检测。
图14A-14C. PGRN通过分子途径介导GBA的溶酶体递送。(A) 经免疫共沉淀法(Co-IP)测定，PGRN在体内结合于GBA。使得自WT小鼠的肺组织溶胞，而蛋白复合物用抗-GBA抗体免疫沉淀并用抗-PGRN抗体检测。(B) 经固相结合测定，PGRN体外直接结合于GBA。不同量的PGRN被包被，并加入生物素-标记的BSA和GBA，接着加入HRP-标记的链霉抗生物素及其底物。(C) 经表面等离子体共振(SPR)与COOH1芯片测定，PGRN以0.71nM KD的高亲和力结合于GBA。
图15A-15D. (A) 用来鉴定涉及PGRN-介导的GBA递送至溶酶体，即PGRN-依赖的GBA相关蛋白的潜在分子的方法方案。免疫沉淀用来自WT和PGRN KO两种小鼠的GBA抗体进行，接着进行高灵敏度质谱。(B) 从WT和PGRN KO两种小鼠分离的击中和HSP70-介导的运输作为PGRN-依赖的GBA-相关途径的鉴定的总结. (C) GBA结合于HSP70是PGRN-依赖的。免疫沉淀用抗-GBA抗体在WT和PGRN KO小鼠中进行，并用HSP70抗体探查。(D) rPGRN恢复PGRN缺乏小鼠体内的GBA和HSP70之间的相互作用。从OVA-未攻击的(Ctrl)、OVA-攻击的(用或未用rPGRN处理的) PGRN KO小鼠制备的肺组织溶胞产物用抗-GBA抗体进行免疫沉淀，而HSP70在免疫沉淀复合物中的存在用HSP70抗体探查。
图16A-16D. (A) PGRN和HSP70经由siRNA方法的抑制显著地减少了巨噬细胞中的溶酶体GBA。RAW264.7巨噬细胞用特异性地针对PGRN或HSP70的siRNA转染，和用脂质混合物预刺激的细胞用MDW933探针标记2小时，并通过免疫荧光染色测定PGRN和HSP70的表达水平。用相应的siRNA转染的细胞用箭头指示。(B) LIMP2与HSP70的结合也是PGRN-依赖的。免疫沉淀用抗-HSP70抗体在WT和PGRN KO小鼠中进行，并用LIMP2抗体探测。(C) GBA，而不是GLA，与选蛋白的结合是PGRN-依赖的。免疫沉淀反应用抗-选蛋白抗体在WT和PGRN KO小鼠中进行，并用或者GBA或者GLA抗体检测。(D) HSP70与选蛋白的结合也是PGRN-依赖的。免疫沉淀用抗-HSP70抗体在WT和PGRN KO小鼠中进行，并用选蛋白抗体检测。
图17描述了解释PGRN在介导GBA/LIMP2通过HSP70蛋白伴侣通路的溶酶体递送中的作用的建议模型。Co代表辅蛋白伴侣。
图18A-18B. 来自OVA-攻击的WT和PGRN KO小鼠肺组织的透射电子显微镜测定.(A) 图3左下小图的彩色和放大图像. 管状溶酶体和线粒体分别以紫色和橙色显示(为从原来的黑白电子显微镜图像创建这种彩色图像，感谢NYU医学院OCS显微镜中心(NYUMedical School OCS Microscopy Core)的Chris Petzold和Kristen Dancel)。(B) 溶酶体在PGRN无效的巨噬细胞中的转化. 1，溶酶体显示与物质贮积的积聚有关的拉长轮廓(19,500 X)；2，溶酶体成为在溶酶体中同时具有高密度与低密度材料的弯曲形状(19,500X)；3，溶酶体最终成为同时具有高密度和低密度两种材料贮积的管状结构(19,500 X)；4，低密度材料最终被具有完整的膜结构的高密度材料替代(110,000 X)。
图19A-19B. (A) 线粒体和内质网在PGRN无效的巨噬细胞中是正常的。得自OVA-攻击的WT和PGRN KO小鼠的肺组织在透射电子显微镜下检查。得自WT (11500x)和PGRN KO(31000x)的线粒体(Mit.)，和得自WT的内质网(ER) (4400x)和PGRN KO巨噬细胞(7100 X)显得正常。(B) 1和2型肺细胞在PGRN无效的鼠中是正常的。在透射电子显微镜下检查得自OVA-攻击的WT和PGRN KO小鼠的肺组织。得自WT和PGRN KO小鼠的1型和2两种肺细胞显得正常(所有图像放大3400x，除了得自PGRN KO的1型肺细胞放大2650x)。
图20A-20C. PGRN KO小鼠和GD患者的组织和血浆中的脂质组成分析. 二酰甘油(DAG) (A)、神经鞘磷脂(SM) (B)，和神经酰胺(C)的水平在得自OVA-攻击的PGRN KO小鼠的肺组织中与OVA-攻击的WT小鼠比较没有增加。DAG、SM，和神经酰胺在用和不用卵清蛋白(OVA)攻击的野生型和PGRN KO动物中的水平被测量，且DAG、SM，和神经酰胺的水平被表示为pmol/mg蛋白。
图21A-21D. 葡糖苷脂酰鞘氨醇(GlcCer)和葡糖基鞘氨醇(GlcSph)在健康对照者(Ctrl)和GD患者的成纤维细胞和血浆中的水平。GlcCer的水平在GD成纤维细胞(A)但不在GD血浆(B)中显著增加，而GlcSph的水平在GD血浆(D)但不在GD成纤维细胞(C)中增加。
图22A-22C. (A) GlcCer在OVA-攻击的PGRN KO小鼠的血浆中的水平与OVA-攻击的WT小鼠比较未有升高。(B-C) GlcSph在OVA-攻击的PGRN KO小鼠的肺组织(B)和血浆(C)中的水平与OVA-攻击的WT小鼠比较有升高。
图23A-23C. GlcCer在血浆(A)、肺(B)和脾(C)中的水平在变老的PGRN KO小鼠中增加。处死3个月-、9个月-，和15个月-龄的PGRN KO小鼠(对于每组n=6)，并将血浆、肺和脾用于测量的β-GlcCer。独立的学生-T检验和单因素ANOVA被用于统计学分析(*p<0.05；**p<0.01；双侧)。
图24A-24H. 年老的PGRN KO小鼠发展长骨骨质减少。处死1岁龄的WT和PGRN KO小鼠并对每只小鼠的两个股骨切片，一个用于骨组织学，而另一个用于显微-CT。(A) WT和PGRN KO股骨的纵向切片用H&E染色。骨小梁骨厚度和连通性在PGRN KO股骨中下降。比例尺代表0.5 mm。(B) 来自年老WT和PGRN KO股骨的股骨三维显微-CT重建的代表性图像. WT和KO小鼠股骨近端的次级骨松质中3-D骨小梁结构参数的直方图：BV/TV = 骨体积/总体积(C)；TbN = 骨小梁数(D)；Tb.Th = 骨小梁厚度(E)；TbSp = 骨小梁分离度(F)。皮层厚度(Crt.Th) (G)。(H) 全身骨矿物质密度(BMD)，如通过双能x-线吸收测量仪扫描评估的。
图25A-25C. 年老的PGRN KO小鼠在脊骨中发展骨质减少症。对得自年老的WT和PGRN KO小鼠的腰椎切片以供显微-CT分析。(A) 得自WT和PGRN KO小鼠的L4椎体的图像表明骨矿物质密度减少。骨体积(B)和骨小梁骨厚度(C)在PGRN KO小鼠中显著降低。数据表示为均值 ± S.D. (每组n=8)；独立的学生-T检验和单因素ANOVA被用于统计学分析(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001 对比WT组；双侧)
图26. 巨大巨噬细胞被发现于用脂质处理的PGRN-缺乏的BMDM中。从WT和PGRN KO小鼠分离BMDM并分化，细胞用5和50µg/ml的脂质混合物处理10天。培养的BMDM的H&E染色。在脂质处理后，巨大BMDM存在于PGRN KO小鼠中。
图27. PGRN逆转脂质-诱导的PGRN无效的BMDM的形态学改变。从PGRN KO小鼠分离BMDM并在体外分化5天。然后BMDM用50 µg/ml脂质混合物单独或与不同的剂量的重组PGRN(0.1、0.4 µg/ml)一起处理10天，每三天补充细胞培养基。细胞形态学在相差显微镜下观察。
图28. 选蛋白的分布在PGRN无效的巨噬细胞中是正常的。PGRN KO小鼠用OVA攻击，固定肺并经处理用于透射电子显微镜。选蛋白的表达用选蛋白抗体，接着用金-标记第二抗体染色。选蛋白的分布在PGRN KO小鼠的戈谢细胞中是正常的，主要在管状溶酶体表达(上小图)，而有些在细胞表面上表达以介导内吞作用(下小图)。
图29.rPGRN通过内吞作用被有效地吸收到BMDMs中，而阻断已知的PGRN's信号途径，包括ERK、PI3K和mTOR，不影响rPGRN's对β-GlcCer清除的作用。rPGRN在PGRN无效的BMDMs中的内吞作用。如在材料和方法中所述，使来自PGRN KO小鼠的BMDMs分化5天。将rPGRN在如指定的不同的时间点，以5µg/ml的最终浓度加入培养基中。在每个时间点结束时立即固定细胞。rPGRN的吸收和分布如所指定的，用PGRN抗体和针对不同分子的抗体通过免疫荧光染色检查。在第一排的图像表明rPGRN单独的内吞作用，而第2、3、4和第5排的图像揭示了吸收的rPGRN分别和EEA1、GBA、LIMP2，和LAMP2之间的共定位。
图30.rPGRN对β-GlcCer清除的影响独立于ERK、PI3K和mTOR信号传导途径。在存在或不存在0.4 µg/ml rPGRN蛋白时，如所指示的有或没有ERK、PI3K和mTOR途径的激酶抑制剂，用脂质混合物(5 µg/ml)刺激WT和PGRN KO BMDMs 2天。细胞用MDW933标记2小时，然后细胞用DAPI-介质固定并封固。MDW933-标记的溶酶体GBA通过共聚焦显微镜下的绿色荧光的强度观察，而β-GlcCer的积聚，经免疫荧光染色用β-GlcCer抗体(红色)染色。
图31. GBA和PGRN在巨噬细胞的胞内运输隔室中的共定位。固定得自WT小鼠的BMDMs，PGRN和GBA的表达，以及用于运输隔室的标记物用各自的特异性第一抗体，接着用不同荧光染料标记的相应的第二抗体检测。PGRN用山羊抗-小鼠PGRN第一抗体和用Alexa-488标记的第二抗体染色(a-f)，GBA用兔抗-小鼠第一抗体，接着用Cy3-标记第二抗体染色(g-l)，以及用于运输隔室的标记物(Calregulin、GM130、TGN38、EEA1、LIMP2，和LAMP2)用相应的源自小鼠的第一抗体，并接着用Alexa-647标记的第二抗体染色(m-r)。小图s-x是4-色染色的合并图像。用DAPI (蓝色)对核染色。
图32. pH对GBA结合于PGRN的影响. (a) GBA和PGRN之间在如所指定的各个pH下的直接相互作用，通过SensiQ Technologies Inc的SPR，使用COOHV1芯片检测。(b) 测定pH对动力学结合值的影响。
图33A-33B.rPGRN对在得自各种LSDs的成纤维细胞中的患病溶酶体的影响。来自健康对照和不同的LSDs的成纤维细胞用rPGRN蛋白(0.4 µg/ml)处理，有或没有脂质刺激。溶酶体经Lysotracker (溶酶体荧光探针)可视化(A)。(B) PGRN显著地纠正I和II型GD、泰-萨二氏病、法韦尔病，和粘脂质贮积病III型(有或没有脂质刺激)中改变的溶酶体。
图34A-34B.PGRN使在III型GD、III和VI型粘多糖贮积病(MPS) (仅在脂质刺激的存在下)中患病的溶酶体正常化。
图35A-35B.PGRN未能恢复B型尼曼-皮克病(NPD B)、法布里病，和IV型粘脂质贮积病(ML) (有或没有脂质刺激)中的溶酶体。10种细胞随机选自每一个样品，而各细胞荧光强度用图像J软件量化。数据表示为从3次独立的实验获得的均值。统计学意义使用单因素ANOVA测试(* p<0.05，** p<0.01，双侧)。
图36A-36C. GD患者降低PGRN的血清水平，而GRN变体在GD患者中鉴定。(A) PGRN的血清水平在GD患者中显著降低。得自115个GD患者、44个来自普通人群(GP)的健康对照者，和55个来自德系犹太人(AJ)的健康对照者的PGRN的血清水平通过ELISA测量。与GP的健康对照者(164.99 ±43.16 ng/ml)，和AJ的健康对照者(150.64 ±33.9 ng/ml)比较，GD患者具有显著更低水平的PGRN (96.65 ± 53.45 ng/ml)。使用单因素ANOVA测试统计学意义(p<0.0001)。(B) 40个GD患者的GRN基因变体的概括. 40个GD患者的基因组DNA被用来通过高-保真PCR扩增覆盖1-kb启动子区和8-kb全长GRN基因的9-kb GRN基因DNA片段。DNA测序由耶鲁大学的基因组研究室(Genomic facility at Yale University)的PacBio RS II测序系统(PacBio RS II Sequencing System)进行。4个SNP位点和3个点突变GD患者中鉴定。(C) 一幅显示GRN基因中鉴定的GRN变体的位置的图。
图37.在OVA攻击后，HexA，但不是HexB，聚集于PGRN KO小鼠中。在OVA攻击后，来自WT和PGRN KO小鼠的肺组织通过免疫组织化学，用HexA和HexB染色。结果表明HexA，而不是HexB，聚集于PGRN KO小鼠中。
图38. 年老的PGRN KO小鼠在脑中具有升高的GM2表达。得自年老的WT和PGRN KO小鼠的脑组织通过免疫组织化学，用GM2抗体染色。
图39描述PGRN和Atsttrin，PGRN-衍生的基因工程蛋白，救济β-GlcCer在PGRN KO巨噬细胞中的积聚。得自PGRN KO小鼠的BMDM以50µg/ml脂质给予，持续10天, 伴有或不伴有各个量的PGRN或Atsttrin，如所指定的(100 ng/ml和400 ng/ml PGRN或Atsttrin)。在光学显微镜(LM)下，在脂质处理后，BMDM变得模糊混乱状，而这种形态的变化由PGRN和Atsttrin二者以剂量-依赖性方式被部分救济(上小图)。用脂质处理会积聚β-GlcCer，而所述积聚通过以剂量-依赖性方式加入重组PGRN或atsttrin来阻断。
图40表明PGRN和Atsttrin救济β-GlcCer在得自GD患者的成纤维细胞中的积聚。成纤维细胞从II型GD患者中分离并用50 µg/ml脂质混合物处理2天。GBA和β-GlcCer的表达通过免疫荧光染色测量，而图像用共聚焦显微镜获得。脂质处理显著地诱导GBA聚集和β-GlcCer在GD成纤维细胞中的积聚。400ng/ml PGRN处理几乎完全防止GBA聚集和β-GlcCer贮积。Atsttrin显示有些作用，但不如PGRN。
图41表明Atsttrin以剂量-依赖的方式救济β-GlcCer在来自用脂质治疗的GD患者的成纤维细胞中的积聚。来自GD患者的成纤维细胞用50 µg/ml脂质混合物与如所指示的不同量的Atsttrin (0、0.5、5和50 ug/ml Atsttrin)一起处理。显示对于β-GlcCer的免疫荧光染色。Atsttrin以剂量-依赖的方式救济β-GlcCer的积聚，特别是在50 µg/ml时有效。
图42.PGRN和Atsttrin具有治疗戈谢病的治疗作用。8周龄的PGRN KO小鼠通过如前所述用OVA攻击来诱导戈谢病。一些组的小鼠经I.P注射重组PGRN蛋白、BSA，和Atsttrin(4 mg/kg/周)，持续4周(每组n=8)。(A) 肺组织的组织学变化通过H&E染色检查。(B) 戈谢细胞数的定量. (C) 戈谢细胞大小的定量. (** p<0.01)
图43. 可用PGRN和Atsttrin二者处理的LSD成纤维细胞。LSD成纤维细胞用脂质单独或用重组PGRN或atsttrin (0.4 µg/ml)分别攻击24小时。溶酶体用溶酶体红色荧光探针(lysotracker-red)染色。在共聚焦显微镜下，对每个样品随机拍摄10幅图像，而溶酶体贮积根据荧光强度，用图像J软件量化。GDI、GDII：戈谢病I和II；TSD：泰-萨二氏病；MLIII：粘脂质贮积病III。(** p<0.01)
图44. 可用PGRN和Atsttrin二者处理的LSD成纤维细胞。LSD成纤维细胞用脂质单独或用重组PGRN或atsttrin (0.4 µg/ml)分别攻击24小时。溶酶体用溶酶体红色荧光探针染色。在共聚焦显微镜下，对每个样品随机拍摄10幅图像，而溶酶体贮积根据荧光强度，用图像J软件量化。MPSII、MPSIII、MPSVI：粘多糖贮积病II、III、VI型；MLD：异染性脑白质营养不良；FD：法韦尔病。(** p<0.01)
图45.PGRN，但不是Atsttrin在脂质攻击后，救济溶酶体在GD III中的贮积。来自GDIII的成纤维细胞用脂质单独或用重组PGRN或atsttrin (0.4 µg/ml)分别攻击24小时。溶酶体用溶酶体红色荧光探针染色。在共聚焦显微镜下，对每个样品随机拍摄10幅图像，而溶酶体贮积根据荧光强度，用图像J软件量化。(** p<0.01)
图46.对PGRN和Atsttrin二者显示减少溶酶体贮积的最小作用的LSD成纤维细胞。LSD成纤维细胞用脂质单独或用重组PGRN或atsttrin (0.4 µg/ml)分别攻击24小时。溶酶体用溶酶体红色荧光探针染色。在共聚焦显微镜下，对每个样品随机拍摄10幅图像，而溶酶体贮积根据荧光强度，用图像J软件量化。ML：粘脂质贮积病；MPS：粘多糖贮积病；NPD：尼曼-皮克病。
图47.PGRN和Atsttrin救济克拉伯病中的溶酶体贮积。得自克拉伯病的成纤维细胞用脂质单独或用重组PGRN或atsttrin (0.4 µg/ml)分别攻击24小时。溶酶体用溶酶体红色荧光探针染色，和在共聚焦显微镜下拍摄10幅图像。
图48描述PGRN蛋白结构，其中示出了颗粒体蛋白单元。
图49A和49B描述(A) 人PGRN (SEQ ID NO: 2)和(B) 小鼠PGRN (SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列。在(B)中，颗粒体蛋白单元GrnA, GrnC, GrnD和GrnE在每个单元都加下划线并注明。
图50描述atsttrin肽(½F+P3+P4+½A+P5+½C)的序列(SEQ ID NO: 4)，和各个其它PGRN肽的序列(SEQ ID NOS: 5-9)。
图51提供8kb PGRN人基因核酸序列(SEQ ID NO: 10)。PGRN mRNA在核苷酸101开始。
详细描述
