JP2021511289A - 組み合わせ治療薬 - Google Patents
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Abstract
【課題】TNF以外の機序により引き起こされる疾患を患う患者に対する新規の治療戦略が必要とされている。【解決手段】本発明は、複数の細胞死受容体誘発系を標的とする少なくとも3種の薬剤の組み合わせを対象に投与することに基づく、炎症性疾患を処置するための新規の処置(方法、使用、及び組成物)であって、この組み合わせは、(1)受容体TNFR1又はそのリガンドを中和する第1の薬剤と、(2)下記:(2a)TRAIL-R若しくはそのリガンド、又は(2b)CD95若しくはそのリガンドのいずれかを中和する第2の薬剤と、(3)下記:(3a)TLR3若しくはTLR4、又はいずれかのリガンド、又は(3b)表1に示すTNF受容体スーパーファミリのメンバーであるさらなる別の受容体、若しくはそのリガンド、(3c)カスパーゼ、(3d)RIPK1の内のいずれかを中和する第3の薬剤を含む、新規の処置を提供する。【選択図】なし
Description
技術分野
本発明は概して、TNF阻害剤又は関連する薬剤による疾患の処置での使用のための、改善された方法及び材料に関する。
本発明は概して、TNF阻害剤又は関連する薬剤による疾患の処置での使用のための、改善された方法及び材料に関する。
背景技術
腫瘍壊死因子(TNF)は炎症の主要な誘導因子であり1、様々な自己免疫疾患を患っている患者は、単独での又は他の薬物との組み合わせでのTNF阻害剤により、成功裏に処置され得る2。
腫瘍壊死因子(TNF)は炎症の主要な誘導因子であり1、様々な自己免疫疾患を患っている患者は、単独での又は他の薬物との組み合わせでのTNF阻害剤により、成功裏に処置され得る2。
しかしながら、TNF阻害剤による治療は必ずしも有効とは限らず、例えば、関節リウマチ(RA)を患っている患者の約50%、乾癬の患者の約65%、及び炎症性腸疾患(IBD)の患者の約60〜80%が、TNF阻害剤による処置に反応するだけである3,4。
さらに、TNF阻害剤による処置の恩恵を患者が受けない多くの他の疾患も存在する5。
Croft及びSiegel(Nature Reviews Rheumatology 13.4 (2017): 217-233)は、リウマチ性疾患の将来の治療の標的としてのTNFスーパーファミリ(TNFSF)のある特定のメンバーの可能性を論じている。彼らは、TNFSFメンバーが、免疫活性化、組織炎症反応、及び細胞死又は細胞抑制等のいくつかのプロセスを開始することに言及している。組織炎症のブロッキングに関して、例えば、TNFブロッカーに反応しなかったRA患者では、TNFに加えて、TNFSFのTWEAKメンバー及びLIGHTメンバーの中和に特に重点が置かれている(第229頁)。
特開2002−114800号は、受容体配列をベースとし且つTNF、TRAIL、及びFasLに対する阻害活性を有することが報告されているペプチドに関する。このペプチドは、リガンドにより引き起こされるアポトーシス及び炎症の阻害に有用であると言われている。
それにもかかわらず、TNF以外の機序により引き起こされる疾患(例えば、限定されないが、(自己)炎症性疾患、自己免疫疾患、及び他の疾患、例えば、上記で列挙されたもの)を患う患者に対する新規の治療戦略が必要とされている。そのような新規の処置の提供は、当該技術分野への貢献となるだろう。
本発明の開示
本発明は、炎症性疾患の新規のモデルを使用して、任意選択的に外因性のアポトーシス及びネクロトーシスのメディエータの遮断(又は他の方法による阻害)と共に、リガンド又はその受容体を遮断する(か又は他の方法で阻害する)薬剤の組み合わせにより媒介される細胞死の阻害をベースとする、そのような疾患の新規の併用療法を提供する。
本発明は、炎症性疾患の新規のモデルを使用して、任意選択的に外因性のアポトーシス及びネクロトーシスのメディエータの遮断(又は他の方法による阻害)と共に、リガンド又はその受容体を遮断する(か又は他の方法で阻害する)薬剤の組み合わせにより媒介される細胞死の阻害をベースとする、そのような疾患の新規の併用療法を提供する。
図面
ケラチノサイトにおけるHOIPの欠失により、TNFR1依存性の出生後致死、及びより高い年齢でのTNFR1非依存性の致死的皮膚炎が引き起こされることを示す。a,d,g,示した遺伝子型を有するマウスの代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=10のマウス)(a,g)。動物を、合計4回の用量で1日おきにビヒクル又は4−OHTで処置した(1つの遺伝子型当たりn=3)(d)。b,e,h,示した遺伝子型を有するマウスからの、H&E又は示した抗体で染色した皮膚切片の代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。矢印(Arrows):濃縮核、星:免疫細胞浸潤、矢印(arrowhead):錯角化、及び黒色の線:角質増殖。核をDAPIで染色した(青色)。白色の破線は、表皮(上)と真皮(下)とを分ける。スケールバー、50μm。c,f,i,示した遺伝子型(上部のパネル)を有するマウスにおける、TUNEL(赤色)及びCC3抗体(緑色)で二重に染色した皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した(青色)。白色の破線は、表皮(上)と真皮(下)とを分ける。スケールバー、50μm。示した遺伝子型(下部のパネル)を有するマウスからの皮膚切片中におけるTUNEL陽性細胞及びCC3陽性細胞の定量(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。エラーバーは、平均値±平均の標準誤差(s.e.m)を表す。*P≦0.05、***P≦0.001。CC3:切断されたカスパーゼ−3。コントロールマウスは、Hoipfl/fl;K14−Cre−及びHoipfl/wt;K14−Cre+(a〜c)、又はTnfr1KO;Hoipfl/fl;K14−Cre−及びTnfr1KO;Hoipfl/wt;K14−Cre+マウス(g〜i)のプールを表す。
「拡張データ図1」として「拡張データ図の凡例」にて説明。
HOIL−1の欠失により、TNFR1依存性の致死的皮膚炎及びTNFR1非依存性の致死的皮膚炎が引き起こされることを示す。a,d,示した遺伝子型を有するマウスの代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=10のマウス)。b,e,示した遺伝子型を有するマウスからの、H&E又は示した抗体で染色した皮膚切片の代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。矢印(Arrows):濃縮核、星:免疫浸潤、矢印(arrowhead):錯角化、及び黒色の線:角質増殖。核をDAPIで染色した(青色)。白色の破線は、表皮(上)と真皮(下)とを分ける。スケールバー、50μm。c,f,示した遺伝子型(上部のパネル)を有するマウスにおける、TUNEL(赤色)及びCC3抗体(緑色)で二重に染色した皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した(青色)。白色の破線は、表皮(上)と真皮(下)とを分ける。スケールバー、50μm。示した遺伝子型(下部のパネル)を有するマウスからの皮膚切片中におけるTUNEL陽性細胞及びCC3陽性細胞の定量(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。**P≦0.01、***P≦0.001。CC3:切断されたカスパーゼ−3。コントロールマウスは、Hoil−1fl/fl;K14−Cre−及びHoil−1fl/wt;K14−Cre+(a〜c)又はTnfr1KO;Hoil−1fl/fl;K14−Cre−及びTnfr1KO;Hoil−1fl/wt;K14−Cre+マウス(d〜f)のプールを表す。
「拡張データ図2」として「拡張データ図の凡例」にて説明。
HoipE-KOマウス及びHoil−1E-KOマウスでは、異常なアポトーシスにより致死的皮膚炎が引き起こされることを示す。a,示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片中におけるTUNEL陽性細胞及びCC3陽性細胞の定量(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05、**P≦0.01、***P≦0.001。b,P0でCD45に対する抗体で染色した(赤色)、示した遺伝子型を有するマウス(n=4)からの皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した(青色)。白色の破線は、表皮(上)と真皮(下)とを分ける。スケールバー、50μm。c,示した出生後日数での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚サンプル中における免疫細胞のフローサイトメトリー分析。棒グラフは、Forward and Side scatterプロファイルに対するCD45陽性細胞の割合を表す(1つの遺伝子型当たりn=5のマウス)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。**P≦0.01、***P≦0.001、NS=有意ではない。d,ZVAD-fmkの存在下で培養した、コントロール(+)マウス又はHoipE-KO(−)マウスに由来するPMK中で、FADD IPを実施した(n=2の独立した実験の代表的なブロット)。溶解物及びIPを、示したタンパク質に関するウエスタンブロッティングにより分析した。e,HoipE-KOマウス及びコントロールマウスに由来するPMKを、阻害剤Necrostatin-1s(N)、ZVAD-fmk(Z)、又はRIPK3iの非存在下で(NT:処置なし)又は存在下で、4日にわたり培養した。4日目に、CellTiter-Gloアッセイにより細胞生存率(%)を測定した。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す(n=5)。***P≦0.001、NS=有意ではない。CC3:切断されたカスパーゼ−3。f,示した遺伝子型を有する成体マウスに由来するPMKのCellTiter-Gloアッセイにより、細胞生存率(%)を測定した。結果を、平均値±SEM(1つの遺伝子型当たりn=8のマウス)で表す。NS=有意ではない。g,示した遺伝子型を有するマウスの代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=15のマウス)。h,示した遺伝子型を有するマウスにおける、H&E又は示した抗体で染色した皮膚切片の代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。矢印:濃縮核。核をDAPIで染色した(青色)。スケールバー、50μm。CC3:切断されたカスパーゼ−3。i,示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片中におけるTUNEL陽性細胞及びCC3陽性細胞の定量(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05、***P≦0.001、NS=有意ではない。j,D70でCD45に対する抗体で染色した(赤色)、示した遺伝子型を有するマウス(n=4)からの皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した(青色)。白色の破線は、表皮(上)と真皮(下)とを分ける。スケールバー、50μm。k,示した遺伝子型を有するマウスのKaplan Meier生存曲線。HoipE-KOマウス(n=10)と、MlklKO;HoipE-KOマウス(n=9)又はMlklKO;カスパーゼ−8KO;HoipE-KOマウス(n=4)との比較、及びHoil−1E-KOマウス(n=13)と、Ripk3KO;Hoil−1E-KOマウス(n=8)又はカスパーゼ−8KO/WT;Hoil−1E-KOマウス(n=4)又はRipk3KO;カスパーゼ−8KO/WT;Hoil−1E-KOマウス(n=11)又はRipk3KO;カスパーゼ−8KO;Hoil−1E-KOマウス(n=15)との比較を、統計解析のために提示した。**P≦0.01、***P≦0.001、NS=有意ではない。Ripk3KO;カスパーゼ−8KO;Hoil−1fl/wtK14cre+マウス(n=13)、及びMlklKO;カスパーゼ−8KO;Hoipfl/wtK14cre+マウス(n=4)を、コントロールとして使用した。カスパーゼ−8とMLKL又はRIPK3とが複合的に欠損している全てのマウスを、重度のリンパ節腫脹及び脾腫大を発症した場合に、動物福祉に関するUK内務省の規則に従って選別淘汰した。コントロールマウスは、Hoipfl/fl;K14−Cre−及びHoipfl/wt;K14−Cre+又はHoil−1fl/fl;K14−Cre−及びHoil−1fl/wt;K14−Cre+(a〜e)、Tnfr1KO;Hoipfl/fl;K14−Cre−及びTnfr1KO;Hoipfl/wt;K14−Cre+マウス(f)、Ripk3KO;Hoil−1fl/fl;K14−Cre−及びRipk3KO;Hoil−1fl/wt;K14−Cre+又はRipk3KO;カスパーゼ−8KO;Hoil−1fl/fl;K14−Cre−及びRipk3KO;カスパーゼ−8KO;Hoil−1fl/wt;K14−Cre+マウス(g〜i)のプールを表す。
「拡張データ図3」として「拡張データ図の凡例」にて説明。
CD95Lにより誘発される細胞死及びTRAILにより誘発される細胞死によりTNFR1非依存性皮膚炎が引き起こされることを示す。a,示した遺伝子型を有する成体マウスに由来するPMKを、TRAIL[50ng/ml]、CD95L[50ng/ml]、及びポリ(I:C)[100μg/ml]で24時間にわたり処置したか、又は処置しなかった。CellTiter-Gloアッセイにより細胞生存率(%)を測定した。結果を、平均値±SEMで表す(1つの遺伝子型当たりn=7のマウス)。**p≦0.01、***p≦0.001、NS=有意ではない。コントロールマウスは、Tnfr1KO;Hoil−1fl/fl;K14−Cre−及びTnfr1KO;Hoil−1fl/wt;K14−Cre+マウスのプールを表す。b,示した遺伝子型を有するマウスの代表的な画像。c,示した遺伝子型を有するマウスにおける皮膚炎の重症度スコアを、P70で評価した。病変の影響を受けた身体の領域(黒色)と病変の特徴(白色)とを評価することにより、総合スコアを決定した。Tnfr1KO;Hoil−1E-KO(n=6)、Trail−rKO;Tnfr1KO;Hoil−1E-KO(n=4)、Tlr3KO;Tnfr1KO;Hoil−1E-KO(n=4)、Cd95E-DD;Tnfr1KO;Hoil−1E-KO(n=12)、Trail−rKO;Tlr3KO;Tnfr1KO;Hoil−1E-KO(n=20)及びCd95E-DD;Trail−rKO;Tnfr1KO;Hoil−1E-KO(n=19)、MlklKO;Tnfr1KO;HoipE-KO(n=13)。d,示した遺伝子型を有するマウスのKaplan-Meier生存曲線。Tnfr1KO;Hoil−1E-KO又はTnfr1KO;HoipE-KOマウスと、示した遺伝子型を有するマウスとの比較を、統計解析のために提示した。*P≦0.05、***P≦0.001;NS=有意ではない。Tnfr1KO;Hoil−1E-KO(n=21)、Trail−rKO;Tlr3KO;Tnfr1KO;Hoil−1E-KO(n=19)及びCd95E-DD;Trail−rKO;Tnfr1KO;Hoil−1E-KO(n=32)、MlklKO;Tnfr1KO;HoipE-KO(n=17)。
「拡張データ図4」として「拡張データ図の凡例」にて説明。
「拡張データ図5」として「拡張データ図の凡例」にて説明。
「拡張データ図6」として「拡張データ図の凡例」にて説明。
「拡張データ図7」として「拡張データ図の凡例」にて説明。
「拡張データ図8」として「拡張データ図の凡例」にて説明。
「拡張データ図9」として「拡張データ図の凡例」にて説明。
そのようなリガンドの例として、TNFスーパーファミリのメンバーが挙げられる。
TNF自体に加えて、他のTNFスーパーファミリのメンバー(例えば、限定されないが、リンホトキシン(LT)−α、LT−β、CD95リガンド(CD95L;FasL又はAPO−1Lとしても既知である)、TRAIL(Apo2Lとしても既知である)、TWEAK、及びTL1A)、並びにパターン認識受容体(PPR)のリガンド(例えば、限定されないが、toll様受容体(TLR)3としても既知であるPRR)も、細胞死を誘発し得る10,11。
具体的には、本発明者らは、そのような標的に関する組み合わせ介入が相乗効果をもたらし得ることを示している。
非限定的な例として、マウス炎症モデルにおけるTNFスーパーファミリ受容体(TNFR1、TRAIL−R、及びCD95)の複合的な除去又は機能障害により、炎症が完全に予防されたが、これらの受容体の個々のターゲティングは、この効果を有しなかった。
非限定的なさらなる例として、マウス炎症モデルにおいて、TNFスーパーファミリ受容体TNFR1及びTRAIL−Rの除去と、TLR3(toll様受容体)の除去とを組み合わせることにより、これらの受容体の内の2つのみ(TNFR1及びTRAIL−R、又はTNFR1及びTLR3)の個々のターゲティングと比較して、炎症の寛解が改善された。
本発明を支持する本発明者らの他の発見を下記で説明する。
本発明者らのこれらの発見は、複数の細胞死受容体誘導系(TNFR1、TRAIL−R、及び/又はさらに第3の標的)が組み合わさって作用して炎症関連疾患の一因となり得ること、これらの細胞死受容体誘導系は互いに実際に補い得ること、そのため、そのような系を組み合わせてブロックすることにより、これらの疾患の処置が改善され得ることを実証する。
下記で説明するように、これらの受容体により媒介される細胞死の阻害を、カスパーゼの活性の阻害と有利に組み合わせ得、好ましくは、受容体共役タンパク質キナーゼ3(RIPK3)及び/又はMLKLの阻害と有利に組み合わせ得る。
これらの併用療法を下記でより詳細に説明する。
これは、例えばTNF(又は、LT−β等の他のTNFスーパーファミリリガンド)の阻害剤が単剤では働かない疾患に特に意味を持つ。疾患の例として、炎症及び炎症関連疾患(例えば、限定されないが、自己免疫疾患、神経炎症性疾患、神経変性疾患、虚血性疾患、敗血症、及び癌)が挙げられる。
本発明の態様は、本明細書で説明されている疾患の処置のための方法又は薬物の製造において、細胞死を誘発し得る他の受容体又はリガンド(例えば、TLR3若しくはTLR4及びそのリガンド)及び/又は外因性のアポトーシス及びネクロトーシスのメディエータと共にTNF受容体スーパーファミリのメンバー又はそれぞれのリガンドの生物活性を中和するか又は低下させる薬剤の組み合わせを提供する。そのような薬剤は、(例えば)TNF/LT−α、TRAIL、CD95L、又はTNFR1、TRAIL−R、CD95、RIPK1、TLR3、TLR4、カスパーゼ−8、RIPK3、及びMLKLの生物活性を低下させ得る。
本発明の方法は、細胞死受容体又は細胞死リガンドを中和して細胞死を阻害し得るか又は細胞死の阻害をもたらし得、炎症の疾患において治療上有用である。このことは、TNF/LT−α、TRAIL、CD95L、dsRNA、LPS、及び/又はTNFR1、TRAIL−R、CD95、TLR3、TLR4による細胞死の阻害若しくはこの細胞死の活性化の防止により達成されるか、又はRIPK1、RIPK3、MLKL、若しくはカスパーゼ−8による細胞死の阻害若しくはこの細胞死の活性化の防止により達成される。
TNFは、異常な細胞死の誘発により炎症を引き起こす可能性があることが既に分かっている6,7。これより以前は、TNFは、異常に高いレベルの遺伝子活性化を誘発することにより炎症及び自己免疫を引き起こすというのが定説であった。この発見に基づいて、疾患の病因がTNFにより誘発される細胞死である患者では、TNFにより誘発される遺伝子活性化を阻害するのではなくTNFにより誘発される異常な細胞死を阻害することによりTNF阻害が働く可能性があることが提案されている8。
さらに、カスパーゼ−8及びRIPK3/MLKLの欠失により、ある特定の炎症モデルにおいて皮膚炎が予防されることが既に分かっている。さらに、炎症のマウスモデルにおける致死性皮膚炎は、TNFR1により媒介されるがTNFR1にとは無関係でもある過剰なカスパーゼ−8により引き起こされるアポトーシスにより誘発されたことが既に示唆されており、このことは、TNFR1非依存性アポトーシスに起因する病理を示唆するだけでなく、RIPK1キナーゼ依存性アポトーシス及びカスパーゼ−8依存性アポトーシスに起因する病理も示唆する(例えば、Abstract presented at 15th TNF international conference, May 20-23, 2015, Ghent, Belgiumを参照されたい)。
しかしながら、これらの先行開示は、本開示の併用療法を教示も示唆もしていなかった。
そのため、本発明の一態様によれば、対象の炎症性疾患を処置する方法であって、この方法は、少なくとも3種の薬剤の組み合わせ処置を個体に施すことを含み、この組み合わせは、
(1)受容体TNFR1又はそのリガンドを中和する第1の薬剤と、
(2)下記:
(2a)TRAIL−R若しくはそのリガンド、
又は
(2b)CD95若しくはそのリガンド
のいずれかを中和する第2の薬剤と、
(3)下記:
(3a)TLR3若しくはTLR4、又はいずれかのリガンド、
又は
(3b)表1に示すTNF受容体スーパーファミリのメンバーであるさらなる別の受容体、若しくはそのリガンド、
(3c)カスパーゼ、
又は
(3d)RIPK1
のいずれかを中和する第3の薬剤と
を含む、方法が提供される。
(1)受容体TNFR1又はそのリガンドを中和する第1の薬剤と、
(2)下記:
(2a)TRAIL−R若しくはそのリガンド、
又は
(2b)CD95若しくはそのリガンド
のいずれかを中和する第2の薬剤と、
(3)下記:
(3a)TLR3若しくはTLR4、又はいずれかのリガンド、
又は
(3b)表1に示すTNF受容体スーパーファミリのメンバーであるさらなる別の受容体、若しくはそのリガンド、
(3c)カスパーゼ、
又は
(3d)RIPK1
のいずれかを中和する第3の薬剤と
を含む、方法が提供される。
この文脈における「中和する」は、直接的に(例えば、関連標的への結合により)又は間接的に生物活性を調節することを意味すると理解されるだろう。本明細書で使用される場合、用語「生物活性」は、タンパク質/受容体(結合パートナー)間の相互作用に起因するあらゆる観察可能な効果を意味する。本発明に関連する生物活性の非限定的な例として、本明細書で考察されている遺伝子(例えば、細胞のアポトーシス又はネクロトーシスに関与するもの)のシグナル伝達及び調節が挙げられる。
「中和する」は、完全な不活性化を意味しない。調節とは一般に、阻害のことであり、即ち、薬剤の非存在下で見られる活性と比較した、関連する生物活性の低下又は減少のことである。
中和は概して、(i)リガンドが受容体に結合することを防止するか、若しくは阻害し、(ii)そのような結合から生じる受容体/リガンド複合体を破壊することにより達成される。
本発明は、対象の炎症性疾患を処置するために薬剤の内のいずれか(例えば第1の薬剤)の治療有効性を増強する方法であって、他の2種の薬剤を個体に投与することを含む方法をさらに提供する。
一実施形態では、第1の薬剤は、TNF及び/又はLT−αを中和する。一実施形態では、第1の薬剤はTNFを中和する。
一実施形態では、第2の薬剤は、TRAIL−Rの内のいずれか又は組み合わせを中和するか、又はTRAILを中和する。一実施形態では、第2の薬剤はTRAIL−R2を中和する。
