CN111655289A - 组合治疗剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于基于向受试者给予靶向多种死亡受体诱导系统的至少三种剂的组合来治疗炎性疾病的新型治疗(方法、用途和组合物)，所述组合包含：(1)第一剂，所述第一剂中和受体TNFR1或其配体；和(2)第二剂，所述第二剂中和以下中的任一者：(2a)TRAIL‑R或其配体；或者(2b)CD95或其配体；以及(3)第三剂，所述第三剂中和以下中的任一者：(3a)TLR3或TLR4或任一者的配体；或者(3b)作为表1中所示的TNF受体超家族成员的另一种不同受体或其配体；(3c)半胱天冬酶；(3d)RIPK1。

Description

组合治疗剂

技术领域

本发明总体上涉及用于用TNF抑制剂或相关的剂治疗疾病的改善的方法和材料。

背景技术

肿瘤坏死因子(TNF)是炎症的主要诱因¹，并且患有许多不同的自身免疫疾病的患者可以成功地用单独的或与其他药物组合的TNF抑制剂成功地治疗²。

然而，用TNF抑制剂进行的疗法并不总是有效的；例如，仅约50％的患有类风湿性关节炎(RA)的患者，约65％的患有银屑病的患者和约60％-80％的患有炎性肠病(IBD)的患者对用TNF抑制剂进行的治疗有反应^3,4。

此外，存在患者并未从用TNF抑制剂进行的治疗获益的许多其他疾病⁵。

Croft和Siegel(Nature Reviews Rheumatology 13.4(2017):217-233)讨论了TNF超家族(TNFSF)的某些成员作为风湿性疾病的未来疗法的靶标的可能性。他们指出，TNFSF成员启动若干过程，包括免疫激活、组织炎性应答和细胞死亡或抑制。关于例如在患有RA的对于TNF阻断剂没有反应的患者中阻断组织炎症，特别强调中和除TNF之外，TNFSF的TWEAK和LIGHT成员(第229页)。

JP2002114800涉及基于受体序列并且被报告具有针对TNF、TRAIL和FasL的抑制性活性的肽。据称这些可用于抑制由这些配体引起的细胞凋亡和炎症。

此外，对于患有包括但不限于由TNF以外的机制驱动的(自身)炎性、自身免疫性和其他疾病(诸如以上列出的那些)的疾病的患者需要新的治疗策略。提供此类新型治疗将为本领域做出贡献。

发明内容

诸位发明人基于由阻断(或以其他方式抑制)配体或其受体的剂的组合介导的对细胞死亡的抑制(任选地结合阻断(或以其他方式抑制)外在细胞凋亡和坏死性凋亡的介体)来使用炎性疾病的新型模型提供此类疾病的新型组合疗法。

此类配体的例子包括TNF超家族的成员。

除TNF本身之外，其他TNF超家族成员，包括但不限于淋巴毒素(LT)-α、LT-β、CD95配体(CD95L；也称为FasL或APO-1L)、TRAIL(也称为Apo2L)、TWEAK和TL1A以及模式识别受体(PPR)(包括但不限于称为toll样受体(TLR)3的PRR)的配体，能够诱导细胞死亡^10,11。

具体地，诸位发明人示出，关于此类靶标的组合干预可以导致协同效应。

以非限制性举例的方式，小鼠炎症模型中TNF超家族受体(TNFR1、TRAIL-R和CD95)的组合消除或损伤完全预防炎症，而单独地靶向这些受体不具有此作用。

进一步以非限制性举例的方式，与仅单独地靶向这些受体中的两个(TNFR1与TRAIL-R，或TNFR1与TLR3)相比，小鼠炎症模型中TNF超家族受体TNFR1和TRAIL-R与TLR3(toll样受体)的组合消除提供了对炎症的改善缓解。

在下文中描述了诸位发明人的支持本发明的其他发现。

表1-TNF受体超家族成员和对应的同源配体

诸位发明人的这些发现证明了，多种死亡受体诱导系统(TNFR1、TRAIL-R和/或CD95，加上第三靶标)可以组合作用而导致炎症相关疾病，它们确实可以彼此补偿，并且因此这些疾病的治疗可以通过组合阻断此类系统来改善。

如以下所解释，抑制由这些受体介导的细胞死亡可以有利地与抑制半胱天冬酶(Caspase)的活性，优选地与抑制受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)和/或MLKL组合。

在下文中更详细地解释这些组合疗法。

这对于其中例如TNF(或其他TNF超家族配体诸如LT-β)作为单一剂未起作用的疾病具有特定的影响。疾病的例子包括炎症和炎症相关疾病，包括但不限于自身免疫疾病、神经炎性疾病、神经退行性疾病、缺血性疾病、败血症和癌症。

本发明的多方面提供了在用于治疗本文所述的疾病的方法或药物制造中的剂的组合，所述剂中和或降低TNF受体超家族成员或其相应配体以及其他能够诱导细胞死亡的受体或配体(诸如TLR3或TLR4及其配体)和/或外在细胞凋亡和坏死性凋亡的介体的生物活性。此类剂可以降低(例如)TNF/LT-α、TRAIL、CD95L或TNFR1、TRAIL-R、CD95、RIPK1、TLR3、TLR4、半胱天冬酶-8、RIPK3和MLKL的生物活性。

本发明的方法可以中和死亡受体或死亡配体以抑制细胞死亡或导致对细胞死亡的抑制，在炎症疾病中具有治疗益处。这通过抑制或预防由TNF/LT-α、TRAIL、CD95L、dsRNA、LPS和/或TNFR1、TRAIL-R、CD95、TLR3、TLR4导致的细胞死亡的激活或者抑制或预防由RIPK1、RIPK3、MLKL或半胱天冬酶-8导致的细胞死亡的激活来实现。

先前已经示出，TNF可以通过诱导异常细胞死亡而导致炎症^6,7。在此之前，教条一直是，TNF通过诱导异常高水平的基因激活而导致炎症和自身免疫性。在此发现的基础上，提出了在具有疾病的由TNF诱导的细胞死亡病源学的患者中，TNF抑制可以通过抑制异常的由TNF诱导的细胞死亡而非TNF诱导的基因激活来起作用⁸。

此外，先前已经示出，半胱天冬酶-8和RIPK3/MLKL的缺失在某些炎症模型中预防皮炎。此外，先前已经示出，小鼠炎症模型中的致死性皮炎通过由TNFR1介导(但也不依赖于TNFR1)的由过量半胱天冬酶-8驱动的细胞凋亡引发，这表明由TNFR1非依赖性但同时RIPK1激酶和半胱天冬酶-8依赖性细胞凋亡产生的病理学(参见例如2015年5月20-23日在比利时根特举办的第15届TNF国际会议呈递的摘要)。

然而，这些较早的公开内容并未传授或提出本发明的组合疗法。

因此，根据本发明的一方面，提供了一种用于治疗受试者的炎性疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予

一种至少3种剂的组合治疗，所述组合包含：

(1)第一剂，所述第一剂中和受体TNFR1或其配体；和

(2)第二剂，所述第二剂中和以下中的任一者：(2a)TRAIL-R或其配体；

或者(2b)CD95或其配体；以及

(3)第三剂，所述第三剂中和以下中的任一者：(3a)TLR3或TLR4或任一者的配体；或者(3b)作为表1中所示的TNF受体超家族成员的另一种不同受体或其配体；(3c)半胱天冬酶；或者(3d)RIPK1。

在此上下文中，“中和”应被理解为意指直接(例如通过结合相关靶标)或间接调节生物活性。如本文所用，术语“生物活性”意指由蛋白质\受体(结合配偶体)之间的相互作用产生的任何可观察到的作用。在本发明的上下文中，生物活性的非限制性例子包括本文讨论的基因(例如，细胞凋亡或坏死性凋亡中涉及的那些)的信号传导和调节。

“中和”不暗示完全失活。调节通常是与剂不存在的情况下所见的活性相比相关生物活性的抑制，即降低或减弱。

中和通常通过以下来实现：(i)防止或抑制配体与受体结合；(ii)破坏由这种结合产生的受体/配体复合物。

本发明还提供了一种增强任一种剂(例如，第一剂)治疗受试者的炎性疾病的治疗有效性的方法，所述方法包括向个体给予其他两种剂。

在一个实施方案中，所述第一剂中和TNF和/或LT-α。在一个实施方案中，所述第一剂中和TNF。

在一个实施方案中，所述第二剂中和TRAIL-R中的任一种或组合，或者中和TRAIL。在一个实施方案中，所述第二剂中和TRAIL-R2。

在一个实施方案中，所述第三剂中和CD95或中和CD95L。

因此，本发明涵盖以下的使用：

(1)中和TNF和/或LT-α的剂；

(2)中和TRAIL-R或TRAIL的剂；

(3)中和CD95L的剂。

在另一个实施方案中，所述第三剂中和TLR3或TLR4，或者中和TLR3或TLR4的配体。

在一个实施方案中，所述第二剂中和CD95或中和CD95L。

在一个实施方案中，所述第三剂中和TLR3或TLR4，或者中和TLR3或TLR4的配体。

因此，本发明涵盖以下的使用：

(1)中和TNF和/或LT-α的剂；

(2)中和CD95或CD95L的剂；

(3)中和TLR3的剂。

在另一个实施方案中，所述第三剂中和一种或多种半胱天冬酶(例如，半胱天冬酶8和/或半胱天冬酶10)，并且使用中和RIPK3和/或MLKL的第四剂。

在另一个实施方案中，所述第三剂中和LT-β。

在另一个实施方案中，所述第三剂中和RIPK1。

如以下所解释，还可以使用第四剂和其他另外的剂。

例如，当尚未包括在组合疗法中时，第四剂可以中和一种或多种半胱天冬酶(例如，半胱天冬酶8)，并且任选的第五剂可以中和RIPK3和/或MLKL。

其他另外的剂包括本领域已知的另外的抗炎生物剂或抗炎化学剂。在一个实施方案中，所述另外的抗炎生物剂或化学剂是口服或局部皮质类固醇。

本发明的具体示例性实施方案包括：

使用中和TNF/LT-α、TRAIL、CD95L、dsRNA(结合TLR3)、LPS(结合TLR4)中的一种或多种和/或中和TNFR1/TRAIL-R/CD95/TLR3中的一种或多种和/或减弱TNF/LT-α/TNFR1、TRAIL/TRAIL-R、CD95L/CD95、dsRNA/TLR3、LPS/TLR4的一种或多种相互作用的剂的组合。

使用减弱RIPK1、RIPK3、MLKL或半胱天冬酶-8的活性的剂与上述组合的组合。

使用防止或抑制配体TNF/LT-α、TRAIL、CD95L、dsRNA、LPS分别结合受体TNFR1、TRAIL-R、CD95、TLR3、TLR4或者破坏由这种结合产生的TNF/LT-α/TNFR1、TRAIL/TRAIL-R、CD95L/CD95、dsRNA/TLR3、LPS/TLR4复合物的剂的组合。

使用防止或抑制由上文所述的配体-受体结合产生的RIPK1、RIPK3、MLKL或半胱天冬酶-8的活性的剂。

剂的例子

在下文中更详细地描述了适用于本发明的中和剂的例子。它们包括结合并中和受体或配体的小分子、抗体或其片段、干扰受体或配体的表达的单链或双链核苷酸(DNA、RNA(siRNA、miRNA、shRNA)、PNA、DNA-RNA杂交分子)。

因此，以非限制性举例的方式，本发明可以使用以下的组合：结合TNFR1、TRAIL-R(优选TRAIL-R1和/或TRAIL-R2)、CD95、TLR3或TLR4的剂-例如特异性地结合TNFR1、TRAIL-R(优选TRAIL-R1和/或TRAIL-R2)、CD95、TLR3、TLR4的抗体或其片段，或特异性地结合TLR3或TLR4从而中和它们的活性例如阻断受体介导的细胞内信号传导的小分子或其片段。

本发明可以使用结合RIPK1、RIPK3、MLKL或半胱天冬酶-8的剂。例如，特异性地结合RIPK1、RIPK3、MLKL或半胱天冬酶-8从而中和它们的活性例如阻断激酶或蛋白酶活性的小分子其片段。

所述例子可以使用剂，其中的每个是融合蛋白，所述融合蛋白包含：TNFR1、TRAIL-R(优选TRAIL-R2或TRAIL-R1)、CD95、TLR3、TLR4的细胞外或其他结构域或其部分，与人抗体的一部分(优选Fc结构域或其部分)融合，具有或不具有抗体铰链区或其部分。

本发明使用作为单链或双链核苷酸(DNA、RNA(sIRNA、rhiRNA、shRNA)、PNA、DNA-RNA杂交分子)的剂，其例如通过结合RNA转录物以便例如减少表达来干扰TNF/LT-α、TRAIL、CD95L和/或TNFR1、任一种TRAIL-R(优选TRAIL-R1和/或TRAIL-R2)、CD95、TLR3、TLR4和/或RIPK1、RIPK3、MLKL或半胱天冬酶-8表达。

使用通过以下降低TNFR1、任一种TRAIL-R(优选地TRAIL-R1和/或TRAIL-R2)、CD95、TLR3、TLR4的生物活性的剂：

(a)减少受体的表达；

(b)增加受体脱敏或受体降解；

(c)减少TNF/LT-α、TRAIL、CD95L、dsRNA、LPS与相应内源受体之间的相互作用；

(d)减少受体介导的细胞内信号传导；

(e)与内源受体竞争结合TNF/LT-α、TRAIL、CD95L、dsRNA、LPS；

(f)结合受体以阻断TNF/LT-α、TRAIL、CD95L、dsRNA、LPS结合；或者

(g)结合TNF/LT-α、TRAIL、CD95L、dsRNA、LPS，从而防止与受体的相互作用。

(h)降低RIPK1和RIPK3的激酶活性；

(i)降低半胱天冬酶-8的蛋白酶活性；

(j)减少RIPK1、RIPK3、MLKL和/或半胱天冬酶-8的表达；

(k)减少RIPK1与RIPK3和/或半胱天冬酶-8的相互作用；

(l)减少RIPK3与MLKL的相互作用；

(m)减少RIPK1、RIPK3、MLKL和/或半胱天冬酶-8的细胞内信号传导作用于权利要求中引用的配体的抑制剂是可商购的或描述于本文中。

优选的抑制剂在表2中示出。

表2：可以在本发明中使用的抑制剂

现在更详细地描述这些中的一些：

已经在临床中广泛地使用TNF的阻断，并且存在若干种可用的TNF(信号传导)抑制剂²。可商购的单克隆TNF中和抗体或重组蛋白是例如：依那西普/Enbrel(Amgen,Pfizer)，它是中和TNF和LT-α的TNFR2免疫球蛋白融合蛋白；英利昔单抗/类克，来自(Johnson&Johnson)；阿达木单抗/Humira，来自(AbbVie Inc.)；戈利木单抗/欣普尼(JanssenBiotech)；赛妥珠单抗/Cimzia(UCB)。