根据本发明，有可能采用本领域技术人员能力范围内的传统的分子生物学、微生物学，和重组DNA技术。这样的技术在文献中有完整的解释。参见，例如，Sambrook et al, "分子克隆：实验室指南(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)" (1989)；"分子生物学的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)" I-III册[Ausubel, R. M., ed.(1994)]；"细胞生物学：实验室手册(Cell Biology: A Laboratory Handbook)" I-III册[J. E. Celis, ed. (1994))]；"免疫学的通用方案" I-III册[Coligan, J. E., ed.(1994)]；"寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)" (M.J. Gait ed. 1984)；"核酸杂交" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]；"转录和翻译(Transcription andTranslation)" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]；"动物细胞培养(AnimalCell Culture)" [R.I. Freshney, ed. (1986)]；"固定化细胞和酶(Immobilized CellsAnd Enzymes)" [IRL Press, (1986)]；B. Perbal, "分子克隆的实践指导(A PracticalGuide To Molecular Cloning)" (1984)。
因此，如果在本文中出现，以下术语应具有下文示出的定义。
术语“颗粒蛋白前体”、“PGRN”、“颗粒体蛋白-上皮肽前体”、“GEP”、“PC-细胞-衍生的生长因子”、“PCDGF”、“上皮肽前体”、“颗粒蛋白前体重组蛋白(acrogranin)”，和“GP80”和任何没有特别地列出的变体，可在本文互换使用，并且如贯穿本申请和权利要求书所用的，指包含单个或多个蛋白，及其活性片段的蛋白质材料，并扩展至具有本文描述的和在图49中示出的，包括如在SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3中示出的氨基酸序列数据，和在本文和在权利要求书中示出的活性特征的那些蛋白。因此，显示实质上相当或改变的活性的蛋白也同样被考虑。这些修饰可以是精心设计的，例如，通过定点突变获得的修饰，或可能是偶然的，如通过在为复合物或其指定的亚单位的生产者的宿主中的突变获得的那些修饰。同样，术语“颗粒蛋白前体”、“PGRN”、“颗粒体蛋白-上皮肽前体”、“GEP”、“PC-细胞-衍生的生长因子”, “PCDGF”, “上皮肽前体”、“颗粒蛋白前体重组蛋白(acrogranin)”，和“GP80”意欲包括在它们范围内的本文特别叙述的蛋白以及所有基本上同源的类似物和等位基因变异。
术语“颗粒体蛋白”、“上皮肽”或任何“颗粒体蛋白A-E”，“GrnA”、“GrnB”、“GrnC”、“GrnD”、“GrnE”指特别是富含半胱氨酸的大小约6kDa的基序，包括包含或具有序列基序CX 5–6CX 5CCX 8CCX 6CCXDX 2HCCPX 4CX 5–6C (SEQ ID NO: 1)，所述颗粒体蛋白可通过蛋白水解处理，从GEP多肽分子释放。这些颗粒体蛋白可保留生物学活性并在活性测定具有活性，包括在细胞生长测定、酶底物积聚测定、蛋白结合包括GBA、选蛋白和/或HSP70结合、GBA和/或其它溶酶体酶处理或递送至溶酶体，和对戈谢型细胞的评价中。颗粒体蛋白可提供PGRN的活性片段。示例性颗粒体蛋白序列包括具有本文描述的和在图49或50中示出的氨基酸序列数据的那些蛋白或其片段，以及在本文示出的活性特征。因此，显示实质上相当或改变的活性的蛋白同样也被考虑。这些修饰可以是精心设计的，例如，通过定点突变获得的修饰，或可能是偶然的，如通过在为复合物或其指定的亚单位的生产者的宿主中的突变获得的那些修饰。同样，术语“颗粒体蛋白”、“上皮肽”或任何“颗粒体蛋白A-E”、“GrnA”、“GrnB”、“GrnC”、“GrnD”、“GrnE”意欲包括在它们范围内的本文特别叙述的蛋白以及所有基本上同源的类似物和等位基因变异。
术语"Atsttrin"、"TNF/TNFR信号传导通过靶向TNF受体的拮抗剂"、"atsttrin肽"和未特别列出的任何变体，可在本文互换使用，并且如贯穿本申请和权利要求书所用的，指包含单个或多个蛋白，特别是从PGRN或PGRN的片段衍生的蛋白并扩展至具有本文描述的和在图50中示出的，并且还有在图48中图解说明的，和如在SEQ ID NO: 4中示出的氨基酸序列数据，和本文描述和示出的和在权利要求书中提供的活性和活性特征的那些蛋白。本文包括和提供在促进酶递送至溶酶体，和/或与溶酶体酶如葡糖脑苷脂酶(GBA)，或与选蛋白和/或HSP70结合或复合方面具有活性的活性PGRN肽。这些活性PGRN肽可保留生物学活性并在活性测定具有活性，包括在细胞生长测定、酶底物积聚测定、蛋白结合包括GBA、选蛋白和/或HSP70结合、GBA和/或其它溶酶体酶处理或递送至溶酶体，和对戈谢型细胞的评价中。人PGRN和小鼠PGRN的全长序列分别在图49A和49B中提供(SEQ ID NO: 2和3)。因此，本文涵盖从PGRN序列衍生的或包含PGRN序列，特别是包括Atsttrin或atsttrin衍生的序列，并具有结合溶酶体的活性和/或促进递送酶至溶酶体的活性的溶酶体酶结合肽，包括GBA-结合肽。这些atsttrin肽包括和涵盖所述肽的片段、变体，和衍生物。因此，显示实质上相等的活性的，和为其修饰体的蛋白同样也被考虑。这些修饰可以是精心设计的，例如，通过定点突变获得的修饰，或可能是偶然的，如通过在为复合物或其指定的亚单位的生产者的宿主中的突变获得的那些修饰。相应的小鼠或其它物种或与人atsttrin和活性PGRN肽序列直系同源的PGRN序列也进一步包括在内。同样，术语"Atsttrin"、"TNF/TNFR信号传导通过靶向TNF受体的拮抗剂"、"atsttrin肽"，意欲包括在它们范围内的本文特别叙述的蛋白以及所有基本上同源的类似物和等位基因变异。
本文描述的氨基酸残基优选呈现为"L"异构形式。然而，"D"异构形式中的残基可取代任何L-氨基酸残基，只要免疫球蛋白-结合的所需的功能特性被多肽保留。NH2指存在于多肽氨基末端的游离氨基。COOH指存在于多肽羧基末端的游离羧基。符合标准的多肽命名法，J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969)，氨基酸残基的缩写示于以下的对应表中：
应该注意到，所有氨基-酸残基序列在本文是由其左和右取向是在氨基-末端至羧基-末端的常规方向的式代表的。而且，应该注意到，在氨基酸残基序列的开始或结束时的破折号表示连接一个或多个氨基-酸残基的进一步序列的肽键。上表示出在本文可交替出现的3-字母和1-字母符号的相关关系。
"复制子"是任何遗传成分(如，质粒、染色体、病毒)，其作为体内DNA复制的自主单元发挥功能；即，能够在其自身的控制下复制。
"载体"是复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，另一DNA区段可连接于其上以使所附接区段复制。
"DNA分子"指脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶，或胞嘧啶)以其单链形式，或双链螺旋存在的聚合形式。这个术语仅指分子的一级和二级结构，并不限制其至任何特定的三级形式。因此，这个术语包括特别是在线性DNA分子(如，限制性片段)、病毒、质粒，和染色体中发现的双链DNA。在讨论特定的双链DNA分子的结构时，本文可根据只给出以5'-3'方向沿非转录的DNA链(即，具有与mRNA同源的序列的链)的序列的正常惯例描述序列。
"复制起点"指参与DNA合成的那些DNA序列。
DNA"编码序列"是当置于适当调节序列的控制下，被体内转录和翻译为多肽的双链DNA序列。编码序列的边界由在5' (氨基)末端的起始密码子和在3' (羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可包括，但不限于，原核序列，来自真核mRNA的cDNA，来自真核细胞(如，哺乳动物) DNA的基因组DNA序列，以及甚至合成的DNA序列。多聚腺苷酸化信号和转录终止序列将通常位于编码序列的3'。
转录和翻译控制序列是DNA调节序列，如启动子、增强子、多聚腺苷化信号、终止子等，其提供编码序列在宿主细胞中的表达。
"启动子序列"是能够在细胞中结合RNA聚合酶并启动下游(3'方向)编码序列的转录的DNA调节区。为了定义本发明的目的，启动子序列在其3'末端由转录起始位点界定并向上游(5'方向)延伸以包括在背景以上的可检测水平启动转录所必需的最小数目碱基或元件。在启动子序列内将发现转录起始位点(通过用核酸酶S1作图方便地限定)，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白结合域(共有序列)。真核启动子将经常，但并不总是包含"TATA"盒和"CAT"盒。原核启动子除了-10和-35共有序列外，还含有Shine-Dalgarno序列。
"表达控制序列"是控制和调节另一DNA序列的转录和翻译的DNA序列。当RNA聚合酶转录编码序列为mRNA时，编码序列是在细胞的转录和翻译控制序列"控制下"的，然后mRNA被翻译为由该编码序列编码的蛋白。
在编码序列之前，可包括"信号序列"。这种序列在多肽N-末端编码信号肽，其与宿主细胞通信以使多肽定向至细胞表面或分泌多肽进入媒介，而这种信号肽在蛋白离开细胞之前就被宿主细胞剪掉。发现信号序列可与原核生物和真核细胞的多种天然蛋白质相关。
如本文涉及本发明的探针所用的术语"寡核苷酸"，被定义为包含两个或更多个，优选地超过3个核糖核苷酸的分子。它的准确大小将取决于许多因素，其继而又取决于寡核苷酸的最终功能和用途。
如本文所用的术语"引物"指寡核苷酸，不管天然存在(如在纯化的限制性消化产物)还是合成产生，其在置于其中合成引物延伸产物(其与核酸链互补)被诱导的条件下，即在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶的存在下和在合适的温度和pH下，能够用作合成起点。引物可以是单链或者双链的并且必须足够长，以在诱导剂的存在下启动所需延伸产物的合成。引物的准确长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。例如，为了诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25或更多个核苷酸，尽管它可含有较少的核苷酸。
选择本文的引物以与特定靶DNA序列的不同链"基本上"互补。这意味着引物必须是充分互补的，以便与其各自的链杂交。因此，引物序列不需要反映模板的精确序列。例如，非-互补核苷酸片段可附接于引物的5'端，引物序列的其余部分与该链互补。或者，可将非-互补碱基或较长的序列间插到引物中，只要引物序列与所述链的序列具有充分互补性，以便与之杂交，从而形成用于合成延伸产物的模板。
如本文所用的，术语"限制性内切酶"和"限制性酶"指细菌酶，其各自在或接近特异性核苷酸序列而切割双链DNA。
当这样的DNA已被引入细胞内时，则细胞已被外源性或异源性DNA"转化"。转化DNA可以或可以不整合(共价连接)进入构成细胞基因组的染色体DNA中。在例如原核生物、酵母，和哺乳动物细胞中，转化DNA可维持在附加体成分如质粒上。至于真核细胞，稳定转化的细胞是其中转化DNA已被整合到染色体上的细胞，以便它被子细胞通过染色体复制而遗传。这种稳定性由真核细胞建立包含含有转化DNA的子细胞群的细胞系或克隆的能力证实。"克隆"是从单一细胞或共同的祖先经有丝分裂衍生的细胞群。"细胞系"是能够在体外稳定生长许多代的初级细胞的克隆。
当在限定长度的DNA序列内至少约75% (优选地至少约80%，和最优选地至少约90或95%)核苷酸匹配时，两个DNA序列是"基本上同源的"。通过使用序列数据库中可获得的标准软件比较序列，或在例如如对具体系统限定的严格条件下的DNA杂交实验中可鉴定基本上同源的序列。限定适宜的杂交条件是在本领域技术人员的能力范围内。参见，例如，Maniatis et al., supra；DNA Cloning, Vols. I & II, supra；Nucleic AcidHybridization, supra。
应理解，也在本发明的范围内的有编码PGRN (包括SEQ ID NO: 10)、PGRN-衍生的肽Atsttrin，或其它PGRN肽的DNA序列，包括或包含一种或多种颗粒体蛋白，其编码与PGRN或PGRN肽具有相同氨基酸序列的肽，包括如在图49或50和与其相关的SEQ ID NOs: 2、3和4-9的任何一个中示出的，但其简并为任何这样的序列。所谓"简并为"是意指不同的3-字母密码子被用来指定一个特定的氨基酸。本领域熟知以下密码子可以互换使用以编码每个特定氨基酸：
苯丙氨酸(Phe或F)　　UUU或UUC
亮氨酸(Leu或L)　　　UUA或UUG或CUU或CUC或CUA或CUG
异亮氨酸(Ile或I)　　AUU或AUC或AUA
甲硫氨酸(Met或M)　　AUG
缬氨酸(Val或V)　　　GUU或GUC of GUA或GUG
丝氨酸(Ser或S) 　UCU或UCC或UCA或UCG或AGU或AGC
脯氨酸(Pro或P)　　　CCU或CCC或CCA或CCG
苏氨酸(Thr或T)　　 ACU或ACC或ACA或ACG
丙氨酸(Ala或A)　 　GCU或GCG或GCA或GCG
酪氨酸(Tyr或Y)　 　UAU或UAC
组氨酸(His或H)　　 CAU或CAC
谷氨酰胺 (Gln或Q)　 CAA或CAG
天冬酰胺 (Asn或N) 　AAU或AAC
赖氨酸(Lys或K)　 　AAA或AAG
天冬氨酸(Asp或D)　　GAU或GAC
谷氨酸(Glu或E)　　　GAA或GAG
半胱氨酸(Cys或C)　　UGU或UGC
精氨酸(Arg或R)　 　CGU或CGC或CGA或CGG或AGA或AGG
甘氨酸(Gly或G)　　 GGU或GGC或GGA或GGG
色氨酸(Trp或W)　 　UGG
终止密码子　　　 UAA (ochre)或UAG (amber)或UGA (opal)
应该理解，上述规定的密码子针对RNA序列。DNA的相应的密码子具有取代U的T。
突变可在PGRN、PGRN-衍生的肽Atsttrin，或PGRN肽序列中进行，以致特定的密码子被改变为编码不同氨基酸的密码子。这样的突变一般通过使最少的核苷酸变化成为可能来进行。可进行这种取代突变，以非保守的方式(即，通过从属于具有特定大小或特征的氨基酸分组的氨基酸至属于另一个分组的氨基酸而改变密码子)或以保守的方式(即，通过从属于具有特定大小或特征的氨基酸分组的氨基酸至属于相同分组的氨基酸而改变密码子)改变生成的蛋白中的氨基酸。这种保守改变通常导致所生成蛋白的结构和功能的较少变化。非-保守改变更可能改变所生成蛋白的结构、活性或功能。本发明应该考虑包括含有保守改变的序列，其不显著地改变所生成蛋白的活性或结合特性。
以下是氨基酸基于它们的R基团的各个分组的一个实例：具有非极性R基团的氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸；具有不带电的极性R基团的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺, 谷氨酰胺；具有带电极性R基团的氨基酸：(在Ph 6.0时带负电)：天冬氨酸、谷氨酸；碱性氨基酸(在pH6.0时带正电)：赖氨酸、精氨酸、组氨酸(在pH 6.0)。另一个分组可以是具有苯基的那些氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸，和酪氨酸。另一个分组可以根据分子量(即，R基团的大小)：
甘氨酸　　　　　75
丙氨酸　　　　　89
丝氨酸　　　　　105
脯氨酸　　　　　115
缬氨酸　　　　　117
苏氨酸　　　　　119
半胱氨酸 　　　121
亮氨酸　　　　　131
异亮氨酸 　　131
天冬酰胺　 　132
天冬氨酸　　 133
谷氨酰胺　 　146
赖氨酸　　 　146
谷氨酸　　　 147
甲硫氨酸　　 　149
组氨酸(pH 6.0)　155
苯丙氨酸　　　 165
精氨酸　　　 　174
酪氨酸　　　 　181
色氨酸　　　 　204
特别优选的取代是：
- Lys取代Arg和反之亦可，以致可以维持正电荷
- Glu取代Asp和反之亦可，以致可以维持负电荷
- Ser取代Thr，以致游离的-OH可以维持；和
- Gln取代Asn，以致游离的NH2可以维持。
也可引入氨基酸取代，以取代为具有特别优选特性的氨基酸。例如，可引入Cys，作为与另一个Cys形成二硫桥的潜在位点。His可被引入作为"催化"位点(即，His可用作酸或碱并且是生物化学催化作用中的最常见氨基酸)。Pro可由于其特别平面结构而被引入，其诱导蛋白结构中的β-转角。
当至少约70%的氨基酸残基(优选地至少约80%，和最优选地至少约90或95%)是相同的，两个氨基酸序列是"基本上同源的"，或代表保守的取代。
DNA构建体的"异源的"区是较大DNA分子内的可识别DNA区段，其未被发现与自然界中的较大分子有关联。因此，当异源区编码哺乳动物基因时，所述基因将通常由源生物的基因组中不侧接哺乳动物基因组DNA的DNA侧接。异源的编码序列的另一个实例是其中编码序列本身在自然界不存在的构建体(例如，其中基因组编码序列含有内含子的cDNA，或具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。等位基因变异或天然存在的突变事件不产生本文定义的DNA异源区。