一実施形態では、第3の薬剤は、CD95を中和するか、又はCD95Lを中和する。そのため、本発明は、
(1)TNF及び/又はLT−αを中和する薬剤、
(2)TRAIL−R又はTRAILを中和する薬剤、
(3)CD95Lを中和する薬剤
の使用を包含する。
(1)TNF及び/又はLT−αを中和する薬剤、
(2)TRAIL−R又はTRAILを中和する薬剤、
(3)CD95Lを中和する薬剤
の使用を包含する。
別の実施形態では、第3の薬剤は、TLR3若しくはTLR4を中和するか、又はTLR3若しくはTLR4のリガンドを中和する。
一実施形態では、第2の薬剤は、CD95を中和するか、又はCD95Lを中和する。
一実施形態では、第3の薬剤は、TLR3若しくはTLR4を中和するか、又はTLR3若しくはTLR4のリガンドを中和する。
そのため、本発明は、
(1)TNF及び/又はLT−αを中和する薬剤、
(2)CD95又はCD95Lを中和する薬剤、
(3)TLR3を中和する薬剤
の使用を包含する。
(1)TNF及び/又はLT−αを中和する薬剤、
(2)CD95又はCD95Lを中和する薬剤、
(3)TLR3を中和する薬剤
の使用を包含する。
別の実施形態では、第3の薬剤は、1種又は複数種のカスパーゼ(例えば、カスパーゼ8及び/又はカスパーゼ10)を中和し、RIPK3及び/又はMLKLを中和する第4の薬剤が使用される。
別の実施形態では、第3の薬剤は、LT−βを中和する。
別の実施形態では、第3の薬剤は、RIPK1を中和する。
下記で説明するように、第4の薬剤及び他の追加の薬剤も使用し得る。
例えば、併用療法にまだ含まれていない場合には、第4の薬剤は、1種又は複数種のカスパーゼ(例えばカスパーゼ8)を中和し得、任意選択の第5の薬剤は、RIPK3及び/又はMLKLを中和し得る。
他の追加の薬剤として、当該技術分野で既知のさらなる抗炎症性生物学的薬剤又は抗炎症性化学薬剤が挙げられる。一実施形態では、このさらなる抗炎症性生物学的薬剤又は抗炎症性化学薬剤は、経口副腎皮質ステロイド又は局所副腎皮質ステロイドである。
本発明の特定の例示的な実施形態として、下記が挙げられる。
TNF/LT−α、TRAIL、CD95L、dsRNA(TLR3に結合する)、LPS(TLR4に結合する)の内の1つ若しくは複数を中和し、及び/又はTNFR1/TRAIL−R/CD95/TLR3の内の1つ若しくは複数を中和し、及び/又は下記の1つ若しくは複数の相互作用:TNF/LT−α/TNFR1、TRAIL/TRAIL−R、CD95L/CD95、dsRNA/TLR3、LPS/TLR4を減少させる薬剤の組み合わせの使用。
上記の組み合わせと組み合わせた、RIPK1、RIPK3、MLKL、又はカスパーゼ−8の活性を低下させる薬剤の使用。
リガンドTNF/LT−α、TRAIL、CD95L、dsRNA、LPSが受容体TNFR1、TRAIL−R、CD95、TLR3、TLR4それぞれに結合することを防止するか若しくは阻害するか、又はそのような結合から生じるTNF/LT−α/TNFR1複合体、TRAIL/TRAIL−R複合体、CD95L/CD95複合体、dsRNA/TLR3複合体、LPS/TLR4複合体を破壊する薬剤の組み合わせの使用。
上記で説明したリガンド−受容体結合に起因するRIPK1、RIPK3、MLKL、又はカスパーゼ−8の活性を防止するか若しくは阻害する薬剤の使用。
薬剤の例
本発明での使用に適した中和剤の例を、下記でより詳細に説明する。この中和剤の例として、小分子、受容体又はリガンドに結合して中和する抗体又はその断片、受容体又はリガンドの発現を妨げる一本鎖ヌクレオチド又は二本鎖ヌクレオチド(DNA、RNA(siRNA、miRNA、shRNA)、PNA、DNA−RNAハイブリッド分子)が挙げられる。
本発明での使用に適した中和剤の例を、下記でより詳細に説明する。この中和剤の例として、小分子、受容体又はリガンドに結合して中和する抗体又はその断片、受容体又はリガンドの発現を妨げる一本鎖ヌクレオチド又は二本鎖ヌクレオチド(DNA、RNA(siRNA、miRNA、shRNA)、PNA、DNA−RNAハイブリッド分子)が挙げられる。
そのため、非限定的な例として、本発明は、TNFR1、TRAIL−R(好ましくは、TRAIL−R1及び/又はTRAIL−R2)、CD95、TLR3、又はTLR4に結合して、その活性を中和する薬剤(例えば、受容体により媒介される細胞内シグナル伝達をブロックする)(例えば、TNFR1、TRAIL−R(好ましくは、TRAIL−R1及び/又はTRAIL−R2)、CD95、TLR3、TLR4に特異的に結合する抗体若しくはその断片、又はTLR3若しくはTLR4に特異的に結合する小分子若しくはその断片)の組み合わせを使用し得る。
本発明は、RIPK1、RIPK3、MLKL、又はカスパーゼ−8に結合する薬剤を使用し得る。例えば、RIPK1、RIPK3、MLKL、又はカスパーゼ−8に特異的に結合してその活性を中和する小分子又はその断片(例えば、キナーゼ活性又はプロテアーゼ活性をブロックする)。
この例は、抗体ヒンジ領域若しくはその一部を用いて、又は抗体ヒンジ領域若しくはその一部を用いることなく、ヒト抗体の一部(好ましくはFcドメイン)に融合している、TNFR1、TRAIL−R(好ましくは、TRAIL−R2若しくはTRAIL−R1)、CD95、TLR3、TLR4の細胞外ドメイン若しくは他のドメイン又はその一部を含む融合タンパク質である薬剤を使用し得る。
本発明は、例えば発現を減少させるようにRNA転写産物に結合することにより、TNF/LT−α、TRAIL、CD95L、及び/又はTNFR1、TRAIL−Rの内のいずれか(好ましくは、TRAIL−R1及び/又はTRAIL−R2)、CD95、TLR3、TLR4、及び/又はRIPK1、RIPK3、MLKL若しくはカスパーゼ−8の発現を妨げる一本鎖ヌクレオチド又は二本鎖ヌクレオチド(DNA、RNA(sIRNA、rhiRNA、shRNA)、PNA、DNA−RNAハイブリッド分子)である薬剤を使用し得る。
(a)受容体の発現を減少させることにより、
(b)受容体の脱感作、又は受容体の破壊を増加させることにより、
(c)TNF/LT−α、TRAIL、CD95L、dsRNA、LPSと、それぞれの内在性受容体との間の相互作用を減少させることにより、
(d)受容体により媒介される細胞内シグナル伝達を減少させることにより、
(e)TNF/LT−α、TRAIL、CD95L、dsRNA、LPSの結合に関して内在性受容体と競合することにより、
(f)受容体に結合して、TNF/LT−α、TRAIL、CD95L、dsRNA、LPSの結合をブロックすることにより、
又は
(g)TNF/LT−α、TRAIL、CD95L、dsRNA、LPSに結合して受容体との相互作用を防止することにより。
(h)RIPK1及びRIPK3のキナーゼ活性を低下させることにより、
(i)カスパーゼ−8のプロテアーゼ活性を低下させることにより、
(j)RIPK1、RIPK3、MLKL、及び/又はカスパーゼ−8の発現を減少させることにより、
(k)RIPK1と、RIPK3及び/又はカスパーゼ−8との相互作用を減少させることにより、
(l)RIPK3とMLKLとの相互作用を減少させることにより、
(m)RIPK1、RIPK3、MLKL、及び/又はカスパーゼ−8の細胞内シグナル伝達を減少させることにより、
TNFR1、TRAIL−Rの内のいずれか(好ましくは、TRAIL−R1及び/又はTRAIL−R2)、CD95、TLR3、TLR4の生物活性を低下させる薬剤の使用。
(b)受容体の脱感作、又は受容体の破壊を増加させることにより、
(c)TNF/LT−α、TRAIL、CD95L、dsRNA、LPSと、それぞれの内在性受容体との間の相互作用を減少させることにより、
(d)受容体により媒介される細胞内シグナル伝達を減少させることにより、
(e)TNF/LT−α、TRAIL、CD95L、dsRNA、LPSの結合に関して内在性受容体と競合することにより、
(f)受容体に結合して、TNF/LT−α、TRAIL、CD95L、dsRNA、LPSの結合をブロックすることにより、
又は
(g)TNF/LT−α、TRAIL、CD95L、dsRNA、LPSに結合して受容体との相互作用を防止することにより。
(h)RIPK1及びRIPK3のキナーゼ活性を低下させることにより、
(i)カスパーゼ−8のプロテアーゼ活性を低下させることにより、
(j)RIPK1、RIPK3、MLKL、及び/又はカスパーゼ−8の発現を減少させることにより、
(k)RIPK1と、RIPK3及び/又はカスパーゼ−8との相互作用を減少させることにより、
(l)RIPK3とMLKLとの相互作用を減少させることにより、
(m)RIPK1、RIPK3、MLKL、及び/又はカスパーゼ−8の細胞内シグナル伝達を減少させることにより、
TNFR1、TRAIL−Rの内のいずれか(好ましくは、TRAIL−R1及び/又はTRAIL−R2)、CD95、TLR3、TLR4の生物活性を低下させる薬剤の使用。
特許請求の範囲で列挙されているリガンドに作用する阻害剤は、市販されているか、又は本明細書で説明されている。
好ましい阻害剤を表2に示す。
これらの内のいくつかを、これからより詳細に説明する。
TNFの遮断は診療所で広く使用されており、TNF(シグナル伝達)のいくつかの阻害剤が利用可能である2。市販のモノクローナルTNF中和抗体又は組換えタンパク質は、例えば下記である:TNF及びLT−αを中和するTNFR2−免疫グロブリン融合タンパク質であるエタネルセプト/Enbrel(Amgen,Pfizer);(Johnson & Johnson)のインフリキシマブ/Remicade;(AbbVie Inc.)のアダリムマブ/Humira;ゴリムマブ/Simponi(Janssen Biotech);セルトリズマブ/Cimzia(UCB)。
LT−βの阻害のために、LT−β受容体−免疫グロブリン融合タンパク質であるバミネルセプトが利用可能である。
本発明は、
(a)受容体の発現を減少させることにより、
(b)受容体脱感作若しくは受容体破壊を増加させることにより、
(c)TRAILと、内在性受容体である受容体との間の相互作用を減少させることにより、
(d)受容体により媒介される細胞内シグナル伝達を減少させることにより、
(e)TRAILの結合に関して内在性受容体と競合することにより、
(f)受容体に結合してTRAILの結合をブロックすることにより、
又は
(g)TRAILに結合して受容体との相互作用を防止することにより、
TRAIL−Rの内のいずれか若しくは組み合わせ(好ましくは、TRAIL−R1及び/又はTRAIL−R2)、又はTRAILの生物活性を低下させる薬剤を利用し得る。
(a)受容体の発現を減少させることにより、
(b)受容体脱感作若しくは受容体破壊を増加させることにより、
(c)TRAILと、内在性受容体である受容体との間の相互作用を減少させることにより、
(d)受容体により媒介される細胞内シグナル伝達を減少させることにより、
(e)TRAILの結合に関して内在性受容体と競合することにより、
(f)受容体に結合してTRAILの結合をブロックすることにより、
又は
(g)TRAILに結合して受容体との相互作用を防止することにより、
TRAIL−Rの内のいずれか若しくは組み合わせ(好ましくは、TRAIL−R1及び/又はTRAIL−R2)、又はTRAILの生物活性を低下させる薬剤を利用し得る。
TRAILに結合して中和する薬剤に関して、TRAILに結合して中和する抗体又はその断片。
市販のモノクローナルTRAIL中和抗体は、例えば下記である:Enzo(http://www.enzolifesciences.com/ALX-804-296/trail-human-mab-2e5/)の抗ヒトTRAILクローン2E5、及びAbcam(http://www.abcam.com/TRAIL-antibody-75411-11-ab10516.html)の抗TRAIL抗体[75411.11] (ab10516)。
上記で説明したように、本発明での使用に適したTRAIL−R2−Fc融合タンパク質は、国際公開第2015001345号で説明されている。そのため、本発明は、抗体ヒンジ領域若しくはその一部を用いて、又は抗体ヒンジ領域若しくはその一部を用いることなく、ヒト抗体の一部(好ましくはFcドメイン)に融合している、TRAIL−R(好ましくはTRAIL−R2)の細胞外ドメイン又はその一部を含む融合タンパク質である薬剤を使用し得る。
本発明は、TRAIL−R2に結合してその活性を中和する薬剤(例えば、TRAIL−R2に特異的に結合する抗体又はその断片)を利用し得る。
本発明は、TRAIL−R1に結合してその活性を中和する薬剤(例えば、TRAIL−R1に特異的に結合する抗体又はその断片)を利用し得る。
本発明は、TRAIL−R1及びTRAIL−R2に結合してその活性を中和する薬剤(例えば、TRAIL−R1及びTRAIL−R2に特異的に結合する抗体又はその断片)を利用し得る。
ヒトIgG1のFc領域に融合しているヒトCD95の細胞外ドメインからなるCD95L−結合タンパク質は、CD95シグナル伝達をブロックするために使用されている12,13。CD95L阻害剤として、Apogenix's APG101 (Asunercept)が挙げられる。
エムリカサンは、カスパーゼに対する使用に適した経口活性パン−カスパーゼプロテアーゼ阻害剤である。
TLR3シグナル伝達の阻害は、TLR3に結合するdsRNAの直接阻害剤、競合阻害剤、及び高親和性阻害剤として作用する小分子により達成され得る14。
TLR3と同様に、TLR4が細胞死を誘発し得ることが知られている。TLR4のリガンドはLPS(リポ多糖)である。Gao他(2017)は、(特に)炎症性障害を処置するためにTLRシグナルを標的とする様々なTLR阻害剤/アンタゴニストの使用を論じている。
ポナチニブ及びパゾパニブは、MLKL阻害剤として知られている。コンゲンシンA及びセラストロールは、RIPK3阻害剤として知られている。
本発明の一実施形態では、本薬剤は、下記の3種の薬剤の組み合わせを含む:
・TNF阻害剤(例えば、Enbrel、Humira、又はRemicade)、
・CD95Lの阻害剤(例えばAsunercept)、
及び
・TRAILの阻害剤(例えばTRAIL−R2−Fc)。
・TNF阻害剤(例えば、Enbrel、Humira、又はRemicade)、
・CD95Lの阻害剤(例えばAsunercept)、
及び
・TRAILの阻害剤(例えばTRAIL−R2−Fc)。
さらなる実施形態では、上述した組み合わせは、RIPK1のキナーゼ活性の阻害剤と組み合わされる。
コンパニオン診断
本発明は患者選択を提供し、例えば、疾患を患っている個体は、TNF阻害剤による処置に対して難治性であることが証明されている。
本発明は患者選択を提供し、例えば、疾患を患っている個体は、TNF阻害剤による処置に対して難治性であることが証明されている。
本発明は、受容体、リガンド、又は標的の組み合わせの内の1つ、複数、又は全ての過剰発現に関して患者をスクリーニングすることを含み得、本治療方法は、この組み合わされた中和に基づく。例えば、TNF、LT−α、TRAIL、及びCD95L等。
このことは、本明細書で説明されている薬剤による処置のために患者を選択するか又は拒否するために行なわれ得る(「コンパニオン診断」)。例えば、この方法は、標的がある特定の閾値を超えて発現されているかどうかを評価すること、及び閾値を超えている場合には、本明細書で説明されている組み合わせ処置により患者を処置することを含み得る。
コンパニオン診断のために、核酸又はタンパク質を含む代表的なサンプルを使用し、このサンプルは、組織、生検プローブ、細胞溶解物、細胞培養物、細胞系統、臓器、オルガネラ、体液、血液サンプル、尿サンプル、皮膚サンプル、及び同類ものからなる群から選択され得る。
例えば、炎症性疾患又は炎症関連疾患の診断時に患者から血液又は生検を採取し、関連する標的に関してスクリーニングする可能性がある。
RNAレベル又はタンパク質レベルにより遺伝子発現を評価する方法は、当該技術分野で既知である。当業者に既知のあらゆる方法(例えば、ディファレンシャルスクリーニング、サブトラクティブハイブリダイゼーション、ディファレンシャルディスプレイ、及びマイクロアレイ)により、RNAレベルを測定し得る。タンパク質に特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかを使用してタンパク質の発現を検出して測定するための様々なプロトコルが、当該技術分野で既知である。例として、ウエスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、及び蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)が挙げられる。
好ましい例として、病理組織学的分析、免疫組織化学的検査(IHC)、インサイチュハイブリダイゼーション、RNAスコープ、又はフローサイトメトリー(FACS)が挙げられる。遺伝子発現を定量するために、長年にわたりリアルタイム定量PCRが使用されている(例えば、Giulietti, Annapaula, et al. Methods 25.4 (2001): 386-401を参照されたい)。
多くの標的用のさらなるアッセイが、例えば、Abcam(Human FAS Ligand ELISA Kit;Human TRAIL ELISA Kit等)、R&D Systems(Human TNF-alpha Quantikine ELISA Kit)等から市販されている。
本発明は、代わりに、又は加えて、細胞死マーカーに関して患者をスクリーニングすることを含み得る。
例えば、炎症性疾患又は炎症関連疾患の診断時に患者から血液又は生検を採取し、細胞死マーカー(例えば、切断されたカスパーゼ−3又はTUNEL陽性)に関してスクリーニングする可能性がある。或いは、例えば抗炎症剤又は抗TNFで処置されていて、且つそのような処置に対して抵抗性である患者も、このスクリーニングにかける可能性がある。患者が細胞死マーカーに関して陽性であることが判明した場合には、この患者を、本発明に従う処置のために選択し得る。
細胞死を検出するための市販の診断キットは、例えば、細胞死のマーカーとしてのDNA鎖切断の検出用の、Merck MilliporeのApopTag Red In Situ Apoptosis Detectionキットである。このキットは、ホルマリン固定組織で特に有効である。
細胞死の検出のための別の市販の診断技術は、切断された(即ち、活性化された)カスパーゼ−3(細胞シグナル伝達、9664)のインサイチュ検出である11。或いは、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assayキット(Promega)により、又はDNA挿入剤又は抗体を使用するFACS分析により、細胞死を検出し得る9。
本発明は、本発明のコンパニオン診断としての、そのような細胞死検出ツールの使用をさらに提供する。
本発明は、対象における、本明細書で説明されている薬剤の組み合わせによる処置の有効性の可能性を決定するための、そのようなキットの使用をさらに含む。
炎症性疾患
「炎症性疾患」には、炎症、並びに自己免疫及び癌等の炎症関連疾患が含まれる。例として、いくつかの炎症性疾患及び自己免疫疾患が挙げられ、例えば下記が挙げられる:炎症性腸疾患(例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎)、乾癬、網膜剥離(及び網膜変性)、網膜色素変性症、黄斑変性症、膵炎、アトピー性皮膚炎、関節炎(例えば、関節リウマチ、脊椎関節炎、痛風、全身型若年性特発性関節炎(SoJIA)、乾癬性関節炎)、全身性エリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群、全身性強皮症、抗リン脂質抗体症候群(APS)、血管炎、変形性関節症、肝損傷/疾患(非アルコール性脂肪性肝炎、アルコール性脂肪性肝炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性肝胆道疾患、原発性硬化性胆管炎(PSC)、アセトアミノフェン毒性、肝毒性)、腎損傷/傷害(腎炎、腎移植、手術、腎毒性薬物(例えばシスプラチン)の投与、急性腎障害(AKI))、セリアック病、自己免疫特発性血小板減少性紫斑病(自己免疫ITP)、移植片拒絶、実質臓器の虚血再灌流障害、敗血症、全身性炎症反応症候群(SIRS)、脳血管発作(CVA、脳卒中)、心筋梗塞(MI)、粥状動脈硬化、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、新生児低酸素性脳傷害、アレルギー性疾患(例えば、喘息及びアトピー性皮膚炎)、火傷(熱傷、火傷ショック)、多発性硬化症、I型糖尿病、ウェゲナー肉芽腫症、肺サルコイドーシス、ベーチェット病、インターロイキン−1変換酵素(ICE、カスパーゼ−1としても既知である)と関連する発熱症候群、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、タバコの煙により誘発される損傷、嚢胞性線維症、腫瘍壊死因子受容体関連周期性症候群(TRAPS)、新生物腫瘍、歯周炎、NEMO変異(NF−κB必須修飾因子遺伝子(IKK−ガンマ又はIKKGとしても既知である)、特に、NEMO欠損症候群、HOIL−1変異((RBCK1としても既知である)heme酸化IRP2ユビキチンリガーゼ−1欠損症)、HOIP変異((RNF31としても既知である)HOIL−1相互作用タンパク質)、XIAP変異((BIRC4としても既知である)アポトーシスのX結合阻害剤)、OTULIN変異((FAM105Bとしても既知である)直鎖結合特異性を有するOTUデユビキチナーゼ)、CYLD変異(円柱腫症)、SPATA2変異(精子形成関連2)、A20変異(TNFAIP3としても既知である)、FADD変異(Fas関連デスドメイン)、カスパーゼ−8変異、又は血液悪性腫瘍及び実質臓器悪性腫瘍、細菌感染及びウイルス感染(例えば、インフルエンザ、スタフィロコッカス(staphylococcus)、及びマイコバクテリウム(mycobacterium)(結核))、並びにリソソーム蓄積症(特に、ゴーシェ病、及び例えば、GM2ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼA欠損症、シスチン症、ダノン病、ファブリ病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、GM1ガングリオシドーシス、ムコリピドーシス、小児型遊離シアル酸蓄積症、若年型ヘキソサミニダーゼA欠損症、クラッベ病、リゾリーマル酸リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症障害、多重スルファターゼ欠損症、ニーマン・ピック病、神経セロイドリポフスチン症、ポンペ病、濃化異骨症、サンドホフ病、シンドラー病、シアル酸蓄積症、テイ・サックス病、及びウォルマン病)、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症、並びに移植臓器、組織、及び細胞の拒絶、並びにあらゆるタイプの炎症関連癌。