对于LT-β的抑制，作为LT-β受体-免疫球蛋白融合蛋白的贝奈西普是可用的。

本发明可以利用通过以下降低TRAIL-R中的任一种或组合(优选TRAIL-R1和/或TRAIL-R2)或TRAIL的生物活性的剂：

(a)减少一种或多种受体的表达；

(b)增加受体脱敏或受体降解；

(c)减少TRAIL与一种或多种作为内源受体的受体之间的相互作用；

(d)减少受体介导的细胞内信号传导；

(e)与一种或多种内源受体竞争结合TRAIL；

(f)结合一种或多种受体以阻断TRAIL结合；或

(g)结合TRAIL，从而防止与一种或多种受体的相互作用。

对于结合并中和TRAIL的剂，结合并中和TRAIL的抗体或其片段。

可商购的单克隆TRAIL中和抗体是例如来自Enzo的抗人TRAIL克隆2E5(http://www.enzolifesciences.com/ALX-804-296/trail-human-mab-2e5/)和来自Abcam的抗TRAIL抗体[75411.11](ab10516)(http://www.abcam.com/TRAIL-antibody-75411-11-ab10516.html)。

如以上所解释，适用于本发明的TRAIL-R2-Fc融合蛋白描述于WO 2015001345中。本发明可以使用作为融合蛋白的剂，所述融合蛋白包含：TRAIL-R(优选TRAIL-R2)的细胞外结构域或其部分，与人抗体的一部分(优选Fc结构域或其部分)融合，具有或不具有抗体铰链区或其部分。

本发明可以利用结合TRAIL-R2的剂，例如特异性地结合TRAIL-R2从而中和其活性的抗体或其片段。

本发明可以利用结合TRAIL-R1的剂，例如特异性地结合TRAIL-R1从而中和其活性的抗体或其片段。

本发明可以利用结合TRAIL-R1和TRAIL-R2的剂，例如特异性地结合TRAIL-R1和TRAIL-R2从而中和它们的活性的抗体或其片段。

由与人IgG1的Fc区融合的人CD95的细胞外结构域组成的CD95L结合蛋白已经用于阻断CD95信号传导^12,13。CD95L抑制剂包括Apogenix的APG101(Asunercept)。

恩利卡生是适用于针对半胱天冬酶的口服有活性的泛半胱天冬酶蛋白酶抑制剂。

抑制TLR3信号传导可以通过充当结合TLR3的dsRNA的直接、竞争性和高亲和力抑制剂的小分子来实现¹⁴。

与TLR3一样，已知TLR4能够诱导细胞死亡。TLR4的配体是LPS(脂多糖)。Gao等人(2017)讨论了使用靶向TLR信号以治疗(特别是)炎性障碍的各种TLR抑制剂/拮抗剂。

普纳替尼和帕唑帕尼是已知的MLKL抑制剂。Kongensin A和雷公藤红素是已知的RIPK3抑制剂。

在本发明的一个实施方案中，所述剂包含三种剂的组合：

·TNF抑制剂(例如，Enbrel、Humira或类克)，

·CD95L的抑制剂(例如，Asunercept)以及

·TRAIL的抑制剂(例如，TRAIL-R2-Fc)

在另一个实施方案中，前述组合与RIPK1的激酶活性的抑制剂组合。

伴随诊断

本发明提供用于患者选择，例如患有已经证明用TNF抑制剂或TNF抑制剂进行的治疗难治的疾病的个体。

本发明可以包括针对过表达受体、配体或靶标的组合中的一个、多个或全部来筛选患者，本发明的治疗方法基于所述受体、配体或靶标的组合中和。例如TNF、LT-α、TRAIL和CD95L等。

可以这样做，以便针对用本文所述的剂进行的治疗选择或排除患者(“伴随诊断”)。例如，所述方法可以包括评估所述靶是否高于某一阈值表达，以及如果超过所述阈值，则用本文所述的组合治疗来治疗患者。

对于伴随诊断，使用包含核酸或蛋白质的典型样品，其可以选自：组织、活检探针、细胞裂解物、细胞培养物、细胞系、器官、细胞器、生物流体、血液样品、尿液样品、皮肤样品等。

例如，在诊断炎性疾病或炎症相关疾病时可以从患者获取血液或活检物，并且针对相关靶标进行筛选。

通过RNA或蛋白质水平评估基因表达的方法是本领域已知的。RNA水平可以通过本领域技术人员已知的任何方法例如像差异筛选、消减杂交、差异显示和微阵列来测量。用于使用对于蛋白质具有特异性的多克隆或单克隆抗体检测蛋白质并测量蛋白质的表达的各种方案是本领域已知的。例子包括蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。

优选的例子包括组织病理学分析、免疫组织化学(IHC)、原位杂交、RNAscope或流式细胞术(FACS)。实时定量PCR的使用多年来已经用于定量基因表达(参见例如Giulietti,Annapaula,等人Methods 25.4(2001):386-401)。

此外，针对许多靶标的测定例如可从Abcam(人FAS配体ELISA试剂盒；人TRAILELISA试剂盒等)、R&D Systems(人TNF-αQuantikine ELISA试剂盒)等商购获得。

替代性地或另外，本发明可以包括针对细胞死亡标记物筛选患者。

例如，在诊断炎性疾病或炎症相关疾病时可以从患者获取血液或活检物，并且针对细胞死亡标记物诸如切割的半胱天冬酶-3或TUNEL阳性进行筛选。替代性地，已经用例如抗炎药物或用抗TNF治疗并且对于此类治疗难治的患者也可以经历此筛选。如果证明患者对于细胞死亡标记物是阳性的，则他们可以被选择进行根据本发明的治疗。

可商购的用于检测细胞死亡的诊断试剂盒是例如Merck Millipore的ApopTagRed原位细胞凋亡检测试剂盒，用于检测作为细胞死亡标记物的DNA链断裂。此试剂盒对于福尔马林固定的组织是特别有效的。

另一种可商购的用于检测细胞死亡的诊断技术是对切割的(即，激活的)半胱天冬酶-3的原位检测(Cell Signalling,9664)¹¹。替代性地，细胞死亡可以通过CellTiter-Glo发光细胞活力测定试剂盒(Promega)或通过使用DNA嵌入剂或抗体进行的FACS分析进行检测⁹。

本发明还提供了此类细胞死亡检测工具作为本发明的伴随诊断的用途。

本发明还包括此类试剂盒用于确定通过本文所述的剂的组合进行的治疗在受试者中的有效性的可能性的用途。

炎性疾病

“炎性疾病”包括炎症和炎症相关疾病，包括自身免疫性和癌症。

例子包括若干炎性和自身免疫疾病，包括炎性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、银屑病、视网膜脱离(和变性)、视网膜色素变性、黄斑变性、胰腺炎、特应性皮炎、关节炎(包括类风湿性关节炎、脊柱关节炎、痛风、全身型幼年特发性关节炎(SoJIA)、银屑病性关节炎)、系统性红斑狼疮(SLE)、舍格伦综合征、系统性硬皮病、抗磷脂综合征(APS)、血管炎、骨关节炎、肝损伤/疾病(非酒精性脂肪性肝炎、酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性肝胆疾病、原发性硬化性胆管炎(PSC)、对乙酰氨基酚毒性、肝毒性)、肾损害/损伤(肾炎、肾移植、手术、给予肾毒性药物例如顺铂、急性肾损伤(AKI))、乳糜泻、自身免疫性特发性血小板减少性紫癜(自身免疫性ITP)、移植排斥反应、实体器官的缺血性再灌注损伤、败血症、全身炎症反应综合征(SIRS)、脑血管意外(CVA，中风)、心肌梗死(MI)、动脉粥样硬化、亨廷顿病、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、新生儿缺氧性脑损伤、变态反应性疾病(包括哮喘和特应性皮炎)、烧伤(烧伤损伤，烧伤休克)、多发性硬化、I型糖尿病、韦格纳肉芽肿(Wegener's granulomatosis)、肺结节病、贝切特病(Behcet'sdisease)、白介素-1转化酶(ICE，也称为半胱天冬酶-1)相关发热综合征、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、香烟烟雾诱发的损伤、囊性纤维化、肿瘤坏死因子受体相关周期性综合征(TRAPS)、赘生性肿瘤、牙周炎、NEMO-突变(NF-κB必需调节物基因(也称为IKK-γ或IKKG)的突变)、具体地NEMO缺陷综合征、HOIL-1突变((也称为RBCK1)血红素氧化的IRP2泛素连接酶-1缺陷)、HOIP突变((也称为RNF31)HOIL-1相互作用蛋白)、XIAP突变((也称为BIRC4)X连接的细胞凋亡抑制剂)、OTULIN突变((也称为FAM105B)具有线性连接特异性的OTU去泛素化酶)、CYLD突变(圆柱瘤)、SPATA2突变(精子发生相关蛋白2)、A20突变(也称为TNFAIP3)、FADD突变(Fas相关死亡结构域)、半胱天冬酶-8突变或血液和实体器官恶性肿瘤、细菌感染和病毒感染(诸如流感、葡萄球菌属和分枝杆菌属(结核病))和溶酶体贮积病(具体地，戈谢病，并且包括GM2神经节苷脂贮积症、α-甘露糖苷贮积症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸病、Danon病、法布里病(Fabry disease)、法伯病(Farber disease)、岩藻糖苷贮积症、半乳糖苷唾液酸贮积症(galactosialidosis)、GM1神经节苷脂贮积症、粘多糖症、婴儿游离唾液酸贮积病、幼年己糖胺酶A缺乏症、克拉伯病(Krabbe disease)、溶酶体酸脂酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、粘多糖贮积症(mucopolysaccharidoses disorders)、多种硫酸酯酶缺乏症、尼曼-匹克病、神经元蜡样脂褐质沉积症(neuronal ceroid lipofuscinoses)、庞贝症(Pompe disease)、致密性成骨不全症、山德霍夫病(Sandhoff disease)、辛德勒病(Schindler disease)、唾液酸贮积病、泰-萨二氏病(Tay-Sachs)和沃尔曼病(Wolman disease))、史蒂芬斯-强森综合征、中毒性表皮坏死松解症以及移植器官、组织和细胞的排斥反应和任何类型的炎症相关癌症。

在一个实施方案中，炎性疾病由HOIL-1、HOIP或OTULIN缺陷，例如突变中的任一种导致(参见例如Krenn,Martin,等人“Mutations outside the N-terminal part of RBCK1may cause polyglucosan body myopathy with immunological dysfunction:expandingthe genotype-phenotype spectrum.”Journal of neurology(2017):1-8；Boisson,Bertrand,等人“Human HOIP and LUBAC deficiency underlies autoinflammation,immunodeficiency,amylopectinosis,and lymphangiectasia.”Journal ofExperimental Medicine 212.6(2015):939-951.)

在一个实施方案中，炎性疾病选自：自身免疫疾病，其任选地选自多发性硬化(MS)、肌萎缩侧索硬化(ALS)；神经炎性疾病，其任选地是肌营养不良；神经退行性疾病，其任选地选自帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病；缺血性疾病，其任选地选自心脏、肾或脑的缺血性疾病；败血症。

优选的靶疾病是表3中所述的那些，所述表3列出了TNF抑制被认为具有益处的疾病，包括某些患者还未成功地产生反应(例如，未对初始治疗产生反应或随时间丧失反应的患者)的那些。

表3：TNF抑制被认为具有益处的所选疾病

在一个最优选的实施方案中，所述炎性疾病选自类风湿性关节炎(RA)；银屑病；炎性肠病(IBD)。

在另一个实施方案中，所述炎性疾病是癌症，并且所述方法还包括向所述个体给予一种或多种另外的用于治疗所述癌症的剂或者对所述个体进行放疗。任选地，所述一种或多种另外的用于治疗所述癌症的剂选自化疗剂；免疫检查点抑制剂，其任选地选自抗PD-1/L1和/或抗CTLA-4抗体；基于细胞的疗法，其任选地选自诸如表达转基因嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的T细胞。

组合疗法

本发明的方法或治疗是利用至少3种剂的组合疗法。

所述剂可以同时或顺序给予，并且可以按个体变化的剂量表并经由不同的途径给予。例如，当顺序给予时，可以以紧密间隔(例如，5-10分钟的时间段)或以更长的间隔(例如，相隔1、2、3、4或更多个小时，或在需要时甚至更长时间的间隔)给予所述剂，精确的剂量方案与所述一种或多种治疗剂的特性相称。

所述剂(即，如在此所述的化合物加上一种或多种其他剂)可以按单一剂型一起配制，或者替代性地，单独剂可以单独配制并以试剂盒的形式一起提供，任选地连同其使用说明一起。

在另一个实施方案中，本发明中的组合疗法可以与至少一种其他治疗活性剂组合给予，其中所述另一种治疗活性剂选自溶栓剂、组织纤溶酶原激活物、抗凝剂、血小板聚集抑制剂、抗微生物剂(抗生素、广谱抗生素、β-内酰胺、抗分枝杆菌剂、杀细菌抗生素、抗MRSA疗法)、长效β激动剂、吸入型皮质类固醇和长效β激动剂的组合、短效β激动剂、白三烯调节剂、抗IgE、甲基黄嘌呤支气管扩张剂、肥大细胞抑制剂、酪氨酸蛋白激酶抑制剂、CRTH2/D前列腺素受体拮抗剂、肾上腺素吸入气雾剂、磷酸二酯酶抑制剂、磷酸二酯酶-3抑制剂和磷酸二酯酶-4抑制剂的组合、长效吸入型抗胆碱能药、毒蕈碱拮抗剂、长效毒蕈碱拮抗剂、低剂量类固醇、吸入型皮质类固醇、口服皮质类固醇、局部皮质类固醇、抗胸腺细胞球蛋白、沙利度胺、苯丁酸氮芥、钙通道阻断剂、局部润肤剂、ACE抑制剂、5-羟色胺再摄取抑制剂、内皮素-1受体抑制剂、抗纤维化剂、质子泵抑制剂、囊性纤维化跨膜传导调节物增效剂、粘液分解剂、胰腺酶、支气管扩张剂、眼科玻璃体内注射剂、抗血管内皮细胞生长因子抑制剂、睫状神经营养生长因子剂、三价(IIV3)灭活流感疫苗、四价(IIV4)灭活流感疫苗、三价重组流感疫苗、四价减毒活流感疫苗、抗病毒剂、灭活流感疫苗、睫状神经营养生长因子、基因转移剂、局部免疫调节剂、钙调磷酸酶抑制剂、干扰素γ、抗组胺药、单克隆抗体、多克隆抗T细胞抗体、抗胸腺细胞γ球蛋白马抗体、抗胸腺细胞球蛋白兔抗体、抗CD40拮抗剂、JAK抑制剂和抗TCR鼠mAb。

