JP2017510623A - リソソーム蓄積症の診断および治療のためのプログラニュリン（ｐｇｒｎ）およびその誘導体 - Google Patents

リソソーム蓄積症の診断および治療のためのプログラニュリン（ｐｇｒｎ）およびその誘導体 Download PDF

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Abstract

本発明は、特にプログラニュリン（ＰＧＲＮ）またはアトストリンを含めた活性なＰＧＲＮペプチドを利用する、ゴーシェ病およびテイ・サックス病を含めたリソソーム蓄積症を診断および治療するための組成物および方法ならびにそれらの診断および治療を提供する。本発明は、ＰＧＲＮヌル変異体およびＰＧＲＮ遺伝子ノックアウトを含めたＰＧＲＮ変異に基づくまたはそれを含む、ゴーシェ病およびテイ・サックス病を含めたリソソーム蓄積症の動物モデルも提供する。

Description

本発明は、一般に、ゴーシェ病を含めたリソソーム蓄積症ならびにそれらの診断および治療に関し、特に、プログラニュリン（ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ）（ＰＧＲＮ）、またはアトストリン（ａｔｓｔｔｒｉｎ）を含めた活性なＰＧＲＮペプチドを利用する、その診断的および治療的態様に関する。
プログラニュリン（ＰＧＲＮ）は、ＰＣ細胞由来増殖因子（ＰＣＤＧＦ）、アクログラニン（ａｃｒｏｇｒａｎｉｎ）、グラニュリン／エピセリン（ｅｐｉｔｈｅｌｉｎ）前駆体（ＧＥＰ）、プロエピセリン（ｐｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉｎ）（ＰＥＰＩ）、またはＧＰ８０としても公知の多機能性増殖因子であり、馴化組織培養培地から増殖因子として最初に精製された（Ｗｒｉｇｈｔ ＷＥら（１９８９年）Ｃｅｌｌ ５６巻（４号）：６０７〜６１７頁；Ｚｈｏｕ Ｊら（１９９３年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８巻（１５号）：１０８６３〜１０８６９頁）。ＰＧＲＮは、見かけの分子量が８８ｋＤａである、５９３アミノ酸の分泌型糖タンパク質である。ＰＧＲＮは、システインリッチモチーフ（ＣＸ５〜６ＣＸ５ＣＣＸ８ＣＣＸ６ＣＣＸＤＸ２ＨＣＣＰＸ４ＣＸ５〜６Ｃ）（配列番号１）の７つ半の繰り返しをＰ−Ｇ−Ｆ−Ｂ−Ａ−Ｃ−Ｄ−Ｅの順序で含有し、Ａ〜Ｇは完全な繰り返しであり、Ｐは半分のモチーフである（図２４）。特に、ＰＧＲＮ（ＧＥＰ）は、タンパク質分解プロセシングを受けて、生物活性を保持する、グラニュリン（またはエピセリン）として公知の小さな６ｋＤａの繰り返し単位が遊離する（Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｂら（２００４年）Ｃａｎｃｅｒ １００巻（１０号）：２１３９〜２１４７頁））。これらのペプチドは、細胞成長アッセイにおいて活性であり、炎症に関連付けることができる（Ｚａｎｏｃｃｏ−Ｍａｒａｎｉ， Ｔら（１９９９年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９巻（２０号）：５３３１〜５３４０頁；Ｌｕ ＲおよびＳｅｒｒｅｒｏ Ｇ（２０００年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７巻（８号）：３９９３〜３９９８頁）。
ＰＧＲＮは、発生、創傷治癒、抗炎症、ニューロン系障害、ならびにがんにおいて多数の生理的および病理学的機能を有する。ＰＧＲＮ（ＧＥＰ）は、急速に循環している上皮細胞、免疫系の細胞、およびニューロンにおいて大量に発現される（Ｂａｂａ Ｔら（１９９３年）Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ ３４巻（３号）：２３３〜２４３頁；Ｄａｎｉｅｌ Ｒら（２０００年）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ４８巻（７号）：９９９〜１００９頁）。高レベルのＧＥＰ発現は、いくつかのヒトのがんにおいても見られ、乳がん、腎明細胞癌、浸潤性卵巣癌、神経膠芽腫、脂肪細胞奇形腫、および多発性骨髄腫を含めた多様ながんにおける腫瘍形成に寄与する（Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｂら（２００４年）Ｃａｎｃｅｒ １００巻（１０号）：２１３９〜２１４７頁；Ｂａｔｅｍａｎ Ａら（１９９０年）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ １７３巻（３号）：１１６１〜１１６８頁；Ｇｏｎｚａｌｅｓ ＥＭら（２００３年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８巻（４０号）：３８１１３〜３８１１６頁；Ｈｅ ＡおよびＢａｔｅｍａｎ Ａ（２００３年）Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８１巻（１０号）：６００〜６１２頁；Ｊｏｎｅｓ ＭＢら（２００３年）Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ ８８巻（１ｐｔ２）：Ｓ１３６〜１３９頁；Ｗａｎｇ Ｗら（２００３年）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ９巻（６号）：２２２１〜２２２８頁）。ＧＥＰは、主に分泌型増殖因子として機能するが、細胞の内側に局在すること、および細胞内活性を直接モジュレートすることも見いだされた（Ｄａｎｉｅｌ Ｒら（２０００年）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ４８巻（７号）：９９９〜１００９頁；Ｈｏｑｕｅ Ｍら（２００３年）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２３巻（５号）：１６８８〜１７０２頁）。ＰＧＲＮの変異は、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）を引き起こすことが２つのグループによって同時に見いだされた（Ｂａｋｅｒ Ｍら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ ４４２巻：９１６〜９１９頁；Ｃｒｕｔｓ Ｍら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ ４４２巻：９２０〜９２４頁）。最初のＦＴＬＤ研究以来、ＦＴＬＤを引き起こす病原性ＰＧＲＮ変異が７０種報告されている（ｖａｎ Ｓｗｉｅｔｅｎによって概説されている（Ｖａｎ Ｓｗｅｉｔｅｎ ＪＣら（２００８年）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ ７巻（１０号）：９６５〜９７４頁）。
いくつかのＰＧＲＮ関連パートナーが報告されており、種々のプロセスにおけるＰＧＲＮの作用に影響を及ぼすことが見いだされている。１つの例は分泌型白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）である。エラスターゼはＰＧＲＮをインターグラニュリンリンカー（ｉｎｔｅｒｇｒａｎｕｌｉｎ ｌｉｎｋｅｒ）において排他的に消化し、グラニュリンペプチドが生成する。ＳＬＰＩは、このタンパク質分解を、エラスターゼに直接結合することによって、またはグラニュリンペプチドを当該酵素から隔離することによって遮断する（Ｚｈｕ Ｊら（２００２年）Ｃｅｌｌ １１１巻（６号）：８６７〜８７８頁）。ＰＧＲＮは、ソーティリンに結合し、神経突起の成長を媒介することも見いだされた（Ｈｕ Ｆら（２０１０年）Ｎｅｕｒｏｎ ６８巻：６５４〜６６７頁）。
最近、ＰＧＲＮ、および特にアトストリンと称されるペプチドを含めたＰＧＲＮペプチドがＴＮＦ／ＴＮＦＲ活性およびシグナル伝達のモジュレーターとして同定され、ＴＮＦ−αに誘導される炎症性関節炎を含めたＴＮＦ媒介性シグナル伝達または応答を阻害または遮断することが実証された（Ｔａｎｇ Ｗら（２０１１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３２巻：４７８〜４８４頁；ＷＯ２０１０１２０３７４）。アトストリンは、ＰＧＲＮ単位Ａ、ＣおよびＦの半分の単位の組み合わせをリンカー単位Ｐ３、Ｐ４およびＰ５と組み合わせて含む、ＰＧＲＮ由来の操作されたタンパク質（ＴＮＦ受容体を標的とすることによるＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達のアンタゴニスト（Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ ＴＮＦ／ＴＮＦＲ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｖｉａ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＴＮＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ））である（米国特許第８，３６２，２１８号；ＷＯ２０１０１２０３７４）。アトストリンは、全長のＰＧＲＮ分子と重複する活性および能力を有するＰＧＲＮ由来の活性ペプチドをもたらす。米国特許第８，３６２，２１８号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１０１２０３７４は、少なくとも１つの半分の単位が１／２Ｆであるプログラニュリン（ｐｒｏｇｒａｎｉｎ）／グラニュリン単位の半分の単位の組み合わせと、リンカー単位、具体的には少なくとも２つのリンカー単位とを含むＰＧＲＮ由来のペプチドを記載している。ＰＧＲＮ、およびアトストリンを含めたＰＧＲＮ由来のペプチドのアミノ酸配列を図４９および５０に示す。
リソソーム蓄積症
リソソームは、細胞構成要素の生理的ターンオーバーを担う細胞内細胞小器官である。リソソームは、最適に機能するために低ｐＨ環境を必要とする異化酵素を含有する。リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）とは、消化されなかったまたは部分的に消化された巨大分子の蓄積を特徴とし、最終的に細胞機能障害および臨床的異常が生じる多数の稀な遺伝性障害の不均一な群を言い表すものである。ＬＳＤは、リソソーム酵素のうちの１つまたは複数の遺伝子変異に起因し、その酵素の基質がリソソーム内に蓄積するものである。臓器肥大、結合組織および眼の病態、ならびに中枢神経系機能障害が生じる可能性がある。古典的には、リソソーム蓄積症にはリソソームヒドロラーゼの酵素欠損症が含まれていた。つい最近、リソソーム蓄積症の概念が拡大されて、リソソーム酵素の正常な翻訳後修飾に必要なタンパク質、活性化因子タンパク質、またはリソソームと他の細胞内区画の間の適切な細胞内輸送に重要なタンパク質の欠損または欠陥が含まれた。
５０種を超えるリソソーム蓄積症が記載されている。発症の年齢および臨床的な症状発現は所与のリソソーム蓄積症を有する患者間で広範に変動する可能性があり、また、同一の変異を有する家族員の間で有意な表現型の不均一性が報告されている。リソソーム蓄積症は、一般に、蓄積する基質によって分類され、スフィンゴリピドーシス、オリゴ糖症（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ）、ムコリピドーシス、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、リポタンパク質蓄積障害、リソソーム運搬欠陥、神経セロイドリポフスチノーシスおよびその他を含む。図１は、スフィンゴ糖脂質に関する経路を示し、種々のリソソーム蓄積症に関連する代謝酵素の変更を示す。
最も一般的なＬＳＤはゴーシェ病であり、これは、スフィンゴ脂質の機能障害性代謝を伴い、酵素グルコセレブロシダーゼの遺伝的欠損に起因する。グルコセレブロシダーゼ酵素は脂肪酸グルコシルセラミドに対して作用し、この酵素に欠陥があると、グルコシルセラミドが特に白血球、ほとんどの場合にはマクロファージに蓄積する。ゴーシェ病ではグルコセレブロシダーゼ（ｇｌｙｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子ＧＢＡ１の３００種を超える独特の変異が同定されている（Ｂｅｕｔｌｅｒ ＥおよびＧｒａｂｏｗｓｋｉ ＧＡ（２００１年）Ｇａｕｃｈｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ． ｉｎ Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ ＣＲ Ｓｃｒｉｖｅｒら編 ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、ＮＹ ３６３５〜３６６８頁；Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ ＧＡ（２００８年）Ｌａｎｃｅｔ ３７２巻（９６４５号）：１２６３〜１２７１頁；Ｚｈａｏら（２００３年）Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ ６４巻（１号）：５７〜６４頁）。グルコシルセラミドは、脾臓、肝臓、腎臓、肺、脳および骨髄に集まり得る。
ゴーシェ病（ＧＤ）は、病態および重症度が異なる３つの亜型に入る。Ｉ型（または非神経障害性型）はこの疾患の最も一般的な形態であり、アシュケナジ系ユダヤ遺伝形質の発生率は出生数５０，０００人に１人である。Ｉ型患者は肝脾腫大を有する。一般に、脳は病理学的に影響を受けず、疾患の発症および重症度に応じて、１型患者は成人期まで健康に生き得る。多くの患者は、この疾患の軽度の形態を有するまたはいかなる症状も示さない可能性がある。Ｉ型は、ＧＢＡ１遺伝子変異Ｎ３７０Ｓホモ接合体と遺伝的に関連する。ＩＩ型（または急性小児性神経障害性ゴーシェ病）は、生後６カ月以内に始まり、発生率は出生数１００，０００人におよそ１人である。ＩＩ型患者は、腫脹した肝臓および脾臓、広範囲にわたる進行性の脳損傷、眼の運動障害、痙縮、発作、四肢硬直、ならびに吸い込みおよび嚥下の不十分な能力を有する。ＩＩ型患者は、重篤な痙攣、緊張過度、精神遅滞および無呼吸を患う。罹患している小児は、通常、２歳までに死亡する。ＩＩ型ＧＤは、ＧＢＡ１変異Ｌ４４４Ｐを含めた、ＧＢＡ１変異対立遺伝子に関連する。ＩＩＩ型ＧＤは、慢性神経障害性の形態であり、小児期のいつでも、またはさらには成人期でも始まる可能性があり、出生数１００，０００人におよそ１人に起こる。ＩＩＩ型ＧＤは、ゆっくりと進行するが、急性またはＩＩ型ＧＤと比較して軽度の神経症状を特徴とする。主要な症状としては、腫脹した脾臓および／または肝臓、発作、不十分な協調、骨格不整、眼球運動障害、貧血を含めた血液障害ならびに呼吸障害が挙げられる。ＩＩＩ型患者は、ミオクローヌスとして公知の筋攣縮、痙攣、認知症および眼筋失行を患う。患者は、多くの場合、１０代初期および成人期まで生存する。ＩＩＩ型ＧＤに関連する遺伝的特質およびいかなる特定のＧＢＡ１変異も不明である。
ゴーシェ病の診断指標としては、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）および免疫グロブリンレベルの上昇が挙げられる。代わりに、または加えて、「ゴーシェ細胞」とも称される「しわくちゃの紙」細胞質および糖脂質を含むマクロファージを示す細胞分析がＧＤの細胞特質である。ＧＢＡ１遺伝子の変異、特に上記の通り疾患および型に関連することが公知のものも評価される。ＧＢＡ１変異性分析は、特に、家族歴に起因してＧＤのリスクがあるまたはＧＢＡ１変異の保因者である家族において有益であり得る。
ＬＳＤに対する療法としては、疾患変異体酵素を置き換えるための酵素補充療法が挙げられる。酵素補充療法（ＥＲＴ）および基質低減療法（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）（ＳＲＴ）は、ゴーシェ病Ｉ型およびＩＩＩ型、ファブリー病、ムコ多糖症Ｉ（ハーラー、ハーラー・シャイエ、およびシャイエ症候群）、ムコ多糖症ＩＩ（ハンター症候群）、ムコ多糖症ＶＩ（マロトー・ラミー症候群）、ならびにポンペ病の患者における末梢症状発現に対して適用可能であり得る。いくつかの他の障害に対する酵素補充選択肢を開発するための試みが進行中である。表１に、ある特定のＬＳＤを治療するために評価または認可されているＥＲＴを提示する。ゴーシェ病に対するＥＲＴを含めた例示的な療法を表２に列挙する。これまで、ＥＲＴは、リソソーム蓄積症の中枢神経系症状発現を改善することにおいて、おそらく血液脳関門を透過することの難しさに起因して、ほとんど失敗していた。これにより、いくつかのリソソーム蓄積症における髄腔内酵素送達の安全性および有効性を評価する活発な臨床試験が導かれている。また、酵素補充療法タンパク質に対する免疫応答が報告されており、これは有害作用を有し、ＥＲＴの安全性および有効性を変更する可能性がある（Ｂｒｏｏｋｓ ＤＡ（１９９９年）Ｍｏｌｅｃ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ６８巻（２号）：２６８〜２７５頁）。
米国特許第８，３６２，２１８号明細書 国際公開第２０１０／１２０３７４号
Ｂｒｏｏｋｓ ＤＡ、Ｍｏｌｅｃ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ（１９９９年）６８巻（２号）：２６８〜２７５頁
したがって、ゴーシェ病を含めたリソソーム蓄積症を評価する、好転させるおよび治療する先行技術による方法に付随する上述の不足を考慮して、ゴーシェ病を含めたリソソーム蓄積症に対する代替療法、追加的な薬剤、および改善された相関性の高い診断が当技術分野で依然として必要とされていることは明らかであるはずである。本発明は、ゴーシェ病を含めたリソソーム蓄積症の診断、好転および治療におけるものを含めた、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）およびアトストリンを含めたそのペプチド誘導体の新規の活性、使用および適用を提供する。
本明細書における参考文献の引用は、そのようなものが本発明の先行技術であると容認されると解釈されるべきではない。
本発明に従って、遺伝子ノックアウトによってＰＧＲＮが存在しないことを含めた、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードする遺伝子の変異が、グルコセレブロシダーゼ酵素遺伝子（ＧＢＡ１）変異によってのみ引き起こされるまたはそれだけに関連することが以前に分かっている遺伝子疾患であるゴーシェ病を導くことが発見された。したがって、グルコセレブロシダーゼＧＢＡ１遺伝子に加えてまたはその代わりに、ＰＧＲＮおよびそれをコードする遺伝子は、動物におけるＧＤに関連し、ＧＤを生成することが可能な新規の遺伝子をもたらす。本明細書において提示する実施例および研究により、ＰＧＲＮノックアウト（ＫＯ）（ヌル変異体）マウスにおいて、電子顕微鏡の下でリソソーム蓄積障害の診断になるゴーシェ細胞の古典的な病理学的外見を含め、ゴーシェ病が発生することが実証される。ＰＧＲＮ ＫＯマウスの脂質分析により、β−ＧｌｃＣｅｒと称される、グルコセレブロシダーゼ酵素の基質であるグルコシルセラミドがマクロファージ内に蓄積することが示される。
本明細書において提示する実施例および研究では、ＰＧＲＮがグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ１）に結合し、ＰＧＲＮ ＫＯマウスではＧＢＡ１酵素のリソソームへの送達が損なわれることが実証される。ゴーシェ病を治療するために使用される臨床薬イミグルセラーゼ（ｉｍｕｇｌｕｃｅｒａｓｅ）は、ＰＧＲＮ ＫＯマウスにおけるゴーシェ病表現型をレスキューする。
また、ゴーシェ病患者の１５％では、ＰＧＲＮタンパク質のレベルが有意に低下しており、ＧＤ患者の７０％超がＰＧＲＮ遺伝子変異を有する。これらの知見により、ＰＧＲＮがリソソームおよびリソソームへのタンパク質の輸送において重要な機能を有すること、ならびにＰＧＲＮ遺伝子の変異がリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）に関連することが示される。ＰＧＲＮ、またはアトストリンを含めたＰＧＲＮ由来のペプチドは、ゴーシェ病を含めたＬＳＤの予防および治療のための新規のタンパク質治療薬をもたらす。
本発明は、ＰＧＲＮ、および、特にアトストリンと称されるペプチド（複数可）を含めたＰＧＲＮペプチドをリソソーム蓄積症のモジュレーターおよびリソソームへの輸送のモジュレーターとして提供する。具体的には、本発明は、ＰＧＲＮ、およびアトストリンを含めたＰＧＲＮペプチドをリソソームへのリソソーム酵素の輸送の促進因子として提供する。特定の実施形態では、本発明は、リソソームへの酵素の送達を促進することができ、かつ／または、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）などのリソソーム酵素と、もしくはソーティリンおよび／もしくはＨＳＰ７０と結合するもしくは複合体を形成することができる、本明細書において開示されているＰＧＲＮペプチドのファミリーおよびアトストリンのファミリーの全てのメンバーに関する。ペプチドのファミリーは、具体的にはＰＧＲＮの１つまたは複数のグラニュリン単位と１つまたは複数のリンカー単位とを含む、ＰＧＲＮ配列と半分の単位の混合部分を含めた、断片または部分を含む。一態様では、ペプチドは、ＰＧＲＮのグラニュリン単位の２つまたはそれ超の半分の単位と１つまたは複数のリンカー単位とを含む。本発明の特定の態様では、ＰＧＲＮペプチドは、グラニュリン単位Ａ、ＣおよびＦの半分の単位の組み合わせをリンカー単位Ｐ３、Ｐ４およびＰ５と組み合わせて含むペプチドアトストリンを含む。特定の態様では、ＧＥＰペプチドは、少なくとも１つの半分の単位が１／２Ｆであるグラニュリン単位の半分の単位の組み合わせと、リンカー単位、具体的には少なくとも２つのリンカー単位とを含む。さらなる特定の態様では、アトストリンは、図５０（配列番号４）において示されているアミノ酸配列を有し、本明細書で示されているものを含めた、グラニュリン単位およびリンカー単位１／２Ｆ−Ｐ３−Ｐ４−１／２Ａ−Ｐ５−１／２Ｃを含む。
本発明の目的は、ＰＧＲＮペプチドおよび／またはアトストリンを含むまたはそれに基づく治療方法において使用するための医薬組成物を提供することである。本発明の目的は、配列番号２、３および４〜９のいずれかで示されるペプチド配列を含むもの、特に配列番号２、３、４を含むものを含めた、ＰＧＲＮペプチドおよび／またはアトストリンを含むまたはそれに基づく治療方法において使用するための医薬組成物を提供することである。医薬組成物は、リソソームへの酵素の送達を促進することができ、かつ／またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）などのリソソーム酵素と、もしくはソーティリンおよび／もしくはＨＳＰ７０と結合するもしくは複合体を形成することができ、かつ／または、リソソームもしくはマクロファージにおけるβ−ＧｌｃＣｅｒなどのリソソーム基質の蓄積を減少させることができる１つもしくは複数のＰＧＲＮペプチドおよび／またはアトストリンの組み合わせを含む。医薬組成物は、本明細書において提供される活性を有する１つもしくは複数のＰＧＲＮペプチドおよび／またはアトストリンの組み合わせならびに１つまたは複数のリソソーム酵素またはリソソーム基質低減剤を含む。リソソーム酵素またはリソソーム基質低減剤としては、グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼおよびスフィンゴミエリナーゼのうちの１つまたは複数が挙げられ、それらから選択することができる。医薬組成物は、ＧＢＡ結合活性を有する１つもしくは複数のＰＧＲＮペプチドおよび／またはアトストリンの組み合わせならびにイミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、タリグルセラーゼアルファ、ミグルスタットおよび酒石酸イソファゴミンのうちの１つまたは複数を含む。
したがって、本発明は、リソソーム蓄積症を治療または緩和するための組成物であって、単離されたＰＧＲＮまたはアトストリンを含めたその活性断片を含み、前記ＰＧＲＮまたは前記活性断片が、配列番号２、３および４〜９のいずれかで示されるものを含めた、図４９または５０のいずれかにおいて示されているアミノ酸配列を含む組成物を提供する。組成物は、グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼおよびスフィンゴミエリナーゼのうちの１つまたは複数を含めた、リソソーム蓄積症に対する酵素補充療法剤または基質低減療法剤をさらに含んでよい。１つのそのような態様では、本発明は、ゴーシェ病を治療または緩和するための、ＰＧＲＮまたはアトストリンをグルコセレブロシダーゼと組み合わせて含む組成物を提供する。ある態様では、本発明の組成物は、ＨＳＰ７０および／またはソーティリンを含めた、１つまたは複数の分子シャペロンまたはリソソーム送達タンパク質をさらに含んでよい。本発明の組成物は、薬学的に許容される担体、ビヒクル、希釈剤または賦形剤をさらに含む医薬組成物を含む。
さらなる実施形態では、本発明は、リソソームへの酵素の送達を促進すること、ならびに／または、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）などのリソソーム酵素と、もしくはソーティリンおよび／もしくはＨＳＰ７０と結合するもしくは複合体を形成すること、ならびに／またはリソソームもしくはマクロファージにおけるβ−ＧｌｃＣｅｒなどのリソソーム基質の蓄積を減少させることができることにおいて、ＰＧＲＮ、ＰＧＲＮペプチドおよび／またはアトストリンまたはその活性断片の活性に基づくことになる、ある特定の治療方法に関する。
したがって、本発明は、動物におけるタンパク質または酵素のリソソーム送達を促進するための方法であって、前記動物に、単離されたＰＧＲＮまたはアトストリンを含めたその活性断片を投与することを含む方法を提供する。そのある態様では、前記ＰＧＲＮまたは前記活性断片は、配列番号２、３および４〜９のいずれかを含むまたはそれで示されるものを含めた、図４９または５０のいずれかにおいて示されているアミノ酸配列を含む。本発明のある態様では、ゴーシェ病の患者においてグルコセレブロシダーゼ（ｇｌｙｃｏｃｅｒｅｂｒｉｓｉｄａｓｅ）（ＧＢＡ）の送達を促進するための方法であって、前記患者に、単離されたＰＧＲＮまたはアトストリンを含めたその活性断片を投与することを含み、前記ＰＧＲＮまたは前記活性断片が、配列番号２、３および４〜９のいずれかを含むまたはそれで示されるものを含めた、図４９または５０のいずれかにおいて示されているアミノ酸配列を含む方法が提供される。
本発明は、動物においてリソソーム蓄積症を治療または緩和するための方法であって、前記動物に、単離されたＰＧＲＮまたはアトストリンを含めたその活性断片を投与することを含み、前記ＰＧＲＮまたは前記活性断片が、図４９または５０のいずれかにおいて示されているアミノ酸配列を含む方法を提供する。本発明は、動物においてリソソーム蓄積症を治療または緩和するための方法であって、前記動物に、単離されたＰＧＲＮまたはアトストリンを含めたその活性断片を投与することを含み、前記ＰＧＲＮまたは前記活性断片が、配列番号２、３および４〜９のいずれかを含むまたはそれで示されるものを含めたアミノ酸配列を含む方法を提供する。これらの方法のある態様では、方法は、リソソーム蓄積症において減少している、存在しない、変異しているまたは変更されている１つまたは複数のリソソーム酵素をさらに投与することを含む。リソソーム酵素は、グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼおよびスフィンゴミエリナーゼのうちの１つまたは複数から選択することができる。
本発明の方法のリソソーム蓄積症は、ゴーシェ病（ＧＤ）、テイ・サックス病、ファブリー病、ファーバー病、サンドホフ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、クラッベ病、ニーマン・ピック病（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型）、ポンペ病、ムコリピドーシスＩＩ型（ハンター症候群）、ムコリピドーシスＩＩＩＡ型、小児性遊離シアル酸蓄積症（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｆｒｅｅ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＩＳＳＤ）、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、ウォルマン病およびサラ病から選択することができる。ある態様では、本発明の方法のリソソーム蓄積症は、ゴーシェ病（ＧＤ）、テイ・サックス病（ＴＳＤ）、ムコリピドーシス（ＭＬ）、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ファーバー病（ＦＤ）およびクラッベ病（ＫＤ）から選択することができる。一態様では、本発明の方法のリソソーム蓄積症は、ＧＤ Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型を含めたゴーシェ病（ＧＤ）、テイ・サックス病（ＴＳＤ）、ＭＬ ＩＩＩを含めたムコリピドーシス（ＭＬ）、ＭＰＳ ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩを含めたムコ多糖症（ＭＰＳ）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ファーバー病（ＦＤ）およびクラッベ病（ＫＤ）から選択することができる。本発明の方法の特定の好ましい態様では、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、ゴーシェ病（ＧＤ）である。本発明の方法のある態様では、方法は、ゴーシェ病を治療または緩和するために、リソソーム酵素グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）またはその活性断片もしくは組換え型をさらに投与することを含む。本発明の方法の特定の好ましい態様では、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）はテイ・サックス病である。
本発明は、動物においてリソソーム蓄積症を診断または評価するための方法およびアッセイであって、前記動物においてＰＧＲＮの発現もしくは活性を決定することまたはＰＧＲＮをコードするゲノムＤＮＡもしくは遺伝子の１つもしくは複数の変異を検出することを含む方法およびアッセイを提供する。
そのような方法またはアッセイはいずれも、前記動物において、さらに１つもしくは複数のリソソーム酵素の発現もしくは活性を決定することまたは１つもしくは複数のリソソーム酵素をコードするゲノムＤＮＡもしくは遺伝子の１つもしくは複数の変異を検出することを含んでよい。特定の態様では、動物においてゴーシェ病を診断または評価するための方法またはアッセイが提供される。この態様では、方法またはアッセイは、前記動物においてさらにＧＢＡの発現もしくは活性を決定することまたはＧＢＡをコードするゲノムＤＮＡもしくは遺伝子の１つもしくは複数の変異を検出することを含んでよい。
本発明に従って、現在、リソソーム蓄積症患者は、多くの場合、ＰＧＲＮ遺伝子またはタンパク質変異を有する可能性があり、また実際にしばしばそのような変異を有することが認識および決定されている。特に蔓延しているＰＧＲＮ遺伝子のバリエーションとしては、４つのＳＮＰ部位、ｒｓ４７９２９３７、ｒｓ８５０７１３、ｒｓ７８４０３８３６、ｒｓ５８４８、ならびに３つの点変異、ｐ．Ｃ３１５Ｓ、ｐ．Ｅ３１６Ｑ、およびｐ．Ｐ３６５Ａが挙げられる。本発明の診断方法およびアッセイは、特に、本発明において提供されるＰＧＲＮ変異のうちの１つまたは複数が査定または決定される場合を含む。ｒｓ４７９２９３７、ｒｓ８５０７１３、ｒｓ７８４０３８３６、ｒｓ５８４８、ならびに３つの点変異、ｐ．Ｃ３１５Ｓ、ｐ．Ｅ３１６Ｑ、およびｐ．Ｐ３６５Ａから選択される１つまたは複数のＰＧＲＮ変異が決定される方法、アッセイおよびキットが提供される。
特定のそのような方法またはキットでは、ｒｓ４７９２９３７、ｒｓ８５０７１３、ｒｓ７８４０３８３６、ｒｓ５８４８から選択される１つまたは複数のＰＧＲＮ変異が決定される。本発明のある態様では、４つのＰＧＲＮ ＳＮＰ部位がＴａｑｍａｎ遺伝子型決定法によって決定される。１つのそのような態様では、方法またはキットは、ｒｓ４７９２９３７フォワードプライマー、５’−ＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＣＴＴＣ−３’（配列番号１１）、リバースプライマー５’−ＣＴＣＣＣＡＡＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＣＴＡ−３’（配列番号１２）、およびＴａｑｍａｎタグ配列５’−ＴＣＡＧＴＡＧＣＴＣＡＣＡ［Ｔ／Ｃ］ＴＴＧＴＡＡ−３’（配列番号１３）；ｒｓ８５０７１３フォワードプライマー５’−ＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＴＧＧＧＣＴＧＧＴＡ−３’（配列番号１４）、リバースプライマー５’−ＡＧＴＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＡＧＣ−３’（配列番号１５）、およびＴａｑｍａｎタグ配列５’−ＡＧＧＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＡＴＧＧＧＧ［Ａ／Ｇ］ＴＡＴＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＧＴＧＧＧ ＧＧＣＡＧＡＧ−３’（配列番号１６）；ｒｓ７８４０３８３６フォワードプライマー５’−ＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣ−３’（配列番号１７）、リバースプライマー５’−ＧＣＧＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＣＡＴＧＡＡＴ−３’（配列番号１８）、およびＴａｇｍａｎタグ配列５’−ＡＧＧＡＡＧＡＣ［Ｇ／Ｃ］ＴＧＡＴＴＴＴ−３’（配列番号１９）；ｒｓ５８４８フォワードプライマー５’−ＣＣＡＧＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧ−３’（配列番号２０）、リバースプライマー５’−ＣＡＣＡＧＧＧＴＣＣＡＣＴＧＡＡＡＣＧ−３’（配列番号２１）、およびＴａｑｍａｎタグ配列ＴＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣＣＴＣＣＣＴＡＧＣＡＣＣＴＣ［Ｃ／Ｔ］ＣＣＣＴＡＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＣＣＣ（配列番号２２）を含めた例示的なプライマーを利用する。ｐ．Ｃ３１５Ｓ、ｐ．Ｅ３１６Ｑ、およびｐ．Ｐ３６５Ａの点変異は、ＰＣＲを含めた認められている方法によって増幅することができ、フォワードプライマー５’−ＧＧＴＧＧＴＧＴＡＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣＴ−３’（配列番号２３）、リバースプライマー５’−ＡＣＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＧＣ−３’（配列番号２４）を含めた例示的なプライマーを利用することができ、その後、配列決定することができる。
