KR20210128434A

KR20210128434A - 안구 장애에서의 wnt 신호 전달의 조절

Info

Publication number: KR20210128434A
Application number: KR1020217029270A
Authority: KR
Inventors: 양 리; 성지앙 투; 성진 이; 웬-첸 예
Original assignee: 서로젠, 인크.
Priority date: 2019-02-11
Filing date: 2020-02-11
Publication date: 2021-10-26
Also published as: WO2020167848A1; AU2020221797A1; EP3924381A4; CN113544150A; CA3129155A1; US20220112278A1; JP2022520084A; EP3924381A1

Abstract

본 발명은 WNT 신호 전달 경로의 조절제로 안구 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 특히, 안구 장애는 망막병증이다. 또한, 투여 방법 및 약학적 조성물이 제공된다.

Description

안구 장애에서의 WNT 신호 전달의 조절

본 출원은 2019년 2월 11일에 출원된 미국 가출원 제62/803,835호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되며, 본원에 참고로 원용된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일명은 SRZN_013_01WO_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 2020년 2월 10일에 생성된 약 27 KB의 파일이며, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된다.

본 발명은 다양한 안구 장애를 치료하기 위한 WNT 신호 조절제를 제공한다. 특히, 망막병증으로도 알려진 눈의 혈관 질환에 대한 치료제가 제공된다.

망막은 안구 뒤쪽에 있는 신경 조직의 얇은 층이다. 이는 시각 자극을 검출하는 역할을 하며, 시각 정보 처리를 위한 제1 스테이션이다. 망막 혈관구조는 이의 적절한 기능을 위한 필수 영양소와 산소의 공급원이다. 망막은 대사적으로 매우 활성이다. 많은 양의 산소를 소비하는 광수용체로 인해 1 g의 망막은 신체의 다른 어떤 기관보다 높은 산소 소모율을 나타낸다. 효과적인 영양분과 산소의 제공을 위해, 망막 혈관구조는 망막에서 하나의 측면에 3개의 평면 혈관 신경총과 다른 한 쪽에 맥락막 모세혈관층으로 이루어진 고정된 구조체로서 위치한다. 내부 혈관 형성은 처음에 망막의 유리체 표면에서 시작되어, 일차 혈관총을 생성한다. 혈관 신경총의 표면 방사성 확장 후, 망막 내로의 혈관의 수직 침투는 내부 신경총층(IPL) 및 외부 신경총층(OPL)에서 2개의 추가 망막내 모세혈관 신경총을 형성한다. 혈관과 망막 간의 기능적 및 구조적 관계로 인해, 비정상적인 혈관 발달 또는 혈관 손상은 망막의 기능과 직접적으로 연결되어, 다양한 유형의 망막병증 및 퇴행을 야기한다.

WNT 신호 전달은 망막에서의 혈관 발달을 위한 중요한 경로로 시사되었다. 인간 및 설치류 연구에서 증가하는 유전적 증거는 망막 혈관구조에서의 WNT 신호 전달의 중요성을 추가로 뒷받침한다(Wang 외, 2018, Prog Retin Eye Res. 2018년 12월 1일. pii: S1350-9462(18)30046-6). WNT 신호 전달에 관여하는 수용체(Fzd4, Lrp5, Tspan12) 또는 리간드(노린(norrin))를 암호화하는 유전자에서의 인간 돌연변이는 다양한 유전성 유리체 망막병증을 초래한다. 유전자의 개별 유전자 돌연변이 마우스(Fzd4, Lrp5, Tspan12, 노린)는 또한 인간 망막병증에서 관찰된 비정상적인 혈관구조의 전형적인 표현형을 보여주었다. 이는 망막병증의 질환의 진행 과정에 대한 이해를 증진시킬 뿐만 아니라, WNT 신호 조절을 통한 망막병증 치료의 가능성을 열었다.

망막병증, 특히 당뇨병성 망막병증은 초기 및 후기 단계로 나누어질 수 있다. 비증식성 망막병증으로도 알려진 초기 단계에서는 망막의 작은 혈관이 약간 악화될 수 있으며, 혈관의 일부가 팽창하여 주변 망막 조직으로 체액이 누출될 수 있다. 후기 망막병증은 망막 부위의 미세동맥류 및 출혈뿐만 아니라 상당한 혈관신생을 수반한다(예를 들어, Grading Diabetic Retinopathy from Stereoscopic Color Fundus Photographs - An Extension of the Modified Airlie House Classification. (1991) Ophthalmology, 98(5), 786-806 참조).

가족성 삼출성 유리체 망막병증(FEVR)은 안구내 혈관구조 형성이 불량한 유전적 안구 질환이다. 50%가 넘는 FEVR 환자는 Fzd4, Lrp5, Tspan12, 또는 노린을 암호화하는 유전자 중 하나에서 돌연변이를 나타낸다. WNT 신호 리간드인 노린은 안구의 정상적인 망막 혈관형성을 위해 Fzd4/Lrp5/Tspan12로 구성된 수용체 복합체를 통해 내피 세포에 신호를 전달한다. 그러나, FEVR 환자에서, 노린, Fzd4, Lrp5, 또는/및 Tspan12 중 하나를 암호화하는 유전자의 돌연변이는 망막에서의 미성숙 혈관 발달을 유발한다. 이로 인한 무혈관 영역의 형성은 망막에 대한 일차 손상인 망막 허혈성 영역을 생성한다. 허혈성 병태는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 안지오포이에틴2(Ang2)의 생성을 유도하여, 혈관신생 및 혈관 다발 형성을 유도한다. 새로이 생성된 비정상적인 혈관은 쉽게 파열되어 삼출 및 출혈로 인한 망막의 이차 손상을 초래할 수 있다. 당뇨병성 망막병증(DR)의 질병 진행은 또한 FEVR 또는 다른 유전적 혈관 기형 또는 기능 부전 질환의 질병 진행과 유사하다. 고혈당증은 망막 혈관 손상을 유도하여 혈관 폐색, 허혈, 혈관신생, 및 출혈로 이어지고, 결국 망막병증을 유도한다.

유전 데이터는 안구에서 적절한 혈관 구조를 확립하는 데 있어서의 WNT 신호 전달의 중요성을 제시하였지만, 발달 후 WNT 신호 전달의 활성화가 혈관 구조의 개선을 초래할 것인지의 여부는 알려져 있지 않다. 특정 보고서는 WNT 신호 전달에 대한 탐구보다는 길항하는 것이 망막병증에 유리할 것이라고 제안하기도 하였다. 따라서, 망막병증 질병 진행과 WNT 신호의 관련성을 이해하는 것은 새로운 치료제의 가능성으로 확장된다. 망막병증의 적절한 치료를 위해, 질환 단계에 따라 WNT 작용제 및 길항제 신호 전달을 조절할 필요가 존재한다. 본 발명은 망막병증의 질환 진행의 상이한 단계에서 WNT 신호 전달 작용 및 길항 작용을 제어하는 방법을 제공한다.

본 발명은, 부분적으로, 망막병증 징후에서 비정상적인 혈관 형성을 조절하기 위한 WNT 신호 전달 작용제 및 길항제의 사용에 기초한다.

본 발명은 망막병증을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 조작된 WNT 신호 전달 조절제를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, WNT 신호 전달 조절제는 조작된 WNT 작용제 또는 조작된 WNT 길항제이다. 추가의 구현예에서, 조작된 WNT 작용제 및 WNT 길항제는 하나 이상의 Fzd 수용체에 결합하는 결합 조성물 및 하나 이상의 LRP 수용체 또는 Tspan12 수용체에 결합하는 결합 조성물을 포함한다. 추가의 구현예에서, 조작된 WNT 작용제의 결합 조성물은 Fzd4 결합 조성물, Lrp5 결합 조성물, Lrp6 결합 조성물, LRP5/6 결합 조성물, 및 Tspan12 결합 조성물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 조작된 WNT 작용제 또는 WNT 길항제는 망막병증의 초기 및/또는 후기 단계에서 독립적으로 투여된다. 대안적인 구현예에서, WNT 작용제 및 WNT 길항제는 망막병증의 초기 및/또는 후기 단계에서 순차적으로 투여되거나, WNT 작용제 및 WNT 길항제는 망막병증의 초기 및/또는 후기 단계에서 공동 투여된다. 추가의 구현예에서, WNT 작용제는 WNT 길항제의 투여 전 또는 후에 투여된다.