当表达控制序列控制和调节DNA序列的转录和翻译时，该DNA序列被"可操作地连接"于表达控制序列。术语"可操作地连接"包括使在DNA序列前面的适宜的起始信号(如，ATG)表达和维持正确的阅读框以允许在表达控制序列的控制下表达DNA序列并生产通过DNA序列编码的所需产物。如果需要插入重组DNA分子的基因不含有适宜的起始信号，这种起始信号可以插入到基因的前面。
术语"标准杂交条件"指对于杂交和洗涤二者基本上相当于5xSSC和65℃的盐和温度条件。然而，本领域技术人员将意识到，这样的"标准杂交条件"依赖于具体的条件包括缓冲液中钠和镁的浓度、核苷酸序列长度和浓度、错配百分率、甲酰胺百分率等。在确定"标准杂交条件"时也重要的是，两个序列杂交是RNA-RNA、DNA-DNA还是RNA-DNA。本领域技术人员根据众所周知的准则很容易确定这样的标准杂交条件，其中如果需要，杂交通常是低于预定或确定的Tm的10-20NC，伴有更高严格性的洗涤。
如本文所用的，"pg"意指皮克，"ng"意指毫微克，"ug"或"µg"意指微克，"mg"意指毫克，"ul"或"µl"意指微升，"ml"意指毫升，"l"意指升。
"抗体"是任何免疫球蛋白，包括抗体及其片段，其结合特异性表位。该术语涵盖多克隆、单克隆，和嵌合抗体，最后提到的进一步详细描述于美国专利号4,816,397和4,816,567中。
"抗体结合位点"是包含特异性地结合抗原的重链和轻链可变区和高可变区的抗体分子的结构部分。
本文所用的各种语法形式的短语"抗体分子"包括完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分二者。
示例性抗体分子是完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和含有抗原互补位的免疫球蛋白分子的那些部分，包括本领域已知的那些部分，如Fab、Fab'、F(ab')2和F(v)，所述部分对于用于本文描述的治疗方法是优选的。抗体分子的Fab和F(ab')2部分分别通过木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对基本上完整的抗体分子的水解反应，采用众所周知的方法制备。Fab'抗体分子部分也是众所周知的并由F(ab')2部分制备，接着用巯基乙醇还原连接两个重链部分的二硫键，接着用试剂如碘代乙酰胺使所生成蛋白硫醇烷基化。含有完整的抗体分子的抗体在本文是优选的。
各种语法形式的短语"单克隆抗体"指只有一种能够与特定的抗原进行免疫反应的抗体结合位点的抗体。因此单克隆抗体通常显示对任何与其进行免疫反应的抗原的单一结合亲和力。单克隆抗体可因此含有具有多个抗体结合位点的抗体分子，各自免疫特异性地针对不同的抗原；如，双特异性(嵌合)单克隆抗体。
短语"药学上可接受的"指当给予人时为生理学上可耐受的且通常不产生过敏或类似的不良反应，如胃不适、头晕等的分子实体和组合物。
术语“治疗有效量”意指将引起受试者的生物学、生理学、临床，或医学反应的药物、化合物、肽，或药剂的量，这样的反应是医生或其他临床医师寻求的。短语"治疗有效量"在本文用来包括足以预防，和优选地减少至少约30 %，更优选至少50 %，最优选至少90 %的在以下方面的临床意义上改变的量：靶细胞质量的S期活性，器官扩大，底物或蛋白的积聚，神经功能缺损或损伤，或可伴随其存在和活性的其它病理学特征例如，升高的血压、发热或白细胞计数、脾或肝肿大。
术语“预防(preventing)”或“防止”指在可被暴露于致病因子，或在疾病发作之前易患该疾病的受试者中减少获得或发展疾病或障碍的风险(即，使疾病的至少一个临床症状不出现)。
术语“预防(prophylaxis)”涉及并包括在术语“防止”中，且指措施或程序，其目的是预防，而不是治疗或治愈疾病。预防措施的非-限制性实例可包括给予疫苗；给予低分子量肝素至由于例如固定而有血栓形成风险的住院患者；和在访问疟疾是地方病，或感染疟疾的风险高的地理区域之前给予抗疟药如氯喹。
术语“溶剂合物”意指可用于本发明的化合物与一种或多种溶剂分子的物理缔合。这种物理缔合包含氢键。在某些例子中，溶剂合物将能够被分离，例如当一种或多种溶剂分子被纳入结晶固体的晶格中时。“溶剂合物”涵盖溶液-相和可分离的溶剂合物二者。代表性溶剂合物包括水合物、乙醇化物和甲醇化物。
术语“受试者”包括人和其它哺乳动物。
术语“治疗”或“医治”任何疾病或障碍，在一个实施方案中，指改善疾病或障碍(即，抑制疾病或减少其至少一个临床症状的表现、程度或严重性)。在另一个实施方案中，‘治疗’或‘处理’指改善至少一个物理参数，其可能不是受试者可辨别的。在还一个实施方案中，“治疗”或“医治”指调节疾病或障碍，或者是身体上(如，可辨别症状的稳定)，生理学上(如，物理参数的稳定)，或者二者。在一个进一步的实施方案中，“治疗”或“医治”涉及减慢疾病的进展。
术语“溶酶体贮积病”、“LSD”指不同种类的一组由未消化的或部分消化的大分子积聚为特征的疾病或障碍，其最终导致细胞功能障碍和临床异常。LSDs由一种或多种溶酶体酶的基因突变产生，导致酶底物在溶酶体中的积聚，最终可在许多情况下导致器官巨大症(Organomegaly)，结缔组织和眼病理学，和中枢神经系统功能障碍。溶酶体贮积病包括神经鞘脂贮积病、神经节苷脂贮积病、黏多糖贮积病、糖蛋白贮积病、粘脂贮积病。该术语包括，但不限于，选自以下的示例性疾病：戈谢病(GD)、泰-萨二氏病、法布里病、法韦尔病、桑德霍夫病、GM1神经节苷脂贮积病、克拉伯病、尼曼-皮克病(A型、B型、C型)、庞贝氏病、II型粘脂贮积病(黏多糖贮积病Ⅱ型)、IIIA型粘脂贮积病、婴儿游离唾液酸贮积病(ISSD)、溶酶体酸脂酶缺乏症、青少年氨基己糖苷酶A缺乏症、沃尔曼病和扎拉病。在一个特定的方面，优选的溶酶体贮积病是戈谢病，包括I型、II型和/或III型戈谢病。
术语“戈谢病”、“GD”指最常见溶酶体贮积病，戈谢病。戈谢病涉及神经鞘脂的功能障碍性代谢，通常由酶葡糖脑苷脂酶(GBA)的遗传缺陷产生。
本发明证实蛋白颗粒蛋白前体PGRN在溶酶体酶至溶酶体的转运中起着重要的和至关重要的作用。因此，PGRN，和PGRN-衍生的活性肽，包括atsttrin，在溶酶体贮积病和障碍中具有治疗、预防和诊断的用途和应用。PGRN在本文已显示结合于溶酶体酶，特别包括结合于半乳糖脑苷脂酶(GBA)。PGRN和特别是PGRN/溶酶体酶复合物，如PGRN/GBA复合物，结合于溶酶体/内体运输和分拣蛋白，包括选蛋白和HSP70。溶酶体贮积病，包括戈谢病，在不存在PGRN或具有突变PGRN时，例如在PGRN敲除(KO)动物中发展。超过70%的GD患者也具有PGRN的突变。因此，PGRN和PGRN-衍生的活性肽(包括atsrttrin)，可应用于诊断、改善和治疗溶酶体贮积病，包括戈谢病。
本发明包括PGRN、PGRN肽、atsttrin，和/或其活性衍生物在预防、治疗或减轻溶酶体贮积病或障碍(LSD)中的用途和应用。本发明包括PGRN、PGRN肽、atsttrin，和/或其衍生物在预防、治疗或减轻溶酶体贮积病，包括底物和/或分子在溶酶体中积聚的病症、症状和临床表现中的用途和应用。溶酶体贮积病包括神经鞘脂贮积病、神经节苷脂贮积病、黏多糖贮积病、糖蛋白贮积病、粘脂贮积病和选自戈谢病(GD)、泰-萨二氏病、法布里病、法韦尔病、桑德霍夫病、GM1神经节苷脂贮积病、克拉伯病、尼曼-皮克病(A型、B型、C型)、庞贝氏病、II型粘脂贮积病(黏多糖贮积病Ⅱ型)、IIIA型粘脂贮积病、婴儿游离唾液酸贮积病(ISSD)、溶酶体酸脂酶缺乏症、青少年氨基己糖苷酶A缺乏症、沃尔曼病和扎拉病的示例性疾病。本发明包括GEP、GEP肽、atsttrin，和/或其衍生物在通过促进需要的或相关的溶酶体药物、酶和/或其它分子递送给溶酶体，预防、治疗或减轻和/或特异性干预性治疗溶酶体贮积病中的用途和应用。
由溶酶体蛋白/酶结合肽，包括本文描述的PGRN、PGRN肽和/或atsttrin的存在而提高的诊断和治疗二者的可能性来自这样的事实，肽参与与溶酶体蛋白/酶，如葡糖脑苷脂酶(GBA)直接和因果关系的蛋白-蛋白相互作用，并用来启动、促进、介导溶酶体蛋白/酶，如葡糖脑苷脂酶(GBA)转运和/或运输至溶酶体或为溶酶体蛋白/酶，如葡糖脑苷脂酶(GBA)转运和/或运输至溶酶体所必需，其中需要它们维持溶酶体隔室和总体适当和有效的蛋白运输和降解的活性。因此，本发明包括在溶酶体中需要的酶/蛋白的运输和递送以及运输和递送至溶酶体的药物干预，以及在调节、减轻、预防或治疗溶酶体贮积病或障碍和任何其它病症的正确的溶酶体功能中的药物干预，所述病症与蛋白和酶的改变的或不充分的运输至溶酶体或内体有关。
本发明提供PGRN和PGRN肽，特别是包括表示为atsttrin的肽，作为溶酶体贮积病和溶酶体运输的调节剂。特别是，本发明提供PGRN和PGRN肽，包括atsttrin，作为溶酶体酶运输至溶酶体的促进剂。在特定的实施方案中，本发明涉及本文公开的PGRN肽和atsttrin家族的所有成员，其能够促进酶递送至溶酶体，和/或与溶酶体酶如葡糖脑苷脂酶(GBA)，或与选蛋白和/或HSP70结合或复合。肽家族包括片段或部分，包括PGRN序列和半单元的混合部分，特别是包含一种或多种颗粒体蛋白单元和PGRN的一个或多个接头单元。在一个方面，肽包含颗粒体蛋白单元的两个或更多个半单元和PGRN的一个或多个接头单元。在本发明的一个特定的方面，PGRN肽包含肽atsttrin，包含颗粒体蛋白单元A、C和F的半单元的组合与接头单元P3、P4和P5的组合。在一个特定的方面，GEP肽包含颗粒体蛋白单元的半单元(其中至少一个半单元是½ F)，和接头单元(特别是至少二个接头单元)的组合。在一个更加特定的方面，atsttrin具有在图50和SEQ ID NO: 4中示出的氨基酸序列并包含颗粒体蛋白单元和接头单元½F-P3-P4-½A-P5-½ C，包括如在本文示出的。
本发明的目的是提供用于治疗方法的药用组合物，其包含或基于PGRN肽和/或atsttrin。药用组合物包含一种或多种PGRN肽和/或atsttrin的组合，其能够促进酶递送至溶酶体，和/或与溶酶体酶如葡糖脑苷脂酶(GBA)，或与选蛋白和/或HSP70的结合或复合，和/或能够减少溶酶体底物积聚，如β-GlcCer在溶酶体或巨噬细胞中的积聚。药用组合物包括如本文提供的具有活性的一种或多种PGRN肽和/或atsttrin和一种或多种溶酶体酶或溶酶体底物还原剂的组合。溶酶体酶或溶酶体底物还原剂包括并可选自葡糖脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-氨基己糖苷酶和神经鞘磷脂酶的一种或多种。药用组合物包括一种或多种具有GBA结合活性的PGRN肽和/或atsttrin和伊米苷酶、重组葡萄糖苷酯酶α、它利罗酶α、美格鲁特和酒石酸异桑叶生物碱的一种或多种的组合。
因此，本发明提供一种用于治疗或减轻溶酶体贮积病的组合物，其包含分离的PGRN，或其活性片段(包含atsttrin)，其中所述PGRN或活性片段包含如在图49或50和在SEQID NOS: 2, 3或4-9的任何一个中示出的氨基酸序列。在一方面，本发明提供一种用于治疗或减轻溶酶体贮积病的组合物，其包含分离的PGRN，其中所述PGRN与如在图49和在SEQ IDNOS: 2和/或3中示出的序列比较，包含具有至少一个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。因此，在一个方面，用于本发明的PGRN (对比野生型或天然人或小鼠PGRN)具有至少一个氨基酸差异。在一个这样的方面，提供包含与葡糖脑苷脂酶组合的用于治疗或减轻戈谢病的PGRN、PGRN肽，或atsttrin的组合物。在一方面，本发明的组合物还可包含一种或多种分子蛋白伴侣或溶酶体递送蛋白，包括HSP70和/或选蛋白。
本发明的组合物包括还包含药学上可接受的载体、媒介、吸收剂或赋形剂的药用组合物。本文描述的PGRN、PGRN肽和/或atsttrin，可用合适的载体，和以有效通过各种方式给予患者的浓度制备为药用组合物，所述患者经历与改变的或无效的溶酶体处理或溶酶体酶相关的不利医学病症，特别是任何溶酶体贮积病或相关的病症，特别是戈谢病。可利用各种给药技术，其中有胃肠外技术如皮下、静脉内和腹膜内注射、导管插入术等。本文描述的PGRN、PGRN肽和/或atsttrin或它们的亚单位的平均量可以变化并且特别是应该基于合格的医生或兽医的建议和处方。
本发明的肽和组合物包括那些PGRN肽，包括atsttrin，其基于人PGRN序列，包括如在图49和50中示出的，包括SEQ ID NOS: 2、3和4-9，及其具有一个或多个或几个或许多取代的变体，其中当与PGRN、PGRN肽或atsttrin肽比较时，所述变体的结合和活性特征被保留。由于得自各种动物或哺乳动物，包括人的PGRN肽是已知的，这些序列提供可能用于本发明的组合物和方法的备选的氨基酸序列和变体，包括一些atsttrin人肽氨基酸的取代。本文在图49B (SEQ ID NO: 2)中提供小鼠GEP序列。各种动物的PGRN序列是公众已知的并被公开，并且将可用于评估和评价本发明的方法和组合物，并且它们的相应的和相关的氨基酸适合用于评估和用作本文的PGRN肽的变体。PGRN序列是可获得的并通过如下的参考结合到本文中：大鼠(Genbank登录号AAA16903.1, CAA44198.1)、小鼠(Genbank登录号P28798.2, BAE35389.1, NP_032201.2)、苏门达腊猩猩(Genbank登录号NP_001126689.1)、食蟹猕猴(Genbank登录号BAE01796.1)、马(Genbank登录号XP_001489791.1)、牛(Genbank登录号NP_001070482.1)、兔(Genbank登录号XP_002719228.1)、猪(Genbank登录号NP_001038043.1)、黑猩猩(Genbank登录号XP_511549.2)和负鼠(Genbank登录号XP_001374870.1)。
此外，包括多克隆和单克隆抗体的抗体，和调节PGRN和/或PGRN肽和/或它们的亚单位的生产或活性的药物可具有某些诊断应用并可例如，用于检测和/或测定与改变的PGRN、溶酶体贮积病、戈谢病相关的或由改变的PGRN、溶酶体贮积病、戈谢病导致的病症的目的。例如，PGRN、atsttrin或其亚单位可被用来在各种细胞培养基中，通过已知技术如杂交瘤技术，利用例如融合的小鼠脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞，自身生产多克隆和单克隆二种抗体。同样地，模拟或拮抗本发明的PGRN，特别是显示结合于溶酶体酶，如结合于GBA的那些PGRN的活性的小分子，可被发现或合成并可被用于诊断和/或治疗方案。
通过杂交瘤制备单克隆抗体的通用方法是众所周知的。生产抗体的永生化细胞系也可用并非融合的技术，如用致瘤的DNA直接转化B淋巴细胞，或用爱泼斯坦-巴尔病毒转染来创建。可对针对PGRN肽产生的单克隆抗体组的各种性质进行筛选；即，同种型、抗原表位、亲和力等。特别感兴趣的是中和PGRN或其亚单位的活性或结合于GBA的单克隆抗体。这样的单克隆可容易地用结合或活性测定法鉴定。优选地，用于本发明诊断方法的抗-PGRN抗体是亲和力纯化的多克隆抗体。更优选地，抗体是单克隆抗体(mAb)。此外，优选本文所用的抗-PGRN抗体分子呈全抗体分子的Fab、Fab'、F(ab')2或F(v)部分。
本发明提供治疗方法，所述方法基于PGRN, PGRN肽和/或atsttrin，或其活性片段，在促进酶递送至溶酶体，和/或与溶酶体酶如葡糖脑苷脂酶(GBA)，或与选蛋白和/或HSP70结合或复合，和/或能够减少溶酶体底物，如β-GlcCer在溶酶体或巨噬细胞中的积聚的活性。
因此，提供了促进蛋白或酶在动物中的溶酶体递送的方法，其包括给予所述动物分离的PGRN，或其活性片段包括atsttrin。在其一个方面，所述PGRN或活性片段包含如图49或50的任何一个中所示的氨基酸序列，包括SEQ ID NOS: 2、3和4-9。方法包括用于治疗或减轻动物的溶酶体贮积病的方法，包括给予所述动物分离的PGRN，或其活性片段包括atsttrin，其中所述PGRN或活性片段包含如图49或50的任何一个中所示的氨基酸序列。在这些方法的一个方面，所述方法包括另外给予一种或多种溶酶体酶，其在溶酶体贮积病中是减少、缺乏、突变或改变的。溶酶体酶可选自葡糖脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-氨基己糖苷酶和神经鞘磷脂酶的一种或多种。本发明方法的溶酶体贮积病可选自戈谢病(GD)、泰-萨二氏病、法布里病、法韦尔病、桑德霍夫病、GM1神经节苷脂贮积病、克拉伯病、尼曼-皮克病(A型、B型、C型)、庞贝氏病、II型粘脂贮积病(黏多糖贮积病Ⅱ型)、IIIA型粘脂贮积病、婴儿游离唾液酸贮积病(ISSD)、溶酶体酸脂酶缺乏症、青少年氨基己糖苷酶A缺乏症、沃尔曼病和扎拉病。在一方面，本发明方法的溶酶体贮积病可选自戈谢病(GD)、泰-萨二氏病(TSD)、粘脂质贮积病(ML)、粘多糖贮积病(MPS)、异染性脑白质营养不良(MLD)、法韦尔病(FD)和克拉伯病(KD)。在一个方面，本发明方法的溶酶体贮积病可选自戈谢病(GD)包括GD I、II或III型、泰-萨二氏病(TSD)、粘脂质贮积病(ML)包括ML III，粘多糖贮积病(MPS)包括MPS II、III、VI，异染性脑白质营养不良(MLD)、法韦尔病(FD)和克拉伯病(KD)。在本发明方法的一个特别优选的方面，溶酶体贮积病(LSD)是戈谢病(GD)。在本发明方法的一个特别优选的方面，溶酶体贮积病(LSD)是戈谢病(GD)。在本发明方法的一个方面，所述方法包括另外给予用于治疗或减轻戈谢病的溶酶体酶葡糖脑苷脂酶(GBA)或其活性片段或重组形式。在本发明方法的一个特别优选的方面，溶酶体贮积病(LSD)是泰-萨二氏病(TSD)。