本発明は、ＰＧＲＮの存在または活性および量を検出することによって動物におけるリソソーム蓄積症を診断または評価するためのキットであって、（ａ）所定量の、ＰＧＲＮの検出可能に標識した特異的な結合パートナー、またはＰＧＲＮを対象とする抗体と、（ｂ）他の試薬と、（ｃ）前記キットを使用するための指示とを含むキットを包含する。
ある態様では、本発明は、動物におけるＰＧＲＮ変異の存在を検出することによって前記動物におけるリソソーム蓄積症を診断または評価するためのキットであって、（ａ）ＰＧＲＮ遺伝子またはコードするＤＮＡに特異的であるまたはそれを対象とする１つまたは複数の核酸プローブまたはプライマーと、（ｂ）他の試薬と、（ｃ）前記キットを使用するための指示とを含むキットを包含する。１つまたは複数の核酸プライマーまたはプローブが、ＰＧＲＮ変異ｒｓ４７９２９３７、ｒｓ８５０７１３、ｒｓ７８４０３８３６、ｒｓ５８４８、ならびに点変異、ｐ．Ｃ３１５Ｓ、ｐ．Ｅ３１６Ｑ、およびｐ．Ｐ３６５Ａのうちの１つまたは複数に特異的であるまたはその検出もしくは決定に適しているキットの態様が提供される。
本発明のキットは、ＧＢＡの検出可能に標識した特異的な結合パートナーもしくはＧＢＡを対象とする抗体またはＧＢＡ遺伝子もしくはコードするＤＮＡに特異的であるかもしくはそれを対象とする１つもしくは複数の核酸プローブもしくはプライマーをさらに含んでよい。
本発明のアッセイ、診断方法またはキットでは、対照量のＰＧＲＮ、ＰＧＲＮペプチド、アトストリン、ＧＢＡ、またはそれに対する抗体などを調製し、酵素、特異的な結合パートナーおよび／または放射性元素を用いて標識することができ、次いで、細胞試料に導入することができる。標識した物質またはその結合パートナー（複数可）が、試料内の部位と反応する機会を有した後、生じた集団を、付着させた標識の性質に伴って変動し得る公知の技法によって調査することができる。同位元素３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅなどの放射性標識を使用した例では、公知の現在利用可能な計数手順を利用することができる。標識が酵素である例では、検出は、現在利用されている当技術分野で公知の比色定量技法、分光光度測定技法、蛍光分光光度測定技法、電流測定技法または気体定量技法のいずれかによって達成することができる。
本発明は、変更されたＰＧＲＮを含み、ＰＧＲＮがヌルであるか、存在しないか、または変異しており、かつマクロファージにおいてリソソーム基質β−ＧｌｃＣｅｒが増加している、ゴーシェ病の動物モデルを提供する。動物モデルは、ゴーシェ病に関連するＧＢＡ変異をさらに含んでよく、またはＧＢＡがヌルであるかもしくは存在しない。
本発明は、ＰＧＲＮまたはＰＧＲＮペプチドの活性を模倣することによってリソソーム酵素輸送および／またはリソソーム基質蓄積をモジュレートするために有効な潜在的な薬物または化合物をスクリーニングするためのアッセイ系を包含する。この態様は、ＰＧＲＮおよびアトストリンペプチドと同様にリソソーム酵素輸送および／またはリソソーム基質蓄積をモジュレートするために有効な追加的な活性なＰＧＲＮ断片、グラニュリン／リンカー単位の組み合わせ、誘導体、改変体およびアミノ酸修飾についてスクリーニングするためのアッセイを含む。一例では、ＧＢＡを伴う細胞試料に試験薬物または化合物を投与して、β−ＧｌｃＣｅｒ蓄積に対する試験薬物または化合物の効果を、対照と比較することによって決定し、これは、対照がＰＧＲＮ、活性なＰＧＲＮペプチド（複数可）、アトストリンである場合を含む。
以下の例示的な図を参照して進行する以下の説明についての総説から他の目的および利点が当業者に明らかになるであろう。
図１は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）に関与するスフィンゴ糖脂質に関する経路を示す図である。スフィンゴ糖脂質代謝は、複数の酵素によって媒介されるプロセスである。酵素不全は、対応する基質のリソソームにおける蓄積を引き起こす。最も一般的なＬＳＤであるゴーシェ病は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）の変異によって引き起こされる。ＧＢＡの変異は、ＧＢＡ基質であるβ−グルコシルセラミド（β−ＧｌｃＣｅｒ）のマクロファージにおける蓄積を導く。
図２Ａ〜２Ｄは、ＯＶＡによる攻撃を受けたＰＧＲＮ ＫＯマウスでゴーシェ病が発生することを示す図である。ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスに、１日目および１５日目にＯＶＡをＩ．Ｐ．注射し、その後、２９日目から開始して、１週間に３回、４週間にわたって１％ＯＶＡを鼻腔内攻撃した。（Ａ）Ｈ＆Ｅ染色により、雄ＰＧＲＮ ＫＯマウスと雌ＰＧＲＮ ＫＯマウスのどちらの肺においても、特にＯＶＡ処置後に巨大なゴーシェ細胞が示される（各群についてｎ＝１０、雄５匹、雌５匹）。（Ｂ）対照およびＯＶＡによる攻撃を受けたＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスにおけるゴーシェ細胞の定量化。（Ｃ）対照およびＯＶＡによる攻撃を受けたＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来の肺のＰＡＳ染色。結果から、ＰＧＲＮ ＫＯマウスにおけるゴーシェ細胞内の糖脂質の蓄積が示される。（Ｄ）対照およびＯＶＡによる攻撃を受けたＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来の気管支肺胞洗浄液から単離した細胞のフローサイトメトリー。ＣＤ１１ｂ＋ＦＳＣｈｉｇｈによって証明される通り、ＰＧＲＮ ＫＯマウスではＯＶＡ処置後に巨大なマクロファージの亜集団が存在する。
図３は、透過型電子顕微鏡（ＥＭ）（上および左下：２６５０×；右上：１１５００×、右下：７１００×）によってアッセイし、ＰＧＲＮ ＫＯマウス由来のマクロファージがＷＴマウス由来のマクロファージよりもはるかに大きいこと、およびリソソームが通常の円形ではなく管様形状になることを示す図である。
図４は、ＰＧＲＮ ＫＯマウスではβ−ＧｌｃＣｅｒが蓄積することを示すグラフである。ＯＶＡによる攻撃を受けたまたは受けていないＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来の肺組織を溶解させ、各試料のタンパク質１ｍｇを脂質組成分析のために使用した。示されている通り、炭素鎖の長さが異なるβ−ＧｌｃＣｅｒのレベル（タンパク質１ｍｇ当たりのｐｍｏｌ）をグラフにしたものである。
図５Ａは、イミグルセラーゼが、ＰＧＲＮ ＫＯマウスにおける脂質の蓄積を緩和することを示す図である。ＯＶＡによる攻撃を受けたＰＧＲＮ ＫＯマウスを、１％ＯＶＡを用いた最初の鼻腔内攻撃の週から開始して、週に１回、イミグルセラーゼ（６０ｕ／ｋｇ）を用いて処置した。肺組織のＨ＆ＥおよびＰＡＳ染色（各群についてｎ＝６）。図５Ｂは、イミグルセラーゼ処置により、ＯＶＡによる攻撃を受けたＰＧＲＮ ＫＯマウスにおけるβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積が減少することを示すグラフである。ＯＶＡ攻撃を受けていないＰＧＲＮ ＫＯマウス（Ｃｔｒｌ）、ビヒクル（ＯＶＡ）またはイミグルセラーゼ（Ｉｍｉｇ．）を用いて処置したＯＶＡによる攻撃を受けたＰＧＲＮ ＫＯマウスからの肺組織を図４に記載の通り処理し、分析した。図５Ｃは、イミグルセラーゼ処置を受けたまたは受けていないＰＧＲＮ ＫＯマウスにおけるゴーシェ細胞の定量化を示すグラフである。図５Ｄは、イミグルセラーゼ処置を行った場合と行わなかった場合の、ＯＶＡ攻撃によって誘導されるＰＧＲＮ ＫＯマウスの肝臓および脾臓のサイズを示すグラフである。肝臓および脾臓のどちらもイミグルセラーゼ処置後に有意に縮小した。一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用して群間で平均を比較した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、両側）。
図６Ａ〜６Ｃは、高齢のＰＧＲＮヌルマウスではゴーシェ病が自然発生することを示す図である。いかなる攻撃も受けていない１歳のＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスを屠殺し、肺、脾臓、肝臓、および骨髄を組織学的検査のために採取した。（Ａ）高齢のＰＧＲＮ ＫＯマウスでは肝脾腫大が発生する。ＷＴおよびＫＯマウスについて、動物の全体重で割った肝臓重量および脾臓重量をグラフにする（群当たりｎ＝８）。（Ｂ）肺、脾臓および骨髄の組織学的検査。ゴーシェ細胞はＰＧＲＮ ＫＯマウスの肺、脾臓、および骨髄において見いだされたが、ＷＴマウスでは見いだされなかった。（Ｃ）骨髄のＰＡＳ染色により、ゴーシェ細胞内の糖脂質の貯蔵が示される。
図７Ａは、ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスにおける骨髄の組織学的検査を示す図である。ＰＧＲＮ ＫＯではＢＭが脂肪組織によって置き換えられたが、ＷＴマウスでは置き換えられなかった。図７Ｂは、ＥＭ下のゴーシェ細胞を示す図である。ＰＧＲＮ ＫＯマウスの肺および骨髄では典型的な管様リソソームが見いだされた。ＷＴマウスとＰＧＲＮ ＫＯマウスの間で肝臓サイズおよび脾臓サイズを比較するために対応のないスチューデントＴ検定を使用した（＊ｐ＜０．０５）。
図８Ａ〜８Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ｒＰＧＲＮがＧＤ表現型をレスキューすることを示す図である。（Ａ）ＰＧＲＮ欠損ＢＭＤＭにはβ−ＧｌｃＣｅｒが蓄積する。ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来のＢＭＤＭを、脂質混合物を５および５０μｇ／ｍｌで用いて１０日間処理した。β−ＧｌｃＣｅｒの蓄積を、β−ＧｌｃＣｅｒに対する特異的な抗体を用いた免疫蛍光染色によって検出し、共焦点顕微鏡によって可視化した。（Ｂ）ｒＰＧＲＮは、ＰＧＲＮ ＫＯ ＢＭＤＭにおけるβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積を用量依存的に予防する。ＰＧＲＮ ＫＯマウス由来のＢＭＤＭを、示されている種々の量のＰＧＲＮ、またはイミグルセラーゼ（Ｉｍｉｇ、１６０ｍＵ／ｍｌ、陽性対照としての機能を果たす）の存在下で脂質混合物を用いて１０日間処理した。β−ＧｌｃＣｅｒを免疫蛍光法によって染色し、代表的な画像を示した。（Ｃ）β−ＧｌｃＣｅｒの蓄積の定量化。パネルＢに示されている通り、１０枚の個別の画像を選択し、Ｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅによって蛍光強度を測定した。データは、３回の独立した実験から得られた平均値として示されている。
図９は、ｒＰＧＲＮが、ＧＤ患者由来の線維芽細胞におけるＧＢＡの凝集およびβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積を予防することを示す図である。ＩＩ型ＧＤ患者由来の線維芽細胞を、ｒＰＧＲＮの存在下または不在下で脂質混合物を用いて２日間処理し、ＧＢＡのレベル（緑色）およびβ−ＧｌｃＣｅｒのレベル（赤色）をそれらの特異的抗体を用いた免疫蛍光染色によって測定し、ＤＡＰＩを用いて核を染色し、共焦点顕微鏡（ｃｏ−ｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）によって画像を捕捉した。
図１０Ａは、ｒＰＧＲＮが、ＯＶＡによる攻撃を受けたＰＧＲＮヌルマウスにおけるＧＤの発生を予防することを示す。ＰＧＲＮ ＫＯマウスをＯＶＡによって攻撃し、ＯＶＡを用いた最初の鼻腔内攻撃の週から開始して週に１回、ＰＢＳまたはｒＰＧＲＮ（４ｍｇ／ｋｇ）を用いて処置した（群当たりｎ＝６）。肺組織のＨ＆Ｅ染色により、ｒＰＧＲＮがゴーシェ細胞の形成を劇的に減少させたことが示される。図１０Ｂは、無処置のＰＧＲＮ ＫＯマウス、ＯＶＡ処置を受けたＰＧＲＮ ＫＯマウス、およびＯＶＡ＋ＰＧＲＮ処置を受けたＰＧＲＮ ＫＯマウスからのゴーシェ細胞数の定量化を示すグラフである。図１０Ｃは、無処置のＰＧＲＮ ＫＯマウス、ＯＶＡ処置を受けたＰＧＲＮ ＫＯマウス、およびＯＶＡ＋ＰＧＲＮ処置を受けたＰＧＲＮ ＫＯマウスからのゴーシェ細胞サイズの定量化を示すグラフである。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して複数の群間で平均を比較した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；両側）。
図１１Ａ〜１１Ｃは、ＧＢＡおよびＬＩＭＰ２をリソソームに送達するためにＰＧＲＮが必要であることを示す図である。（Ａ）ＧＢＡ酵素活性は、ＰＧＲＮ ＫＯマウスとＷＴマウスとで変化しない。ＰＢＳまたはＯＶＡのいずれかで攻撃した後のＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来の肺組織を溶解させ、その基質である４ＭＵＧＰの切断によってＧＢＡ活性を測定した。（Ｂ）ＰＢＳ攻撃後およびＯＶＡ攻撃後に、ＷＴマウスに対してＫＯマウスではＧＢＡタンパク質レベルは低下せず、実際はわずかに上昇する。肺組織を溶解させ、ＧＢＡのレベルをウエスタンブロッティングによって測定した。（Ｃ）ＰＧＲＮ ＫＯマクロファージにおけるＧＢＡの分布は変更されるが、ＧＬＡの分布は変更されない。パラフィン包埋肺スライドを、ＧＢＡまたはＧＬＡ抗体を用いて免疫組織化学的検査によって染色した。ＰＧＲＮ ＫＯマクロファージにおけるＧＢＡの凝集が矢印で示されている。
図１２Ａは、ＰＧＲＮ ＫＯマウスにおけるＧＢＡの分布がβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積に伴って変更されることを示す図である。ＯＶＡによる攻撃を受けたＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来の肺組織の凍結切片を、ＧＢＡおよびβ−ＧｌｃＣｅｒ抗体を用いて免疫蛍光法によって染色した。ＧＢＡの凝集が矢印で示されている。図１２Ｂは、肺組織の免疫金標識によってアッセイして、ＰＧＲＮヌルマクロファージの細胞質内にＧＢＡが凝集することを示す図である。ＧＢＡは、ＷＴマクロファージでは矢印によって示されるリソソームにおいて発現されるが（左側のパネル、５３，０００×）、ＧＢＡは、管様リソソームには存在せず、また、ＧＢＡは、ＰＧＲＮ ＫＯマウスのマクロファージでは凝集する（右側のパネル、２５，０００×）。免疫金標識の密度が高い凝集領域が破線で囲まれている。図１２Ｃは、活性に基づくプローブＭＤＷ９３３を用いてアッセイして、ＰＧＲＮ欠損マクロファージではリソソームＧＢＡが検出不能であることを示す図である。脂質混合物を用いて予備刺激したＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来のＢＭＤＭを、５０ｎＭのＭＤＷ９３３を用いて２時間にわたって標識し、その後、固定し、ＤＡＰＩ染色し、共焦点顕微鏡の下で画像を取得した。
図１３Ａは、ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来のマクロファージにおけるＬＩＭＰ２およびＬＡＭＰ２の発現を示す図である。ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスからのパラフィン包埋肺スライドを、ＬＩＭＰ２およびＬＡＭＰ２を用いて免疫組織化学的検査によって染色した。ＰＧＲＮ ＫＯマクロファージにおけるＬＩＭＰ２の凝集を矢印で示した。図１３Ｂは、肺組織の免疫金標識によってアッセイして、ＰＧＲＮヌルマクロファージでは、ＬＩＭＰ２がリソソームでは検出不能であり、細胞質内に凝集することを示す図である。ＬＩＭＰ２は、ＷＴマクロファージの矢印で示されるリソソームでは検出可能であるが（左側のパネル、５３，０００×）、ＰＧＲＮ−ヌルマクロファージの細胞質内に凝集し、管様リソソームでは観察されない（右側のパネル、３１，０００×）。免疫金標識の密度が高い凝集領域が破線で囲まれている。図１３Ｃは、凝集したＧＢＡおよび凝集したＬＩＭＰ２がＰＧＲＮ ＫＯマクロファージに共局在化することを示す図である。ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスの肺組織の凍結切片を、ＧＢＡおよびＬＩＭＰ２抗体を用いて染色し、ＧＢＡおよびＬＩＭＰ２の分布を免疫蛍光染色によってアッセイし、共焦点顕微鏡によって画像化した。凝集領域が矢印で示されている。図１３Ｄは、免疫共沈降（Ｃｏ−ＩＰ）によってアッセイして、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＧＢＡがＰＧＲＮの不在下でＬＩＭＰ２に結合することを示す図である。ＷＴマウスおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスの両方からの肺組織を溶解させ、タンパク質複合体を、抗ＧＢＡ抗体を用いて免疫沈降させ、抗ＬＩＭＰ２抗体を用いて検出した。
図１４Ａ〜１４Ｃは、ＰＧＲＮがＧＢＡのリソソーム送達を媒介する分子経路を示す図である。（Ａ）免疫共沈降（Ｃｏ−ＩＰ）によってアッセイして、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＧＲＮはＧＢＡに結合する。ＷＴマウス由来の肺組織を溶解させ、タンパク質複合体を、抗ＧＢＡ抗体を用いて免疫沈降させ、抗ＰＧＲＮ抗体を用いて検出した。（Ｂ）固相結合アッセイによってアッセイして、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＧＲＮはＧＢＡに直接結合する。種々の量のＰＧＲＮをコーティングし、ビオチン標識したＢＳＡおよびＧＢＡを添加し、その後、ＨＲＰ標識したストレプトアビジンおよびその基質を添加した。（Ｃ）ＣＯＯＨ１チップを用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってアッセイして、ＰＧＲＮは、ＧＢＡに０．７１ｎＭの高親和性ＫＤで結合する。
図１５Ａは、ＧＢＡのリソソームへのＰＧＲＮ媒介性送達に関与する潜在的分子、すなわち、ＰＧＲＮ依存性ＧＢＡ関連タンパク質を同定するために使用した方法のスキームである。ＷＴマウスおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス両方からのＧＢＡ抗体を用いて免疫沈降を実施し、その後、高感度質量スペクトルを実施した。図１５Ｂは、ＷＴマウスおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスの両方から単離されたヒットならびにＰＧＲＮ依存性ＧＢＡ関連経路としてのＨＳＰ７０媒介性輸送の同定の要約を示す図である。図１５Ｃは、ＧＢＡとＨＳＰ７０の結合はＰＧＲＮ依存性であることを示す図である。ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスにおいて抗ＧＢＡ抗体を用いて免疫沈降を行い、ＨＳＰ７０抗体を用いてプローブした。図１５Ｄは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ｒＰＧＲＮが、ＰＧＲＮ欠損マウスにおけるＧＢＡとＨＳＰ７０の相互作用を回復させることを示す図である。ＯＶＡ攻撃を受けていないＰＧＲＮ ＫＯマウス（Ｃｔｒｌ）、ｒＰＧＲＮを用いた処置を受けたまたは受けていないＯＶＡによる攻撃を受けたＰＧＲＮ ＫＯマウスから調製した肺組織溶解物を、抗ＧＢＡ抗体を用いて免疫沈降させ、免疫沈降した複合体におけるＨＳＰ７０の存在を、ＨＳＰ７０抗体を用いてプローブした。
図１６Ａは、マクロファージにおいて、ｓｉＲＮＡ手法によるＰＧＲＮおよびＨＳＰ７０の抑制によりリソソームＧＢＡが著しく減少することを示す図である。ＲＡＷ２６４．７マクロファージにＰＧＲＮまたはＨＳＰ７０に対して特異的なｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、脂質混合物を用いて予備刺激した細胞をＭＤＷ９３３プローブで２時間にわたって標識し、ＰＧＲＮおよびＨＳＰ７０の発現レベルを免疫蛍光染色によって測定した。対応するｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞が矢印で示されている。図１６Ｂは、ＬＩＭＰ２とＨＳＰ７０の結合もＰＧＲＮ依存性であることを示す図である。ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスにおいて抗ＨＳＰ７０抗体を用いて免疫沈降を行い、ＬＩＭＰ２抗体を用いてプローブした。図１６Ｃは、ＧＢＡとソーティリンの結合はＰＧＲＮ依存性であるが、ＧＬＡとソーティリンの結合はＰＧＲＮ依存性ではなかったことを示す図である。ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスにおいて抗ソーティリン抗体を用いて免疫沈降を実施し、ＧＢＡまたはＧＬＡ抗体のいずれかを用いて検出した。図１６Ｄは、ＨＳＰ７０とソーティリンの結合もＰＧＲＮ依存性であることを示す図である。ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスにおいて抗ＨＳＰ７０抗体を用いて免疫沈降を実施し、ソーティリン抗体を用いて検出した。
図１７は、ＨＳＰ７０シャペロン経路を通じたＧＢＡ／ＬＩＭＰ２のリソソーム送達の媒介におけるＰＧＲＮの役割を説明する、提唱されたモデルを示す図である。Ｃｏはコシャペロンを表す。
図１８Ａ〜１８Ｂは、ＯＶＡによる攻撃を受けたＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来の肺組織の透過型電子顕微鏡アッセイを示す図である。（Ａ）図３の左下のパネルのカラーの拡大画像。管様リソソームおよびミトコンドリアがそれぞれ紫色およびオレンジ色で示されている（元の白黒の電子顕微鏡画像からのこのカラー画像の作成はＮＹＵ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ ＯＣＳ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＣｏｒｅのＣｈｒｉｓ ＰｅｔｚｏｌｄおよびＫｒｉｓｔｅｎ Ｄａｎｃｅｌのおかげである）。（Ｂ）ＰＧＲＮヌルマクロファージにおけるリソソームの転換。１、リソソームは、物質貯蔵の蓄積に伴って伸長したプロファイルを示す（１９，５００×）；２、リソソームは、リソソーム内に高密度の物質と低密度の物質の両方を伴い曲線状になった（１９，５００×）；３、リソソームは、最終的に、高密度の物質貯蔵と低密度の物質貯蔵の両方を伴う管様構造になった（１９，５００×）；４、低密度の物質は最終的にインタクトな膜構造を有する高密度の物質で置き換えられた（１１０，０００×）。
図１９Ａは、ＰＧＲＮヌルマクロファージにおいてミトコンドリアおよび小胞体が正常であったことを示す図である。ＯＶＡによる攻撃を受けたＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来の肺組織を透過型電子顕微鏡の下で調査した。ＷＴ（１１５００×）およびＰＧＲＮ ＫＯ（３１０００×）由来のミトコンドリア（Ｍｉｔ．）、ならびにＷＴ（４４００×）およびＰＧＲＮ ＫＯマクロファージ（７１００×）由来の小胞体（ＥＲ）は正常に見えた。図１９Ｂは、ＰＧＲＮヌルマウスにおいて１型および２型肺胞細胞が正常であったことを示す図である。ＯＶＡによる攻撃を受けたＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来の肺組織を透過型電子顕微鏡の下で調査した。ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来の１型および２型肺胞細胞は両方とも正常に見えた（ＰＧＲＮ ＫＯ由来の１型肺胞細胞を２６５０×に拡大した以外は全ての画像を３４００×に拡大した）。
図２０Ａ〜２０Ｃは、ＰＧＲＮ ＫＯマウスおよびＧＤ患者の組織および血漿における脂質組成分析を示す図である。ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（Ａ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）（Ｂ）、およびセラミド（Ｃ）のレベルはＯＶＡによる攻撃を受けたＰＧＲＮ ＫＯマウス由来の肺組織においてＯＶＡによる攻撃を受けたＷＴマウスと比較して上昇しない。オボアルブミン（ＯＶＡ）による攻撃を受けた、および受けていない野生型およびＰＧＲＮ ＫＯ動物におけるＤＡＧ、ＳＭ、およびセラミドのレベルを測定し、ＤＡＧ、ＳＭ、およびセラミドのレベルをタンパク質１ｍｇ当たりのｐｍｏｌとして示す。
図２１Ａ〜２１Ｄは、健康な対照（Ｃｔｒｌ）およびＧＤ患者の線維芽細胞および血漿におけるグルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）およびグルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）のレベルを示すグラフである。ＧｌｃＣｅｒのレベルはＧＤ線維芽細胞において有意に上昇するが（Ａ）ＧＤ血漿では上昇せず（Ｂ）、ＧｌｃＳｐｈのレベルはＧＤ血漿において上昇するが（Ｄ）ＧＤ線維芽細胞では上昇しない（Ｃ）。
図２２Ａは、ＧｌｃＣｅｒのレベルがＯＶＡによる攻撃を受けたＰＧＲＮ ＫＯマウスの血漿においてＯＶＡによる攻撃を受けたＷＴマウスと比較して上昇しないことを示すグラフである。図２２Ｂ〜Ｃは、ＧｌｃＳｐｈのレベルがＯＶＡによる攻撃を受けたＰＧＲＮ ＫＯマウスの肺組織（Ｂ）と血漿（Ｃ）のどちらにおいてもＯＶＡによる攻撃を受けたＷＴマウスと比較して上昇することを示すグラフである。
図２３Ａ〜２３Ｃは、血漿（Ａ）、肺（Ｂ）および脾臓（Ｃ）におけるＧｌｃＣｅｒのレベルがＰＧＲＮ ＫＯマウスの老化とともに上昇することを示すグラフである。３カ月齢、９カ月齢、および１５カ月齢のＰＧＲＮ ＫＯマウス（各群についてｎ＝６）を屠殺し、血漿、肺および脾臓を使用してβ−ＧｌｃＣｅｒを測定した。独立スチューデントＴ検定および一元配置ＡＮＯＶＡを統計解析のために使用した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；両側）。
図２４Ａ〜２４Ｈは、高齢のＰＧＲＮ ＫＯマウスでは長骨において骨減少症が発生することを示す図である。１歳のＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスを屠殺し、各マウスの２つの大腿骨を解剖し、一方を骨組織学的検査用とし、他方をマイクロＣＴ用とした。（Ａ）Ｈ＆Ｅを用いて染色したＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯ大腿骨の縦断切片。ＰＧＲＮ ＫＯ大腿骨では小柱骨（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ）の厚さおよび接続性が減少する。スケールバーは０．５ｍｍを表す。（Ｂ）高齢のＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯ大腿骨由来の大腿骨の３次元マイクロＣＴ再構築の代表的な画像。ＷＴおよびＫＯマウスの近位大腿骨の二次海綿質における３Ｄ小柱状構造パラメータのヒストグラム：ＢＶ／ＴＶ＝骨体積／総体積（Ｃ）；ＴｂＮ＝小柱の数（Ｄ）；Ｔｂ．Ｔｈ＝小柱の厚さ（Ｅ）；ＴｂＳｐ＝小柱の分離（Ｆ）。皮質の厚さ（Ｃｒｔ．Ｔｈ）（Ｇ）。（Ｈ）二重Ｘ線吸光光度スキャンによって査定される全身骨塩密度（ＢＭＤ）。
図２５Ａ〜２５Ｃは、高齢のＰＧＲＮ ＫＯマウスでは脊椎において骨減少症が発生することを示す図である。高齢のＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来の腰椎をマイクロＣＴ分析のために解剖した。（Ａ）ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来のＬ４椎骨の画像は、骨塩密度の低下を示す。ＰＧＲＮ ＫＯマウスでは骨体積（Ｂ）および小柱骨の厚さ（Ｃ）が有意に減少した。データは、平均±Ｓ．Ｄ．として表されている。（群当たりｎ＝８）；独立スチューデントＴ検定および一元配置ＡＮＯＶＡを統計解析のために使用した（ＷＴ群に対して＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側）。
図２６は、脂質を用いて処理したＰＧＲＮ欠損ＢＭＤＭにおいて巨大なマクロファージが見いだされたことを示す図である。ＢＭＤＭをＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスから単離し、分化させ、細胞を、脂質混合物を５および５０μｇ／ｍｌで用いて１０日間処理した。培養したＢＭＤＭのＨ＆Ｅ染色。脂質処理後にＰＧＲＮ ＫＯマウスでは巨大なＢＭＤＭが存在する。
図２７は、ＰＧＲＮがＰＧＲＮヌルＢＭＤＭの脂質に誘導される形態変化を逆転させたことを示す図である。ＰＧＲＮ ＫＯマウス由来のＢＭＤＭを単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで５日間分化させた。次いで、ＢＭＤＭを、５０μｇ／ｍｌの脂質混合物単独を用いて、または異なる用量の組換えＰＧＲＮ（０．１、０．４μｇ／ｍｌ）を用いて１０日間処理し、３日ごとに細胞培養培地を補充した。細胞形態を位相差顕微鏡の下で観察した。
図２８は、ＰＧＲＮヌルマクロファージではソーティリンの分布が正常であることを示す図である。ＰＧＲＮ ＫＯマウスを、ＯＶＡを用いて攻撃し、肺を固定し、透過型電子顕微鏡のために処理した。ソーティリンの発現をソーティリン抗体によって染色し、その後、金標識した二次抗体によって染色した。ＰＧＲＮ ＫＯマウスにおいて、ゴーシェ細胞におけるソーティリンの分布は正常であり、これは、主に管様リソソームにおいて発現され（上のパネル）、いくつかは細胞表面上に発現されてエンドサイトーシスを媒介する（下のパネル）。
図２９は、ｒＰＧＲＮがＢＭＤＭにおいてエンドサイトーシスによって効率的に取り込まれ、ＥＲＫ、ＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲを含めた公知のＰＧＲＮのシグナル経路を遮断することはｒＰＧＲＮのβ−ＧｌｃＣｅｒクリアランスに対する効果に影響しなかったことを示す図である。ＰＧＲＮヌルＢＭＤＭにおけるｒＰＧＲＮのエンドサイトーシス。ＰＧＲＮ ＫＯマウス由来のＢＭＤＭを材料および方法に記載の通り５日間分化させた。示されている種々の時点でｒＰＧＲＮを培養培地に最終濃度５μｇ／ｍｌで添加した。各時点の最後に細胞をすぐに固定した。ｒＰＧＲＮの取り込みおよび分布を、ＰＧＲＮ抗体および示されている種々の分子に対する抗体を用いて免疫蛍光染色によって調査した。最初の行の画像は、ｒＰＧＲＮ単独のエンドサイトーシスを示し、２番目、３番目、４番目および５番目の行の画像は、取り込まれたｒＰＧＲＮと、それぞれＥＥＡ１、ＧＢＡ、ＬＩＭＰ２、およびＬＡＭＰ２の共局在を示す。
図３０は、β−ＧｌｃＣｅｒクリアランスに対するｒＰＧＲＮの効果はＥＲＫ、ＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲシグナル伝達経路非依存性であることを示す図である。ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯ ＢＭＤＭを、示されているＥＲＫ、ＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲ経路のキナーゼ阻害剤を伴ってまたは伴わずに、０．４μｇ／ｍｌのｒＰＧＲＮタンパク質の存在下または不在下で、脂質混合物（５μｇ／ｍｌ）で２日間刺激した。細胞を、ＭＤＷ９３３を用いて２時間にわたって標識し、次いで、細胞を固定し、ＤＡＰＩ媒体を用いてマウントした。ＭＤＷ９３３標識したリソソームＧＢＡを共焦点顕微鏡の下で緑色蛍光の強度によって可視化し、β−ＧｌｃＣｅｒの蓄積をβ−ＧｌｃＣｅｒ抗体（赤色）を用いて免疫蛍光染色によって染色した。
図３１は、マクロファージ内の細胞内輸送区画におけるＧＢＡおよびＰＧＲＮの共局在を示す図である。ＷＴマウス由来のＢＭＤＭを固定し、ＰＧＲＮおよびＧＢＡ、ならびに輸送区画のマーカーの発現を、それぞれの特異的な一次抗体を用いて、その後、異なる蛍光色素で標識した対応する二次抗体を用いて検出した。ＰＧＲＮをヒツジ抗マウスＰＧＲＮ一次抗体およびＡｌｅｘａ−４８８で標識した二次抗体を用いて染色し（ａ〜ｆ）、ＧＢＡをウサギ抗マウス一次抗体、その後にＣｙ３標識した二次抗体を用いて染色し（ｇ〜ｌ）、輸送区画のマーカー（カルレギュリン、ＧＭ１３０、ＴＧＮ３８、ＥＥＡ１、ＬＩＭＰ２、およびＬＡＭＰ２）を対応するマウス由来の一次抗体、その後Ａｌｅｘａ−６４７標識した二次抗体を用いて染色した（ｍ〜ｒ）。パネルｓ〜ｘは４色染色の統合画像である。核はＤＡＰＩ（青色）を用いて染色した。