其他示例性治疗活性剂包括肝素、香豆定(Coumadin)、氯吡格雷(clopidrogel)、双嘧达莫、盐酸噻氯匹定、依替巴肽、阿司匹林、万古霉素、头孢吡肟、哌拉西林和他唑巴坦的组合、亚胺培南、美罗培南、多尼培南、环丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、莫西沙星、氢化可的松(hydrocortisone)、维多珠单抗、阿利弗森、remestemcel-L、艾克珠单抗、替曲吉珠单抗(tildrakizumab)、苏金单抗(secukinumab)、氯己定、多西环素、米诺环素、氟替卡松(丙酸氟替卡松、糠酸氟替卡松)、二丙酸倍氯米松、布地奈德、曲安奈德(trimcinoloneacetonide)、氟尼缩松、糠酸莫美他松、环索奈德、酒石酸阿福特罗、富马酸福莫特罗、昔美酸沙美特罗、沙丁胺醇(硫酸沙丁胺醇)、酒石酸左旋沙丁胺醇、溴化异丙托品、孟鲁司特钠、扎鲁司特、齐留通、奥马珠单抗、茶碱、色甘酸钠(cromulyn sodium)、奈多罗米钠、马赛替尼、AMG 853、茚达特罗、E004、瑞替珠单抗、沙丁胺醇、噻托溴铵、VR506、乐瑞吉珠单抗(lebrikizumab)、RPL554、阿柏西普、乌美溴铵、马来酸茚达特罗、阿地溴铵、罗氟司特、SCH527123、格隆溴铵、奥达特罗、糠酸氟替卡松和维兰特罗维兰特罗的组合、丙酸氟替卡松和沙美特罗的组合、糠酸氟替卡松和丙酸氟替卡松的组合、丙酸氟替卡松和富马酸福莫特罗二水合物的组合、福莫特罗和布地奈德的组合、二丙酸倍氯米松和福莫特罗的组合、糠酸莫米松和富马酸福莫特罗二水合物的组合、乌美溴铵和维兰特罗的组合、溴化异丙托品和硫酸沙丁胺醇的组合、格隆溴铵和马来酸茚达特罗的组合、格隆铵(glycopyrrolate)和富马酸福莫特罗的组合、阿地铵和福莫特罗的组合、异烟肼、ehambutol、利福平、吡嗪酰胺、利福布丁、利福喷汀、卷曲霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、氧氟沙星、乙硫异烟胺(ehionamide)、环丝氨酸、卡那霉素、链霉素、紫霉素、富马酸贝达喹啉(bedaquiline fumarate)、PNU-100480、德拉马尼、伊马替尼、ARG201、托珠单抗、莫罗单抗-CD3、巴利昔单抗、达利珠单抗、利妥昔单抗、泼尼松龙、抗胸腺细胞球蛋白、FK506(他克莫司)、甲氨蝶呤、环孢菌素、西罗莫司、依维莫司、霉酚酸钠、吗替麦考酚酯、环磷酰胺、硫唑嘌呤、沙利度胺、苯丁酸氮芥、硝苯地平、尼卡地平、硝化甘油、赖诺普利、地尔硫、氟西汀、波生坦、依前列醇、秋水仙碱、对氨基苯甲酸、二甲基亚砜、D-青霉胺、干扰素α、干扰素γ(INF-g))、奥美拉唑、甲氧氯普胺、兰索拉唑、埃索美拉唑、泮托拉唑、雷贝拉唑、伊马替尼、贝利木单抗、ARG201、托珠单抗、ivacftor、阿法链道酶(dornase alpha)、胰脂肪酶、妥布霉素、氨曲南、粘菌素甲烷磺酸钠、头孢羟氨苄一水化合物、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢唑啉、莫西沙星、左氧氟沙星、吉米沙星、阿奇霉素、庆大霉素、头孢他啶、甲氧苄啶和磺胺甲噁唑的组合、氯霉素、ivacftor和鲁玛卡托的组合、ataluren、NT-501-CNTF、编码肌球蛋白VIIA的基因转移剂(MY07A)、雷珠单抗、培加他尼钠、NT501、人源化sphingomab、贝伐珠单抗、奥司他韦、扎那米韦、金刚乙胺、金刚烷胺、乙氧萘青霉素(nafcillin)、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、柳氮磺胺吡啶、乙酰磺胺异噁唑、万古霉素、莫罗单抗-CD3、ASKP-1240、ASP015K、TOL101、吡美莫司、氢化可的松(hydrocortizone)、倍他米松、氟氢缩松、曲安西龙、氟轻松、氯倍他索、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、重组合成I型干扰素、干扰素α-2a、干扰素α-2b、羟嗪、苯海拉明、氟氯西林、双氟西林和红霉素。

在另一个实施方案中，本发明中的组合疗法可以与至少一种其他治疗活性剂组合给予-例如可以针对以上任何指示与其他抗炎剂组合给予，包括口服或局部皮质类固醇、5-氨基水杨酸和美沙拉嗪制剂、羟氯喹(hydroxyeloroquine)、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、环磷酰胺、环孢菌素、钙调磷酸酶抑制剂、霉酚酸、mTOR抑制剂、JAK抑制剂、Syk抑制剂、抗炎生物剂，包括抗IL-6生物制剂、抗IL-1剂(包括抗IL1β和抗IL-1α生物制剂)、抗I-17生物制剂、抗CD22、抗整合素剂、抗IFNα、抗CD20或CD4生物制剂、以及针对T细胞或B细胞受体或白介素的其他细胞因子抑制剂或生物制剂。

本文所述的方法可以包括向需要这种治疗的受试者给予“治疗有效”量的降低配体或受体的生物活性的剂。能够降低生物活性的剂可以通过多种方式实现它们的作用。例如，这种剂可以是(以非限制性举例的方式)减少受体的表达；增加受体脱敏或受体降解；减少配体与其内源受体之间的相互作用；减少受体介导的细胞内信号传导；与内源受体竞争结合配体；结合受体以阻断配体结合；或结合配体从而防止与其受体的相互作用的剂。

优选的是，所述剂直接与受体或配体相互作用。

在一个优选的实施方案中，所述剂结合受体或配体并阻断其活性，或者所述剂结合内源配体/受体并阻断内源配体/受体复合物适当地形成，使得其不再可以参与细胞内信号传导。

可以与此类靶标相互作用的生物治疗性药物的例子是抗体，例如人或人源化抗体。本发明中的抗体可以是单克隆、多克隆、嵌合、单链抗体或功能抗体片段。

生物治疗性药物的另一个例子是可溶性受体蛋白，例如可溶性受体-Fc融合蛋白，其含有受体的细胞外部分或其能够以抑制所讨论的相应配体(的受体刺激活性)的方式结合配体的至少一部分。

为了简洁起见，以下实施方案可以非限制性举例的方式关于TRAIL或TRAIL-R诸如TRAIL-R1或TRAIL-R2进行描述。然而，应理解，所有的这种讨论在经必要修改之后均适用于任何其他TRAIL-R，例如TRAIL-R1、TRAIL-R3或TRAIL-R4。还应理解，所有的这种讨论在经必要修改之后均适用于本文所述的其他配体及其相应的受体。

抗体

对于根据本发明的抗体的生产，可以通过注射以上提及的待靶向的蛋白质或具有免疫源性的两种蛋白质的任何片段来使不同的宿主物种免疫。

例如，可以针对全长人TRAIL序列来产生中和TRAIL活性的抗体。

根据宿主物种选择适当的佐剂，以便增加免疫应答。优先地，用于诱导针对它们的抗体应答的肽、片段或寡聚物将含有至少五个，但是优选地十个氨基酸。针对两种蛋白质的单克隆抗体可以使用通过培养连续细胞系提供抗体分子或这些抗体的重组和非重组功能片段的生产的任何技术来生产。这些技术包括但不限于杂交瘤技术和人B细胞杂交瘤技术。此外，可以使用针对嵌合抗体(例如，重组抗体)的生产而开发的技术。所得的抗体可以在具有或不具有修饰(诸如标记，抗体段的重组接合)或具有充当报告物的分子的情况下使用。修饰可以是共价的和/或非共价的。

许多不同的免疫测定和非免疫测定可以用于筛选以鉴定具有所需特异性的抗体。使用具有已经建立的特异性的多克隆或单克隆抗体进行竞争性结合和免疫放射测定的各种方案是本领域熟知的。这些免疫测定通常涉及测量受体或配体与其特异性抗体之间的复合物形成。基于单克隆的“夹心”(即，双侧)免疫测定是优选的，其包括针对两种非干扰性的蛋白质表位的单克隆抗体，但是也可以使用竞争性结合测定。

更具体地，优选的是，抗体是γ免疫球蛋白(IgG)。

应理解，抗体的可变区限定抗体的特异性，并且因此，此区域应保留在根据本发明的抗体的功能衍生物中。可变结构域以外的区域(C结构域)的序列是相对恒定的。应理解，根据本发明的抗体的表征特征是V_H和V_L结构域。还应理解，C_H和C_L结构域的准确性质总体而言对于本发明不是至关重要的。实际上，根据本发明的优选抗体可以具有非常不同的C_H和C_L结构域。此外，优选的抗体功能衍生物可以包含可变结构域而没有C结构域(例如，scFV抗体)。

抗体衍生物可以与多克隆混合物中的单克隆抗体或特异性抗体具有75％的序列同一性，更优选90％的序列同一性并且最优选具有至少95％的序列同一性。应理解，最大的序列变化可发生在框架区(FR)中，而抗体及其功能衍生物的CDR序列是最保守的。

本发明的多个优选实施方案涉及具有可变结构域和恒定结构两者的分子。然而，应理解，本发明还涵盖抗体片段(例如，scFV抗体)，其本质上包含抗体的可变区而没有任何恒定区。

已知在一种物种中生成的抗体当用于治疗不同的物种时，具有若干严重的缺点。例如，当在人类中使用鼠抗体时，它们往往在血清中具有短循环半衰期，并且被所治疗的患者识别为外来蛋白。这导致发生不想要的人抗小鼠(或大鼠)抗体应答。当需要频繁给予抗体时，这是特别麻烦的，因为它可增强抗体的清除，阻断其治疗作用，并且诱导超敏反应。因此，用于人类疗法的优选抗体(如果是非人来源的话)是人源化的。

单克隆抗体通过通常涉及生成非人mAb的杂交瘤技术生成。所述技术使得能够生产具有几乎任何特异性的啮齿类动物单克隆抗体。因此，本发明的优选实施方案可以使用这种技术来开发针对TRAIL受体的单克隆抗体。虽然此类抗体在治疗上是可用的，但是应理解，此类抗体在人类中不是理想的治疗剂(如以上所表明)。理想地，人单克隆抗体将是治疗应用的优选选择。然而，目前为止，使用常规细胞融合技术生成人mAb并不是特别成功。人源化的问题可以至少部分地通过使用来自非人(例如，啮齿类动物)mAb的V区序列和来自人抗体的C区(和理想地来自V区的FR)序列的工程化抗体来解决。所得的‘工程化’mAb在人类中比在产生它们的啮齿类动物mAb具有更少的免疫原性，并且因此更适于临床使用。

人源化抗体可以是嵌合单克隆抗体，其中使用重组DNA技术，啮齿类动物免疫球蛋白恒定区被人抗体的恒定区替代。然后可以将嵌合H链和L链克隆到含有合适的调节元件的表达载体中，并且诱导到哺乳动物细胞中以便产生完全糖基化的抗体。通过针对此过程选择适当的人H链C区基因，可以预先确定抗体的生物活性。此类嵌合抗体优于非人单克隆抗体，因为它们激活效应功能的能力可以针对特定治疗应用来定制，并且减少了它们所诱导的抗球蛋白应答。

此类嵌合分子是用于治疗根据本发明的疾病的优选剂。RT-PCR可以用于从优选的mAb分离V_H和V_L基因，克隆并用于构建具有人结构域的mAb的嵌合形式。

抗体的进一步人源化可涉及抗体的CDR移植或重构。此类抗体可以通过将啮齿类动物mAb的重链和轻链CDR(其形成抗体的抗原结合位点)移植到人抗体的对应框架区中来生产。

片段或融合蛋白

如本文所述的剂可以基于任选地与异源蛋白结构域融合或与非蛋白部分组合的受体的部分(例如，可溶性片段)。

以非限制性举例的方式，TRAIL抑制剂包含TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4或OPG的细胞外结构域(优选TRAIL-R2的细胞外结构域)，或其配体结合部分，或根据Walczak等人(Walczak,H.,Degli-Esposti,M.A.,Johnson,R.S.,Smolak,P.J.,Waugh,J.Y.,Boiani,N.,Timour,M.S.,Gerhart,M.J.,Schooley,K.A.,Smith,C.A.,等人(1997).TRAIL-R2:a novel apoptosis-mediating receptor for TRAIL.The EMBO journal 16,5386-5397)以及C.T.Rauch和H.Walczak(US 6569642B1)的专利(所述文献确切地通过引用并入本文)的成熟TRAIL-R2序列的细胞外结构域，所述细胞外结构域可以与异源多肽结构域特别是免疫球蛋白分子的包括或不包括铰链区或其部分的Fc部分(例如来自人IgG分子)，优选人IgG1、IgG2、IgG3或人IgG4的具有或不具有铰链区或其部分的Fc区融合。

两个完全人蛋白部分融合的方式可以按照降低所得融合蛋白的免疫源性可能性的方式进行，如Walczak(WO/2004/085478；PCT/EP2004/003239:“Improved Fc fusionproteins”)中所述。

因为存在表达的TRAIL-R2的两种剪接形式并且所述剪接影响TRAIL-R2的细胞外结构域(Screaton,G.R.,Mongkolsapaya,J.,Xu,X.N.,Cowper,A.E.,McMichael,A.J.,和Bell,J.I.(1997).TRICK2,a new alternatively spliced receptor that transducesthe cytotoxic signal from TRAIL.Current biology:CB 7,693-696.)，所以TRAIL-R2的具有不同氨基酸序列的至少两个细胞外结构域是已知的。在一个实施方案中，当构建TRAIL抑制性TRAIL-R2融合蛋白时，TRAIL-R2的细胞外结构域的TRAIL结合部分可以来自这两者中的任一者。

适用于本发明的TRAIL-R2-Fc融合体描述于WO 2015001345中，所述文献的特别是关于TRAIL-R2-Fc融合体的内容明确地通过交叉引用的方式并入本文。来自WO 2015001345的TRAIL-R2-Fc多肽在下文中列出。TRAIL-R2部分加下划线。Fc部分以粗体描绘。应注意，在TRAIL-R2部分与人IgG1 FC部分之间存在一个氨基酸重叠。前导肽以斜体描绘。成熟蛋白以序列ITQQDLA开始。当重组产生时，N末端的精确位置可以具有几个氨基酸的变化；这意味着成熟蛋白可以短或长例如一至五个氨基酸。