至于溶酶体贮积病，戈谢病，提供用于促进葡糖脑苷脂酶(GBA)在患有戈谢病的患者中递送的方法，其包括给予所述患者分离的PGRN，或其活性片段包括atsttrin。PGRN或活性片段可特别地包含如图49或50的任何一个中所示的氨基酸序列，包括SEQ ID NOS: 2、3和4-9。对于在人类中的戈谢病，可特别利用人PGRN蛋白或其肽，并可任选地与重组人葡糖脑苷脂酶或GBA，如伊米苷酶组合。
本发明的方法和测定包括用于诊断或评估动物的溶酶体贮积病的方法和测定，其包括在所述动物中测定PGRN的表达或活性或检测基因组DNA或编码PGRN的基因中的一个或多个突变。任何这样的方法或测定可包括在所述动物中另外测定一种或多种溶酶体酶的表达或活性或检测基因组DNA或编码一种或多种溶酶体酶的基因中的一个或多个突变。提供一种诊断或评估动物的戈谢病的方法或测定。在这个方面，所述方法或测定可包括在所述动物中另外测定GBA的表达或活性或检测基因组DNA或编码GBA的基因中的一个或多个突变。
根据本发明，现在已经认识到并确定溶酶体贮积病患者可(并且事实上往往)携带PGRN基因或蛋白突变。特别普遍的PGRN基因突变包括rs4792937、rs850713、rs78403836、rs5848，和3个点突变，p.C315S, p,E316Q，和p.P365A。本发明的诊断方法和测定特别包括其中本文提供的一个或多个PGRN突变被评估或确定。本文提供方法、测定和试剂盒，其中选自rs4792937、rs850713、rs78403836、rs5848的一个或多个PGRN突变，和3个点突变，p.C315S, p,E316Q，和p.P365被测定。
这样的特别方法或试剂盒，是其中选自rs4792937、rs850713、rs78403836、rs5848的一个或多个PGRN突变被测定。在一方面，4 PGRN SNP位点通过Tagman基因分型方法测定，包括以下示例性引物：rs4792937正向引物，5’-TGTCCTGGAAA CCATCCTTC-3’ (SEQ ID NO:11)、反向引物5’-CTCCCAAAGCGATTCTCCTA-3’ (SEQ ID NO: 12)，和Taqman标签序列5’-TCAGTAGCTCACA[T/C]TTGTAA-3’ (SEQ ID NO: 13)；rs850713正向引物5’-CCTTCCCTGAGTGGGCTGGTA-3’ (SEQ ID NO: 14)、反向引物5’-AGTGCACCCTGTCTTCACAG C-3’(SEQ ID NO: 15)，和Taqman标签序列5’-AGGTACAAATCTGGGGGAGATGGGG[A/G]TATGTGGAGGGAAGTGGG GGCAGAG-3’ (SEQ ID NO: 16)；rs78403836正向引物5’-CTGTCCTCTCCCATGGCTAC-3’ (SEQ ID NO: 17)、反向引物5’-GCGGACCTGTAAGCATGAAT-3’(SEQ ID NO: 18)，和Tagman标签序列5’-AGGAAGAC [G/ C]TGATTTT-3’ (SEQ ID NO: 19)；rs5848正向引物5’-CCAGGGGTACCAAGTGTTTG-3’ (SEQ ID NO: 20)、反向引物5’-CACAGGGTCCACTGAAACG-3’ (SEQ ID NO: 21)，和Taqman标签序列TCTGCTCAGGCCTCCCTAGCACCTC[C/T]CCCTAACCAAATTCTCCCTGGACCC (SEQ ID NO: 22)。在一方面，p.C315S, p,E316Q，和p.P365A的点突变用PCR，和正向引物5’-GGTGGTGTAAGCGGTACCCT-3’ (SEQ ID NO:23)、反向引物5’-ACCTGCCCAGGCCAAGATGC-3’ (SEQ ID NO: 24)扩增，接着是测序。
本文提供通过检测PGRN的存在或活性和量，诊断或评估动物的溶酶体贮积病的试剂盒，其包含：(a) 预定量的PGRN的可检测标记的、特异性结合的配偶体或针对PGRN的抗体；(b) 其它试剂；和(c) 所述试剂盒的使用说明。这样的试剂盒包括通过检测PGRN突变在所述动物中的存在，诊断或评估动物的溶酶体贮积病的试剂盒，其包含：(a) 对PGRN基因或编码DNA具有特异性的或针对PGRN基因或编码DNA的一种或多种核酸探针或引物；(b) 其它试剂；和(c) 所述试剂盒的使用说明。本发明提供试剂盒的一个方面，其中一种或多种核酸引物或探针对一个或多个PRN突变是特异性的或适合于检测或测定一个或多个PRN突变，所述突变选自rs4792937、rs850713、rs78403836、rs5848，和3个点突变，p.C315S、p,E316Q，和p.P365A。
本发明的试剂盒还可包含GBA的可检测标记的特异性结合配偶体或者针对GBA的抗体，或者对GBA基因或编码DNA具有特异性或针对GBA基因或编码DNA的一种或多种核酸探针或引物。
在本发明的测定、诊断方法或试剂盒中，控制量的PGRN、PGRN肽、atsttrin、GBA，或其抗体等可制备并用酶、特异性结合配偶体和/或放射性元素标记，然后可引入细胞样品中。在标记的材料或其结合配偶体有机会与样品内的位点反应后，由此产生的质量可通过已知技术检查，其可随着所附标记的性质变化。在其中使用放射性标记，例如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I，和186Re的情况下，可采用目前已知的可获得的计数程序。在其中标记是酶的情况下，检测通过本领域已知的任何目前采用的比色法、分光光度法，荧光分光光度法、电流测量技术或气体定量分析技术完成。
如前面所提到的，本发明的诊断方法包括通过测定检查细胞样品或培养基，所述测定包括有效量的对PGRN蛋白或其肽(包括atsttrin)的拮抗剂，如抗-PGRN抗体，优选亲和力-纯化的多克隆抗体，且更优选mAb。此外，优选本文所用的抗体分子以Fab、Fab', F(ab')2或F(v)部分或全抗体分子的形式存在。如前文所讨论的，能够从这种方法受益的患者包括罹患溶酶体贮积病或戈谢病的那些患者。用于分离抗体和诱导抗-PGRN抗体并用于测定和优化抗-PGRN抗体的能力以帮助检查和评估临床样品的靶细胞或临床样品的方法都是本领域熟知的。
本发明还包括可用于实施本发明的治疗方法的治疗组合物。本治疗组合物包含呈混合物的药学上可接受的赋形剂(载体)和本文描述的作为活性成分的一种或多种PGRN、其多肽类似物或其片段如atsttrin。
含有多肽、类似物或活性片段作为活性成分的治疗组合物的制备是本领域充分了解的。通常，这样的组合物被制备为注射剂，作为液态溶液剂或混悬剂，然而，也可制备在注射前适合于在液体中的溶液，或混悬液的固体形式。制剂也可以是乳化的。活性治疗成分经常与药学上可接受的并与活性成分适配的赋形剂混合。合适的赋形剂有例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如果需要，组合物可含有少量的增强活性成分有效性的辅助物质如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂。
多肽、类似物或活性片段可被配制为作为中和的药学上可接受的盐形式的治疗组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(用多肽或抗体分子的游离氨基形成)并且其用无机酸例如，盐酸或磷酸，或这样的有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。从游离的羧基形成的盐也可从无机碱，例如，钠、钾、铵、钙，或铁的氢氧化物，和这样的有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生。
含有治疗性PGRN多肽、类似物如atsttrin，或活性片段的组合物经常规静脉内给予，例如通过注射单位剂量，但也可经由任何合适的方式包括IM、IP、IV、口服、经皮等给药。术语"单位剂量"当用于提及本发明的治疗组合物时指适合作为用于人的单位剂量的物理上的离散单位，每个单位含有与需要的稀释剂；即载体或媒介混合的、经计算产生所需的治疗作用的预定量的活性材料。
组合物以与剂量配方相容的方式，并且以治疗有效量给予。要给予的量取决于待治疗的受试者，受试者免疫系统利用活性成分的能力，和所需的PGRN活性或PGRN-GBA结合能力。需要给予的活性成分的精确量取决于从业人员的判断并且对每个个体都是独特的。然而，合适的剂量可在从约0.001至1, 0.01至10、0.1至20、0.5至50，优选地在约0.5至约10，和更优选在一至几毫克活性成分/千克体重个体/天的范围内并取决于给药途径。最初给药和后续给药的合适方案也是变化的，但通常是最初的给药，接着是经一个或多个小时时间间隔后的重复剂量的后续注射或其它给药。或者，考虑足以维持在血液中的10纳摩尔-10微摩尔浓度的连续静脉内输注。
本发明当然考虑了几种制备本发明的PGRN、PGRN肽和/或atsttrin的方法，包括如本文示例说明的和/或使用已知的重组技术，因而本发明意欲涵盖在其范围内的这样的合成制剂。测定本文公开的氨基酸序列促进通过任何的各种合成方法或任何的已知重组技术的肽的再生产，因此，本发明延伸到包含编码本发明肽的核酸的表达载体，其用于通过重组DNA技术在宿主系统中表达，并延伸到所得到的转化的宿主。
本发明也涉及重组DNA分子、重组核酸，或克隆的基因，或其简并变体，优选核酸分子，特别是重组DNA分子或克隆的基因，编码在图49或50中所示的一种或多种PGRN肽或其变体的氨基酸。在特定的实施方案中，重组DNA分子、重组核酸，或其简并变体，优选核酸分子，编码能够结合GBA，促进溶酶体酶转运，和/或减少溶酶体底物如β-GlcCer积聚的PGRN肽，其包含一个或多个颗粒体蛋白单元和PGRN的一个或多个接头单元，如在图48中描述的和如在PGRN，或PGRN肽，如atsttrin，例如如在图48、49和50中的序列示出的，包括包含如在SEQ IDNOS: 2、3或4-9中示出的序列。在进一步的特定的实施方案中，重组DNA分子、重组核酸，或其简并变体，优选核酸分子，编码能够结合GBA，促进溶酶体酶转运，和/或减少溶酶体底物如β-GlcCer积聚(如在图49或50中示出的)并包含颗粒体蛋白单元和接头单元½F-P3-P4-½A-P5-½C的PGRN或PGRN肽atsttrin。
如本领域熟知的，DNA序列可通过将它们可操作地连接于适宜的表达载体中的表达控制序列并使用该表达载体转化适宜的单细胞宿主来表达。本发明的DNA序列与表达控制序列的这样的可操作性连接当然包括，如果不是已经是DNA序列一部分的话，在DNA序列上游的正确阅读框中提供起始密码子ATG。
各种各样的宿主/表达载体组合可用于表达本发明的DNA序列。有用的表达载体，例如，可由染色体的、非-染色体的和合成的DNA序列的区段组成。合适的载体包括SV40和已知细菌质粒的衍生物，如大肠杆菌(E. coli)质粒col El、pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物、质粒如RP4；噬菌体DNAS，如，噬菌体λ的许多衍生物，如NM989，和其它噬菌体DNA，如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒如2µ质粒或其衍生物；可用于真核细胞的载体，如可用于昆虫或哺乳动物细胞的载体；衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，如已被修饰以使用噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒；等等。
各种各样的表达控制序列(即，控制可操作地与其连接的DNA序列的表达的序列)的任何一种，可用于这些载体以表达本发明的DNA序列。这样的有用的表达控制序列包括，例如，SV40、CMV、牛痘、多瘤病毒或腺病毒的早期或晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、LTR系统，噬菌体λ的主要的操纵基因和启动子区，fd外壳蛋白的控制区，对于3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，酸性磷酸酶的启动子(如，Pho5)，酵母α-交配因子的启动子，和已知控制原核或真核细胞或它们的病毒的基因表达的其它序列，及其各种组合。
各种各样的单细胞宿主细胞也可用于表达本发明的DNA序列。这些宿主可包括众所周知的真核和原核宿主，如大肠杆菌(E. coli)、假单胞菌(Pseudomonas)、杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)、真菌如酵母，和动物细胞，如CHO、Rl.l、B-W和L-M细胞，非洲绿猴肾细胞(如，COS 1、COS 7、BSC1、BSC40，和BMT10)，昆虫细胞(如，Sf9)，和组织培养中的人细胞和植物细胞。
本领域技术人员将能够选择适当的载体、表达控制序列，和宿主，而无需过度的实验，以实现所需的表达而不背离本发明的范围。
合成DNA序列允许基因的便利的构建，所述基因将表达PGRN或atsttrin类似物或"突变蛋白(mutein)"。作为选择，编码突变蛋白的DNA可通过天然PGRN基因或cDNA的定点突变制备，并且突变蛋白可直接使用传统的多肽合成制备。
在本发明的测定和诊断试剂盒中，可使用标记。这些研究的最常用的标记是放射性元素、酶、当暴露于紫外光时会发出荧光的化学物质等。许多荧光物质是已知的并可被用作标记。这些包括，例如，荧光素、罗丹明、金胺槐黄(auramine)、德克萨斯红、AMCA蓝和萤光黄。特定的检测材料是在山羊中制备并通过异硫氰酸酯与荧光素缀合的抗-兔抗体。PGRN或其结合配偶体也可用放射性元素或用酶标记。放射性标记可通过任何目前可利用的计数程序检测。优选的同位素可选自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I，和186Re。酶标记同样是有用的，并可通过任何目前采用的比色法、分光光度法、荧光分光光度法、电流测量技术或气体定量分析技术检测。酶通过与桥接分子如碳二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等反应而结合于选择的颗粒。可用于这些程序的许多酶是已知的并可利用。优选的有过氧化物酶、β-葡糖苷酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加过氧化物酶和碱性磷酸酶。
溶酶体贮积病，包括戈谢病，特别是概括临床病症的溶酶体贮积病的动物模型的生成已被证明是一个挑战(Farfel-Becker T et al (2011) Dis Model Mech 4(6):746-752)。对于GD，在动物中的许多GBA敲除和无效突变已导致致死或早期死亡(Sun Y et al(2005) J Lipid Res 46:2102-2113)。动物模型已基于已知的GBA突变，包括L449P、N370S、V394L、D409H和D409V点突变生成，其与GD的各种常见形式，以及化学诱导模型相关，例如涉及给予GlcCerase抑制剂(Farfel-Becker T et al (2011) Dis Model Mech 4(6):746-752)。
泰-萨二氏病自然存在于雅各伯羊(Jacob sheep)中，该病在雅各伯羊中的生物化学机制与在人中的实质上是相同的(Torres PA, et al (2010) Molecular Genetics and Metabolism101 (4): 357–363)。在雅各伯羊中，已显示氨基己糖苷酶A的活性下降导致GM2神经节苷脂在受影响的动物绵羊中的浓度增加(Porter BF, et al (2011) Veterinary Pathology48 (3): 807–813)。绵羊HexA基因与人HexA基因在核苷酸的数目上是相同的并与人HexA基因具有86%核苷酸同一性。错义突变(G444R)被发现于受影响的绵羊的HEXAcDNA中，在外显子11的末端提供单一核苷酸变化，通过剪接导致外显子的缺失(翻译前)(Kolodny E, Horak F, Horak J (2011) ALBC Newsletter (Pittsboro, NorthCarolina, USA: American Livestock Breeds Conservancy)。雅各伯羊提供可利用的泰-萨二氏病的动物模型，然而，绵羊不如较小动物或具有确定的重组方法方案的那些动物(如小鼠或大鼠)那样容易操控或圈养。因此，用于小鼠等的泰-萨二氏病的备选模型将是非常有益的。
本发明提供用于溶酶体贮积病，包括戈谢病的新的和新颖的动物模型。具有改变的PGRN或PGRN敲除/无效(KO)的动物发展为溶酶体贮积病，类似于临床戈谢病。动物在溶酶体中积聚GBA底物β-GlcCer，发展肝脾肿大，其是戈谢病的充分确证的症状，并且戈谢细胞可在组织学上见到。PGRN KO或无效突变体动物可用卵清蛋白或其它药物处理，以产生具有GD和溶酶体贮积病表型并模拟该疾病的慢性炎症模型。因此，在本发明的一个方面，提供用于GD和/或其它溶酶体贮积病的动物模型。本发明的示例性动物模型可基于PGRN的敲除或无效突变，改变的表达或条件性PGRN突变体、rs4792937、rs850713、rs78403836、rs5848，和3个点突变，p.C315S、p,E316Q，和p.P365A。一种或多种PGRN改变或突变可与一个或多个GBA突变或改变，或与另一溶酶体酶，包括例如一种或多种α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、鞘磷脂酶中的突变组合，以产生GD或其它溶酶体贮积病的动物模型。