図３２は、ＧＢＡとＰＧＲＮの結合に対するｐＨの影響を示すグラフである。（ａ）示されている種々のｐＨにおけるＧＢＡとＰＧＲＮの直接相互作用をＳｅｎｓｉＱ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．においてＣＯＯＨＶ１チップを使用することによってＳＰＲによって検出した。（ｂ）動力学的結合値に対するアッセイｐＨの影響。
図３３Ａ〜３３Ｂは、様々な種類のＬＳＤ由来の線維芽細胞における疾患リソソームに対するｒＰＧＲＮの効果を示す図である。健康な対照および異なるＬＳＤ由来の線維芽細胞を、ｒＰＧＲＮタンパク質（０．４μｇ／ｍｌ）を用い、脂質刺激を伴ってまたは伴わずに処理した。リソソームをＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒによって可視化した（Ａ）。（Ｂ）脂質刺激を伴ってまたは伴わずに、ＰＧＲＮは、Ｉ型およびＩＩ型ＧＤ、テイ・サックス病、ファーバー病、およびムコリピドーシスＩＩＩ型におけるリソソームの変更を有意に補正する。
図３４Ａ〜３４Ｂは、ＰＧＲＮが、ＩＩＩ型ＧＤ、ＩＩＩ型およびＶＩ型ムコ多糖症（ＭＰＳ）における疾患リソソームを脂質刺激の存在下でのみ正常化することを示す図である。
図３５Ａ〜３５Ｂは、ニーマン・ピック病Ｂ型（ＮＰＤ Ｂ）、ファブリー病、およびＩＶ型ムコリピドーシス（ＭＬ）では、脂質刺激を伴ってまたは伴わずに、ＰＧＲＮがリソソームを復帰させることができないことを示す図である。各試料から細胞１０個をランダムに選択し、各細胞の蛍光強度をＩｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅによって定量化した。データは、３回の独立した実験から得られた平均値として示されている。一元配置ＡＮＯＶＡを使用することによって有意性を検定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、両側）。
図３６Ａ〜３６Ｃは、ＧＤ患者においてＰＧＲＮの血清中レベルが低下し、また、ＧＤ患者においてＧＲＮ改変体が同定されたことを示す図である。（Ａ）ＰＧＲＮの血清中レベルは、ＧＤ患者では有意に低い。ＧＤ患者１１５名、一般集団（ＧＰ）からの健康な対照４４名、およびアシュケナジ系ユダヤ人（ＡＪ）からの健康な対照５５名からのＰＧＲＮの血清中レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。ＧＤ患者ではＰＧＲＮのレベル（９６．６５±５３．４５ｎｇ／ｍｌ）がＧＰの健康な対照（１６４．９９±４３．１６ｎｇ／ｍｌ）、およびＡＪの健康な対照（１５０．６４±３３．９ｎｇ／ｍｌ）と比較して有意に低い。一元配置ＡＮＯＶＡを使用することによって有意性を検定した（ｐ＜０．０００１）。（Ｂ）ＧＤ患者４０名におけるＧＲＮ遺伝子改変体の要約。ＧＤ患者４０名のゲノムＤＮＡを使用して、１ｋｂのプロモーター領域および８ｋｂの全長ＧＲＮ遺伝子を網羅する９ｋｂのＧＲＮ遺伝子ＤＮＡ断片を高忠実度ＰＣＲによって増幅した。ＤＮＡ配列決定をＹａｌｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＧｅｎｏｍｉｃ ｆａｃｉｌｉｔｙにおいてＰａｃＢｉｏ ＲＳ ＩＩ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍによって実施した。ＧＤ患者において４つのＳＮＰ部位および３つの点変異が同定された。（Ｃ）ＧＲＮ遺伝子における同定されたＧＲＮ改変体の位置を示す図である。
図３７は、ＰＧＲＮ ＫＯマウスにおいてＯＶＡ攻撃後にＨｅｘＡは凝集するがＨｅｘＢは凝集しなかったことを示す図である。ＯＶＡ攻撃後のＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来の肺組織を、ＨｅｘＡおよびＨｅｘＢを用いて免疫組織化学的検査によって染色した。結果から、ＰＧＲＮ ＫＯマウスにおいてＨｅｘＡは凝集するが、ＨｅｘＢは凝集しないことが示される。
図３８は、高齢のＰＧＲＮ ＫＯマウスでは脳におけるＧＭ２の発現が増加することを示す図である。高齢のＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来の脳組織を、ＧＭ２抗体を用いて免疫組織化学的検査によって染色した。
図３９は、ＰＧＲＮ ＫＯマクロファージにおいて、ＰＧＲＮ、およびＰＧＲＮ由来の操作されたタンパク質であるアトストリンがβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積をレスキューすることを示す図である。ＰＧＲＮ ＫＯマウス由来のＢＭＤＭに、示されている種々の量のＰＧＲＮまたはアトストリン（１００ｎｇ／ｍｌおよび４００ｎｇ／ｍｌのＰＧＲＮまたはアトストリン）を伴ってまたは伴わずに、５０μｇ／ｍｌの脂質を１０日間投与した。光学顕微鏡検査（ＬＭ）の下で、ＢＭＤＭは脂質処理後に乱雑様になり、この形態学的変化はＰＧＲＮおよびアトストリンのどちらによっても用量依存的に部分的にレスキューされた（上のパネル）。脂質処理に伴ってβ−ＧｌｃＣｅｒが蓄積し、この蓄積は組換えＰＧＲＮまたはアトストリンを添加することによって用量依存的に遮断される。
図４０は、ＧＤ患者由来の線維芽細胞において、ＰＧＲＮおよびアトストリンがβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積をレスキューすることを示す図である。線維芽細胞をＩＩ型ＧＤ患者から単離し、５０μｇ／ｍｌの脂質混合物を用いて２日間処理した。ＧＢＡおよびβ−ＧｌｃＣｅｒの発現を免疫蛍光染色によって測定し、共焦点顕微鏡によって画像を取得した。脂質処理により、ＧＤ線維芽細胞におけるＧＢＡの凝集およびβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積が有意に誘導された。４００ｎｇ／ｍｌのＰＧＲＮによる処理により、ＧＢＡの凝集およびβ−ＧｌｃＣｅｒの貯蔵がほぼ完全に予防される。アトストリンはいくらかの効果を示すがＰＧＲＮ未満である。
図４１は、脂質を用いて処理したＧＤ患者由来の線維芽細胞において、アトストリンがβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積を投与量依存的にレスキューすることを示す図である。ＧＤ患者由来の線維芽細胞を、５０μｇ／ｍｌの脂質混合物を示されている種々の量のアトストリン（０、０．５、５および５０ｕｇ／ｍｌのアトストリン）と共に用いて処理した。β−ＧｌｃＣｅｒについての免疫蛍光染色が示されている。アトストリンは、β−ＧｌｃＣｅｒの蓄積を用量依存的にレスキューし、５０μｇ／ｍｌが特に有効である。
図４２は、ＰＧＲＮおよびアトストリンにゴーシェ病を治療する治療効果があることを示す図である。８週齢のＰＧＲＮ ＫＯマウスに、以前に記載されている通りＯＶＡを用いて攻撃することによってゴーシェ病を誘導した。マウスのいくつかの群に、組換えＰＧＲＮタンパク質、ＢＳＡ、およびアトストリン（４ｍｇ／ｋｇ／週）を４週間にわたってＩ．Ｐ注射した（群当たりｎ＝８）。（Ａ）肺組織の組織学的変化をＨ＆Ｅ染色によって調査した。（Ｂ）ゴーシェ細胞数の定量化。（Ｃ）ゴーシェ細胞サイズの定量化（＊＊ｐ＜０．０１）。
図４３は、ＰＧＲＮおよびアトストリンのどちらによっても処理することができるＬＳＤ線維芽細胞を示す図である。ＬＳＤ線維芽細胞を、脂質を単独で、または、組換えＰＧＲＮもしくはアトストリン（０．４μｇ／ｍｌ）と一緒に用いて、それぞれ２４時間にわたって攻撃した。ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ−ｒｅｄを用いてリソソームを染色した。各試料について画像１０枚を共焦点顕微鏡の下でランダムに取得し、リソソーム貯蔵をｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅによって蛍光強度に基づいて定量化した。ＧＤＩ、ＧＤＩＩ：ゴーシェ病ＩおよびＩＩ；ＴＳＤ：テイ・サックス病；ＭＬＩＩＩ：ムコリピドーシスＩＩＩ（＊＊ｐ＜０．０１）。
図４４は、ＰＧＲＮおよびアトストリンのどちらによっても処理することができるＬＳＤ線維芽細胞を示す図である。ＬＳＤ線維芽細胞を、脂質を単独で、または組換えＰＧＲＮもしくはアトストリン（０．４μｇ／ｍｌ）と一緒に用いて、それぞれ２４時間にわたって攻撃した。ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ−ｒｅｄを用いてリソソームを染色した。各試料について画像１０枚を共焦点顕微鏡の下でランダムに取得し、リソソーム貯蔵をｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅによって蛍光強度に基づいて定量化した。ＭＰＳＩＩ、ＭＰＳＩＩＩ、ＭＰＳＶＩ：ムコ多糖症ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＶＩ型；ＭＬＤ：異染性白質ジストロフィー；ＦＤ：ファーバー病（＊＊ｐ＜０．０１）。
図４５は、ＰＧＲＮが脂質による攻撃後のＧＤ ＩＩＩにおけるリソソーム貯蔵をレスキューするが、アトストリンはレスキューしないことを示す図である。ＧＤ ＩＩＩ由来の線維芽細胞を、脂質を単独で、または組換えＰＧＲＮもしくはアトストリン（０．４μｇ／ｍｌ）と一緒に用いて、それぞれ２４時間にわたって攻撃した。ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ−ｒｅｄを用いてリソソームを染色した。各試料について画像１０枚を共焦点顕微鏡の下でランダムに取得し、リソソーム貯蔵をｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅによって蛍光強度に基づいて定量化した（＊＊ｐ＜０．０１）。
図４６は、ＰＧＲＮとアトストリンの両方がリソソーム貯蔵の減少に対して最小限の効果しか示さないＬＳＤ線維芽細胞を示す図である。ＬＳＤ線維芽細胞を、脂質を単独で、または組換えＰＧＲＮもしくはアトストリン（０．４μｇ／ｍｌ）と一緒に用いて、それぞれ２４時間にわたって攻撃した。ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ−ｒｅｄを用いてリソソームを染色した。各試料について画像１０枚を共焦点顕微鏡の下でランダムに取得し、リソソーム貯蔵をｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅによって蛍光強度に基づいて定量化した。ＭＬ：ムコリピドーシス；ＭＰＳ：ムコ多糖症；ＮＰＤ：ニーマン・ピック病。
図４７は、クラッベ病において、ＰＧＲＮおよびアトストリンが、リソソーム貯蔵をレスキューすることを示す図である。クラッベ病由来の線維芽細胞を、脂質を単独で、または組換えＰＧＲＮもしくはアトストリン（０．４μｇ／ｍｌ）と一緒に用いて、それぞれ２４時間にわたって攻撃した。ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ−ｒｅｄを用いてリソソームを染色し、共焦点顕微鏡の下で画像を１０枚取得した。
図４８は、示されたグラニュリン単位を有するＰＧＲＮタンパク質の構造を示す図である。
図４９Ａおよび４９Ｂは、（Ａ）ヒトＰＧＲＮのアミノ酸配列（配列番号２）および（Ｂ）マウスＰＧＲＮのアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。（Ｂ）では、グラニュリン単位ＧｒｎＡ、ＧｒｎＣ、ＧｒｎＤおよびＧｒｎＥに下線が引かれており、各単位で示されている。
図５０は、アトストリンペプチド（１／２Ｆ＋Ｐ３＋Ｐ４＋１／２Ａ＋Ｐ５＋１／２Ｃ）の配列（配列番号４）、および種々の他のＰＧＲＮペプチドの配列（配列番号５〜９）を示す図である。
図５１は、８ｋｂのＰＧＲＮヒト遺伝子核酸配列（配列番号１０）を示す図である。ＰＧＲＮ ｍＲＮＡはヌクレオチド１０１から始まる。 図５１は、８ｋｂのＰＧＲＮヒト遺伝子核酸配列（配列番号１０）を示す図である。ＰＧＲＮ ｍＲＮＡはヌクレオチド１０１から始まる。 図５１は、８ｋｂのＰＧＲＮヒト遺伝子核酸配列（配列番号１０）を示す図である。ＰＧＲＮ ｍＲＮＡはヌクレオチド１０１から始まる。
本発明によると、当技術分野の技量の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技法を使用することができる。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９８９年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｒ． Ｍ．編（１９９４年）］；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ｊ． Ｅ． Ｃｅｌｉｓ編（１９９４年））］；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ．編（１９９４年）］；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ編１９８４年）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５年）］；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）］；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」［Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６年）］；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、（１９８６年）］；Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４年）を参照されたい。
したがって、本明細書において出てきた場合、以下の用語は、以下に示す定義を有するものとする。
「プログラニュリン」、「ＰＧＲＮ」、「グラニュリン−エピセリン前駆体」、「ＧＥＰ」、「ＰＣ細胞由来増殖因子」、「ＰＣＤＧＦ」、「プロエピセリン」、「アクログラニン」および「ＧＰ８０」という用語および具体的には列挙されていない任意の変形は、本明細書では互換的に使用することができ、本出願および特許請求の範囲全体を通して使用される場合、単一または複数のタンパク質、およびその活性断片を含めたタンパク質性物質を指し、配列番号２および配列番号３で示されるものを含めた、本明細書に記載されており、図４９に示されているアミノ酸配列データ、ならびに本明細書および特許請求の範囲に説明されている活性のプロファイルを有するタンパク質まで及ぶ。したがって、実質的に等しいまたは変更された活性を示すタンパク質が同様に意図されている。これらの改変は、例えば、部位特異的変異誘発によって得られる改変などの意図的なものであってもよく、複合体またはその指定されたサブユニットの産生者である宿主における変異によって得られるものなどの偶発的なものであってもよい。また、「プログラニュリン」、「ＰＧＲＮ」、「グラニュリン−エピセリン前駆体」、「ＧＥＰ」、「ＰＣ細胞由来増殖因子」、「ＰＣＤＧＦ」、「プロエピセリン」、「アクログラニン」および「ＧＰ８０」という用語は、本明細書において具体的に列挙されているタンパク質ならびに全ての実質的に相同な類似体および対立遺伝子バリエーションをそれらの範囲内に含むものとする。
「グラニュリン（複数可）」、「エピセリン」または「グラニュリンＡ〜Ｅ」のいずれか、「ＧｒｎＡ」、「ＧｒｎＢ」、「ＧｒｎＣ」、「ＧｒｎＤ」、「ＧｒｎＥ」という用語は、ＧＥＰポリペプチド分子からタンパク質分解プロセシングによってグラニュリンを放出することができる、配列モチーフＣＸ５〜６ＣＸ５ＣＣＸ８ＣＣＸ６ＣＣＸＤＸ２ＨＣＣＰＸ４ＣＸ５〜６Ｃ（配列番号１）を含むまたは有するものを含めた、およそ６ｋＤａのサイズの特定のシステインリッチモチーフを指す。これらのグラニュリン（複数可）は、生物活性を保持してよく、細胞成長アッセイ、酵素基質蓄積アッセイ、ＧＢＡ、ソーティリンおよび／またはＨＳＰ７０結合を含めたタンパク質結合、ＧＢＡおよび／または他のリソソーム酵素プロセシングまたはリソソームへの送達、ならびにゴーシェ型細胞の査定を含め、活性アッセイにおいて活性であってよい。グラニュリンは、ＰＧＲＮの活性断片をもたらし得る。例示的なグラニュリン配列としては、本明細書に記載されており、図４９または５０に示されているアミノ酸配列データ、および本明細書に説明されている活性のプロファイルを有するタンパク質またはその断片が挙げられる。したがって、実質的に等しいまたは変更された活性を示すタンパク質が同様に意図されている。これらの改変は、例えば、部位特異的変異誘発によって得られる改変などの意図的なものであってもよく、複合体またはその指定されたサブユニットの産生者である宿主における変異によって得られるものなどの偶発的なものであってもよい。また、「グラニュリン（複数可）」、「エピセリン」または「グラニュリンＡ〜Ｅ」のいずれか、「ＧｒｎＡ」、「ＧｒｎＢ」、「ＧｒｎＣ」、「ＧｒｎＤ」、「ＧｒｎＥ」という用語は、本明細書において具体的に列挙されているタンパク質ならびに全ての実質的に相同な類似体および対立遺伝子バリエーションをそれらの範囲に含むものとする。
「アトストリン」、「ＴＮＦ受容体を標的とすることによるＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達のアンタゴニスト」、「アトストリンペプチド」という用語および具体的には列挙されていない任意の変形は、本明細書では互換的に使用することができ、本出願および特許請求の範囲全体を通して使用される場合、特にＰＧＲＮに由来するまたはその断片である単一または複数のタンパク質を含めたペプチドを指し、本明細書に記載されており図５０に示されており、また図４８に図示されており、配列番号４で示されているアミノ酸配列データ、ならびに本明細書において記載され説明されており、特許請求の範囲において提示される活性および能力のプロファイルを有するタンパク質に及ぶ。リソソームへの酵素の送達を促進すること、ならびに／またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）などのリソソーム酵素と、もしくはソーティリンおよび／もしくはＨＳＰ７０と結合するもしくは複合体を形成することにおいて活性を有する活性なＰＧＲＮペプチドが本発明に含まれ、提供される。これらの活性なＰＧＲＮペプチドは生物活性を保持してよく、細胞成長アッセイ、酵素基質蓄積アッセイ、ＧＢＡ、ソーティリンおよび／またはＨＳＰ７０結合を含めたタンパク質結合、ＧＢＡおよび／または他のリソソーム酵素プロセシングまたはリソソームへの送達、ならびにゴーシェ型細胞の査定を含め、活性アッセイにおいて活性であってよい。ヒトＰＧＲＮの全長配列およびマウスＰＧＲＮの全長配列は、それぞれ図４９Ａおよび４９Ｂにおいて提示される（配列番号２および３）。したがって、特にアトストリンまたはアトストリン由来配列を含めたＰＧＲＮ配列（複数可）に由来するまたはＰＧＲＮ配列（複数可）を含み、酵素に結合し、かつ／または酵素のリソソームへの送達を促進する活性を有するＧＢＡ結合性ペプチドを含めたリソソーム酵素結合性ペプチドが本発明に包含される。これらのアトストリンペプチドは、ペプチドの断片、改変体、および誘導体を含み、包含する。したがって、実質的に等しい活性を示し、その改変であるタンパク質が同様に意図されている。これらの改変は、例えば、部位特異的変異誘発によって得られる改変などの意図的なものであってもよく、複合体またはその指定されたサブユニットの産生者である宿主における変異によって得られるものなどの偶発的なものであってもよい。ヒトアトストリンおよび活性なＰＧＲＮペプチド配列に対応するマウスまたは他の種またはオルソログＰＧＲＮ配列がさらに意図されている。また、「アトストリン」、「ＴＮＦ受容体を標的とすることによるＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達のアンタゴニスト」、「アトストリンペプチド」という用語は、本明細書において具体的に列挙されているタンパク質ならびに全ての実質的に相同な類似体および対立遺伝子バリエーションをそれらの範囲内に含むものとする。
本明細書に記載のアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体型であることが好ましい。しかし、免疫グロブリン結合の所望の機能性がポリペプチドによって保持される限りは、「Ｄ」異性体型の残基で任意のＬアミノ酸残基を置換することができる。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離のカルボキシ基を指す。標準のポリペプチド命名法、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２４３巻：３５５２〜５９頁（１９６９年）に従って、アミノ酸残基の略語を以下の対応表に示す：
本明細書では、アミノ酸残基配列は全て、左から右の方向がアミノ末端からカルボキシ末端の従来の方向である式で表されていることに留意するべきである。さらに、アミノ酸残基配列の開始または終了時のダッシュは、１つまたは複数のアミノ酸残基のさらなる配列とのペプチド結合を示すことに留意するべきである。上記の表は、本明細書においてどちらかが現れ得る３文字および１文字表示法と相関するように示されている。
「レプリコン」とは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＤＮＡ複製の自律単位として機能する、すなわち、それ自体の制御下で複製することが可能な任意の遺伝要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
「ベクター」とは、別のＤＮＡセグメントを付着させ、したがって付着したセグメントの複製をもたらすことができるプラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。
「ＤＮＡ分子」とは、一本鎖形態、または二本鎖へリックスのいずれかのポリマーの形態のデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）を指す。この用語は、分子の一次および二次構造のみを指し、分子をいかなる特定の三次形態にも限定するものではない。したがって、この用語は、とりわけ、直鎖ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミド、および染色体において見いだされる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造の考察において、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’の方向の配列のみをもたらす通常の慣習に従って本明細書に記載され得る。
「複製開始点」とは、ＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列を指す。
ＤＮＡ「コード配列」とは、適切な調節配列の制御下に置かれると、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて転写され、ポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端にある開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端にある翻訳終止コドンによって決定される。コード配列としては、これらに限定されないが、原核生物の配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、およびさらには合成ＤＮＡ配列を挙げることができる。通常ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列がコード配列の３’側に位置する。
転写制御配列および翻訳制御配列は、例えば、宿主細胞においてコード配列の発現をもたらす、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどのＤＮＡ調節配列である。
「プロモーター配列」とは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流の（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義するために、プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位に結合され、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基またはエレメントが含まれるように上流（５’方向）に伸長する。プロモーター配列内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって都合よく定義される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合性ドメイン（コンセンサス配列）が見いだされる。真核生物のプロモーターは、多くの場合、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。原核生物のプロモーターは、−１０および−３５コンセンサス配列に加えてシャイン・ダルガルノ配列を含有する。
「発現制御配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いでそれがコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される際に、細胞内の転写制御配列および翻訳制御配列の「制御下にある」。
「シグナル配列」は、コード配列の前に含まれていてよい。この配列は、宿主細胞と交信してポリペプチドを細胞表面に導くまたはポリペプチドを培地中に分泌させる、ポリペプチドに対してＮ末端側にあるシグナルペプチドをコードし、このシグナルペプチドはタンパク質が細胞から出る前に宿主細胞によって削除される。シグナル配列は、原核生物および真核生物に対してネイティブな種々のタンパク質に関連して見いだすことができる。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本発明のプローブに関して本明細書で使用される場合、２つまたはそれ超、好ましくは３つ超のリボヌクレオチドで構成される分子と定義される。その正確なサイズは、多くの因子に左右され、その因子はオリゴヌクレオチドの最終的な機能および使用に左右される。
「プライマー」という用語は、本明細書で使用される場合、精製された制限消化物の場合など天然に存在するか合成により作製されたかにかかわらず、核酸鎖と相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下で適切な温度およびｐＨに置いた場合に合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、誘導剤の存在下で所望の伸長産物の合成を刺激するのに十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源および方法の使用を含めた多くの因子に左右される。例えば、診断に適用するためには、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは、一般には、１５〜２５またはそれ超のヌクレオチドを含有するが、それよりも少ないヌクレオチドを含有してよい。
本発明でのプライマーは、特定の標的ＤＮＡ配列の異なる鎖と「実質的に」相補的になるように選択される。これは、プライマーが、それらのそれぞれの鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片をプライマーの５’末端に付着させることができ、プライマー配列の残りは鎖と相補的である。あるいは、プライマー配列が鎖の配列と、それとハイブリダイズし、それにより、伸長産物を合成するための鋳型を形成するのに十分な相補性を有するのであれば、非相補的塩基またはより長い配列がプライマー内に散在してよい。
本明細書で使用される場合、「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、細菌酵素を指し、そのそれぞれが二本鎖ＤＮＡを特定のヌクレオチド配列においてまたはその付近で切断する。
細胞は、外因性または異種ＤＮＡが細胞の内部に導入されている場合、そのようなＤＮＡによって「形質転換」されている。形質転換用ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれて（共有結合により連結して）いてもよく、そうでなくてもよい。原核生物、酵母、および哺乳動物細胞では、例えば、形質転換用ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソームエレメント上で維持することができる。真核細胞に関しては、安定に形質転換された細胞とは、形質転換用ＤＮＡが染色体に組み込まれ、したがって、それが染色体の複製を通じて娘細胞に遺伝する細胞である。この安定性は、形質転換用ＤＮＡを含有する娘細胞の集団から構成される細胞株またはクローンを樹立する真核細胞の能力によって実証される。「クローン」とは、単一細胞または共通の祖先から有糸分裂によって引き出される細胞の集団である。「細胞株」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて多くの世代にわたって安定に成長することができる、初代細胞のクローンである。
２つのＤＮＡ配列は、ヌクレオチドの少なくとも約７５％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）がＤＮＡ配列の定義済みの長さにわたりマッチする場合、「実質的に相同」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクにおいて入手可能な標準のソフトウェアを使用して配列を比較することによって、または、例えばその特定のシステムに対して定義されるようなストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは当技術分野の技量の範囲内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｉ ＆ ＩＩ巻、上記；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、上記を参照されたい。
図４９または５０およびそれに関連する配列番号２、３および４〜９のいずれかで示されるものを含めた、ＰＧＲＮまたはＰＧＲＮペプチドと同じアミノ酸配列を有するペプチドをコードするが、縮重して任意のそのような配列になっている、１つまたは複数のグラニュリンを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、ＰＧＲＮ（配列番号１０を含む）、ＰＧＲＮ由来のペプチドアトストリン、または他のＰＧＲＮペプチドをコードするＤＮＡ配列も本発明の範囲内に入ることが理解されるべきである。「への縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｔｏ）」とは、特定のアミノ酸を指定するために異なる３文字コドンが使用されることを意味する。以下のコドンは、特異的なアミノ酸のそれぞれをコードするために互換的に使用することができることが当技術分野で周知である：
フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ） ＵＵＵまたはＵＵＣ
ロイシン（ＬｅｕまたはＬ） ＵＵＡまたはＵＵＧまたはＣＵＵまたはＣＵＣまたはＣＵＡまたはＣＵＧ
イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ） ＡＵＵまたはＡＵＣまたはＡＵＡ
メチオニン（ＭｅｔまたはＭ） ＡＵＧ
バリン（ＶａｌまたはＶ） ＧＵＵまたはＧＵＣまたはＧＵＡまたはＧＵＧ
セリン（ＳｅｒまたはＳ） ＵＣＵまたはＵＣＣまたはＵＣＡまたはＵＣＧまたはＡＧＵまたはＡＧＣ
プロリン（ＰｒｏまたはＰ） ＣＣＵまたはＣＣＣまたはＣＣＡまたはＣＣＧ
トレオニン（ＴｈｒまたはＴ） ＡＣＵまたはＡＣＣまたはＡＣＡまたはＡＣＧ
アラニン（ＡｌａまたはＡ） ＧＣＵまたはＧＣＧまたはＧＣＡまたはＧＣＧ
チロシン（ＴｙｒまたはＹ） ＵＡＵまたはＵＡＣ
ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ） ＣＡＵまたはＣＡＣ
グルタミン（ＧｌｎまたはＱ） ＣＡＡまたはＣＡＧ
アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ） ＡＡＵまたはＡＡＣ
リシン（ＬｙｓまたはＫ） ＡＡＡまたはＡＡＧ
アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ） ＧＡＵまたはＧＡＣ
グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ） ＧＡＡまたはＧＡＧ
システイン（ＣｙｓまたはＣ） ＵＧＵまたはＵＧＣ
アルギニン（ＡｒｇまたはＲ） ＣＧＵまたはＣＧＣまたはＣＧＡまたはＣＧＧまたはＡＧＡまたはＡＧＧ
グリシン（ＧｌｙまたはＧ） ＧＧＵまたはＧＧＣまたはＧＧＡまたはＧＧＧ
トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ） ＵＧＧ
終結コドン ＵＡＡ（オーカー）またはＵＡＧ（アンバー）またはＵＧＡ（オパール）
上で指定されたコドンはＲＮＡ配列についてのものであることが理解されるべきである。ＤＮＡの対応するコドンはＵの代わりにＴを使用する。
ＰＧＲＮ、ＰＧＲＮ由来のペプチドアトストリン、またはＰＧＲＮペプチド（複数可）配列（複数可）に変異を生じさせることができ、したがって、特定のコドンを異なるアミノ酸をコードするコドンに変化させる。そのような変異は、一般に、可能性のある最も少ないヌクレオチド変化を生じさせることによって成すことができる。この種の置換変異を生じさせて、得られるタンパク質のアミノ酸を非保存的に（すなわち、特定のサイズまたは特性を有するアミノ酸の群に属するアミノ酸から別の群に属するアミノ酸にコドンを変化させることによって）または保存的に（すなわち、特定のサイズまたは特性を有するアミノ酸の群に属するアミノ酸から同じ群に属するアミノ酸にコドンを変化させることによって）変化させることができる。そのような保存的変化では、一般に、得られるタンパク質の構造および機能の変化が少なくなる。非保存的変化は、得られるタンパク質の構造、活性または機能を変更する可能性がより高い。本発明は、得られるタンパク質の活性または結合特性を有意に変更しない保存的変化を含有する配列を含むものとみなされるべきである。