结合并中和TRAIL活性的TRAIL-R融合蛋白可以使用通过培养连续细胞系提供这些蛋白质的重组和非重组全长或功能片段的生产的任何技术来生产。

如以下所述，所得的蛋白质可以在具有或不具有修饰(诸如标记，抗体段的重组接合)或具有充当受体的分子的情况下使用。修饰可以是共价的和/或非共价的。

肽剂

应理解，根据本发明使用或提供的肽或蛋白质剂可以是天然或原始序列的衍生物，并且因此包括增加所述剂的体内有效性或半衰期的衍生物。根据本发明的能够增加多肽的半衰期的衍生物的例子包括类肽衍生物、D-氨基酸衍生物和肽-类肽杂交体。

根据本发明的蛋白质和肽剂可以经受通过多种方式(诸如在靶位点处的蛋白酶活性)进行的降解。这种降解可限制其生物利用度，并且因此限制治疗性用途。存在多种良好建立的技术，通过所述技术可以设计并生产在生物环境中具有增强的稳定性的肽衍生物。由于对于蛋白酶介导的降解的抗性增加，此类肽衍生物可以具有改善的生物利用度。优选地，适于根据本发明使用的衍生物比产生它的蛋白质或肽更具蛋白酶抗性。肽衍生物和产生它的蛋白质或肽的蛋白酶抗性可以通过熟知的蛋白质降解测定来评价。然后可以比较肽衍生物和肽的蛋白酶抗性的相对值。

根据本发明的蛋白质和肽的类肽衍生物可以易于由根据本发明的第一方面的受体或根据本发明的第四、第五或第六方面的剂的结构的知识来设计。可商购的软件可以用于根据良好建立的方案开发类肽衍生物。

逆类肽(其中所有的氨基酸被类肽残基按倒序替换)也能够模拟根据本发明的蛋白质或肽。与含有一个类肽残基的肽或类肽-肽杂交体相比，预期逆类肽以相反方向结合在配体结合沟中。因此，类肽残基的侧链能够以与原始肽中的侧链相同的方向指向。

根据本发明的肽或蛋白质的修饰形式的另一个实施方案包括D-氨基酸形式。在这种情况下，氨基酸残基的顺序倒置。使用D-氨基酸而非L-氨基酸制备肽极大地减少了这种衍生物由正常代谢过程造成的不希望的降解，减少了需要给予的衍生物的量以及其给予频率。

核酸

在本发明的另一个实施方案中，所述剂或抑制剂是核酸效应分子。

核酸效应分子可以是DNA、RNA(包括siRNA、miRNA和shRNA)、PNA或DNA-RNA杂交分子。这些可以特异性地针对TRAIL或TRAIL-R序列的下调(参见例如实施例5)。siRNA形成已知为RNA干扰(RNAi)的基因剪接机制的一部分，其导致mRNA的序列特异性破坏并且能够产生基因表达的靶向敲除。用于基因沉默的siRNA可以包括21个核苷酸长度的双链RNA，通常在每个3’末端具有2核苷酸突出。替代性地，可以使用短发夹RNA(shRNA)，其使用通过发夹环连接的有义序列和反义序列。siRNA和shRNA两者均可以化学合成并引入到用于瞬时RNAi的细胞中或由启动子内源地表达以进行基因表达的长期抑制。用作根据本发明的剂的siRNA分子可以包含10-50个核苷酸的双链RNA。优选地，用作根据本发明的剂的siRNA包含18-30个核苷酸。更优选地，用作根据本发明的剂的siRNA包含21-25个核苷酸。并且最优选地，用作根据本发明的剂的siRNA包含21个核苷酸。应理解，siRNA需要基于根据本发明的第二方面的序列。优选的双链siRNA分子包含来自结合互补反义链的TRAIL或其受体的序列的21-25个连续核苷酸的有义链。替代性地，使用有义序列和反义序列的shRNA可以用作根据本发明的剂。优选地，使用有义序列和反义序列的可以用作根据本发明的剂的shRNA包含20-100个核苷酸。

在其他实施方案中，所述核酸可以编码本发明的其他剂-例如所述的融合蛋白。

所述核酸可以是单链或双链的。核酸效应分子可以直接作为药物递送(其可以是“裸的”或例如在脂质体中)，它可以由用于将核苷酸序列递送到靶器官、组织或细胞群体中的逆转录病毒、腺病毒、疱疹或痘苗病毒或细菌质粒表达。

这些构建体可以用于将不可翻译的有义序列或反义序列引入到细胞中。

在不整合到DNA中的情况下，这些载体可以继续产生RNA分子，直至被细胞核酸酶降解。载体系统可以在非复制型载体的情况下产生一个月或更长的瞬时表达，并且如果适当的复制元件是载体系统的一部分，则瞬时表达更长。

因此，如本领域熟知的，重组载体可以包括其他功能元件。例如，重组载体可以被设计成使得所述载体在细胞中自发复制。在这种情况下，可能在重组载体中需要诱导DNA复制的元件。替代性地，重组载体可以被设计成使得所述载体和核酸分子整合到细胞的基因组中。在这种情况下，有利于靶向整合(例如，通过同源重组)的DNA序列是希望的。重组载体还可以具有编码可以用作克隆过程中的可选择标记物的基因的DNA。重组载体还可以包含根据需要控制核酸的表达的启动子或调节物。

变体

在本文中讨论氨基酸和核酸序列的任何情况下(例如关于编码融合蛋白或其他剂)，技术人员应理解，还设想本文公开的氨基酸和核酸序列的功能衍生物-此类衍生物可以具有与本文提及的任何序列的氨基酸/多肽/核酸序列具有至少30％、优选40％、更优选50％并且甚至更优选60％的序列同一性的序列。还设想与提及的任何序列具有大于优选65％、更优选75％、甚至更优选85％并且甚至更优选90％的同一性的氨基酸/多肽/核酸序列。优选地，所述氨基酸/多肽/核酸序列与任何提及的序列具有92％的同一性，甚至更优选95％的同一性，甚至更优选97％的同一性，甚至更优选98％的同一性，并且最优选99％的同一性。

不同氨基酸/多肽/核酸序列之间的同一性百分比的计算可以如下进行。首先通过ClustalX程序生成多重比对(成对参数：缺口开放10.0，缺口延伸0.1，蛋白质矩阵Gonnet250，DNA矩阵IUB；多个参数：缺口开放10.0，缺口延伸0.2，延迟趋异序列(delay divergentsequence)30％，DNA转变权重0.5，负矩阵分解，蛋白质矩阵gonnet系列，DNA权重IUB；蛋白质缺口参数，特殊残基罚分on，亲水性罚分on，亲水性残基GPSNDQERK，缺口分离距离4，末端缺口分离off)。然后由多重比对将同一性百分比计算为(N/T)*100，其中N是两个序列共享相同残基的位置的数量，并且T是比较的位置的总数量。替代性地，可以将同一性百分比计算为(N/S)*100，其中S是所比较的较短序列的长度。氨基酸/多肽/核酸序列可以从头合成，或者可以是天然氨基酸/多肽/核酸序列或其衍生物。

替代性地，基本上相似的核苷酸序列将由在严格条件下与本文提及的任何核酸序列或其互补序列杂交的序列编码。严格条件意指核苷酸在大约45℃下在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与过滤器结合的DNA或RNA杂交，接着在大约5-65℃下在0.2x SSC/0.1％SDS中进行至少一次洗涤。替代性地，基本上相似的多肽可以与根据本发明的肽序列相差至少1个，但小于5、10、20、50或100个氨基酸。

由于遗传密码的简并性，清楚的是，任何核酸序列可以在基本上不影响由此编码的受体蛋白的序列的情况下进行变化或改变，以便提供其功能变体。合适的核苷酸变体是具有通过在序列内取代编码相同氨基酸的不同密码子，从而产生沉默变化而改变的序列的那些。其他合适的变体是具有同源核苷酸序列，但是包含通过以下方式改变的序列的全部或一部分的那些：用与它所取代的氨基酸具有相似的生物物理特性的侧链取代编码氨基酸的不同密码子以产生保守变化。例如，小的非极性疏水性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。大的非极性疏水性氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。

已经通过多个研究详细研究了蛋白质或DNA的准确比对。特别重要的是最佳序列匹配之间的权衡以及引入缺口以获得这种匹配。在蛋白质的情况下，对匹配进行评分的方式也很重要。PAM矩阵(例如，Dayhoff,M.等人,1978,Atlas of protein sequence andstructure,Natl.Biomed.Res.Found.)和BLOSUM矩阵族定量保守取代的性质和概率，并且用于多重比对算法，但其他同样可用的矩阵也是本领域技术人员已知的。常用的多重比对程序ClustalW及其windows版本ClustalX(Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research,22,4673-4680；Thompson等人,1997,Nucleic Acids Research,24,4876-4882)是生成蛋白质和DNA的多重比对的有效方式。

通常，自动生成的比对需要利用经过训练的使用者关于所研究的蛋白质家族的知识，例如关键保守位点的生物知识，进行手动比对。一个这种比对编辑器程序是Align(http://www.gwdg.de/～dhepper/download/；Hepperle,D.,2001:Multicolor SequenceAlignment Editor.Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries,16775Stechlin,Germany)，但其他程序也是合适的，诸如JalView或Cinema。

蛋白质之间的同一性百分比的计算在由Clustal生成多重比对期间发生。然而，如果比对得到手动改善，或者针对两个序列的有意比较，这些值需要重新计算。计算比对内的成对蛋白质序列的此值的程序包括PHYLIP系统发育软件包内的PROTDIST(Felsenstein；http://evolution.gs.washington.edu/phylip.html)，其使用“相似性表”选择作为氨基酸取代的模型(P)。对于DNA/RNA，相同的选择存在于PHYLIP的DNADIST程序内。

还设想蛋白质序列中的其他修饰并且在要求保护的本发明的范围内，即在翻译期间或之后例如通过乙酰化、酰胺化、羧化、磷酸化、蛋白水解切割或连接至配体发生的那些。

组合物、剂量和方案

本发明中使用的剂(例如，其结合TNF/LT-α、TRAIL、CD95L或TNFR1、TRAIL-R、CD95、TLR3、TLR4、半胱天冬酶-8、RIPK3、MLKL或RIPK1，中和由TNF/LT-α/TNFR1、TRAIL/TRAIL-R、CD95L/CD95、dsRNA/TLR3、LPS/TLR4、RIPK1、半胱天冬酶-8、RIPK3和MLKL触发的细胞死亡和炎症)可以作为“药物组合物”提供。

可以将药物组合物单独给予或与至少一种其他剂诸如稳定化合物组合给予，可以将药物组合物在任何无菌的可生物相容的药物载体溶液(包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖和水)中给予。可以将所述组合物单独或与其他剂、药物或激素组合向患者给予。本发明中详述的药物组合物可以通过任何数量的途径给予，所述途径包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、脑室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下或直肠方式。

药物组合物通常包含有效实现预期目的的量的剂。

有效剂量的确定完全在经过训练的人员的能力范围内。对于任何化合物，治疗有效剂量可以最初在例如细胞系的细胞培养测定中或在动物模型(通常但并非排外地是小鼠)中估计。动物模型还可以用于确定适当的浓度范围和给予途径。基于此类预实验，可以确定针对在人类中给予的有用的剂量和途径。治疗有效剂量是指活性成分(例如本发明的核酸或蛋白质或抗体)的足以治疗特定病症的量。治疗功效和毒性可以通过在细胞培养或实验动物中的标准药学程序，例如ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)和LD50(对50％群体致死的剂量)来确定。在治疗作用与毒性作用之间的剂量比是治疗指数，并且其可以表示为LD50/ED50。优选表现出较大治疗指数的药物组合物。所述剂量优选地在包括ED50而具有很小或没有毒性的一系列循环浓度内。所述剂量根据所采用的剂量、患者的敏感性和给予途径而在此范围内变化。确切剂量将根据与需要治疗的受试者相关的因素由从业人员确定。调整剂量和给予以提供足够水平的活性部分以维持所需作用。可以考虑的因素包括疾病状态的严重程度、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、给予的时间和频率、一种或多种药物组合、反应敏感性以及对治疗的耐受性/反应。长效药物组合物可以根据特定配制品的半衰期和清除率每3至4天、每周或每两周给予一次。正常剂量可以根据给予途径从0.1至100,000微克变化，最高达约1g的总剂量。关于具体剂量和递送方法的指导提供于文献中并且通常可被本领域的从业人员获得。本领域技术人员针对核苷酸所采用的配制品与针对蛋白质或其抑制剂所采用的配制品不同。相似地，多核苷酸或多肽的递送对于如上所述的特定细胞和病症是特有的。

一般声明

如本文所用，在治疗病症的上下文中，术语“治疗”通常涉及治疗和疗法，无论是人还是动物(例如，在兽医应用中)，其中实现了一些所需的治疗作用，例如，抑制所述病症的进展，并且包括降低进展速度(延长存活)、停下进展速度、消退所述病症、改善所述病症和治愈所述病症。

如本文所用，术语“治疗有效量”涉及本发明的化合物或包含所述化合物的材料、组合物或剂型的量，其有效于产生一些所需的治疗作用，当根据所需的治疗方案给予时，与合理的效益/风险比相称。诸位发明人已经证明，就本发明的疾病而言，MT化合物的治疗有效量可以比本领域迄今所理解的低得多。

本发明还包括治疗，而预防措施也包括在内并且“治疗”由此得以被理解。预防治疗可以利用“预防有效量”，其在本文中使用的情况下涉及剂的量，所述量在根据所需的治疗方案给予时，有效用于产生一些与合理的益处/风险比相称的所需预防效作用。

在本说明书的上下文中的“预防”不应被理解为限制完全成功，即完全保护或完全预防。相反，在本文中的预防是指在检测到症状状况之前给予的措施，其目的是通过帮助延迟、减轻或避免此特定病症来保持健康。

在本文描述采用剂的治疗方法的任何情况下，应理解，还描述了用于此方法的剂(第一剂、第二剂、第三剂中的任一种)，也描述了用于制造治疗相关炎性疾病的药剂的剂(第一剂、第二剂、第三剂中的任一种)。还描述了用于增强其他两种剂的活性的方法的第一剂、第二剂、第三剂中的任一种。

在本文描述组合物的情况下，应理解，还设想用于本文所述的治疗方法(包括预防方法)的相同组合物，也设想用于制造治疗相关炎性疾病的药剂的组合物。

本文引用了许多专利和出版物，以便更全面地描述和公开本发明以及本发明所属领域的现状。这些参考文献中的每一个以引用的方式整体并入本文的公开内容中，其程度如同每个单独的参考文献被具体和单独地指出以引用的方式并入。