本发明还提供用于其它溶酶体贮积病，包括泰-萨二氏病，特别是其中具有改变的PGRN的动物或PGRN敲除/无效动物显示出溶酶体贮积病的生理学或分子方面的动物模型。例如，本文提供的实例显示了对于PGRN KO小鼠，作为泰-萨二氏病标志的HexA和GM2神经节苷脂的改变。具有改变的PGRN的动物或PGRN敲除/无效动物，单独或与HexA基因突变或HexA突变体组合，提供新的可供选择的Tay-Sach's疾病模型。
本发明可通过参考以下非-限制性实施例得到更好的理解，提供这些实施例作为本发明的示例。示出以下实施例以更全面地说明本发明的优选实施方案，然而，决不应视为限制本发明的宽范围。
实施例1
需要颗粒蛋白前体用于β-葡糖脑苷脂酶的溶酶体递送且其缺乏会引起戈谢病
鞘糖脂代谢是由多种酶介导的过程。代谢酶不足造成其相应的底物在溶酶体中的积聚。涉及溶酶体贮积病(LSD)的鞘糖脂代谢途径描述于图1。戈谢病，最常见LSD，由葡糖脑苷脂酶(GBA)的突变引起，其将β-葡糖苷脂酰鞘氨醇代谢为神经酰胺，如在图1中所示。GBA的突变导致GBA底物，β-葡糖苷脂酰鞘氨醇(β-GlcCer)在巨噬细胞中的积聚。
戈谢病(GD)，最常见的溶酶体贮积病，通常由葡糖脑苷脂酶(GBA)的遗传缺陷引起。发明人在此报告缺乏颗粒蛋白前体(PGRN)，一种具有独特的结构和多种功能的生长因子，也预料不到的地引起戈谢-样疾病。卵清蛋白-攻击的和年老的PGRN-缺乏小鼠均表现出GD的体征，且相关的组织被“戈谢细胞”浸润，即显示由葡糖苷脂酰鞘氨醇积聚导致的特征性“起皱纸”细胞质外观的巨噬细胞。重组PGRN促进葡糖苷脂酰鞘氨醇在PGRN-缺乏的巨噬细胞中的清除并防止GD在PGRN-缺乏的小鼠中发展。PGRN直接结合于GBA并为递送GBA至溶酶体所必需。无偏质谱法(Unbiased Mass Spectrometry approaches)鉴定热休克蛋白70(HSP70)，一种进化上保守的分子蛋白伴侣，作为介导GBA通过作为必不可少的衔接子的PGRN而运输的GBA-相关蛋白。总的来说，这些结果不仅证实PGRN是HSP70介导的折叠和转运途径的新的辅蛋白伴侣并在GBA溶酶体递送中起着重要的作用，而且这些结果还提供针对各种HSP70-介导的病变和溶酶体贮积病(包括GD)的新的指导治疗性干预的范例。
戈谢病(GD)，最常见的溶酶体贮积病(LSD)，由导致葡糖苷脂酰鞘氨醇(β-GlcCer)在巨噬细胞和其它细胞类型中的积聚的葡糖脑苷脂酶(GBA)突变引起1,2。β-GlcCer贮积将溶酶体转化为通过电子显微镜观察到的管状结构，伴有充满脂质的巨噬细胞(戈谢细胞)，其在光学显微镜下显示特征性“起皱手纸”外观。根据GD的神经系统并发症，存在3种类型的GD (I型是非-神经病性的，II型是急性神经病性的和III型是温和的慢性神经病性的)。额外的神经系统特征包括肝脾肿大、全血细胞减少和骨质疏松症，因为戈谢细胞在这些器官中浸润3。
颗粒蛋白前体(PGRN)，也称为颗粒体蛋白上皮肽前体(GEP)、PC-细胞-衍生的生长因子(PCDGF)、前上皮肽，和颗粒蛋白前体重组蛋白(acrogranin)，含有富含半胱氨酸的基序(CX5–6CX5CCX8CCX6CCXDX2HCCPX4CX5–6C) (SEQ ID NO: 1)的7个半重复单元并形成独特的“串珠(beads-on-a-string)”结构4。PGRN在上皮细胞，免疫系统的细胞，和神经元中大量表达5。已知PGRN在多种生理和疾病过程，包括早期胚胎发生，伤口愈合6,7，以及宿主防御中起着重要作用8。PGRN也作为神经营养因子发挥功能，而导致PGRN蛋白的部分或完全损失的PGRN基因(GRN)突变分别导致额颞叶痴呆(FTD)9,10和神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)11,12。
PGRN与TNF受体超家族的一些成员，包括TNFR1、TNFR2和DR3有关13-16，并在各种病症中具有抑制炎症的能力7,13。针对PGRN的自身-抗体已在几种自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、银屑病性关节炎和炎性肠道疾病中发现，并且这样的抗体促进了在一个亚组患者中的促炎环境17,18。在确定PGRN是否也在慢性肺炎中起作用的努力中，我们用卵清蛋白(OVA)攻击PGRN缺乏小鼠，这导致PGRN作为不可缺少的GBA-相关因子的意外发现。在此，我们报告PGRN是通过连接GBA/LIMP2复合物与热休克蛋白70 (HSP70)的用于GBA的溶酶体递送的重要辅蛋白伴侣，热休克蛋白70是一种介导许多蛋白的折叠和转运的进化上高度保守的分子蛋白伴侣19。
PGRN缺乏在OVA-攻击的和"年老的"两种小鼠模型中引起戈谢-样疾病
PGRN在各种病症，包括炎性关节炎中起着重要的抗-炎和免疫调节作用的发现13，促使我们检查其在慢性肺炎中的牵涉。为此目的，在8-周龄的WT和PGRN敲除(KO)小鼠中，在第1和15天经腹膜内(IP)注射OVA，接着在第29天开始1% OVA的鼻内攻击，1周3次，持续4周，诱导慢性肺炎。令人惊讶和令人注目的是，大量的“巨大细胞”被发现于PGRN KO小鼠的肺中，特别是在OVA处理后(图2A)。这些细胞充满具有“起皱手纸”外观的物质，这是戈谢细胞的典型形态学。这样的细胞在经OVA攻击或未经OVA攻击的WT小鼠中没有发现。在未攻击的PGRNKO小鼠中鉴定出很少的戈谢-样细胞，而在OVA攻击后其数目显著增加(图2A、2B)。过碘酸-Schiff (PAS)染色显示糖脂物质在PGRN KO小鼠的戈谢-样细胞中积聚(图2C)。支气管肺泡灌洗液的流式细胞计分析鉴定了在OVA处理后的PGRN KO小鼠中的巨大巨噬细胞亚群，这通过CD11b+FSC高证实，因为前向散射光(FSC)的值与细胞大小成正比(图2D)。
PGRN无效的巨噬细胞当用透射电子显微镜(TEM)检查时，显示戈谢-样细胞的典型管状溶酶体外观。得自PGRN KO小鼠的巨噬细胞比WT小鼠中的那些巨噬细胞大得多，并且PGRN无效的溶酶体变成管状，而不是规则的圆形(图3，图18A)。连同物质的积聚，发现溶酶体从正常的圆形转变为管状结构(图18B)。其它细胞器，如线粒体和内质网，和其它类型的细胞，1和2型肺细胞似乎正常(图19A、19B)。
GD由导致β-GlcCer积聚的GBA酶活性降低所引起20。来自WT和PGRN KO小鼠(经受或未经受OVA攻击)的肺溶胞产物的脂质组成如先前报道的进行分析21。如在图4中所示，β-GlcCer显示在用OVA攻击对比PBS攻击的WT和PGRN KO两种小鼠中，所有链长物质增加。而且，在OVA攻击后，所有种类的β-GlcCer在PGRN KO对比WT小鼠中显著升高(图4)。即使未处理的PGRN KO小鼠具有比WT小鼠更高水平的β-GlcCer。β-GlcCer在PGRN KO小鼠中的积聚是特殊的，因为其它脂质组成，如神经鞘磷脂、二酰甘油(DAG)，和神经酰胺，在WT和PGRN KO小鼠之间保持不变(图20A-20C)。有趣的是，β-葡糖基鞘氨醇的血浆水平被发现在PGRN缺乏小鼠中显著升高，虽然未观察到β-GlcCer的血浆水平的显著增加(图21A-21D和图22A-22C)。
虽然GBA独立于甘露糖-6-磷酸受体(MPR)系统而被转运至溶酶体中22,23，但伊米苷酶，一种用于戈谢病的酶替代疗法(ERT)的巨噬细胞-靶向的、甘露糖-封端的人GBA，经由MPR-依赖性途径被递送至溶酶体。用OVA攻击PGRN KO小鼠，并在鼻内攻击的第一周开始用PBS或伊米苷酶注射处理(60 u/kg/周)直至实验结束24。OVA攻击后，许多戈谢-样细胞出现并几乎占据整个肺泡腔(图5A，中小图)。伊米苷酶注射显著降低PAS-阳性物质的尺寸和积聚(图5A，下小图)以及β-GlcCer在戈谢-样细胞中的贮积(图5B)。戈谢-样细胞的数目是可比较的，然而使用伊米苷酶的细胞质和核的大小之间的比例显著降低(图5C)，表明戈谢-样细胞的大小在伊米苷酶治疗后变得更小。由OVA攻击诱导的PGRN KO小鼠的肝和脾肿大的大小在伊米苷酶治疗后也显著减少(图5D)。在用OVA攻击的PGRN无效的小鼠中的一般身体活动通过伊米苷酶治疗而改善。用OVA攻击的PGRN KO小鼠由于受损的肺功能而减少体力活动。这样的小鼠是有病的且不喜欢移动直至触及夹钳(数据未显示)。接受伊米苷酶疗法的OVA-攻击的PGRN KO小鼠变得正常且有活力(数据未显示)。总的来说，这些数据和PGRN KO小鼠对伊米苷酶的响应证实OVA-攻击的PGRN缺乏小鼠发展戈谢病表型。
由于PGRN KO小鼠显示出肺戈谢-样细胞，即使在不存在OVA攻击时，然后我们试图确定年老的PGRN缺乏小鼠是否自发地发展为戈谢-样疾病。WT和PGRN KO小鼠维持至多1年，然后处死1岁龄的无任何攻击的WT和PGRN KO小鼠。收集肺、脾、肝、股骨，和脊骨用于组织学和显微-CT分析。类似于GD患者，年老的PGRN KO小鼠发展成肝脾肿大(图6A)，这是戈谢病的最常见症状。组织学上，戈谢-样细胞被发现于年老的PGRN KO小鼠的肺、脾，和骨髓中，但不在年龄-匹配的WT小鼠中(图6B)。骨髓的PAS染色显示糖脂在PGRN无效的戈谢-样细胞中的贮积(图6C)。组织和血浆中的β-GlcCer水平在年老的PGRN缺乏小鼠中增加(图23A-23C)。在一些年老的PGRN KO小鼠中，骨髓被脂肪组织替代(图7A)。当在TEM下检查时，在得自PGRNKO肺和骨髓的PGRN无效的戈谢-样细胞中观察到管状溶酶体(图7B)。此外，年老的PGRN缺乏小鼠表现出长骨(图24A-24H)和椎骨(图25A-25C)的骨质减少的特征，这也是戈谢病的完全确证的症状。总之，年老的PGRN缺乏小鼠自发地发展为戈谢-样疾病表型。
重组PGRN防止β-GlcCer在PGRN无效的巨噬细胞中积聚和在PGRN-缺乏小鼠中的GD发展
为评估重组PGRN (rPGRN)是否可救济在PGRN KO动物中所见到的GD-样表型，我们首先开发体外细胞培养模型以模拟β-GlcCer在GD的巨噬细胞中的积聚。如前所述，分离骨髓-衍生的-巨噬细胞(BMDM)并从WT和PGRN KO小鼠中分化25。BMDM细胞用5和50 µg/ml含有许多类型脂质的脑溶胞产物处理10天。H&E染色显示巨大巨噬细胞存在于PGRN KO BMDM中，但不存在于WT BMDM中(图26)。免疫荧光染色揭示在脂质混合物处理后，β-GlcCer以剂量-依赖的方式积聚在PGRN KO BMDM中。然而得自WT小鼠的BMDM不显示增加的β-GlcCer水平(图8A)。
为测试rPGRN，其有效地通过内吞作用摄取和递送至溶酶体26 (图29和图30)，是否可防止β-GlcCer积聚在PGRN KO BMDM中，将0.1和0.4 µg/ml PGRN蛋白加入到含有脂质混合物(50 µg/ml)的培养基培养10天，而β-GlcCer的积聚通过免疫荧光染色测量。在光学显微镜下，BMDM在脂质暴露后显现为扩大和混乱的，伴有高折光的细胞质斑点(punctae)，并且这种形态学改变被PGRN以剂量-依赖的方式纠正(图27)。用脂质处理，β-GlcCer积聚，而这种积聚被rPGRN和伊米苷酶(用作阳性对照)加入有效地阻断(图8B和8C)。此外，阻断已知PGRN's信号途径，包括ERK、PI3K和mTOR，不影响rPGRN's对β-GlcCer清除的作用(图30)，表明被重组PGRN防止的β-GlcCer积聚主要通过内吞作用的摄取介导，但不是通过激活胞内信号传导途径。
重组PGRN防止在PGRN KO BMDMs中GBA聚集和β-GlcCer积聚的发现还通过来自GD患者的成纤维细胞证实。简言之，得自II型GD患者的成纤维细胞用50 µg/ml脂质混合物(伴有或没有0.4 µg/ml rPGRN)处理。在脂质处理后，GBA变成聚集的圆形核，伴有β-GlcCer积聚，而所有这些表型通过加入rPGRN而显著抑制(图9)。
接着，我们检查rPGRN是否也可体内救济GD表型。从鼻内攻击的第一周起始，对用OVA攻击的PGRN KO小鼠I.P.注射PBS或者rPGRN (4 mg/kg每周)，直至实验结束。肺组织的组织学显示在用OVA攻击诱导的PGRN KO小鼠中，浸润有戈谢-样细胞，并且rPGRN显著逆转表型(图10A)。与伊米苷酶处理减少大小而对戈谢-样细胞数无显著影响不同(图5C、5D)，rPGRN显著减少戈谢-样细胞的数目和大小(图10B、10C)，表明PGRN既抑制戈谢-样细胞形成，又抑制β-GlcCer积聚。
GBA及其转运受体LIMP2聚集于PGRN-缺乏的巨噬细胞的细胞质中而不存在于PGRN-缺乏的巨噬细胞的溶酶体中
然后，我们试图通过评估GBA活性和表达，确定无效PGRN-空诱导GD-样表型的潜在机制。β-GlcCer在GD中的积聚由减少的GBA酶活性或降低的GBA蛋白表达引起20。令我们惊讶的是，GBA酶活性和蛋白表达在PGRN KO小鼠中都是正常的，实际上在OVA攻击后，GBA表达在PGRN KO小鼠中稍有增加(图11A、11B)。虽然GBA的蛋白水平和活性没有降低，但GBA的免疫组织化学染色揭示，GBA细胞分布有极大的改变。GBA分布于WT小鼠的巨噬细胞的细胞质中，而GBA表达聚集于PGRN KO小鼠的细胞质中(图11C)。相反，α-半乳糖苷酶A (GLA)，一种主要经由甘露糖-6-磷酸受体-依赖性途径递送至溶酶体的溶酶体酶27，的细胞分布在PGRN缺乏细胞中不受影响(图11C)。肺组织冷冻切片的共焦染色证实GBA聚集，伴有β-GlcCer在PGRN缺乏的组织中的积聚(图12A)。免疫金标记TEM也证实GBA聚集于戈谢-样细胞的细胞质中，且GBA在PGRN无效的巨噬细胞的管状溶酶体中缺乏，而GBA在WT巨噬细胞的溶酶体中是可检测的(图12B)。作为对免疫金标记TEM的对照，选蛋白被发现主要聚集在细胞膜附近，介导内吞作用，并且存在于PGRN KO小鼠的戈谢细胞的管状溶酶体中(图28)。为进一步观察PGRNKO巨噬细胞的GBA溶酶体外观的缺陷，我们采用基于活性的探针或(ABP) MDW933，其可自发地跨膜并允许敏感和特异性标记活细胞中的活性溶酶体GBA28-30。这种探针不能检测PGRN缺乏的BMDMs中的GBA，虽然它有效地标记WT BMDMs中的溶酶体GBA (图12C、图30)。此外，重组PGRN救济PGRN-缺乏的巨噬细胞中的GBA的溶酶体外观(图30)。总之，这些结果证实GBA递送至溶酶体取决于PGRN的存在。
溶酶体整联膜蛋白2 (LIMP2)，一种溶酶体标记物，被报道作为介导GBA递送至溶酶体的GBA-结合受体发挥作用31,32。有趣的是，我们发现LIMP2的溶酶体递送在PGRN-缺乏的巨噬细胞中也是缺乏的(图13A、13B)。然而，溶酶体相关的膜蛋白-2 (LAMP-2)，另一种溶酶体标记物，的细胞分布在PGRN无效的巨噬细胞中不受影响。特别地，LIMP2和LAMP2二者均分布于WT巨噬细胞的细胞质中；然而LIMP2的表达聚集于PGRN无效的巨噬细胞的细胞质中，而LAMP2 被分布于PGRN KO巨噬细胞中(图13A)。用免疫金TEM染色进一步证实LIMP2的聚集(图13B)。此外，GBA和LIMP2二者共定位于PGRN KO巨噬细胞的聚集体中(图13C)并且仍然在体内相互结合(图13D)。总的来说，GBA及其受体LIMP2二者的溶酶体递送在PGRN缺乏小鼠中缺乏。已报道LIMP2缺乏引起GBA的分泌增加31，然而，在野生型和PGRN-缺乏细胞之间未观察到GBA分泌的显著差异，虽然PGRN缺失，类似于LIMP2缺乏31，也导致GBA在溶酶体中的缺乏。
PGRN是介导GBA/LIMP2溶酶体递送的HSP70蛋白伴侣通路的重要辅蛋白伴侣
需要PGRN以使GBA靶向溶酶体的发现促使我们确定PGRN是否与GBA相关。通过共免疫沉淀，使用GBA抗体以免疫沉淀蛋白复合物并用PGRN抗体探测来证实PGRN和GBA之间的体内相互作用(图14A)。然后我们使用固-相结合测定，用重组PGRN和GBA确定PGRN是否直接结合于GBA。PGRN表现出剂量-依赖性结合并饱和液相GBA (图14B)，而未检测到PGRN和LIMP2之间的直接相互作用(图14B)。然后，如所述的，使用表面等离子体共振(SPR)与SensiQ Pioneer测量PGRN和GBA之间的结合亲和力13,14。结果证实PGRN以非常高的亲和力(KD= 0.71 nM)结合于GBA (图14C)，高于PGRN结合于选蛋白的亲和力，选蛋白是已知的PGRN-结合溶酶体受体(KD =3.67 nM) (未显示)26。
四色免疫荧光染色揭示，GBA和PGRN共同定位于巨噬细胞的胞内运输隔室，包括内质网(ER)、高尔基体，和反面高尔基体网络(TGN) (图31)。GBA/PGRN在从ER至溶酶体的途中通过不同pH的细胞内隔室31。GBA对PGRN在一定范围pH值的直接结合亲和力也使用SensíQPioneer测试(图32A)。类似于GBA和LIMP2之间的相互作用31，GBA与PGRN的结合在中性pH下更有利，并随着pH降低有亲和力降低的趋势(图32B)。总之，这些结果提示GBA和PGRN结合的可能点是前溶酶体的(prelysosomal)，可能早在ER和高尔基体的隔室中开始。
然后我们试图确定PGRN调节GBA所用的分子途径。为分离涉及GBA的PGRN调节的分子，免疫沉淀用得自WT和PGRN KO两种组织的GBA抗体进行，接着是高灵敏度质谱(MS)。用GBA抗体的免疫沉淀pull-down WT组织中的PGRN-依赖的和PGRN-独立的两种GBA-相关蛋白。当相同免疫沉淀实验在PGRN KO组织中进行时，只有PGRN-独立的GBA-相关蛋白被免疫沉淀。从来自PGRN KO的击中减去来自WT小鼠的击中，得到PGRN-依赖的GBA相关的蛋白，其中基本原理是参与PGRN-介导的GBA递送的分子是仅存在于WT小鼠而不存在于PGRN KO小鼠中的击中(图15A)。WT小鼠中的134个击中和PGRN KO小鼠中的114个击中被鉴定。它们中的9个是两组中共有的，而发现39个蛋白对WT小鼠是特异性的，提示这些蛋白将是PGRN-依赖的GBA-相关蛋白(图15B)。基底膜蛋白多糖和白细胞弹性蛋白酶抑制剂，两种已知的PGRN-结合蛋白7,33，从39个击中中鉴定，验证了该技术。此外，HSP70及其辅蛋白伴侣TCP1，以及细胞骨架、囊泡运输相关蛋白，和产生能量的酶都在39个击中中。