以下は、Ｒ基に基づくアミノ酸の種々の群分けの１つの例である：非極性Ｒ基を有するアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（Ｐｈ６．０で負に荷電）：アスパラギン酸、グルタミン酸；塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に荷電）：リシン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０）。別の群は、フェニル基を有するアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンであり得る。別の群分けは、分子量（すなわち、Ｒ基のサイズ）に応じたものであり得る：
グリシン ７５
アラニン ８９
セリン １０５
プロリン １１５
バリン １１７
トレオニン １１９
システイン １２１
ロイシン １３１
イソロイシン １３１
アスパラギン １３２
アスパラギン酸 １３３
グルタミン １４６
リシン １４６
グルタミン酸 １４７
メチオニン １４９
ヒスチジン（ｐＨ６．０） １５５
フェニルアラニン １６５
アルギニン １７４
チロシン １８１
トリプトファン ２０４ 。
特に好ましい置換は、
−ＡｒｇからＬｙｓおよびその逆、その結果、正電荷を維持することができる；
−ＡｓｐからＧｌｕおよびその逆、その結果、負電荷を維持することができる；
−ＴｈｒからＳｅｒ、その結果、遊離の−ＯＨを維持することができる；および
−ＡｓｎからＧｌｎ、その結果、遊離のＮＨ２を維持することができる。
アミノ酸置換は、特に好ましい性質を有するアミノ酸を置換するためにも導入することができる。例えば、Ｃｙｓを、別のＣｙｓとのジスルフィド架橋のための潜在的部位に導入することができる。Ｈｉｓを特に「触媒」部位として導入することができる（すなわち、Ｈｉｓは酸または塩基として作用し得、生化学的触媒作用において最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏは、特に平面構造であり、タンパク質の構造内にβ−ターンを誘導するので、導入することができる。
２つのアミノ酸配列は、アミノ酸残基の少なくとも約７０％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）が同一である、または保存的置換を示す場合、「実質的に相同」である。
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、天然ではより大きな分子に付随しては見いだされない、より大きなＤＮＡ分子内の同定可能なＤＮＡのセグメントである。したがって、異種領域が哺乳動物の遺伝子をコードする場合、遺伝子には、通常、供給源である生物体のゲノム内では哺乳動物のゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡが隣接している。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然に見いだされない構築物（例えば、ゲノムコード配列が、イントロン、またはネイティブな遺伝子とは異なるコドンを有する合成の配列を含有するｃＤＮＡ）である。対立遺伝子バリエーションまたは天然に存在する変異事象によっては、本明細書で定義されているＤＮＡの異種領域は生じない。
ＤＮＡ配列は、発現制御配列がそのＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節する場合、発現制御配列に「作動可能に連結」している。「作動可能に連結」という用語は、発現されるＤＮＡ配列の前に適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有すること、ならびに発現制御配列の制御下にあるＤＮＡ配列の発現およびＤＮＡ配列によりコードされる所望の産物の産生を可能にするための正しい読み枠を維持することを含む。組換えＤＮＡ分子に挿入することが望まれる遺伝子が適切な開始シグナルを含有しない場合には、そのような開始シグナルをその遺伝子の前に挿入することができる。
「標準のハイブリダイゼーション条件」という用語は、ハイブリダイゼーションと洗浄の両方に対して５×ＳＳＣおよび６５℃と実質的に同等である塩および温度条件を指す。しかし、そのような「標準のハイブリダイゼーション条件」は、緩衝液中のナトリウムおよびマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列の長さおよび濃度、ミスマッチ％、ホルムアミド％などを含めた特定の条件に左右されることが当業者には理解されよう。ハイブリダイズする２つの配列がＲＮＡ−ＲＮＡであるか、ＤＮＡ−ＤＮＡであるか、またはＲＮＡ−ＤＮＡであるかも「標準のハイブリダイゼーション条件」の決定において重要である。そのような標準のハイブリダイゼーション条件は、周知の公式に従って当業者によって容易に決定され、ハイブリダイゼーションは、一般には、予測されるまたは決定されたＴｍより１０−２０ＮＣ下であり、所望であればより高いストリンジェンシーの洗浄を伴うものである。
本明細書で使用される場合、「ｐｇ」はピコグラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｕｇ」または「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｕｌ」または「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「ｌ」はリットルを意味する。
「抗体」とは、特異的なエピトープに結合する抗体およびその断片を含めた任意の免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル、モノクローナル、およびキメラ抗体を包含し、最後に言及したものについては米国特許第４，８１６，３９７号および同第４，８１６，５６７号においてさらに詳細に記載されている。
「抗体結合部位」とは、抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖の可変領域および超可変領域で構成される抗体分子の構造的部分である。
種々の文法形式の「抗体分子」という句は、本明細書で使用される場合、インタクトな免疫グロブリン分子と免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の両方を意図するものである。
例示的な抗体分子は、インタクトな免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子、ならびに、本明細書に記載されている治療方法において使用するのに好ましい、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）として当技術分野で公知の部分を含めた、パラトープを含有する免疫グロブリン分子の部分である。抗体分子のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２部分は、周知の方法により、それぞれ実質的にインタクトな抗体分子に対するパパインおよびペプシンのタンパク質分解反応によって調製される。Ｆａｂ’抗体分子部分も周知であり、Ｆ（ａｂ’）２部分から、メルカプトエタノールを用いて２つの重鎖部分を連結するジスルフィド結合を還元し、その後、得られたタンパク質メルカプタンをヨードアセトアミドなどの試薬を用いてアルキル化して作製される。本発明では、インタクトな抗体分子を含有する抗体が好ましい。
種々の文法形式の「モノクローナル抗体」という句は、特定の抗原と免疫反応することができる抗体結合部位を１種のみ有する抗体を指す。したがって、モノクローナル抗体は、一般には、それが免疫反応するいずれかの抗原に対して単一の結合親和性を示す。したがって、モノクローナル抗体は、それぞれが異なる抗原に対して免疫特異的である複数の抗体結合部位を有する抗体分子を含有する、例えば、二特異性（キメラ）モノクローナル抗体であってよい。
「薬学的に許容される」という句は、生理的に許容可能であり、一般には、ヒトに投与された際に、アレルギー反応も、例えば、胃腸の不調、めまい感など同様の不都合な反応も生じさせない分子実体および組成物を指す。
「治療有効量」という用語は、医師または他の臨床家によって求められている、被験体の生物学的、生理的、臨床的、または医学的応答を引き出す、薬物、化合物、ペプチド、または医薬品の量を意味する。「治療有効量」という句は、本明細書では、器官の膨大、基質もしくはタンパク質の蓄積、神経学的欠損もしくは機能障害、または、例えば、その存在および活性を伴い得る血圧の上昇、発熱もしくは白血球数、脾臓もしくは肝臓の膨大などの病態の他の特徴における標的細胞集団のＳ期活性の臨床的に有意な変化を予防する、好ましくは少なくとも約３０パーセント、より好ましくは少なくとも５０パーセント、最も好ましくは少なくとも９０パーセント低下させるのに十分な量を含むために使用される。
「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、疾患を引き起こす作用物質に曝露する可能性がある、または疾患の発症前に疾患の素因がある可能性がある被験体において、疾患または障害がもたらされるまたは発生するリスクを低下させる（すなわち、疾患の臨床症状の少なくとも１つが発生しないようにする）ことを指す。
「予防法（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」という用語は、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語に関連し、それに包含され、疾患を治療または治癒するのではなく、予防することが目的の手段または手順を指す。予防的手段の非限定的な例としては、ワクチンの投与；例えば不動化に起因する血栓症のリスクがある入院患者への低分子量ヘパリンの投与；およびマラリアが風土病であるまたはマラリアに罹患するリスクが高い地理的地域への訪問前のクロロキンなどの抗マラリア剤の投与を挙げることができる。
「溶媒和化合物」という用語は、本発明において有用な化合物と１つまたは複数の溶媒分子との物理的な会合を意味する。この物理的な会合は水素結合を含む。特定の例では、溶媒和化合物は、例えば、１つまたは複数の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子に組み入れられている場合、単離することができる。「溶媒和化合物」は、溶液相および単離可能な溶媒和化合物の両方を包含する。代表的な溶媒和化合物としては、水和物、エタノレートおよびメタノレートが挙げられる。
「被験体」という用語は、ヒトおよび他の哺乳動物を包含する。
任意の疾患または障害を「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、一実施形態では、疾患または障害を好転させること（すなわち、疾患を静止させることまたはその臨床症状の少なくとも１つの症状発現、程度もしくは重症度を低下させること）を指す。別の実施形態では、「治療すること」または「治療」とは、被験体によって識別可能でない可能性がある少なくとも１つの身体的パラメータを好転させることを指す。さらに別の実施形態では、「治療すること」または「治療」とは、疾患または障害を、物理的に（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理的に（例えば、身体的パラメータの安定化）、またはその両方でモジュレートすることを指す。さらなる実施形態では、「治療すること」または「治療」とは、疾患の進行を遅らせることに関する。
「リソソーム蓄積症（複数可）」、「ＬＳＤ」という用語は、最終的に細胞機能障害および臨床的異常が生じる、消化されなかったまたは部分的に消化された巨大分子の蓄積を特徴とする疾患または障害の不均一な群を指す。ＬＳＤは、リソソーム酵素のうちの１つまたは複数の遺伝子変異に起因し、その酵素の基質のリソソーム内での蓄積をもたらし、多くの場合、最終的に臓器肥大、結合組織および眼の病態、ならびに中枢神経系機能障害に至る。リソソーム蓄積症（複数可）としては、スフィンゴリピドーシス、ガングリオシドーシス、ムコ多糖症、糖タンパク質蓄積症、ムコリピドーシスが挙げられる。この用語は、これらに限定されないが、ゴーシェ病（ＧＤ）、テイ・サックス病、ファブリー病、ファーバー病、サンドホフ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、クラッベ病、ニーマン・ピック病（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型）、ポンペ病、ムコリピドーシスＩＩ型（ハンター症候群）、ムコリピドーシスＩＩＩＡ型、小児性遊離シアル酸蓄積症（ＩＳＳＤ）、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、ウォルマン病およびサラ病から選択される例示的な疾患を包含する。特定の態様では、好ましいリソソーム蓄積症は、Ｉ型、ＩＩ型および／またはＩＩＩ型ゴーシェ病を含めたゴーシェ病である。
「ゴーシェ病」、「ＧＤ」という用語は、最も一般的なリソソーム蓄積症であるゴーシェ病を指す。ゴーシェ病はスフィンゴ脂質の機能障害性代謝を伴い、古典的には酵素グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）の遺伝的欠損に起因する。
本発明は、タンパク質プログラニュリンＰＧＲＮがリソソーム酵素のリソソームへの運搬において重要な決定的な役割を果たすことを実証する。そのように、ＰＧＲＮ、およびアトストリンを含めたＰＧＲＮ由来の活性ペプチドは、リソソーム蓄積症および障害における治療的、予防的、および診断的使用および適用を有する。ＰＧＲＮは、本発明において、特にガラクトセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）を含めたリソソーム酵素に結合することが実証される。ＰＧＲＮおよび特にＰＧＲＮ／ＧＢＡ複合体などのＰＧＲＮ／リソソーム酵素複合体は、ソーティリンおよびＨＳＰ７０を含めたリソソーム／エンドソーム輸送および選別タンパク質に結合する。ゴーシェ病を含めたリソソーム蓄積症は、例えばＰＧＲＮノックアウト（ＫＯ）動物において、ＰＧＲＮの不在下または変異したＰＧＲＮに伴って発生する。ＧＤ患者の７０％超がＰＧＲＮの変異も有する。したがって、ＰＧＲＮおよびアトストリンを含めたＰＧＲＮ由来の活性ペプチドを、ゴーシェ病を含めたリソソーム蓄積症（複数可）の診断、好転および療法のために適用することができる。
本発明は、リソソーム蓄積症または障害（ＬＳＤ）を予防、治療または緩和するための、ＰＧＲＮ、ＰＧＲＮペプチド、アトストリン、および／またはそれらの活性な誘導体の使用および適用を包含する。本発明は、リソソーム内への基質および／または分子の蓄積の状態、症状および臨床的な症状発現を含めたリソソーム蓄積症を予防、治療または緩和するための、ＰＧＲＮ、ＰＧＲＮペプチド、アトストリン、および／またはそれらの誘導体の使用および適用を包含する。リソソーム蓄積症としては、スフィンゴリピドーシス、ガングリオシドーシス、ムコ多糖症、糖タンパク質蓄積症、ムコリピドーシス、ならびに、ゴーシェ病（ＧＤ）、テイ・サックス病、ファブリー病、ファーバー病、サンドホフ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、クラッベ病、ニーマン・ピック病（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型）、ポンペ病、ムコリピドーシスＩＩ型（ハンター症候群）、ムコリピドーシスＩＩＩＡ型、小児性遊離シアル酸蓄積症（ＩＳＳＤ）、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、ウォルマン病およびサラ病から選択される例示的な疾患が挙げられる。本発明は、必要なまたは関連性のあるリソソームの作用物質、酵素および／または他の分子のリソソームへの送達を促進することによって、リソソーム蓄積障害を予防、治療もしくは緩和するため、および／またはリソソーム蓄積障害に特異的に治療介入するための、ＧＥＰ、ＧＥＰペプチド、アトストリン、および／またはそれらの誘導体の使用および適用を包含する。
本明細書に記載のＰＧＲＮ、ＰＧＲＮペプチドおよび／またはアトストリンを含めたリソソームのタンパク質／酵素結合性ペプチドが存在することによって生じる診断的可能性および治療的可能性の両方は、ペプチドが、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）などのリソソームのタンパク質（複数可）／酵素（複数可）との直接かつ原因となるタンパク質間相互作用に関与し、また、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）などのリソソームのタンパク質（複数可）／酵素（複数可）の、リソソーム区画ならびに全体的な適切かつ有効なタンパク質の輸送および分解を維持する活性のためにそれらを必要とするリソソームへの運搬および／または輸送を開始、促進、媒介する機能を果たすまたはそれに必要であるという事実から導かれる。したがって、本発明は、リソソームまたはエンドソームへのタンパク質および酵素の変更されたまたは不十分な輸送に関連するリソソーム蓄積症または障害および任意の他の状態をモジュレート、緩和、予防または治療するための、リソソームへの必要な酵素／タンパク質の輸送および送達ならびに適切なリソソーム機能への薬学的介入を意図している。
本発明は、ＰＧＲＮ、および、特にアトストリンと称されるペプチド（複数可）を含めたＰＧＲＮペプチドをリソソーム蓄積症のモジュレーターおよびリソソーム輸送のモジュレーターとして提供する。具体的には、本発明は、ＰＧＲＮ、およびアトストリンを含めたＰＧＲＮペプチドをリソソームへのリソソーム酵素の輸送の促進因子として提供する。特定の実施形態では、本発明は、リソソームへの酵素の送達を促進することができ、かつ／または、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）などのリソソーム酵素と、もしくはソーティリンおよび／もしくはＨＳＰ７０と結合するもしくは複合体を形成することができる、本明細書において開示されているＰＧＲＮペプチドのファミリーおよびアトストリンのファミリーの全てのメンバーに関する。ペプチドのファミリーは、具体的にはＰＧＲＮの１つまたは複数のグラニュリン単位と１つまたは複数のリンカー単位とを含む、ＰＧＲＮ配列と半分の単位の混合部分を含めた、断片または部分を含む。一態様では、ペプチドは、ＰＧＲＮのグラニュリン単位の２つまたはそれ超の半分の単位と１つまたは複数のリンカー単位とを含む。本発明の特定の態様では、ＰＧＲＮペプチドは、グラニュリン単位Ａ、ＣおよびＦの半分の単位の組み合わせをリンカー単位Ｐ３、Ｐ４およびＰ５と組み合わせて含むペプチドアトストリンを含む。特定の態様では、ＧＥＰペプチドは、少なくとも１つの半分の単位が１／２Ｆであるグラニュリン単位の半分の単位の組み合わせと、リンカー単位、具体的には少なくとも２つのリンカー単位とを含む。さらなる特定の態様では、アトストリンは、図５０および配列番号４において示されているアミノ酸配列を有し、本明細書で示されているものを含めた、グラニュリン単位およびリンカー単位１／２Ｆ−Ｐ３−Ｐ４−１／２Ａ−Ｐ５−１／２Ｃを含む。
本発明の目的は、ＰＧＲＮペプチドおよび／またはアトストリンを含むまたはそれに基づく治療方法において使用するための医薬組成物を提供することである。医薬組成物は、リソソームへの酵素の送達を促進することができ、かつ／またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）などのリソソーム酵素と、もしくはソーティリンおよび／もしくはＨＳＰ７０と結合するもしくは複合体を形成することができ、かつ／または、リソソームもしくはマクロファージにおけるβ−ＧｌｃＣｅｒなどのリソソーム基質の蓄積を減少させることができる１つもしくは複数のＰＧＲＮペプチドおよび／またはアトストリンの組み合わせを含む。医薬組成物は、本明細書において提供される活性を有する１つもしくは複数のＰＧＲＮペプチドおよび／またはアトストリンの組み合わせならびに１つまたは複数のリソソーム酵素またはリソソーム基質低減剤を含む。リソソーム酵素またはリソソーム基質低減剤としては、グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼおよびスフィンゴミエリナーゼのうちの１つまたは複数が挙げられ、それらから選択することができる。医薬組成物は、ＧＢＡ結合活性を有する１つもしくは複数のＰＧＲＮペプチドおよび／またはアトストリンの組み合わせならびにイミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、タリグルセラーゼアルファ、ミグルスタットおよび酒石酸イソファゴミンのうちの１つまたは複数を含む。
したがって、本発明は、リソソーム蓄積症を治療または緩和するための組成物であって、単離されたＰＧＲＮまたはアトストリンを含めたその活性断片を含み、前記ＰＧＲＮまたは前記活性断片が、図４９または５０のいずれかおよび配列番号２、３または４〜９で示されるアミノ酸配列を含む組成物を提供する。ある態様では、本発明は、リソソーム蓄積症を治療または緩和するための組成物であって、単離されたＰＧＲＮを含み、前記ＰＧＲＮが、図４９ならびに配列番号２および／または３で示される配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含む組成物を提供する。したがって、一態様では、本発明において使用するＰＧＲＮは、野生型または天然のヒトまたはマウスＰＧＲＮに対して少なくとも１つのアミノ酸の差異を有する。１つのそのような態様では、ゴーシェ病を治療または緩和するための、ＰＧＲＮ、ＰＧＲＮペプチド、またはアトストリンをグルコセレブロシダーゼと組み合わせて含む組成物が提供される。ある態様では、本発明の組成物は、ＨＳＰ７０および／またはソーティリンを含めた、１つまたは複数の分子シャペロンまたはリソソーム送達タンパク質をさらに含んでよい。
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体、ビヒクル、希釈剤または賦形剤をさらに含む医薬組成物を含む。本明細書に記載のＰＧＲＮ、ＰＧＲＮペプチドおよび／またはアトストリンは、適切な担体と共に、変更されたまたは効力のないリソソームプロセシングまたはリソソーム酵素（複数可）に関連する有害な医学的状態、特にリソソーム蓄積症または関連する状態のいずれか、特にゴーシェ病を経験している患者に種々の手段で投与するのに有効な強度で医薬組成物に調製することができる。種々の投与技法を利用することができ、それらとしては、例えば皮下、静脈内および腹腔内注射、カテーテル法などの非経口技法がある。本明細書に記載のＰＧＲＮ、ＰＧＲＮペプチドおよび／またはアトストリンまたはそれらのサブユニットの平均の量は変動し得、特に、資格のある医師または獣医師による推奨および処方に基づくべきである。
本発明のペプチドおよび組成物は、配列番号２、３および４〜９を含め、図４９および５０において示されるものを含めたヒトＰＧＲＮ配列、ならびに１つもしくは複数またはわずかなもしくは多くの置換を有するその改変体に基づく、アトストリンを含めたＰＧＲＮペプチドを含み、ここで、改変体（複数可）の結合および活性プロファイルは、ＰＧＲＮ、ＰＧＲＮペプチドまたはアトストリンペプチドと比較して保持される。ヒトを含めた種々の動物または哺乳動物由来のＰＧＲＮペプチドが公知であるので、これらの配列は、アトストリンヒトペプチドアミノ酸の一部を置換することによるものを含めた、本発明の組成物および方法における潜在的使用がある代替アミノ酸配列および改変体をもたらす。マウスＧＥＰ配列は、本明細書において図４９Ｂ（配列番号２）に提供される。種々の動物のＰＧＲＮ配列が公知であり、開示されており、本発明の方法および組成物、ならびに本発明におけるＰＧＲＮペプチドの改変体としての評価および使用に適した、それらの対応し、相関するアミノ酸における評価および査定のために入手可能である。ＰＧＲＮ配列は、以下の通り入手可能であり、参照により本明細書に組み込まれる：ラット（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＡ１６９０３．１、ＣＡＡ４４１９８．１）、マウス（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｐ２８７９８．２、ＢＡＥ３５３８９．１、ＮＰ＿０３２２０１．２）、スマトラオランウータン（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＰ＿００１１２６６８９．１）、カニクイザル（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＢＡＥ０１７９６．１）、ウマ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＸＰ＿００１４８９７９１．１）、ウシ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＰ＿００１０７０４８２．１）、ウサギ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＸＰ＿００２７１９２２８．１）、ブタ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＰ＿００１０３８０４３．１）、チンパンジー（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＸＰ＿５１１５４９．２）およびオポッサム（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＸＰ＿００１３７４８７０．１）。
また、ＰＧＲＮおよび／またはＰＧＲＮペプチドおよび／またはそれらのサブユニットの産生または活性をモジュレートするポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を含めた抗体、ならびに薬物には、ある特定の診断的適用があり得、例えば、変更されたＰＧＲＮ、リソソーム蓄積症、ゴーシェ病に関連するまたはそれにより生じる状態を検出し、かつ／または測定する目的で利用することができる。例えば、ＰＧＲＮ、アトストリンまたはそのサブユニットを使用して、種々の細胞培地において、例えば、融合したマウス脾臓リンパ球と骨髄腫細胞を利用するハイブリドーマ技法などの公知の技法によって、それらに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を産生させることができる。同様に、本発明のＰＧＲＮの活性（複数可）を模倣するまたはそれと拮抗する小分子、特に、ＧＢＡとの結合などの、リソソーム酵素との結合を実証するものを発見または合成することができ、診断および／または治療プロトコールにおいて使用することができる。
ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作出するための一般的な方法論は周知である。発がん性ＤＮＡを用いたＢリンパ球の直接形質転換、またはエプスタイン・バーウイルスを用いたトランスフェクションなどの融合以外の技法によって不死抗体産生細胞株を創出することもできる。ＰＧＲＮペプチドに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルを、種々の性質；すなわち、アイソタイプ、エピトープ、親和性などについてスクリーニングすることができる。ＰＧＲＮもしくはそのサブユニットの活性を中和するモノクローナル抗体またはＧＢＡに結合するモノクローナル抗体が特に興味深い。そのようなモノクローナルは、結合または活性アッセイにおいて容易に同定することができる。本発明の診断方法において使用される抗ＰＧＲＮ抗体は、アフィニティ精製されたポリクローナル抗体であることが好ましい。抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であることがより好ましい。さらに、本明細書で使用される抗ＰＧＲＮ抗体分子は抗体分子全体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦ（ｖ）部分の形態であることが好ましい。
本発明は、リソソームへの酵素の送達を促進すること、ならびに／またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）などのリソソーム酵素と、もしくはソーティリンおよび／もしくはＨＳＰ７０と結合するもしくは複合体を形成すること、ならびに／またはリソソームもしくはマクロファージにおけるβ−ＧｌｃＣｅｒなどのリソソーム基質の蓄積を減少させることができることにおけるＰＧＲＮ、ＰＧＲＮペプチドおよび／またはアトストリンまたはその活性断片の活性に基づく治療方法を提供する。
したがって、動物におけるタンパク質または酵素のリソソーム送達を促進するための方法であって、前記動物に、単離されたＰＧＲＮまたはアトストリンを含めたその活性断片を投与することを含む方法が提供される。そのある態様では、前記ＰＧＲＮまたは前記活性断片は、配列番号２、３および４〜９を含めた図４９または５０のいずれかにおいて示されているアミノ酸配列を含む。方法は、動物においてリソソーム蓄積症を治療または緩和するための方法であって、前記動物に、単離されたＰＧＲＮまたはアトストリンを含めたその活性断片を投与することを含み、前記ＰＧＲＮまたは前記活性断片が、図４９または５０のいずれかにおいて示されているアミノ酸配列を含む方法を含む。これらの方法のある態様では、方法は、リソソーム蓄積症において減少している、存在しない、変異しているまたは変更されている１つまたは複数のリソソーム酵素をさらに投与することを含む。リソソーム酵素は、グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼおよびスフィンゴミエリナーゼのうちの１つまたは複数から選択することができる。本発明の方法のリソソーム蓄積症は、ゴーシェ病（ＧＤ）、テイ・サックス病、ファブリー病、ファーバー病、サンドホフ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、クラッベ病、ニーマン・ピック病（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型）、ポンペ病、ムコリピドーシスＩＩ型（ハンター症候群）、ムコリピドーシスＩＩＩＡ型、小児性遊離シアル酸蓄積症（ＩＳＳＤ）、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、ウォルマン病およびサラ病から選択することができる。ある態様では、本発明の方法のリソソーム蓄積症は、ゴーシェ病（ＧＤ）、テイ・サックス病（ＴＳＤ）、ムコリピドーシス（ＭＬ）、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ファーバー病（ＦＤ）およびクラッベ病（ＫＤ）から選択することができる。一態様では、本発明の方法のリソソーム蓄積症は、ＧＤ Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型を含めたゴーシェ病（ＧＤ）、テイ・サックス病（ＴＳＤ）、ＭＬ ＩＩＩを含めたムコリピドーシス（ＭＬ）、ＭＰＳ ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩを含めたムコ多糖症（ＭＰＳ）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ファーバー病（ＦＤ）およびクラッベ病（ＫＤ）から選択することができる。本発明の方法の特定の好ましい態様では、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、ゴーシェ病（ＧＤ）である。本発明の方法の特定の好ましい態様では、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）はゴーシェ病（ＧＤ）である。本発明の方法のある態様では、方法は、ゴーシェ病を治療または緩和するために、リソソーム酵素グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）またはその活性断片もしくは組換え型をさらに投与することを含む。本発明の方法の特定の好ましい態様では、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）はテイ・サックス病（ＴＳＤ）である。
リソソーム蓄積症、ゴーシェ病に関して、ゴーシェ病の患者においてグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）の送達を促進するための方法であって、前記患者に、単離されたＰＧＲＮまたはアトストリンを含めたその活性断片を投与することを含む方法が提供される。ＰＧＲＮまたは活性断片は、配列番号２、３および４〜９を含めた図４９または５０のいずれかにおいて示されているアミノ酸配列を特に含んでよい。ヒトにおけるゴーシェ病に関しては、ヒトＰＧＲＮタンパク質またはそのペプチドを特に利用することができ、任意選択で、イミグルセラーゼなどの組換えヒトグルコセレブロシダーゼまたはＧＢＡと組み合わせることができる。
本発明の方法およびアッセイは、動物においてリソソーム蓄積症を診断または評価するための方法およびアッセイであって、前記動物においてＰＧＲＮの発現もしくは活性を決定することまたはＰＧＲＮをコードするゲノムＤＮＡもしくは遺伝子の１つもしくは複数の変異を検出することを含む方法およびアッセイを含む。そのような方法またはアッセイはいずれも、前記動物において、さらに１つもしくは複数のリソソーム酵素の発現もしくは活性を決定することまたは１つもしくは複数のリソソーム酵素をコードするゲノムＤＮＡもしくは遺伝子の１つもしくは複数の変異を検出することを含んでよい。動物においてゴーシェ病を診断または評価するための方法またはアッセイが提供される。この態様では、方法またはアッセイは、前記動物においてさらにＧＢＡの発現もしくは活性を決定することまたはＧＢＡをコードするゲノムＤＮＡもしくは遺伝子の１つもしくは複数の変異を検出することを含んでよい。