일부 구현예에서, WNT 작용제 및/또는 WNT 길항제는 VEGF 및/또는 Ang2에 특이적인 결합 조성물과 함께 투여된다. 특정 구현예에서, VEGF 또는 Ang2에 특이적인 결합 조성물은 VEGF 또는 Ang2 활성의 길항제이다. 추가의 구현예에서, VEGF 길항제는 베바시주맙, 라니비주맙, 애플리버셉트, 라무시루맙, 및 타니비루맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, Ang2 길항제는 네스바쿠맙, AMG780, 및 MEDI3617로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정 구현예에서, 망막병증은 망막 혈관 질환이다. 일부 구현예에서, 망막 혈관 질환은 혈관 발달의 억제에 의해 야기된다. 대안적인 구현예에서, 망막 혈관 질환은 과도한 혈관신생에 의해 야기된다. 특정 구현예에서, 망막 혈관 질환은: 가족성 삼출성 유리체망막병증(FEVR), 삼출성 유리체망막병증, 노리병, 당뇨병성 망막병증(DR), 노화 관련 황반 변성(AMD), 미숙아 망막병증(ROP), 골다공증-후신경교종 증후군(OPPG), 망막 정맥 폐색, 및 코트병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

도 1a 및 1b는 사용된 WNT 대리 분자에 대한 설명을 제공한다. 도 1a는 WNT 대리 분자의 도식적 표현을 나타내며, 도 1b는 WNT 대리 분자의 각 성분에 대한 클론 명칭 및 서열 식별자를 제공한다.
도 2a 내지 2h는 식별된 WNT 대리 분자 및 RSPO로 치료된 세포에서 SuperTop Flash(STF) 분석으로 측정된 바와 같은 WNT 신호 전달 활성을 나타내는 그래프이다. 도 2a 내지 2d는 다양한 mono-FZD4 WNT 대리체 및 20 nM RSPO로 치료된 형질감염되지 않은 HEK293 세포에서 WNT 신호 전달 활성이 거의 내지 전혀 없음을 나타낸다. 대조적으로, 도 2e 내지 2h는 다양한 FZD4 WNT 대리체 및 20 nM RSPO로 치료했을 경우 WNT 신호 전달 활성을 갖는, 인간 FZD4 유전자로 형질감염된 HEK293 세포를 나타낸다.
도 3은 FZD4 과발현 HEK293 세포의 반정량적 PCR 분석을 나타낸다.
도 4a 내지 4p는 WNT 반응성 프로모터에 의해 조절되는 루시페라아제 유전자를 함유하는 bEnd.3 세포(혈관 연구에 사용되는 마우스 뇌 내피 세포주)에서의 WNT 신호 전달 활성(도 4a 내지 4d) 및 Axin2 발현(도 4e 내지 4h); 또는 WNT 반응성 프로모터에 의해 조절되는 루시페라아제 유전자를 함유하는 HRMEC(일차 인간 망막 미세혈관 내피 세포)에서의 WNT 신호 전달 활성(도 4i 내지 4l) 및 Axin2 발현(도 4m 내지 4p)을 나타낸다.
도 5a 및 5b는 bEnd.3 세포(도 5a) 및 HRMEC(도 5b)에서의 다양한 WNT 수용체 유전자 발현의 반정량적 PCR 분석을 나타낸다.
도 6a 내지 6f는 bEnd.3 세포(도 6a 내지 6c) 또는 HRMEC 세포(도 6d 내지 6f)에서의 WNT 신호 전달 활성에 대해 RSPO를 첨가하거나 첨가하지 않은 다양한 FZD4 WNT 대리체로 치료한 효과를 나타낸다.
도 7a 및 7b는 산소-유도 망막병증 모델의 랫트 모델에서의 다양한 FZD4 WNT 대리 분자를 사용한 실험 설계를 나타낸다. 도 7a는 산소-유도 망막병증 모델의 타임라인을 나타내고; 도 7b는 연구의 아암에 대한 세부사항을 제공한다.
도 8a 및 8b는 항-VEGF 또는 FZD4 WNT 대리 분자 중 하나로 치료한 후의 망막 혈관 성장 및 병리학적 전망막 혈관신생을 나타낸다. 도 8a는 랫트 망막 플랫마운트의 형광 염색을 나타낸다. 도 8b는 혈관 성장 및 혈관신생의 컴퓨터 보조 이미지 분석에 의한 정량적 분석을 나타낸다.

첨부된 청구범위를 포함하여, 본원에서 사용되는 바와 같이, 문맥이 명백하게 달리 언급하지 않는 한, "한", "하나", 및 "그"와 같은 단수 형태의 단어는 이들의 대응하는 복수의 참조를 포함한다.

본원에 인용된 모든 참조 문헌은 각각의 개별 간행물, 특허 출원 또는 특허가 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로서 통합되도록 표시된 것과 동일한 정도로 참조로서 통합된다.

I. 정의.

분자의 "활성"은, 리간드 또는 수용체에 대한 분자의 결합, 촉매 활성, 유전자 발현을 자극하는 능력, 항원 활성, 다른 분자의 활성의 조절 등을 기술하거나 지칭할 수 있다. 분자의 "활성"은 또한 세포-대-세포 상호작용, 예를 들어 접착을 조절하거나 유지하는 활성, 또는 세포의 구조, 예를 들어 세포막 또는 세포골격을 유지하는 활성을 지칭할 수도 있다. "활성"은 또한 특이적 활성, 예를 들어, [촉매 활성]/[mg 단백질], 또는 [면역학적 활성]/[mg 단백질] 등을 의미할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "투여하는" 또는 "도입하는" 또는 "제공하는"은 대상체의 세포, 세포들, 조직 및/또는 기관, 또는 대상체에게 조성물을 전달하는 것을 의미한다. 이러한 투여 또는 도입은 생체 내, 시험관 내 또는 생체 외에서 일어날 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "항체"는 항원 에피토프에 특이적으로 결합하기 위해 필요한 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 또는 재조합 결합제를 의미한다. 따라서, 항체는 목적하는 생물학적 활성, 예를 들어 표적 항원에 대한 특이적 결합을 나타내는 임의의 형태의 항체 또는 이의 단편이다. 따라서, 이는 가장 넓은 의미로 사용되고, 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 단클론 항체(전장 단클론 항체 포함), 다클론 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 나노바디, 디아바디, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 scFv, Fab, 및 Fab2를 포함하지만 이에 한정되지 않는 항체 단편을 특이적으로 포함한다.

"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 예를 들어 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체(예를 들어, Zapata 외, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체의 파페인 소화는 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 용이하게 결정화하는 능력을 나타내는 잔류 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 가지며 여전히 항원을 가교 결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.

용어 "항원"은 항체와 같은 선택적 결합제에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부, 및 그 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 동물에서 사용될 수 있는 30개의 추가적인 것을 지칭한다. 특정 구현예에서, 결합제(예를 들어, WNT 대리 분자 또는 이의 결합 영역, 또는 WNT 길항제)는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 이의 표적 항원을 우선적으로 인식할 경우 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 언급된다.

본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 단편"은, 관심 항원에, 특히 하나 이상의 Fzd 수용체, 또는 LRP5 및/또는 LRP6에 결합하는, 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 VHH/sdAb(단일 도메인 항체) 또는 Nanobody®(Nab)의 적어도 하나의 CDR을 함유하는 폴리펩티드 단편을 지칭한다. 이와 관련하여, 본원에 기술된 항체의 항원 결합 단편은 하나 이상의 Fzd 수용체 또는 LRP5 및/또는 LRP6에 결합하는 항체로부터의 VH 및 VL의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR 모두를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "생물학 활성" 및 "생물학적 활성"은 세포 내의 특정 생물학적 요소에 기인한 활성을 지칭한다. 예를 들어, WNT 작용제, 또는 이의 단편 또는 변이체의 "생물학적 활성"은 WNT 신호를 모방하거나 향상시키는 능력을 지칭한다. 다른 예로서, 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체의 생물학적 활성은, 예를 들어, 결합, 효소 활성 등의 고유 기능을 수행하는 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체의 능력을 지칭한다. 세번째 예로서, 유전자 조절 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 코작 서열 등의 생물학적 활성은 조절 요소 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체가 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현의 번역을 각각 조절하는, 즉, 촉진, 강화 또는 활성화하는 능력을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "이기능성 항체"는 하나의 항원 부위에 대한 특이성을 갖는 제1 아암 및 상이한 항원 부위에 대한 특이성을 갖는 제2 아암을 포함하는, 즉 이중 특이성을 갖는 이기능성 항체를 지칭한다.

"이중특이성 항체"는 사중종(quadroma) 기술(Milstein 외, Nature, 305(5934): 537-540 (1983) 참조), 2개의 상이한 단클론 항체의 화학적 접합(Staerz 외, Nature, 314(6012): 628-631 (1985) 참조), 또는 Fc 영역에 돌연변이를 도입하는 노브-인투-홀 또는 유사한 접근법(Holliger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(14): 6444-6448 (1993) 참조)에 의해 생성된 전장 항체를 지칭하기 위해 본원에서 사용되며, 이는 기능적 이중특이적 항체가 하나만 있는 다수의 상이한 면역글로불린 종을 생성한다. 이중특이적 항체는 2개의 결합 아암 중 하나(HC/LC의 한 쌍)에서 하나의 항원(또는 에피토프)에 결합하고, 제2 아암(HC/LC의 다른 쌍)에서 상이한 항원(또는 에피토프)에 결합한다. 이러한 정의에 의해, 이중특이적 항체는 (특이성 및 CDR 서열 모두에서) 2개의 구별되는 항원 결합 아암을 가지며, 이중특이적 항체가 결합하는 각 항원에 대해 1가이다.