表3
可能是PGRN-依赖的GBA相关蛋白的基因
在这些数据之后，在用编码带His标签的PGRN的表达质粒稳定转染的HEK293EBAN细胞中进行研究13。两种蛋白用带His标签的PGRN共纯化，并且MS分析揭示这些是HSP70和TCP1(未显示)。为证实MS数据，我们使用GBA抗体在WT和PGRN KO组织中进行免疫沉淀，并用抗HSP70抗体探测。在OVA攻击后，HSP70在WT小鼠中结合于GBA，并且这种相互作用在PGRN KO小鼠中未能检测到(图15C)。此外，给予rPGRN有效地救济PGRN KO小鼠中GBA与HSP70的结合(图15D)。然后我们检查是否需要HSP70用于GBA的溶酶体递送，而HSP70使用siRNA途径抑制。类似于敲除PGRN (用作对照)，HSP70的抑制导致在活细胞中用MDW933标记测定时，未能检测到溶酶体GBA (图16A)。
LIMP2是主要的GBA转运受体的先前报道31,34,35，连同GBA和LIMP2二者均在PGRN缺乏的巨噬细胞中聚集的发现(图13)，使我们确定HSP70是否也与LIMP2相互作用。类似于GBA，LIMP2也与WT但不与PGRN KO组织中的HSP70相关(图16B)。选蛋白被报道为PGRN的受体并介导神经元内PGRN向内体/溶酶体途径的递送26。我们因此确定选蛋白是否通过作为接头蛋白的PGRN，与LIMP2/GBA/PGRN/HSP70形成三元复合物并促进LIMP2/GBA/PGRN/HSP70沿着内体/溶酶体途径的递送。在此我们发现正是这种情况。在OVA攻击后，选蛋白和GBA之间的相互作用在WT肺中鉴定，这种相互作用在PGRN KO肺中完全失去，而选蛋白和GLA27之间的相互作用不受PGRN缺乏的影响(图16C)。此外，选蛋白在未处理的WT肺中与HSP70呈极弱的相关性，且这种相互作用通过OVA攻击显著地升高(图16D)，而这种相互作用在PGRN KO肺中也完全消失(图16D)。总的来说，选蛋白通过作为不可缺少的衔接子的PGRN与LIMP2/GBA/PGRN/HSP70复合物相关。
PGRN用作GBA折叠和运输所需的HSP70途径的辅蛋白伴侣的发现，与以下事实(1)旨在提高GBA运输的基于蛋白伴侣的治疗已证明是用于GD的ERT (酶替代治疗)的有效备选36，和(2) 已显示重组HSP70有效改正在尼曼-皮克疾病(NPD)中见到的改变的溶酶体稳定性37，一起促使我们检查PGRN是否具有在GDs和其它LSDs中的治疗作用。使用类似的Lysotracker (溶酶体荧光探针)方法37，我们检查rPGRN对得自正常的成纤维细胞和11个不同的LSDs，包括GDs的患者成纤维细胞的影响。如所期望的，PGRN有效地恢复在得自I和II型两种GD (伴有或不伴有脂质刺激)的成纤维细胞中的改变的溶酶体(图33A、33B)。我们兴奋地观察到PGRN也使泰-萨二氏病、法韦尔病，和粘脂质贮积病III的成纤维细胞中改变的溶酶体显著正常化(图33A, 33B)。按照这些结果，GAG和M2神经节苷脂的积聚也在得自年老的PGRN缺乏小鼠的组织中观察到(数据未显示)。在III型GD、粘多糖病III和VI的情况下，PGRN证实在脂质刺激的存在下的有益作用(图34A、34B)。虽然PGRN修正得自LSDs (前面在单一患者疾病样品成纤维细胞中提到的)的患病溶酶体，我们初步评估，在我们的得自尼曼-皮克病B型、法布里病和粘脂质贮积病VI的样品中未观察到成纤维细胞的显著改善(图35A、35B)。然而，鉴于样本量小，计划用另外的样品进一步研究以评估PGRN在这些后一类疾病中的作用，由于还不能作出没有显著作用的结论。总之，这些结果涉及PGRN，作为HSP70运输途径的辅蛋白伴侣，除了GBA外，还涉及其它溶酶体酶的溶酶体递送。
讨论
报道了PGRN-缺乏小鼠表现出加速的脂褐质沉积和遍在蛋白化11,12。在此我们报告PGRN无效的鼠发展戈谢-样疾病，该发现进一步支持PGRN可能是溶酶体的关键调节剂这一主张26,38。OVA-攻击的成年和年老的两种PGRN无效的小鼠均表现出戈谢-样细胞和典型的管状-样溶酶体外观，这因此提出逼真模仿人GD体征的新的小鼠模型39。这个新的GD动物模型不仅有助于人们更好地理解GD的发病机理，而且还可促进治疗GD的新药的试验和开发。PGRN-缺乏小鼠的神经元已显示积聚脂褐质和线粒体ATP合酶的亚单位c (SCMAS)，其通常被认为是神经元蜡样脂褐质沉积(NCL)生物化学信号11,12。PGRN缺乏小鼠显示GD和NCL二者的发现表明表型的重叠特征。我们也观察到在我们的小鼠模型的脑中的脂褐质和SCMAS的积聚。因此，在报道的PGRN缺乏小鼠模型中的差异可能是由于在研究的细胞群中的差别所致(在GD中的巨噬细胞对比在NCL中的神经元)。在PGRN缺乏小鼠模型中GD-样的预料不到的发展导致我们检查PGRN水平是否也与GD人患者相关。确实，GD患者的血清PGRN水平不仅显著低于普通的健康对照组，而且也低于德系犹太人对照者，并且几种GRN基因变体也通过全GRN基因测序在GD患者中鉴定(图36)。
将HSP70分离为依赖于PGRN在我们的无偏筛选(unbiased screen)的存在的许多GBA-相关蛋白之一。有趣的是，GBA与HSP70关联以及它们在GD中的参与先前已有报道36,40,41，虽然它们的关联性质尚不清楚。此外，PGRN与HSP70的结合最近也有报道42。我们的方法确定了PGRN作为介导GBA的溶酶体递送的GBA/PGRN/HSP70三元复合物的重要组分。重要的是，PGRN，用作主要的连接GBA至HSP70-介导的折叠和运输途径的辅蛋白伴侣，有效地使得自GD患者的成纤维细胞的改变的溶酶体正常化。此外，旨在促进GBA折叠和运输的基于蛋白伴侣的治疗已证明是治疗GD的有前景的方法36,43。更重要的是，目前ERT仅对一种LSD相对有效，相应地，s，PGRN还可为除GD外的各种LSD的可供选择的治疗，因为PGRN也显著地校正其它LSD的患病溶酶体(图33、34、35)。
LIMP2，已知的GBA转运受体31,34,35，也聚集于PGRN缺乏的细胞中，并且GBA-LIMP2配体-受体与PGRN和HSP70蛋白伴侣构成三元复合物，其需要PGRN作为衔接子。此外，选蛋白，一种已知参与几种蛋白向溶酶体的递送的PGRN-结合溶酶体受体26,27，也通过直接结合于PGRN与这种三元复合物相关。一个提出的用于解释PGRN在通过HSP70辅蛋白伴侣通路，介导LSD酶的折叠和溶酶体递送中的作用的模型，用GBA/LIMP2举例说明，示于图17中。GBA/LIMP2通过作为主要的衔接子的PGRN与ER/高尔基体中的HSP70/辅蛋白伴侣关联，并同时转运至溶酶体。其它溶酶体受体，如选蛋白，也可促进复合物向内体/溶酶体的递送。另外，与PGRN/HSP70途径的关联对于GBA和LIMP2的折叠也可能是重要的。总的来说，PGRN用作经由介导GBA/LIMP2复合物的折叠和运输的GBA/LIMP2溶酶体转运机器不可缺少的组分。
虽然OVA促进PGRN KO巨噬细胞的GD-样表型的机制尚不清楚，有些已知的PGRN功能可促进理解在OVA-攻击的PGRN KO小鼠中的预料不到的观测结果。例如，PGRN与TNF受体结合并具有抑制各种病症中的炎症的能力7,13,13-16，因此PGRN的缺乏可导致巨噬细胞对OVA-诱导的炎症的异常响应。此外，炎症已知涉及多种鞘脂LSDs，抗-炎药物单独使用或与其它治疗组合具有治疗LSDs的益处2。此外，PGRN被报道与ER-应激相关的未折叠蛋白应答相关16，提示其在GD的细胞死亡中起关键作用44。PGRN的缺乏导致异常的ER应激响应和各种蛋白，如TDP-439,45和GBA/LIMP2 (该实例)的聚集，其继而诱导用于降解细胞质和核中聚集蛋白的增加的遍在蛋白化，而在溶酶体中，PGRN缺乏引起GBA的溶酶体递送的缺陷并继而引起β-GlcCer的积聚。OVA刺激可加速这种过程。最近，已报道RIPK3，一种介导坏死性凋亡的TNFR1信号传导复合物的组分，也涉及GD的病理学，抑制RIPK3可能是新的治疗GD的方法46。因此，PGRN's的抗-TNF和抗-细胞死亡活性也可促进其在GD和其它LSDs中的治疗作用。
GRN基因的突变与前颞痴呆症相关9,10。PGRN的不足与神经元退行性疾病相关47。GRN的纯合型突变也与NCL有关11,12。PGRN是介导GBA/LIMP2的溶酶体递送的HSP70途径的不可缺少的组分的发现也可能与神经退行性疾病有关。GRN基因的突变可直接影响HSP70运输途径并继而导致蛋白如TDP-43，和α-突触核蛋白的清除的缺陷48，或间接影响由GBA递送受损及随后的葡糖苷脂酰鞘氨醇的积聚所引起的溶酶体功能49。因此，PGRN作为HSP70的辅蛋白伴侣的鉴定也可有助于我们更好地理解作为GRN突变-相关障碍的基础的假定分子机制。此外，PGRN物理地结合于GBA，后者的突变也与帕金森氏病(PD)相关50，表明GRN和GBA基因之间可存在功能和遗传学联系，以及它们的纯合或杂合型突变可使得有些携带者易患罕见(GD)和/或常见(PD)疾病。
总之，该研究鉴定PGRN为一种先前未认识到的与GD相关的并能够引起GD的分子，因此为在GD和其它溶酶体贮积病中与这种关键因子有关的将来发现提供坚实的基础。此外，也分离出PGRN作为突出的HSP70-介导的折叠/运输途径的新辅蛋白伴侣，因此揭露了靶向代谢性疾病的这种主要途径的独特策略。考虑到HSP70折叠和运输途径参与大量的疾病过程，HSP70途径的这种新辅蛋白伴侣的鉴定和操控可能导致用于治疗LSDs，特别是GD，和其它代谢性病变和病症的创新治疗剂。
方法概述
使用各个动物模型，用于确定PGRN在GBA的溶酶体递送中的重要作用的体内测定:OVA-攻击的野生型和PGRN-缺乏小鼠的比较；1-岁龄野生型和PGRN-缺乏小鼠的比较；给予伊米苷酶或重组人PGRN (rPGRN)至OVA-攻击的、发展为戈谢-样疾病的PGRN-缺乏小鼠。
经重组PGRN检查β-GlcCer清除的体外基于细胞的测定：在存在或不存在rPGRN时，脂质-攻击的野生型和PGRN无效的骨髓衍生的巨噬细胞(BMDMs)的比较；在各个LSD的成纤维细胞(伴有或没有脂质刺激)中改变的溶酶体的PGRN纠正的比较。
用于表征戈谢-样疾病和用于观察戈谢-样细胞的测定：组织学分析；免疫组织化学；脂质组分分析；GBA酶活性；透射电子显微镜(TEM)；免疫金标记TEM；免疫荧光染色和共聚焦显微镜；流式细胞术；在活细胞中的活性溶酶体GBA使用MDW933 inhibody绿色探针标记。
鉴定和表征PGRN、GBA、HSP70和选蛋白中关联的质谱和蛋白/蛋白相互作用测定：共免疫沉淀；固相结合；分析表面等离子体共振与SensíQ Pioneer，灵敏的和传统的质谱。
材料和方法
材料：来自I、II和III型GD、泰-萨二氏病、法韦尔病、IV和IV型粘脂质贮积病(ML)、III和VI型粘多糖贮积病(MPS)、尼曼-皮克疾病类型B，和法布里病的成纤维细胞购自CoriellCell Repositories (Camden, NJ)，而正常的成纤维细胞购自Gibico。所有成纤维细胞在含有10 % FBS的DMEM培养基中培养。抗GBA抗体(sc-100544、sc-30844和sc-32883)、PGRN(SC-28928)、选蛋白(sc-376576)、α-GLA (sc-25823)、HSP70 (sc-373867)、Calregulin(sc-373863)、TGN38 (sc-271624)、EEA1 (sc-365652) LIMP2 (sc-55571)和LAMP2 (sc-18822)购自Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas)。β-GlcCer抗体(Cat. No. RAS_0010)购自Glycobiotech GmbH (德国)。用Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor 647，或青色素cy3标记的驴抗-小鼠IgG，和用Alexa Fluor® 488，或青色素cy3标记的驴抗-兔，和用Alexa Fluor 488，或青色素cy3标记的驴抗-山羊IgG购自Jackson ImmunoResearchLaboratories, Inc. (West Grove, PA)。重组His-标签PGRN蛋白从293T稳定的细胞系纯化，如前所述13,14。重组GBA (Cat. No. 7410-GH-010)、选蛋白(Cat. No. 3154-ST-050)，和LIMP2 (Cat. No. 1966-LM-050)蛋白和山羊抗-小鼠PGRN抗体(AF2557)购自R&D Systems(Minneapolis, MN)。人PGRN ELISA试剂盒购自AdipoGen (San Diego, CA)。ERK抑制剂PD98059、PI3K抑制剂渥曼青霉素和mTOR抑制剂雷帕霉素购自Life Technologies。伊米苷酶由Dr. Pastores提供。
慢性肺炎模型：C57B/L6 WT和PGRN KO小鼠在如前所述的纽约大学的动物饲养设施圈养13,55。8周龄小鼠在第1天和第15天经I.P.注射OVA-Alum攻击，接着在第29天开始1%OVA的鼻内攻击，1周3次，持续4周，诱导慢性肺炎51。在PGRN救济实验中，OVA的鼻内攻击的频率增加至1周3次。处死小鼠，并收集脾、肝、腿、肺和支气管肺泡灌洗液(BAL)。在PGRN救济实验中，当鼻内攻击开始时，每周I.P注射4 mg/kg重组PGRN或60 u/kg伊米苷酶。
在另一个实验中，WT和PGRN KO小鼠在纽约大学的动物饲养设施圈养直至1岁龄。直接处死年老的小鼠，并收集肺、脾、肝、股骨和脊骨用于组织学和显微-CT分析。
组织学和分析：处死小鼠后，切下未经灌注的一叶肺用于后续蛋白和脂质分析，肺的剩余部分用4%仲甲醛(PFA)灌注。也收集脾、肝和股骨，并用4% PFA固定。将所有这些组织包埋在石蜡中，切成薄片，并通过Mass Histology Service用H&E和PAS染色(Worcester,MA)。戈谢-样细胞数的定量，和戈谢-样细胞面积的测量用图像J软件分析。
从指定组的小鼠的股骨清除软组织。在常规固定，脱钙，和石蜡包埋后，制备组织切片并用苏木精和曙红染色。我们使用BioQuant软件，测量了在标准区(位于距生长板至少0.5 mm)内的骨体积，不包括初级松质骨和连接皮层骨的小梁骨，并计算在与用于评估骨体积(10×原始放大)的相同区域中的破骨细胞和骨小梁面积。
脂质组成分析: 收集得自WT和PGRN KO小鼠(伴有或没有OVA攻击)的肺，并用含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液匀化。此外，来自不同年龄的PGRN KO小鼠的肺和脾，和来自健康对照和GD患者的成纤维细胞也使用相同的方法处理。使用来自每个样品的1mg总蛋白，由南卡罗来纳医科大学Lipidomics Core测量脂质组成。神经酰胺、DAG、神经鞘磷脂、β-GlcCer，和葡糖基鞘氨醇(GlcSph)的水平通过高效液相色谱/质谱(LC-MS/MS)方法测量，如前所述的21。收集得自健康对照和GD患者，以及得自WT和PGRN KO小鼠的血浆，并测量β-GlcCer和GlcSph的水平。脂质的分析结果表示为：脂质水平/总细胞蛋白：pmol/mg蛋白，或pmol/ml血浆。
GBA酶活性: 使得自WT和PGRN KO小鼠的肺裂解，使用20 µg总蛋白以测量GBA活性，如前所述52。简言之，GBA活性通过在pH5.9溶液中(含0.15% Triton X-100和0.125%牛磺胆酸钠的50 mM柠檬酸盐磷酸缓冲液)裂解人造底物4-甲基伞形酮基-β-D-吡喃葡糖苷(4MUGP)成4-甲基伞形酮进行定量。4-甲基伞形酮的量以360 nm激发和460 nm发射过滤器测量。GBA活性表示为nM/mg总蛋白/h。
透射电子显微镜(TEM)：麻醉WT和PGRN KO小鼠(在OVA处理后)，以及年老的PGRNKO小鼠并用含有在0.1M甲次砷酸钠缓冲液(pH 7.2)中的2.5%戊二醛和2%仲甲醛的固定液灌注固定肺2小时。在洗涤后，在1% OsO4中固定样品1小时，用1%乙酸双氧铀阻断染色1小时，脱水并包埋在Embed 812 (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)中。切成60nm薄片，并通过标准方法用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色。在Philips CM-12电子显微镜(FEI；Eindhoven，Netherlands)下检查染色的网格(grid)并用Gatan (4k x2.7k)数字相机(Gatan, Inc., Pleasanton, CA)拍照。