本発明に従って、現在、リソソーム蓄積症患者が、ＰＧＲＮ遺伝子またはタンパク質変異を有する可能性があり、多くの場合、実際に有することが認識および決定されている。特に蔓延しているＰＧＲＮ遺伝子変異としては、ｒｓ４７９２９３７、ｒｓ８５０７１３、ｒｓ７８４０３８３６、ｒｓ５８４８、ならびに３つの点変異、ｐ．Ｃ３１５Ｓ、ｐ．Ｅ３１６Ｑ、およびｐ．Ｐ３６５Ａが挙げられる。本発明の診断方法およびアッセイは、特に、本発明で提供されるＰＧＲＮ変異のうちの１つまたは複数を査定または決定する場合を含む。ｒｓ４７９２９３７、ｒｓ８５０７１３、ｒｓ７８４０３８３６、ｒｓ５８４８、ならびに３つの点変異、ｐ．Ｃ３１５Ｓ、ｐ．Ｅ３１６Ｑ、およびｐ．Ｐ３６５から選択される１つまたは複数のＰＧＲＮ変異が決定される方法、アッセイおよびキットが提供される。
特定のそのような方法またはキットでは、ｒｓ４７９２９３７、ｒｓ８５０７１３、ｒｓ７８４０３８３６、ｒｓ５８４８から選択される１つまたは複数のＰＧＲＮ変異が決定される。ある態様では、４つのＰＧＲＮ ＳＮＰ部位が以下の例示的なプライマーを含むＴａｇｍａｎ遺伝子型決定法によって決定される：ｒｓ４７９２９３７フォワードプライマー、５’−ＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＡ ＣＣＡＴＣＣＴＴＣ−３’（配列番号１１）、リバースプライマー５’−ＣＴＣＣＣＡＡＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＣＴＡ−３’（配列番号１２）、およびＴａｑｍａｎタグ配列５’−ＴＣＡＧＴＡＧＣＴＣＡＣＡ［Ｔ／Ｃ］ＴＴＧＴＡＡ−３’（配列番号１３）；ｒｓ８５０７１３フォワードプライマー５’−ＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＴＧＧＧＣＴＧＧＴＡ−３’（配列番号１４）、リバースプライマー５’−ＡＧＴＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＡＧ Ｃ−３’（配列番号１５）、およびＴａｑｍａｎタグ配列５’−ＡＧＧＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＡＴＧＧＧＧ［Ａ／Ｇ］ＴＡＴＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＧＴＧＧＧ ＧＧＣＡＧＡＧ−３’（配列番号１６）；ｒｓ７８４０３８３６フォワードプライマー５’−ＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣ−３’（配列番号１７）、リバースプライマー５’−ＧＣＧＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＣＡＴＧＡＡＴ−３’（配列番号１８）、およびＴａｇｍａｎタグ配列５’−ＡＧＧＡＡＧＡＣ［Ｇ／Ｃ］ＴＧＡＴＴＴＴ−３’（配列番号１９）；ｒｓ５８４８フォワードプライマー５’−ＣＣＡＧＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧ−３’（配列番号２０）、リバースプライマー５’−ＣＡＣＡＧＧＧＴＣＣＡＣＴＧＡＡＡＣＧ−３’（配列番号２１）、およびＴａｑｍａｎタグ配列ＴＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣＣＴＣＣＣＴＡＧＣ ＡＣＣＴＣ［Ｃ／Ｔ］ＣＣＣＴＡＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＣＣＣ（配列番号２２）。ある態様では、ｐ．Ｃ３１５Ｓ、ｐ．Ｅ３１６Ｑ、およびｐ．Ｐ３６５Ａの点変異をＰＣＲ、およびフォワードプライマー５’−ＧＧＴＧＧＴＧＴＡＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣＴ−３’（配列番号２３）、リバースプライマー５’−ＡＣＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＧＣ−３’（配列番号２４）によって増幅し、その後、配列決定を行う。
ＰＧＲＮの存在または活性および量を検出することによって動物におけるリソソーム蓄積症を診断または評価するためのキットであって、（ａ）所定量の、検出可能に標識した、ＰＧＲＮの特異的な結合パートナーまたはＰＧＲＮを対象とする抗体と、（ｂ）他の試薬と、（ｃ）前記キットを使用するための指示とを含むキットが本発明で提供される。そのようなキットとしては、動物におけるＰＧＲＮ変異の存在を検出することによって前記動物におけるリソソーム蓄積症を診断または評価するためのキットであって、（ａ）ＰＧＲＮ遺伝子またはコードするＤＮＡに特異的であるまたはそれを対象とする１つまたは複数の核酸プローブまたはプライマーと、（ｂ）他の試薬と、（ｃ）前記キットを使用するための指示とを含むキットが挙げられる。１つまたは複数の核酸プライマーまたはプローブが、ｒｓ４７９２９３７、ｒｓ８５０７１３、ｒｓ７８４０３８３６、ｒｓ５８４８、ならびに３つの点変異、ｐ．Ｃ３１５Ｓ、ｐ．Ｅ３１６Ｑ、およびｐ．Ｐ３６５Ａから選択される１つまたは複数のＰＲＮ変異に特異的であるまたはその検出または決定に適しているキットの態様が提供される。
本発明のキットは、ＧＢＡの検出可能に標識した特異的な結合パートナーもしくはＧＢＡを対象とする抗体またはＧＢＡ遺伝子もしくはコードするＤＮＡに特異的であるかもしくはそれを対象とする１つもしくは複数の核酸プローブもしくはプライマーをさらに含んでよい。
本発明のアッセイ、診断方法またはキットでは、対照量のＰＧＲＮ、ＰＧＲＮペプチド、アトストリン、ＧＢＡ、またはそれに対する抗体などを調製し、酵素、特異的な結合パートナーおよび／または放射性元素を用いて標識することができ、次いで、細胞試料に導入することができる。標識した物質またはその結合パートナー（複数可）を試料内の部位と反応する機会を有した後、生じた集団を、付着させた標識の性質に伴って変動し得る公知の技法によって調査することができる。同位元素３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅなどの放射性標識を使用した例では、公知の現在利用可能な計数手順を利用することができる。標識が酵素である例では、検出は、現在利用されている当技術分野で公知の比色定量技法、分光光度測定技法、蛍光分光光度測定技法、電流測定技法または気体定量技法のいずれかによって達成することができる。
以前に提案された通り、本発明の診断方法は、抗ＰＧＲＮ抗体、好ましくはアフィニティ精製されたポリクローナル抗体、およびより好ましくはｍＡｂなどの、ＰＧＲＮタンパク質またはアトストリンを含めたそのペプチドに対するアンタゴニストの有効量を含むアッセイによって細胞試料または培地を調査することを含む。さらに、本明細書で使用される抗体分子はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦ（ｖ）部分または抗体分子全体の形態であることが好ましい。以前に考察されている通り、この方法から利益を得ることができる患者としては、リソソーム蓄積症またはゴーシェ病に罹患している患者が挙げられる。抗体を単離し、抗ＰＧＲＮ抗体を誘導するための方法、ならびに、標的細胞または臨床試料の調査および評価を補助する抗ＰＧＲＮ抗体の能力を決定し、最適化するための方法は全て当技術分野で周知である。
本発明は、本発明の治療方法の実施において有用な治療用組成物をさらに意図している。主題の治療用組成物は、混和物中に、薬学的に許容される賦形剤（担体）と、活性成分として本明細書に記載のＰＧＲＮ、アトストリンなどのそのポリペプチド類似体またはその断片のうちの１つまたは複数とを含む。
活性成分としてポリペプチド、類似体または活性断片を含有する治療用組成物の調製は当技術分野においてよく理解されている。一般には、そのような組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかで注射剤として調製されるが、注射前に液体中溶液または懸濁物にするのに適した固体の形態も調製することができる。調製物は乳化することもできる。活性な治療用成分は、多くの場合、薬学的に許容され、活性成分と適合する賦形剤と混合する。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびこれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、組成物は、活性成分の効果を増強する湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの微量の補助物質を含有してよい。
ポリペプチド、類似体または活性断片は、中和された薬学的に許容される塩の形態として治療用組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（ポリペプチドまたは抗体分子の遊離のアミノ基と形成される）が挙げられ、これは、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される。遊離のカルボキシル基から形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から得ることもできる。
治療用ＰＧＲＮポリペプチド、アトストリンなどの類似体、または活性断片を含有する組成物は、慣習的に、例えば、単位用量の注射によって静脈内に投与されるが、ＩＭ、ＩＰ、ＩＶ、経口、経皮などを含めた任意の適切な手段によって投与することができる。「単位用量」という用語は、本発明の治療用組成物に関して使用される場合、ヒトに対する単位投与量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の治療効果がもたらされるように算出された所定量の活性な物質を、必要な希釈剤；すなわち、担体またはビヒクルを伴って含有する。
組成物は、投薬製剤と適合する様式で、治療有効量で投与される。投与される量は、治療される被験体、被験体の免疫系の活性成分を利用する能力、および所望のＰＧＲＮ活性またはＰＧＲＮ−ＧＢＡ結合能に左右される。投与に必要な活性成分の正確な量は、実施者の判断に応じ、各個体に対して独特のものになる。しかし、適切な投与量は、１日当たり個体の体重１キログラム当たり約０．００１〜１、０．０１〜１０、０．１〜２０、０．５〜５０、好ましくは約０．５〜約１０、より好ましくは１〜数ミリグラムの活性成分の範囲であり得、また、投与経路に左右される。最初の投与およびその後の投与の適切なレジメンも変動するが、最初の投与の後、１時間またはそれより長い間隔でその後の注射または他の投与により繰り返し投薬を続けることが典型的である。あるいは、血液中１０ナノモル〜１０マイクロモルの濃度を維持するのに十分な継続的な静脈内注入が意図されている。
本発明は、当然、本発明のＰＧＲＮ、ＰＧＲＮペプチドおよび／またはアトストリンを調製するための、本明細書において例示されているものを含み、かつ／または公知の組換え技法を使用するいくつかの手段を意図しており、したがって、本発明は、そのような合成調製物をその範囲内に網羅することが意図されている。本明細書において開示されているアミノ酸配列の決定により、種々の合成方法のいずれかまたは任意の公知の組換え技法によるペプチドの再生が容易になり、したがって、本発明は、組換えＤＮＡ技法によって宿主系において発現させるための、本発明のペプチドをコードする核酸を含む発現ベクター、および得られる形質転換された宿主にまで及ぶ。
本発明は、図４９または５０に示されている１つまたは複数のＰＧＲＮペプチドのアミノ酸またはその改変体をコードする、組換えＤＮＡ分子、組換え核酸、またはクローニングされた遺伝子、またはその縮重改変体、好ましくは核酸分子、特に組換えＤＮＡ分子またはクローニングされた遺伝子にも関する。特定の実施形態では、組換えＤＮＡ分子、組換え核酸、またはその縮重改変体、好ましくは核酸分子は、ＧＢＡに結合すること、リソソーム酵素運搬を促進すること、および／またはβ−ＧｌｃＣｅｒなどのリソソーム基質の蓄積を減少させることができる、図４８に示されており、例えば、配列番号２、３または４〜９で示される配列を含むものを含めた図４８、４９および５０のＰＧＲＮまたはアトストリンなどのＰＧＲＮペプチドの配列で示される、ＰＧＲＮの１つまたは複数のグラニュリン単位と１つまたは複数のリンカー単位とを含む、ＰＧＲＮペプチドをコードする。さらなる特定の実施形態では、組換えＤＮＡ分子、組換え核酸、またはその縮重改変体、好ましくは核酸分子は、ＧＢＡに結合すること、リソソーム酵素運搬を促進すること、および／またはβ−ＧｌｃＣｅｒなどのリソソーム基質の蓄積を減少させることができる、図４９または５０で示され、グラニュリン単位およびリンカー単位１／２Ｆ−Ｐ３−Ｐ４−１／２Ａ−Ｐ５−１／２Ｃを含むＰＧＲＮまたはＰＧＲＮペプチドアトストリンをコードする。
当技術分野で周知の通り、ＤＮＡ配列は、適切な発現ベクター内で発現制御配列に作動可能に連結させ、その発現ベクターを使用して適切な単細胞宿主を形質転換することによって発現させることができる。本発明のＤＮＡ配列と発現制御配列のそのような作動可能な連結は、当然、すでにＤＮＡ配列の一部になっていなければ、開始コドンＡＴＧをＤＮＡ配列の上流の正しい読み枠内にもたらすことを含む。
本発明のＤＮＡ配列の発現には多種多様な宿主／発現ベクターの組み合わせを使用することができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなり得る。適切なベクターとしては、ＳＶ４０の誘導体および公知の細菌プラスミド、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドｃｏｌ Ｅｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ファージλの多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、ならびに他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３および繊維状一本鎖ファージＤＮＡ；２μプラスミドまたはその誘導体などの酵母プラスミド；昆虫または哺乳動物細胞において有用なベクターなどの、真核細胞において有用なベクター；ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列が使用されるように改変されたプラスミドなどの、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクターなどが挙げられる。
本発明のＤＮＡ配列を発現させるために、多種多様な発現制御配列−−作動可能に連結したＤＮＡ配列の発現を制御する配列−−のいずれかをこれらのベクターに使用することができる。そのような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期または後期プロモーター、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマまたはアデノウイルス、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α接合因子のプロモーター、ならびに原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知の他の配列、ならびに、それらの様々な組み合わせが挙げられる。
多種多様な単細胞宿主細胞も本発明のＤＮＡ配列の発現において有用である。これらの宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの株、酵母などの真菌、ならびに、ＣＨＯ、Ｒｌ．ｌ、Ｂ−ＷおよびＬ−Ｍ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、およびＢＭＴ１０）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、およびヒト細胞などの動物細胞、ならびに組織培養物中の植物細胞などの周知の真核生物宿主および原核生物宿主を挙げることができる。
当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく所望の発現を達成するために、過度な実験を伴わずに適切なベクター、発現制御配列、および宿主を選択することができる。
合成ＤＮＡ配列により、ＰＧＲＮまたはアトストリン類似体または「変異タンパク質」を発現する遺伝子の都合のよい構築が可能になる。あるいは、変異タンパク質をコードするＤＮＡを、ネイティブなＰＧＲＮ遺伝子またはｃＤＮＡの部位特異的変異誘発によって作出することができ、従来のポリペプチド合成を使用して変異タンパク質を直接作出することができる。
本発明のアッセイおよび診断用キットでは、標識を使用することができる。これらの研究に最も一般的に使用される標識は、放射性元素、酵素、紫外線に曝露すると蛍光を発する化学物質、およびその他である。いくつかの蛍光物質が公知であり、標識として利用することができる。これらとしては、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＡＭＣＡ ｂｌｕｅおよびルシファーイエローが挙げられる。特定の検出用物質は、ヤギにおいて調製し、イソチオシアネートを通じてフルオレセインと結合体化させた抗ウサギ抗体である。ＰＧＲＮまたはその結合パートナー（複数可）は、放射性元素または酵素で標識することもできる。放射性標識は、現在利用可能な計数手順のいずれかによって検出することができる。好ましい同位元素は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅから選択することができる。酵素標識は同様に有用であり、現在利用されている比色定量技法、分光光度測定技法、蛍光分光光度測定技法、電流測定技法または気体定量技法のいずれかによって検出することができる。酵素は、選択された粒子と、例えばカルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの架橋分子を用いた反応によって結合体化する。これらの手順において使用することができる多くの酵素が公知であり、利用することができる。ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが好ましい。
ゴーシェ病を含めたリソソーム蓄積症の動物モデル、特に臨床状態を再現するモデルの生成は難しいことが証明されている（Ｆａｒｆｅｌ−Ｂｅｃｋｅｒ Ｔら（２０１１年）Ｄｉｓ Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ ４巻（６号）：７４６〜７５２頁）。ＧＤに関しては、動物における多くのＧＢＡノックアウトおよびヌル変異により、致死または初期の死亡が導かれている（Ｓｕｎ Ｙら（２００５年）Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４６巻：２１０２〜２１１３頁）。ＧＤの種々の共通する形態に関連するＬ４４９Ｐ、Ｎ３７０Ｓ、Ｖ３９４Ｌ、Ｄ４０９ＨおよびＤ４０９Ｖ点変異を含めた公知のＧＢＡ変異に基づいた動物モデル、ならびに、例えばＧｌｃＣｅｒａｓｅ阻害剤の投与を伴う化学的に誘導されたモデルが生成されている（Ｆａｒｆｅｌ−Ｂｅｃｋｅｒ Ｔら（２０１１年）Ｄｉｓ Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ ４巻（６号）：７４６〜７５２頁）。
テイ・サックス病はジャコブヒツジ（Ｊａｃｏｂ Ｓｈｅｅｐ）において天然に存在し、ジャコブヒツジにおける疾患に関する生化学的機構はヒトにおける生化学的機構と事実上同一である（Ｔｏｒｒｅｓ ＰＡら（２０１０年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １０１巻（４号）：３５７〜３６３頁）。ジャコブヒツジでは、罹患した動物ヒツジにおいて、ヘキソサミニダーゼＡの活性の減弱によりＧＭ２ガングリオシドの濃度の上昇がもたらされることが示されている（Ｐｏｒｔｅｒ ＢＦら（２０１１年）Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４８巻（３号）：８０７〜８１３頁）。ヒツジＨｅｘＡ遺伝子は、ヒトＨｅｘＡ遺伝子とヌクレオチドの数が同一であり、８６％のヌクレオチド同一性を有する。罹患したヒツジのＨＥＸＡ ｃＤＮＡにおいてミスセンス変異（Ｇ４４４Ｒ）が見いだされ、これにより、エクソン１１の最後に単一ヌクレオチド変化が生じ、その結果、そのエクソンがスプライシングにより欠失する（翻訳前）（Ｋｏｌｏｄｎｙ Ｅ、Ｈｏｒａｋ Ｆ、Ｈｏｒａｋ Ｊ（２０１１年）ＡＬＢＣ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ（Ｐｉｔｔｓｂｏｒｏ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡ： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ Ｂｒｅｅｄｓ Ｃｏｎｓｅｒｖａｎｃｙ）。ジャコブヒツジは利用可能なテイ・サックス病の動物モデルをもたらすが、ヒツジはより小さな動物またはマウスもしくはラットなどの確立された組換え方法プロトコールを用いたものと同じようには容易に操作も飼育もできない。したがって、マウスにおけるテイ・サックスの代替モデルなどが非常に有益になる。
本発明は、ゴーシェ病を含めたリソソーム蓄積症の新しい新規の動物モデルを提供する。ＰＧＲＮが変更されたまたはＰＧＲＮノックアウト／ヌル（ＫＯ）動物では、臨床的なゴーシェ病と同様のリソソーム蓄積症が発生する。動物において、ＧＢＡ基質であるβ−ＧｌｃＣｅｒがリソソーム内に蓄積し、肝脾腫大が発生し、これはゴーシェ病の文書により十分に立証された症状であり、また、ゴーシェ細胞が組織学的に認められ得る。ＰＧＲＮ ＫＯまたはヌル変異体動物を、オボアルブミンまたは他の薬剤（複数可）を用いて処置して、ＧＤおよびリソソーム蓄積症表現型を有し、かつ疾患を模倣する慢性炎症モデルを生成することができる。したがって、本発明のある態様では、ＧＤおよび／または他のリソソーム蓄積症の動物モデルが提供される。本発明の例示的な動物モデルは、ＰＧＲＮのノックアウトまたはヌル変異、発現の変更または条件的なＰＧＲＮ変異体、ｒｓ４７９２９３７、ｒｓ８５０７１３、ｒｓ７８４０３８３６、ｒｓ５８４８、ならびに３つの点変異、ｐ．Ｃ３１５Ｓ、ｐ．Ｅ３１６Ｑ、およびｐ．Ｐ３６５Ａに基づくものであり得る。１つまたは複数のＰＧＲＮの変更または変異を、１つもしくは複数のＧＢＡの変異もしくは変更と、または、例えば、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ（ｓｐｈｉｎｇｏｍｅｙｅｌｉｎａｓｅ）のうちの１つもしくは複数を含めた別のリソソーム酵素の変異と組み合わせて、ＧＤまたは他のリソソーム蓄積症の動物モデルを生成することができる。
本発明は、特に変更されたＰＧＲＮを有する動物またはＰＧＲＮノックアウト／ヌル動物がリソソーム蓄積症の生理的または分子態様を示す、テイ・サックス病を含めた他のリソソーム蓄積症の動物モデルも提供する。例えば、本明細書において提示される実施例では、ＰＧＲＮ ＫＯマウスを用いてテイ・サックス病の特質であるＨｅｘＡおよびＧＭ２ガングリオシドの変更が実証される。変更されたＰＧＲＮを有する動物もしくはＰＧＲＮノックアウト／ヌル動物単独により、またはＨｅｘＡ遺伝子変異もしくはＨｅｘＡ変異体と組み合わせて、新規の代替テイ・サックス病モデルがもたらされる。
本発明は、本発明の例示として提供される以下の非限定的な実施例を参照することによってよりよく理解することができる。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより詳細に例示するために提示されるが、決して広範囲の本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
（実施例１）
プログラニュリンはβ−グルコセレブロシダーゼのリソソーム送達に必要であり、その欠損は、ゴーシェ病を引き起こす
スフィンゴ糖脂質代謝は、多数の酵素によって媒介されるプロセスである。代謝酵素の不全は、その対応する基質のリソソームにおける蓄積を引き起こす。リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）に関与するスフィンゴ糖脂質代謝に関する経路が図１に示されている。最も一般的なＬＳＤであるゴーシェ病は、図１に示されている通り、β−グルコシルセラミドをセラミドに代謝するグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）の変異によって引き起こされる。ＧＢＡの変異は、ＧＢＡ基質であるβ−グルコシルセラミド（β−ＧｌｃＣｅｒ）のマクロファージにおける蓄積を導く。
最も一般的なリソソーム蓄積症であるゴーシェ病（ＧＤ）は、一般には、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）の遺伝的欠損によって引き起こされる。本明細書において、本発明者らは、予想外に、独特の構造および多数の機能を有する増殖因子であるプログラニュリン（ＰＧＲＮ）の欠損もゴーシェ様疾患を引き起こすことを報告する。オボアルブミンによる攻撃を受けたＰＧＲＮ欠損マウスおよび高齢のＰＧＲＮ欠損マウスのどちらもＧＤの徴候を示し、関連する組織に「ゴーシェ細胞」、すなわち、グルコシルセラミドの蓄積によって生じる特徴的な「しわくちゃの紙」細胞質の外見を示すマクロファージが浸潤する。組換えＰＧＲＮは、ＰＧＲＮ欠損マクロファージにおけるグルコシルセラミドクリアランスを促進し、ＰＧＲＮ欠損マウスにおけるＧＤの発生を予防する。ＰＧＲＮは直接ＧＢＡに結合し、ＧＢＡをリソソームに送達するために必要とされる。不偏質量分析手法により、進化的に保存された分子シャペロンである熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）が、不可欠なアダプターとしてＰＧＲＮを通じたＧＢＡの輸送を媒介するＧＢＡ関連タンパク質として同定される。まとめると、これらの知見により、ＰＧＲＮがＨＳＰ７０媒介性フォールディングおよび輸送経路の新規のコシャペロンであること、およびＧＢＡのリソソーム送達において不可欠な役割を果たすことが実証されるだけでなく、種々のＨＳＰ７０媒介性病態およびＧＤを含めたリソソーム蓄積症に対する治療介入の指針となる新しいパラダイムももたらされる。
最も一般的なリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）であるゴーシェ病（ＧＤ）は、マクロファージおよび他の細胞型におけるグルコシルセラミド（β−ＧｌｃＣｅｒ）の蓄積を導くグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）変異によって引き起こされる１、２。β−ＧｌｃＣｅｒの貯蔵により、リソソームが電子顕微鏡検査によって観察される管様構造に転換し、脂質がうっ積したマクロファージ（ゴーシェ細胞）が光学顕微鏡検査の下で特徴的な「しわくちゃのティッシュペーパー」の外見を示す。ＧＤには、その神経性合併症に基づいて３つの型が存在する（Ｉ型は非神経障害性であり、ＩＩ型は急性神経障害性であり、ＩＩＩ型は軽度の慢性神経障害性である）。神経系外の特徴としては、これらの器官へのゴーシェ細胞の浸潤の結果として肝脾腫大、汎血球減少、および骨粗鬆症が挙げられる３。
プログラニュリン（ＰＧＲＮ）は、グラニュリンエピセリン前駆体（ＧＥＰ）、ＰＣ細胞由来増殖因子（ＰＣＤＧＦ）、プロエピセリン、およびアクログラニンとしても公知であり、システインリッチモチーフ（ＣＸ５〜６ＣＸ５ＣＣＸ８ＣＣＸ６ＣＣＸＤＸ２ＨＣＣＰＸ４ＣＸ５〜６Ｃ）（配列番号１）の７つ半の繰り返しを含有し、独特の「数珠状（ｂｅａｄｓ−ｏｎ−ａ−ｓｔｒｉｎｇ）」構造を形成する４。ＰＧＲＮは、上皮細胞、免疫系の細胞、およびニューロンにおいて大量に発現される５。ＰＧＲＮは、初期胚形成、創傷治癒６、７、および宿主防御８を含めた種々の生理的および疾患プロセスにおいて決定的な役割を果たすことが公知である。ＰＧＲＮは、神経栄養因子としても機能し、ＰＧＲＮタンパク質の部分的なまたは完全な喪失をもたらすＰＧＲＮ遺伝子（ＧＲＮ）の変異は、それぞれ前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）９、１０および神経セロイドリポフスチノーシス（ＮＣＬ）１１、１２を引き起こす。
ＰＧＲＮは、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２およびＤＲ３１３〜１６を含めたＴＮＦ受容体スーパーファミリーのいくつかのメンバーと会合し、様々な種類の状態における炎症を抑制する能力を有する７、１３。関節リウマチ、乾癬性関節炎、および炎症性腸疾患を含めたいくつかの自己免疫疾患においてＰＧＲＮに対する自己抗体が見いだされ、そのような抗体は、患者の亜群において炎症促進性の環境を促進した１７、１８。ＰＧＲＮが慢性肺炎症においても役割を果たすかどうかを決定するための取り組みにおいて、ＰＧＲＮ欠損マウスをオボアルブミン（ＯＶＡ）で攻撃し、それにより、ＰＧＲＮが不可欠なＧＢＡ関連因子であるという予期しない発見が導かれた。ここで、本発明者らは、ＰＧＲＮが、ＧＢＡ／ＬＩＭＰ２複合体を、多数のタンパク質のフォールディングおよび輸送を媒介する１９進化的に高度に保存された分子シャペロンである熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）と連結することを通じたＧＢＡのリソソーム送達のために必須のコシャペロンであることを報告する。
ＯＶＡによる攻撃を受けたマウスモデルおよび「高齢」マウスモデルのどちらにおいてもＰＧＲＮ欠損はゴーシェ様疾患を引き起こす
炎症性関節炎を含めた種々の状態においてＰＧＲＮが重要な抗炎症および免疫調節の役割を果たすという知見１３に促され、慢性肺炎症におけるＰＧＲＮの関与を調査した。この目的のために、８週齢のＷＴおよびＰＧＲＮノックアウト（ＫＯ）マウスにおいて、１日目および１５日目にＯＶＡを腹腔内（ＩＰ）注射し、その後、２９日目から開始して１週間に３回、４週間にわたって１％ＯＶＡの鼻腔内攻撃により、慢性肺炎症を誘導した。驚くべきであり、かつ注目すべきことに、ＰＧＲＮ ＫＯマウスの肺において、特にＯＶＡ処置後に多数の「巨細胞」が見いだされた（図２Ａ）。これらの細胞には、ゴーシェ細胞の典型的な形態である「しわくちゃのティッシュペーパー」の外見を伴う物質がうっ積していた。ＷＴマウスでは、ＯＶＡによる攻撃を受けていても受けていなくてもそのような細胞は見いだされなかった。攻撃を受けていないＰＧＲＮ ＫＯマウスではわずかなゴーシェ様細胞が同定され、ＯＶＡ攻撃後には数が有意に増加した（図２Ａ、２Ｂ）。過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色により、ＰＧＲＮ ＫＯマウスにおけるゴーシェ様細胞内の糖脂質物質の蓄積が示された（図２Ｃ）。気管支肺胞洗浄液のフローサイトメトリー分析により、ＰＧＲＮ ＫＯマウスにおいてＯＶＡ処置後に巨大なマクロファージの亜集団が同定され、これは、前方散乱光（ＦＳＣ）の値が細胞サイズに比例するので、ＣＤ１１ｂ＋ＦＳＣｈｉｇｈによって証明される（図２Ｄ）。
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって調査したところ、ＰＧＲＮヌルマクロファージはゴーシェ様細胞の古典的な管様リソソームの外見を示した。ＰＧＲＮ ＫＯマウス由来のマクロファージはＷＴマウスにおけるものよりもはるかに大きく、ＰＧＲＮヌルリソソームは通常の円形ではなく管様になった（図３、図１８Ａ）。リソソームの通常の円形から管様構造への転換は物質の蓄積と共に見いだされた（図１８Ｂ）。ミトコンドリアおよび小胞体などの他の細胞小器官、ならびに他の細胞型、１型および２型肺胞細胞は正常に見えた（図１９Ａ、１９Ｂ）。
ＧＤは、β−ＧｌｃＣｅｒの蓄積を導くＧＢＡ酵素活性の低下によって引き起こされる２０。ＯＶＡによる攻撃を受けたまたは受けていないＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来の肺溶解物の脂質組成を以前に報告した通り分析した２１。図４に示されている通り、ＰＢＳによる攻撃を受けたものに対してＯＶＡによる攻撃を受けたＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスのどちらにおいても、全ての鎖長種で、β−ＧｌｃＣｅｒの増加が示された。さらに、ＯＶＡ攻撃後に、β−ＧｌｃＣｅｒの全ての種がＷＴマウスに対してＰＧＲＮ ＫＯでは有意に高かった（図４）。無処置のＰＧＲＮ ＫＯマウスでも、ＷＴマウスよりもβ−ＧｌｃＣｅｒのレベルが高かった。ＰＧＲＮ ＫＯマウスにおけるβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積は、スフィンゴミエリン、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、およびセラミドなどの他の脂質組成はＷＴマウスとＰＧＲＮ ＫＯマウスの間で変化しないままであったので、特異的なものであった（図２０Ａ〜２０Ｃ）。興味深いことに、ベータ−グルコシルスフィンゴシンの血漿中レベルはＰＧＲＮ欠損マウスにおいて有意に上昇することが見いだされたが、β−ＧｌｃＣｅｒの血漿中レベルには有意な増加は観察されなかった（図２１Ａ〜２１Ｄおよび図２２Ａ〜２２Ｃ）。