"포함하는"은 인용된 요소가, 예를 들어, 조성물, 방법, 키트 등에 필요하지만, 다른 요소가 청구범위의 범위 내에서, 예를 들어, 조성물, 방법, 키트 등을 형성하기 위해 포함될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 프로모터에 작동가능하게 연결된 치료 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 "포함하는" 발현 카세트는 유전자 및 프로모터에 더하여 다른 요소, 예를 들어 폴리-아데닐화 서열, 인핸서 요소, 다른 유전자, 링커 도메인 등을 포함할 수 있는 발현 카세트이다.

"본질적으로 구성되는"은, 예를 들어, 조성물, 방법, 키트 등의 기본 및 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 특정 물질 또는 단계에 기술된, 예를 들어, 조성물, 방법, 키트 등의 범위의 제한을 의미한다. 예를 들어, 프로모터 및 폴리아데닐화 서열에 작동가능하게 연결된 치료 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로 "본질적으로 구성되는" 발현 카세트는 유전자의 전사 또는 번역에 실질적으로 영향을 미치지 않는 한, 추가 서열, 예를 들어 링커 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 인용된 서열로 "본질적으로 구성된" 변이체, 또는 돌연변이체, 폴리펩티드 단편은 그것이 유래된 전장 순수 폴리펩티드에 기초하는 서열의 경계에서, 인용된 서열의 아미노산 서열에 약 10개를 더하거나 뺀, 예를 들어, 인용된 결합 아미노산 잔기보다 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 더 적거나, 인용된 결합 아미노산 잔기보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 더 많은, 아미노산 잔기를 갖는다.

"~로 구성되는"은 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분의 조성물, 방법, 또는 키트로부터의 배제를 의미한다. 예를 들어, 인용된 서열로 "구성되는" 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인은 인용된 서열만을 함유한다.

"대조군 요소" 또는 "대조군 서열"은 폴리뉴클레오티드의 복제, 복사, 전사, 스플라이싱, 번역 또는 분해를 포함하는, 폴리뉴클레오티드의 기능적 조절에 기여하는 분자의 상호작용에 관여하는 뉴클레오티드 서열이다. 조절은 프로세스의 빈도, 속도 또는 특이성에 영향을 미칠 수 있고, 본질적으로 향상되거나 억제될 수 있다. 당업계에 공지된 제어 요소는, 예를 들어, 프로모터 및 인핸서와 같은 전사 조절 서열을 포함한다. 프로모터는 RNA 중합효소에 결합하고 일반적으로 프로모터로부터 하류(3' 방향으로)에 위치한 암호화 영역의 전사를 개시할 수 있는 특정 조건 하에서의 DNA 영역이다.

"발현 벡터"는 관심 유전자 산물을 암호화하는 영역을 포함하는, 본원에서 논의되거나 당업계에 공지된 바와 같은 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 미니서클, 바이러스 벡터, 리포좀 등이며, 의도된 표적 세포에서의 유전자 산물의 발현을 실행하는 데 사용된다. 발현 벡터는 또한 표적에서 유전자 산물의 발현을 용이하게 하기 위해 암호화 영역에 작동 가능하게 연결된 대조군 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, UTR, miRNA 표적화 서열 등을 포함한다. 조절 요소와 이들이 발현을 위해 작동 가능하게 연결되는 유전자 또는 유전자들의 조합은 때때로 "발현 카세트"로서 지칭되며, 그 중 많은 수가 당업계에 공지되어 있고 이용 가능하거나 당업계에서 이용 가능한 성분으로부터 용이하게 작제될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "FR 세트"는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 CDR 세트의 CDR을 프레이밍하는 4개의 측면 아미노산 서열을 지칭한다. 일부 FR 잔기는 결합된 항원과 접촉할 수 있지만; FR은 주로 V 영역을 항원 결합 부위, 특히 CDR에 직접 인접한 FR 잔기 내로 접는 역할을 한다. FR 내에서, 특정 아미노 잔기 및 특정 구조적 특징은 매우 잘 보존된다. 이와 관련하여, 모든 V 영역 서열은 약 90개의 아미노산 잔기의 내부 이황화 루프를 함유한다. V 영역이 결합 부위 내로 접힐 때, CDR은 항원 결합 표면을 형성하는 투사 루프 모티프로서 디스플레이된다. 정확한 CDR 아미노산 서열에 관계없이, 특정 "정형" 구조 내로의 CDR 루프의 접힌 형상에 영향을 미치는 FR의 보존된 구조 영역이 존재한다는 것이 일반적으로 인식된다. 또한, 특정 FR 잔기는 항체 중쇄 및 경쇄의 상호작용을 안정화시키는 비공유 도메인 간 접촉에 참여하는 것으로 알려져 있다.

용어 "개별", "숙주", "대상체", 및 "환자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 시미언 및 인간을 포함하는 인간 및 비인간 영장류; 포유류 스포츠 동물(예를 들어, 말); 포유류 농장 동물(예를 들어, 양, 염소 등); 포유류 애완동물(개, 고양이 등), 및 설치류(예를 들어, 마우스, 랫트 등)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 포유류를 지칭한다.

"단클론 항체"는 에피토프의 선택적 결합에 관여하는 아미노산(자연 발생 및 비-자연 발생)으로 구성된 동종 항체 집단을 지칭한다. 단클론 항체는 매우 특이적이며, 단일 에피토프에 대해 지시된다. 용어 "단클론 항체"는 온전한 단클론 항체 및 전장 단클론 항체를 포함할 뿐만 아니라, 이의 단편(예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단쇄 (scFv), Nanobody®, 이들의 변이체, 단클론 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질, 인간화 단클론 항체, 키메라 단클론 항체, 필요한 특이성의 항원 결합 단편(에피토프 인식 부위) 및, 본원에 개시된 WNT 대리 분자를 포함하는 에피토프에 결합하는 능력을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다. 이는 항체의 공급원 또는 항체의 제조 방식(예를 들어, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 유전자이식 동물 등)과 관련하여 제한하고자 하는 것은 아니다. 전술한 용어는 전체 면역글로불린뿐만 아니라 "항체"의 정의 하에 전술한 단편 등을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "천연" 또는 "야생형"은 야생형 세포, 조직, 기관 또는 유기체에 존재하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 유전자, 또는 유전자 산물, 예를 들어, RNA 또는 단백질을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "변이체"는 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 돌연변이체, 예를 들어 천연 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 지칭하며, 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 다른 방식으로, 변이체는 기준 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 천연 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 비해 적어도 하나의 아미노산 차이(예를 들어, 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실)를 포함한다. 예를 들어, 변이체는 전장 천연 폴리뉴클레오티드 서열과 50% 이상, 60% 이상, 또는 70% 이상의 서열 동일성, 예를 들어, 전장 천연 폴리뉴클레오티드 서열과 75% 또는 80% 이상의 동일성, 예컨대 85%, 90%, 또는 95% 이상의 동일성, 예를 들어 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 다른 예로서, 변이체는 전장 천연 폴리펩티드 서열과 70% 이상의 서열 동일성, 예를 들어, 전장 천연 폴리펩티드 서열과 75% 또는 80% 이상의 동일성, 예컨대 85%, 90%, 또는 95% 이상의 동일성, 예를 들어 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 변이체는 또한 참조의 변이체 단편, 예를 들어, 천연, 70% 이상의 서열 동일성을 참조의 단편과 공유하는 서열, 예를 들어, 천연, 서열, 예를 들어, 천연 서열과 75% 또는 80% 이상의 동일성, 예컨대 천연 서열과 85%, 90%, 또는 95% 이상, 예를 들어, 98% 또는 99%의 동일성을 공유하는 서열을 포함할 수 있다.

"작동 가능하게 연결된" 또는 "작동하도록 연결된"은 유전적 요소의 병치를 지칭하며, 요소는 이들이 기대된 방식으로 작동하도록 허용하는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터가 암호화 서열의 전사를 개시하는 것을 돕는 경우, 프로모터는 암호화 영역에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한 프로모터와 암호화 영역 사이에 개재 잔기가 있을 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 전술한 용어는 또한 변형된 아미노산 중합체를 포함하며; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 당질화, 지질화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합을 포함한다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이의 유사체를 포함하는, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있고, 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 폴리뉴클레오티드는 이중- 및 단일-가닥 분자와 상호 교환적으로 지칭한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드인 본 발명의 임의의 구현예는 이중-가닥 형태 및 이중-가닥 형태를 구성하는 것으로 알려지거나 예측되는 2개의 상보적 단일-가닥 형태 각각을 모두 포함한다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 다른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대한 소정의 백분율 "서열 동일성"을 가지며, 이는 정렬될 때, 2개의 서열을 비교할 경우 염기 또는 아미노산의 백분율이 동일하다는 것을 의미한다. 서열 유사성은 다수의 상이한 방식으로 결정될 수 있다. 서열 동일성을 결정하기 위해, ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 전 세계 웹을 통해 이용 가능한 BLAST를 포함하는 방법 및 컴퓨터 프로그램을 사용하여 서열을 정렬할 수 있다. 또 다른 정렬 알고리즘은, Oxford Molecular Group, Inc.의 전액 출자 자회사인 미국 위스콘신 주 매디슨의 Genetics Computing Group(GCG) 패키지로 입수 가능한 FASTA이다. 정렬을 위한 다른 기술은 Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, Calif., USA에 기술되어 있다. 특별한 관심 분야는 서열에 갭를 허용하는 정렬 프로그램이다. Smith-Waterman은 서열 정렬의 갭를 허용하는 알고리즘의 한 유형이다. Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997) 참조. 또한, Needleman 및 Wunsch 정렬 방법을 사용하는 GAP 프로그램을 사용해 서열을 정렬할 수 있다. J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970) 참조.