对于免疫电子显微镜检，灌注小鼠并用4% PFA的0.1M 磷酸缓冲液(pH7.4)固定，切开肺并在新鲜制备的3% PFA的0.1M 磷酸缓冲液(含有0.1% 戊二醛和4%蔗糖) (pH 7.4)中连续固定。洗涤和脱水后，将组织包埋在Lowicryl K4M (Polysciences, Inc.,Warrington, PA)和LR White (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)中。聚合将在UV光(360nm)下，对于LK4M于-35℃和对于LR White于-10℃下进行。切下超薄切片，固定在Formvar-Carbon涂布的镍网格上。在用第一抗体于4℃孵育过夜后，应用金缀合的第二抗体(15nm Protein A Gold, Cell Microscopy Center, University Medical CenterUtrecht, 35584 CX Utrecht, The Netherlands; 18nm Colloidal Gold-AffiniPureGoat Anti-Rabbit IgG (H+L), Jackson ImmunoReasearch Laboratories, Inc., WestGrove, PA)。网格用乙酸双氧铀和柠檬酸铅经标准方法染色，并在Philips CM-12电子显微镜(FEI；Eindhoven, The Netherlands)下检查并用Gatan (4k x2.7k)数字相机(Gatan,Inc., Pleasanton, CA)拍照。
免疫荧光染色和共聚焦显微镜：冷冻的肺切片，或盖玻片培养的BMDM，用4%仲甲醛固定5 min并用PBS洗涤两次。细胞经0.1% Triton-100 PBS渗透5 min，然后用PBS洗涤。用1:50 稀释的正常驴血清封闭组织30 min。第一抗体在玻片上于4℃探测过夜。次日用PBS洗涤玻片，加入荧光-标记的第二抗体(Alexa Fluor® 488-标记的驴抗-小鼠与青色素cy3-标记的驴抗-兔抗体合并，或在一些实验中使用不同的荧光)持续1小时并用PBS洗涤。使组织或BMDM细胞固定在含有DAPI的防褪色培养基中。图像用Leica TCS SP5共聚焦系统拍摄。
流式细胞术：当处死小鼠时收集BAL，并以1200 rpm离心5 min以收集细胞。使细胞悬浮并在含有0.1% FBS的冰冷的PBS中洗涤两次。用FITC-标记CD11b抗体(eBioscienceSan Diego, CA)染色细胞1小时并通过BD FACScan分析，而数据用FlowJo软件分析。
骨矿物质密度(BMD)的测量：我们使用PIXImus骨密度计(Lunar, Madison, WI)评估年老的WT和PGRN-缺乏小鼠的全骨骼的BMD (gm/cm2)。在每次扫描期前校准器械，根据生产商的指导原则，使用具有已知的BMD的模型。通过腹膜内注射氯胺酮(90 μg/g体重)和甲苯噻嗪(10 μg/g体重)麻醉小鼠，然后以卧姿放置在样品托盘上以允许扫描整个骨骼。
显微-CT：使用Scanco μCT40扫描仪(Scanco Medical AG, Basserdorf,Switzerland)，测量股骨远端干骺端的骨小梁体积。阈值300被用于所有扫描的评估。分析30片，从第一片开始，其中髁突和初级骨松质不再是可见的。
免疫沉淀：使得自OVA-攻击或-未攻击的WT和PGRN KO小鼠(伴有或没有rPGRN治疗)的肺组织通过含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解。12000 rpm离心10 min以使细胞碎屑沉淀。将上清液转移到新管并用10秒的超声脉冲进一步释放膜蛋白。将来自每组小鼠的相同量蛋白混合一起以代表各组的蛋白质分布。将来自混合样品的400 µg蛋白用于免疫沉淀。加入2 µg/ml正常的小鼠和兔抗体和20 µl蛋白A/G琼脂糖珠，并于4℃孵育1小时。以3000 rpm离心5 min以沉淀珠。将上清液转移到新管中并加入2 µg/ml第一抗体，于4℃孵育1小时，然后加入20 µl蛋白A/G琼脂糖珠并孵育过夜。用RIPA裂解缓冲液洗涤珠6-8次，将样品在SDS-PAGE上运行，用抗体探测目标蛋白，并通过蛋白质印迹法观察。在有些实验中，样品经免疫沉淀后被送往NYU core facility进行质谱。
免疫组织化学：得自WT和PGRN KO小鼠的石蜡-包埋的肺切片经二甲苯和梯度乙醇脱石蜡。抗原通过使用0.1%胰蛋白酶(用0.1% CaCl2从0.5%胰蛋白酶稀释)于37℃修复30min。内源性过氧化氢酶用在PBS中的3% H2O2失活10分钟。切片用3% BSA和20%山羊血清封闭30分钟。第一抗体用2%山羊血清，按1:20-50稀释，于4℃在玻片引发过夜。次日用PBS洗涤玻片并加入第二抗体(1:200 生物素-标记的山羊-抗兔抗体或山羊-抗小鼠抗体)持续1小时。用载体ABC过氧化物酶试剂盒，接着是DAB底物观察染色。
质谱：1) 凝胶分离和消化。用DTT于57˚C还原样品1小时并于RT下、在暗处用碘代乙酰胺烷基化45分钟。将每个样品加载到NuPAGE® 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm。凝胶用GelCode蓝色染料试剂(Thermo Scientific)染色和考马斯亮蓝(Coomassie)染色的凝胶带如在凝胶图像指示的被切除。切除的凝胶片用甲醇和100 mM碳酸氢铵的50:50 v/v溶液脱染色。凝胶片用乙腈漂洗而被部分地脱水，并且在SpeedVac浓缩器中进一步干燥20分钟。将300 ng测序级修饰的胰蛋白酶(Promega)加入每个凝胶样品中。在胰蛋白酶被吸收后，加入100 µl 100 mM碳酸氢铵以覆盖凝胶片。于RT在摇动器上进行消化过夜。
(2) 蛋白提取。将R2 20 µm Poros珠(Life Technologies Corporation)在5%甲酸和0.2%三氟乙酸(TFA)中的浆液以等于加入以供消化的碳酸氢铵的体积的体积加入到每个样品中。于4˚C振摇样品2小时。将珠加载到平衡的C18 ziptips (Millipore)上，使用微型离心机以6000 rpm离心30秒钟。用0.1% TFA漂洗凝胶片3次并将每份漂洗液加入到其相应的ziptip，接着微量离心。经提取的porors珠用0.5%乙酸进一步洗涤。通过添加在0.5%乙酸中的40%乙腈，接着添加在0.5%乙酸中的80%乙腈，稀释肽。有机溶剂使用SpeedVac浓缩器除去并使样品在0.5%乙酸中复溶。
MS分析。1/5的每个样品首先用分析的mIgG进行单独的分析，然后用KO GBA，和最后用WT GBA分析。样品经注射以供使用EASY-nLC 1000 (Thermo Scientific)的自动取样器的在线LC-MS。肽从柱直接梯度稀释至Q Exactive质谱仪(Thermo Scientific)，使用1小时梯度溶剂A：5%乙腈，0.5%乙酸，溶剂B：95%乙腈，0.5%乙酸。
MS方法. 高分辨率全MS谱用70,000的分辨率获取，1e6的AGC目标，最大离子时间为120 ms，和扫描范围为300-1500 m/z。在每次全MS后，获得20个数据-依赖的高分辨率HCDMS/MS谱。收集所有MS/MS谱，使用以下设备参数：17,000的分辨率，2e5的AGC目标， 250 ms的最大离子时间，一个显微扫描，2 m/z分离窗，150 m/z的第一次质量固定，和27的NCE。使用在Proteome Discoverer中的Sequest，对uniprot小鼠数据库检索MS/MS谱。
表面等离子体共振(SPR)：所有SPR实验由SensiQ Technologies Inc. (OklahomaCity, OK)，使用SensíQ Pioneer在控制的分析温度25◦C下进行，仪器样品架中的样品维持于18℃。整个固定和分析的运行缓冲液由10mM HEPES、150mM NaCl、0.005% 吐温20组成。对于各运行，缓冲液的pH被调节至pH 7.4、6.5、6.0或5.5，并且对于每个pH，运行缓冲液被用来制备PGRN样品和蔗糖扩散标准品。
安装COOH1芯片并经由10秒钟注射(各2x) 10mM HCl、50mM NaOH，和0.1% SDS来调节。以20uL/min的流速，经由5分钟注射在水中的4mM EDC和1mM NHS激活通道3。然后以10uL/min的流速，注射GBA (25ug/mL在10mM乙酸钠中，pH 5.5) ~2分钟。然后通道1和2用在水中的4mM EDC和1mM NHS激活5分钟。选蛋白(10ug/mL在乙酸钠中，pH 4.0)经由5分钟注射，以10uL/min流速固定于通道1上。BSA (10 ug/mL在乙酸钠中，pH 4.3)被固定于参考通道以减少非-特异性结合。用4分钟注射1M乙醇胺(pH8.0)覆盖所有通道。
PGRN的测定用总共5份缓冲液空白注射和2份一式两份的200nM PGRN进行，所有这些都被给予1小时的解离时间。为这种测定，使用OneStep™注射以从单一的梯度注射测定动力学速率常数和平衡解离常数。进行在运行缓冲液中的3%蔗糖的两次注射以用作扩散标准品。
数据使用QDat分析软件(SensíQ Technologies and BioLogic Software)分析。将所有数据双重引用到参考通道(通道 2)和空白缓冲液。使用空白缓冲液的平均信号以减去注射假象。来自分析通道的参考的SPR数据经模型拟合以确定相互作用的ka、kd和KD。
固相结合：将0.1、1、2和5 µg/ml PGRN蛋白涂布在96-孔的PBS中过夜，重复3个孔。用0.1%吐温/ PBS洗涤板5次，然后用2% BSA/PBS溶液封闭。按照EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素和生物素化试剂盒(Thermo Scientific)的方案，用生物素标记2 µ g BSA、LIMP2和GBA蛋白。加入生物素-标记的LIMP2、GBA或BSA至板中并孵育2小时。用0.1%吐温/PBS洗涤，并用链霉抗生物素-HRP (1:2000稀释度)溶液包被1小时。洗涤后加入底物并用100 µl 2MH2SO4终止反应。以UV 450nm在读板仪读出结果。
BMDM分化和体外GD模型：BMDMs的分化通过先前报道的以下方案进行25,53。简言之，从WT和KO 骨髓分离单核细胞并在补充有L929条件培养基的RPMI1640中培养5天以分化为巨噬细胞。为体外模拟产生戈谢细胞，将含有各种脂质，包括鞘脂的50 µg/ml脑溶胞产物(在10ml DMEM培养基中，用Bio-Gen PRO200匀化器以最高速度匀化1g小鼠脑组织1 min)加入细胞培养上清液中10天。在体外救济实验的情况下，将0.1和0.4µg/ml PGRN与脂质同时加入。每三天补充细胞培养基。β-GlcCer的水平通过免疫荧光染色进行染色。
活性形式的溶酶体GBA的荧光标记：MDW933，一种标记活性溶酶体GBA的特异性敏感荧光染料28,30，由莱顿大学的Dr. Hermen E. Overkleeft慷慨地提供。BMDMs在盖玻片上培养，并将MDW933 (50 nM)加入培养基2小时以标记溶酶体GBA。然后用在PBS中的3% (v/v)仲甲醛固定细胞15 min，并用在PBS中的0.1 mM NH4Cl渗透10 min。BMDMs用DAPI-介质固定，而荧光在共聚焦显微镜下观察。
PGRN和HSP70经siRNA途径的敲除：针对小鼠PGRN和HSP70的siRNAs购自LifeTechnology。用20 pmol相应的siRNA，使用Lipofectamine 2000转染RAW264.7细胞。然后用脂质混合物(50 µg/ml)处理细胞24小时，活性形式的GBA的水平用MDW933染料测量，而PGRN或HSP70的敲除效率通过免疫荧光染色，使用它们的特异性抗体检查。
LSD成纤维细胞的溶酶体染色：将得自不同的LSDs和健康对照者的成纤维细胞在24-孔板的盖玻片上，在重组PGRN蛋白(0.4 µg/ml)、脂质裂解剂(50µg/ml)，和PGRN加脂质裂解剂的存在下或不存在下培养24小时。次日，经1小时加入含有100nM Lysotracker® Red(溶酶体红色荧光探针)的新鲜培养基。细胞用PBS洗涤并在2% PFA中固定。将盖玻片固定于切片上，染色的溶酶体用共聚焦显微镜成像。自每个样品随机拍摄10幅图像，而荧光强度用图像J软件测量。
人研究的参与者：由Dr. Pastores从纽约大学医学院收集115份GD样品。来自普通人群的44个健康对照者和德系犹太人的55个健康对照者由Dr. Saunders-Pullman从贝斯以色列医学中心(Beth Israel Medical Center)提供。每个患者签署了同意书。该研究由纽约大学医学院和贝斯以色列医学中心的伦理审查委员会批准。
GD患者中的PGRN的血清水平：PGRN的血清水平通过得自Adipogen (San Diego,CA)的ELISA试剂盒测量。简言之，用300 µl封闭缓冲液封闭ELISA板30 min。用PBS稀释血清200倍。在封闭后，加载100 µl样品和标准品2小时。用PBS/吐温洗涤板5次并加入100 µl检测抗体1小时。再次洗涤板并经另一小时加入100 µl 检测剂。漂洗该板并加入100 µl TMB底物溶液，并用停止溶液终止反应。用读板仪于450 nm记录结果。PGRN的浓度基于标准曲线计算。
测序GRN基因：来自40 GD患者的基因组DNAs被用作通过Phusion®高-保真DNA聚合酶(NEB Inc, Ipswich, MA)，扩增全长GRN基因，包括1kb启动子区和8kb全长GRN基因的模板。所有PCR产物以等摩尔比例在一个试管中混合。最终样品被送到耶鲁大学基因组设施，通过一种新技术，PacBio RS II测序系统54以供基因测序。每个患者的序列通过他们的条码序列分类，并使用得自Pacific BioSciences (github, Pacific Biosciences；Chaisson, MJ和Tesler, G (2012) BMC Bioinformatics 13: 238)的具有连续细化的基本局部比对(basic local alignment with successive refinement) (blasr)对全长GRN序列进行比对，然后采用SAMtools (samtools sourceforge)检测患者样品的变化。
统计学分析：为比较各治疗组，我们进行未配对t-检验，和单向或双向ANOVA (在合适时)。所有统计学分析使用SPSS软件进行。统计学意义是双侧的并当p< 0.05时达到。
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实施例2
PGRN衍生肽ATSTTRIN
PGRN肽，特别是包括表示为Atsttrin的PGRN衍生肽, 已被评价和鉴定为具有重叠PGRN活性并且，在有些情况下，活性升高(对比野生型或全长PGRN)。PGRN衍生肽Atsttrin作为TNF/TNFR活性和信号传导的调节剂，抑制或阻断TNF-介导的信号传导或响应，包括TNF-α-诱导的炎性关节炎是有活性的(Tang W et al (2011) Science 332:478-484；WO2010120374)。Atsttrin是一种PGRN-衍生的工程蛋白(TNF/TNFR通过靶向TNF受体的信号传导的拮抗剂)，包含PGRN单元A、C和F的半单元的组合与接头单元P3、P4和P5的组合(美国专利8,362,218；WO 2010120374)。Atsttrin提供一种PGRN-衍生的活性肽，其具有与全长PGRN分子的重叠活性和能力。
对PGRN衍生肽Atsttrin，如同PGRN在LSDs中，包括在PGRN KO诱导的戈谢病中的活性和作用进行评估。发现PGRN和PGRN-衍生的工程蛋白Atsttrin二者救济β-GlcCer在PGRNKO巨噬细胞中的积聚。得自PGRN KO小鼠的BMDM用50µg/ml脂质处理10天，伴有或没有各个量的PGRN或atsttrin (100 ng/ml或400 ng/ml)并评价(图39)。在光学显微镜下，BMDM显得杂乱并且细胞在脂质治疗后变得紊乱，而这些形态学改变部分地被PGRN和Atsttrin中的任何一个以剂量-依赖的方式救济(上小图) (图39第一组小图(LM))。β-GlcCer积聚用脂质治疗，而所述积聚被以剂量-依赖的方式加入重组PGRN和Atsttrin的任何一种而得到防止(图39)。
PGRN和Atsttrin被发现救济β-GlcCer在得自GD患者的成纤维细胞中积聚。成纤维细胞从II型GD患者中分离并对未治疗、脂质混合物单独，或脂质混合物与用PGRN (400ng/ml)或者atsttrin (400ng/ml)联合治疗进行评估。成纤维细胞用50 µg/ml脂质混合物(伴有或没有加入PGRN或atsttrin)处理2天。GBA和β-GlcCer的表达然后经免疫荧光染色测量，并用共聚焦显微镜获取图像。结果(图40)显示脂质治疗显著诱导GBA聚集和β-GlcCer积聚在GD成纤维细胞中，并且400ng/ml PGRN治疗几乎完全防止GBA聚集和β-GlcCer贮积。与得自PGRN KO小鼠的BMDM不同，Atsttrin在救济积聚表型方面表现出比PGRN更小的功效。
我们发现PGRN和Atsttrin二者在得自PGRN KO小鼠的BMDM中效果很好，然而，Atstrrin在相同剂量时，在GD成纤维细胞中显示出稍微较低的疗效。提示PGRN可以成功地进入成纤维细胞，而Atsttrin进入成纤维细胞的效率较低。PGRN的内吞作用由选蛋白介导，并且PGRN用其最后三个C-末端的氨基酸结合选蛋白，而Atsttrin不具有这种基序。我们推测，Atsttrin可能不能经由选蛋白-依赖的内吞作用(entodytosis)途径进入成纤维细胞。值得注意的是，增加的浓度的Attstrin (见下文)有效地救济β-GlcCer在GD成纤维细胞中的积聚。相反，PGRN和Atsttrin二者均可被巨噬细胞摄取，因此这两种蛋白在巨噬细胞中是同等有效的。
进一步的研究显示，Atsttrin以剂量-依赖的方式救济β-GlcCer积聚，特别是在较高剂量时。得自GD患者的成纤维细胞用50 µg/ml脂质混合物(如上所述)，与各个量的Atsttrin (0.5µg/ml、5µg/ml，和50µg/ml)一起处理。评估β-GlcCer水平并通过免疫荧光染色观察(图41)。Atsttrin以剂量-依赖的方式(且特别是50 µg/ml)救济β-GlcCer积聚.