「炎症性疾患」には、炎症、並びに自己免疫及び癌等の炎症関連疾患が含まれる。例として、いくつかの炎症性疾患及び自己免疫疾患が挙げられ、例えば下記が挙げられる:炎症性腸疾患(例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎)、乾癬、網膜剥離(及び網膜変性)、網膜色素変性症、黄斑変性症、膵炎、アトピー性皮膚炎、関節炎(例えば、関節リウマチ、脊椎関節炎、痛風、全身型若年性特発性関節炎(SoJIA)、乾癬性関節炎)、全身性エリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群、全身性強皮症、抗リン脂質抗体症候群(APS)、血管炎、変形性関節症、肝損傷/疾患(非アルコール性脂肪性肝炎、アルコール性脂肪性肝炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性肝胆道疾患、原発性硬化性胆管炎(PSC)、アセトアミノフェン毒性、肝毒性)、腎損傷/傷害(腎炎、腎移植、手術、腎毒性薬物(例えばシスプラチン)の投与、急性腎障害(AKI))、セリアック病、自己免疫特発性血小板減少性紫斑病(自己免疫ITP)、移植片拒絶、実質臓器の虚血再灌流障害、敗血症、全身性炎症反応症候群(SIRS)、脳血管発作(CVA、脳卒中)、心筋梗塞(MI)、粥状動脈硬化、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、新生児低酸素性脳傷害、アレルギー性疾患(例えば、喘息及びアトピー性皮膚炎)、火傷(熱傷、火傷ショック)、多発性硬化症、I型糖尿病、ウェゲナー肉芽腫症、肺サルコイドーシス、ベーチェット病、インターロイキン−1変換酵素(ICE、カスパーゼ−1としても既知である)と関連する発熱症候群、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、タバコの煙により誘発される損傷、嚢胞性線維症、腫瘍壊死因子受容体関連周期性症候群(TRAPS)、新生物腫瘍、歯周炎、NEMO変異(NF−κB必須修飾因子遺伝子(IKK−ガンマ又はIKKGとしても既知である)、特に、NEMO欠損症候群、HOIL−1変異((RBCK1としても既知である)heme酸化IRP2ユビキチンリガーゼ−1欠損症)、HOIP変異((RNF31としても既知である)HOIL−1相互作用タンパク質)、XIAP変異((BIRC4としても既知である)アポトーシスのX結合阻害剤)、OTULIN変異((FAM105Bとしても既知である)直鎖結合特異性を有するOTUデユビキチナーゼ)、CYLD変異(円柱腫症)、SPATA2変異(精子形成関連2)、A20変異(TNFAIP3としても既知である)、FADD変異(Fas関連デスドメイン)、カスパーゼ−8変異、又は血液悪性腫瘍及び実質臓器悪性腫瘍、細菌感染及びウイルス感染(例えば、インフルエンザ、スタフィロコッカス(staphylococcus)、及びマイコバクテリウム(mycobacterium)(結核))、並びにリソソーム蓄積症(特に、ゴーシェ病、及び例えば、GM2ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼA欠損症、シスチン症、ダノン病、ファブリ病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、GM1ガングリオシドーシス、ムコリピドーシス、小児型遊離シアル酸蓄積症、若年型ヘキソサミニダーゼA欠損症、クラッベ病、リゾリーマル酸リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症障害、多重スルファターゼ欠損症、ニーマン・ピック病、神経セロイドリポフスチン症、ポンペ病、濃化異骨症、サンドホフ病、シンドラー病、シアル酸蓄積症、テイ・サックス病、及びウォルマン病)、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症、並びに移植臓器、組織、及び細胞の拒絶、並びにあらゆるタイプの炎症関連癌。
一実施形態では、HOIL−1、HOIP、又はOTULINの欠損症(例えば変異)の内のいずれかにより引き起こされる炎症性疾患(例えば、Krenn, Martin, et al. “Mutations outside the N-terminal part of RBCK1 may cause polyglucosan body myopathy with immunological dysfunction: expanding the genotype-phenotype spectrum.” Journal of neurology (2017): 1-8;Boisson, Bertrand, et al. “Human HOIP and LUBAC deficiency underlies autoinflammation, immunodeficiency, amylopectinosis, and lymphangiectasia.” Journal of Experimental Medicine 212.6 (2015): 939-951を参照されたい)。
一実施形態では、炎症性疾患は、多発性硬化症(MS)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)から任意選択的に選択される自己免疫疾患;任意選択的に筋ジストロフィーである神経炎症性疾患;パーキンソン病、アルツハイマー病、及びハンチントン病から任意選択的に選択される神経変性疾患;心臓、腎臓、又は脳の虚血性疾患から任意選択的に選択される虚血性疾患;敗血症からなるリストから選択される。
好ましい標的疾患は、TNF阻害が有益であると考えられる疾患を列挙する表3に示すものであり、ある特定の患者(例えば、最初の処置に反応しないか又は経時的に反応を失う患者)が成功裏に反応していないものが挙げられる。
最も好ましい一実施形態では、炎症性疾患は、関節リウマチ(RA);乾癬;炎症性腸疾患(IBD)からなるリストから選択される。
別の実施形態では、炎症性疾患は癌であり、本方法は、前記癌を処置するための1種若しくは複数種の追加の薬剤を個体に投与すること、又は前記個体に放射線療法を実施することをさらに含む。任意選択的に、前記癌を処置するための1種又は複数種の追加の薬剤は、化学療法剤;抗PD−1/L1抗体及び/又は抗CTLA−4抗体から任意選択的に選択される免疫チェックポイント阻害剤;例えばトランスジェニックキメラ抗原受容体(CAR)(又はT細胞受容体(TCR))発現T細胞から任意選択的に選択される細胞ベースの治療薬
からなるリストから選択される。
からなるリストから選択される。
併用療法
本発明の方法又は処置は、少なくとも3種の薬剤を利用する併用療法である。
本発明の方法又は処置は、少なくとも3種の薬剤を利用する併用療法である。
これらの薬剤を、同時に投与してもよいし、順次投与してもよく、且つ個々に異なる用量スケジュールで及び異なる経路で投与してもよい。例えば、順次投与する場合には、これらの薬剤を、密な間隔で(例えば、5〜10分の期間にわたり)投与し得るか、又はより長い間隔で(例えば、1、2、3、4、若しくはより長い時間離れて、又は必要な場合にはさらに長い期間離れて)投与し得、正確な投与レジメンは、治療薬の特性に見合ったものである。
薬剤(即ち、本明細書で説明されている化合物、さらに1種又は複数種の他の薬剤)を、単一剤形で一緒に製剤化してもよいし、或いは、個々の薬剤を別々に製剤化して、任意選択でこれらの使用説明書と共に、キットの形態で一緒に提示してもよい。
別の実施形態では、本発明の併用療法を、少なくとも1種の他の治療的に活性な薬剤と組み合わせて施し得、この他の治療的に活性な薬剤は、下記から選択される:血栓溶解剤、組織プラスミノーゲン活性化因子、抗凝固薬、血小板凝集抑制剤、抗菌剤(抗生物質、広域抗生物質、β−ラクタム、抗マイコバクテリア剤、殺菌性抗生物質、抗MRSA治療薬)、長期間作用性ベータアゴニスト、吸入ステロイド剤及び長期間作用性ベータアゴニストの組み合わせ、短期間作用性ベータアゴニスト、ロイコトリエン修飾薬(leukotriene modifier)、抗IgE、メチルキサンチン気管支拡張剤、肥満細胞阻害剤、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤、CRTH2/Dプロスタノイド受容体アンタゴニスト、エピネフリン吸入エアロゾル、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ホスホジエステラーゼ−3阻害剤及びホスホジエステラーゼ−4阻害剤の組み合わせ、長期間作用性吸入抗コリン作用薬、ムスカリン性アンタゴニスト、長期間作用性ムスカリン性アンタゴニスト、低用量ステロイド、吸入副腎皮質ステロイド、経口副腎皮質ステロイド、局所副腎皮質ステロイド、抗胸腺細胞グロブリン、サリドマイド、クロラムブシル、カルシウムチャネル遮断薬、局所皮膚軟化薬、ACE阻害剤、セロトニン再取り込み阻害剤、エンドセリン−1受容体阻害剤、抗線維化剤、タンパク質ポンプ阻害剤、嚢胞性線維症膜貫通透過性制御因子増強剤(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator potentiator)、粘液溶解薬、膵酵素、気管支拡張剤、眼硝子体内注射(opthalmic intravitreal injection)、抗血管内皮増殖因子阻害剤、繊毛様神経栄養成長因子剤、3価(IIV3)不活性化インフルエンザワクチン、4価(IIV4)不活性化インフルエンザワクチン、3価組換えインフルエンザワクチン、4価弱毒化生インフルエンザワクチン、抗ウイルス剤、不活性化インフルエンザワクチン、繊毛様神経栄養成長因子、遺伝子導入剤、局所免疫調節剤、カルシニューリン阻害剤、インターフェロンガンマ、抗ヒスタミン剤、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗T細胞抗体、抗胸腺細胞ガンマグロブリン−ウマ抗体、抗胸腺細胞グロブリン−ウサギ抗体、抗CD40アンタゴニスト、JAK阻害剤、及び抗TCRマウスmAb。
例示的な他の治療的に活性な薬剤として、下記が挙げられる:ヘパリン、クマジン、クロピドグレル(clopidrogel)、ジピリダモール、チクロピジンHC?、エプチフィバチド、アスピリン、バンコマイシン(vacomycin)、セフェピライム(cefeprime)、ピペラシリン及びタゾバクタムの組み合わせ、イミペネム、メロペネム、ドリペネム、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、オフロキサシン、モキシフロキサシン、ヒドロコルチゾン、ベドリズマブ、アリカホルセン、レメステメセル−L(remestemcel-L)、イキセキズマブ、ティルドラキズマブ、セクキヌマブ、クロルヘキシジン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、フルチカゾン(フルチカゾンプロピオン酸エステル、フルチカゾンフロ酸エステル)、ベクロメタゾンプロピオン酸エステル、ブデソニド、トリアムシノロンアセトニド(trimcinolone acetonide)、フルニソリド、モメタゾンフランカルボン酸エステル、シクレソニド、アルフォルモテロール酒石酸塩、ホルモテロールフマル酸塩、サルメテロールキシナホ酸塩、アルブテロール(アルブテロール硫酸塩)、レバルブテロール酒石酸塩、臭化イプラトロピウム、モンテルカストナトリウム、ザフィルルカスト、ジロートン、オマリズマブ、テオフィリン、クロモリンナトリウム、ネドクロミルナトリウム、マシチニブ、AMG 853、インダカテロール、E004、レスリズマブ、サルブタモール、臭化チオトロピウム、VR506、レブリキズマブ、RPL554、アフリベルセプト(afibercept)、ウメクリジニウム、インダカテロールマレイン酸塩、アクリジニウム臭化物、ロフルミラスト、SCH527123、臭化グリコピロニウム、オロダテロール、フルチカゾンフロ酸エステル及びビランテロールビランテロールの組み合わせ、フルチカゾンプロピオン酸エステル及びサルメテロールの組み合わせ、フルチカゾンフロ酸エステル及びフルチカゾンプロピオン酸エステルの組み合わせ、フルチカゾンプロピオン酸エステル及びホルモテロールフマル酸塩二水和物(eformoterol fumarate dihydrate)の組み合わせ、ホルモテロール及びブデソニドの組み合わせ、ベクロメタゾンプロピオン酸エステル及びホルモテロールの組み合わせ、フランカルボン酸モメタゾン及びホルモテロールフマル酸塩二水和物の組み合わせ、ウメクリジニウム及びビランテロールの組み合わせ、臭化イプラトロピウム及びアルブテロール硫酸塩の組み合わせ、臭化グリコピロニウム及びインダカテロールマレイン酸塩の組み合わせ、グリコピロレート及びフマル酸ホルモテロールの組み合わせ、アクリジニウム及びホルモテロールの組み合わせ、イソニアジド、エタンブトール、リファンピン、ピラジナミド、リファブチン、リファペンチン、カプレオマイシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、オフロキサシン、エチオナミド、サイクロセリン、カナマイシン、ストレプトマイシン、バイオマイシン、ベダキリンフマル酸塩、PNU-100480、デラマニド、イマチニブ、ARG201、トシリズマブ、ムロモナブ−CD3、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、プレドニゾロン、抗胸腺細胞グロブリン、FK506(タクロリムス)、メトトレキサート、シクロスポリン、シロリムス、エベロリムス、ミコフェノール酸ナトリウム、ミコフェノール酸モフェチル、シクロホスファミド、アザチオプリン、サリドマイド、クロラムブシル、ニフェジピン、ニカルジピン、ニトログリセリン、リシノプリル、ジルチアゼム、フルオキセチン、ボセンタン、エポプロステノール、コルヒチン、パラ−アミノ安息香酸、ジメチルスルホキシド、D−ペニシラミン、インターフェロンアルファ、インターフェロンガンマ(INF−g)、オメプラゾール、メトクロプラミド、ランソプラゾール、エソメプラゾール、パントプラゾール、ラベプラゾール、イマチニブ、ベリムマブ、ARG201、トシリズマブ、イバクフトール(ivacftor)、ドルナーゼアルファ、パンクレリパーゼ、トブラマイシン、アズトレオナム、コリスチンメタナトリウム、セファドロキシル一水和物、セファゾリン、セファレキシン、セファゾリン、モキシフロキサシン、レボフロキサシン、ゲミフロキサシン、アジスロマイシン、ゲンタマイシン、セフタジジム、トリメトプリム及びスルファメトキサゾールの組み合わせ、クロラムフェニコール、イバクフトール及びルマカフトールの組み合わせ、アタルレン、NT-501-CNTF、ミオシンVIIAをコードする遺伝子導入剤(MY07A)、ラニビズマブ、ペガプタニブナトリウム、NT501、ヒト化スフィンゴマブ(humanized sphingomab)、ベバシズマブ、オセルタミビル、ザナミビル、リマンタジン、アマンタジン、ナフシリン、スルファメトキサゾレム(sulfamethoxazolem)、トリメトプリム、スルファサラジン、アセチルスルフィソキサゾール、バンコマイシン、ムロモナブ−CD3、ASKP-1240、ASP015K、TOL101、ピメクロリムス、ヒドロコルチゾン、ベタメタゾン、フルランドレノロン、トリアムシノロン、フルオシノニド、クロベタゾール、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、組換え合成I型インターフェロン、インターフェロンアルファ−2a、インターフェロンアルファ−2b、ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、フルクロキサシリン、ジクロキサシリン、並びにエリスロマイシン。
別の実施形態では、本発明の併用療法を、少なくとも1種の他の治療的に活性な薬剤と組み合わせて施し得、例えば、上記適応症の内のいずれかの他の抗炎症剤、例えば、経口副腎皮質ステロイド又は局所副腎皮質ステロイド、5−アミノサルチル酸及びメサラミン調製物、ヒドロキシクロロキン(hydroxyeloroquine)、チオプリン、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、カルシニューリン阻害剤、ミコフェノール酸、mTOR阻害剤、JAK阻害剤、Syk阻害剤、抗炎症性生物学的薬剤、例えば、抗IL−6生物製剤、抗IL−1剤(例えば、抗IL1β及び抗IL−1α生物製剤)、抗I−17生物製剤、抗CD22、抗インテグリン剤、抗IFNα、抗CD20又はCD4生物製剤、並びにT細胞受容体又はB細胞受容体又はインターロイキンに対する他のサイトカイン阻害剤又は生物製剤)と組み合わせて施し得る。
本明細書で説明されている方法は、リガンド又は受容体の生物活性を低下させる薬剤の「治療上有効な」量を、そのような処置を必要とする対象に投与することを含み得る。生物活性を低下させ得る薬剤は、多くの手段によりその効果を達成し得る。例えば、そのような薬剤は、(非限定的な例として)受容体の発現を減少させるもの;受容体脱感作又は受容体破壊を増加させるもの;リガンドとその内在性受容体との間の相互作用を減少させるもの;受容体により媒介される細胞内シグナル伝達を減少させるもの;リガンドの結合に関して内在性受容体を競合するもの;受容体に結合してリガンドの結合をブロックするもの;又はリガンドに結合してその受容体との相互作用を防止するものであり得る。
この薬剤が受容体又はリガンドと直接相互作用することが好ましい。
好ましい一実施形態では、この薬剤は、受容体又はリガンドに結合してその活性をブロックし、又は結合して内在性リガンド/受容体複合体が適切に形成されることをブロックし、その結果、この複合体は細胞内シグナル伝達にもはや関与し得ない。
そのような標的と相互作用し得る生物学的薬物の一例は抗体であり、例えばヒト抗体又はヒト化抗体である。本発明における抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよいし、キメラ抗体であってもよいし、一本鎖抗体であってもよいし、機能性抗体断片であってもよい。
生物学的薬物の別の例は可溶性受容体タンパク質であり、例えば、受容体の細胞外タンパク質を含む可溶性受容体−Fc融合タンパク質、又はその、問題となっているそれぞれのリガンド(の受容体刺激活性)が阻害される方法でリガンドに結合し得る少なくとも一部である。
簡潔さのために、下記の実施形態を、TRAIL又はTRAIL−R(例えば、TRAIL−R1若しくはTRAIL−R2)に関する非限定的な例により説明し得る。それにもかかわらず、そのような考察の全ては、あらゆる他のTRAIL−R(例えば、TRAIL−R1、TRAIL−R3、又はTRAIL−R4)に準用されることが認識されるだろう。そのような考察の全ては、本明細書で説明されている他のリガンド及びそのそれぞれの受容体に準用されることも認識されるだろう。
抗体
本発明に係る抗体の製造のために、様々な宿主種を、標的とする上述のタンパク質又は免疫原性である2種のタンパク質の任意の断片の注射により免疫化し得る。
本発明に係る抗体の製造のために、様々な宿主種を、標的とする上述のタンパク質又は免疫原性である2種のタンパク質の任意の断片の注射により免疫化し得る。
例えば、TRAIL活性を中和するための抗体は、完全長ヒトTRAIL配列に対して産生され得る。
免疫応答を高めるために、宿主種に応じて適切なアジュバントを選択する。好ましくは、このアジュバントに対する抗体応答を誘発するために使用されるペプチド、断片、又はオリゴペプチドは、少なくとも5個のアミノ酸を含むが、好ましくは10個のアミノ酸を含む。培養中に連続細胞系統により抗体分子又はこの抗体の組換え機能性断片及び非組み換え機能性断片を産生する任意の技術を使用して、2種のタンパク質に対するモノクローナル抗体を製造し得る。この技術として、ハイブリドーマ技術、及びヒトB細胞ハイブリドーマ技術が上げられるが、これらに限定されない。加えて、キメラ抗体(例えば組換え抗体)の製造のために開発され技術を使用し得る。得られた抗体を、改変(例えば、ラベリング、抗体ストレッチ(antibody stretch)の組換え結合)と共に、若しくはこの改変なしに、又はレポーターとして機能する分子と共に、使用し得る。改変は、共有結合的であり得、及び/又は非共有結合的であり得る。
所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリーニングに、多くの様々な免疫アッセイ及び非免疫アッセイを使用し得る。既に確立されている特異性を有するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかを使用する競合的結合アッセイ及び免疫放射アッセイのための様々なプロトコルが、当該技術分野で公知である。これら免疫アッセイは概して、受容体又はリガンドとそれらの特異的抗体との間の複合体形成を測定することを含む。2種の非干渉性タンパク質エピトープに対するモノクローナル抗体を含む「サンドイッチ」(即ち両側性の)モノクローナルベースの免疫アッセイが好ましいが、競合的結合アッセイも使用し得る。
より具体的には、この抗体はγ−免疫グロブリン(IgG)であることが好ましい。抗体の可変領域はこの抗体の特異性を定義すること、及びこの領域それ自体が、本発明に係る抗体の機能性誘導体で保存されるべきであることが認識されるだろう。この可変ドメインを超える領域(C−ドメイン)は、配列が比較的不変である。本発明に係る抗体の特徴的な性質はVHドメイン及びVLドメインであることが認識されるだろう。CHドメイン及びCLドメインの正確な性質は概して本発明にとって不可欠ではないことがさらに認識されるだろう。実際に、本発明に係る好ましい抗体は、非常に異なるCHドメイン及びCLドメインを有し得る。さらに好ましい抗体機能性誘導体は、可変ドメインを含み得るがCドメインを含まない(例えば、scFV抗体)。
抗体誘導体は、ポリクローナルミックス中のモノクローナル抗体又は特異的抗体に対して75%の配列同一性を有し得、より好ましくは90%の配列同一性を有し得、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する。ほとんどの配列変化はフレームワーク領域(FR)で起こり得、抗体のCDR及びその機能性誘導体の配列はほとんど保存されていることが認識されるだろう。
本発明の多くの好ましい実施形態は、可変ドメイン及び定常ドメインの両方を有する分子に関する。しかしながら、抗体の可変領域を本質的に含むがいかなる定常領域も含まない抗体断片(例えばscFV抗体)もまた、本発明に包含されることが認識されるだろう。
ある種で生成された抗体は、異なる種を処置するために使用される場合には、いくつかの重大な欠点を有することが知られている。例えば、マウス抗体をヒトで使用する場合には、このマウス抗体は、血清中での循環半減期が短い傾向があり、且つ処置されている患者に外来タンパク質と認識される。このことにより、望ましくないヒト抗マウス(又はラット)抗体応答が発生する。このことは、抗体を頻繁に投与することが必要である場合には特に厄介であり、なぜならば、抗体のクリアランスが増強され、この抗体の治療効果がブロックされ、且つ過敏性応答が誘発される可能性があるからである。従って、ヒトの治療での使用に好ましい抗体(非ヒト由来の場合)は、ヒト化されている。
モノクローナル抗体は、非ヒトmAbの生成を通常は含むハイブリドーマ技術により生成される。この技術により、ほとんどの特異性を有する齧歯類モノクローナル抗体の作製が可能になる。従って、本発明の好ましい実施形態は、そのような技術を使用して、TRAIL受容体に対するモノクローナル抗体を開発し得る。そのような抗体は治療的に有用であるが、(上記で示唆したように)そのような抗体はヒトでの理想的な治療薬ではないことが認識されるだろう。理想的には、ヒトモノクローナル抗体が、治療への応用のための好ましい選択であるだろう。しかしながら、従来の細胞融合技術を使用するヒトmAbの生成は、これまであまり成功していない。このヒト化の問題は、非ヒト(例えば齧歯類)mAb由来のV領域配列と、ヒト抗体由来のC領域(及び理想的にはV領域由来のFR)配列とを使用する抗体を操作することにより、少なくとも部分的に対処され得る。得られた「操作された」mAbは、これが由来する齧歯類mAbと比べてヒトでの免疫原性が低く、そのため臨床での使用により適している。
ヒト化抗体は、組換えDNA技術を使用して齧歯類免疫グロブリンの定常領域がヒト抗体の定常領域に置き換えられているキメラモノクローナル抗体であってもよい。次いで、キメラH鎖遺伝子及びキメラL鎖遺伝子を、適切な調節エレメントを含む発現ベクターにクローニングし、哺乳類動物細胞に誘導して完全グリコシル化抗体を作製し得る。このプロセスのために適切なヒトH鎖C領域遺伝子を選択することにより、この抗体の生物活性を予め決定し得る。そのようなキメラ抗体は、エフェクター機能を活性化する能力を特定の治療用途に合せて調整し得るという点で、及びこのキメラ抗体が誘発する抗グロブリン応答が減少するという点で、非ヒトモノクローナル抗体よりも優れている。