관심 있는 것은 서열 동일성을 결정하기 위해 Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘(Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)에서의 고급형)을 사용하는 BestFit 프로그램이다. 갭 생성 페널티는 보통 1 내지 5, 일반적으로 2 내지 4의 범위일 것이고, 많은 구현예에서는 3일 것이다. 갭 연장 페널티는 보통 약 0.01 내지 0.20의 범위일 것이고, 많은 경우에 0.10일 것이다. 프로그램은 비교를 위해 입력된 서열에 의해 결정된 디폴트 파라미터를 갖는다. 바람직하게는, 서열 동일성은 프로그램에 의해 결정된 디폴트 파라미터를 사용하여 결정된다. 이 프로그램은 또한 미국 위스콘신 주 매디슨의 Genetics Computing Group(GCG) 패키지로부터 입수 가능하다.

또 다른 관심 프로그램은 FastDB 알고리즘이다. FastDB는 Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149(1988), Alan R. Liss, Inc.에 기술되어 있다. 서열 동일성 백분율은 다음 파라미터에 기초하여 FastDB로 계산된다: 불일치 페널티: 1.00; 갭 페널티: 1.00; 갭 크기 패널티: 0.33; 및 결합 패널티: 30.0.

본원에 사용된 "프로모터"는 RNA 중합효소의 결합을 지시하고 이에 의해 RNA 합성, 즉 전사를 지시하기에 충분한 최소 서열을 촉진하는 DNA 서열을 포함한다. 프로모터 및 상응하는 단백질 또는 폴리펩티드 발현은 유비쿼터스일 수 있으며, 이는 광범위한 세포, 조직에서 강력하게 활성이고 종 또는 세포 유형 특이적, 조직 특이적, 또는 종 특이적임을 의미한다, 프로모터는 "구성적", 즉 지속적으로 활성인, 또는 "유도성"일 수 있으며, 이는 프로모터가 생물 또는 비생물 인자의 존재 또는 부재에 의해 활성화되거나 비활성화될 수 있음을 의미한다. 또한, 본 발명의 핵산 작제물 또는 벡터에는 프로모터 서열과 인접하거나 인접하지 않을 수 있는 인핸서 서열이 포함된다. 인핸서 서열은 프로모터-의존성 유전자 발현에 영향을 미치며, 천연 유전자의 5' 또는 3' 영역에 위치할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 적용되는 "재조합"은 폴리뉴클레오티드가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드와 구별되는 작제물을 생성하는 클로닝, 제한 또는 연결 단계, 및 다른 절차의 다양한 조합의 산물임을 의미한다.

용어 "치료", "치료하는" 등은 일반적으로 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미하도록 본원에서 사용된다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 측면에서, 예를 들어, 질환 또는 이의 증상이 대상체에서 발생할 가능성을 감소시키는 측면에서 예방적일 수 있고/있거나, 질환에 대한 부분적 또는 완전한 치유 및/또는 질환에 기인하는 부작용의 측면에서 치료적일 수 있다. 본원에서 사용되는 "치료"는 포유동물에서의 질환의 임의의 치료를 포함하며, (a) 질환에 걸리기 쉬우나 아직 질환에 걸린 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질환을 억제하는 것; 즉, 질환의 발달을 억제하는 것; 또는 (c) 질환을 완화시키는 것, 즉, 질환의 퇴행을 유발하는 것을 포함한다. 치료제는 질환 또는 상해의 발병 전, 발병 중 또는 발병 후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 바람직하지 않은 임상 증상을 안정화시키거나 감소시키는, 진행 중인 질환의 치료는 특히 관심 대상이다. 이러한 치료는 바람직하게는 영향을 받은 조직에서의 기능의 완전한 상실 전에 수행된다. 대상체 요법은 바람직하게는 질환의 증상성 단계 동안 투여될 것이고, 일부 경우에는 질환의 증상성 단계 후에 투여될 것이다.

본원에서 사용되는 문구 "망막 혈관 질환"은 눈의 질환, 특히 비정상적인 혈관구조 형성에 의해 야기되는 망막의 질환이다. 일부 양태에서, 비정상적인 혈관구조는 혈관구조 발달의 억제에 의해 야기되고, 다른 양태에서, 비정상적인 혈관구조는 과도한 혈관형성에 의해 야기된다.

본 발명의 실시는, 달리 명시되지 않는 한, 당업자의 기술 범위 내에 있는, 세포 생물학, 분자 생물학 기술, 미생물학, 생화학 및 면역학의 종래의 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 제2판(Sambrook 외, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel 외 eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis 외 eds., 1994); 및 "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan 외 eds., 1991)에 자세히 설명되어 있고, 이들 각각은 본원에 참조로서 명시적으로 통합된다.

본 발명의 몇몇 양태는 예시를 위한 예시적인 응용을 참조하여 다음에서 설명된다. 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해 수많은 특정 세부 사항, 관계 및 방법이 제시된다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 관련 기술 분야에서 통상의 기술을 가진 자는 특정 세부 사항들 중 하나 이상 없이 또는 다른 방법들과 함께 본 발명이 실시될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다. 본 발명은, 일부 실행이 상이한 순서로 발생할 수 있고/있거나 다른 실행 또는 이벤트와 동시에 발생할 수 있기에, 예시된 실행 또는 이벤트의 순서에 의해 제한되지 않는다. 또한, 모든 예시된 실행 또는 이벤트가 본 발명에 따른 방법론을 구현하는 데 필요한 것은 아니다.

본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 본원에서 사용되는 단수 형태 "한", "하나" 및 "그"는 문맥상 달리 명시되지 않는 한, 복수 형태를 또한 포함하도록 의도된다. 또한, 용어 "포함하다", "포함하는", "갖다", "갖는", "가진" 또는 이들의 변형이 상세한 설명 및/또는 청구범위에 사용되는 한, 이러한 용어는 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적이도록 의도된다.

용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정되는 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내의 것을 의미하며, 이는 그 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 부분적으로 좌우될 것이다. 예를 들어, "약"은 당 기술분야의 실행에 따라, 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 바람직하게는 최대 10%, 더 바람직하게는 최대 5%, 및 더욱 바람직하게는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정에 대해, 전술한 용어는 값의 크기 내에서, 바람직하게는 5배 이내, 보다 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구범위에 기술되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내의 용어 "약"의 의미가 가정되어야 한다.

본원에 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용되는 것과 관련된 방법 및/또는 자료를 개시하고 설명하기 위해 참조로서 본원에 통합된다. 본 개시는 모순이 있는 범위 내에서 통합된 간행물의 임의의 개시를 대체하는 것으로 이해된다.

또한, 청구범위는 임의의 선택적 요소를 배제하도록 작성될 수 있음을 추가로 유의한다. 이와 같이, 본 명세서는 청구 요소의 인용 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "단지", "오직" 등과 같은 배타적인 용어 사용에 대한 선행 근거로서 사용하기 위한 것이다.

달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 용어는 당업자에게 의미하는 바와 동일한 의미를 가지며, 본 발명의 실시는, 당업자의 지식 내에 있는, 미생물학 및 재조합 DNA 기술의 종래의 기술을 사용할 것이다.

II. 일반.

본 발명은, 이에 제한되지는 않지만, FEVR 및 기타 유전적 장애, DR 및 AMD를 포함하는, 망막병증을 치료하기 위해 WNT 신호를 조절하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 망막병증의 진행에서 비정상적인 혈관신생을 억제하기 위한 WNT/b-카테닌 작용제 및/또는 길항제를 제공한다.

WNT("Wingless-related integration site" 또는 "Wingless and Int-1" 또는 "Wingless-Int") 리간드 및 이들의 신호는 뼈, 간, 피부, 위, 장, 신장, 중추 신경계, 유선, 미뢰, 난소, 달팽이관, 폐, 및 다른 여러 조직을 포함하는 많은 필수 기관 및 조직의 발달, 항상성 및 재생을 조절하는 데 핵심적인 역할을 한다(예를 들어, Clevers, Loh, 및 Nusse, 2014; 346:1248012에서 검토됨). WNT 신호 전달 경로의 조절은 퇴행성 질환 및 조직 손상의 치료에 대한 가능성을 갖는다.