然后在PGRN KO小鼠中对比评估Atsttrin和PGRN。如上所述，通过用OVA攻击诱导PGRNKO小鼠的戈谢病。KO小鼠用重组PGRN蛋白、BSA，或Atsttrin (4 mg/kg/周)注射(i.p.)，持续4周。然后，对肺组织变化进行组织学检查，定量戈谢细胞数并测定戈谢细胞大小。结果提供于图42中。用PGRN或者atsttrin处理的动物显示出类似的组织学，用PGRN或者PGRN衍生肽Atsttrin治疗减少戈谢细胞数以及细胞大小。无论是PGRN还是atsttrin的显著性程度是类似的。
实施例3
PGRN衍生肽ATSTTRIN在各种溶酶体贮积病中的有效性
接着，从LSD患者获得成纤维细胞并用PGRN或者Atsttrin处理。从患有各种溶酶体贮积病，包括戈谢病(GD)；泰-萨二氏病(TSD)；粘脂质贮积病(ML)；粘多糖贮积病(MPS)；异染性脑白质营养不良 (MLD)；和法韦尔病(FD)的患者评估成纤维细胞。对于每组LSD疾病成纤维细胞，LSD成纤维细胞用脂质单独或与重组PGRN或atsttrin (0.4 µg/ml)组合分别攻击24小时。溶酶体用溶酶体红色荧光探针染色。在共聚焦显微镜下，对每个样品随机拍摄10幅图像，并基于荧光强度，用图像J软件对溶酶体贮积定量。结果描述于图43和图44中。如结果所示的，Atsttrin和PGRN二者均是有效的并在所有LSD疾病(戈谢病I型和II (GDI和GDII)、泰-萨二氏病(TSD)；粘脂质贮积病III (MLIII)、粘多糖贮积病II、III和VI (MPSII、MPSIII、MPSVI)、异染性脑白质营养不良(MLD)，和法韦尔病(FD))的成纤维细胞中，溶酶体贮积显著减少。
评估得自慢性神经病性形式戈谢病III型(GDIII)的成纤维细胞。得自GD III患者的成纤维细胞用脂质单独或用重组PGRN或atsttrin (0.4 µg/ml)分别攻击24小时。溶酶体用溶酶体红色荧光探针染色并对每个样品随机拍摄10幅图像，基于荧光强度对溶酶体贮积定量。在该研究中，PGRN是明显有效的，然而用Atsttrin治疗的溶酶体贮积，如由荧光强度评估的，没有显著减少(图45)。
在LSD成纤维细胞研究中，有些病变的成纤维细胞显示PGRN或atsttrin减少溶酶体贮积的更小的作用。然而，这些仅仅是一组实验。使用如上所示的相同的方法，得自法布里病(FABRY)粘脂质贮积病IV (MLIV)；粘多糖贮积病IVA和VII (MPSIVA和MPSVII)和尼曼-皮克病A和B (NPDA和NPDB)的每一种的LSD成纤维细胞通过用脂质单独或与重组PGRN或atsttrin (0.4 µg/ml)攻击LSD成纤维细胞来评估(图46)。在这些特定LSD成纤维细胞的每一种中，发现无论是PGRN或者是atsttrin的作用都不是显著的。
得自克拉伯病患者的LSD成纤维细胞被类似地评估(图47)。PGRN和Atsttrin二者均有效显著减少溶酶体脂质在克拉伯病患者成纤维细胞中的贮积。
总之，这些研究证实颗粒蛋白前体PGRN和颗粒蛋白前体衍生物肽二者在减少溶酶体在各种公认的溶酶体贮积病中贮积的显著有效性，如通过PGRN肽Atsttrin所例证的。PGRN和Atsttrin二者显著减少在得自患有LSDs包括戈谢病、泰-萨二氏病、异染性脑白质营养不良、法韦尔病，以及在粘脂质贮积病和粘多糖贮积病形式的患者的细胞溶酶体中的脂质堆积。
实施例4
在溶酶体贮积病泰-萨二氏病中的颗粒蛋白前体的评估
泰-萨二氏病(也称为GM2神经节苷脂贮积病或氨基己糖苷酶A缺乏症)是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病，其进行性破坏大脑和脊髓的神经细胞。泰-萨二氏病起因于当一种有助于分解脂肪物质的酶(β-氨基己糖苷酶A) (图1)缺乏时和当有害量的神经节苷脂积聚在脑神经细胞中时发生疾病，最终导致细胞的过早死亡。神经节苷脂是鞘脂的一种形式，因此泰-萨二氏病是神经鞘脂贮积病的成员。
泰-萨二氏病在婴儿中可变得明显(婴儿泰-萨二氏病)，其中婴儿在3-6个月龄后失去运动技能，如翻身、坐着和爬行。随着疾病进展，儿童的身体丧失功能，导致失明、耳聋、瘫痪和死亡。迟发形式的泰-萨二氏病也有发生但很少见，最初见于2-10岁(青少年泰-萨二氏病)或后来罕见的形式出现在30多岁或40多岁的成人(成人/晚发型泰-萨二氏病)。特征性特征包括肌肉无力、肌肉协调能力丧失(共济失调)、痉挛，和其它运动问题、言语问题，认知能力下降，和精神病。在编码酶β-氨基己糖苷酶A的α亚单位的HEXA基因中的突变引起泰-萨二氏病。β-氨基己糖苷酶A酶位于溶酶体中并帮助分解GM2神经节苷脂。GM2神经节苷脂在溶酶体中积聚至毒性水平。泰-萨二氏病患者和泰-萨二氏病的携带者可通过测量氨基己糖苷酶A活性的血液试验或通过评估HEXA基因的突变来鉴定。注意到泰-萨二氏病在德系犹太人群中的流行率增加。导致HEXA基因的阅读框改变的外显子11中四碱基对的插入(1278insTATC)已被确认是德系犹太人群中是最普遍的HEXA突变。这种突变也发现于法裔路易斯安那州人中。两个其它不相关的突变已在法裔加拿大人中鉴定并与泰-萨二氏病相关。
目前尚不能治愈或治疗泰-萨二氏病。即使有最好的护理，罹患婴儿泰-萨二氏病的儿童到4岁时将死亡。患者接受支持性护理以缓解症状或延长生命。在迟发型泰-萨二氏病中，药物(如，治疗抑郁症的锂)有时可控制精神病症状和癫痫发作。最近，研究者发现乙胺嘧啶(Pyrimethamine)可增加β-氨基己糖苷酶活性，因此有效地减慢迟发型泰-萨二氏病的进展(Clarke JT, et al (2004) Molecular Genetics and Metabolism 102 (1): 6–12；Osher E, et al (2011) Mol. Genet. Metab. (Molecular Genetics andMetabolism) 102 (3): 356–63)。
以上实施例研究和图33评估得自LSD患者，包括泰-萨二氏病患者的成纤维细胞中的溶酶体。得自健康对照和不同的LSDs包括泰-萨二氏病的成纤维细胞用颗粒蛋白前体(PGRN) (用和不用脂质刺激)处理。PGRN显著纠正泰-萨二氏病患者成纤维细胞中的溶酶体。进行以下研究以另外评估PGRN在泰-萨二氏病中并作为调节剂的作用。
首先，HexA蛋白以及HexB (其编码酶(β-氨基己糖苷酶A)的β亚单位)的水平在PGRN KO小鼠中评估。通过免疫组织化学(HexA抗体sc-376777，和HexB抗体sc-134581，来自Santa Cruz)，对得自OVA攻击后WT和PGRN KO小鼠的肺组织(在早先实施例的上文中描述)针对HexA和HexB进行染色。结果描述于图37中并证实HexA，但不是HexB聚集于PGRN小鼠中。
同样，在年老的PGRN KO小鼠脑中，对GM2神经节苷脂进行评价。得自年老的PGRNKO小鼠的脑组织通过免疫组织化学，用GM2抗体染色并与WT小鼠(GM2抗体，Cat. No.345759, EMD Millipore)比较。图38表明在年老的PGRN KO小鼠脑中的GM2升高。因此我们得出结论，通过PGRN敲除，HexA聚集和GM2积聚在脑中。PGRN的缺乏导致GM2神经节苷脂的积聚和HexA的改变，这二者均是泰-萨二氏病的指标，进一步指明了PGRN在泰-萨二氏病中的作用并为PGRN在泰-萨二氏病患者和患者细胞中的作用提供了进一步的论证。
本发明可以其它形式得到体现或以其它方式进行而不背离其精神或必要特征。因此认为本公开在所有方面是举例说明的，而不是限制性的，本发明的范围由所附权利要求书指明，并且在等效意义和范围内的所有变化均意欲包括在其中。
在本说明书中引用了各种参考文献，其各自通过引用以其整体结合到本文中。

Claims (32)

1.一种用于治疗或减轻溶酶体贮积病的组合物，其包含分离的PGRN，或其活性片段包括atsttrin，其中所述PGRN或活性片段包含如图49或50的任何一个所示的氨基酸序列。
2.权利要求1的组合物，其还包含用于溶酶体贮积病的酶替代治疗剂或底物还原治疗剂。
3.权利要求2的组合物，其还包含葡糖脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-氨基己糖苷酶和神经鞘磷脂酶的一种或多种。
4.权利要求2的组合物，其包含与葡糖脑苷脂酶组合用于治疗或减轻戈谢病的PGRN或atsttrin。
5.权利要求2的组合物，其包含与β-氨基己糖苷酶A组合用于治疗或减轻泰-萨二氏病的PGRN或atsttrin。
6.权利要求1的组合物，其还包含一种或多种分子伴侣或溶酶体递送蛋白。
7.权利要求6的组合物，其中分子伴侣或溶酶体递送蛋白是HSP70。
8.权利要求1-7的任一项的组合物，其是药用组合物并且还包含药学上可接受的载体、媒介、稀释剂或赋形剂。
9.一种在动物中促进蛋白或酶的溶酶体递送的方法，其包括给予所述动物分离的PGRN，或其活性片段包括atsttrin，其中所述PGRN或活性片段包含如图49或50的任一个中所示的氨基酸序列。
10.权利要求9的用于在患有戈谢病的患者中促进葡糖脑苷脂酶(GBA)的递送的方法，其包括给予所述患者分离的PGRN，或其活性片段包括atsttrin，其中所述PGRN或活性片段包含如图49或50的任何一个中所示的氨基酸序列。
11. 权利要求9的用于在患有泰-萨二氏病的患者中促进β-氨基己糖苷酶A (HexA)的递送的方法，其包括给予所述患者分离的PGRN，或其活性片段包括atsttrin，其中所述PGRN或活性片段包含如图49或50的任何一个中所示的氨基酸序列。
12.一种在动物中治疗或减轻溶酶体贮积病的方法，其包括给予所述动物分离的PGRN，或其活性片段包括atsttrin，其中所述PGRN或活性片段包含如图49或50的任何一个中所示的氨基酸序列。
13.权利要求12的方法，其包括另外给予一种或多种溶酶体酶，所述溶酶体酶在溶酶体贮积病中是减少、缺乏、突变或改变的。
14.权利要求12的方法，其中溶酶体贮积病选自戈谢病(GD)、泰-萨二氏病、法布里病、法韦尔病、桑德霍夫病、GM1神经节苷脂贮积病、克拉伯病、尼曼-皮克病(A型、B型、C型)、庞贝氏病、II型粘脂贮积病(亨特综合征)、IIIA型粘脂贮积病、婴儿游离唾液酸贮积病(ISSD)、溶酶体酸脂酶缺乏症、青少年氨基己糖苷酶A缺乏症、沃尔曼病和扎拉病。
15.权利要求12的方法，其中溶酶体贮积病选自戈谢病(GD)、泰-萨二氏病(TSD)、粘脂贮积病(ML)、粘多糖贮积病(MPS)、异染性脑白质营养不良(MLD)、法韦尔病(FD)和克拉伯病(KD)。
16.权利要求12的方法，其包括另外给予溶酶体酶葡糖脑苷脂酶(GBA)或其活性片段或重组形式，用于治疗或减轻戈谢病。
17. 权利要求12的方法，其包括另外给予溶酶体酶β-氨基己糖苷酶A (HexA)或其活性片段或重组形式，用于治疗或减轻泰-萨二氏病。
18.权利要求12的方法，其中溶酶体酶选自葡糖脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-氨基己糖苷酶和神经鞘磷脂酶的一种或多种。
19.一种诊断或评估动物的溶酶体贮积病的方法，其包括在所述动物中测定PGRN的表达或活性或检测基因组DNA或编码PGRN的基因中的一个或多个突变。
20.权利要求19的方法，其还包括在所述动物中测定一种或多种溶酶体酶的表达或活性或检测基因组DNA或编码一种或多种溶酶体酶的基因中的一个或多个突变。
21.权利要求19的方法，其用于诊断或评估动物的戈谢病。
22.权利要求19的用于诊断或评估戈谢病的方法，其还包括在所述动物中测定GBA的表达或活性或检测基因组DNA或编码GBA的基因中的一个或多个突变。
23.权利要求19-22的任一项的方法，其中选自rs4792937、rs850713、rs78403836、rs5848，和3个点突变，p.C315S、p,E316Q和p.P365A的一个或多个PGRN突变被测定。
24.权利要求22的方法，其中选自rs4792937、rs850713、rs78403836、rs5848，和3个点突变，p.C315S、p,E316Q和p.P365A的一个或多个PGRN突变被测定。
25. 权利要求24的方法，其中PGRN SNP位点通过Tagman基因分型方法测定，其中引物选自：用于突变rs4792937的正向引物，5’-TGTCCTGGAAA CCATCCTTC-3’ (SEQ ID NO: 11)、反向引物5’-CTCCCAAAGC GATTCTCCTA-3’ (SEQ ID NO: 12)，和Taqman标签序列5’-TCAGTAGCTCACA[T/C]TTGTAA-3’ (SEQ ID NO: 13)；用于突变rs850713的正向引物5’-CCTTCCC T GAGTGGGCTGGTA-3’ (SEQ ID NO: 14)、反向引物5’-AGT GCACCCTGTCTTCACAGC-3’ (SEQ ID NO: 15)，和Taqman标签序列5’-AGGTACAAATCTGGGG GAGATGGGG[A/G]TATGTGGAGGGAAGTGGG GGCAGAG-3’ (SEQ ID NO: 16)；用于突变rs78403836的正向引物5’-CTGTCCTCTCCCATGGCTAC-3’(SEQ ID NO: 17)、反向引物5’-GCGGACCTGTAAGCATGAAT-3’(SEQ ID NO: 18)，和Tagman标签序列5’-AGGAAGAC [G/ C]TGATTTT-3’ (SEQ ID NO: 19)；用于突变rs5848的正向引物5’-CCAGGGGTACCAAGTGTTTG-3’ (SEQ ID NO: 20)、反向引物5’-CACAGGGTCCACTGAAACG-3’ (SEQ ID NO: 21)，和Taqman标签序列TCTGCTCAGGCCTCCCTAGCACCTC[C/ T]CCCTAACCAAATTCTCCCTGGACCC (SEQ ID NO: 22)；以及用于p.C315S、p,E316Q和p.P365A的点突变，其中用于PCR扩增的引物包含正向引物5’-GGTGGTGTAAGCGGTAC CCT-3’ (SEQ ID NO: 23)和反向引物5’-ACCTGCCCAGGCCAAGATGC-3’(SEQ ID NO: 24)，接着是测序。
26.一种通过检测PGRN的存在或活性和量，诊断或评估动物的溶酶体贮积病的试剂盒，其包含
(a) 预定量的PGRN的可检测标记的、特异性结合的配偶体或针对PGRN的抗体；
(b) 其它试剂；和
(c) 所述试剂盒的使用说明。
27.一种通过检测PGRN突变在动物中的存在，诊断或评估所述动物的溶酶体贮积病的试剂盒，其包含
(a) 对PGRN基因或编码DNA具有特异性的或针对PGRN基因或编码DNA的一种或多种核酸探针或引物；
(b) 其它试剂；和
(c) 所述试剂盒的使用说明。
28.权利要求27的试剂盒，其中一种或多种核酸引物或探针对PRN突变是特异性的或适合于检测或测定PRN突变，所述PRN突变选自rs4792937、rs850713、rs78403836、rs5848，和3个点突变，p.C315S、p,E316Q和p.P365A。
29.权利要求26-28的任一项的用于诊断或评估戈谢病的试剂盒，其中所述试剂盒还包含GBA的可检测标记的特异性结合配偶体或针对GBA的抗体，或者对GBA基因或编码DNA具有特异性或针对GBA基因或编码DNA的一种或多种核酸探针或引物。
30.一种用于戈谢病的动物模型，其中动物包含改变的PGRN，其中PGRN是无效、缺乏或突变的和溶酶体底物β-GlcCer在巨噬细胞中是增加的。
31.权利要求30的动物模型，其还包含与戈谢病相关的GBA突变或其中GBA是无效或缺乏的。
32.一种用于泰-萨二氏病的动物模型，其中动物包含改变的PGRN，其中PGRN是无效、缺乏或突变的和溶酶体底物β-氨基己糖苷酶A在巨噬细胞中是增加的。
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