そのようなキメラ分子は、本発明に係る疾患の処置に好ましい薬剤である。RT−PCRを使用して、好ましいmAbからVH遺伝子及びVL遺伝子を単離し、クローニングし、使用して、ヒトドメインを有するmAbのキメラバージョンを構築し得る。
抗体のさらなるヒト化は、抗体のCDRグラフト化又は再形成を含んでもよい。そのような抗体を、(この抗体の抗原結合部位を形成する)齧歯類mAbの重鎖CDR及び軽鎖CDRを、ヒト抗体の対応するフレームワーク領域に移植することにより作製する。
断片又は融合タンパク質
本明細書で説明されている薬剤は、受容体の一部(例えば可溶性断片)をベースとし得、任意選択的に、異種タンパク質ドメインに融合しているか又は非タンパク質部分と結合している。
本明細書で説明されている薬剤は、受容体の一部(例えば可溶性断片)をベースとし得、任意選択的に、異種タンパク質ドメインに融合しているか又は非タンパク質部分と結合している。
非限定的な例として、TRAIL阻害剤は、ヒンジ領域若しくはその一部を用いて、又はヒンジ領域若しくはその一部を用いることなく、例えばヒトIgG分子(好ましくは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はヒトIgG4のFc領域)由来の(ヒンジ領域又はその一部を含むか又は含まない)異種ポリペプチドドメイン(特に、免疫グロブリン分子のFc部分)に融合され得る、TRAIL−R1、TRAIL−R2、TRAIL−R3、TRAIL−R4、若しくはOPGの細胞外ドメイン(優先的には、TRAIL−R2のもの)又はそのリガンド結合部分、又は参照により本明細書に具体的に組み込まれるWalczak他(Walczak, H., Degli-Esposti, M.A., Johnson, R.S., Smolak, P.J., Waugh, J.Y., Boiani, N., Timour, M.S., Gerhart, M.J., Schooley, K.A., Smith, C.A., et al. (1997). TRAIL-R2: a novel apoptosis-mediating receptor for TRAIL. The EMBO journal 16, 5386-5397)並びにC.T. Rauch及び H. Walczakの特許(米国特許第6569642B1号)に従う成熟TRAIL−R2配列の細胞外ドメインを含む。
2種の完全ヒトタンパク質部分を融合させる方法を、Walczak(国際公開第2004/085478号;PCT/EP2004/003239:「改善されたFc融合タンパク質」)で説明されているように、得られた融合タンパク質の免疫原性の可能性を低下させる方法で行ない得る。
発現したTRAIL−R2には2種のスプライシング型が存在し、且つこのスプライシングはTRAIL−R2の細胞外ドメインに影響を及ぼすことから(Screaton, G.R., Mongkolsapaya, J., Xu, X.N., Cowper, A.E., McMichael, A.J., and Bell, J.I. (1997). TRICK2, a new alternatively spliced receptor that transduces the cytotoxic signal from TRAIL. Current biology: CB 7, 693-696.)、アミノ酸配列が異なるTRAIL−R2の少なくとも2種の細胞外ドメインが知られている。一実施形態では、TRAIL−R2の細胞外ドメインのTRAIL結合部分は、TRAIL阻害性TRAIL−R2融合タンパク質を構築する際に、これらの2種の内のいずれか一方に由来し得る。
本発明での使用に適したTRAIL−R2−Fc融合は、国際公開第2015001345号で説明されており、この内容は、特にTRAIL−R2−Fc融合に関して、相互参照により本明細書で明示的に組み込まれる。国際公開第2015001345号由来のTRAIL−R2−Fcポリペプチドを下記に示す。TRAIL−R2部分に下線を引いている。Fc部分を太字で示す。TRAIL−R2部分とヒトIgG1 FC部分との間に1個のアミノ酸重複が存在することに留意されたい。リーダーペプチドをイタリックで示す。成熟タンパク質は配列ITQQDLAで始まる。組換えにより製造された場合には、N末端の正確な位置は数個のアミノ酸だけ異なり得、このことは、成熟タンパク質が例えば1〜5個のアミン酸だけ短い又は長い可能性があることを意味する。
TRAILに結合してその活性を中和するTRAIL−R融合タンパク質を、培養中に連続細胞系統によりこのタンパク質の組換え及び非組み換えの完全長又は機能性断片が産生される任意の技術を使用して製造し得る。
下記で説明するように、得られたタンパク質を、改変(例えば、ラベリング、抗体ストレッチの組換え結合)と共に、若しくはこの改変なしに、又はレポーターとして機能する分子と共に、使用し得る。改変は、共有結合的であり得、及び/又は非共有結合的であり得る。
ペプチド剤
本発明に従って使用されるか又は提供されるペプチド剤又はタンパク質剤は、天然の又はオリジナルの配列の派生であり得、そのため、インビボでのこの薬剤の有効性又は半減期を増加させる誘導体を含むことが認識されるだろう。本発明に係るポリペプチドの半減期を増加させ得る誘導体の例として、ペプトイド誘導体、Dアミノ酸誘導体、及びペプチド−ペプトイドハイブリッドが挙げられる。
本発明に従って使用されるか又は提供されるペプチド剤又はタンパク質剤は、天然の又はオリジナルの配列の派生であり得、そのため、インビボでのこの薬剤の有効性又は半減期を増加させる誘導体を含むことが認識されるだろう。本発明に係るポリペプチドの半減期を増加させ得る誘導体の例として、ペプトイド誘導体、Dアミノ酸誘導体、及びペプチド−ペプトイドハイブリッドが挙げられる。
本発明に係るタンパク質剤及びペプチド剤は、多くの手段(例えば、標的部位でのプロテアーゼ活性)による分解を受け得る。そのような分解は、これらのバイオアベイラビリティを制限し、従って治療上の有用性を制限する場合がある。生物学的分文脈で安定性が増強されているペプチド誘導体を設計して製造し得る、多くの十分に確立された技術が存在する。そのようなペプチド誘導体は、プロテアーゼにより媒介される分解に対する抵抗性の増加の結果としてバイオアベイラビリティが改善され得る。好ましくは、本発明に従う使用に適した誘導体は、この誘導体が由来するタンパク質又はペプチドと比べてプロテアーゼ耐性が高い。ペプチド誘導体及びこのペプチド誘導体が由来するタンパク質又はペプチドのプロテアーゼ耐性を、公知のタンパク質分解アッセイにより評価し得る。次いで、ペプチド誘導体及びペプチドに関するプロテアーゼ耐性の相対値を比較し得る。
本発明に係るタンパク質及びペプチドのペプトイド誘導体は、本発明の第1の態様に係る受容体の知識から、又は本発明の第4、第5、若しくは第6の態様に係る薬剤の知識から、容易に設計され得る。市販のソフトウェアを使用して、十分に確立されたプロトコルに従ってペプトイド誘導体を開発し得る。
レトロペプトイド(retropeptoid)(全てのアミノ酸が逆の順序でレペプトイド残基に置き換えられている)もまた、本発明に係るタンパク質又はペプチドを模倣し得る。レトロペプトイドは、1個のペプトイド残基を含むペプチド又はペプトイド−ペプチドハイブリッドと比較して、リガンド結合溝中で逆方向に結合することが予想される。その結果、このペプトイド残基の側鎖は、オリジナルのペプチドにおける側鎖と同じ方向を示し得る。
本発明に係るペプチド又はタンパク質の改変形態のさらなる実施形態は、D−アミノ酸形態を含む。この場合には、アミノ酸残基の順序が逆になる。L−アミノ酸よりもむしろD−アミノ酸を使用するペプチドの調製により、通常の代謝プロセスによるそのような誘導体のあらゆる不要な分解が大幅に減少し、投与する必要がある誘導体の量が、この誘導体の投与頻度と共に減少する。
核酸
本発明のさらなる実施形態では、本薬剤又は本阻害剤は、核酸エフェクター分子である。
本発明のさらなる実施形態では、本薬剤又は本阻害剤は、核酸エフェクター分子である。
この核酸エフェクター分子は、DNA、RNA(例えば、siRNA、miRNA、及びshRNA)、PNA、又はDNA−RNA−ハイブリッド分子であり得る。これらは、具体的には、TRAIL配列又はTRAIL−R配列の下方制御に向けられ得る(例えば実施例5を参照されたい)。siRNAは、RNA干渉(RNAi)として既知である遺伝子サイレンシング機序の一部を形成し、これにより、mRNAが配列特異的に破壊され、遺伝子発現の標的化ノックアウトが可能になる。遺伝子サイレンシングで使用されるsiRNAは、典型的には各3'末端で2個のヌクレオチドオーバーハングを有する、21個のヌクレオチドの長さの二本鎖RNAを含み得る。或いは、ヘアピンループにより接続されているセンス配列及びアンチセンス配列を使用する短いヘアピンRNA(shRNA)を使用してもよい。siRNA及びshRNAは両方とも、化学的に合成されて、一過性RNAiのために細胞に導入され得るか、又は遺伝子発現の長期にわたる阻害のためにプロモーターから内因的に発現され得る。本発明に係る薬剤としての使用のためのsiRNA分子は、10〜50個のヌクレオチドのいずれかの二本鎖RNAを含んでもよい。好ましくは、本発明の係る薬剤としての使用のためのsiRNAは、18〜30個のヌクレオチドを含む。より好ましくは、本発明に係る薬剤としての使用のためのsiRNAは、21〜25個のヌクレオチドを含む。最も好ましくは、本発明に係る薬剤としての使用のためのsiRNAは、21個のヌクレオチドを含む。siRNAは、本発明の第2の態様に係る配列をベースとする必要があることが認識されるだろう。好ましい二本鎖siRNA分子は、相補的なアンチセンス鎖に結合しているTRAIL又はその受容体の配列由来の21〜25個の連続ヌクレオチドのセンス鎖を含む。或いは、センス配列及びアンチセンス配列を使用するshRNAが、本発明に係る薬剤として使用され得る。好ましくは、本発明に係る薬剤として用いられ得るセンス配列及びアンチセンス配列を使用するshRNAは、20〜100個のヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、核酸は本発明の他の薬剤をコードし得、例えば、説明されている融合タンパク質をコードし得る。
核酸は、一本鎖であってもよいし二本鎖であってもよい。この核酸エフェクター分子は、薬物として直接送達されてもよく(これは、「裸」にされるか又は例えばリポソーム中の可能性がある)、標的とする臓器、組織、又は細胞集団へのヌクレオチド配列の送達のために、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス若しくはワクシニアウイルス、又は細菌プラスミドから発現されてもよい。
この構築物を使用して、翻訳不能なセンス配列又はアンチセンス配列を細胞に導入し得る。
DNAへの組込みなしに、これらのベクターは、細胞ヌクレアーゼによる分解までRNA分子を産生し続け得る。ベクター系は、非複製ベクターを用いて1ヶ月以上にわたり、適切な複製エレメントがこのベクター系の一部である場合にはより長くにわたり、一時的に発現し得る。
そのため、当該技術分野で公知であるように、組換えベクターは、他の機能性エレメントを含んでもよい。例えば、組換えベクターは、このベクターが細胞内で自律的に複製するように設計され得る。この場合には、この組換えベクターには、DNA複製を誘発するエレメントが必要とされ得る。或いは、この組換えベクターは、このベクター及び核酸分子が細胞のゲノムに統合するように設計されてもよい。この場合には、(例えば相同組換えによる)標的統合を好むDNA配列が望ましい。組換えベクターはまた、クローニングプロセスにおいて選択可能マーカーとして使用され得る遺伝子をコードするDNAを有してもよい。この組換えベクターはまた、必要に応じて、核酸の発現を制御するためのプロモーター又はレギュレーターをさらに含んでもよい。
バリアント
アミノ酸配列及び核酸配列が、(例えば、融合タンパク質又は他の薬剤のコーディングに関して)本明細書で論じられている場合は常に、本明細書で開示されているアミノ酸配列及び核酸配列の機能性誘導体も想定されていることが当業者に認識され、そのような誘導体は、本明細書で言及されている配列の内のいずれかのアミノ酸/ポリペプチド/核酸配列と少なくとも30%、好ましくは40%、より好ましくは50%、さらにより好ましくは60%の配列同一性を有する配列を有し得る。言及されている配列の内のいずれかに対して好ましくは65%、より好ましくは75%、さらにより好ましくは85%、さらにより好ましくは90%を超える同一性を有するアミノ酸/ポリペプチド/核酸配列も想定される。好ましくは、アミノ酸/ポリペプチド/核酸配列は、言及されている配列の内のいずれかと92%の同一性、さらにより好ましくは95%の同一性、さらにより好ましくは97%の同一性、さらにより好ましくは98%の同一性、最も好ましくは99%の同一性を有する。
アミノ酸配列及び核酸配列が、(例えば、融合タンパク質又は他の薬剤のコーディングに関して)本明細書で論じられている場合は常に、本明細書で開示されているアミノ酸配列及び核酸配列の機能性誘導体も想定されていることが当業者に認識され、そのような誘導体は、本明細書で言及されている配列の内のいずれかのアミノ酸/ポリペプチド/核酸配列と少なくとも30%、好ましくは40%、より好ましくは50%、さらにより好ましくは60%の配列同一性を有する配列を有し得る。言及されている配列の内のいずれかに対して好ましくは65%、より好ましくは75%、さらにより好ましくは85%、さらにより好ましくは90%を超える同一性を有するアミノ酸/ポリペプチド/核酸配列も想定される。好ましくは、アミノ酸/ポリペプチド/核酸配列は、言及されている配列の内のいずれかと92%の同一性、さらにより好ましくは95%の同一性、さらにより好ましくは97%の同一性、さらにより好ましくは98%の同一性、最も好ましくは99%の同一性を有する。
異なるアミノ酸/ポリペプチド/核酸配列の間の同一性百分率の算出を、下記のように実行し得る。多重アラインメントを、ClustalXプログラム(ペアワイズパラメータ:ギャップオープニング10.0、ギャップ伸長0.1、タンパク質マトリックスGonnet 250、DNAマトリックスIUB;多重パラメータ:ギャップオープニング10.0、ギャップ伸長0.2、遅延発散配列(delay divergent sequence)30%、DNA遷移重量(DNA transition weight)0.5、負のマトリックスオフ、タンパク質マトリックスgonnetシリーズ、DNA重量IUB;タンパク質ギャップパラメータ、残基特異的ペナルティオン、親水性ペナルティオン、親水性残基GPSNDQERK、ギャップ分離距離4、エンドギャップ分離オフ)により最初に作成する。次いで、同一性百分率を、(N/T)*100(Nは、2種の配列が同一残基を共有する位置の数であり、Tは、比較する位置の総数である)として、この多重アラインメントから算出する。或いは、同一性百分率を、(N/S)*100(Sは、比較するより短い配列の長さである)として算出し得る。アミノ酸/ポリペプチド/核酸配列をデノボで合成してもよいし、天然のアミノ酸/ポリペプチド/核酸配列又はこれらの誘導体であってもよい。
或いは、実質的に類似するヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で、本明細書で言及されている核酸配列の内のいずれか又はその相補体にハイブリダイズする配列によりコードされる。ストリンジェントな条件とは、ヌクレオチドが、約45℃で、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中において、フィルタに結合したDNA又はRNAにハイブリダイズし、続いて約5〜65℃で、0.2×SSC/0.1%SDSで少なくとも1回洗浄することを意味する。或いは、実質的に類似するポリペプチドは、本発明に係るペプチド配列と少なくとも1個ではあるが5個、10個、20個、50個、又は100個未満のアミノ酸が異なり得る。
遺伝子コードの縮重に起因して、コードされる受容体タンパク質の配列に実質的に影響を及ぼすことなく、任意の核酸配列を変更するか又は変化させて、この受容体タンパク質の機能性バリアントを得ることができることは明白である。適切なヌクレオチドバリアントは、配列内の同一のアミノ酸をコードする異なるコドンの置換により変更され、そのためサイレント変化を生じる配列を有するものである。他の適切なバリアントは、相同ヌクレオチド配列を有するが、保存的変化を生じるように、置換されるアミノ酸に対して生物物理学的特徴が類似する側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換により変更されている配列の全て又は一部を含むものである。例えば、小さい非極性の疎水性アミノ酸として、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、及びメチオニンが挙げられる。大きい非極性の疎水性アミノ酸として、フェニルアライン、トリプトファン、及びチロシンが挙げられる。極性中性のアミノ酸として、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられる。正に帯電した(塩基性)アミノ酸として、リシン、アルギニン、及びヒスチジンが挙げられる。負に帯電した(酸性)アミノ酸として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。
タンパク質又はDNAの正確なアラインメントは、多くの研究者により詳細に調べられている。特に重要なのは、配列の最適なマッチングと、そのようなマッチを得るためのギャップの導入との間のトレードオフである。タンパク質の場合には、マッチをスコア化する手段も重要である。PAMマトリックス(例えば、Dayhoff, M. et al., 1978, Atlas of protein sequence and structure, Natl. Biomed. Res. Found.)及びBLOSUMマトリックスのファミリは、保存的置換の性質及び可能性を定量し、多重アラインメントアルゴリズムで使用されるが、他の同等に適用可能なマトリックスが当業者に既知であるだろう。一般的な多重アラインメントプログラムClustalW及びそのウィンドウズバージョンClustalX(Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882)は、タンパク質及びDNAの多重アラインメントを作成するのに効果的な方法である。
高頻度で、自動的に作成されるアラインメントは、研究されているタンパク質ファミリに関する熟練したユーザーの知識(例えば、重要な保存部位の生物学的知識)を利用する手動のアラインメントを必要とする。そのようなアラインメントエディタプログラムの1つは、Align(http://www.gwdg.de/~dhepper/download/; Hepperle, D., 2001: Multicolor Sequence Alignment Editor. Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries, 16775 Stechlin, Germany)であるが、他のもの(例えばJalView又はCinema)も適している。
タンパク質間の同一性百分率の算出は、Clustalによる多重アラインメントの作成の最中に行なわれる。しかしながら、この値は、このアラインメントが手動により改善されている場合には、又は2種の配列を意図的に比較するために、再算出される必要がある。アラインメント内のタンパク質配列のペアに関するこの値を算出するプログラムとして、アミノ酸置換(P)のモデルとして「Similarity Table」オプションを使用するPHYLIP系統パッケージ(Felsenstein; http://evolution.gs.washington.edu/ phylip.html)内のPROTDISTが挙げられる。DNA/RNAの場合には、同一のオプションがPHYLIPのDNADISTプログラム内に存在する。
タンパク質配列における他の改変(即ち、例えば、アセチル化、アミド化、カルボキル化、リン酸化、タンパク質分解切断、又はリガンドへの連結により、翻訳の最中又は後に生じるもの)も想定され、且つ特許請求されている本発明の範囲内である。
組成物、投与量、及びレジメン
本発明で利用される薬剤(例えば、TNF/LT−α/TNFR1、TRAIL/TRAIL−R、CD95L/CD95、dsRNA/TLR3、LPS/TLR4、RIPK1、カスパーゼ−8、RIPK3、及びMLKLにより引き起こされる細胞死及び炎症を中和する、TNF/LT−α、TRAIL、CD95L、又はTNFR1、TRAIL−R、CD95、TLR3、TLR4、カスパーゼ−8、RIPK3、MLKL、又はRIPK1に結合する薬剤)を、「医薬組成物」として提供してもよい。
本発明で利用される薬剤(例えば、TNF/LT−α/TNFR1、TRAIL/TRAIL−R、CD95L/CD95、dsRNA/TLR3、LPS/TLR4、RIPK1、カスパーゼ−8、RIPK3、及びMLKLにより引き起こされる細胞死及び炎症を中和する、TNF/LT−α、TRAIL、CD95L、又はTNFR1、TRAIL−R、CD95、TLR3、TLR4、カスパーゼ−8、RIPK3、MLKL、又はRIPK1に結合する薬剤)を、「医薬組成物」として提供してもよい。
医薬組成物を、単独で投与してもよいし、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、ブドウ糖、及び水が挙げられるがこれらに限定されない任意の滅菌された生体適合性のある医薬担体溶液中で投与され得る少なくとも1種の他の薬剤(例えば安定化化合物)と組み合わせて投与してもよい。この組成物を、単独で患者に投与してもよいし、他の薬剤、薬物、又はホルモンと組み合わせて患者に投与してもよい。本発明で詳述されている医薬組成物を、あらゆる経路(例えば、限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内(intraventricular)、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、又は直腸の手段)により投与し得る。
医薬組成物は一般に、意図された目的を達成するのに有効な量で薬剤を含む。
有効用量の決定は、十分に熟練者の能力内である。任意の化合物に関して、治療上有効な用量を、例えば細胞系統の細胞培養アッセイ、又は通常はマウスであるがそれに限定されない動物モデルのいずれかにおいて、最初に推定し得る。同様に、動物モデルを使用して、適切な濃度範囲及び投与経路を決定し得る。そのようなパイロット実験に基づいて、ヒトでの投与に有用な用量及び経路を決定し得る。治療上有効な用量は、特定の状態を処置するのに十分な有効成分(例えば、本発明の核酸若しくはタンパク質、又は抗体)の量を指す。治療上での有効性及び毒性を、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順により決定し得、例えば、ED50(集団の50%において治療上有効な用量)及びLD50(集団の50%に致死的な用量)により決定し得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療指数であり、LD50/ED50で表され得る。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。投与量は、好ましくは、毒性がほぼないED50を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、用いられる投与量、患者の感受性、及び投与経路に依存して、この範囲内で変動する。正確な投与量は、処置を必要とする対象に関連する因子を考慮して、専門家により決定される。投与量及び投与を、十分なレベルの活性部位を提供するために、又は所望の効果を維持するために、調整する。考慮され得る因子として、病状の重症度の、対象の全身の健康状態、対象の年齢、体重、及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ、反応感度、並びに治療に対する耐性/応答が挙げられる。長時間作用する医薬組成物を、特定の製剤の半減期及びクリアランス率に応じて、3〜4日に1回、1週間に1回、又は2週間に1回投与し得る。通常の投与量は、投与経路に応じて、0.1〜100,000マイクログラムで変動し得、最大で約1gの総用量であり得る。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、当業者は一般に入手可能である。当業者は、ヌクレオチドに関して、タンパク質又はその阻害剤の場合とは異なる製剤を用いる。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達は、上記で詳述したように特定の細胞又は状態に特異的である。