贯穿本说明书及其后的权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包含(包括)(comprise)”以及变型如“包含(包括)(comprises)”或“包含(包括)(comprising)”应当被理解为是指包含一个提及的整体或步骤或者多个整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或者多个整体或步骤的组。

必须指出，如在说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地规定。因此，例如，提到“一种药物载体”包括两种或更多种这此类载体的混合物等。

范围在本文中通常表达为从“约”一个具体值和/或到“约”另一个具体值。当表达这样的范围时，另一个实施方案包括从一个具体值和/或到另一个具体值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，将理解所述具体值形成另一个实施方案。

本文中的任何子标题仅为了方便而包括，并且不应被解释为以任何方式限制本公开内容。

现在将参考以下非限制性附图和实施例进一步描述本发明。本领域技术人员根据这些内容易于想到本发明的其他实施方案。

附图说明

图1.角质形成细胞中HOIP的缺失在较大年龄导致TNFR1依赖性产后致死性和TNFR1非依赖性致死性皮炎。a,d,g,具有指示基因型的小鼠(n＝10只小鼠/基因型)的代表性图像(a,g)。每隔一天用媒介物或4-OHT处理动物，总计4个剂量(n＝3只小鼠/基因型)(d)。b,e,h,来自具有指示基因型的小鼠(n＝3只小鼠/基因型)的用H&E或用指示抗体染色的皮肤切片的代表性图像。箭头：核固缩，星号：免疫细胞浸润，箭头：角化不全，和黑条：角化过度。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。白色虚线将表皮(上)与真皮(下)分开。比例尺，50μm。c,f,i,具有指示基因型的小鼠中用TUNEL(红色)和CC3抗体(绿色)双染色的皮肤切片的代表性图像(顶部图)。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。白色虚线将表皮(上)与真皮(下)分开。比例尺，50μm。来自具有指示基因型的小鼠(n＝3只小鼠/基因型)的皮肤切片中TUNEL和CC3阳性细胞的定量(底部图)。误差条代表均值±均值的标准误差(s.e.m)。*P≤0.05,***P≤0.001。CC3：切割的半胱天冬酶-3。对照小鼠代表Hoip^fl/fl；K14-Cre-和Hoip^fl/wt；K14-Cre+(a-c)或Tnfr1^KO；Hoip^fl/fl；K14-Cre-和Tnfr1^KO；Hoip^fl/wt；K14-Cre+小鼠(g-i)的池。

图2.HOIL-1的丧失导致TNFR1依赖性和TNFR1非依赖性致死性皮炎。a,d,具有指示基因型的小鼠(n＝10只小鼠/基因型)的代表性图像。b,e,来自具有指示基因型的小鼠(n＝3只小鼠/基因型)的用H&E或用指示抗体染色的皮肤切片的代表性图像。箭头：核固缩，星号：免疫浸润，箭头：角化不全，和黑条：角化过度。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。白色虚线将表皮(上)与真皮(下)分开。比例尺，50μm。c,f,具有指示基因型的小鼠中用TUNEL(红色)和CC3抗体(绿色)双染色的皮肤切片的代表性图像(顶部图)。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。白色虚线将表皮(上)与真皮(下)分开。比例尺，50μm。来自具有指示基因型的小鼠(n＝3只小鼠/基因型)的皮肤切片中TUNEL和CC3阳性细胞的定量(底部图)。误差条代表均值±s.e.m。**P≤0.01,***P≤0.001。CC3：切割的半胱天冬酶-3。对照小鼠代表Hoil-1^fl/fl；K14-Cre-和Hoil-1^fl/wt；K14-Cre+(a-c)或Tnfr1^KO；Hoil-1^fl/fl；K14-Cre-和Tnfr1^KO；Hoil-1^fl/wt；K14-Cre+小鼠(d-f)的池。

图3.异常细胞凋亡驱动Hoip^E-KO和Hoil-1^E-KO小鼠中的致死性皮炎。a,来自具有指示基因型的小鼠(n＝3只小鼠/基因型)的皮肤切片中TUNEL和CC3阳性细胞的定量。误差条代表均值±s.e.m。*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001。b,在P0处来自具有指示基因型的小鼠(n＝4)的用针对CD45的抗体染色(红色)的皮肤切片的代表性图像。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。白色虚线将表皮(上)与真皮(下)分开。比例尺，50μm。c,在指示产后天数处来自具有指示基因型的小鼠的皮肤样品中免疫细胞的流式细胞术分析。柱状图代表CD45阳性细胞相对于前向和侧向散射曲线的百分比(n＝5只小鼠/基因型)。误差条代表均值±s.e.m。**P≤0.01,***P≤0.001,NS＝不显著。d,在来源于存在ZVAD-fmk的情况下培养的对照(+)或Hoip^E-KO(-)小鼠的PMK中进行FADD IP(n＝2个独立实验的代表性印迹)。针对指示的蛋白质通过蛋白质印迹分析裂解物和IP。在抑制剂坏死稳定素-1s(N)、ZVAD-fmk(Z)或RIPK3i不存在(NT：未处理)或存在的情况下将来源于Hoip^E-KO和对照小鼠的PMK培养四天。在第四天通过CellTiter-Glo测定测量细胞活力(％)。误差条代表均值±s.e.m。(n＝5)。***P≤0.001,NS＝不显著。CC3：切割的半胱天冬酶-3。f,来源于具有指示基因型的成年小鼠的PMK的通过CellTiter-Glo测定测量的细胞活力(％)。结果表示为均值±SEM(n＝8只小鼠/基因型)。NS＝不显著。g,具有指示基因型的小鼠(n＝15只小鼠/基因型)的代表性图像。h,具有指示基因型的小鼠(n＝3只小鼠/基因型)中的用H&E或用指示抗体染色的皮肤切片的代表性图像。箭头：核固缩。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。比例尺，50μm。CC3：切割的半胱天冬酶-3。i,来自具有指示基因型的小鼠(n＝3只小鼠/基因型)的皮肤切片中TUNEL和CC3阳性细胞的定量。误差条代表均值±s.e.m。*P≤0.05,***P≤0.001,NS＝不显著。j,在D70处来自具有指示基因型的小鼠(n＝4)的用针对CD45的抗体染色(红色)的皮肤切片的代表性图像。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。白色虚线将表皮(上)与真皮(下)分开。比例尺，50μm。k,具有指示基因型的小鼠的Kaplan Meier存活曲线。提交Hoip^E-KO(n＝10)和Mlkl^KO；Hoip^E-KO(n＝9)或Mlkl^KO；半胱天冬酶-8^KO；Hoip^E-KO(n＝4)和Hoil-1^E-KO(n＝13)和Ripk3^KO；Hoil-1^E-KO(n＝8)或半胱天冬酶-8^KO/WT；Hoil-1^E-KO(n＝4)或Ripk3^KO；半胱天冬酶-8^KO/WT；Hoil-1^E-KO(n＝11)或Ripk3^KO；半胱天冬酶-8^KO；Hoil-1^E-KO(n＝15)小鼠之间的比较以用于统计分析。**P≤0.01,***P≤0.001,NS＝不显著。Ripk3^KO；半胱天冬酶-8^KO；Hoil-1^fl/wtK14cre+(n＝13)和Mlkl^KO；半胱天冬酶-8^KO；Hoip^fl/wtK14cre+(n＝4)小鼠用作对照。根据英国动物福利内政部(UK home office for animal welfare)的规定，将具有半胱天冬酶-8和MLKL或RIPK3的组合缺陷的所有小鼠在它们发展严重的淋巴结病和脾肿大时处死。对照小鼠代表Hoip^fl/fl；K14-Cre-和Hoip^fl/wt；K14-Cre+或Hoil-1^fl/fl；K14-Cre-和Hoil-1^fl/wt；K14-Cre+(a-e),Tnfr1^KO；Hoip^fl/fl；K14-Cre-和Tnfr1^KO；Hoip^fl/wt；K14-Cre+小鼠(f),Ripk3^KO；Hoil-1^fl/fl；K14-Cre-和Ripk3^KO；Hoil-1^fl/wt；K14-Cre+或Ripk3^KO；半胱天冬酶-8^KO；Hoil-1^fl/fl；K14-Cre-和Ripk3^KO；半胱天冬酶-8^KO；Hoil-1^fl/wt；K14-Cre+小鼠(g-i)的池。

图4.CD95L和TRAIL诱导的细胞死亡驱动TNFR1非依赖性皮炎。a,将来源于具有指示基因型的成年小鼠的PMK用TRAIL[50ng/ml]、CD95L[50ng/ml]和聚(I:C)[100μg/ml]处理24小时或不处理。通过CellTiter-Glo测定测量细胞活力(％)。结果表示为均值±SEM。(n＝7只小鼠/基因型)。**p≤0.01,***p≤0.001,NS＝不显著。对照小鼠代表Tnfr1^KO；Hoil-1^{fl /fl}；K14-Cre-和Tnfr1^KO；Hoil-1^fl/wt；K14-Cre+小鼠的池。b,具有指示基因型的小鼠的代表性图像。c,在P70处在具有指示基因型的小鼠中评估皮炎的严重性得分。通过评价被病灶影响的身体区域(黑色)和病灶特征(白色)来确定总得分。Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO(n＝6),Trail-r^KO；Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO(n＝4),Tlr3^KO；Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO(n＝4),Cd95^E-DD；Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO(n＝12),Trail-r^KO；Tlr3^KO；Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO(n＝20)和Cd95^E-DD；Trail-r^KO；Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO(n＝19),Mlkl^KO；Tnfr1^KO；Hoip^E-KO(n＝13)。d,具有指示基因型的小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。提交Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO或Tnfr1^KO；Hoip^E-KO小鼠与具有指示基因型的小鼠之间的比较以用于统计分析。*P≤0.05,***P≤0.001；NS＝不显著。Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO(n＝21),Trail-r^KO；Tlr3^KO；Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO(n＝19)和Cd95^E-DD；Trail-r^KO；Tnfr1^KO；Hoil-1^{E -KO}(n＝32),Mlkl^KO；Tnfr1^KO；Hoip^E-KO(n＝17)。

扩展数据图例

扩展数据图1：角质形成细胞中HOIP缺陷的生成和表征。a,从具有指示基因型的小鼠的耳孔分离的DNA的PCR基因分型。b,来源于具有指示基因型的小鼠的PMK中LUBAC组分的蛋白质印迹分析。c,在P4处用针对HOIP的抗体染色的皮肤切片的代表性图像。比例尺，50μm。d,在来源于存在ZVAD-fmk的情况下培养并用FLAG-TNF刺激的对照(+)或Hoip^E-KO(-)小鼠的PMK中通过FLAG IP进行内源TNFR1复合物I下拉。针对指示的蛋白质通过蛋白质印迹分析裂解物和IP。e,在带His标签的TNF[100ng/ml]刺激不同时间点(min)之后从源自对照(+)或Hoip^E-KO(-)小鼠的PMK获得的全细胞裂解物中指示蛋白质的蛋白质印迹分析。f,在P4处来自具有指示基因型的小鼠的皮肤切片的表皮厚度定量(n＝4/基因型)。误差条代表均值±s.e.m。***P≤0.001。g,在P4处来自具有指示基因型的小鼠的皮肤样品中免疫细胞的流式细胞术分析。柱状图示出CD45⁺、CD11b⁺GR-1⁺、CD11b⁺F4/80⁺和CD19⁺、CD3⁺细胞相对于有效散射和侧向散射曲线的百分比(n＝5/基因型)。误差条代表均值±s.e.m。**P≤0.01,***P≤0.001,NS＝不显著。h,每隔一天用总计4个剂量的媒介物或4-OHT处理的Hoip^{fl/ wt}K14CreER^tam小鼠的用H&E或用指示抗体染色的皮肤切片的代表性图像(n＝3只小鼠/基因型)。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。白色虚线将表皮(上)与真皮(下)分开。比例尺，50μm。i,具有指示基因型并如在(h)中处理的小鼠的表皮厚度定量(n＝3/基因型)。误差条代表均值±s.e.m。*P≤0.05,NS＝不显著。j,使用ImageJ通过测量总体荧光强度进行来自具有指示基因型的如在h中处理的小鼠的皮肤切片中CD45染色的定量。au＝任意单位。k,具有指示基因型的小鼠中用TUNEL(红色)和CC3抗体(绿色)双染色的皮肤切片的代表性图像(顶部图)。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。白色虚线将表皮(上)与真皮(下)分开。比例尺，50μm。来自按指示处理的Hoip^fl/wtK14CreER^tam小鼠(底部图)(n＝3只小鼠/基因型)的皮肤切片中TUNEL和CC3阳性细胞的定量。未检测到(nd)CC3。误差条代表均值±s.e.m。NS＝不显著。CC3：切割的半胱天冬酶-3。对照小鼠代表Tnfr1^KOHoip^fl/fl；K14-Cre-和Tnfr1^KOHoip^fl/wt；K14-Cre+小鼠(b)或Hoip^fl/fl；K14-Cre-和Hoip^fl/wt；K14-Cre+小鼠(c,f,g)的池。

扩展数据图2：Hoip^E-KO小鼠中的TNFR1缺陷导致成年期的皮肤炎症。a,具有指示基因型的小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。提交Hoip^E-KO(n＝10)和Tnfr1^KO；Hoip^E-KO(n＝27)小鼠之间的比较以用于统计分析。***P≤0.001。根据英国动物福利内政部的规定，由于严重的皮肤疾病，将Tnfr1^KO；Hoip^E-KO小鼠处死。b,在D70处来自具有指示基因型的小鼠的皮肤切片的表皮厚度定量(n＝4/基因型)。误差条代表均值±s.e.m。***P≤0.001。c,在D70处来自具有指示基因型的小鼠的皮肤样品中免疫细胞的流式细胞术分析。柱状图示出指示的免疫细胞亚群相对于有效散射和侧向散射曲线的百分比(n＝5/基因型)。误差条代表均值±s.e.m。*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001。对照小鼠代表Tnfr1^KO；Hoip^fl/fl；K14-Cre-和Tnfr1^KO；Hoip^fl/wt；K14-Cre+小鼠(b,c)的池。

扩展数据图3：RIPK1的激酶活性的遗传抑制使Hoip^E-KO小鼠的致死性延迟4天。a,在指示的产后天数处小鼠的代表性图像(n＝8只小鼠/基因型)。箭头指示在P8处的RIPK1^D138N；Hoip^E-KO小鼠(右图)。在P4处RIPK1^D138N；Hoip^E-KO小鼠与对照同窝小鼠不可区分(左图)。b,来自具有指示基因型的小鼠(n＝3只小鼠/基因型)的用H&E染色的皮肤切片的代表性图像。箭头：核固缩，星号：免疫细胞浸润，箭头：角化不全，和黑条：角化过度。比例尺，50μm。对照小鼠代表RIPK1^D138N；Hoip^fl/fl；K14-Cre-和RIPK1^D138N；Hoip^fl/wt；K14-Cre+小鼠的池。