ＧＢＡはマンノース−６−リン酸受容体（ＭＰＲ）系には非依存的にリソソームに運搬されるが２２、２３、ゴーシェ病に対する酵素補充療法（ＥＲＴ）において使用するための、マクロファージを標的とする、マンノース末端化したヒトＧＢＡであるイミグルセラーゼはＭＰＲ依存性経路を介してリソソームに送達される。ＰＧＲＮ ＫＯマウスを、ＯＶＡを用いて攻撃し、鼻腔内攻撃の最初の週の開始時から実験の終了時までＰＢＳまたはイミグルセラーゼ注射（６０ｕ／ｋｇ／週）を用いて処置した２４。ＯＶＡ攻撃の後、多くのゴーシェ様細胞が存在しており、肺胞空間全体のほとんどを占めていた（図５Ａ、中央のパネル）。イミグルセラーゼ注射により、ゴーシェ様細胞におけるＰＡＳ陽性物質のサイズおよび蓄積（図５Ａ、下のパネル）ならびにβ−ＧｌｃＣｅｒの貯蔵（図５Ｂ）が有意に減少した。ゴーシェ様細胞の数は同等であったが、細胞質と核のサイズの比はイミグルセラーゼを用いると有意に低下し（図５Ｃ）、これにより、ゴーシェ様細胞のサイズがイミグルセラーゼ処置後に小さくなったことが示される。ＯＶＡ攻撃によって誘導されるＰＧＲＮ ＫＯマウスの腫脹した肝臓および脾臓のサイズもイミグルセラーゼ処置後に有意に減少した（図５Ｄ）。ＯＶＡを用いた攻撃を受けたＰＧＲＮヌルマウスにおける一般的な身体活動はイミグルセラーゼ処置によって改善された。ＯＶＡを用いた攻撃を受けたＰＧＲＮ ＫＯマウスでは、肺機能が損なわれたことが原因で身体活動が低下した。そのようなマウスは加減が悪く、鉗子で触れるまで動きたがらなかった（データは示していない）。イミグルセラーゼ療法を受けた、ＯＶＡによる攻撃を受けたＰＧＲＮ ＫＯマウスは正常になり活動的になった（データは示していない）。まとめると、これらのデータおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスのイミグルセラーゼに対する応答により、ＯＶＡによる攻撃を受けたＰＧＲＮ欠損マウスでゴーシェ病表現型が発生したことが確認された。
ＰＧＲＮ ＫＯマウスはＯＶＡ攻撃の不在下であっても肺ゴーシェ様細胞を示したので、次に、高齢のＰＧＲＮ欠損マウスでゴーシェ様疾患が自然発生するかどうかを決定しようとした。ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスを１年に至るまで維持し、次いで、いかなる攻撃も受けていない１歳のＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスを屠殺した。肺、脾臓、肝臓、大腿骨、および脊椎を組織学的検査およびマイクロＣＴ分析のために採取した。ＧＤ患者と同様に、高齢のＰＧＲＮ ＫＯマウスにおいてゴーシェ病の最も一般的な症状である肝脾腫大が発生した（図６Ａ）。組織学的に、高齢のＰＧＲＮ ＫＯマウスの肺、脾臓、および骨髄においてゴーシェ様細胞が見いだされたが、年齢を釣り合わせたＷＴマウスでは見いだされなかった（図６Ｂ）。骨髄のＰＡＳ染色により、ＰＧＲＮヌルゴーシェ様細胞における糖脂質の貯蔵が示された（図６Ｃ）。組織および血漿におけるβ−ＧｌｃＣｅｒレベルはＰＧＲＮ欠損マウスの老化とともに上昇した（図２３Ａ〜２３Ｃ）。一部の高齢のＰＧＲＮ ＫＯマウスでは骨髄が脂肪組織で置き換えられた（図７Ａ）。ＴＥＭの下で調査したところ、ＰＧＲＮ ＫＯの肺および骨髄由来のＰＧＲＮ−ヌルゴーシェ様細胞において管様リソソームが観察された（図７Ｂ）。さらに、高齢のＰＧＲＮ欠損マウスは、長骨（図２４Ａ〜２４Ｈ）および椎骨（図２５Ａ〜２５Ｃ）において骨減少症の特徴を示し、これも文書により十分に立証されたゴーシェ病の症状である。結論として、高齢のＰＧＲＮ欠損マウスではゴーシェ様疾患表現型が自然発生した。
組換えＰＧＲＮは、ＰＧＲＮヌルマクロファージにおけるβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積およびＰＧＲＮ欠損マウスにおけるＧＤの発生を予防する
組換えＰＧＲＮ（ｒＰＧＲＮ）が、ＰＧＲＮ ＫＯ動物において見られるＧＤ様表現型をレスキューすることができるかどうかを評価するために、まず、ＧＤにおけるマクロファージへのβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積を模倣するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養モデルを開発した。以前に記載されている通りＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスから骨髄由来のマクロファージ（ＢＭＤＭ）を単離し、分化させた２５。ＢＭＤＭ細胞を、多くの型の脂質を含有する５および５０μｇ／ｍｌの脳溶解物を用いて１０日間処理した。Ｈ＆Ｅ染色により、巨大なマクロファージがＰＧＲＮ ＫＯ ＢＭＤＭには存在しているが、ＷＴ ＢＭＤＭには存在していないことが示された（図２６）。免疫蛍光染色により、脂質混合物による処理後にβ−ＧｌｃＣｅｒがＰＧＲＮ ＫＯ ＢＭＤＭに用量依存的に蓄積したことが明らかになった。しかし、ＷＴマウス由来のＢＭＤＭはβ−ＧｌｃＣｅｒのレベルの上昇を示さなかった（図８Ａ）。
エンドサイトーシスによって有効に取り込まれ、リソソームに送達されたｒＰＧＲＮ２６（図２９および図３０）が、ＰＧＲＮ ＫＯ ＢＭＤＭにおけるβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積を予防することができるかどうかを試験するために、０．１および０．４μｇ／ｍｌのＰＧＲＮタンパク質を脂質混合物（５０μｇ／ｍｌ）を伴う培養培地に１０日間添加し、β−ＧｌｃＣｅｒの蓄積を免疫蛍光染色によって測定した。光学顕微鏡の下で、脂質曝露後のＢＭＤＭは拡大したように見え、高度に屈折性の細胞質斑点を伴って組織が壊され、この形態学的変化はＰＧＲＮによって用量依存的に補正された（図２７）。脂質処理に伴ってβ−ＧｌｃＣｅｒが蓄積し、この蓄積はｒＰＧＲＮおよびイミグルセラーゼ（陽性対照としての機能を果たす）を添加することによって有効に遮断された（図８Ｂおよび８Ｃ）。さらに、ＥＲＫ、ＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲを含めた公知のＰＧＲＮのシグナル経路の遮断は、β−ＧｌｃＣｅｒクリアランスに対するｒＰＧＲＮの効果に影響を及ぼさず（図３０）、組換えＰＧＲＮによるβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積の予防は主にエンドサイトーシスによる取り込みによって媒介され、細胞質ゾルのシグナル伝達経路を活性化することにより媒介されるのではないことが示される。
組換えＰＧＲＮがＰＧＲＮ ＫＯ ＢＭＤＭにおけるＧＢＡの凝集およびβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積を予防するという知見を、ＧＤ患者由来の線維芽細胞を用いてさらに確認した。簡単に述べると、ＩＩ型ＧＤ患者由来の線維芽細胞を、０．４μｇ／ｍｌのｒＰＧＲＮを伴ってまたは伴わずに５０μｇ／ｍｌの脂質混合物を用いて処理した。脂質処理後、β−ＧｌｃＣｅｒの蓄積に伴ってＧＢＡが核の周囲に凝集し、これらの表現型は全て、ｒＰＧＲＮを添加することによって著しく阻害された（図９）。
次に、ｒＰＧＲＮが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてもＧＤ表現型をレスキューすることができるかどうかを調査した。ＯＶＡを用いた攻撃を受けたＰＧＲＮ ＫＯマウスに、ＰＢＳまたはｒＰＧＲＮ（１週間当たり４ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを、鼻腔内攻撃を開始した最初の週から実験の終了時までＩ．Ｐ．注射した。肺組織の組織学的検査により、ＰＧＲＮ ＫＯマウスにおいてＯＶＡ攻撃によって誘導されたゴーシェ様細胞の浸潤、およびｒＰＧＲＮが当該表現型を劇的に逆転することが示された（図１０Ａ）。ゴーシェ様細胞の数に対する有意な効果は伴わず、サイズを減少させたイミグルセラーゼ処理とは異なり（図５Ｃ、５Ｄ）、ｒＰＧＲＮは、ゴーシェ様細胞の数とサイズの両方を有意に減少させ（図１０Ｂ、１０Ｃ）、これにより、ＰＧＲＮがゴーシェ様細胞の形成とβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積の両方を阻害することが示される。
ＧＢＡおよびその運搬受容体ＬＩＭＰ２は細胞質内に凝集し、ＰＧＲＮ欠損マクロファージのリソソームには存在しない
次に、ＧＢＡ活性および発現を評価することによって、ＰＧＲＮ−ヌルで誘導されるＧＤ様表現型の基礎をなす機構を決定しようとした。ＧＤにおけるβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積は、ＧＢＡ酵素活性の低下またはＧＢＡタンパク質の発現の減少によって引き起こされる２０。驚いたことに、ＰＧＲＮ ＫＯマウスにおいてＧＢＡ酵素活性とタンパク質の発現はどちらも正常であり、実際にはＰＧＲＮ ＫＯマウスにおけるＧＢＡ発現はＯＶＡ攻撃後にわずかに増加した（図１１Ａ、１１Ｂ）。ＧＢＡのタンパク質レベルおよび活性は低下しなかったが、ＧＢＡの免疫組織化学的染色により、ＧＢＡ細胞分布が劇的に変更されたことが明らかになった。ＷＴマウスではＧＢＡはマクロファージの細胞質に分布していたが、ＰＧＲＮ ＫＯマウスではＧＢＡ発現は細胞質内に凝集した（図１１Ｃ）。対照的に、ＰＧＲＮ欠損細胞において、マンノース−６−リン酸受容体依存性経路によって主にリソソームに送達される２７リソソーム酵素であるアルファ−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）の細胞分布は影響を受けなかった（図１１Ｃ）。肺組織の凍結切片を用いた共焦点染色により、ＰＧＲＮ欠損組織においてβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積に伴ってＧＢＡが凝集することが確認された（図１２Ａ）。免疫金標識ＴＥＭによっても、ＰＧＲＮヌルマクロファージではゴーシェ様細胞の細胞質にＧＢＡが凝集し、管様リソソームにはＧＢＡが存在しないが、ＷＴマクロファージではリソソームにおいてＧＢＡが検出可能であることが実証された（図１２Ｂ）。免疫金標識ＴＥＭの対照として、ソーティリンは、ＰＧＲＮ ＫＯマウスにおいて、主にエンドサイトーシスを媒介する細胞膜の近くにクラスター化し、ゴーシェ細胞の管様リソソーム内に存在することが見いだされた（図２８）。ＰＧＲＮ ＫＯマクロファージにおけるＧＢＡのリソソームでの出現の欠陥をさらに可視化するために、自発的に膜を横切ることができ、生細胞における活性なリソソームＧＢＡの感度が高く特異的な標識を可能にする２８〜３０、活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）ＭＤＷ９３３を使用した。このプローブではＰＧＲＮ欠損ＢＭＤＭにおけるＧＢＡを検出することができなかったが、ＷＴ ＢＭＤＭにおけるリソソームＧＢＡは効率的に標識された（図１２Ｃ、図３０）。さらに、組換えＰＧＲＮは、ＰＧＲＮ欠損マクロファージにおけるＧＢＡのリソソームでの出現をレスキューした（図３０）。総合すると、これらの結果により、ＧＢＡのリソソームへの送達がＰＧＲＮの存在に依存することが実証される。
リソソームのマーカーであるリソソーム内在性膜タンパク質２（ＬＩＭＰ２）は、ＧＢＡのリソソームへの送達を媒介するＧＢＡ結合性受容体として機能することが報告された３１、３２。興味深いことに、本発明者らは、ＰＧＲＮ欠損マクロファージではＬＩＭＰ２のリソソーム送達にも欠陥があることを見いだした（図１３Ａ、１３Ｂ）。しかし、ＰＧＲＮヌルマクロファージにおいて、別のリソソームのマーカーであるリソソーム関連膜タンパク質−２（ＬＡＭＰ−２）の細胞分布は影響を受けなかった。詳細には、ＬＩＭＰ２とＬＡＭＰ２はどちらもＷＴマクロファージの細胞質内に分布していたが、ＬＩＭＰ２の発現はＰＧＲＮヌルマクロファージの細胞質内に凝集し、ＬＡＭＰ２はＰＧＲＮ ＫＯマクロファージ内に分布した（図１３Ａ）。ＬＩＭＰ２の凝集は免疫金ＴＥＭ染色を用いてさらに確認された（図１３Ｂ）。さらに、ＰＧＲＮ ＫＯマクロファージではＧＢＡとＬＩＭＰ２の両方が凝集体内に共局在化し（図１３Ｃ）、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてなお互いに結合していた（図１３Ｄ）。まとめると、ＰＧＲＮ欠損マウスでは、ＧＢＡとその受容体であるＬＩＭＰ２の両方のリソソーム送達に欠陥があった。ＬＩＭＰ２欠損によりＧＢＡの分泌が増加することが報告されているが３１、野生型細胞とＰＧＲＮ欠損細胞の間でＧＢＡ分泌における有意差は観察されなかったが、ＰＧＲＮ欠失によっても、ＬＩＭＰ２欠損３１と同様に、リソソームにおけるＧＢＡの不在が導かれた。
ＰＧＲＮは、ＧＢＡ／ＬＩＭＰ２のリソソームへの送達を媒介するＨＳＰ７０シャペロン経路の必須のコシャペロンである
ＧＢＡをリソソームにターゲティングするためにはＰＧＲＮが必要であるという知見に促され、ＰＧＲＮがＧＢＡと会合するかどうかを決定した。ＧＢＡ抗体を使用してタンパク質複合体を免疫沈降させ、ＰＧＲＮ抗体を用いてプローブすることによる免疫共沈降により、ＰＧＲＮとＧＢＡのｉｎ ｖｉｖｏにおける相互作用が実証された（図１４Ａ）。次に、組換えＰＧＲＮおよびＧＢＡを用いた固相結合アッセイを使用して、ＰＧＲＮがＧＢＡに直接結合するかどうかを決定した。ＰＧＲＮの液相ＧＢＡに対する用量依存的な結合および飽和が実証されたが（図１４Ｂ）、ＰＧＲＮとＬＩＭＰ２との間の直接相互作用は検出されなかった（図１４Ｂ）。次いで、ＰＧＲＮとＧＢＡとの間の結合親和性を、記載の通り１３、１４ＳｅｎｓｉＱ Ｐｉｏｎｅｅｒを用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して測定した。結果により、ＰＧＲＮが、公知のＰＧＲＮ結合性リソソーム受容体である２６ソーティリンに対するＰＧＲＮの親和性（ＫＤ＝３．６７ｎＭ）（示されていない）よりも高い、非常に高い親和性（ＫＤ＝０．７１ｎＭ）でＧＢＡに結合する（図１４Ｃ）ことが実証された。
４色免疫蛍光染色により、ＧＢＡおよびＰＧＲＮが小胞体（ＥＲ）、ゴルジ、およびトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）を含めたマクロファージの細胞内輸送区画内に共局在化することが明らかになった（図３１）。ＧＢＡ／ＰＧＲＮは、異なるｐＨの細胞内区画をＥＲからリソソームまでの経路で通過する３１。一連のｐＨ値にわたるＧＢＡとＰＧＲＮの直接結合親和性も、ＳｅｎｓｉＱ Ｐｉｏｎｅｅｒを使用して試験した（図３２Ａ）。ＧＢＡとＬＩＭＰ２との間の相互作用３１と同様に、ＧＢＡとＰＧＲＮの結合は中性ｐＨで有利であり、ｐＨの低下に伴って親和性が低下する傾向があった（図３２Ｂ）。総合すると、これらの結果により、ＧＢＡとＰＧＲＮのとの会合の可能性のある点はリソソームより前であり、おそらく、ＥＲおよびゴルジ装置ほどの初期の区画で始まることが示唆された。
次に、ＰＧＲＮがＧＢＡを調節する分子経路を決定しようとした。ＧＢＡのＰＧＲＮによる調節に関与する分子を単離するために、ＷＴ組織およびＰＧＲＮ ＫＯ組織の両方からのＧＢＡ抗体を用いて免疫沈降を実施し、その後、高感度質量分析（ＭＳ）を行った。ＧＢＡ抗体を用いた免疫沈降により、ＷＴ組織ではＰＧＲＮ依存性ＧＢＡ関連タンパク質とＰＧＲＮ非依存性ＧＢＡ関連タンパク質の両方がプルダウンされた。ＰＧＲＮ ＫＯ組織において同じ免疫沈降実験を実施したところ、ＰＧＲＮ非依存性ＧＢＡ関連タンパク質のみが免疫沈降した。ＰＧＲＮ媒介性ＧＢＡ送達に関与する分子はＷＴマウスにおいてのみ存在し、ＰＧＲＮ ＫＯマウスにおいては存在しないヒットの中にあるという理論的根拠を用いて、ＷＴマウスからのヒットからＰＧＲＮ ＫＯからのヒットを引いて、ＰＧＲＮ依存性ＧＢＡ関連タンパク質を得た（図１５Ａ）。ＷＴマウスにおける１３４ヒットおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスにおける１１４ヒットを同定した。それらのうち９５が両群に共通するものであり、３９種のタンパク質がＷＴマウスに特異的であることが見いだされ、これらのタンパク質がＰＧＲＮ依存性ＧＢＡ関連タンパク質であることが示唆される（図１５Ｂ）。３９ヒットの中で２つの公知のＰＧＲＮ結合性タンパク質７、３３であるパールカンおよび白血球エラスターゼ阻害剤が同定され、当該技法が検証された。さらに、ＨＳＰ７０およびそのコシャペロンタンパク質であるＴＣＰ１、ならびに細胞骨格、小胞輸送関連タンパク質、およびエネルギー産生酵素が３９ヒットの中に存在した。
表３
ＰＧＲＮ依存性ＧＢＡ関連タンパク質であり得る遺伝子
パールカン（ヘパラン硫酸プロテオグリカン２） ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｈｓｐｇ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１−［Ｂ１Ｂ０Ｃ７＿ＭＯＵＳＥ］＊１
モエシン ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｍｓｎ ＰＥ＝１ ＳＶ＝３−［ＭＯＥＳ＿ＭＯＵＳＥ］
Ｔ−複合体タンパク質１サブユニットゼータ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｃｃｔ６ａ ＰＥ＝１ ＳＶ＝３−［ＴＣＰＺ＿ＭＯＵＳＥ］＊２
熱ショック７０ｋＤａタンパク質１２Ｂ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｈｓｐａ１２ｂ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１−［ＨＳ１２Ｂ＿ＭＯＵＳＥ］＊２
特徴付けられていないタンパク質 ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｇｍ８９９１ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１−［Ｅ９Ｑ７Ｈ５＿ＭＯＵＳＥ］
ＥＨドメイン含有タンパク質４ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｅｈｄ４ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１−［ＥＨＤ４＿ＭＯＵＳＥ］
ポリマー免疫グロブリン受容体 ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｐｉｇｒ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１−［ＰＩＧＲ＿ＭＯＵＳＥ］
白血球エラスターゼ阻害剤Ａ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｓｅｒｐｉｎｂ１ａ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１−［ＩＬＥＵＡ＿ＭＯＵＳＥ］＊１
特徴付けられていないタンパク質（断片） ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｆｕｓ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１−［Ｇ３ＵＸＴ７＿ＭＯＵＳＥ］
アルファ−１−抗トリプシン１−２ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｓｅｒｐｉｎａ１ｂ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２−［Ａ１ＡＴ２＿ＭＯＵＳＥ］
タンパク質Ｓ１００−Ａ９ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｓ１００ａ９ ＰＥ＝１ ＳＶ＝３−［Ｓ１０Ａ９＿ＭＯＵＳＥ］
ビンキュリン ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｖｃｌ ＰＥ＝１ ＳＶ＝４−［ＶＩＮＣ＿ＭＯＵＳＥ］
クラスタリン ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｃｌｕ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１−［ＣＬＵＳ＿ＭＯＵＳＥ］
推定ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼＰ１１０ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｄ１Ｐａｓ１ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１−［ＤＤＸ３Ｌ＿ＭＯＵＳＥ］
ニバン様タンパク質１ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｆａｍ１２９ｂ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２−［ＮＩＢＬ１＿ＭＯＵＳＥ］
セロトランスフェリン ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｔｆ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１−［ＴＲＦＥ＿ＭＯＵＳＥ］
アネキシンＡ１１ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ａｎｘａ１１ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２−［ＡＮＸ１１＿ＭＯＵＳＥ］
アンキコルビン（Ａｎｋｙｃｏｒｂｉｎ） ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｒａｉ１４ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１−［ＲＡＩ１４＿ＭＯＵＳＥ］
Ｅｈｄ２タンパク質 ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｅｈｄ２ ＰＥ＝２ ＳＶ＝１−［Ｑ８Ｒ２Ｘ０＿ＭＯＵＳＥ］
ペルオキシレドキシン １（断片）ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｐｒｄｘ１ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１−［Ｂ１ＡＸＷ５＿ＭＯＵＳＥ］
ＬＩＭおよびＳＨ３タンパク質１（断片） ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｌａｓｐ１ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１−［Ａ２Ａ６Ｇ９＿ＭＯＵＳＥ］
リボヌクレアーゼ阻害剤 ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｒｎｈ１ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１−［ＲＩＮＩ＿ＭＯＵＳＥ］
異種性核リボ核タンパク質Ｕ、アイソフォーム ＣＲＡ＿ｂ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｈｎｒｎｐｕ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１−［Ｇ３ＸＡ１０＿ＭＯＵＳＥ］
フィブリノーゲンベータ鎖 ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｆｇｂ ＰＥ＝２ ＳＶ＝１−［ＦＩＢＢ＿ＭＯＵＳＥ］
ＮＫ１３ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｓｅｒｐｉｎｂ６ｂ ＰＥ＝２ ＳＶ＝２−［Ｏ０８８０４＿ＭＯＵＳＥ］
細胞内塩化物イオンチャネルタンパク質４ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｃｌｉｃ４ ＰＥ＝１ ＳＶ＝３−［ＣＬＩＣ４＿ＭＯＵＳＥ］
ジメチルアニリンモノオキシゲナーゼ［Ｎ−オキシド形成性］２ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｆｍｏ２ ＰＥ＝１ ＳＶ＝３−［ＦＭＯ２＿ＭＯＵＳＥ］
セルロプラスミン、アイソフォームＣＲＡ＿ｆ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｃｐ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１−［Ｇ３Ｘ９Ｔ８＿ＭＯＵＳＥ］
ミオシン軽鎖ポリペプチド６ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｍｙｌ６ ＰＥ＝１ ＳＶ＝３−［ＭＹＬ６＿ＭＯＵＳＥ］
フィブリノーゲン、アルファポリペプチド ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｆｇａ ＰＥ＝２ ＳＶ＝１−［Ｑ９９Ｋ４７＿ＭＯＵＳＥ］
アルコールデヒドロゲナーゼ１ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ａｄｈ１ ＰＥ＝２ ＳＶ＝２−［ＡＤＨ１＿ＭＯＵＳＥ］
ミオシン−ＸＶＩＩＩａのアイソフォーム４ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｍｙｏ１８ａ−［ＭＹ１８Ａ＿ＭＯＵＳＥ］
コピン−３ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｃｐｎｅ３ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２−［ＣＰＮＥ３＿ＭＯＵＳＥ］
肺サーファクタント関連タンパク質Ｄ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｓｆｔｐｄ ＰＥ＝２ ＳＶ＝１−［ＳＦＴＰＤ＿ＭＯＵＳＥ］
アクチン関連タンパク質２／３複合体サブユニット１Ｂ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ａｒｐｃ１ｂ ＰＥ＝１ ＳＶ＝４−［ＡＲＣ１Ｂ＿ＭＯＵＳＥ］
Ｆ−アクチンキャッピングタンパク質サブユニット アルファ−１ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｃａｐｚａ１ ＰＥ＝１ ＳＶ＝４−［ＣＡＺＡ１＿ＭＯＵＳＥ］
インテグリンベータ ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｉｔｇｂ２ ＰＥ＝２ ＳＶ＝１−［Ｑ５４２Ｉ８＿ＭＯＵＳＥ］
フィブリノーゲンガンマ鎖 ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ｆｇｇ ＰＥ＝２ ＳＶ＝１−［ＦＩＢＧ＿ＭＯＵＳＥ］
長鎖特異的アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ミトコンドリアの ＯＳ＝Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＮ＝Ａｃａｄｌ ＰＥ＝２ ＳＶ＝２−［ＡＣＡＤＬ＿ＭＯＵＳＥ］
注：＊１ 公知のＰＧＲＮ結合性タンパク質、＊２ ＨＳＰ７０およびそのコシャペロン
これらのデータを、Ｈｉｓタグを付けたＰＧＲＮ１３をコードする発現プラスミドを用いて安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＥＢＡＮ細胞における研究を用いて追跡した。２種のタンパク質がＨｉｓタグを付けたＰＧＲＮと共精製され、ＭＳ分析により、これらがＨＳＰ７０およびＴＣＰ１であることが明らかになった（示されていない）。ＭＳデータを確認するために、ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯ組織においてＧＢＡ抗体を使用して免疫沈降を行い、ＨＳＰ７０に対する抗体を用いてプローブした。ＷＴマウスではＯＶＡ攻撃後にＨＳＰ７０がＧＢＡに結合し、この相互作用はＰＧＲＮ ＫＯマウスでは検出不能であった（図１５Ｃ）。さらに、ｒＰＧＲＮの投与により、ＰＧＲＮ ＫＯマウスにおけるＧＢＡとＨＳＰ７０の結合が効率的にレスキューされた（図１５Ｄ）。次に、ＧＢＡのリソソーム送達にＨＳＰ７０が必要かどうかを調査し、ｓｉＲＮＡ手法を使用してＨＳＰ７０を抑制した。ＰＧＲＮのノックダウン（対照としての機能を果たす）と同様に、ＨＳＰ７０の抑制により、生細胞におけるＭＤＷ９３３標識を用いたアッセイで、リソソームＧＢＡが検出不能になった（図１６Ａ）。
ＬＩＭＰ２が主要なＧＢＡ運搬受容体であるという以前の報告３１、３４、３５と、ＰＧＲＮ欠損マクロファージではＧＢＡおよびＬＩＭＰ２がどちらも凝集したという知見（図１３）とに導かれ、ＨＳＰ７０がＬＩＭＰ２とも相互作用するかどうかを決定した。ＧＢＡと同様に、ＬＩＭＰ２もＷＴではＨＳＰ７０と会合したが、ＰＧＲＮ ＫＯ組織では会合しなかった（図１６Ｂ）。ソーティリンは、ＰＧＲＮの受容体であり、ニューロンにおけるＰＧＲＮのエンドソーム／リソソーム経路への送達を媒介することが報告されている２６。したがって、ソーティリンがＬＩＭＰ２／ＧＢＡ／ＰＧＲＮ／ＨＳＰ７０と、リンカータンパク質としてＰＧＲＮを通じて三元複合体を形成し、エンドソーム／リソソーム経路に沿ったＬＩＭＰ２／ＧＢＡ／ＰＧＲＮ／ＨＳＰ７０の送達を促進するかどうかを決定した。ここで、本発明者らは、これが事実であることを見いだした。ＷＴ肺においてＯＶＡ攻撃後にソーティリンとＧＢＡとの間の相互作用が同定され、これはＰＧＲＮ ＫＯ肺では完全に喪失したが、ソーティリンとＧＬＡとの間の相互作用２７はＰＧＲＮの欠損の影響を受けなかった（図１６Ｃ）。さらに、無処置のＷＴ肺ではソーティリンはＨＳＰ７０と非常に弱く会合し、この相互作用はＯＶＡ攻撃によって著しく増強されたが（図１６Ｄ）、この相互作用もＰＧＲＮ ＫＯ肺では完全に消失した（図１６Ｄ）。まとめると、ソーティリンはＬＩＭＰ２／ＧＢＡ／ＰＧＲＮ／ＨＳＰ７０複合体と、不可欠なアダプターとしてのＰＧＲＮを通じて会合する。
ＰＧＲＮが、ＧＢＡのフォールディングおよび輸送のために必要なＨＳＰ７０経路のコシャペロンとして作用するという知見と、（１）ＧＢＡ輸送の増強を目的とするシャペロンに基づく治療が、ＧＤに対するＥＲＴ（酵素補充療法）の有効な代替法であることが証明されており３６、（２）組換えＨＳＰ７０が、ニーマン・ピック病（ＮＰＤ）において見られる変更されたリソソームの安定性を有効に補正することが示されている３７という事実とに促され、ＰＧＲＮがＧＤおよび他のＬＳＤにおいて治療効果を有するかどうかを調査した。同様のｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ手法３７を使用して、正常な線維芽細胞およびＧＤを含めたＬＳＤの１１の異なる患者線維芽細胞に対するｒＰＧＲＮの効果を調査した。予測通り、ＰＧＲＮは、Ｉ型ＧＤおよびＩＩ型ＧＤのどちらに由来する線維芽細胞においても、脂質刺激を伴ってまたは伴わずに、変更されたリソソームを有効に復帰させた（図３３Ａ、３３Ｂ）。本発明者らは、テイ・サックス病、ファーバー病、およびムコリピドーシスＩＩＩの線維芽細胞においても、ＰＧＲＮが、変更されたリソソームを著しく正常化したことを観察して興奮した（図３３Ａ、３３Ｂ）。これらの知見に沿って、ＧＡＧおよびＭ２ガングリオシドの蓄積も高齢のＰＧＲＮ欠損マウス由来の組織において観察された（データは示していない）。ＩＩＩ型ＧＤ、ムコ多糖症ＩＩＩおよびＶＩの場合では、脂質刺激の存在下でＰＧＲＮの有益な効果が実証された（図３４Ａ、３４Ｂ）。最初に評価した単一の患者疾患試料線維芽細胞において、ＰＧＲＮは上述のＬＳＤ由来の疾患リソソームを補正したが、ニーマン・ピック病Ｂ型、ファブリー病およびムコリピドーシスＶＩに由来する本発明者らの試料中の線維芽細胞に対する有意な改善は観察されなかった（図３５Ａ、３５Ｂ）。しかし、サンプルサイズが小さいことを考慮して、有意な効果がないという結論をまだ出すことはできないので、これらの後者の疾患におけるＰＧＲＮの効果を評価するために、追加的な試料を用いたさらなる研究を計画している。総合すると、これらの結果により、ＰＧＲＮが、ＨＳＰ７０輸送経路のコシャペロンとして、ＧＢＡに加えて他のリソソーム酵素のリソソーム送達に関与するものとして意味付けられる。
考察
ＰＧＲＮ欠損マウスは、リポフスチン沈着症およびユビキチン化の加速を示すことが報告されている１１、１２。ここで、本発明者らは、ＰＧＲＮヌルマウスでゴーシェ様疾患が発生したことを報告し、これは、ＰＧＲＮがリソソームの重要なレギュレーター（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）であり得るという概念２６、３８をさらに支持する知見である。ＯＶＡによる攻撃を受けた成体および高齢のＰＧＲＮヌルマウスのどちらにおいてもゴーシェ様細胞および典型的な管様リソソームの外見が実証され、したがって、ヒトＧＤ３９の徴候を密接に模倣する新規のマウスモデルが提示される。この新規のＧＤ動物モデルは、ＧＤの病因をよりよく理解する助けとなるだけでなく、ＧＤを治療するための新しい薬物の試験および開発の促進にもなり得る。ＰＧＲＮ欠損マウスのニューロンには、一般に、神経セロイドリポフスチノーシス（ＮＣＬ）の生化学的シグネチャーとみなされる１１、１２、リポフスチンおよびミトコンドリアＡＴＰシンターゼ（ＳＣＭＡＳ）のサブユニットｃが蓄積することが示されている。ＰＧＲＮ欠損マウスがＧＤとＮＣＬのどちらも示すという知見により、表現型の重複する特徴が示される。本発明者らのマウスモデルの脳におけるリポフスチンおよびＳＣＭＡＳの蓄積も観察した。したがって、報告されたＰＧＲＮ欠損マウスモデルの間の矛盾は、おそらく、研究した細胞集団の差異（ＧＤにおけるマクロファージ 対 ＮＣＬにおけるニューロン）に起因する。ＰＧＲＮ欠損マウスモデルにおけるＧＤ様の予想外の発生に導かれ、ＰＧＲＮレベルがＧＤのヒト患者にも関連するかどうかを調査した。実際に、ＧＤ患者の血清中ＰＧＲＮレベルは、全体的に健康な対照およびアシュケナジ系ユダヤ人対照のどちらよりも有意に低く、また、全ＧＲＮ遺伝子配列決定により、ＧＤ患者におけるいくつかのＧＲＮ遺伝子改変体も同定された（図３６）。
本発明者らの不偏スクリーニングにおいて、ＰＧＲＮの存在に依存する多数のＧＢＡ関連タンパク質のうちの１つとしてＨＳＰ７０を単離した。興味深いことに、ＧＢＡとＨＳＰ７０の会合ならびにそれらのＧＤへの関与が以前に報告されているが３６、４０、４１、それらの会合の性質は不明であった。さらに、ＰＧＲＮとＨＳＰ７０の結合も最近報告された４２。本発明者らの手法により、ＰＧＲＮが、ＧＢＡのリソソーム送達を媒介するＧＢＡ／ＰＧＲＮ／ＨＳＰ７０三元複合体の不可欠な構成要素として同定された。重要なことに、ＧＢＡをＨＳＰ７０媒介性フォールディングおよび輸送経路と連結するための必須のコシャペロンとして作用するＰＧＲＮは、ＧＤ患者由来の線維芽細胞における変更されたリソソームを有効に正常化した。さらに、ＧＢＡフォールディングおよび輸送の促進を目的とするシャペロンに基づく治療がＧＤを治療するための有望な手法であることが証明された３６、４３。より重要なことに、現行のＥＲＴは、１種のＬＳＤに対してのみ対応して有効であるが、ＰＧＲＮは追加的なＬＳＤの疾患リソソームも有意に補正した（図３３、３４、３５）ので、ＰＧＲＮは、ＧＤに加えて様々な種類のＬＳＤに対する代替治療になり得る。