概説
用語「処置」は、本明細書においてある状態を処置する文脈で使用される場合、一般に、ヒトか(例えば獣医学的用途での)動物かに関わりなく、いくつかの所望の治療効果(例えば、この状態の進行の阻害)が達成される処置及び治療に関し、進行速度の低下(生存期間の延長)、進行速度の停止、この状態の後退、この状態の寛解、及びこの状態の治癒を含む。
用語「処置」は、本明細書においてある状態を処置する文脈で使用される場合、一般に、ヒトか(例えば獣医学的用途での)動物かに関わりなく、いくつかの所望の治療効果(例えば、この状態の進行の阻害)が達成される処置及び治療に関し、進行速度の低下(生存期間の延長)、進行速度の停止、この状態の後退、この状態の寛解、及びこの状態の治癒を含む。
用語「治療上有効な量」は、本明細書で使用される場合、所望の処置レジメンに従って投与された場合に、合理的な利益/リスク比に見合って、いくつかの所望の治療効果をもたらすのに有効な本発明の化合物、又は前記化合物を含む材料、組成物、若しくは剤形(dosage from)の量に関する。本発明者らは、本発明の疾患に関するMT化合物の治療上有効な量が、これまで当該技術分野で理解されていたのと比べてはるかに低い量であり得ることを実証している。
本発明はまた、予防手段としての処置も含まれることを包含し、「処置する」は、それに応じて理解されるだろう。予防的処置は、「予防上有効な量」を利用し得、この量は、本明細書で使用される場合、所望の処置レジメンに従って投与された場合に、合理的な利益/リスク比に見合って、いくつかの所望の予防効果をもたらすのに有効な薬剤の量に関する。
本明細書の文脈における「予防」は、完全な成功(即ち、完全な保護又は完全な予防)を制限するように理解されるべきではない。むしろ、本文脈における予防は、ある症候性の状態を遅延させるか、緩和するか、又は回避することを助けることにより健康を維持することを目的として、この特定の状態の検出に先だって施される措置を指す。
薬剤を利用する処置方法が本明細書で説明されている場合は常に、この方法での使用のための薬剤(第1、第2、第3の薬剤の内のいずれか1つ)も説明されており、関連する炎症性疾患を処置するための薬物の製造での使用のための薬剤(第1、第2、第3の薬剤の内のいずれか1つ)も説明されていることが認識されるだろう。同様に説明されているのは、他の2種の薬剤の活性を増強する方法での使用のための第1、第2、第3の薬剤の内のいずれか1つである。
組成物が本明細書で説明されている場合は常に、本明細書で説明されている治療方法(予防方法を含む)での使用のための同一の組成物も想定され、関連する炎症性疾患を処置するための薬物の製造における使用のための組成物も想定されることが認識されるだろう。
本明細書では、本発明及び本発明が関連する技術水準をより完全に説明し且つ開示するために、多くの特許及び刊行物が引用されている。これらの参考文献のそれぞれは、本明細書では、各個々の参考文献が、参照により組み込まれることが具体的に且つ個別に示されていた場合と同程度まで、その全体が本開示に参照により組み込まれる。
別途文脈が求めない限り、本明細書(後続する特許請求の範囲を含む)全体を通して、単語「含む(comprise)」、並びに「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」等の変化形は、述べられている整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群の包含を意味するが、いかなる他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群の排除も意味しないことが理解されるだろう。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、別途文脈が明確に示さない限り、単数形「a」、「an」、及び「the」は複数の参照対象を含むことに留意しなければならない。そのため、例えば、「医薬担体(a pharmaceutical carrier)」への言及は、2種以上のそのような担体の混合物及び同類のものを含む。
範囲は、本明細書では、「約」ある特定の値から及び/又は「約」別の特定の値までとして表現されることが多い。そのような範囲が表現されている場合には、別の実施形態は、ある特定の値から及び/又は他の特定の値までを含む。同様に、値が、先行詞「約」の使用により近似値として表現されている場合には、この特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるだろう。
本明細書におけるあらゆるサブタイトルは、便宜のみのために含まれており、決して本開示を限定すると解釈してはならない。
これより、下記の非限定的な図及び実施例を参照して本発明をさらに説明する。これらを考慮して、当業者は、本発明の他の実施形態に気付くだろう。
拡張データ図の凡例
拡張データ図1:ケラチノサイトにおけるHOIPの欠損の生成及びキャラクタリゼーションを示す。a,示した遺伝子型を有するマウスの耳パンチから単離されたDNAのPCR遺伝子型判定。b,示した遺伝子型を有するマウスに由来するPMKにおけるLUBAC成分のウエスタンブロット分析。c,P4でHOIPに対する抗体で染色した皮膚切片の代表的な画像。スケールバー、50μm。d,ZVAD-fmkの存在下で培養してFLAG−TNFで刺激した、コントロール(+)マウス又はHoipE-KO(−)マウスに由来するPMK中におけるFLAG IPにより、内在性TNFR1複合体Iのプルダウンを実施した。溶解物及びIPを、示したタンパク質に関するウエスタンブロッティングにより分析した。e,様々な時点(分)での、Hisタグ付きTNF[100ng/ml]刺激後のコントロール(+)マウス及びHoipE-KO(−)マウスに由来するPMKからの全細胞溶解物中における、示したタンパク質のウエスタンブロット分析。f,P4での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片の表皮厚の定量(1つの遺伝子型当たりn=4のマウス)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。***P≦0.001。g,P4での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚サンプル中における免疫細胞のフローサイトメトリー分析。棒グラフは、live and Side Scatterプロファイルに対するCD45+、CD11b+GR−1+、CD11b+F4/80+及びCD19+、CD3+細胞の割合を示す(1つの遺伝子型当たりn=5のマウス)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。**P≦0.01、***P≦0.001。NS=有意ではない。h,合計4回の用量で1日おきにビヒクル又は4−OHTで処置し、H&E又は示した抗体で染色したHoipfl/wtK14CreERtamマウスの皮膚切片の代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。核をDAPIで染色した(青色)。白色の破線は、表皮(上)と真皮(下)とを分ける。スケールバー、50μm。i,示した遺伝子型を有し且つ(h)と同様に処置されたマウスの表皮厚の定量(1つの表現型当たりn=3)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05、NS=有意ではない。j,ImageJを使用して全体の蛍光強度を測定することにより、hと同様に処置した、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片におけるCD45染色の定量を実施した。au=任意の単位。k,示した遺伝子型(上部のパネル)を有するマウスにおける、TUNEL(赤色)及びCC3抗体(緑色)で二重に染色した皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した(青色)。白色の破線は、表皮(上)と真皮(下)とを分ける。スケールバー、50μm。示されている(下部のパネル)ように処置したHoipfl/wtK14CreERtamマウスからの皮膚切片中におけるTUNEL陽性細胞及びCC3陽性細胞の定量(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。CC3を検出しなかった(nd)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。NS=有意ではない。CC3:切断されたカスパーゼ−3。コントロールマウスは、Tnfr1KOHoipfl/fl;K14−Cre−及びTnfr1KOHoipfl/wt;K14−Cre+マウス(b)、又はHoipfl/fl;K14−Cre−及びHoipfl/wt;K14−Cre+マウス(c,f,g)のプールを表す。
拡張データ図2:HoipE-KOマウスにおけるTNFR1欠損により、成体期に皮膚炎症が引き起こされることを示す。a,示した遺伝子型を有するマウスのKaplan-Meier生存曲線。HoipE-KOマウス(n=10)とTnfr1KO;HoipE-KOマウス(n=27)との比較を、統計解析のために提示した。***P≦0.001。Tnfr1KO;HoipE-KOマウスを、動物福祉に関するUK内務省の規則に従って、重度の皮膚疾患に起因して選別淘汰した。b,D70での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片の表皮厚の定量(1つの遺伝子型当たりn=4)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。***P≦0.001。c,D70での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚サンプル中における免疫細胞のフローサイトメトリー分析。棒グラフは、ライブ及びSide Scatterプロファイルに対する、示した免疫細胞亜集団の割合を示す(1つの遺伝子型当たりn=5)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05、**P≦0.01、***P≦0.001。コントロールマウスは、Tnfr1KO;Hoipfl/fl;K14−Cre−及びTnfr1KO;Hoipfl/wt;K14−Cre+マウス(b,c)のプールを表す。
拡張データ図3:RIPK1のキナーゼ活性の遺伝的阻害により、HoipE-KOマウスの致死が4日遅れることを示す。a,示した出生後日数でのマウスの代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=8のマウス)。矢印は、P8でのRIPK1D138N;HoipE-KOマウスを示す(右側のパネル)。RIPK1D138N;HoipE-KOマウスは、P4ではコントロール同腹子と識別不能であった(左側のパネル)。b,示した遺伝子型を有するマウスからの、H&Eで染色した皮膚切片の代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。矢印(Arrows):濃縮核、星:免疫細胞浸潤、矢印(arrowhead):錯角化、及び黒色の線:角質増殖。スケールバー、50μm。コントロールマウスは、RIPK1D138N;Hoipfl/fl;K14−Cre−及びRIPK1D138N;Hoipfl/wt;K14−Cre+マウスのプールを表す。
拡張データ図4:Hoil−1E-KOマウス及びTnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスの作成及びキャラクタリゼーションを示す。a,Hoil−1E-KOマウスを作成するために従うノックアウト戦略の略図。b,示した遺伝子型を有するマウスの耳パンチから単離されたDNAのPCR遺伝子型判定。c,示した遺伝子型を有するマウスに由来するPMKにおけるLUBAC成分のウエスタンブロット分析。d,P4でHOIL−1に対する抗体で染色した皮膚切片の代表的な画像。スケールバー、50μm。e,h,P4(e)及びD70(h)での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片の表皮厚の定量(1つの遺伝子型当たりn=4)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。**P≦0.01、***P≦0.001。f,i,P4(f)及びD70(i)での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚サンプル中における免疫細胞のフローサイトメトリー分析。棒グラフは、Forward and Side scatterプロファイルに対するCD45陽性細胞の割合を表す(1つの遺伝子型当たりn=5)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05、**P≦0.01。g,示した遺伝子型を有するマウスのKaplan-Meier生存曲線。Hoil−1E-KOマウス(n=12)マウスと、Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウス(n=20)との比較を、統計解析のために提示した。Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスを、動物福祉に関するUK内務省の規則に従って選別淘汰した。***P≦0.001。コントロールマウスは、Hoil−1fl/fl;K14−Cre−及びHoil−1fl/wt;K14−Cre+(d〜f)又はTnfr1KO;Hoil−1fl/fl;K14−Cre−及びTnfr1KO;Hoil−1fl/wt;K14−Cre+マウス(c,g〜i)のプールを表す。
拡張データ図5:様々な日でのHoipE-KOマウス及びHoil−1E-KOマウスの分析を示す。a,b,示した時間で示した染色及び対応する定量(TUNEL(赤色)及びCC3抗体(緑色))を行なった、HoipE-KOマウスからの皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した(青色)。白色の破線は、表皮(上)と真皮(下)とを分ける。矢印は濃縮核を示す。スケールバー、50μm。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05、**P≦0.01(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。c,P2での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚サンプル中における免疫細胞のフローサイトメトリー分析。棒グラフは、Forward and Side scatterプロファイルに対する示した免疫細胞亜集団の割合を表す(1つの遺伝子型当たりn=5)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05、***P≦0.001。d,e,P0(d)及びP2(f)で示したように染色した、示した遺伝子型を有するマウスの皮膚切片の代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。矢印は濃縮核を示す。核をDAPIで染色した(青色)。スケールバー、50μm。f,g,P0(f)及びP2(g)での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片の表皮厚の定量(1つの遺伝子型当たりn=3)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05、**P≦0.01、NS=有意ではない。CC3=切断されたカスパーゼ−3。コントロールマウスは、Hoipfl/fl;K14−Cre−及びHoipfl/wt;K14−Cre+又はHoil−1fl/fl;K14−Cre−及びHoil−1fl/wt;K14−Cre+(a〜g)のプールを表す。
拡張データ図6:成体マウスのケラチノサイトにおいてHOIPが欠失した場合には、細胞死が炎症に先行することを示す。a,ビヒクル又は4−OHTによる1回、2回、又は3回の処置の後に分析し、示したように染色した、Hoipfl/flK14CreERtamマウスの代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=3)。矢印:濃縮核、星:免疫浸潤。核をDAPIで染色した(青色)。スケールバー、50μm。b,(a)と同様に処置したHoipfl/flK14CreERtamマウスの皮膚切片におけるTUNEL陽性細胞の定量(1つの遺伝子型当たりn=3)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。***P≦0.001、NS=有意ではない。c,ImageJを使用して全体の蛍光強度を測定することにより、aと同様に処置したHoipfl/flK14CreERtamマウスからの皮膚切片におけるCD45染色の定量を実施した。NS=有意ではない(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。au=任意の単位。d,HoipE-KOマウス及びコントロールマウスに由来するPMKを、エタネルセプト(Enbrel(登録商標))[50μg/ml]と共に又はなし(NT)で培養した。CellTiter-Gloアッセイにより細胞生存率(%)を測定した。結果を、平均値±s.e.mで表す(1つの遺伝子型当たりn=7のマウス)。*P≦0.05、**P≦0.01、***P≦0.001。コントロールマウスは、Hoipfl/fl;K14−Cre−及びHoipfl/wt;K14−Cre+のプールを表す。
拡張データ図7:RIPK3/MLKLにより媒介されるネクロトーシスの欠失は、LUBAC特異的ケラチノサイト欠損マウスの表現型には影響を及ぼさないことを示す。a,g,示した遺伝子型を有するマウスの交配の後に得られた動物の遺伝子型統計を示す表。Mendelian度数(Mendelian frequency)に従って、得られた(離乳した)動物の数と、予想される動物の数とを報告する。b,h,P5での、示した遺伝子型を有するマウスの代表的な画像。c,i,P0(c)及びP4(i)で示したように染色した、示した遺伝子型を有するマウスの皮膚切片の代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=4)。矢印は濃縮核を示す。核をDAPIで染色した(青色)。スケールバー、50μm。d,j,P0(d)及びP4(j)での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片の表皮厚の定量(1つの遺伝子型当たりn=4)。エラーバーは、平均値±s.e.m.表す。*P≦0.05、NS=有意ではない。e,k,示した遺伝子型(上部のパネル)を有するマウスにおける、TUNEL(赤色)及びCC3抗体(緑色)で二重に染色した皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した(青色)。白色の破線は、表皮(上)と真皮(下)とを分ける。スケールバー、50μm。示した遺伝子型(下部のパネル)を有するマウスからの皮膚切片中におけるTUNEL陽性細胞及びCC3陽性細胞の定量(1つの遺伝子型当たりn=3)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05、**P≦0.01。CC3:切断されたカスパーゼ−3。f,示した遺伝子型を有するマウスに由来する示した臓器におけるMLKL発現のウエスタンブロット分析。コントロールマウスは、Ripk3KO;Hoil−1fl/fl;K14−Cre−及びRipk3KO;Hoil−1fl/wt;K14−Cre+マウス(b〜e)、並びにMlklKO;Hoipfl/fl;K14−Cre−及びMlklKO;Hoipfl/wt;K14−Cre+マウス(h〜k)のプールを表す。
拡張データ図8:RIPK3及びカスパーゼ−8の複合的な欠失により、Hoil−1E-KOマウスの致死的炎症表現型が完全の防止されることを示す。a,示した遺伝子型を有するマウスの交配の後に得られた動物の遺伝子型統計を示す表。Mendelian度数に従って、得られた(離乳した)動物の数と、予想される動物の数とを報告する。b,g,示した表現型を有するマウスの代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=4(b)及び11(g))。c,生後から指定した日数での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片の表皮厚の定量(1つの遺伝子型当たりn=3)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05、NS=有意ではない。d,示した遺伝子型を有するマウスにおける、TUNEL(赤色)及びCC3抗体(緑色)で二重に染色した皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した(青色)。白色の破線は、表皮(上)と真皮(下)とを分ける。スケールバー、50μm。e,約7ヶ月での、示した遺伝子型を有するマウスからの軸リンパ節及び脾臓の代表的な画像。f,D20で示したように染色した、示した遺伝子型を有するマウスの皮膚切片の代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=3)。矢印は濃縮核を示す。核をDAPIで染色した(青色)。スケールバー、50μm。h,示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片における、TUNEL陽性細胞及びCC3陽性細胞の定量(1つの遺伝子型当たりn=3)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05。CC3:切断されたカスパーゼ−3。コントロールマウスは、MlklKO;カスパーゼ−8KO;Hoipfl/fl;K14−Cre−及びMlklKO;カスパーゼ−8KO;Hoipfl/wt;K14−Cre+(b)又はRipk3KO;カスパーゼ−8KO;Hoil−1fl/fl;K14−Cre−、Ripk3KO;カスパーゼ−8KO;Hoil−1fl/wt;K14−Cre+又はRipk3KO;カスパーゼ−8KO/WT;Hoil−1fl/fl;K14−Cre−及びRipk3KO;カスパーゼ−8KO/WT;Hoil−1fl/wt;K14−Cre+マウス(c、d、f〜h)のプールを表す。