치료제로서 WNT 신호 전달을 조절하는 것의 과제 중 하나는 다수의 WNT 리간드 및 WNT 수용체인 Frizzled 1-10(Fzd1-10)의 존재이며, 많은 조직은 다수 및 중첩 Fzd를 발현한다. 또한, 정규 WNT 신호는 Fzds 이외에 다양한 조직에서 광범위하게 발현되는 다저밀도 지단백질(LDL) 수용체 관련 단백질 5(LRP5) 또는 저밀도 지단백질(LDL) 수용체 관련 단백질 6(LRP6)을 공수용체로서 포함한다.

R-스폰딘 1 내지 4는 WNT 신호를 증폭하는 리간드 계열이다. 각각의 R-스폰딘은 하나의 말단에 아연 및 링 핑거 3(ZNRF3) 또는 링 핑거 단백질 43(RNF43)을 함유하는 수용체 복합체 및 다른 말단에 류신이 풍부한 반복-함유 G-단백질 결합 수용체 4-6(LGR4-6)을 통해 작용한다(예를 들어, Knight 및 Hankenson 2014, Matrix Biology; 37: 157-161에서 검토됨). R-스폰딘은 또한 추가적인 작용 메커니즘을 통해 작용할 수 있다. ZNRF3 및 RNF43은 분해를 위해 WNT 수용체(Fzd1-10 및 LRP5 또는 LRP6)를 특이적으로 표적화하는 2개의 막-결합 E3 리가아제이다. ZNRF3/RNF43 및 LGR4-6에 대한 R-스폰딘의 결합은 삼상 복합체의 제거 또는 격리를 유발하는데, 이는 WNT 수용체로부터 E3 리가아제를 제거하고 WNT 수용체를 안정화시켜, WNT 신호를 향상시킨다. 각각의 R-스폰딘은 2개의 퓨린 도메인(1 및 2)을 함유하며, 퓨린 도메인 1은 ZNRF3/RNF43에 결합하고, 퓨린 도메인 2는 LGR4-6에 결합한다. 퓨린 도메인 1 및 2를 함유하는 R-스폰딘의 단편은 WNT 신호 전달을 증폭하기에 충분하다. R-스폰딘 효과는 WNT 신호에 의존하지만, LGR4-6 및 ZNRF3/RNF43 둘 모두는 다양한 조직에서 광범위하게 발현되기 때문에, R-스폰딘의 효과는 조직 특이적이지 않다.

일부 구현예에서, WNT/β-카테닌 신호 전달 길항제 또는 작용제는 하나 이상의 Fzd 수용체에 결합하여 WNT 신호 전달을 억제하거나 향상시키는 결합제 또는 에피토프 결합 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제제 또는 항체는 이들이 결합하는 인간 프리즐드 수용체(들) 내의 시스테인-풍부 도메인(CRD)에 특이적으로 결합한다. 또한, LRP에 대한 에피토프 결합 도메인을 함유하는 길항 결합제가 사용될 수도 있다. 일부 구현예에서, WNT/β-카테닌 길항제는 E3 리가아제 ZNRF3/RNF43 및 하나 이상의 FZD 수용체 또는 하나 이상의 LRP 공-수용체에 결합하는 결합제 또는 에피토프 결합 도메인을 보유하여 FZD 또는 LRP 수용체의 분해를 촉진하고, 이 분자는 표적화를 위한 세포 유형 특이적 에피토프에 결합하는 결합 도메인을 또한 함유할 수 있다. E3 리가아제 작용제 항체 또는 이의 단편은 단일 분자이거나 다른 WNT 길항제, 예를 들어, Fzd 수용체 길항제, LRP 수용체 길항제 등과 조합될 수 있다.

당업계에 잘 알려진 바와 같이, 항체는 면역글로불린 분자의 가변 영역 상에 위치한 적어도 에피토프 결합 도메인을 통해, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 같은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 전술한 용어는 온전한 다클론 또는 단클론 항체를 포함할 뿐만 아니라, 에피토프 결합 도메인(예를 들어, dAb, Fab, Fab', (F(ab')₂, Fv, 단쇄 (scFv), VHH 또는 단일 도메인 항체(sdAb)), DVD-Ig, 이의 합성 변이체, 자연 발생 변이체, 에피토프 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 및 필요한 특이성의 항원 결합 부위 또는 단편(에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다. 유전자 융합에 의해 작제된 "디아바디", 다가 또는 다중특이적 단편(WO94/13804; P. Holliger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993) 또한 본원에서 고려되는 항체의 특정 형태이다. CH3 도메인에 결합된 scFv를 포함하는 소형체 또한 본원에 포함된다(S. Hu 외, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996) (예를 들어, Ward, E. S. 외, Nature 341, 544-546 (1989); Bird 외, Science, 242, 423-426, 1988; Huston 외, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); PCT/US92/09965; WO94/13804; P. Holliger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993; Y. Reiter 외, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996; S. Hu 외, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996 참조).

단백질분해 효소 파파인은 IgG 분자를 우선적으로 절단하여 여러 단편을 수득하며, 이들 중 2개(F(ab) 단편)는 각각 온전한 항원 결합 부위를 포함하는 공유 이종이량체를 포함한다. 효소 펩신은 IgG 분자를 절단하여 항원 결합 부위 둘 모두를 포함하는 F(ab')2 단편을 포함하는 여러 단편을 제공할 수 있다. 본 개시의 특정 구현예에 따라 사용하기 위한 Fv 단편은 IgM의 우선적 단백질분해 절단에 의해, 그리고 드물게는 IgG 또는 IgA 면역글로불린 분자의 절단에 의해 생성될 수 있다. 그러나, Fv 단편은 당업계에 공지된 재조합 기술을 사용하여 보다 일반적으로 유도된다. Fv 단편은 천연 항체 분자의 항원 인식 및 결합 능력의 대부분을 보유하는 항원 결합 부위를 포함하는 비공유 VH::VL 이종이량체를 포함한다. Inbar 외, (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman 외, (1976) Biochem 15:2706-2710; 및 Ehrlich 외, (1980) Biochem 19:4091-4096 참조.

특정 구현예에서, 단쇄 Fv 또는 scFV 항체가 고려된다. 예를 들어, Kappa Bodys(Ill 외, Prot. Eng. 10: 949-57 (1997)); 소형체(Martin 외, EMBO J 13: 5305-9 (1994)); 디아바디(Holliger 외, PNAS 90: 6444-8 (1993)); 또는 Janusins(Traunecker 외, EMBO J 10: 3655-59 (1991) 및 Traunecker 외, Int. J. Cancer Suppl. 7: 51-52 (1992))는 목적하는 특이성을 갖는 항체를 선택하는 것에 관한 본 출원의 교시에 따라 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 리간드를 포함하는 이중특이적 또는 키메라 항체가 제조될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체는 상이한 항체로부터의 CDR 및 프레임워크 영역을 포함할 수 있는 반면, 하나의 결합 도메인을 통해 하나 이상의 Fzd 수용체에 특이적으로 그리고 제2 결합 도메인을 통해 제2 분자에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체가 생성될 수 있다. 이들 항체는 재조합 분자 생물학적 기술을 통해 생산되거나 물리적으로 함께 접합될 수 있다.

단쇄 Fv(scFv) 폴리펩티드는 펩티드 암호화 링커에 의해 연결된 VH- 및 VL-암호화 유전자를 포함하는 유전자 융합으로부터 발현되는 공유 결합된 VH:VL 이종이량체이다. Huston 외, (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85(16):5879-5883 참조. 항체 V 영역으로부터 자연적으로 응집되지만 화학적으로 분리된, 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 항원 결합 부위의 구조와 실질적으로 유사한 3차원 구조로 접힐 scFv 분자로 변환하기 위한 화학적 구조를 구별하기 위한 다수의 방법이 기술되었다. 예를 들어, Huston 외, 미국 특허 제5,091,513호 및 제5,132,405호; 및 Ladner 외, 미국 특허 제4,946,778호 참조.

특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 항체는 디아바디의 형태이다. 디아바디는 폴리펩티드의 다량체이며, 각각의 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄의 결합 영역을 포함하는 제1 도메인 및 면역글로불린 중쇄의 결합 영역을 포함하는 제2 도메인을 포함하되, 2개의 도메인은 (예를 들어, 펩티드 링커에 의해) 연결되지만 서로 결합하여 항원 결합 부위를 형성할 수 없고: 항원 결합 부위는 다량체 내의 하나의 폴리펩티드의 제1 도메인과 다량체 내의 다른 폴리펩티드의 제2 도메인과의 결합에 의해 형성된다(WO94/13804).

항체의 dAb 단편은 VH 도메인으로 구성된다(Ward, E. S. 외, Nature 341, 544-546 (1989)).

이중특이적 항체가 사용될 경우, 이들은, 예를 들어, 화학적으로 또는 하이브리도마로부터 제조되거나, 전술한 이중특이적 항체 단편 중 어느 하나일 수 있는, 다양한 방식으로 제조될 수 있는 종래의 이중특이적 항체일 수 있다(Holliger, P. 및 Winter G., Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)). 디아바디 및 scFv는 가변 도메인만을 사용하여 Fc 영역 없이 작제될 수 있으며, 잠재적으로 항-이질형 반응의 효과를 감소시킨다.