公知のＧＢＡ運搬受容体であるＬＩＭＰ２３１、３４、３５もＰＧＲＮ欠損細胞において凝集され、ＧＢＡ−ＬＩＭＰ２リガンド−受容体はＰＧＲＮおよびＨＳＰ７０シャペロンと三元複合体を構成し、これにはアダプターとしてＰＧＲＮが必要である。さらに、いくつかのタンパク質のリソソームへの送達に関与することが公知のＰＧＲＮ結合性リソソーム受容体であるソーティリン２６、２７も、ＰＧＲＮに直接結合することによってこの三元複合体と会合した。ＧＢＡ／ＬＩＭＰ２を用いて例示される、ＨＳＰ７０シャペロン経路を通じたＬＳＤ酵素のフォールディングおよびリソソーム送達の媒介におけるＰＧＲＮの役割を説明するために提唱されたモデルが図１７に示されている。ＧＢＡ／ＬＩＭＰ２は、ＥＲ／ゴルジにおいて、ＨＳＰ７０／コシャペロンと、必須のアダプターとしてのＰＧＲＮを通じて会合し、リソソームに同時に運搬される。ソーティリンなどの他のリソソーム受容体も、当該複合体のエンドソーム／リソソームへの送達を促進し得る。さらに、ＰＧＲＮ／ＨＳＰ７０経路との会合もＧＢＡおよびＬＩＭＰ２のフォールディングに重要であり得る。まとめると、ＰＧＲＮは、ＧＢＡ／ＬＩＭＰ２複合体のフォールディングおよび輸送の媒介を介したＧＢＡ／ＬＩＭＰ２のリソソーム運搬機構の不可欠な構成成分として作用する。
ＯＶＡがＰＧＲＮ ＫＯマクロファージのＧＤ様表現型を増強する機構は不明であるが、ＰＧＲＮのいくつかの公知の機能が、ＯＶＡによる攻撃を受けたＰＧＲＮ ＫＯマウスにおける予想外の観察結果を理解することに寄与し得る。例えば、ＰＧＲＮはＴＮＦ受容体と会合し、様々な種類の状態における炎症を抑制する能力を有し７、１３、１３〜１６、したがって、ＰＧＲＮの欠如は、ＯＶＡに誘導される炎症に対するマクロファージの異常な応答を導き得る。さらに、炎症は、多数のスフィンゴ脂質ＬＳＤに関与することが公知であり、ＬＳＤの治療では、抗炎症薬が、単独でまたは他の治療と組み合わせて使用されると有益である２。さらに、ＰＧＲＮは、ＧＤにおける細胞死において重要な役割を果たすことが示唆されている４４ＥＲストレスと関連するフォールディングされていないタンパク質応答と関連することが報告された１６。ＰＧＲＮの喪失は、異常なＥＲストレス応答ならびにＴＤＰ−４３９、４５およびＧＢＡ／ＬＩＭＰ２（本実施例）などの種々のタンパク質の凝集を導き、それにより今度は細胞質および核において凝集したタンパク質を分解するためのユビキチン化の増加が誘導され、リソソームでは、ＰＧＲＮ欠損は、ＧＢＡのリソソーム送達の欠陥を引き起こし、今度はβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積を引き起こす。ＯＶＡによる刺激は、このプロセスを加速し得る。最近、ネクロトーシスを媒介するＴＮＦＲ１シグナル伝達複合体の構成成分であるＲＩＰＫ３もＧＤの病態に関与し、ＲＩＰＫ３の阻害がＧＤに対する新規の治療的手法になり得ることが報告された４６。したがって、ＰＧＲＮの抗ＴＮＦおよび抗細胞死活性も、ＧＤおよび他のＬＳＤにおけるその治療効果に寄与し得る。
ＧＲＮ遺伝子の変異は、前頭側頭型認知症に関連する９、１０。ＰＧＲＮの不全は、ニューロン変性疾患に関連付けられている４７。ＧＲＮのホモ接合性変異もＮＣＬに関連付けられている１１、１２。ＰＧＲＮが、ＧＢＡ／ＬＩＭＰ２のリソソーム送達を媒介するＨＳＰ７０経路の不可欠な構成成分であるという知見は、神経変性疾患にも関連付けることができる。ＧＲＮ遺伝子の変異は、ＨＳＰ７０輸送経路に直接影響を及ぼし、今度はＴＤＰ−４３、およびα−シヌクレインなどのタンパク質のクリアランスの欠陥を導く可能性がある４８、または、ＧＢＡ送達の機能障害および結果としてグルコシルセラミドの蓄積によって生じるリソソームの機能に間接的に影響を及ぼす可能性がある４９。したがって、ＨＳＰ７０のコシャペロンとしてのＰＧＲＮの同定は、ＧＲＮ変異関連障害の基礎をなす推定分子機構をより良く理解する助けにもなり得る。さらに、ＰＧＲＮは、その変異がパーキンソン病（ＰＤ）にも関連するＧＢＡに物理的に結合し５０、ＧＲＮ遺伝子とＧＢＡ遺伝子の間に機能的および遺伝的関連が存在する可能性があり、それらのホモ接合性またはヘテロ接合性変異により一部の保因者が希少疾患（ＧＤ）および／または一般疾患（ＰＤ）に罹りやすくなる可能性があることが示される。
要約すると、この研究は、ＰＧＲＮを、ＧＤに関連しＧＤを引き起こすことができる、以前に認識されていない分子として同定し、したがって、ＧＤおよび他のリソソーム蓄積症におけるこの重大な因子に関する今後の発見のための強固な基盤をもたらす。さらに、この研究ではまた、ＰＧＲＮを顕著なＨＳＰ７０媒介性フォールディング／輸送経路の新規のコシャペロンとして単離し、したがって、代謝疾患のこの基本的な経路を標的とする独特の戦略を明らかにする。ＨＳＰ７０のフォールディングおよび輸送経路が、疾患プロセスの多血症に関与するという考察を用いて、ＨＳＰ７０経路のこの新しいコシャペロンの同定および操作により、ＬＳＤ、特にＧＤ、および他の代謝病態および状態を治療するための革新的な治療薬がもたらされ得る。
方法の概要
種々の動物モデルを使用してＧＢＡのリソソーム送達におけるＰＧＲＮの必須の役割を定義するためのｉｎ ｖｉｖｏアッセイ：ＯＶＡによる攻撃を受けた野生型マウスとＰＧＲＮ欠損マウスの比較；１歳の野生型マウスとＰＧＲＮ欠損マウスの比較；ゴーシェ様疾患が発生するＯＶＡによる攻撃を受けたＰＧＲＮ欠損マウスへのイミグルセラーゼまたは組換えヒトＰＧＲＮ（ｒＰＧＲＮ）の投与。
組換えＰＧＲＮによってβ−ＧｌｃＣｅｒクリアランスを調査するためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞に基づくアッセイ：ｒＰＧＲＮの存在下または不在下での、脂質による攻撃を受けた野生型骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）とＰＧＲＮヌル骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）の比較；脂質刺激を伴うまたは伴わない、種々のＬＳＤの線維芽細胞における変更されたリソソームのＰＧＲＮによる補正の比較。
ゴーシェ様疾患を特徴付けるためおよびゴーシェ様細胞を視覚化するためのアッセイ：組織学的分析；免疫組織化学的検査；脂質組成分析；ＧＢＡ酵素活性；透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）；免疫金標識ＴＥＭ；免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡；フローサイトメトリー；ＭＤＷ９３３ ｉｎｈｉｂｏｄｙ ｇｒｅｅｎプローブを使用した、生細胞における活性なリソソームＧＢＡの標識。
ＰＧＲＮ、ＧＢＡ、ＨＳＰ７０およびソーティリンの間の会合を同定し特徴付けるための質量分析およびタンパク質／タンパク質相互作用アッセイ：免疫共沈降；固相結合；ＳｅｎｓｉＱ Ｐｉｏｎｅｅｒ、Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙを用いた分析的表面プラズモン共鳴。
材料および方法
材料：Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型ＧＤ、テイ・サックス病、ファーバー病、ＩＶ型ムコリピドーシス（ＭＬ）、ＩＩＩ型およびＶＩ型ムコ多糖症（ＭＰＳ）、ニーマン・ピック病Ｂ型、ならびにファブリー病由来の線維芽細胞はＣｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）から購入し、正常な線維芽細胞はＧｉｂｉｃｏから購入した。線維芽細胞は全て、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で培養した。ＧＢＡに対する抗体（ｓｃ−１００５４４、ｓｃ−３０８４４、およびｓｃ−３２８８３）、ＰＧＲＮに対する抗体（ＳＣ−２８９２８）、ソーティリンに対する抗体（ｓｃ−３７６５７６）、α−ＧＬＡに対する抗体（ｓｃ−２５８２３）、ＨＳＰ７０に対する抗体（ｓｃ−３７３８６７）、カルレギュリンに対する抗体（ｓｃ−３７３８６３）、ＴＧＮ３８に対する抗体（ｓｃ−２７１６２４）、ＥＥＡ１に対する抗体（ｓｃ−３６５６５２）、ＬＩＭＰ２に対する抗体（ｓｃ−５５５７１）、およびＬＡＭＰ２に対する抗体（ｓｃ−１８８２２）はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘａｓ）から購入した。β−ＧｌｃＣｅｒ抗体（Ｃａｔ番号ＲＡＳ＿００１０）は、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、またはＣｙａｎｉｎｅ ｃｙ３で標識したロバ抗マウスＩｇＧ、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８またはＣｙａｎｉｎｅ ｃｙ３で標識したロバ抗ウサギＩｇＧ、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８またはＣｙａｎｉｎｅ ｃｙ３で標識したロバ抗ヒツジＩｇＧはＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から購入した。組換えＨｉｓタグＰＧＲＮタンパク質は２９３Ｔ安定細胞株から以前に記載されている通り１３、１４精製した。組換えＧＢＡ（Ｃａｔ番号７４１０−ＧＨ−０１０）、ソーティリン（Ｃａｔ番号３１５４−ＳＴ−０５０）、およびＬＩＭＰ２（Ｃａｔ番号１９６６−ＬＭ−０５０）タンパク質およびヒツジ抗マウスＰＧＲＮ抗体（ＡＦ２５５７）はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。ヒトＰＧＲＮ ＥＬＩＳＡキットはＡｄｉｐｏＧｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。ＥＲＫ阻害剤ＰＤ９８０５９、ＰＩ３Ｋ阻害剤ウォルトマニンおよびｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。イミグルセラーゼはＤｒ．Ｐａｓｔｏｒｅｓにより提供された。
慢性肺炎症モデル：Ｃ５７Ｂ／Ｌ６ ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスをＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物施設において以前に記載されている通り１３、５５飼育した。８週齢のマウスに、ＯＶＡ−ミョウバンのＩ．Ｐ．注射により１日目および１５日目に攻撃し、その後、１％ＯＶＡを２９日目に開始して１週間に３回、４週間にわたって鼻腔内攻撃することによって慢性肺炎症を誘導した５１。ＰＧＲＮレスキュー実験では、ＯＶＡによる鼻腔内攻撃の頻度を１週間に３回に増やした。マウスを屠殺し、脾臓、肝臓、脚、肺および気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）を採取した。ＰＧＲＮレスキュー実験では、４ｍｇ／ｋｇの組換えＰＧＲＮまたは６０ｕ／ｋｇのイミグルセラーゼを鼻腔内攻撃の開始時から毎週Ｉ．Ｐ注射した。
別の実験では、ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスをＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物施設において１歳まで飼育した。高齢マウスを直接屠殺し、肺、脾臓、肝臓、大腿骨、および脊椎を組織学的検査およびマイクロＣＴ分析のために採取した。
組織学的検査および分析：マウスを屠殺した後、後のタンパク質および脂質分析のために１つの肺葉を灌流せずに切除し、肺の残りの部分を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流した。脾臓、肝臓、および大腿骨も採取し、４％ＰＦＡを用いて固定した。これらの組織を全て、Ｍａｓｓ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）により、パラフィンに包埋し、スライドに切断し、Ｈ＆ＥおよびＰＡＳを用いて染色した。ゴーシェ様細胞数の定量化、およびゴーシェ様細胞の領域の測定をＩｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅによって分析した。
示されているマウスの群由来の大腿骨から軟部組織を取り除いた。常套的な固定後、脱灰し、パラフィン包埋し、組織切片を調製し、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。一次海綿質、および皮質骨に接続した小柱を除いて、骨端軟骨板から少なくとも０．５ｍｍに位置付けた標準の帯域内の骨体積を測定し、ＢｉｏＱｕａｎｔ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して骨体積（１０×元の拡大率）を査定するために使用するものと同じ帯域内の破骨細胞および小柱状領域を数え上げた。
脂質組成分析：ＯＶＡによる攻撃を受けたまたは受けていないＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスから肺を採取し、プロテイナーゼ阻害剤カクテルを含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液を用いてホモジナイズした。さらに、種々の年齢のＰＧＲＮ ＫＯマウスからの肺および脾臓、ならびに健康な対照およびＧＤ患者からの線維芽細胞も同じ方法を使用して処理した。各試料由来の総タンパク質１ｍｇを使用し、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ ＣａｒｏｌｉｎａにおけるＬｉｐｉｄｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅにより脂質組成が測定された。セラミド、ＤＡＧ、スフィンゴミエリン、β−ＧｌｃＣｅｒ、およびグルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）のレベルを、以前に記載されている通り２１高速液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）方法論によって測定した。健康な対照およびＧＤ患者由来の血漿、ならびにＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来の血漿を採取し、β−ＧｌｃＣｅｒおよびＧｌｃＳｐｈのレベルを測定した。脂質の分析結果を脂質レベル／総細胞タンパク質：タンパク質１ｍｇ当たりのｐｍｏｌ、または血漿１ｍｌ当たりのｐｍｏｌとして表した。
ＧＢＡ酵素活性：ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスからの肺を溶解させ、総タンパク質２０μｇを使用して、ＧＢＡ活性を以前に報告されている通り５２測定した。簡単に述べると、人工基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（４ＭＵＧＰ）をｐＨ５．９溶液（０．１５％トリトンＸ１００および０．１２５％タウロコール酸ナトリウムを含有する５０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液）で切断して４−メチルウンベリフェロンにすることによってＧＢＡ活性を定量化した。４−メチルウンベリフェロンの量を３６０ｎｍの励起および４６０ｎｍの放出フィルターで測定した。ＧＢＡ活性を１時間当たりの総タンパク質１ｍｇ当たりのｎＭとして表した。
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）：ＯＶＡ処置後のＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス、ならびに高齢のＰＧＲＮ ＫＯマウスを麻酔し、肺を灌流し、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中２．５％グルタルアルデヒドおよび２％パラホルムアルデヒドを含有する固定液を用いて２時間にわたって固定した。洗浄後、試料を１％ＯｓＯ４中に１時間にわたって固定し、１％酢酸ウラニルを用いて１時間にわたってブロック染色し、脱水し、Ｅｍｂｅｄ８１２（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）に包埋した。６０ｎｍの切片を切り取り、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛を用いて標準の方法によって染色した。染色されたグリッドをＰｈｉｌｉｐｓ ＣＭ−１２電子顕微鏡（ＦＥＩ；Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の下で調査し、Ｇａｔａｎ（４ｋ×２．７ｋ）デジタルカメラ（Ｇａｔａｎ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を用いて撮影した。
免疫電子顕微鏡検査のために、マウスを灌流し、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中４％ＰＦＡを用いて固定し、肺を解剖し、新鮮に作出した、０．１％グルタルアルデヒドおよび４％スクロース（ｐＨ７．４）を含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液中３％ＰＦＡ中に継続的に固定した。洗浄および脱水後、組織をＬｏｗｉｃｒｙｌ Ｋ４Ｍ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）およびＬＲ Ｗｈｉｔｅ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）に包埋した。重合はＵＶ光の下（３６０ｎｍ）、ＬＫ４Ｍについては−３５℃で、ＬＲ Ｗｈｉｔｅについては−１０℃で行う。超薄切片を切り取り、フォルムバール炭素でコーティングしたニッケルグリッドにマウントした。一次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした後、金と結合体化した二次抗体（１５ｎｍのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｇｏｌｄ、Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｕｔｒｅｃｈｔ、３５５８４ ＣＸ Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；１８ｎｍのＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅａｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を適用した。グリッドを、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛を用いて標準の方法によって染色し、Ｐｈｉｌｉｐｓ ＣＭ−１２電子顕微鏡（ＦＥＩ；Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の下で調査し、Ｇａｔａｎ（４ｋ×２．７ｋ）デジタルカメラ（Ｇａｔａｎ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を用いて撮影した。
免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡：凍結肺切片、またはカバーガラスで培養したＢＭＤＭを、４％ホルムアルデヒドレート（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｒａｔｅ）を用いて５分にわたって固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を０．１％トリトン−１００ ＰＢＳによって５分にわたって透過処理し、次いで、ＰＢＳで洗浄した。組織を１：５０希釈度の標準的なロバ血清を用いて３０分にわたってブロッキングした。一次抗体をスライド上、４℃で一晩プローブした。翌日、スライドをＰＢＳで洗浄し、蛍光標識した二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８で標識したロバ抗マウスとＣｙａｎｉｎｅ ｃｙ３で標識したロバ抗ウサギ抗体の組み合わせ、またはいくつかの実験では異なる蛍光を使用した）を添加して１時間置き、ＰＢＳで洗浄した。組織またはＢＭＤＭ細胞を、ＤＡＰＩを含有する退色防止用封入剤（ａｎｔｉ−ｆａｄｅ ｍｅｄｉｕｍ）上にマウントした。Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点システムによって画像を取得した。
フローサイトメトリー：マウスを屠殺した際にＢＡＬを採取し、１２００ｒｐｍで５分遠心分離して細胞を採取した。細胞を２回、０．１％ＦＢＳを含有する氷冷ＰＢＳに懸濁させ、洗浄した。細胞をＦＩＴＣで標識したＣＤ１１ｂ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて１時間にわたって染色し、ＢＤ ＦＡＣＳｃａｎによって分析し、データをＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅによって解析した。
骨塩密度（ＢＭＤ）の測定値：高齢のＷＴおよびＰＧＲＮ欠損マウスの全骨格のＢＭＤ（ｇｍ／ｃｍ２）を、ＰＩＸＩｍｕｓ 骨密度測定装置（Ｌｕｎａｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して査定した。当該計器は各スキャンセッションの前に、ＢＭＤ既知のファントムを製造業者のガイドラインに従って使用して較正した。マウスを、ケタミン（体重１ｇ当たり９０μｇ）およびキシラジン（体重１ｇ当たり１０μｇ）を腹腔内注射することによって麻酔し、次いで、検体トレー上に腹臥位で乗せて骨格全体のスキャンを可能にした。
マイクロＣＴ：遠位大腿骨幹端における小柱状の体積を、Ｓｃａｎｃｏ μＣＴ４０スキャナー（Ｓｃａｎｃｏ Ｍｅｄｉｃａｌ ＡＧ、Ｂａｓｓｅｒｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して測定した。全てのスキャンの評価のために閾値３００を使用した。顆および一次海綿質が目に見えなくなった最初のスライスから開始して３０枚のスライスを分析した。
免疫沈降：ｒＰＧＲＮ処置を伴うまたは伴わない、ＯＶＡによる攻撃を受けたまたはＯＶＡによる攻撃を受けていないＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来の肺組織を、プロテアーゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液によって溶解させた。１２０００ｒｐｍで１０分遠心分離して残渣をペレットにした。上清を新しいチューブに移し、１０秒間の超音速パルスを使用して膜タンパク質をさらに放出させた。マウスの各群由来のタンパク質を同量で混合して各群のタンパク質プロファイルを表した。混合試料由来のタンパク質４００μｇを免疫沈降のために使用した。２μｇ／ｍｌの標準的なマウスおよびウサギ抗体ならびに２０μｌのプロテインＡ／Ｇアガロース−ビーズを添加し、４℃で１時間インキュベートした。３０００ｒｐｍで５分遠心分離してビーズをペレットにした。上清を新しいチューブに移し、２μｇ／ｍｌの一次抗体を添加し、４℃で１時間インキュベートし、次いで、２０μｌのプロテインＡ／Ｇアガロース−ビーズを添加し、一晩インキュベートした。ビーズをＲＩＰＡ溶解緩衝液で６〜８回洗浄し、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、抗体を用いて標的とするタンパク質をプローブし、ウエスタンブロットによって可視化した。いくつかの実験では、質量分析を行うために免疫沈降後の試料をＮＹＵコア施設に送付した。
免疫組織化学的検査：ＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウスからのパラフィン包埋肺スライドをキシレンおよび勾配エタノールによって脱パラフィンした。０．１％トリプシン（０．５％トリプシンから０．１％ＣａＣｌ２によって希釈したもの）を３７℃で３０分にわたって使用することによって抗原を回復させた。内在性水素ペルオキシダーゼをＰＢＳ中３％Ｈ２Ｏ２により１０分にわたって失活させた。スライドを３％ＢＳＡおよび２０％ヤギ血清を用いて３０分ブロッキングした。一次抗体を、２％ヤギ血清を用いて１：２０〜５０に希釈し、スライド上、４℃で一晩刺激した。翌日、スライドをＰＢＳで洗浄し、二次抗体（１：２００のビオチン標識したヤギ抗ウサギ抗体またはヤギ抗マウス抗体）を１時間にわたり添加した。染色をＶｅｃｔｏｒ ＡＢＣペルオキシダーゼキット、その後、ＤＡＢ基質によって可視化した。
質量スペクトル：１）ゲル分離および消化。試料を、ＤＴＴを用い、５７℃で１時間にわたって還元し、ヨードアセトアミドを用いて室温、暗所中で４５分にわたってアルキル化した。各試料をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ １．０ｍｍにローディングした。ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してゲルを染色し、クーマシー染色したゲルバンドを、ゲル画像上に示されている通りに切り出した。切り出したゲル小片をメタノールと１００ｍＭの炭酸水素アンモニウムの５０：５０ｖ／ｖ溶液を用いて脱染した。ゲル小片をアセトニトリルによるすすぎで部分的に脱水し、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮機中、２０分にわたってさらに乾燥させた。配列決定グレードの改変トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）３００ｎｇを各ゲル試料に添加した。トリプシンを吸収させた後、１００ｍＭの炭酸水素アンモニウム１００μｌを、ゲル小片を覆うように添加した。振とう機上、室温で一晩、消化を進行させた。
（２）タンパク質抽出。５％ギ酸および０．２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中Ｒ２ ２０μｍ Ｐｏｒｏｓビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のスラリーを、消化のために添加した炭酸水素アンモニウムの体積と同等の体積で各試料に添加した。試料を４℃で２時間振とうした。ビーズを、６０００ｒｐｍで３０秒の微量遠心分離機を使用して平衡化したＣ１８ ｚｉｐｔｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にローディングした。ゲル小片を０．１％のＴＦＡで３回すすぎ、各すすぎ液をその対応するｚｉｐｔｉｐに添加し、その後、微量遠心分離した。抽出されたｐｏｒｏｒｓビーズをさらに０．５％酢酸で洗浄した。０．５％酢酸中４０％アセトニトリルを添加し、その後、０．５％酢酸中８０％アセトニトリルを添加することによってペプチドを溶出させた。ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮機を使用して有機溶媒を除去し、試料を０．５％酢酸中に再構成した。
ＭＳ分析。各試料の１／５を個別に、まずｍＩｇＧ、次いでＫＯ ＧＢＡ、最後にＷＴ ＧＢＡで分析した。ＥＡＳＹ−ｎＬＣ １０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のオートサンプラーを使用して試料をオンラインＬＣ−ＭＳに注入した。ペプチドを、１時間勾配、溶媒Ａ：５％アセトニトリル、０．５％酢酸、溶媒Ｂ：９５％アセトニトリル、０．５％酢酸を使用してカラムから直接Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に勾配溶出させた。
ＭＳ法。分解能７０，０００、ＡＧＣターゲット１ｅ６、最大イオン時間１２０ｍｓ、およびスキャン範囲３００〜１５００ｍ／ｚで高分解能完全ＭＳスペクトルを取得した。各完全ＭＳに従って、２０のデータ依存性高分解能ＨＣＤ ＭＳ／ＭＳスペクトルを取得した。全てのＭＳ／ＭＳスペクトルを以下の計器パラメータを使用して収集した：分解能１７，０００、ＡＧＣターゲット２ｅ５、最大イオン時間２５０ｍｓ、１マイクロスキャン、２ｍ／ｚ単離ウインドウ、固定された最初の質量１５０ｍ／ｚ、およびＮＣＥ２７。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ内のＳｅｑｕｅｓｔを使用してｕｎｉｐｒｏｔマウスデータベースに対してＭＳ／ＭＳスペクトルを検索した。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：ＳＰＲ実験は全てＳｅｎｓｉＱ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ、ＯＫ）により、制御された分析温度２５℃で、計器試料ラック内の試料を１８℃に維持して、ＳｅｎｓｉＱ Ｐｉｏｎｅｅｒを使用することによって行われた。ランニング緩衝液は、固定化およびアッセイ全体を通して、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０からなった。緩衝液のｐＨは、個々の実行に対してｐＨ７．４、６．５、６．０または５．５に調整し、各ｐＨについて、ランニング緩衝液を使用してＰＧＲＮ試料およびスクロース拡散標準物質を調製した。
ＣＯＯＨ１チップを取り付け、１０ｍＭのＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＯＨ、および０．１％ＳＤＳの１０秒間の注射（各２×）によって条件付けた。チャネル３を、水中４ｍＭのＥＤＣおよび１ｍＭのＮＨＳを毎分２０ｕＬの流量で５分かけて注射することによって活性化した。次いで、ＧＢＡ（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中２５ｕｇ／ｍＬ）を毎分１０ｕＬの流量で約２分かけて注射した。次いで、チャネル１および２を、水中４ｍＭのＥＤＣおよび１ｍＭのＮＨＳを用いて５分かけて活性化した。ソーティリン（酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中１０ｕｇ／ｍＬ）を、毎分１０ｕＬの流量で５分かけて注射することによってチャネル１上に固定化した。ＢＳＡ（酢酸ナトリウム、ｐＨ４．３中１０ｕｇ／ｍＬ）を参照チャネル上に固定化して、非特異的な結合を減少させた。全てのチャネルに１Ｍのエタノールアミン、ｐＨ８．０を４分かけて注射することによってキャップした。
ＰＧＲＮのアッセイを、合計５つの緩衝液ブランク注射および２００ｎＭのＰＧＲＮの２つの反復を用いて実施し、その全てに１時間の解離時間を取った。単回勾配注射から動力学的速度定数および平衡解離定数を決定するために、このアッセイにはＯｎｅＳｔｅｐ（商標）注射を使用した。拡散標準として機能させるためにランニング緩衝液中３％スクロースの注射を２回実施した。
ＱＤａｔ 解析ソフトウェア（ＳｅｎｓｉＱ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してデータを解析した。全てのデータを参照チャネル（チャネル２）および緩衝液ブランクに対して２重参照した。緩衝液ブランクの平均シグナルを使用して注射アーチファクトを減少させた。分析チャネルからの参照されたＳＰＲデータをモデルフィッティングして相互作用についてのｋａ、ｋｄ、およびＫＤを確認した。
固相結合：０．１、１、２、および５μｇ／ｍｌのＰＧＲＮタンパク質を９６ウェル中、３連のウェルで、ＰＢＳ中に一晩コーティングした。プレートを０．１％ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで５回洗浄し、次いで、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を用いてブロッキングした。２μｇのＢＳＡ、ＬＩＭＰ２およびＧＢＡタンパク質を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＢｉｏｔｉｎおよびＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のプロトコールに従ってビオチンで標識した。ビオチン標識したＬＩＭＰ２、ＧＢＡまたはＢＳＡをプレートに添加し、２時間インキュベートした。０．１％ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：２０００希釈）溶液で１時間コーティングした。洗浄後、基質を添加し、２ＭのＨ２ＳＯ４ １００μｌを用いて反応を停止した。プレートリーダーでＵＶ４５０ｎｍにおける結果を読み取った。
ＢＭＤＭ分化およびｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＤモデル：ＢＭＤＭの分化を以前に報告されたプロトコール２５、５３に従うことによって実施した。簡単に述べると、単球をＷＴおよびＫＯ骨髄から単離し、Ｌ９２９馴化培地を補充したＲＰＭＩ１６４０中で５日間培養してマクロファージに分化させた。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてゴーシェ細胞の発生を模倣するために、スフィンゴ脂質を含めた様々な種類の脂質を含有する５０μｇ／ｍｌの脳溶解物（マウス脳組織１ｇをＤＭＥＭ培地１０ｍｌ中、Ｂｉｏ−Ｇｅｎ ＰＲＯ２００ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒにより最高スピードで１分ホモジナイズしたもの）を細胞培養上清に１０日間にわたり添加した。ｉｎ ｖｉｔｒｏレスキュー実験の場合では、０．１および０．４μｇ／ｍｌのＰＧＲＮを脂質と同時に添加した。３日ごとに細胞培養培地を補充した。β−ＧｌｃＣｅｒのレベルを免疫蛍光染色によって染色した。