扩展数据图4：Hoil-1^E-KO和Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO小鼠的生成和表征。a,为生成Hoil-1^E-KO小鼠而遵循的敲除策略的示意图。b,从具有指示基因型的小鼠的耳孔分离的DNA的PCR基因分型。c,来源于具有指示基因型的小鼠的PMK中LUBAC组分的蛋白质印迹分析。d,在P4处用针对HOIL-1的抗体染色的皮肤切片的代表性图像。比例尺，50μm。e,h,在P4(e)和D70(h)处来自具有指示基因型的小鼠的皮肤切片的表皮厚度定量(n＝4/基因型)。误差条代表均值±s.e.m。**P≤0.01,***P≤0.001。f,i,在P4(f)和D70(i)处来自具有指示基因型的小鼠的皮肤样品中免疫细胞的流式细胞术分析。柱状图代表CD45阳性细胞相对于前向和侧向散射曲线的百分比(n＝5/基因型)。误差条代表均值±s.e.m。*P≤0.05,**P≤0.01。g,具有指示基因型的小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。提交Hoil-1^E-KO(n＝12)和Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO(n＝20)小鼠之间的比较以用于统计分析。根据英国动物福利内政部的规定，将Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO小鼠处死。***P≤0.001。对照小鼠代表Hoil-1^fl/fl；K14-Cre-和Hoil-1^fl/wt；K14-Cre+(d-f)或Tnfr1^KO；Hoil-1^fl/fl；K14-Cre-和Tnfr1^KO；Hoil-1^fl/wt；K14-Cre+小鼠(c,g-i)的池。

扩展数据图5：在不同天数处Hoip^E-KO和Hoil-1^E-KO小鼠的分析。a,b在指示时间处来自Hoip^E-KO小鼠的具有指示染色的皮肤切片的代表性图像和对应定量，TUNEL(红色)和CC3(绿色)。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。白色虚线将表皮(上)与真皮(下)分开。箭头指示核固缩。比例尺，50μm。误差条代表均值±s.e.m。*P≤0.05,**P≤0.01(n＝3只小鼠/基因型)。c,在P2处来自具有指示基因型的小鼠的皮肤样品中免疫细胞的流式细胞术分析。柱状图代表指示的免疫细胞亚群相对于前向和侧向散射曲线的百分比(n＝5/基因型)。误差条代表均值±s.e.m。*P≤0.05,***P≤0.001。d,e,在P0(d)和P2(f)处具有指定基因型的小鼠的如所指示染色的皮肤切片的代表性图像(n＝3只小鼠/基因型)。箭头指示核固缩。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。比例尺，50μm。f,g,在P0(f)和P2(g)处来自具有指示基因型的小鼠的皮肤切片的表皮厚度定量(n＝3/基因型)。误差条代表均值±s.e.m。*P≤0.05,**P≤0.01,NS＝不显著。CC3：切割的半胱天冬酶-3。对照小鼠代表Hoip^fl/fl；K14-Cre-和Hoip^fl/wt；K14-Cre+或Hoil-1^fl/fl；K14-Cre-和Hoil-1^fl/wt；K14-Cre+(a-g)的池。

扩展数据图6：当HOIP在成年小鼠的角质形成细胞中缺失时细胞死亡之后出现炎症。a,在用媒介物或4-OHT进行一次、两次或三次处理并如所指示染色之后分析的Hoip^{fl/ fl}K14CreER^tam小鼠(n＝3/基因型)的代表性图像。箭头：核固缩，星号：免疫浸润。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。比例尺，50μm。b,如在(a)中处理的Hoip^fl/flK14CreER^tam小鼠(n＝3/基因型)的皮肤切片中TUNEL阳性细胞的定量。误差条代表均值±s.e.m。***P≤0.001,NS＝不显著。c,使用ImageJ通过测量总体荧光强度进行来自如在a中处理的Hoip^fl/flK14CreER^tam小鼠的皮肤切片中CD45染色的定量。NS＝不显著。(n＝3只小鼠/基因型)。au＝任意单位。d,用或不用(NT)依那西普

[50μg/ml]培养来源于Hoip^E-KO和对照小鼠的PMK。通过CellTiter-Glo测定测量细胞活力(％)。结果表示为均值±s.e.m。(n＝7只小鼠/基因型)。*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001。对照小鼠代表Hoip^fl/fl；K14-Cre-和Hoip^fl/wt；K14-Cre+的池。

扩展数据图7：RIPK3/MLKL介导的坏死性凋亡的丧失不影响LUBAC特异性角质形成细胞缺陷小鼠的表型。a,g,描绘使具有指示基因型的小鼠杂交之后获得的动物的基因型统计的表。报告了获得的(断奶)和根据孟德尔频率预期的动物的数量。b,h,在P5处具有指示基因型的小鼠的代表性图像。c,i,在P0(c)和P4(i)处具有指示基因型的小鼠的如所指示染色的皮肤切片的代表性图像(n＝4/基因型)。箭头指示核固缩。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。比例尺，50μm。d,j,在P0(d)和P4(j)处来自具有指示基因型的小鼠的皮肤切片的表皮厚度定量(n＝4/基因型)。误差条代表均值±s.e.m。*P≤0.05,NS＝不显著。e,k,具有指示基因型的小鼠中用TUNEL(红色)和CC3抗体(绿色)双染色的皮肤切片的代表性图像(顶部图)。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。白色虚线将表皮(上)与真皮(下)分开。比例尺，50μm。来自具有指示基因型的小鼠(n＝3/基因型)的皮肤切片中TUNEL和CC3阳性细胞的定量(底部图)。误差条代表均值±s.e.m。*P≤0.05,**P≤0.01。CC3：切割的半胱天冬酶-3。f,来源于具有指示基因型的小鼠的指示器官中MLKL表达的蛋白质印迹分析。对照小鼠代表Ripk3^KO；Hoil-1^fl/fl；K14-Cre-和Ripk3^KO；Hoil-1^fl/wt；K14-Cre+(b-e)和Mlkl^KO；Hoip^fl/fl；K14-Cre-和Mlkl^KO；Hoip^fl/wt；K14-Cre+小鼠(h-k)的池。

扩展数据图8：RIPK3和半胱天冬酶-8的组合缺失完全防止Hoil-1^E-KO小鼠的致死性炎性表型。a,描绘使具有指示基因型的小鼠杂交之后获得的动物的基因型统计的表。报告了获得的(断奶)和根据孟德尔频率预期的动物的数量。b,g,具有指示基因型的小鼠(n＝4(b)和11(g)/基因型)的代表性图像。c,在出生之后的指示天数处来自具有指示基因型的小鼠的皮肤切片的表皮厚度定量(n＝3/基因型)。误差条代表均值±s.e.m。*P≤0.05,NS＝不显著。d,具有指示基因型的小鼠中用TUNEL(红色)和CC3抗体(绿色)双染色的皮肤切片的代表性图像。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。白色虚线将表皮(上)与真皮(下)分开。比例尺，50μm。e,在约7个月处来自具有指示基因型的小鼠的轴向淋巴结和脾脏的代表性图像。f,在D20处具有指示基因型的小鼠的如所指示染色的皮肤切片的代表性图像(n＝3/基因型)。箭头指示核固缩。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。比例尺，50μm。h,来自具有指示基因型的小鼠(n＝3/基因型)的皮肤切片中TUNEL和CC3阳性细胞的定量。误差条代表均值±s.e.m。*P≤0.05。CC3：切割的半胱天冬酶-3。对照小鼠代表Mlkl^KO；半胱天冬酶-8^KO；Hoip^fl/fl；K14-Cre-和Mlkl^KO；半胱天冬酶-8^KO；Hoip^fl/wt；K14-Cre+(b)或Ripk3^KO；半胱天冬酶-8^KO；Hoil-1^fl/fl；K14-Cre-,Ripk3^KO；半胱天冬酶-8^KO；Hoil-1^fl/wt；K14-Cre+或Ripk3^KO；半胱天冬酶-8^KO/WT；Hoil-1^fl/fl；K14-Cre-和Ripk3^KO；半胱天冬酶-8^KO/WT；Hoil-1^fl/wt；K14-Cre+小鼠(c,d,f-h)的池。

扩展数据图9：单独的TLR3、CD95的DD或TRAIL-R缺失不足以预防TNFR1非依赖性皮炎。a,具有指示基因型的小鼠的代表性图像。b,Kaplan-Meier存活曲线，提交Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO小鼠与具有指示基因型的小鼠之间的比较以进行统计分析。Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO(n＝21),Trail-r^KO；Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO(n＝11),Tlr3^KOTnfr1^KO；Hoil-1^E-KO(n＝6)和Cd95^E-DD；Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO(n＝15)。c,具有指示基因型的小鼠的寿命。

实施例

实施例1-总结

现在已经开发了小鼠的疾病模型，其中动物发展比在我们2011和2013年的研究^6,7中采用的模型中更严重形式的炎性皮肤疾病。

具体地，SHARPIN(线性泛素链组装复合物(LUBAC)的组分^6-9)通过抑制TNF诱导的RIPK1激酶活性依赖性细胞死亡来预防炎症^7,8,10。

在本发明的模型中，显示了其他两种LUBAC组分HOIP或HOIL-1^11-13(Hoip^E-KO和Hoil-1^E-KO小鼠)中的任一者的角质形成细胞特异性丧失导致产后致死性皮肤炎症。

与SHARPIN突变体动物相比，在Hoip^E-KO和Hoil-1^E-KO小鼠中，TNFR1的丧失不消除但仅延迟致死性皮炎。TNFR1的遗传消除使经由此受体进行的细胞死亡诱导完全失活，而且也使基因激活完全失活。这意味着在这些新模型中，TNFR1介导的信号传导有助于产生炎症，但是并非唯一性地对其负责。

我们发现，与TNFR1组成型缺失相比，角质形成细胞中TNFR1的组成型丧失与TRAIL-R、TLR3的组成型丧失或与CD95的死亡结构域(DD)的特异性丧失的组合不导致炎症发作的任何进一步延迟。

然而，引人注意的是，在角质形成细胞中，当与TRAIL-R的组成型缺失和CD95的DD的特异性缺失组合时，TNFR1的组成型缺失意外地预防所得小鼠中任何炎性综合征的发展。

因此，在TNFR1不存在的情况下，CD95L和TRAIL一起负责通过诱导细胞死亡来导致致死性皮炎。

此外，我们还发现，TNFR1与TRAIL-R和TLR3的组合丧失显著地改善严重的皮肤炎性疾病，但它并不完全预防皮肤炎症。

总体上，此研究揭示了作为皮炎的病源学的由异常死亡受体介导的细胞死亡，并且对在TNFR1不存在的情况下或当TNF被阻断时发生的自身炎症和自身免疫性的机制进行了新的揭示。

我们的结果进一步表明了，其疾病具有细胞死亡病源学但是(当前认为)对于TNF抑制难治的自身免疫患者可能从将TNF抑制与TRAIL和CD95L或如本文所述的其他靶标的抑制组合中获益。重要的是，此新的治疗示范可以延伸超出当前成功地使用TNF抑制的自身免疫疾病。

说明书和实施例1的参考文献

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实施例2-哺乳动物炎症模型

LUBAC是由若干先天性和适应性免疫受体(包括TNFR1)触发的基因激活和细胞死亡途径的关键调节物^19-21。缺乏SHARPIN的小鼠(被称为慢性增殖性皮炎小鼠(cpdm))患有由异常TNF/TNFR1诱导的RIPK1激酶活性依赖性细胞死亡^7,8,10,25导致的严重皮肤炎症^22-24。

HOIP是中心和催化活性LUBAC组分^11,13，并且其缺乏导致胚胎致死²⁶。为了理解HOIP在皮肤稳态中的作用，我们生成了在表皮角质形成细胞中选择性缺乏HOIP的小鼠(Hoip^E-KO小鼠)(扩展数据图1a-c)。HOIP缺陷消除了TNFR1信号传导复合物(TNFR1-SC)处的线性泛素化(扩展数据图1d)，并且减弱了来自Hoip^E-KO小鼠的原代鼠角质形成细胞(PMK)中由TNFR1介导的NF-κB激活(扩展数据图1e)。这些小鼠快速发展严重受损且呈鳞状的皮肤，这总是在P4与P6之间导致小鼠死亡(图1a)。P4处Hoip^E-KO小鼠的组织学分析揭示了表皮厚度、角化不全、角化过度和角质形成细胞分化缺陷增加(图1b和扩展数据图1f)。这些特征伴随髓样细胞浸润和高水平的细胞死亡，如通过增加的切割的半胱天冬酶-3和TUNEL染色所证明(图1b，c和扩展数据图1g)。总体上，这些观察揭示了Hoip^E-KO小鼠发展了特征在于炎症和异常角质形成细胞死亡的致命性皮炎。

为了评估角质形成细胞中HOIP的急性缺失的影响，我们用4-羟基他莫昔芬(4-OHT)处理成年Hoip^fl/flK14CreER^Tam成年小鼠的皮肤的局部区域。这些皮肤区域显示表皮增厚、增生、角化过度以及角化不全和角质形成细胞分化缺陷(图1d，e和扩展数据图1h，i)，伴随免疫细胞浸润和细胞死亡增加(图1e，f和扩展数据图1h，j，k)。这使人想起Hoip^E-KO小鼠的皮肤表型，证明了也需要HOIP来维持成年小鼠的皮肤稳态。

实施例3-哺乳动物炎症模型中的TNFR1和RIPK1

因为在cpdm小鼠中观察到的炎性表型被TNF、TNFR1的不存在或RIPK1的激酶死亡形式完全解救^7,8,10，我们接下来测试了TNFR1的遗传消除或RIPK1的激酶活性的遗传消除是否也可以预防Hoip^E-KO小鼠的发病和死亡。

然而，意料之外的是，在Tnfr1^KO；Hoip^E-KO小鼠中炎症仅被延迟，因为它们逐渐发展严重的皮肤病灶，从而导致70天的中值存活期(图1g和扩展数据图2a)。患病的Tnfr1^KO；Hoip^E-KO小鼠呈现表皮破坏、增厚、角化不全和角化过度(图1h和扩展数据图2b)。重要的是，与对照动物相比，髓样细胞和淋巴样细胞进行的浸润和细胞死亡在成年Tnfr1^KO；Hoip^E-KO小鼠的表皮中显著加强(图1h，i和扩展数据图2c)。