이중특이적 전체 항체와 대조적으로, 이중특이적 디아바디가 대장균에서 쉽게 구성되고 발현될 수 있기 때문에, 이 또한 특히 유용할 수 있다. 적절한 결합 특이성의 디아바디(및 항체 단편과 같은 많은 다른 폴리펩티드)는 라이브러리로부터의 파지 디스플레이(WO94/13804)를 사용하여 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 항원 X에 대해 유도된 특이성으로, 디아바디의 하나의 아암이 일정하게 유지되어야 하는 경우, 다른 아암이 가변되고 적절한 특이성의 항체가 선택되는 라이브러리가 만들어질 수 있다. 이중특이적 전체 항체는 노브-인투-홀 조작에 의해 제조될 수 있다(J. B. Ridgeway 외, Protein Eng., 9, 616-621 (1996)).

특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 UniBody®의 형태로 제공될 수 있다. UniBody®는 힌지 영역이 제거된 IgG4 항체이다(GenMab Utrecht, The Netherlands 참조; 또한, 예를 들어 US20090226421 참조). 이러한 독점 항체 기술은 현재의 소형 항체 포맷보다 더 긴 치료 기간이 예상되는 안정적이고 더 작은 항체 포맷을 생성한다. IgG4 항체는 불활성으로 간주되므로 면역계와 상호작용하지 않는다. 완전한 인간 IgG4 항체는 상응하는 온전한 IgG4(GenMab, Utreecht)에 비해 뚜렷한 안정성 특성을 갖는 반분자 단편을 수득하기 위해 항체의 힌지 영역을 제거함으로써 변형될 수 있다. IgG4 분자를 절반으로 만들면 UniBody®에서 동족 항원(예를 들어, 질환 표적)에 결합할 수 있는 하나의 영역만 남게 되고, 따라서 UniBody®는 표적 세포 상의 하나의 부위에만 1가 결합하게 된다.

특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편은 각각 중쇄 및 경쇄 CDR 세트를 포함하는데, 이는 CDR에 대한 지지를 제공하고 서로에 대한 CDR의 공간적 관계를 정의하는 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역(FR) 세트 사이에 개재된다. 본원에서 사용되는 용어 "CDR 세트"는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 3개의 초가변 영역을 지칭한다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단으로부터, 이들 영역은

각각 "CDR1", "CDR2", 및 "CDR3"으로 표시하였다. 따라서, 항원 결합 부위는 중쇄 및 경쇄 V 영역 각각으로부터의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR을 포함한다. 단일 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2 또는 CDR3)을 포함하는 폴리펩티드는 본원에서 "분자 인식 유닛"으로서 지칭된다. 다수의 항원-항체 복합체의 결정학적 분석은 CDR의 아미노산 잔기가 결합된 항원과의 광범위한 접촉을 형성함을 입증하였는데, 여기에서 가장 광범위한 항원 접촉은 중쇄 CDR3 과의 접촉이다. 따라서, 분자 인식 단위는 항원 결합 부위의 특이성을 주로 담당한다.

특정 구현예에서, 본 개시의 항체는 Nanobody®의 형태를 취할 수 있다. Nanobody® 기술은 원래 낙타과(예를 들어, 낙타 및 라마)가 중쇄로만 구성되고 따라서 경쇄가 결여된 완전한 기능적 항체를 갖고 있다는 발견 및 식별에 따라 개발되었다. 이들 중쇄 단독 항체는 단일 가변 도메인(VHH) 및 2개의 불변 도메인(CH2, CH3)을 함유한다. 클로닝되고 단리된 단일 가변 도메인은 완전한 항원 결합 능력을 가지며 매우 안정적이다. 이들 단일 가변 도메인은, 이들의 고유한 구조적 및 기능적 특성을 가지고, "Nanobody®"의 기초를 형성한다. Nanobody®는 단일 유전자에 의해 암호화되고, 거의 모든 원핵 및 진핵 숙주, 예를 들어, 대장균(예를 들어, 미국 특허 제6,765,087호), 몰드(예를 들어, 아스페르길루스 또는 트리코데마) 및 효모(예를 들어, 사카로미세스, 클루이버미세스, 한세눌라 또는 피치아(예를 들어, 미국 특허 제6,838,254호))에서 효율적으로 생산된다. 생산 공정은 확장 가능하며, Nanobody®의 다중 킬로그램 수량이 생산된 바 있다. Nanobody®는 장기간 사용 가능하게 바로 사용이 가능한 용액으로 제형화될 수 있다. Nanoclone® 방법(예를 들어, WO06/079372 참조)은 B-세포의 자동화된 고처리량 선택에 기초하여 목적하는 표적에 대해 Nanobody®를 생성하는 독점적인 방법이다. Nanobody®는 낙타과-특이적 중쇄 단독 항체의 단일 도메인 항원 결합 단편이다. VHH 항체로도 지칭되는 Nanobody®는 일반적으로 약 15 kDa의 작은 크기를 갖는다.

고려되는 또 다른 항체 단편은 이중 가변 도메인-면역글로불린(DVD-Ig)이며, 하나의 분자 엔티티에서 2개의 단클론 항체의 기능 및 특이성을 조합하는 조작된 단백질이다. DVD-Ig는 각각의 경쇄 및 중쇄는 IgG 내의 하나의 가변 도메인 대신에 짧은 펩티드 연결을 통해 일렬로 2개의 가변 도메인을 함유하는 것을 제외하고는 IgG-유사 분자로서 설계된다. 2개의 가변 도메인의 융합 배향 및 링커 서열의 선택은 분자의 기능적 활성 및 효율적인 발현에 중요하다. DVD-Ig는 제조 및 정제용 단일 종으로서 종래의 포유류 발현 시스템에 의해 생산될 수 있다. DVD-Ig는 모 항체의 특이성을 가지며, 생체 내에서 안정적이고, IgG-유사 물리화학적 및 약동학적 특성을 나타낸다. DVD-Ig 및 이를 제조하기 위한 방법은 Wu, C. 외, Nature Biotechnology, 25:1290-1297 (2007)에 기술되어 있다.

특정 구현예에서, 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화된다. 이는, 일반적으로 재조합 기술을 사용하여 제조되고, 비인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 유래된 항원-결합 부위 및 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초하여 분자의 나머지 면역글로불린 구조를 갖는 키메라 분자를 지칭한다. 항원 결합 부위는 불변 도메인 상에 융합된 완전한 가변 도메인 또는 가변 도메인 내의 적절한 프레임워크 영역 상에 접목된 CDR만을 포함할 수 있다. 에피토프 결합 부위는 야생형이거나 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 이는 인간 개체에서 불변 영역으로서의 면역원을 제거하지만, 외래 가변 영역에 대한 면역 반응의 가능성이 남아 있다(LoBuglio, A. F. 외, (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:4220-4224; Queen 외, PNAS (1988) 86:10029-10033; Riechmann 외, Nature (1988) 332:323-327). 본원에 개시된 항-Fzd 또는 LRP 항체의 인간화에 대한 예시적인 방법은 미국 특허 제7,462,697호에 기술된 방법을 포함한다.

또 다른 접근법은 인간 유래 불변 영역을 제공하는 것뿐만 아니라, 가변 영역을 변형시켜 인간 형태에 가능한 한 가깝게 이들의 형상을 재형성하는 것에 초점을 맞춘다. 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 영역은 문제의 에피토프에 반응하여 가변적이고, 주어진 종에서 상대적으로 보존되고 CDR에 대해 추정상으로 스캐폴드를 제공하는 4개의 프레임워크 영역(FR)이 측면에 위치하는 결합 능력을 결정하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 것으로 알려져 있다. 비인간 항체가 특정 에피토프에 대해 제조되는 경우, 가변 영역은 변형될 인간 항체에 존재하는 FR 상에 비인간 항체로부터 유래된 CDR을 접목시킴으로써 "재형성"되거나 "인간화"될 수 있다. 다양한 항체에 대한 이러한 접근법의 적용은 Sato, K. 외, (1993) Cancer Res 53:851-856; Riechmann, L. 외, (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. 외, (1988) Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. 외, (1991) Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. 외, (1991) Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D.외, (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:4181-4185; Tempest, P. R. 외, (1991) Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. 외, (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Carter, P. 외, (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289; 및 Co, M. S. 외, (1992) J Immunol 148:1149-1154에서 보고된 바 있다. 일부 구현예에서, 인간화 항체는 모든 CDR 서열(예를 들어, 마우스 항체로부터의 6개의 CDR을 모두 함유하는 인간화 마우스 항체)을 보존한다. 다른 구현예에서, 인간화 항체는 원래의 항체에 대해 변경된 하나 이상의 CDR(1, 2, 3, 4, 5, 6개)을 가지며, 이는 원래의 항체로부터 하나 이상의 CDR로부터 "유래된" 하나 이상의 CDR로도 지칭된다.