拡張データ図9:TLR3、CD95のDD、又はTRAIL−Rの欠失のみでは、TNFR1非依存性の皮膚炎を予防するには不十分であることを示す。a,示した遺伝子型を有するマウスの代表的な画像。b,Kaplan-Meier生存曲線、Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスと、示した遺伝子型を有するマウスとの比較を、統計解析のために提示した。Tnfr1KO;Hoil−1E-KO(n=21)、Trail−rKO;Tnfr1KO;Hoil−1E-KO(n=11)、Tlr3KOTnfr1KO;Hoil−1E-KO(n=6)、及びCd95E-DD;Tnfr1KO;Hoil−1E-KO(n=15)。c,示した遺伝子型を有するマウスの寿命。
拡張データ図1:ケラチノサイトにおけるHOIPの欠損の生成及びキャラクタリゼーションを示す。a,示した遺伝子型を有するマウスの耳パンチから単離されたDNAのPCR遺伝子型判定。b,示した遺伝子型を有するマウスに由来するPMKにおけるLUBAC成分のウエスタンブロット分析。c,P4でHOIPに対する抗体で染色した皮膚切片の代表的な画像。スケールバー、50μm。d,ZVAD-fmkの存在下で培養してFLAG−TNFで刺激した、コントロール(+)マウス又はHoipE-KO(−)マウスに由来するPMK中におけるFLAG IPにより、内在性TNFR1複合体Iのプルダウンを実施した。溶解物及びIPを、示したタンパク質に関するウエスタンブロッティングにより分析した。e,様々な時点(分)での、Hisタグ付きTNF[100ng/ml]刺激後のコントロール(+)マウス及びHoipE-KO(−)マウスに由来するPMKからの全細胞溶解物中における、示したタンパク質のウエスタンブロット分析。f,P4での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片の表皮厚の定量(1つの遺伝子型当たりn=4のマウス)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。***P≦0.001。g,P4での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚サンプル中における免疫細胞のフローサイトメトリー分析。棒グラフは、live and Side Scatterプロファイルに対するCD45+、CD11b+GR−1+、CD11b+F4/80+及びCD19+、CD3+細胞の割合を示す(1つの遺伝子型当たりn=5のマウス)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。**P≦0.01、***P≦0.001。NS=有意ではない。h,合計4回の用量で1日おきにビヒクル又は4−OHTで処置し、H&E又は示した抗体で染色したHoipfl/wtK14CreERtamマウスの皮膚切片の代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。核をDAPIで染色した(青色)。白色の破線は、表皮(上)と真皮(下)とを分ける。スケールバー、50μm。i,示した遺伝子型を有し且つ(h)と同様に処置されたマウスの表皮厚の定量(1つの表現型当たりn=3)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05、NS=有意ではない。j,ImageJを使用して全体の蛍光強度を測定することにより、hと同様に処置した、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片におけるCD45染色の定量を実施した。au=任意の単位。k,示した遺伝子型(上部のパネル)を有するマウスにおける、TUNEL(赤色)及びCC3抗体(緑色)で二重に染色した皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した(青色)。白色の破線は、表皮(上)と真皮(下)とを分ける。スケールバー、50μm。示されている(下部のパネル)ように処置したHoipfl/wtK14CreERtamマウスからの皮膚切片中におけるTUNEL陽性細胞及びCC3陽性細胞の定量(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。CC3を検出しなかった(nd)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。NS=有意ではない。CC3:切断されたカスパーゼ−3。コントロールマウスは、Tnfr1KOHoipfl/fl;K14−Cre−及びTnfr1KOHoipfl/wt;K14−Cre+マウス(b)、又はHoipfl/fl;K14−Cre−及びHoipfl/wt;K14−Cre+マウス(c,f,g)のプールを表す。
拡張データ図2:HoipE-KOマウスにおけるTNFR1欠損により、成体期に皮膚炎症が引き起こされることを示す。a,示した遺伝子型を有するマウスのKaplan-Meier生存曲線。HoipE-KOマウス(n=10)とTnfr1KO;HoipE-KOマウス(n=27)との比較を、統計解析のために提示した。***P≦0.001。Tnfr1KO;HoipE-KOマウスを、動物福祉に関するUK内務省の規則に従って、重度の皮膚疾患に起因して選別淘汰した。b,D70での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片の表皮厚の定量(1つの遺伝子型当たりn=4)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。***P≦0.001。c,D70での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚サンプル中における免疫細胞のフローサイトメトリー分析。棒グラフは、ライブ及びSide Scatterプロファイルに対する、示した免疫細胞亜集団の割合を示す(1つの遺伝子型当たりn=5)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05、**P≦0.01、***P≦0.001。コントロールマウスは、Tnfr1KO;Hoipfl/fl;K14−Cre−及びTnfr1KO;Hoipfl/wt;K14−Cre+マウス(b,c)のプールを表す。
拡張データ図3:RIPK1のキナーゼ活性の遺伝的阻害により、HoipE-KOマウスの致死が4日遅れることを示す。a,示した出生後日数でのマウスの代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=8のマウス)。矢印は、P8でのRIPK1D138N;HoipE-KOマウスを示す(右側のパネル)。RIPK1D138N;HoipE-KOマウスは、P4ではコントロール同腹子と識別不能であった(左側のパネル)。b,示した遺伝子型を有するマウスからの、H&Eで染色した皮膚切片の代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。矢印(Arrows):濃縮核、星:免疫細胞浸潤、矢印(arrowhead):錯角化、及び黒色の線:角質増殖。スケールバー、50μm。コントロールマウスは、RIPK1D138N;Hoipfl/fl;K14−Cre−及びRIPK1D138N;Hoipfl/wt;K14−Cre+マウスのプールを表す。
拡張データ図4:Hoil−1E-KOマウス及びTnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスの作成及びキャラクタリゼーションを示す。a,Hoil−1E-KOマウスを作成するために従うノックアウト戦略の略図。b,示した遺伝子型を有するマウスの耳パンチから単離されたDNAのPCR遺伝子型判定。c,示した遺伝子型を有するマウスに由来するPMKにおけるLUBAC成分のウエスタンブロット分析。d,P4でHOIL−1に対する抗体で染色した皮膚切片の代表的な画像。スケールバー、50μm。e,h,P4(e)及びD70(h)での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片の表皮厚の定量(1つの遺伝子型当たりn=4)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。**P≦0.01、***P≦0.001。f,i,P4(f)及びD70(i)での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚サンプル中における免疫細胞のフローサイトメトリー分析。棒グラフは、Forward and Side scatterプロファイルに対するCD45陽性細胞の割合を表す(1つの遺伝子型当たりn=5)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05、**P≦0.01。g,示した遺伝子型を有するマウスのKaplan-Meier生存曲線。Hoil−1E-KOマウス(n=12)マウスと、Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウス(n=20)との比較を、統計解析のために提示した。Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスを、動物福祉に関するUK内務省の規則に従って選別淘汰した。***P≦0.001。コントロールマウスは、Hoil−1fl/fl;K14−Cre−及びHoil−1fl/wt;K14−Cre+(d〜f)又はTnfr1KO;Hoil−1fl/fl;K14−Cre−及びTnfr1KO;Hoil−1fl/wt;K14−Cre+マウス(c,g〜i)のプールを表す。
拡張データ図5:様々な日でのHoipE-KOマウス及びHoil−1E-KOマウスの分析を示す。a,b,示した時間で示した染色及び対応する定量(TUNEL(赤色)及びCC3抗体(緑色))を行なった、HoipE-KOマウスからの皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した(青色)。白色の破線は、表皮(上)と真皮(下)とを分ける。矢印は濃縮核を示す。スケールバー、50μm。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05、**P≦0.01(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。c,P2での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚サンプル中における免疫細胞のフローサイトメトリー分析。棒グラフは、Forward and Side scatterプロファイルに対する示した免疫細胞亜集団の割合を表す(1つの遺伝子型当たりn=5)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05、***P≦0.001。d,e,P0(d)及びP2(f)で示したように染色した、示した遺伝子型を有するマウスの皮膚切片の代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。矢印は濃縮核を示す。核をDAPIで染色した(青色)。スケールバー、50μm。f,g,P0(f)及びP2(g)での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片の表皮厚の定量(1つの遺伝子型当たりn=3)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05、**P≦0.01、NS=有意ではない。CC3=切断されたカスパーゼ−3。コントロールマウスは、Hoipfl/fl;K14−Cre−及びHoipfl/wt;K14−Cre+又はHoil−1fl/fl;K14−Cre−及びHoil−1fl/wt;K14−Cre+(a〜g)のプールを表す。
拡張データ図6:成体マウスのケラチノサイトにおいてHOIPが欠失した場合には、細胞死が炎症に先行することを示す。a,ビヒクル又は4−OHTによる1回、2回、又は3回の処置の後に分析し、示したように染色した、Hoipfl/flK14CreERtamマウスの代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=3)。矢印:濃縮核、星:免疫浸潤。核をDAPIで染色した(青色)。スケールバー、50μm。b,(a)と同様に処置したHoipfl/flK14CreERtamマウスの皮膚切片におけるTUNEL陽性細胞の定量(1つの遺伝子型当たりn=3)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。***P≦0.001、NS=有意ではない。c,ImageJを使用して全体の蛍光強度を測定することにより、aと同様に処置したHoipfl/flK14CreERtamマウスからの皮膚切片におけるCD45染色の定量を実施した。NS=有意ではない(1つの遺伝子型当たりn=3のマウス)。au=任意の単位。d,HoipE-KOマウス及びコントロールマウスに由来するPMKを、エタネルセプト(Enbrel(登録商標))[50μg/ml]と共に又はなし(NT)で培養した。CellTiter-Gloアッセイにより細胞生存率(%)を測定した。結果を、平均値±s.e.mで表す(1つの遺伝子型当たりn=7のマウス)。*P≦0.05、**P≦0.01、***P≦0.001。コントロールマウスは、Hoipfl/fl;K14−Cre−及びHoipfl/wt;K14−Cre+のプールを表す。
拡張データ図7:RIPK3/MLKLにより媒介されるネクロトーシスの欠失は、LUBAC特異的ケラチノサイト欠損マウスの表現型には影響を及ぼさないことを示す。a,g,示した遺伝子型を有するマウスの交配の後に得られた動物の遺伝子型統計を示す表。Mendelian度数(Mendelian frequency)に従って、得られた(離乳した)動物の数と、予想される動物の数とを報告する。b,h,P5での、示した遺伝子型を有するマウスの代表的な画像。c,i,P0(c)及びP4(i)で示したように染色した、示した遺伝子型を有するマウスの皮膚切片の代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=4)。矢印は濃縮核を示す。核をDAPIで染色した(青色)。スケールバー、50μm。d,j,P0(d)及びP4(j)での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片の表皮厚の定量(1つの遺伝子型当たりn=4)。エラーバーは、平均値±s.e.m.表す。*P≦0.05、NS=有意ではない。e,k,示した遺伝子型(上部のパネル)を有するマウスにおける、TUNEL(赤色)及びCC3抗体(緑色)で二重に染色した皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した(青色)。白色の破線は、表皮(上)と真皮(下)とを分ける。スケールバー、50μm。示した遺伝子型(下部のパネル)を有するマウスからの皮膚切片中におけるTUNEL陽性細胞及びCC3陽性細胞の定量(1つの遺伝子型当たりn=3)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05、**P≦0.01。CC3:切断されたカスパーゼ−3。f,示した遺伝子型を有するマウスに由来する示した臓器におけるMLKL発現のウエスタンブロット分析。コントロールマウスは、Ripk3KO;Hoil−1fl/fl;K14−Cre−及びRipk3KO;Hoil−1fl/wt;K14−Cre+マウス(b〜e)、並びにMlklKO;Hoipfl/fl;K14−Cre−及びMlklKO;Hoipfl/wt;K14−Cre+マウス(h〜k)のプールを表す。
拡張データ図8:RIPK3及びカスパーゼ−8の複合的な欠失により、Hoil−1E-KOマウスの致死的炎症表現型が完全の防止されることを示す。a,示した遺伝子型を有するマウスの交配の後に得られた動物の遺伝子型統計を示す表。Mendelian度数に従って、得られた(離乳した)動物の数と、予想される動物の数とを報告する。b,g,示した表現型を有するマウスの代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=4(b)及び11(g))。c,生後から指定した日数での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片の表皮厚の定量(1つの遺伝子型当たりn=3)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05、NS=有意ではない。d,示した遺伝子型を有するマウスにおける、TUNEL(赤色)及びCC3抗体(緑色)で二重に染色した皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した(青色)。白色の破線は、表皮(上)と真皮(下)とを分ける。スケールバー、50μm。e,約7ヶ月での、示した遺伝子型を有するマウスからの軸リンパ節及び脾臓の代表的な画像。f,D20で示したように染色した、示した遺伝子型を有するマウスの皮膚切片の代表的な画像(1つの遺伝子型当たりn=3)。矢印は濃縮核を示す。核をDAPIで染色した(青色)。スケールバー、50μm。h,示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片における、TUNEL陽性細胞及びCC3陽性細胞の定量(1つの遺伝子型当たりn=3)。エラーバーは、平均値±s.e.mを表す。*P≦0.05。CC3:切断されたカスパーゼ−3。コントロールマウスは、MlklKO;カスパーゼ−8KO;Hoipfl/fl;K14−Cre−及びMlklKO;カスパーゼ−8KO;Hoipfl/wt;K14−Cre+(b)又はRipk3KO;カスパーゼ−8KO;Hoil−1fl/fl;K14−Cre−、Ripk3KO;カスパーゼ−8KO;Hoil−1fl/wt;K14−Cre+又はRipk3KO;カスパーゼ−8KO/WT;Hoil−1fl/fl;K14−Cre−及びRipk3KO;カスパーゼ−8KO/WT;Hoil−1fl/wt;K14−Cre+マウス(c、d、f〜h)のプールを表す。
拡張データ図9:TLR3、CD95のDD、又はTRAIL−Rの欠失のみでは、TNFR1非依存性の皮膚炎を予防するには不十分であることを示す。a,示した遺伝子型を有するマウスの代表的な画像。b,Kaplan-Meier生存曲線、Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスと、示した遺伝子型を有するマウスとの比較を、統計解析のために提示した。Tnfr1KO;Hoil−1E-KO(n=21)、Trail−rKO;Tnfr1KO;Hoil−1E-KO(n=11)、Tlr3KOTnfr1KO;Hoil−1E-KO(n=6)、及びCd95E-DD;Tnfr1KO;Hoil−1E-KO(n=15)。c,示した遺伝子型を有するマウスの寿命。
実施例1−概要
本発明者らは現在、マウスにおける疾患モデルを開発しており、この疾患モデルでは、動物は、2011年及び2013年での本発明者らの研究6,7で本発明者らが利用したモデルと比べて重症の炎症性皮膚疾患を発症する。
本発明者らは現在、マウスにおける疾患モデルを開発しており、この疾患モデルでは、動物は、2011年及び2013年での本発明者らの研究6,7で本発明者らが利用したモデルと比べて重症の炎症性皮膚疾患を発症する。
具体的には、直鎖状ユビキチン鎖集合複合体(linear ubiquitin chain assembly complex)(LUBAC)6〜9の構成成分であるSHARPINは、TNFにより誘発されるRIPK1キナーゼ活性依存性細胞死を阻害することにより、炎症を予防する7,8,10。
本モデルでは、本発明者らは、他の2種のLUBAC構成成分HOIP又はHOIL−111〜13のいずれかでのケラチノサイト特異的欠失(HoipE-KOマウス及びHoil−1E-KOマウス)により出生後の致死性皮膚炎症が引き起こされることを示す。
SHARPIN変異動物とは対照的に、HoipE-KOマウス及びHoil−1E-KOマウスでは、TNFR1の欠失は致死性皮膚炎を抑止せず、遅延させるだけであった。TNFR1の遺伝的アブレーションにより、この受容体を介した細胞死誘発が完全に不活性化され、遺伝子活性化も完全に不活性化される。このことは、これらの新規モデルでは、TNFR1により媒介されるシグナル伝達が炎症の一因となるが、炎症の唯一の原因ではないことを意味する。
本発明者らは、TRAIL−R、TLR3の構成的欠失、又はケラチノサイトにおけるCD95のデスドメイン(DD)の特異的欠失のいずれかとの、TNFR1の複合的な構成的欠失は、TNFR1を構成的に欠失させた場合と比較して炎症の発症をそれ以上遅延させないことを発見した。
しかしながら、際立ったことに、TNFR1の構成的欠失は、TRAIL−Rの構成的欠失及びケラチノサイトにおけるCD95のDDの特異的欠失と組み合わせた場合には、得られたマウスにおける任意の炎症性症候群の発症を予想外にも予防した。
そのため、TNFR1の非存在下では、CD95L及びTRAILは一緒に、細胞死を誘発することにより致死性皮膚炎を引き起こす原因となる。
さらに、本発明者らはまた、TNFR1の欠失と、TRAIL−R及びTLR3の欠失とを組み合わせることにより、皮膚炎症は完全には予防されないが、重度の皮膚炎症疾患が有意に寛解されることも発見した。
まとめると、この研究は、皮膚炎の病因として、細胞死受容体により媒介される異常な細胞死を明らかにし、TNFR1の非存在下で起こるか又はTNFがブロックされた場合に起こる自己炎症及び自己免疫の機序に新たな光を当てる。
本発明者らの結果は、細胞死病因を有するがTNF阻害に対して抵抗性である(と現在は考えられる)自己免疫疾患の患者が、TNF阻害と、TRAIL及びCD95Lか又は本明細書で説明されているような他の標的の阻害との組み合わせから利益を得る可能性があることをさらに示唆する。重要なことに、この新規の処置パラダイムは、現在TNF阻害が成功裏に使用されている自己免疫疾患を超えて広がる可能性がある。
説明及び実施例1の参考文献
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13 von Karstedt, S., Montinaro, A. & Walczak, H. Exploring the TRAILs less trav elled: TRAIL in cancer biology and therapy. Nature reviews. Cancer 17, 352 -366, doi:10.1038/nrc.2017.28 (2017).
14 Wick, W. et al. A phase II, randomized, study of weekly APG101+reirradiation versus reirradiation in progressive glioblastoma. Clinical cancer researc h : an official journal of the American Association for Cancer Research 20 , 6304-6313, doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-0951-T (2014).
15 Tuettenberg, J. et al. Pharmacokinetics, pharmacodynamics, safety and tolera bility of APG101, a CD95-Fc fusion protein, in healthy volunteers and two glioma patients. Int Immunopharmacol 13, 93-100, doi:10.1016/j.intimp.2012 .03.004 (2012).