意外的是，RIPK1的激酶活性的遗传消除在预防致死性皮炎方面的效率甚至比TNFR1消除低，因为RIPK1^D138N；Hoip^E-KO小鼠在约P8处死亡，显示严重皮肤疾病的征象(扩展数据图3)。因此，角质形成细胞中由HOIP缺陷导致的致死性皮炎仅部分地由RIPK1的激酶活性介导，并且甚至在TNFR1不存在的情况下发生。

实施例4-炎症的其他哺乳动物模型

我们接下来检查了HOIL-1(第三LUBAC组分)在皮肤稳态中的作用。虽然在其他地方生成的HOIL-1缺陷小鼠被报告是健康的²⁷，但是我们发现，角质形成细胞中HOIL-1不存在(Hoil-1^E-KO小鼠)(扩展数据图4a-d)产生由严重皮炎和表皮细胞死亡增加导致的产后致死性(图2a-c和扩展数据图4e，f)。这概括了Hoip^E-KO小鼠的表型，从而证明了HOIL-1在预防表皮细胞死亡和致死性皮肤炎症方面与HOIP同样重要。此发现与我们最近的观察一致，即与HOIP的组成型丧失²⁶一样，HOIL-1的组成型丧失也导致胚胎致死(Peltzer等人,修订稿)。

与实施例3的发现一致，成年Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO小鼠在发展特征在于免疫细胞浸润和表皮细胞死亡增加的皮炎之后显示70天的中值存活期，类似于Tnfr1^KO；Hoip^E-KO小鼠的表型(图2d-f和扩展数据图4g-i)。这证明了在HOIP或HOIL-1的角质形成细胞特异性缺失的情况下，对于皮肤炎症的影响延伸超出了TNFR1信号传导的调节。

我们接下来调查了Hoip^E-KO和Hoil-1^E-KO小鼠中异常细胞死亡与炎症之间的时间关系。Hoip^E-KO和Hoil-1^E-KO小鼠的表皮中细胞死亡增加已经在E18.5处在子宫内和在出生时(P0)出现(图3a和扩展数据图5a，b)。这表明角质形成细胞中线性泛素化缺乏在无菌条件下导致异常细胞死亡。Hoip^E-KO和Hoil-1^E-KO小鼠仅在P2和P4处展示免疫细胞浸润异常增加，但在出生时并非如此(图1，2，3b，c和扩展数据图1g，4f，5c)。因此，角质形成细胞分化和表皮厚度在P2和P4处出现异常，但在E18.5或P0处未出现异常(图1，2和扩展数据图5a，d-g)。

此外，4-OHT处理的Hoip^fl/flK14CreER^Tam小鼠在免疫细胞浸润出现之前持续地表现出细胞死亡增加(扩展数据图6a-c)。因此，过多细胞死亡之后出现炎性应答，从而表明角质形成细胞中HOIP或HOIL-1丧失时细胞死亡触发致死性皮炎。

实施例5-哺乳动物炎症模型中细胞死亡诱导的机制

为了理解Hoip^E-KO和Hoil-1^E-KO小鼠的皮肤中细胞死亡诱导的机制，我们首先通过在来源于这些动物的PMK中使衔接蛋白FADD免疫沉淀来分析已知触发死亡受体下游的细胞死亡的信号传导平台的形成²⁸。这揭示了，即使在没有外源刺激的情况下，含有FADD/半胱天冬酶-8/RIPK1的复合物可易于在HOIP缺陷PMK中检测到，但在对照PMK中并非如此(图3d)。与通过这种复合物进行的细胞凋亡信号传导一致，在外源刺激不存在的情况下，HOIP缺陷细胞的活力也较低(图3e)。

这种活力丧失通过分别与ZVAD或坏死稳定素-1s一起孵育来抑制半胱天冬酶或RIPK1活性来预防，但不能通过抑制RIPK3活性来预防(图3e)。

TNFR1的遗传消除或TNF的抑制也恢复活力(图3f和扩展数据图6d)。这些结果指示在PMK中，HOIP预防由自分泌TNF触发的异常RIPK1激酶依赖性细胞凋亡。然而，体内调节细胞凋亡似乎更复杂，因为RIPK1激酶活性或TNFR1的遗传消除不预防Hoip^E-KO小鼠的皮炎。

实施例6-细胞凋亡和坏死性凋亡在哺乳动物炎症模型的细胞死亡诱导中的作用

为了评价过多细胞死亡是否可能是Hoip^E-KO和Hoil-1^E-KO小鼠中致死性皮炎的原因，我们首先探索了坏死性凋亡的作用。

与在体外观察到的细胞凋亡细胞死亡一致，Hoil-1^E-KO小鼠中Ripk3的遗传消除和Hoip^E-KO小鼠中Mlkl的遗传消除不能预防导致产后致死性的细胞死亡和皮肤炎症(图3h，i和扩展数据图7)。

因此，我们接下来通过使半胱天冬酶-8在Mlkl^KO；Hoip^E-KO和Ripk3^KO；Hoil-1^E-KO小鼠中缺失来解决细胞凋亡的作用的问题。引人注目的是，Mlkl^KO；半胱天冬酶-8^KO；Hoip^E-KO和Ripk3^KO；半胱天冬酶-8^KO；Hoil-1^E-KO小鼠两者均达到成年期而没有任何皮肤疾病的征象(图3g和扩展数据图8a-b)。与之一致的是，表皮结构和角质形成细胞分化在Ripk3^KO；半胱天冬酶-8^KO；Hoil-1^E-KO小鼠中完全正常，并且这些动物未表现出细胞死亡增加，其皮肤中也没有免疫细胞浸润(图3h-j和扩展数据图8c，d)。当Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO小鼠患上严重的皮炎(图3k和扩展数据图4g)时，Ripk3^KO；半胱天冬酶-8^KO；Hoil-1^E-KO小鼠良好地存活超过70天，但是由于淋巴结病和脾肿大而必须被处死(扩展数据图8e)，如先前针对缺乏RIPK3和半胱天冬酶-8的小鼠所报告的^29,30。

值得注意的是，半胱天冬酶-8的杂合性能够使Hoil-1^E-KO小鼠的存活延伸至P7-P9(图3k)，并且Ripk3^KO；半胱天冬酶-8^KO/WT；Hoil-1^E-KO小鼠在约第20天处发展致死性皮炎(图3k和扩展数据图8f-h)。总体上，这些结果证明了半胱天冬酶-8介导的细胞凋亡是角质形成细胞中缺乏HOIP或HOIL-1的小鼠的致死性皮炎的原因。相比之下，坏死性凋亡仅有助于产生半胱天冬酶-8^KO/WT；Hoil-1^E-KO小鼠的皮肤炎症，而在实质细胞凋亡组分保留时并非唯一地对所述皮肤炎症负责。

实施例7-哺乳动物炎症模型中的TNFR1非依赖性细胞死亡

我们然后研究了TNFR1非依赖性细胞死亡，其导致在LUBAC角质形成细胞特异性缺陷小鼠中的致死性炎症。

我们首先致力于鉴定Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO小鼠中细胞死亡的介体。

在进行TNF相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)、CD95(Fas/APO-1)配体(CD95L)或聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚(I:C))刺激时，与对照相比，来源于Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO小鼠的PMK显示细胞活力降低(图4a)，这与我们先前在其他细胞类型中的发现一致^21,32。因此，我们接下来系统性地使TRAIL-R或TLR3或使CD95的死亡结构域(DD)特异性地在Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO小鼠中的角质形成细胞中遗传消除。然而，遗憾的是，所得的Trail-r^KO；Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO、Tlr3^KO；Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO和Cd95^E-DD；Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO小鼠全部患有皮肤病灶，其强度与Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO小鼠的那些不可区分(图4c和扩展数据图9a，b)。

尽管存在此令人沮丧的结果，我们使TRAIL-R和TLR3在Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO小鼠中共缺失，并且在D70处观察到所得的Trail-r^KO；Tlr3^KO；Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO小鼠中皮肤炎症的瞬时但显著的改善(图4b，c)。然而，这些小鼠在约D80处患上炎性皮肤疾病(图4d)。

我们接下来在Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO小鼠中将TRAIL-R的丧失与DC95的DD的角质形成细胞特异性缺失组合。引人注意的是，这使得与Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO小鼠相比，在所得的Cd95^E-DD；Trail-r^KO；Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO小鼠中D70处皮炎被完全预防并且存活显著延长(图4b-d)。

因此，我们得出结论，CD95和TRAIL-R诱导的细胞死亡可以彼此补偿以驱动Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO小鼠中的炎症，并且仅当两个系统同时失活时，才可以预防TNFR1非依赖性疾病。

我们接下来研究了坏死性凋亡在Tnfr1^KO；Hoip^E-KO小鼠中的病源学中的作用。与Tnfr1^KO；Hoip^E-KO小鼠相比，Tnfr1^KO；Hoip^E-KO小鼠中的MLKL缺失显著延迟皮炎的进展，因为Mlkl^KO；Tnfr1^KO；Hoip^E-KO小鼠在D70处具有更温和的病灶(图4b，c)。然而，这些小鼠在约D90处由于严重的皮炎而死亡(图4d)。因此，虽然坏死性凋亡有助于产生TNFR1非依赖性疾病，但是它并非唯一地对其负责，因为持续的细胞凋亡足以驱动所述疾病。

实施例8-根据实施例2至7得出的结论

总体上，我们的研究揭示了HOIP和HOIL-1在预防致死性皮炎中的至关重要且先前未知的生理作用。此皮肤炎症由角质形成细胞的TNFR1依赖性死亡导致，但是重要地也由角质形成细胞的TNFR1非依赖性死亡导致(扩展数据图9c)。

此外，我们认识到，TNFR1非依赖性细胞死亡由TRAIL和CD95L信号传导系统的协调作用驱动。

这些发现对于超过当前治疗范例(即，抑制TNF)的自身炎症和自身免疫性的治疗具有若干影响。

首先，我们认识到，无论触发物如何，预防细胞死亡是治疗自身免疫性的可能有效策略。

第二，我们的研究为以下提供了证据，即包括TNF、TRAIL和CD95L的阻断剂的组合治疗可能有益于不能从单独的TNF抑制获益并且其疾病当前被归类为TNF抑制难治的自身免疫患者。任选地与RIPK1激酶抑制或本文所述的其他抑制剂结合，可以预期本发明的方法延伸至超过当前适于用TNF抑制剂治疗的自身免疫疾病的疾病。

实施例2-8的方法

小鼠。先前已经描述了Hoip^fl/fl小鼠²⁶。通过基因靶向策略生成Hoil-1^fl/fl小鼠，其中靶向盒由被Frt位点侧接的潮霉素抗性盒以及被loxP位点侧接的Hoil-1基因的外显子1和2构成。通过将这些小鼠与表达FlpE重组酶的小鼠杂交来去除潮霉素盒³⁴。为了生成Hoip^E-KO和Hoil-1^E-KO小鼠，将Hoip^fl/fl和Hoil-1^fl/fl小鼠与在人角蛋白14启动子(由Geertvan Loo获得)¹²的控制下表达Cre重组酶的小鼠(品系AZO-Nn4Cre(K14))杂交。使用TALEN技术生成Mlkl^KO小鼠。简而言之，经由Golden-gate组件克隆靶向Mlkl基因的外显子1的TALEN。针对TACCGTTTCAGATGTCA的TAL1的RVD序列是NI HD HD NN NG NG NG HD NI NN NI NG NNNG HD NI，并且针对TCGATCTTCCTGCTGCC的TAL2的RVD序列是HD NN NI NG HD NG NG HD HDNG NN HD NG NN HD HD。使用mMESSAGE

T7转录试剂盒(Ambion)体外产生加帽的RNA，并且使用聚(A)加尾试剂盒(Ambion)添加聚A尾部。将纯化的转录物混合并调整至25ng/μL。将受精卵注射到胞质和前核两者中。将胚胎转移到假孕雌性中。使用从耳孔获得的基因组DNA通过测序对幼鼠进行基因分型。选择携带19bp的导致提前终止密码子的纯合缺失的一个雌性进行进一步培育。先前已经描述了K14CreER^Tam小鼠³⁵。Tnfr1^KO、Tlr3^KO和Cd95-DD^fl小鼠(C57BL/6-Fastm1Cgn/J)购自Jackson Laboratories。Ripk3^{KO 36},半胱天冬酶-8^{KO 37},Trail-r^KO(Grosse-Wilde,A.,Voloshanenko,O.,Bailey,S.L.,Longton,G.M.,Schaefer,U.,Csernok,A.I.,Schutz,G.,Greiner,E.F.,Kemp,C.J.,和Walczak,H.(2008).TRAIL-R deficiency in mice enhances lymph node metastasis without affectingprimary tumor development.The Journal of clinical investigation 118,100-110)。

并且先前已经描述了Ripk1^D138N小鼠³⁸。为了诱导成年小鼠的皮肤中HOIP的缺失，如先前所述处理Hoip^fl/flK14CreER^Tam小鼠³⁹。简而言之，每隔一天用50μL的20mg/mL溶解在乙醇中的4-羟基他莫昔芬(4-OHT)处理背侧颈部的小刮毛区，进行总计1、2、3或4次处理，如所指示。作为媒介物处理，将尾部附近的小背侧区域刮毛并用乙醇处理。Hoip^{fl/ wt}K14CreER^Tam小鼠用作他莫昔芬对照。在最后一次处理之后2天或如图例中所指示对小鼠进行分析。如先前所述进行定时交配²⁶。通过PCR分析对所有小鼠进行分型。让群体进行随意进食。按照ASPA(动物(科学程序)法案1986)，根据英国动物福利内政部的规定，在适当的英国项目许可证下进行所有的动物实验。

免疫染色和定量。遵循标准方案，对经福尔马林固定的石蜡包埋的4μm厚的皮肤切片进行染色。简而言之，将切片在微波中在10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中煮沸。将载玻片在含有Tween 20 0.5％和BSA 0.2％的缓冲液中封闭。对于CD45染色，将载玻片在Retrievagen A(BD)中煮沸并用没有Tween的缓冲液封闭。接下来，将载玻片与一抗在4℃下一起孵育过夜。使用以下抗体：抗K14，抗K10，抗兜甲蛋白和抗K6(Covance)，抗Ki-67(Abcam)，抗CD45(BDbiosciences)，抗切割的半胱天冬酶-3(Cell Signaling)，抗HOIP(定制，Thermo Fisher Scientific)，抗HOIL-1¹¹。将载玻片与以下二抗在室温(RT)下一起孵育1h：Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG，594山羊抗兔IgG(Invitrogen)或山羊抗大鼠HRP(Cambridge bioscience)。在使用HRP缀合抗体的情况下，根据制造商的说明书应用TSA^TMPlus Cyanine 3系统(Perkin Elmer)。将切片用DAPI(Roche)复染。替代性地，根据先前所述的方案在BOND-III(Leica Microsystems)和BenchMark Ultra(Ventana-RocheMedical System)上进行常规免疫组织化学⁴⁰。对于TUNEL染色(其与切割的半胱天冬酶-3染色组合进行)，根据制造商的说明书使用ApopTag Red原位细胞凋亡检测试剂盒(MerckMillipore)。通过荧光显微镜分析切片。