특정 구현예에서, 본 개시의 항체는 키메라 항체일 수 있다. 이와 관련하여, 키메라 항체는 상이한 항체의 이종 Fc 부분에 작동 가능하게 연결되거나 달리 융합된 항체의 항원 결합 단편으로 구성된다. 특정 구현예에서, 이종 Fc 도메인은 인간 기원이다. 다른 구현예에서, 이종 Fc 도메인은 IgA(서브클래스 IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE, IgG(서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 포함), 및 IgM을 포함하는 모 항체와 상이한 Ig 클래스로부터 유래할 수 있다. 추가의 구현예에서, 이종 Fc 도메인은 상이한 Ig 클래스 중 하나 이상의 CH2 및 CH3 도메인으로 구성될 수 있다. 인간화 항체와 관련하여 전술한 바와 같이, 키메라 항체의 항원 결합 단편은 본원에 기술된 항체의 CDR 중 하나 이상(예를 들어, 본원에 기술된 항체의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR)만을 포함할 수 있거나, 전체 가변 도메인(VL, VH 또는 둘 모두)을 포함할 수 있다.

면역글로불린 CDR 및 가변 도메인의 구조 및 위치는, Kabat, E. A. 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 제4판, 마국 보건복지부(1987), 및 인터넷 상에서 이용 가능한 그의 업데이트(immuno.bme.nwu.edu)를 참조하여 결정할 수 있다.

특정 구현예에서, 길항제 또는 작용제 결합제는 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 또는 약 10 nM 이하의 해리 상수(K_D)로 결합한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 둘 이상의 FZD에 결합하는 본원에 기술된 FZD 결합제 또는 항체는 약 100 nM 이하, 약 20 nM 이하, 또는 약 10 nM 이하의 K_D로 이들 FZD에 결합한다. 특정 구현예에서, 결합제는 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 또는 약 1 nM 20 이하의 EC50으로 하나 이상의 그의 표적 항원에 결합한다.

본 발명의 항체 또는 다른 제제는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 특이적 결합에 대해 분석될 수 있다. 사용될 수 있는 면역분석은, 바이오층 간섭계(BLI) 분석, FACS 분석, 면역형광법, 면역세포화학, 웨스턴 블롯, 방사성 면역분석, ELISA, "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 침전 반응, 겔 확산 침전소 반응, 면역확산 분석, 응집 분석, 보체 고정 분석, 면역방사능 분석, 형광 면역분석, 및 단백질 A 면역분석과 같은 경쟁 또는 비경쟁적 분석 시스템을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 분석은 통상적이고 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Ausubel 외 편집, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York 참조, 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).

예를 들어, 표적 항원에 대한 항체의 특이적 결합은 ELISA를 사용하여 결정될 수 있다. ELISA 분석은 항원을 제조하는 단계, 항원으로 96 웰 마이크로역가 플레이트의 웰을 코팅하는 단계, 항체 또는 효소 기질(예를 들어, 호스래디쉬 과산화효소 또는 알칼리 인산분해효소)과 같은 검출 가능한 화합물에 접합된 다른 결합제를 웰에 첨가하는 단계, 일정 기간 동안 배양하는 단계, 및 항원의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 제제는 검출 가능한 화합물에 접합되지 않고, 대신에 제1 항체 또는 제제를 인식하는 제2 접합된 항체가 웰에 첨가된다. 일부 구현예에서, 항원으로 웰을 코팅하는 대신에, 항체 또는 제제가 웰에 코팅될 수 있고, 항원을 코팅된 웰에 첨가한 후, 검출 가능한 화합물에 접합된 제2 항체가 첨가될 수 있다. 당업자는 검출된 신호를 증가시키기 위해 변형될 수 있는 파라미터뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 ELISA 변형(예를 들어, Ausubel 외 편집, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, 11.2.1 참조)에 대해 인지할 것이다.

항체 또는 다른 제제의 표적 항원에 대한 결합 친화도 및 항체-항원 상호작용의 오프-레이트(off-rate)는 경쟁 결합 분석에 의해 결정될 수 있다. 경쟁 결합 분석의 일례는, 표지된 항원(예를 들어, Fzd, LRP), 또는 이의 단편 또는 변이체를, 증가하는 양의 표지되지 않은 항원의 존재 하에 관심 항체를 사용해 배양한 다음, 표지된 항원에 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함하는 방사성 면역 분석이다. 항체의 친화도 및 결합 오프-레이트는 스카차드 플롯 분석에 의한 데이터로부터 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, BLI 분석은 항체 또는 제제의 결합 온 및 오프 레이트를 결정하는 데 사용된다. BLI 동역학 분석은 그의 표면 상에 고정된 항원이 있는 칩으로부터 항체의 결합 및 해리를 분석하는 단계를 포함한다.

특정 구현예에서, WNT 작용제는 그 전체가 본원에 통합되는 PCT 공개 번호 제WO2019126398호에 개시된 것들로부터 선택된다. 특정 구현예에서, WNT 작용제는 도 1a에 도시된 구조를 갖고/갖거나 도 1b에 개시된 WNT 작용제 중 어느 하나에 대해 개시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, WNT 작용제는 리더 서열이 이탤릭체로 표시되고, 링커 서열에 밑줄이 그어져 있고, VHH/sdAb 또는 VH 또는 VL 서열은 굵은 글씨체인 서열번호: 1 내지 8 중 어느 하나에 개시된 서열에 대해 적어도 90%의 동일성(예를 들어, 95%, 98% 또는 100%의 동일성)을 갖는 서열을 포함한다.

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III. 약학적 조성물

본원에 기술된 WNT 길항제 또는 작용제 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 또한 개시된다.

추가의 구현예에서, 본원에 기술된 WNT 길항제/작용제 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체, 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 또한 개시된다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 mRNA, 예를 들어, 변형된 mRNA이다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 캡 서열 및/또는 3' 테일링 서열, 예를 들어, 폴리A 테일을 더 포함하는 변형된 mRNA이다. 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트이다.

일부 구현예에서, WNT 길항제/작용제는 WNT 신호 전달 경로 내의 다양한 분자에 결합하는 다양한 에피토프 결합 단편을 포함하는 조작된 재조합 폴리펩티드이다. 예를 들어, WNT 길항제는 Fzd4 수용체 및/또는 LRP 수용체에 결합하여 WNT 신호 전달을 억제하는 항체 또는 이의 단편일 수 있다. Fzd4 및 LRP 항체 단편(예를 들어, Fab, scFv, VHH/sdAb 등)은 하나의 분자 상에서 직접적으로 또는 다양한 크기의 링커와 함께 결합될 수 있다.

역으로, 조작된 WNT 작용제/길항제는 또한 WNT 신호 전달 경로 내의 다양한 분자에 결합하여 WNT 신호 전달을 향상시키는 에피토프 결합 단편을 포함하는 재조합 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, WNT 작용제는 Fzd 수용체 및/또는 LRP 수용체에 결합하여 WNT 신호 전달을 향상시키는 항체 또는 이의 단편일 수 있다. Fzd 및 LRP 항체 단편(예를 들어, Fab, scFv, VHH/sdAb 등)은 하나의 분자 상에서 직접적으로 또는 다양한 크기의 링커와 함께 결합될 수 있다.

추가의 구현예에서, 본원에 기술된 WNT 길항제/작용제 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체, 또는 부형제를 포함하는 발현 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터를 포함하는 약학적 조성물이 또한 개시된다. 특정 구현예에서, WNT 길항제 분자를 암호화하는 핵산 서열 및 WNT 작용제를 암호화하는 핵산 서열은 동일한 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 발현 카세트 내에 있다.

본 개시는, WNT 길항제/작용제 분자를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체, 또는 부형제를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 세포를 포함하는, 약학적 조성물을 추가로 고려한다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 WNT 길항제 및 WNT 작용제를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 세포를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, WNT 길항제 분자를 암호화하는 핵산 서열 및 WNT 작용제 분자를 암호화하는 핵산 서열은 동일한 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 발현 카세트 및/또는 동일한 세포 내에 존재한다. 특정 구현예에서, 세포는 치료 대상인 대상체로부터 수득된 이종 세포 또는 자가 세포이다.

특정 구현예에서, 세포는 줄기 세포, 예를 들어, 지방 유래 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포이다. 본 개시는 WNT 길항제 분자를 제1 활성제로서 전달하기 위한 제1 분자, 및 제2 분자로서 WNT 작용제를 포함하는 약학적 조성물을 고려한다. 제1 및 제2 분자는 동일한 유형의 분자 또는 상이한 유형의 분자일 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 제1 및 제2 분자는 각각 다음의 유형의 분자로부터 독립적으로 선택될 수 있다: 폴리펩티드, 작은 유기 분자, 제1 또는 제2 활성제를 암호화하는 핵산(선택적으로, DNA 또는 mRNA, 선택적으로 변형된 RNA), 제1 또는 제2 활성제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터(선택적으로, 발현 벡터 또는 바이러스 벡터), 및 제1 또는 제2 활성제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 세포(선택적으로, 발현 카세트).