活性形態のリソソームＧＢＡの蛍光標識：活性なリソソームＧＢＡを標識するための特異的な高感度蛍光色素であるＭＤＷ９３３２８、３０はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＬｅｉｄｅｎのＤｒ．Ｈｅｒｍｅｎ Ｅ．Ｏｖｅｒｋｌｅｅｆｔにより惜しみなく提供された。ＢＭＤＭをカバーガラス上で培養し、リソソームＧＢＡを標識するためにＭＤＷ９３３（５０ｎＭ）を培養培地に２時間にわたり添加した。次いで、細胞を、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドを用いて１５分にわたって固定し、ＰＢＳ中０．１ｍＭのＮＨ４Ｃｌによって１０分にわたって透過処理した。ＢＭＤＭを、ＤＡＰＩＩ媒体を用いてマウントし、蛍光を共焦点顕微鏡の下で可視化した。
ｓｉＲＮＡ手法によるＰＧＲＮおよびＨＳＰ７０のノックダウン：マウスＰＧＲＮおよびＨＳＰ７０に対するｓｉＲＮＡはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。ＲＡＷ２６４．７細胞に、リポフェクタミン２０００を使用して対応するｓｉＲＮＡ２０ｐｍｏｌをトランスフェクトした。次いで、細胞を、脂質混合物（５０μｇ／ｍｌ）を用いて２４時間にわたって処理し、活性形態のＧＢＡのレベルをＭＤＷ９３３色素によって測定し、ＰＧＲＮまたはＨＳＰ７０のノックダウン効率を、それらの特異的抗体を使用した免疫蛍光染色によって調査した。
ＬＳＤ線維芽細胞におけるリソソーム染色：異なるＬＳＤおよび健康な対照由来の線維芽細胞を、２４ウェルプレート中、カバーガラス上、組換えＰＧＲＮタンパク質（０．４μｇ／ｍｌ）、脂質溶解物（５０μｇ／ｍｌ）、およびＰＧＲＮプラス脂質溶解物の不在下または存在下で、２４時間培養した。翌日、１００ｎＭのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄを含有する新鮮な培地を１時間にわたり添加した。細胞をＰＢＳで洗浄し、２％ＰＦＡ中で固定した。カバーガラスをスライドにマウントし、リソソームの染色を共焦点顕微鏡検査によって画像化した。各試料から画像１０枚をランダムに取得し、蛍光強度をＩｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅによって測定した。
ヒト研究参加者：１１５例のＧＤ試料がＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅからＤｒ．Ｐａｓｔｏｒｅｓにより収集された。一般集団からの健康な対照４４例およびアシュケナジ系ユダヤ人の健康な対照５５例がＢｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｍｅｄｉｃａｌ ＣｅｎｔｅｒのＤｒ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ−Ｐｕｌｌｍａｎにより提供された。患者のそれぞれが同意書に署名した。この研究は、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅおよびＢｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒの倫理調査委員会により承認されたものであった。
ＧＤ患者におけるＰＧＲＮの血清中レベル：ＰＧＲＮの血清中レベルをＡｄｉｐｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からのＥＬＩＳＡキットによって測定した。簡単に述べると、プレーティングしたＥＬＩＳＡを、ブロッキング緩衝液３００μｌを用いて３０分にわたってブロッキングした。血清をＰＢＳによって２００倍に希釈した。ブロッキング後、試料１００μｌおよび標準物質を２時間にわたってローディングする。プレートをＰＢＳ／ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、検出抗体１００μｌを１時間にわたり添加した。プレートを再度洗浄し、検出器１００μｌをさらに１時間にわたり添加した。プレートをすすぎ、ＴＭＢ基質溶液１００μｌを添加し、停止溶液によって反応を終結させた。結果を４５０ｎｍにおいてプレートリーダーによって記録した。ＰＧＲＮの濃度を標準曲線に基づいて算出した。
ＧＲＮ遺伝子の配列決定：ＧＤ患者４０名からのゲノムＤＮＡを、１ｋｂのプロモーター領域および８ｋｂの全長ＧＲＮ遺伝子を含む全長ＧＲＮ遺伝子をＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ（ＮＥＢ Ｉｎｃ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）によって増幅するための鋳型として使用した。全てのＰＣＲ産物を同等のモル比で混合して１つのチューブに入れた。最終的な試料を、新規の技術であるＰａｃＢｉｏ ＲＳ ＩＩ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ５４による遺伝子配列決定のためにＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのゲノム施設に送付した。各患者の配列をそれらのバーコード配列によって選別し、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓからの逐次的な精密化（ｂｌａｓｒ）を伴う基本的な局所アラインメント（ｇｉｔｈｕｂ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｃｈａｉｓｓｏｎ， ＭＪおよびＴｅｓｌｅｒ， Ｇ（２０１２年）ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １３巻：２３８頁）を使用して全長ＧＲＮ配列をアラインし、次いで、ＳＡＭｔｏｏｌｓ（ｓａｍｔｏｏｌｓ ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ）を使用して患者試料中の改変体を検出した。
統計解析：処理群の比較のために、対応のないｔ検定、および一元配置または二元配置ＡＮＯＶＡ（適切な場合には）を実施した。統計解析は全て、ＳＰＳＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して実施した。統計的有意性は両側性であり、ｐ＜０．０５の場合に達成された。
参考文献
（実施例２）
ＰＧＲＮ誘導体ペプチドアトストリン
特にアトストリンと称されるＰＧＲＮ誘導体ペプチドを含めたＰＧＲＮペプチドが評価され、野生型または全長ＰＧＲＮと比較して重複したＰＧＲＮ活性を有し、いくつかの場合には、増強された活性を有することが同定された。ＰＧＲＮ誘導体ペプチドアトストリンは、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ活性、および、ＴＮＦ−αに誘導される炎症性関節炎を含めたＴＮＦ媒介性シグナル伝達または応答のシグナル伝達、阻害または遮断のモジュレーターとして活性である（Ｔａｎｇ Ｗら（２０１１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３２巻：４７８〜４８４頁；ＷＯ２０１０１２０３７４）。アトストリンは、ＰＧＲＮ由来の操作されたタンパク質（ＴＮＦ受容体を標的とすることによるＴＮＦ／ＴＮＦＲシグナル伝達のアンタゴニスト）であり、ＰＧＲＮ単位Ａ、ＣおよびＦの半分の単位の組み合わせをリンカー単位Ｐ３、Ｐ４およびＰ５と組み合わせて含む（米国特許第８，３６２，２１８号；ＷＯ２０１０１２０３７４）。アトストリンは、全長のＰＧＲＮ分子と重複する活性および能力を有するＰＧＲＮ由来の活性ペプチドをもたらす。
ＰＧＲＮ誘導体ペプチドアトストリンを、ＰＧＲＮ ＫＯに誘導されるゴーシェ病を含めたＬＳＤにおけるＰＧＲＮ様の活性および効果について評価した。ＰＧＲＮ、およびＰＧＲＮ由来の操作されたタンパク質であるアトストリンの両方が、ＰＧＲＮ ＫＯマクロファージにおけるβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積をレスキューすることが見いだされた。ＰＧＲＮ ＫＯマウス由来のＢＭＤＭを、種々の量のＰＧＲＮまたはアトストリン（１００ｎｇ／ｍｌまたは４００ｎｇ／ｍｌ）を伴ってまたは伴わずに、５０μｇ／ｍｌの脂質を用いて１０日間処理し、査定した（図３９）。光学顕微鏡の下で、脂質処理後にＢＭＤＭは乱雑に見え、細胞は組織が壊され、そしてこれらの形態学的変化はＰＧＲＮおよびアトストリンのいずれかによって用量依存的に部分的にレスキューされた（上のパネル）（図３９、最初のパネルのセット（ＬＭ））。脂質処理に伴いβ−ＧｌｃＣｅｒが蓄積し、この蓄積は組換えＰＧＲＮおよびアトストリンのいずれかを添加することによっても用量依存的に予防される（図３９）。
ＰＧＲＮおよびアトストリンは、ＧＤ患者由来の線維芽細胞におけるβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積をレスキューすることが見いだされた。線維芽細胞をＩＩ型ＧＤ患者から単離し、無処理、脂質混合物単独、または脂質混合物とＰＧＲＮ（４００ｎｇ／ｍｌ）もしくはアトストリン（４００ｎｇ／ｍｌ）のいずれかでの処理と組み合わせて用いて評価した。線維芽細胞を、ＰＧＲＮまたはアトストリンの添加を伴ってまたは伴わずに、５０μｇ／ｍｌの脂質混合物を用いて２日間処理した。次いで、ＧＢＡおよびβ−ＧｌｃＣｅｒの発現を免疫蛍光染色によって測定し、共焦点顕微鏡検査によって画像を取得した。結果（図４０）から、脂質処理によりＧＤ線維芽細胞におけるＧＢＡの凝集およびβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積が有意に誘導されたこと、ならびに４００ｎｇ／ｍｌのＰＧＲＮによる処理により、ＧＢＡの凝集およびβ−ＧｌｃＣｅｒの貯蔵がほぼ完全に予防されたことが示される。ＰＧＲＮ ＫＯマウス由来のＢＭＤＭの場合とは異なり、蓄積表現型のレスキューにおいてアトストリンはＰＧＲＮと比較して低い効率を示した。
本発明者らは、ＰＧＲＮおよびアトストリンのどちらもＰＧＲＮ ＫＯマウス由来のＢＭＤＭにおいて良好に機能するが、アトストリンはＧＤ線維芽細胞において同じ用量でいくらか低い有効性を示すことを見いだした。これにより、ＰＧＲＮは線維芽細胞に首尾よく入り込むことができるが、アトストリンは線維芽細胞により低い効率で侵入することが示唆される。ＰＧＲＮのエンドサイトーシスはソーティリンによって媒介され、ＰＧＲＮは最後の３つのＣ末端アミノ酸でソーティリンに結合するが、アトストリンはこのモチーフを有さない。アトストリンは線維芽細胞にソーティリン依存性エンドサイトーシス経路を介して侵入しない可能性があるという仮説を立てた。アトストリンの濃度を上昇させること（以下を参照されたい）が、ＧＤ線維芽細胞におけるβ−ＧｌｃＣｅｒの蓄積をレスキューするのに有効であることに注目すべきである。対照的に、ＰＧＲＮおよびアトストリンはどちらもマクロファージによって取り込まれ得、したがって、両方のタンパク質はマクロファージにおいては同等に有効である。
さらなる研究から、アトストリンが、β−ＧｌｃＣｅｒの蓄積を投与量依存的に、特に高用量でレスキューすることが示された。ＧＤ患者由来の線維芽細胞を、５０μｇ／ｍｌの脂質混合物（上記の通り）を種々の量のアトストリン（０．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および５０μｇ／ｍｌ）と共に用いて処理した。β−ＧｌｃＣｅｒレベルを評価し、免疫蛍光染色によって観察した（図４１）。アトストリンは、β−ＧｌｃＣｅｒの蓄積を用量依存的に、特に５０μｇ／ｍｌでレスキューする。
次いで、ＰＧＲＮ ＫＯマウスにおいてアトストリンをＰＧＲＮと比較して評価した。ＰＧＲＮ ＫＯマウスに、上記の通りＯＶＡを用いて攻撃することによってゴーシェ病を誘導した。ＫＯマウスに、組換えＰＧＲＮタンパク質、ＢＳＡ、またはアトストリン（４ｍｇ／ｋｇ／週）のいずれかを４週間にわたって注射（ｉ．ｐ．）した。次いで、肺組織変化を組織学的に検査し、ゴーシェ細胞数を定量化し、ゴーシェ細胞サイズを決定した。結果が図４２に提示されている。ＰＧＲＮまたはアトストリンのいずれかで処置した動物は、同様の組織学的検査およびゴーシェ細胞数を示し、細胞サイズはＰＧＲＮまたはＰＧＲＮ誘導体ペプチドアトストリン処置のいずれかで減少した。ＰＧＲＮまたはアトストリンのいずれかを用いた場合の有意性の程度は同様であった。
（実施例３）
種々のリソソーム蓄積症におけるＰＧＲＮ誘導体ペプチドアトストリンの効果
次に、ＬＳＤ患者から線維芽細胞を得、ＰＧＲＮまたはアトストリンのいずれかを用いて処理した。ゴーシェ病（ＧＤ）；テイ・サックス病（ＴＳＤ）；ムコリピドーシス（ＭＬ）；ムコ多糖症（ＭＰＳ）；異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）；およびファーバー病（ＦＤ）を含めた種々のリソソーム蓄積症患者由来の線維芽細胞を評価した。ＬＳＤ罹患線維芽細胞の各セットについて、ＬＳＤ線維芽細胞を、脂質を単独で、または組換えＰＧＲＮもしくはアトストリン（０．４μｇ／ｍｌ）と組み合わせて用いて、それぞれ２４時間にわたって攻撃した。ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ−ｒｅｄを用いてリソソームを染色した。各試料について画像１０枚を共焦点顕微鏡の下でランダムに取得し、リソソーム貯蔵をｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅによって蛍光強度に基づいて定量化した。結果は図４３および図４４に示されている。結果に示されている通り、アトストリンおよびＰＧＲＮはどちらも有効であり、ゴーシェ病Ｉ型およびＩＩ型（ＧＤＩおよびＧＤＩＩ）、テイ・サックス病（ＴＳＤ）、ムコリピドーシスＩＩＩ（ＭＬＩＩＩ）、ムコ多糖症ＩＩ、ＩＩＩおよびＶＩ（ＭＰＳＩＩ、ＭＰＳＩＩＩ、ＭＰＳＶＩ）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、およびファーバー病（ＦＤ）について、全てのＬＳＤ罹患線維芽細胞においてリソソーム貯蔵が有意に減少した。
慢性神経障害性型のゴーシェ病ＩＩＩ型（ＧＤＩＩＩ）由来の線維芽細胞を評価した。ＧＤ ＩＩＩ患者由来の線維芽細胞を、脂質を単独で、または組換えＰＧＲＮもしくはアトストリン（０．４μｇ／ｍｌ）と一緒に用いて、それぞれ２４時間にわたって攻撃した。ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ−ｒｅｄを用いてリソソームを染色し、各試料について画像１０枚をランダムに取得し、リソソーム貯蔵を蛍光強度に基づいて定量化した。この研究では、ＰＧＲＮは有意に有効であったが、アトストリン処理では蛍光強度によって評価されるリソソーム貯蔵は有意には減少しなかった（図４５）。
ＬＳＤ線維芽細胞研究では、一部の罹患線維芽細胞は、リソソーム貯蔵を減少させるＰＧＲＮまたはアトストリンのさらにわずかな効果を示した。しかし、これらは実験の単一のセットのみであった。上記と同じ手法を使用して、ファブリー病（ＦＡＢＲＹ）、ムコリピドーシスＩＶ（ＭＬＩＶ）；ムコ多糖症ＩＶＡおよびＶＩＩ（ＭＰＳＩＶＡおよびＭＰＳＶＩＩ）ならびにニーマン・ピック病ＡおよびＢ（ＮＰＤＡおよびＮＰＤＢ）のそれぞれに由来するＬＳＤ線維芽細胞を、ＬＳＤ線維芽細胞を脂質単独または組換えＰＧＲＮまたはアトストリン（０．４μｇ／ｍｌ）を用いて攻撃することによって評価した（図４６）。これらの特定のＬＳＤ線維芽細胞のそれぞれでは、ＰＧＲＮの効果もアトストリンの効果も有意ではないことが見いだされた。
クラッベ病患者由来のＬＳＤ線維芽細胞を同様に評価した（図４７）。ＰＧＲＮおよびアトストリンはどちらも、クラッベ病患者の線維芽細胞におけるリソソーム内脂質貯蔵を有意に減少させるのに有効であった。
総合すると、これらの研究により、プログラニュリンＰＧＲＮ、およびＰＧＲＮペプチドアトストリンによって例示されるプログラニュリン誘導体ペプチドの両方の、種々の認識されているリソソーム蓄積症におけるリソソーム貯蔵を減少させることにおける注目すべき効果が実証される。ＰＧＲＮおよびアトストリンのどちらによっても、ゴーシェ病、テイ・サックス病、異染性白質ジストロフィー、ファーバー病、クラッベ病、ならびにムコリピドーシスおよびムコ多糖症の形態を含めたＬＳＤの患者由来の細胞におけるリソソーム内の脂質の集積が有意に減少する。
（実施例４）
リソソーム蓄積症であるテイ・サックス病におけるプログラニュリンの評価
テイ・サックス病（ＧＭ２ガングリオシドーシスまたはヘキソサミニダーゼＡ欠損症としても公知）は、脳および脊髄における神経細胞を次第に破壊する、稀な常染色体劣性の遺伝性障害である。テイ・サックス病は、脂肪性物質の分解を補助する酵素（β−ヘキソサミニダーゼＡ）（図１）が存在しない場合に結果として生じ、当該疾患は、有害な量のガングリオシドが脳の神経細胞に蓄積すると起こり、最終的に早発の細胞死に至る。ガングリオシドは、スフィンゴ脂質の一形態であり、したがって、テイ・サックス病はスフィンゴリピドーシスのメンバーである。
テイ・サックスは、乳児期に明らかになり得（小児性テイ・サックス病）、その場合、乳児は、３〜６カ月齢から寝返りをうつ、座ることおよびはうことなどの運動技能を失う。疾患が進行するにつれて、小児の体は機能を失い、失明、聴覚消失、麻痺および死亡に至る。遅発型のテイ・サックス病も起こるが非常に稀であり、２歳〜１０歳で最初に見られる（若年性テイ・サックス病）、または、より遅発性の稀な形態が３０代または４０代の成人において見られる（成人／遅発型テイ・サックス病）。独特の特徴としては、筋肉の衰弱、筋肉協調の損失（運動失調）、痙縮、および他の運動障害、会話障害、認知機能低下、および精神病が挙げられる。酵素β−ヘキソサミニダーゼＡのアルファサブユニットをコードするＨＥＸＡ遺伝子の変異はテイ・サックス病を引き起こす。β−ヘキソサミニダーゼＡ酵素はリソソームに位置し、ＧＭ２ガングリオシドの分解を補助する。ＧＭ２ガングリオシドがリソソーム内に有毒なレベルまで蓄積する。テイ・サックスの患者および保因者は、ヘキソサミニダーゼＡ活性を測定する血液検査によって、またはＨＥＸＡ遺伝子の変異を評価することによって同定することができる。テイ・サックス病はアシュケナジ系ユダヤ人において有病率が上昇することが認められている。ＨＥＸＡ遺伝子の読み枠の変更をもたらすエクソン１１への４つの塩基対の挿入（１２７８ｉｎｓＴＡＴＣ）が、アシュケナジ系集団において最も蔓延しているＨＥＸＡ変異であると同定された。この変異は、ルイジアナのケージャン人においても見られる。他の無関係の変異が２つ、フランス系カナダ人において同定されており、テイ・サックスに関連する。
現在、テイ・サックス病の治癒法も治療も存在しない。最良の医療を用いたとしても、小児性テイ・サックス病の小児は４歳までに死亡する。患者は、症状を和らげるためまたは寿命を延ばすために支持医療を受ける。遅発型テイ・サックスでは、薬物療法（例えば、うつ病に対するリチウム）により、時には精神医学的症状および発作を制御することができる。最近、研究者は、ピリメタミンがβ−ヘキソサミニダーゼ活性を上昇させ、したがって、遅発型テイ・サックス病の進行を潜在的に減速させることができることを発見した（Ｃｌａｒｋｅ ＪＴら（２００４年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １０２巻（１号）：６〜１２頁；Ｏｓｈｅｒ Ｅら（２０１１年）Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． Ｍｅｔａｂ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）１０２巻（３号）：３５６〜６３頁）。
上記の研究の例および図３３では、テイ・サックス病患者を含めたＬＳＤ患者由来の線維芽細胞におけるリソソームを評価した。健康な対照およびテイ・サックス病を含めた異なるＬＳＤ由来の線維芽細胞を、脂質刺激を伴ってまたは伴わずに、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）を用いて処理した。ＰＧＲＮは、テイ・サックス病患者の線維芽細胞におけるリソソームを有意に補正した。テイ・サックス病における、およびモジュレーターとしてのＰＧＲＮの役割をさらに評価するために、以下の研究を行った。
まず、ＰＧＲＮ ＫＯマウスにおいてＨｅｘＡタンパク質のレベルおよび同様にＨｅｘＢ（酵素（β−ヘキソサミニダーゼＡ）のベータサブユニットをコードする）のレベルを評価した。ＯＶＡ攻撃後（以前の実施例に上記されている）のＷＴおよびＰＧＲＮ ＫＯマウス由来の肺組織を、ＨｅｘＡおよびＨｅｘＢについて免疫組織化学的検査によって染色した（ＨｅｘＡ抗体ｓｃ−３７６７７７、およびＨｅｘＢ抗体ｓｃ−１３４５８１はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚからのものである）。結果は図３７に示されており、ＰＧＲＮマウスにおいてＨｅｘＡは凝集するがＨｅｘＢは凝集しないことを実証している。
また、高齢のＰＧＲＮ ＫＯマウスを、脳内のＧＭ２ガングリオシドについて評価した。高齢のＰＧＲＮ ＫＯマウス由来の脳組織を、ＧＭ２抗体を用いて免疫組織化学的検査によって染色し、ＷＴマウスと比較した（ＧＭ２抗体、Ｃａｔ番号３４５７５９、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。図３８は、高齢のＰＧＲＮ ＫＯマウスの脳内のＧＭ２が上昇したことを示している。したがって、ＰＧＲＮノックアウトを用いると、脳内にＨｅｘＡが凝集し、ＧＭ２が蓄積すると結論付ける。ＰＧＲＮが存在しないことにより、どちらもテイ・サックス病の指標である、ＧＭ２ガングリオシドの蓄積およびＨｅｘＡの変更がもたらされ、これにより、テイ・サックス病におけるＰＧＲＮの役割がさらに示され、テイ・サックス病患者および患者の細胞におけるＰＧＲＮの効果についてのさらなる論拠がもたらされる。
本発明は、その主旨または本質的な特性から逸脱することなく、他の形態に具体化することもでき、他のやり方で行うこともできる。したがって、本開示は、全ての態様において例示的であり、限定的なものではないとみなされるべきであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって示され、均等性の意味および範囲内に入る変化は全て、本発明の範囲内に包含されるものとする。
種々の参考文献が本明細書全体を通して引用されており、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (32)

  1. リソソーム蓄積症を治療または緩和するための組成物であって、単離されたＰＧＲＮまたはアトストリンを含めたその活性断片を含み、前記ＰＧＲＮまたは前記活性断片は、図４９または５０のいずれかにおいて示されているアミノ酸配列を含む、組成物。
  2. リソソーム蓄積症に対する酵素補充療法剤または基質低減療法剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  3. グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼおよびスフィンゴミエリナーゼのうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項２に記載の組成物。
  4. ゴーシェ病を治療または緩和するための、ＰＧＲＮまたはアトストリンをグルコセレブロシダーゼと組み合わせて含む、請求項２に記載の組成物。
  5. テイ・サックス病を治療または緩和するための、ＰＧＲＮまたはアトストリンをβ−ヘキソサミニダーゼＡと組み合わせて含む、請求項２に記載の組成物。
  6. １つまたは複数の分子シャペロンまたはリソソーム送達タンパク質をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記分子シャペロンまたは前記リソソーム送達タンパク質がＨＳＰ７０である、請求項６に記載の組成物。
  8. 医薬組成物であり、薬学的に許容される担体、ビヒクル、希釈剤または賦形剤をさらに含む、請求項１から７までのいずれかに記載の組成物。
  9. 動物におけるタンパク質または酵素のリソソーム送達を促進するための方法であって、前記動物に、単離されたＰＧＲＮまたはアトストリンを含めたその活性断片を投与することを含み、前記ＰＧＲＮまたは前記活性断片は、図４９または５０のいずれかにおいて示されているアミノ酸配列を含む、方法。
  10. 前記患者に、単離されたＰＧＲＮまたはアトストリンを含めたその活性断片を投与することを含み、前記ＰＧＲＮまたは前記活性断片が、図４９または５０のいずれかにおいて示されているアミノ酸配列を含む、ゴーシェ病の患者においてグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）の送達を促進するための、請求項９に記載の方法。
  11. 前記患者に、単離されたＰＧＲＮまたはアトストリンを含めたその活性断片を投与することを含み、前記ＰＧＲＮまたは前記活性断片が、図４９または５０のいずれかにおいて示されているアミノ酸配列を含む、テイ・サックス病の患者においてβ−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）の送達を促進するための、請求項９に記載の方法。
  12. 動物においてリソソーム蓄積症を治療または緩和するための方法であって、前記動物に、単離されたＰＧＲＮまたはアトストリンを含めたその活性断片を投与することを含み、前記ＰＧＲＮまたは前記活性断片は、図４９または５０のいずれかにおいて示されているアミノ酸配列を含む、方法。
  13. 前記リソソーム蓄積症において減少している、存在しない、変異しているまたは変更されている１つまたは複数のリソソーム酵素をさらに投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記リソソーム蓄積症が、ゴーシェ病（ＧＤ）、テイ・サックス病、ファブリー病、ファーバー病、サンドホフ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、クラッベ病、ニーマン・ピック病（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型）、ポンペ病、ムコリピドーシスＩＩ型（ハンター症候群）、ムコリピドーシスＩＩＩＡ型、小児性遊離シアル酸蓄積症（ＩＳＳＤ）、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、ウォルマン病およびサラ病から選択される、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記リソソーム蓄積症が、ゴーシェ病（ＧＤ）、テイ・サックス病（ＴＳＤ）、ムコリピドーシス（ＭＬ）、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ファーバー病（ＦＤ）およびクラッベ病（ＫＤ）から選択される、請求項１２に記載の方法。
  16. ゴーシェ病を治療または緩和するために、リソソーム酵素グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）またはその活性断片もしくは組換え型をさらに投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
  17. テイ・サックス病を治療または緩和するために、リソソーム酵素β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）またはその活性断片もしくは組換え型をさらに投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
  18. リソソーム酵素が、グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼおよびスフィンゴミエリナーゼのうちの１つまたは複数から選択される、請求項１２に記載の方法。
  19. 動物においてリソソーム蓄積症を診断または評価するための方法であって、前記動物においてＰＧＲＮの発現もしくは活性を決定することまたはＰＧＲＮをコードするゲノムＤＮＡもしくは遺伝子の１つもしくは複数の変異を検出することを含む、方法。
  20. 前記動物において、さらに１つもしくは複数のリソソーム酵素の発現もしくは活性を決定することまたは１つもしくは複数のリソソーム酵素をコードするゲノムＤＮＡもしくは遺伝子の１つもしくは複数の変異を検出することを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 動物においてゴーシェ病を診断または評価するための、請求項１９に記載の方法。
  22. 前記動物において、さらにＧＢＡの発現もしくは活性を決定することまたはＧＢＡをコードするゲノムＤＮＡもしくは遺伝子の１つもしくは複数の変異を検出することを含む、ゴーシェ病を診断または評価するための、請求項１９に記載の方法。
  23. ｒｓ４７９２９３７、ｒｓ８５０７１３、ｒｓ７８４０３８３６、ｒｓ５８４８、ならびに３つの点変異、ｐ．Ｃ３１５Ｓ、ｐ．Ｅ３１６Ｑ、およびｐ．Ｐ３６５Ａから選択される１つまたは複数のＰＧＲＮ変異が決定される、請求項１９から２２までのいずれかに記載の方法。
  24. ｒｓ４７９２９３７、ｒｓ８５０７１３、ｒｓ７８４０３８３６、ｒｓ５８４８、ならびに３つの点変異、ｐ．Ｃ３１５Ｓ、ｐ．Ｅ３１６Ｑ、およびｐ．Ｐ３６５Ａから選択される１つまたは複数のＰＧＲＮ変異が決定される、請求項２２に記載の方法。
  25. プライマーが、変異ｒｓ４７９２９３７についてはフォワードプライマー、５’−ＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＡ ＣＣＡＴＣＣＴＴＣ−３’（配列番号１１）、リバースプライマー５’−ＣＴＣＣＣＡＡＡＧＣ ＧＡＴＴＣＴＣＣＴＡ−３’（配列番号１２）、およびＴａｑｍａｎタグ配列５’−ＴＣＡＧＴＡＧＣＴＣＡＣＡ［Ｔ／Ｃ］ＴＴＧＴＡＡ−３’（配列番号１３）；変異ｒｓ８５０７１３については、フォワードプライマー５’−ＣＣＴＴＣＣＣ Ｔ ＧＡＧＴＧＧＧＣＴＧＧＴＡ−３’（配列番号１４）、リバースプライマー５’−ＡＧＴ ＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＡＧ Ｃ−３’（配列番号１５）、およびＴａｑｍａｎタグ配列５’−ＡＧＧＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＧＧ ＧＡＧＡＴＧＧＧＧ［Ａ／Ｇ］ＴＡＴＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＧＴＧＧＧ ＧＧＣＡＧＡＧ−３’（配列番号１６）；変異ｒｓ７８４０３８３６については、フォワードプライマー５’−ＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣ−３’（配列番号１７）、リバースプライマー５’−ＧＣＧＧＡＣＣＴＧＴＡＡＧＣＡＴＧＡＡＴ−３’（配列番号１８）、およびＴａｇｍａｎタグ配列５’−ＡＧＧＡＡＧＡＣ［Ｇ／Ｃ］ＴＧＡＴＴＴＴ−３’（配列番号１９）；変異ｒｓ５８４８については、フォワードプライマー５’−ＣＣＡＧＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧ−３’（配列番号２０）、リバースプライマー５’−ＣＡＣＡＧＧＧＴＣＣＡＣＴＧＡＡＡＣＧ−３’（配列番号２１）、およびＴａｑｍａｎタグ配列ＴＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣＣＴＣＣＣＴＡＧＣＡＣＣＴＣ［Ｃ／Ｔ］ＣＣＣＴＡＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＣＣＣ（配列番号２２）から選択され、ｐ．Ｃ３１５Ｓ、ｐ．Ｅ３１６Ｑ、およびｐ．Ｐ３６５Ａの点変異については、ＰＣＲ増幅のためのプライマーがフォワードプライマー５’−ＧＧＴＧＧＴＧＴＡＡＧＣＧＧＴＡＣ ＣＣＴ−３’（配列番号２３）およびリバースプライマー５’−ＡＣＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＧＣ−３’（配列番号２４）を含む、Ｔａｇｍａｎ遺伝子型決定法、その後の配列決定によってＰＧＲＮ ＳＮＰ部位が決定される、請求項２４に記載の方法。
  26. ＰＧＲＮの存在または活性および量を検出することによって動物におけるリソソーム蓄積症を診断または評価するためのキットであって、
    （ａ）所定量の、ＰＧＲＮの検出可能に標識した特異的な結合パートナー、またはＰＧＲＮを対象とする抗体と、
    （ｂ）他の試薬と、
    （ｃ）前記キットを使用するための指示と
    を含む、キット。
  27. 動物におけるＰＧＲＮ変異の存在を検出することによって前記動物におけるリソソーム蓄積症を診断または評価するためのキットであって、
    （ａ）ＰＧＲＮ遺伝子またはコードするＤＮＡに特異的であるかまたはそれを対象とする１つまたは複数の核酸プローブまたはプライマーと、
    （ｂ）他の試薬と、
    （ｃ）前記キットを使用するための指示と
    を含む、キット。
  28. １つまたは複数の核酸プライマーまたはプローブが、ｒｓ４７９２９３７、ｒｓ８５０７１３、ｒｓ７８４０３８３６、ｒｓ５８４８、ならびに３つの点変異、ｐ．Ｃ３１５Ｓ、ｐ．Ｅ３１６Ｑ、およびｐ．Ｐ３６５Ａから選択されるＰＲＮ変異に特異的であるかまたは前記ＰＲＮ変異の検出もしくは決定に適している、請求項２７に記載のキット。
  29. ＧＢＡの検出可能に標識した特異的な結合パートナーもしくはＧＢＡを対象とする抗体またはＧＢＡ遺伝子もしくはコードするＤＮＡに特異的であるかもしくはそれを対象とする１つもしくは複数の核酸プローブもしくはプライマーをさらに含む、ゴーシェ病を診断または評価するための、請求項２６から２８までのいずれかに記載のキット。
  30. ゴーシェ病の動物モデルであって、変更されたＰＧＲＮを含み、ＰＧＲＮがヌルであるか、存在しないか、または変異しており、かつマクロファージにおいてリソソーム基質β−ＧｌｃＣｅｒが増加している、動物モデル。
  31. ゴーシェ病に関連するＧＢＡ変異をさらに含むか、またはＧＢＡがヌルであるかもしくは存在しない、請求項３０に記載の動物モデル。
  32. テイ・サックス病の動物モデルであって、変更されたＰＧＲＮを含み、ＰＧＲＮがヌルであるか、存在しないか、または変異しており、かつマクロファージにおいてリソソーム基質β−ヘキソサミニダーゼＡが増加している、動物モデル。
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