获取至少十个不同的图像(40x)/载玻片。由使用ImageJ软件由不知晓样品的基因型的实验人员将单色图像定量为对于特定染色阳性的细胞相对于表皮内的细胞总数(DAPI阳性)的百分比。

表皮厚度定量。针对每只小鼠的至少10个不同地方，在每个显微场的5个不同位置中测量表皮厚度。通过使用ImageJ软件由不知晓样品的基因型的实验人员进行定量。

评分系统。基于两个主要临床标准在宏观上对小鼠进行评估。给予受病灶影响的身体的每个区域(包括头部、颈部、背部和腹部)1的得分，并且这些的总和提供病灶扩展程度的信息。另一个标准是病灶的特征：断续的小硬皮、合并的硬皮和溃疡，分别具有1至3的得分。两个标准的总和代表病灶的总严重性得分。由两个单独的研究人员进行评分。

原代鼠角质形成细胞的分离、培养和活力。根据建立的方案由Hoip^E-KO新生幼鼠、Tnfr1^KO；Hoip^E-KO和Tnfr1^KO；Hoil-1^E-KO成年尾部获得PMK⁴¹。简而言之，将皮肤与在没有钙和镁的HBSS中的0.25％胰蛋白酶(Stratech Scientific Ltd)在4℃下一起孵育。第二天，分离真皮和表皮。将细胞悬浮液在没有钙的EMEM(Lonza)中与8％螯合FCS和青霉素-链霉素(Sigma)一起培养。将PMK接种在预涂覆胶原蛋白I(Life technologies)的板中，以用于随后的实验。将PMK在补充20μM Z-VAD-fmk(Abcam)、10μM坏死稳定素-1s(CambridgeBioscience)、1μM RIPK3抑制剂(GSK2399872B)或50μg/mL依那西普

(Pfizer和来自Biotest的Pentaglobin)的培养基中培养四天，补充的培养基每天更换。在最后一天，使用CellTiter-Glo荧光细胞活力测定试剂盒(Promega)遵循制造商的说明书测量细胞活力。替代性地，将PMK用以下配体按指示处理24小时：50ng/ml小鼠iz-TRAIL、50ng/mlCD95L-Fc或100μg/ml聚(I:C)(Invitrogen)。

蛋白质印迹和免疫沉淀。如先前所述进行蛋白质印迹¹¹。简而言之，将PMK在IP裂解缓冲液(30mM Tris-HCl[pH 7.4]、120mM NaCl、2mM EDTA、2mM KCl、1％Triton X-100)、不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和1x磷酸酶抑制剂混合物2(Sigma)中在4℃下裂解20min。将裂解物用还原样品缓冲液和DTT在95℃下变性10min。将蛋白质通过SDS-PAGE(NuPAGE)分离并且用针对HOIP(定制，Thermo Fisher Scientific)、HOIL-1¹¹、Sharpin(ProteinTech)、肌动蛋白(Sigma)、微管蛋白(Sigma)、FADD(Santa Cruz)、RIPK1(BD)、切割的半胱天冬酶-8(Cell signalling)、MLKL(Millipore)、TNFR1(Abcam)、磷酸化的IκBα(Cell Signaling)、IκBα(Cell Signaling)和线性泛素(Millipore)的抗体通过蛋白质印迹分析。如先前所述进行天然TNFR1-SC的分离和FADD免疫沉淀(IP)²⁶。简而言之，将PMK在20μM Z-VAD-fmk(Abcam)的存在下培养，并且在TNFR1-SC分析的情况下用0.5μg/mL 3xFlag-2xStrep-TNF刺激持续指示的时间或不进行处理。将细胞裂解物经受使用M2珠粒(SIGMA；德国施内尔多夫)进行的抗Flag IP，持续16h。对于FADD IP，将裂解物与抗FADD抗体(SantaCruz)和蛋白质G琼脂糖珠粒(GE healthcare)在4℃下一起孵育4h。

流式细胞术。将从皮肤样品获得的细胞悬浮液用可固定活力染料

780(eBioscience)进行荧光标记。然后将样品用针对以下细胞表面标记物的抗体染色：CD45-APC、CD45-AF700、CD3-PerCP/Cy5.5、CD4-FITC、CD8-PE/Cy7、GR1-FITC、GR1-PE/Cy7、F4/80-PE、F4/80-BV786、CD11b-Percp/Cy5.5(Biolegend)、CD19-BV650和CD19-PE(Invitrogen)。用LSRFORTESSA X-20(BD)或Accuri(BD)获取样品，随后使用FlowJo软件进行数据分析。

统计。使用GraphPad Prism 6软件(GraphPad软件)或Microsoft Excel分析数据。图中所示的数据代表均值±s.e.m，如在图例中所指示。使用初步数据集来确定产生足够的统计意义所需的群组大小。通过非配对双尾学生t检验进行统计分析。使用对数秩检验确定存活曲线的统计显著性。>0.05的P值被认为是不显著的(NS)，而P≤0.05用一个星号指示，P≤0.01(**)并且P≤0.001(***)。在所有情况下，在指示的KO小鼠与相应的同窝小鼠对照之间进行比较。

实施例2-8的参考文献

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US 8153583 B2

Claims (45)

1.一种用于治疗受试者的炎性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者给予至少3种剂的组合治疗，所述组合包含：

(1)第一剂，所述第一剂中和受体TNFR1或其配体；

和

(2)第二剂，所述第二剂中和以下中的任一者：

(2a)TRAIL-R或其配体；

或者

(2b)CD95或其配体；

以及

(3)第三剂，所述第三剂中和以下中的任一者：

(3a)TLR3或TLR4或任一者的配体；或者

(3b)作为表1中所示的TNF受体超家族成员的另一种不同受体或其配体；

(3c)半胱天冬酶；

(3d)RIPK1。

2.一种增强以下的在治疗受试者的炎性疾病中的治疗有效性的方法：

(1)第一剂，所述第一剂中和受体TNFR1或其配体；

所述方法包括向所述受试者给予：

(2)第二剂，所述第二剂中和以下中的任一者：

(2a)TRAIL R或其配体；

或者

(2b)CD95或其配体；

以及

(3)第三剂，所述第三剂中和以下中的任一者：

(3a)TLR3或TLR4或任一者的配体；或者

(3b)作为表1中所示的TNF受体超家族成员的另一种不同受体或其配体；

(3c)半胱天冬酶；

(3d)RIPK1。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述中和受体或其配体的剂任一者：

(i)防止或抑制所述配体与所述受体结合；

(ii)破坏由这种结合产生的受体/配体复合物。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第一剂中和TNF和/或LT-α。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第二剂中和TRAIL-R或中和TRAIL。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二剂中和TRAIL-R1和/或TRAIL R2。

7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述第三剂中和CD95或中和CD95L。

8.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中：

(1)所述第一剂中和TNF和/或LT-α；

(2a)所述第二剂中和TRAIL-R或TRAIL；

(3a)所述第三剂中和CD95L。

9.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述第三剂中和TLR3，或者中和TLR3的配体，或TLR4或任一者的配体。

10.根据权利要求9所述的方法，其中：

(1)所述第一剂中和TNF和/或LT-α；

(2a)所述第二剂中和TRAIL-R或TRAIL；

(3a)所述第三剂中和TLR3。

11.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第二剂中和CD95或中和CD95L。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第三剂中和TLR3或中和TLR3的配体。

13.根据权利要求12所述的方法，其中：

(1)所述第一剂中和TNF和/或LT-α；

(2a)所述第二剂中和CD95或CD95L；

(3a)所述第三剂中和TLR3。

14.根据权利要求1至5或权利要求11中任一项所述的方法，其中所述第三剂中和半胱天冬酶，并且使用中和RIPK3和/或MLKL的第四剂。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述半胱天冬酶是半胱天冬酶8。

16.根据权利要求1至5或权利要求11中任一项所述的方法，其中所述第三剂中和LT-β。

17.根据权利要求1至5或权利要求11中任一项所述的方法，其中所述第三剂中和RIPK1。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述剂是干扰所述受体或配体的表达的单链或双链核苷酸(DNA、RNA(siRNA、miRNA、shRNA)、PNA、DNA-RNA杂交分子)，或者是结合并中和所述受体或配体的抗体或其片段。

19.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其利用表2中所示的抑制剂中的一种或多种。

20.根据权利要求5至10或14至17中任一项所述的方法，其利用通过以下方式降低TRAIL-R或TRAIL的生物活性的第二剂：

(a)减少所述受体的表达；

(b)增加受体脱敏或受体降解；

(c)减少TRAIL与作为内源受体的所述受体之间的相互作用；

(d)减少受体介导的细胞内信号传导；

(e)与内源受体竞争结合TRAIL；

(f)结合所述受体以阻断TRAIL结合；或

(g)结合TRAIL，从而防止与所述受体的相互作用。

21.根据权利要求20所述的方法，其利用结合并中和TRAIL的第二剂。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述剂是结合并中和TRAIL的抗体或其片段。

23.根据权利要求20至21所述的方法，其利用作为融合蛋白的剂，所述融合蛋白包含TRAIL-R的优选TRAIL-R2的与人抗体Fc结构域或其部分融合的细胞外结构域或其部分，具有或不具有抗体铰链区或其部分。

24.根据权利要求20所述的方法，其利用结合两种或更多种TRAIL-R的第二剂，或者其中所述方法利用第二剂和一种或多种另外的剂，其中的每一种结合一种或多种TRAIL-R。

25.根据权利要求23所述的方法，其中所述第二剂：

(1)是结合TRAIL-R1和TRAIL-R2两者从而中和其活性的抗体或抗体片段，或者其中

(2)所述第二剂是结合TRAIL-R1从而中和其活性的抗体或抗体片段，并且与另外的结合TRAIL-R2从而中和其活性的抗体或抗体片段一起使用。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者给予一种或多种剂或者一种或多种另外的中和外在细胞凋亡和/或坏死性凋亡的介体的剂，所述另外的剂任选地选自以下中的一种或多种：半胱天冬酶、RIPK3和MLKL。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者给予另外的抗炎生物剂或抗炎化学剂。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述另外的抗炎生物剂或化学剂是口服或局部皮质类固醇。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病选自：自身免疫疾病，其任选地选自多发性硬化(MS)、肌萎缩侧索硬化(ALS)；神经炎性疾病，其任选地是肌营养不良；神经退行性疾病，其任选地选自帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病；缺血性疾病，其任选地选自心脏、肾或脑的缺血性疾病；败血症；由HOIL-1、HOIP或OTULIN缺陷中的任一种导致的炎性疾病。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病选自表3。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述炎性疾病选自类风湿性关节炎(RA)；银屑病；炎性肠病(IBD)。

32.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病是癌症，并且所述方法还包括向所述受试者给予一种或多种另外的用于治疗所述癌症的剂或者对所述受试者进行放疗。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述一种或多种另外的用于治疗所述癌症的剂选自化疗剂；免疫检查点抑制剂，其任选地选自抗PD-1/L1和/或抗CTLA-4抗体；基于细胞的疗法，其任选地选自诸如表达转基因嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的T细胞。

34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述受试者作为患有炎性疾病的受试者被选择，并且通过针对取自所述患者的生物样品中细胞死亡的证据进行筛选而被进一步选择。

35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述受试者作为患有炎性疾病并且其中所述疾病已经被证明对于用TNF抑制剂进行的治疗难治的受试者被选择。

36.根据权利要求35所述的方法，其包括以下步骤：

(i)选择其中所述疾病已经被证明对于用TNF抑制剂进行的治疗难治的受试者；

以及

(ii)向所述受试者给予至少3种剂的所述组合治疗。

37.一种中和受体TNFR1或中和TNFR1的配体的第一剂，其用于根据权利要求1至36中任一项所述的组合方法。

38.一种中和以下中的任一者的第二剂：

(2a)TRAIL R或其配体；

或者

(2b)CD95或其配体；

所述第二剂用于根据权利要求1至36中任一项所述的组合方法。

39.一种中和以下中的任一者的第三剂：

(3a)TLR3或TLR4或任一者的配体；或者

(3b)作为表1中所示的TNF受体超家族成员的另一种不同受体或其配体；

(3c)半胱天冬酶；

(3d)RIPK1，所述第三剂用于根据权利要求1至36中任一项所述的组合方法。

40.一种至少3种剂的组合治疗，所述组合包含：

(1)第一剂，所述第一剂中和受体TNFR1或其配体；

和

(2)第二剂，所述第二剂中和以下中的任一者：

(2a)TRAIL R或其配体；

或者

(2b)CD95或其配体；

以及

(3)第三剂，所述第三剂中和以下中的任一者：

(3a)TLR3或TLR4或任一者的配体；或者

(3b)作为表1中所示的TNF受体超家族成员的另一种不同受体或其配体；

(3c)半胱天冬酶；

(3d)RIPK1，所述组合治疗用于治疗受试者的炎性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者给予至少3种剂的所述组合治疗。

41.以下的用于制造治疗受试者的炎性疾病的药剂的用途：

(1)第一剂，所述第一剂中和受体TNFR1或其配体；

和

(2)第二剂，所述第二剂中和以下中的任一者：

(2a)TRAIL R或其配体；

或者

(2b)CD95或其配体；

以及

(3)第三剂，所述第三剂中和以下中的任一者：

(3a)TLR3或TLR4或任一者的配体；或者

(3b)作为表1中所示的TNF受体超家族成员的另一种不同受体或其配体；

(3c)半胱天冬酶；

(3d)RIPK1。

42.第二剂的用于制造治疗受试者的炎性疾病的药剂的用途，

所述第二剂中和以下中的任一者：

(2a)TRAIL R或其配体；

或者

(2b)CD95或其配体；

以及

所述治疗还包括

使用以下：

(1)第一剂，所述第一剂中和受体TNFR1或其配体；

和

以及

(3)第三剂，所述第三剂中和以下中的任一者：

(3a)TLR3或TLR4或任一者的配体；或者

(3b)作为表1中所示的TNF受体超家族成员的另一种不同受体或其配体；

(3c)半胱天冬酶；

(3d)RIPK1。

43.根据权利要求39至42中任一项所述的组合治疗或用途，用于根据权利要求1至36中任一项所述的方法，或者其中所述每一种剂是根据这些权利要求中任一项所述的剂。

44.根据权利要求1至43中任一项所述的方法、治疗或用途，其中所述第一剂、所述第二剂和所述第三剂彼此在12小时内顺序给予。

45.根据权利要求1至43中任一项所述的方法、治疗或用途，其中将所述第一剂、所述第二剂和所述第三剂任选地在单一剂量单位内同时给予。

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