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実施例2−炎症の哺乳類モデル
LUBACは、TNFR1等のいくつかの先天性免疫応答及び適応免疫応答により引き起こされる遺伝子活性化及び細胞死経路の主要な調節因子である19〜21。SHARPIN欠損マウス(慢性増殖性皮膚炎マウス(cpdm)とも称される)は、TNF/TNFR1により誘発されるRIPK1キナーゼ活性依存性の異常な細胞死7,8,10,25により引き起こされる重度の皮膚炎症に罹患する22〜24。
LUBACは、TNFR1等のいくつかの先天性免疫応答及び適応免疫応答により引き起こされる遺伝子活性化及び細胞死経路の主要な調節因子である19〜21。SHARPIN欠損マウス(慢性増殖性皮膚炎マウス(cpdm)とも称される)は、TNF/TNFR1により誘発されるRIPK1キナーゼ活性依存性の異常な細胞死7,8,10,25により引き起こされる重度の皮膚炎症に罹患する22〜24。
HOIPは、中心的な且つ触媒的に活性なLUBAC構成成分であり11,13、HOIPの欠損は胚性致死をもたらす26。皮膚恒常性におけるHOIPの役割を理解するために、本発明者らは、表皮ケラチノサイトにおいて選択的にHOIPを欠くマウス(HoipE-KOマウス)を作成した(拡張データ図1a〜c)。HOIP欠損は、TNFR1シグナル伝達複合体(TNFR1−SC)での直鎖状ユビキチン化を抑止し(拡張データ図1d)、HoipE-KOマウスからの初代マウスケラチノサイト(PMK)におけるTNFR1により媒介されるNF−κB活性化を減少させた(拡張データ図1e)。これらのマウスは、重度の損傷を受けた鱗状の皮膚を迅速に発症し、その結果、P4〜P6で常に死亡した(図1a)。P4でのHoipE-KOマウスの組織学的分析により、表皮厚の増加、錯角化、角質増殖、及びケラチノサイト分化障害が明らかになった(図1b、及び拡張データ図1f)。これらの特徴は、切断されたカスパーゼ−3及びTUNEL染色の増加により実証されるように、骨髄細胞浸潤及び高レベルの細胞死を伴っていた(図1b、c、及び拡張データ図1g)。まとめると、これらの観察から、HoipE-KOマウスが、炎症及び異常なケラチノサイト死を特徴とする致死性皮膚炎を発症していることが明らかになる。
ケラチノサイトにおけるHOIPの急性欠失の影響を評価するために、本発明者らは、皮膚の局所領域において、4−ヒドロキシタモキシフェン(4−OHT)で成体Hoipfl/flK14CreERTam成体マウスを処置した。この皮膚領域は、表皮肥厚、過形成、角質増殖及び錯角化、並びにケラチノサイト分化障害を示しており(図1d、e、及び拡張データ図1h、i)、免疫細胞浸潤及び細胞死の増加を伴っていた(図1e、f、及び拡張データズ1h、j、k)。このことはHoipE-KOマウスの皮膚表現型を連想させ、成体マウスにおいて皮膚恒常性を維持するためにはHOIPも必要であることが実証される。
実施例3−炎症の哺乳類モデルにおけるTNFR1及びRIPK1
cpdmマウスで観察した炎症性表現型は、TNF、TNFR1の非存在によるか又はRIPK1のキナーゼ死バージョンにより完全に救出されることから7,8,10、本発明者らは、次に、TNFR1の遺伝的アブレーション又はRIPK1のキナーゼ活性の遺伝的アブレーションによっても、HoipE-KOマウスにおける病的状態及び死亡が予防され得るかどうかを試験した。
cpdmマウスで観察した炎症性表現型は、TNF、TNFR1の非存在によるか又はRIPK1のキナーゼ死バージョンにより完全に救出されることから7,8,10、本発明者らは、次に、TNFR1の遺伝的アブレーション又はRIPK1のキナーゼ活性の遺伝的アブレーションによっても、HoipE-KOマウスにおける病的状態及び死亡が予防され得るかどうかを試験した。
しかしながら、予想外にも、重度の皮膚病変が連続的に発症され、その結果、生存期間の中央値が70日であったことから、Tnfr1KO;HoipE-KOマウスでは、炎症は遅延されるだけであった(図1g、及び拡張データ図2a)。病的なTnfr1KO;HoipE-KOマウスは、表皮の破壊、肥厚、錯角化、及び角質増殖を呈した(図1h、及び拡張データズ2b)。重要なことに、コントロール動物と比較して、成体Tnfr1KO;HoipE-KOマウスの表皮では、骨髄細胞及びリンパ球細胞の浸潤と細胞死とが有意に増加していた(図1h、i、及び拡張データ図2c)。
驚くべきことに、RIPK1のキナーゼ活性の遺伝的アブレーションは、致死性皮膚炎の予防においてTNFR1アブレーションと比べてはさらに低い効率であり、なぜならば、RIPK1D138N;HoipE-KOマウスは、重度の皮膚疾患の徴候を示す約P8で死亡したからである(拡張データ図3)。そのため、ケラチノサイトにおけるHOIP欠損により引き起こされる致死性皮膚炎は、RIPK1のキナーゼ活性により部分的にのみ媒介され、且つTNFR1の非存在下であっても発生する。
実施例4−炎症のさらなる哺乳類モデル
本発明者らは、次に、皮膚恒常性における、第3のLUBAC構成成分であるHOIL−1の役割を調べた。他で作成されたHOIL−1欠損マウスは健康であることが報告されていたが27、本発明者らは、ケラチノサイトにおけるHOIL−1の欠如(Hoil−1E-KOマウス)(拡張データ図4a〜d)により、上皮細胞死が増加している重度の皮膚炎により引き起こされる出生後致死がもたらされることを発見した(図2a〜c、及び拡張データ図4e、f)。これはHoipE-KOマウスの表現型を再現しており、これにより、HOIL−1は、表皮細胞死及び致死性皮膚炎症の予防においてHOIPと同様に重要であることが実証される。この発見は、HOIPの構成的欠失と同様に26、HOIL−1の構成的欠失によっても胚性致死が引き起こされるという本発明者らの最近の観察と一致している(Peltzer他、原稿修正中)。
本発明者らは、次に、皮膚恒常性における、第3のLUBAC構成成分であるHOIL−1の役割を調べた。他で作成されたHOIL−1欠損マウスは健康であることが報告されていたが27、本発明者らは、ケラチノサイトにおけるHOIL−1の欠如(Hoil−1E-KOマウス)(拡張データ図4a〜d)により、上皮細胞死が増加している重度の皮膚炎により引き起こされる出生後致死がもたらされることを発見した(図2a〜c、及び拡張データ図4e、f)。これはHoipE-KOマウスの表現型を再現しており、これにより、HOIL−1は、表皮細胞死及び致死性皮膚炎症の予防においてHOIPと同様に重要であることが実証される。この発見は、HOIPの構成的欠失と同様に26、HOIL−1の構成的欠失によっても胚性致死が引き起こされるという本発明者らの最近の観察と一致している(Peltzer他、原稿修正中)。
実施例3の発見と同様に、成体Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスは、Tnfr1KO;HoipE-KOマウスの表現型に類似する免疫細胞浸潤及び表細胞死の増加を特徴とする皮膚炎の発症後70日の生存期間の中央値を示した(図2d〜f、及び拡張データ図4g〜i)。このことは、HOIP又はHOIL−1のいずれかのケラチノサイト特異的欠失の場合には、皮膚炎症への影響が、TNFR1シグナル伝達の調節を超えて広がることを実証する。
本発明者らは、次に、HoipE-KOマウス及びHoil−1E-KOマウスにおける異常細胞死と炎症との間の時間的関係を調べた。HoipE-KOマウス及びHoil−1E-KOマウスの表皮における細胞死の増加は、E18.5で子宮内内において及び出生時(P0)で既に明らかであった(図3a、及び拡張データ図5a、b)。このことは、ケラチノサイトにおける直鎖状ユビキチン化の欠如により滅菌条件下で異常な細胞死がもたらされることを暗示する。HoipE-KOマウス及びHoil−1E-KOマウスは、P2及びP4でのみ免疫細胞浸潤の異常な増加を示し、出生時には示さなかった(図1、2、3b、c及び拡張データ図1g、4f、5c)。従って、ケラチノサイト分化及び表皮厚は、P2及びP4で異常であるように見えたが、E18.5又はP0ではそうは見えなかった(図1、2、及び拡張データ図5a、d〜g)。
さらに、4−OHT処置したHoipfl/flK14CreERTamマウスは、免疫細胞浸潤が明らかになる前に細胞死の増加を一貫して示した(拡張データ図6a〜c)。そのため、過剰な細胞死は炎症反応に先行しており、ケラチノサイトにおけるHOIP又はHOIL−1の欠失時に細胞死が致死性皮膚炎を引き起こすことが示唆される。
実施例5−炎症の哺乳類モデルにおける細胞死誘発の機序
HoipE-KOマウス及びHoil−1E-KOマウスの皮膚における細胞死誘発の機序を理解するために、本発明者らは、最初に、これらの動物に由来するPMKにおけるアダプタータンパク質FADDを免疫沈降させることにより、細胞死受容体の下流で細胞死を引き起こすことが知られているシグナル伝達プラットフォームの形成28を分析した。これにより、たとえ外因性刺激がなくても、HOIP欠損ではFADD/カスパーゼ−8/RIPK1含有複合体が容易に検出可能であるが、コントロールPMKではそうではないことが明らかになった(図3d)。そのような複合体によるアポトーシスシグナル伝達と一致して、HOIP欠損細胞はまた、外因性刺激の非存在下であっても生存能力が低かった(図3e)。
HoipE-KOマウス及びHoil−1E-KOマウスの皮膚における細胞死誘発の機序を理解するために、本発明者らは、最初に、これらの動物に由来するPMKにおけるアダプタータンパク質FADDを免疫沈降させることにより、細胞死受容体の下流で細胞死を引き起こすことが知られているシグナル伝達プラットフォームの形成28を分析した。これにより、たとえ外因性刺激がなくても、HOIP欠損ではFADD/カスパーゼ−8/RIPK1含有複合体が容易に検出可能であるが、コントロールPMKではそうではないことが明らかになった(図3d)。そのような複合体によるアポトーシスシグナル伝達と一致して、HOIP欠損細胞はまた、外因性刺激の非存在下であっても生存能力が低かった(図3e)。
この生存率の低下は、ZVAD又はnecrostatin-1sそれぞれとのインキュベーションによるカスパーゼ又はRIPK1の活性の阻害により防止されたが、RIPK3活性の阻害では防止されなかった(図3e)。
TNFR1の遺伝的アブレーション又はTNFの阻害もまた、生存率を回復した(図3f、及び拡張データ図6d)。これらの結果は、PMKにおいて、HOIPは、自己分泌TNFにより引き起こされた異常なRIPK1キナーゼ依存性アポトーシスを防止することを示す。さらに、インビボでのアポトーシスの調節はより複雑であると思われ、なぜならば、RIPK1キナーゼ活性又はTNFR1の遺伝的アブレーションはHoipE-KOマウスの皮膚炎を予防しなかったからである。
実施例6−炎症の哺乳類モデルにける細胞死誘発でのアポトーシス及びネクロトーシスの役割
過剰な細胞死が、HoipE-KOマウス及びHoil−1E-KOマウスにおける致死性皮膚炎の原因であり得るかどうかを評価するために、本発明者らは、最初に、ネクロトーシスの役割を調べた。
過剰な細胞死が、HoipE-KOマウス及びHoil−1E-KOマウスにおける致死性皮膚炎の原因であり得るかどうかを評価するために、本発明者らは、最初に、ネクロトーシスの役割を調べた。
インビボで観察したアポトーシス細胞死と一致して、Hoil−1E-KOにおけるRipk3の遺伝的アブレーション及びHoipE-KOマウスにおけるMlklの遺伝的アブレーションは、出生後致死をもたらす細胞死及び皮膚炎症を予防し得なかった(図3h、i、及び拡張データ図7)。
従って、本発明者らは、次に、MlklKO;HoipE-KOマウス及びRipk3KO;Hoil−1E-KOマウスにおいてカスパーゼ−8を欠失させることにより、アポトーシスの役割を調べた。意外なことに、MlklKO;カスパーゼ−8KO;HoipE-KOマウス及びRipk3KO;カスパーゼ−8KO;Hoil−1E-KOマウスの両方が、皮膚疾患のいかなる徴候も示すことなく成体期に達した(図3g、及び拡張データ8a〜b)。一貫して、Ripk3KO;カスパーゼ−8KO;Hoil−1E-KOマウスでは表皮構造及びケラチノサイト分化は完全に正常であり、この動物は、その皮膚において細胞死や免疫細胞浸潤の増加を示さなかった(図3h〜j、及び拡張データ図8c、d)。Ripk3KO;カスパーゼ−8KO;Hoil−1E-KOマウスは、Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスが重度の皮膚炎で死亡した70日を超えて良好に生存したが(図3k、及び拡張データ図4g)、RIPK3及びカスパーゼ−8が欠損したマウスに関して既に報告されているように29,30、リンパ節腫脹及び脾腫大のために屠殺しなければならなかった(拡張データ図8e)。
注目すべきことに、カスパーゼ−8の異型接合性は、Hoil−1E-KOマウスの生存期間をP7〜P9まで延長し得(図3k)、Ripk3KO;カスパーゼ−8KO/WT;Hoil−1E-KOマウスは、約20日で致死性皮膚炎を発症した(図3k、及び拡張データ図8f〜h)。まとめると、これらの結果から、ケラチノサイトにおいてHOIP又はHOIL−1を欠くマウスでは、カスパーゼ8により媒介されるアポトーシスが致死性皮膚炎の原因であることが実証される。対照的に、カスパーゼ−8KO/WT;Hoil−1E-KOマウスでは、ネクロトーシスは皮膚炎症にのみ寄与するが、実施的なアポトーシス成分が残っていることから唯一の原因ではない。
実施例7−炎症の哺乳類モデルにおけるTNFR1非依存性細胞死
次いで、本発明者らは、LUBAC−ケラチノサイト特異的欠損マウスにおいて、致死性炎症の原因となるTNFR1非依存性細胞死を研究した。
次いで、本発明者らは、LUBAC−ケラチノサイト特異的欠損マウスにおいて、致死性炎症の原因となるTNFR1非依存性細胞死を研究した。
本発明者らは、最初に、Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスにおける細胞死のメディエータを同定することを目指した。
Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスに由来するPMKは、TNF関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、CD95(Fas/APO−1)リガンド(CD95L)、又はポリイノシン酸:ポリシチジル酸(Poly(I:C))による刺激時に、他の細胞型での本発明者らの以前の発見と一致して21,32、コントロールと比較して細胞生存率の低下を示した(図4a)。従って、本発明者らは、次に、Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスにおいて、全身的にTRAIL−R又はTLR3を遺伝的アブレートしたか、又はケラチノサイトにおいて特異的にCD95のデスドメイン(DD)を遺伝的アブレートした。しかしながら、残念なことながら、得られたTrail−rKO;Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウス、Tlr3KO;Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウス、及びCd95E-DD;Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスは全て、Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスのものとは強度が識別不能な皮膚病変に罹患した(図4c、及び拡張データ図9a、b)。
この残念な結果にもかかわらず、本発明者らは、Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスにおいてTRAIL−R及びTLR3を共欠失させ、D70での、得られたTrail−rKO;Tlr3KO;Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスにおいて、一時的ではあるが有意な皮膚炎症の寛解を観察した(図4b、c)。しかしながら、このマウスは、約D80にて炎症性皮膚疾患で死亡した(図4d)。
本発明者らは、次に、Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスにおいて、TRAIL−Rの欠失と、CD95のDDのケラチノサイト特異的欠失とを組み合わせた。際立ったことに、このことにより、Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスと比較して、得られたCd95E-DD;Trail−rKO;Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスにおいて、D70での皮膚炎の完全な予防と、生存期間の有意な延長とがもたらされた(図4b〜d)。
従って、本発明者らは、CD95に誘発される細胞死及びTRAIL−Rにより誘発される細胞死は、Tnfr1KO;Hoil−1E-KOマウスにおいて互いに補償して炎症を引き起こし得ると、並びに両方の系が同時に不活性化された場合にのみTNFR1非依存性疾患が予防され得ると結論付ける。
本発明者らは、次に、Tnfr1KO;HoipE-KOマウスの病理におけるネクロトーシスの役割を研究した。Tnfr1KO;HoipE-KOマウスでのMLKLの欠失は皮膚炎の進行を有意に遅延させており、なぜならば、MlklKO;Tnfr1KO;HoipE-KOマウスは、Tnfr1KO;HoipE-KOマウスと比較した場合にD70で軽度の病変を有したからである(図4b、c)。しかしながら、このマウスは、重度の皮膚炎に起因して約D90で死亡した(図4d)。従って、ネクロトーシスはTNFR1非依存性疾患の一因となっているが唯一の原因ではなく、なぜならば、持続的なアポトーシスは、この疾患を引き起こすには十分であるからである。
実施例8−実施例2〜7からの結論
まとめると、本発明者らの研究は、致死性皮膚炎の予防におけるHOIP及びHOIL−1の重要な且つこれまで未知の生理的役割を明らかにする。この皮膚炎症は、ケラチノサイトのTNFR1依存性死により引き起こされるが、重要なことに、ケラチノサイトのTNFR1非依存性死によっても引き起こされる(拡張データ図9c)。
まとめると、本発明者らの研究は、致死性皮膚炎の予防におけるHOIP及びHOIL−1の重要な且つこれまで未知の生理的役割を明らかにする。この皮膚炎症は、ケラチノサイトのTNFR1依存性死により引き起こされるが、重要なことに、ケラチノサイトのTNFR1非依存性死によっても引き起こされる(拡張データ図9c)。
さらに、本発明者らは、このTNFR1非依存性細胞死は、TRAILシグナル伝達系及びCD95Lシグナル伝達系の統合された作用により引き起こされることを認めた。
この発見は、TNFの阻害という現在の処置パラダイムに勝る、自己炎症及び自己免疫の処置に対するいくつかの意味を持つ。
第一に、本発明者らは、細胞死の予防は、トリガーに関係なく、自己免疫の処置におそらく有効な戦略と認める。
第二に、本発明者らの研究は、TNF、TRAIL、及びCD95Lのブロッカーを含む組み合わせ処置が、TNF阻害単独の恩恵を受けず且つ疾患がTNF阻害に対して難治性と現在分類されている自己免患者に対して有益であり得る証拠を提供する。任意選択的に、本明細書で説明されているRIPK1キナーゼ阻害又は他の阻害剤と併せて、本発明の方法は、TNF阻害剤による処置に現在適している自己免疫を超える疾患にまで及ぶと予想され得る。
実施例2〜8の方法
マウス。Hoipfl/flマウスは既に説明されている26。ターゲティングカセットが、Frt部位で挟まれたハイグロマイシン耐性カセットと、loxP部位で挟まされたHoil−1遺伝子のエクソン1及び2とで構成されている遺伝子ターゲティング戦略により、Hoil−1fl/fマウスを作成した。このマウスと、FlpEリコンビナーゼを発現するマウスとを交配させることにより、このハイグロマイシンカセットを除去した34。HoipE-KOマウス及びHoil−1E-KOマウスを作成するために、ヒトケラチン14プロモーター(Geert van Looから得た)12、株AZO−Nn4Cre(K14)の制御下で、Hoipfl/flマウス及びHoil−1fl/flマウスと、CreEリコンビナーゼを発現するマウスとを交配させた。MlklKOマウスを、TALEN技術を使用して作成した。簡潔に説明すると、Mlkl遺伝子のエクソン1を標的とするTALENを、ゴールデンゲートアセンブリによりクローニングした。TACCGTTTCAGATGTCAに対するTAL1のRVD配列は、NI HD HD NN NG NG NG HD NI NN NI NG NN NG HD NIであり、TCGATCTTCCTGCTGCCに対するTAL2は、HD NN NI NG HD NG NG HD HD NG NN HD NG NN HD HDであった。キャップされたRNAを、mMESSAGE mMACHINE(登録商標)T7 Transcription Kit(Ambion)を使用してインビトロで作製し、ポリAテールを、Poly(A) Tailing Kit (Ambion)を使用して付加した。精製した転写産物を、混合して25ng/μLに調整した。受精卵を、細胞質及び前核の両方に注射した。胚を偽妊娠雌に移植した。耳パンチから得たゲノムDNAを使用する配列決定により、仔の遺伝子型を決定した。早期停止コドンを生じる19bpのホモ接合欠失を持つ1匹の雌を、さらなる繁殖のために選択した。K14CreERTamマウスは既に説明されている35。Tnfr1KOマウス、Tlr3KOマウス、及びCd95−DDflマウス(C57BL/6−Fastm1Cgn/J)を、Jackson Laboratoriesから購入した。Ripk3KO 36、カスパーゼ−8KO 37、Trail−rKO(Grosse-Wilde, A., Voloshanenko, O., Bailey, S.L., Longton, G.M., Schaefer, U., Csernok, A.I., Schutz, G., Greiner, E.F., Kemp, C.J., and Walczak, H. (2008). TRAIL-R deficiency in mice enhances lymph node metastasis without affecting primary tumor development. The Journal of clinical investigation 118, 100-110)。及びRipk1D138Nマウスは、既に説明されている38。成体マウスの皮膚においてHOIPの欠失を誘発するために、Hoipfl/flK14CreERTamマウスを、既に説明されているように処置した39。簡潔に説明すると、背頸部の小さい剃毛領域を、示したように、合計1回、2回、3回、又は4回の処置で1日おきに、エタノールに溶解させた4−ヒドロキシタモキシフェン(4−OHT)20mg/mL 50μLで処置した。ビヒクル処置として、尾部付近の小さい背領域を剃毛し、エタノールで処置した。Hoipfl/wtK14CreERTamマウスを、タモキシフェンコントロールとして使用した。マウスを、最後の処置から2日後に又は図の凡例で示すように分析した。時限交配(timed mating)を、既に説明されているように実施した26。全てのマウスをPCR分析により分類した。コロニーに自由に給餌した。全ての動物実験を、ASPA(animal (scientific procedure) Act 1986)に従って、動物福祉に関するUK内務省の規則に従い、適切なUKプロジェクトライセンスの下で実行した。
マウス。Hoipfl/flマウスは既に説明されている26。ターゲティングカセットが、Frt部位で挟まれたハイグロマイシン耐性カセットと、loxP部位で挟まされたHoil−1遺伝子のエクソン1及び2とで構成されている遺伝子ターゲティング戦略により、Hoil−1fl/fマウスを作成した。このマウスと、FlpEリコンビナーゼを発現するマウスとを交配させることにより、このハイグロマイシンカセットを除去した34。HoipE-KOマウス及びHoil−1E-KOマウスを作成するために、ヒトケラチン14プロモーター(Geert van Looから得た)12、株AZO−Nn4Cre(K14)の制御下で、Hoipfl/flマウス及びHoil−1fl/flマウスと、CreEリコンビナーゼを発現するマウスとを交配させた。MlklKOマウスを、TALEN技術を使用して作成した。簡潔に説明すると、Mlkl遺伝子のエクソン1を標的とするTALENを、ゴールデンゲートアセンブリによりクローニングした。TACCGTTTCAGATGTCAに対するTAL1のRVD配列は、NI HD HD NN NG NG NG HD NI NN NI NG NN NG HD NIであり、TCGATCTTCCTGCTGCCに対するTAL2は、HD NN NI NG HD NG NG HD HD NG NN HD NG NN HD HDであった。キャップされたRNAを、mMESSAGE mMACHINE(登録商標)T7 Transcription Kit(Ambion)を使用してインビトロで作製し、ポリAテールを、Poly(A) Tailing Kit (Ambion)を使用して付加した。精製した転写産物を、混合して25ng/μLに調整した。受精卵を、細胞質及び前核の両方に注射した。胚を偽妊娠雌に移植した。耳パンチから得たゲノムDNAを使用する配列決定により、仔の遺伝子型を決定した。早期停止コドンを生じる19bpのホモ接合欠失を持つ1匹の雌を、さらなる繁殖のために選択した。K14CreERTamマウスは既に説明されている35。Tnfr1KOマウス、Tlr3KOマウス、及びCd95−DDflマウス(C57BL/6−Fastm1Cgn/J)を、Jackson Laboratoriesから購入した。Ripk3KO 36、カスパーゼ−8KO 37、Trail−rKO(Grosse-Wilde, A., Voloshanenko, O., Bailey, S.L., Longton, G.M., Schaefer, U., Csernok, A.I., Schutz, G., Greiner, E.F., Kemp, C.J., and Walczak, H. (2008). TRAIL-R deficiency in mice enhances lymph node metastasis without affecting primary tumor development. The Journal of clinical investigation 118, 100-110)。及びRipk1D138Nマウスは、既に説明されている38。成体マウスの皮膚においてHOIPの欠失を誘発するために、Hoipfl/flK14CreERTamマウスを、既に説明されているように処置した39。簡潔に説明すると、背頸部の小さい剃毛領域を、示したように、合計1回、2回、3回、又は4回の処置で1日おきに、エタノールに溶解させた4−ヒドロキシタモキシフェン(4−OHT)20mg/mL 50μLで処置した。ビヒクル処置として、尾部付近の小さい背領域を剃毛し、エタノールで処置した。Hoipfl/wtK14CreERTamマウスを、タモキシフェンコントロールとして使用した。マウスを、最後の処置から2日後に又は図の凡例で示すように分析した。時限交配(timed mating)を、既に説明されているように実施した26。全てのマウスをPCR分析により分類した。コロニーに自由に給餌した。全ての動物実験を、ASPA(animal (scientific procedure) Act 1986)に従って、動物福祉に関するUK内務省の規則に従い、適切なUKプロジェクトライセンスの下で実行した。
免疫染色及び定量。4μm厚のホルマリン固定パラフィン包埋皮膚切片を、標準的なプロトコルに従って染色した。簡潔に説明すると、切片を、マイクロ波中において10mMのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中で沸騰させた。スライドを、Tween 20 0.5%及びBSA 0.2%を含む緩衝液中でブロックした。CD45染色のために、スライドをRetrievagen A(BD)中で沸騰させ、Tweenを含まない緩衝液でブロックした。次に、スライドを、4℃で一晩、一次抗体と共にインキュベートした。下記の抗体を使用した:抗K14、抗K10、抗ロリクリン、及び抗K6(Covance)、抗Ki−67(Abcam)、抗CD45(BDbiosciences)、抗切断カスパーゼ−3(Cell Signaling)、抗HOIP(特注、Thermo Fisher Scientific)、抗HOIL−111。スライドを、1時間にわたり室温(RT)で、下記の二次抗体と共にインキュベートした:Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit IgG、594 Goat anti-Rabbit IgG(Invitrogen)、又はgoat anti-rat HRP(Cambridge bioscience)。HRPコンジュゲート抗体を使用した場合には、製造業者の指示に従って、TSA(商標)Plus Cyanine 3 System(Perkin Elmer)を適用した。切片をDAPI(Roche)で対染色した。或いは、既に説明されているプロトコル40に従って、BOND-III(Leica Microsystems)及びBenchMark Ultra(Ventana-Roche Medical System)に対して従来の免疫組織化学を実施した。切断されたカスパーゼ−3染色と組み合わせて実施するTUNEL染色のために、製造業者の指示に従って、ApopTag Red In Situ Apoptosis Detectionキット(Merck Millipore)を使用した。切片を蛍光顕微鏡で分析した。1枚のスライド当たり少なくとも10枚の異なる画像(40×)を取得した。表皮内の細胞の総数(DAPI陽性)に対する特異的染色に関する陽性の細胞の割合として、モノクロ画像に対してImageJ Softwareを使用することにより、サンプルの遺伝子型に対して盲検化された実験者により定量を実施した。
表皮厚の定量。表皮厚を、1匹のマウス当たり少なくとも10箇所の異なる領域にわたり1つの顕微鏡視野当たり5箇所の異なる位置で測定した。ImageJ Softwareを使用することにより、サンプルの遺伝子型に対して盲検化された実験者により定量を実施した。
スコアリングシステム。マウスを、2種の主要な臨床基準に基づいて巨視的に評価した。病変の影響を受けた身体の各領域(頭部、頸部、背部、側腹部を含む)に1のスコアを付与し、これらの合計は、この病原がどのようにして拡大したかの情報を提供した。他の基準は、病変の下記の特徴:断続的な小さい外皮、癒合した外皮、及び潰瘍化(それぞれ1〜3のスコア)であった。両方の基準の合計は、病変の総重症度スコアを表した。スコアリングを、2名の独立した研究者により実施した。
原発性マウスケラチノサイトの単離、培養、及び生存率。確立されたプロトコル41に従って、HoipE-KO新生仔、Tnfr1KO;HoipE-KO及びTnfr1KO;Hoil−1E-KO成体の尾部からPMKを得た。簡潔に説明すると、皮膚を、4℃で一晩、カルシウム及びマグネシウムを含まないHBSS中の0.25% Trypsin(Stratech Scientific Ltd)と共にインキュベートした。翌日、真皮及び表皮を分離した。細胞懸濁液を、8%のキレートFCS及びペニシリン−ストレプトマイシン(Sigma)と共に、カルシウムを含まないEMEM(Lonza)中で培養した。PMKを、その後の実験のために、コラーゲンI(Life technologies)でプレーコートしたプレート中に播種した。PMKを、4日にわたり、20μMのZ-VAD-fmk(Abcam)、10μMのNecrostatin-1s(Cambridge Bioscience)、1μMのRIPK3阻害剤(GSK2399872B)、又は50μg/mLのエタネルセプト(Enbrel(登録商標))(Pfizer and Pentaglobin from Biotest)が補充された培地中で培養し、補充された培地を毎日交換した。最終日に、製造業者の指示に従って、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay キット(Promega)を使用して、細胞生存率を測定した。或いは、PMKを、下記に示すリガンドで24時間にわたり処理した:50ng/mlのマウスiz−TRAIL、50ng/mlのCD95L−Fc、又は100μg/mlのポリ(I:C)(Invitrogen)。
ウエスタンブロッティング及び免疫沈降。ウエスタンブロッティングを、既に説明されているように実施した11。簡潔に説明すると、PMKを、20分にわたり4℃で、IP−溶解緩衝液(30mMのTris−HCl[pH7.4]、120mMのNaCl、2mMのEDTA、2mMのKCl、1% Triton X−100、EDTA−フリープロテイナーゼ阻害剤カクテル(Roche)、及び1xホスファターゼ阻害剤カクテル2(Sigma)に溶解させた。溶解物を、10分にわたり95℃にて、還元性サンプル緩衝液及びDTTで変性させた。タンパク質を、SDS−PAGE(NuPAGE)で分離し、HOIP(特注、Thermo Fisher Scientific)、HOIL−111、Sharpin(ProteinTech)、アクチン(Sigma)、チューブリン(Sigma)、FADD(Santa Cruz)、RIPK1(BD)、切断されたカスパーゼ−8(Cell signalling)、MLKL(Millipore)、TNFR1(Abcam)、リン酸化IκBα(Cell Signaling)、IκBα(Cell Signaling)、及び直鎖状ユビキチン(Millipore)に対する抗体によるウエスタンブロッティングにより分析した。未変性TNFR1−SCの単離及びFADD免疫沈降(IP)を、既に説明されているように実施した26。簡潔に説明すると、PMKを、20μMのZ-VAD-fmk(Abcam)の存在下で培養し、TNFR1−SCの分析の場合には、示した時間にわたり0.5μg/mL 3xFlag−2xStrep−TNFで刺激したか、又は未処理のままであった。細胞溶解物を、16時間にわたり、42ビーズ(SIGMA; Schnelldorf, Germany)を使用して、抗Flag IPにかけた。FADD IPの場合には、溶解物を、4時間にわたり4℃にて、抗FADD抗体(Santa Cruz)及びプロテインG Sepharose Beads(GE healthcare)と共にインキュベートした。
フローサイトメトリー。皮膚サンプルから得た細胞懸濁液を、Fixable Viability Dye eFluor(登録商標)780(eBioscience)で蛍光標識した。次いで、サンプルを、下記の細胞表面マーカーに対する抗体で染色した:CD45−APC、CD45−AF700、CD3−PerCP/Cy5.5、CD4−FITC、CD8−PE/Cy7、GR1−FITC、GR1−PE/Cy7、F4/80−PE、F4/80−BV786、CD11b−Percp/Cy5.5(Biolegend)、CD19−BV650、及びCD19−PE (Invitrogen)。サンプルをLSRFORTESSA X-20(BD)又はAccuri(BD)により取得し、FlowJoソフトウェアを使用して、その後のデータ解析を行なった。
統計。データを、GraphPad Prism 6ソフトウェア(GraphPad Software)又はMicrosoft Excelで解析した。グラフに示したデータは、図の凡例に示すように、平均値±s.e.mを表す。予備的データセットを使用して、十分な検出力に必要な群サイズを決定した。統計解析を、対応のない両側スチューデントのt検定により実施した。生存曲線における統計的有意性を、対数順位検定を使用して決定した。>0.05のP値は有意でない(NS)と見なし、P≦0.05を1個のアスタリスク(*)で示し、P≦0.01(**)及びP≦0.001(***)。全ての場合において、示されたKOマウスと、それぞれの同腹子コントロールとの間で比較を行なった。
実施例2〜8の参考文献
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13 Tokunaga, F. et al. Involvement of linear polyubiquitylation of NEMO in NF-k appaB activation. Nat Cell Biol, doi:10.1038/ncb1821 (2009).
19 Tokunaga, F. Linear ubiquitination-mediated NF-kappaB regulation and its rel ated disorders. Journal of biochemistry 154, 313-323, doi:10.1093/jb/mvt07 9 (2013).
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23 HogenEsch, H., Janke, S., Boggess, D. & Sundberg, J. P. Absence of Peyer’s patches and abnormal lymphoid architecture in chronic proliferative dermat itis (cpdm/cpdm) mice. J Immunol 162, 3890-3896 (1999).
24 Seymour, R. E. et al. Spontaneous mutations in the mouse Sharpin gene result in multiorgan inflammation, immune system dysregulation and dermatitis. G enes Immun 8, 416-421, doi:6364403 [pii]10.1038/sj.gene.6364403 (2007).
25 Berger, S. B. et al. Cutting Edge: RIP1 kinase activity is dispensable for n ormal development but is a key regulator of inflammation in SHARPIN-defici ent mice. J Immunol 192, 5476-5480, doi:10.4049/jimmunol.1400499 (2014).
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28 Peltzer, N., Darding, M. & Walczak, H. Holding RIPK1 on the Ubiquitin Leash in TNFR1 Signaling. Trends in cell biology, doi:10.1016/j.tcb.2016.01.006 (2016).
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表2及び3の参考文献
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特許参考文献
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欧州特許第0914157B1号
国際公開第2013087912A1号
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欧州特許出願公開第1447093A1号
国際公開第2004071528A1号
欧州特許出願公開第1020521A1号
国際公開第2010006772A3号
国際公開第2015001345号
米国特許第8153583B2号
米国特許出願公開第5919452A号
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国際公開第2013087912A1号
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国際公開第2010006772A3号
国際公開第2015001345号
米国特許第8153583B2号
Claims (45)
- 対象の炎症性疾患を処置する方法であって、前記方法は、少なくとも3種の薬剤の組み合わせ処置を前記対象に施すことを含み、前記組み合わせは、
(1)受容体TNFR1又はそのリガンドを中和する第1の薬剤と、
(2)下記:
(2a)TRAIL−R若しくはそのリガンド、
又は
(2b)CD95若しくはそのリガンド
のいずれかを中和する第2の薬剤と、
(3)下記:
(3a)TLR3若しくはTLR4、又はいずれかのリガンド、
又は
(3b)表1に示すTNF受容体スーパーファミリのメンバーであるさらなる別の受容体、若しくはそのリガンド、
(3c)カスパーゼ、
(3d)RIPK1
のいずれかを中和する第3の薬剤と
を含む、方法。 - 対象の炎症性疾患を処置するために、
(1)受容体TNFR1又はそのリガンドを中和する第1の薬剤
の治療有効性を増強する方法であって、この方法は、前記対象に、
(2)下記:
(2a)TRAIL R若しくはそのリガンド、
又は
(2b)CD95若しくはそのリガンド
のいずれかを中和する第2の薬剤と、
(3)下記:
(3a)TLR3若しくはTLR4、又はいずれかのリガンド、
又は
(3b)表1に示すTNF受容体スーパーファミリのメンバーであるさらなる別の受容体、若しくはそのリガンド、
(3c)カスパーゼ、
(3d)RIPK1
のいずれかを中和する第3の薬剤と
を投与することを含む方法。 - 前記受容体又はそのリガンドを中和する薬剤が、
(i)前記リガンドが前記受容体に結合することを防止するか、若しくは阻害するか、
(ii)そのような結合から生じる受容体/リガンド複合体を破壊する、
請求項1又は2に記載の方法。 - 前記第1の薬剤が、TNF及び/又はLT−αを中和する、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2の薬剤が、TRAIL−Rを中和するか、又はTRAILを中和する、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2の薬剤が、TRAIL−R1及び/又はTRAIL R2を中和する、請求項5に記載の方法。
- 前記第3の薬剤が、CD95を中和するか、又はCD95Lを中和する、請求項5又は6に記載の方法。
- (1)前記第1の薬剤が、TNF及び/又はLT−αを中和し、
(2a)前記第2の薬剤が、TRAIL−R又はTRAILを中和し、
(3a)前記第3の薬剤が、CD95Lを中和する、
請求項6又は7に記載の方法。 - 前記第3の薬剤が、TLR3を中和するか、又はTLR3のリガンド、又はTLR4若しくはいずれかのリガンドを中和する、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- (1)前記第1の薬剤が、TNF及び/又はLT−αを中和し、
(2)前記第2の薬剤が、TRAIL−R又はTRAILを中和し、
(3a)前記第3の薬剤が、TLR3を中和する、
請求項9に記載の方法。 - 前記第2の薬剤が、CD95を中和するか、又はCD95Lを中和する、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第3の薬剤が、TLR3を中和するか、又はTLR3のリガンドを中和する、請求項11に記載の方法。
- (1)前記第1の薬剤が、TNF及び/又はLT−αを中和し、
(2a)前記第2の薬剤が、CD95又はCD95Lを中和し、
(3a)前記第3の薬剤が、TLR3を中和する、
請求項12に記載の方法。 - 前記第3の薬剤が、カスパーゼを中和し、RIPK3及び/又はMLKLを中和する第4の薬剤を使用する、請求項1から5のいずれか1項又は請求項11に記載の方法。
- 前記カスパーゼが、カスパーゼ8である、請求項14に記載の方法。
- 前記第3の薬剤が、LT−βを中和する、請求項1から5のいずれか1項又は請求項11に記載の方法。
- 前記第3の薬剤が、RIPK1を中和する、請求項1から5のいずれか1項又は請求項11に記載の方法。
- 前記薬剤が、前記受容体若しくはリガンドの発現を妨げる一本鎖ヌクレオチド若しくは二本鎖ヌクレオチド(DNA、RNA(siRNA、miRNA、shRNA)、PNA、DNA−RNAハイブリッド分子)であるか、又は前記受容体若しくはリガンドに結合して中和する抗体若しくはその断片である、請求項1から17のいずれか1項に記載の方法。
- 表2に示す阻害剤の内の1つ又は複数を利用する請求項1から13のいずれか1項に記載の方法。
- (a)前記受容体の発現を減少させることにより、
(b)受容体脱感作若しくは受容体破壊を増加させることにより、
(c)TRAILと、内在性受容体である前記受容体との間の相互作用を減少させることにより、
(d)受容体により媒介される細胞内シグナル伝達を減少させることにより、
(e)TRAILの結合に関して内在性受容体と競合することにより、
(f)前記受容体に結合してTRAILの結合をブロックすることにより、
又は
(g)TRAILに結合して前記受容体との相互作用を防止することにより、
TRAIL−R又はTRAILの生物活性を低下させる第2の薬剤を利用する請求項5から10又は14から17のいずれか1項に記載の方法。 - TRAILに結合して中和する第2の薬剤を利用する請求項20に記載の方法。
- 前記薬剤が、TRAILに結合して中和する抗体又はその断片である、請求項21に記載の方法。
- 抗体ヒンジ領域若しくはその一部を用いて、又は抗体ヒンジ領域若しくはその一部を用いることなく、ヒト抗体Fcドメイン又はその一部に融合している、TRAIL−R(好ましくはTRAIL−R2)の細胞外ドメイン又はその一部を含む融合タンパク質である薬剤を利用する、請求項20又は21に記載の方法。
- 2種以上のTRAIL−Rに結合する第2の薬剤を利用するか、又は第2の薬剤及び1種若しくは複数種のさらなる薬剤を利用し、これらのそれぞれは1種若しくは複数種のTRAIL−Rに結合する、請求項20に記載の方法。
- 前記第2の薬剤が、
(1)TRAIL−R1及びTRAIL−R2の両方に結合してこれらの活性を中和する抗体若しくはその断片であるか、
又は
(2)前記第2の薬剤は、TRAIL−R1に結合してその活性を中和する抗体若しくはその断片であり、TRAIL−R2に結合してその活性を中和するさらなる抗体若しくはその断片と共に使用される、
請求項23に記載の方法。 - 前記対象に、1種若しくは複数種の薬剤、又は外因性のアポトーシス及び/又はネクロトーシスのメディエータを中和する1種若しくは複数種のさらなる薬剤を投与することをさらに含み、前記メディエータは、カスパーゼ、RIPK3、及びMLKLの内の1つ又は複数から任意選択的に選択される、請求項1から25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象に、さらなる抗炎症性生物学的薬剤又は抗炎症性化学薬剤を投与することをさらに含む請求項1から26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記さらなる抗炎症性生物学的薬剤又は抗炎症性化学薬剤が、経口副腎皮質ステロイド又は局所副腎皮質ステロイドである、請求項27に記載の方法。
- 前記炎症性疾患が、多発性硬化症(MS)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)から任意選択的に選択される自己免疫疾患;任意選択的に筋ジストロフィーである神経炎症性疾患;パーキンソン病、アルツハイマー病、及びハンチントン病から任意選択的に選択される神経変性疾患;心臓、腎臓、又は脳の虚血性疾患から任意選択的に選択される虚血性疾患;敗血症;HOIL−1、HOIP、又はOTULINの欠損症の内のいずれかにより引き起こされる炎症性疾患からなるリストから選択される、請求項1から28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記炎症性疾患が表3から選択される、請求項1から29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記炎症性疾患が、関節リウマチ(RA);乾癬;炎症性腸疾患(IBD)からなるリストから選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記炎症性疾患が癌であり、前記方法が、前記癌を処置するための1種若しくは複数種の追加の薬剤を前記対象に投与すること、又は前記対象に放射線療法を実施することをさらに含む、請求項1から28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記癌を処置するための1種又は複数種の追加の薬剤が、化学療法剤;抗PD−1/L1抗体及び/又は抗CTLA−4抗体から任意選択的に選択される免疫チェックポイント阻害剤;例えばトランスジェニックキメラ抗原受容体(CAR)(又はT細胞受容体(TCR))発現T細胞から任意選択的に選択される細胞ベースの治療薬からなるリストから選択される、請求項32に記載の方法。
- 前記対象が、炎症性疾患を有するものとして選択され、前記患者から採取された生体サンプル中における細胞死の証拠に関してスクリーニングすることによりさらに選択される、請求項1から33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が、炎症性疾患を有するものとして選択され、前記疾患は、TNF阻害剤による処置に対して難治性であることが証明されている、請求項1から34のいずれか1項に記載の方法。
- (i)対象における前記疾患がTNF阻害剤による処置に対して難治性であることが証明されている対象を選択する工程と、
(ii)前記少なくとも3種の薬剤の組み合わせ処置を前記対象に投与する工程と
を含む請求項35に記載の方法。 - 請求項1から36のいずれか1項に記載の組み合わせ方法での使用のための、前記受容体TNFR1を中和するか又はTNFR1のリガンドを中和する第1の薬剤。
- 請求項1から36のいずれか1項に記載の組み合わせ方法での使用のための、
下記:
(2a)TRAIL−R若しくはそのリガンド、
又は
(2b)CD95若しくはそのリガンド
のいずれかを中和する第2の薬剤。 - 請求項1から36のいずれか1項に記載の組み合わせ方法での使用のための、
下記:
(3a)TLR3若しくはTLR4、又はいずれかのリガンド、
又は
(3b)表1に示すTNF受容体スーパーファミリのメンバーであるさらなる別の受容体、若しくはそのリガンド、
(3c)カスパーゼ、
(3d)RIPK1
の内のいずれかを中和する第3の薬剤。 - 少なくとも3種の薬剤の組み合わせ処置であって、前記組み合わせは、
(1)受容体TNFR1又はそのリガンドを中和する第1の薬剤と、
(2)下記:
(2a)TRAIL R若しくはそのリガンド、
又は
(2b)CD95若しくはそのリガンド
のいずれかを中和する第2の薬剤と、
(3)下記:
(3a)TLR3若しくはTLR4、又はいずれかのリガンド、
又は
(3b)表1に示すTNF受容体スーパーファミリのメンバーであるさらなる別の受容体、若しくはそのリガンド、
(3c)カスパーゼ、
(3d)RIPK1
の内のいずれかを中和する第3の薬剤と
を含み、
組み合わせ処置は、対象の炎症性疾患を処置する方法での使用のためであり、
前記方法は、前記少なくとも3種の薬剤の組み合わせ処置を前記対象に施すことを含む、
少なくとも3種の薬剤の組み合わせ処置。 - 対象の炎症性疾患の処置のための薬物の製造における、
(1)受容体TNFR1又はそのリガンドを中和する第1の薬剤と、
(2)下記:
(2a)TRAIL R若しくはそのリガンド、
又は
(2b)CD95若しくはそのリガンド
のいずれかを中和する第2の薬剤と、
(3)下記:
(3a)TLR3若しくはTLR4、又はいずれかのリガンド、
又は
(3b)表1に示すTNF受容体スーパーファミリのメンバーであるさらなる別の受容体、若しくはそのリガンド、
(3c)カスパーゼ、
(3d)RIPK1
の内のいずれかを中和する第3の薬剤と
の使用。 - 対象の炎症性疾患の処置のための薬物の製造における、
下記:
(2a)TRAIL R若しくはそのリガンド、
又は
(2b)CD95若しくはそのリガンド
のいずれかを中和する第2の薬剤の使用であって、
処置は、
(1)受容体TNFR1又はそのリガンドを中和する第1の薬剤と、
(3)下記:
(3a)TLR3若しくはTLR4、又はいずれかのリガンド、
又は
(3b)表1に示すTNF受容体スーパーファミリのメンバーであるさらなる別の受容体、若しくはそのリガンド、
(3c)カスパーゼ、
(3d)RIPK1
の内のいずれかを中和する第3の薬剤と
の使用をさらに含む、
第2の薬剤の使用。 - 請求項1から36のいずれか1項に記載の方法での使用のための請求項39から42のいずれか1項に記載の組み合わせ処置又は使用であって、前記各薬剤は、これらの請求項の内のいずれかで定義されている薬剤である、組み合わせ処置又は使用。
- 前記第1の薬剤、前記第2の薬剤、及び前記第3の薬剤を、互いに12時間以内に順次投与する、請求項1から43のいずれか1項に記載の方法、処置、又は使用。
- 前記第1の薬剤、前記第2の薬剤、及び前記第3の薬剤を、任意選択的に単一投与単位内で、同時に投与する、請求項1から43のいずれか1項に記載の方法、処置、又は使用。
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