대상 분자는, 단독으로 또는 조합하여, 일반적으로 안전하고, 비독성이고, 바람직한 제형을 제조하는 데 유용한 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 및 시약과 조합될 수 있고, 포유류, 예를 들어, 인간 또는 영장류에 대해 허용 가능한 부형제를 포함한다. 이러한 부형제는 고체, 액체, 반고체일 수 있거나, 에어로졸 조성물의 경우, 기체일 수 있다. 이러한 담체, 희석제 및 부형제의 예는 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로오스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 보충 활성 화합물 또한 제형에 혼입될 수 있다. 제형에 사용되는 용액 또는 현탁액은 주사용수, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균 화합물; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트화 화합물; 아세테이트, 시트르산염 또는 인산염과 같은 완충제; Tween 20과 같은 응집을 방지하는 세제; 및 염화나트륨 또는 포도당과 같은 등장성 조절용 화합물을 포함할 수 있다. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절될 수 있다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 멸균 상태이다.

약학적 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 추가로 포함할 수 있다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리식염수, 정균수, 또는 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 일부 경우, 조성물은 멸균 상태이고, 주사기 내로 흡인되거나 주사기로부터 대상체에게 전달될 수 있는 유체여야 한다. 소정의 구현예에서, 이는 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이며, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존된다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적절한 혼합물을 함유하는, 예컨대 용매 또는 분산액 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우, 등장성 제제, 예를 들어, 당, 만니톨과 같은 폴리알코올, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물 내에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 내부 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.

멸균 용액은, WNT 길항제/작용제 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (또는 이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 세포를 암호화하는 것)을 필요에 따라, 위에서 열거된 성분 중 하나 또는 조합을 사용해 적절한 용매에 혼입한 후, 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산액 매질 및 위에서 열거된 것들로부터 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 운송체 내에 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 활성 성분의 분말과 사전에 멸균 여과된 이의 용액으로부터 임의의 추가의 목적하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다.

일 구현예에서, 약제학적 조성물은, 이식물 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 방출 제어 제형과 같은, 신체로부터의 신속한 제거에 대해 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 보호할 담체와 함께 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 물질은 또한 상업적으로 수득될 수 있다. 리포좀 현탁액은 또한 약학적으로 허용 가능한 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.

투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 약학적 조성물을 투여량 단위 형태로 제형화하는 것이 유리할 수 있다. 본원에서 사용되는 투여량 단위 형태는 치료 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 이산된 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 요구되는 약학적 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정의 양의 활성 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유한다. 투여 단위 형태에 대한 사양은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 고유한 특성과 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 개체의 치료를 위해 이러한 활성 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 합성하는 기술에 내재된 한계에 의해 지시되고 직접적으로 좌우된다.

약학적 조성물은 용기, 팩 또는 분배기, 예를 들어 주사기, 예를 들어 사전 충전된 주사기에 투여 지침과 함께 포함될 수 있다.

본 개시의 약학적 조성물은 임의의 약학적으로 허용 가능한 염, 에스테르, 또는 이러한 에스테르의 염, 또는 인간을 포함하는 동물에게 투여 시, 생물학적으로 활성인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 임의의 다른 화합물을 포함한다.

본 개시는 본원에 기술된 WNT 길항제/작용제 분자의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 본 개시의 화합물의 생리학적 및 약학적으로 허용 가능한 염: 즉, 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 유지하고 이에 대해 바람직하지 않은 독성학적 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 다양한 염이 당업계에 공지되어 있다: 예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 제17판, Alfonso R. Gennaro(편), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985(및 이의 최신판), "Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology", 제3판, James Swarbrick(편), Informa Healthcare USA (Inc.), NY, USA, 2007, 및 J. Pharm. Sci. 66:2(1977). 또한, 적절한 염류에 대한 검토는 "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use", Stahl 및 Wermuth(Wiley-VCH, 2002)를 참조한다. 약학적으로 허용 가능한 염기 첨가 염은 알칼리 및 알칼리 토금속 또는 유기 아민과 같은 금속 또는 아민으로 형성된다.

양이온으로서 사용되는 금속은 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등을 포함한다. 아민은 N-N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 디시클로헥실아민, 에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 및 프로카인을 포함한다(예를 들어, Berge 외, "Pharmaphical Salts", J. Pharma Sci., 1977, 66, 119 참조). 전술한 산성 화합물의 염기 첨가 염은 유리산 형태를 충분한 양의 목적하는 염기와 접촉시켜 종래의 방식으로 염을 생산함으로써 제조된다. 유리산 형태는 염 형태를 산과 접촉시키고 종래의 방식으로 유리산을 단리함으로써 재생될 수 있다. 유리산 형태는 극성 용매에서의 용해도와 같은 특정 물리적 특성에서 이들의 각각의 염 형태와 다소 상이할지라도, 염은 본 개시의 목적을 위해 각각의 유리산과 동등하다.

일부 구현예에서, 본원에서 제공된 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제, 예를 들어, 식염수, 인산염 완충 식염수, 인산염 및 아미노산, 중합체, 폴리올, 당, 완충제, 보존제 및 기타 단백질과 혼합된 WNT 길항제/작용제 분자 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 치료적 유효량을 포함한다. 예시적인 아미노산, 중합체 및 당류 등은 옥틸페녹시 폴리에톡시 에탄올 화합물, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 화합물, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 수크로오스, 과당, 덱스트로스, 말토오스, 포도당, 만니톨, 덱스트란, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 자일리톨, 락토오스, 트레할로스, 소 또는 인간 혈청 알부민, 시트르산염, 아세테이트, 링거 및 행크 용액, 시스테인, 아르기닌, 카르니틴, 알라닌, 글리신, 리신, 발린, 류신, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 및 글리콜이다. 바람직하게는, 이러한 제형은 4°C에서 적어도 6개월 동안 안정적이다.

일부 구현예에서, 본원에서 제공된 약학적 조성물은 인산 완충 식염수(PBS) 또는 인산나트륨/황산나트륨, 트리스 완충액, 글리신 완충액, 멸균수 및 Good외, (1966) Biochemistry 5:467에서 기술된 바와 같은 당업자에게 공지된 다른 완충액을 포함한다. 완충액의 pH는 6.5 내지 7.75, 바람직하게는 7 내지 7.5, 및 가장 바람직하게는 7.2 내지 7.4의 범위일 수 있다.

IV. 사용 방법

본 개시는 또한, 예를 들어, WNT 신호 전달 경로를 조절하기 위해, 예를 들어, WNT 신호 전달을 증가시키거나 감소시키기 위해 WNT 길항제/작용제 분자를 사용하는 방법, 및 다양한 치료 환경에서 WNT 길항제/작용제 분자를 투여하는 방법을 제공한다. WNT 길항제/작용제 분자를 사용하는 치료 방법이 본원에 제공된다. 일 구현예에서, WNT 길항제/작용제 분자는 부적절하거나 조절되지 않은 WNT 신호 전달을 수반하는 질환을 가진 대상체에게 제공된다.

특정 구현예에서, WNT 길항제/작용제 분자는 조직 또는 세포에서 WNT 신호 전달 경로를 차단하거나 향상시키기 위해 사용될 수 있다. WNT 신호 전달 경로를 길항하는 단계는 세포 또는 조직에서 WNT 신호 전달을 감소시키거나 억제하는 단계를 포함할 수 있다. WNT 신호 전달 경로를 작용화하는 단계는, 예를 들어, 조직 또는 세포에서 WNT 신호 전달을 증가시키거나 WNT 신호 전달을 향상시키는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시는 세포 내에서 WNT 신호 전달 경로를 길항/작용시키는 방법을 제공하며, 이는 조직 또는 세포를 본원에 개시된 WNT 길항제/작용제 분자 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하되, WNT 길항제/작용제 분자는 WNT 신호 전달 경로 길항제/작용제이다. 일부 구현예에서, 접촉시키는 단계는 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내에서 일어난다. 특정 구현예에서, 세포는 배양된 세포이고, 접촉하는 단계는 시험관 내에서 일어난다.

WNT 길항제/작용제 분자는 망막병증의 치료에 사용될 수 있다. 특히, WNT 신호 전달의 활성화는 눈의 혈관 발생 동안 망막 혈관 형성에 필요하다. 노린, Fzd4, Lrp5 또는 Tspan12의 유전적 결실은 표재성 망막 표면 상에서 혈관 발달을 심각하게 퇴행시킬 뿐만 아니라, 망막의 더 깊은 층으로의 혈관 침투도 심각하게 퇴행시킨다. 또한, 미성숙 혈관화로 인해 생성된 혈관 외 영역은 허혈로 유도된 혈관신생을 유발한다. 따라서, WNT 작용제 및/또는 길항제의 시기 적절하게 조절된 투여는 망막병증 질환 진행을 퇴행시킬 뿐만 아니라 질환의 개선으로 이어질 것이다. 특정 구현예에서, WNT 작용제/길항제는 대상체에서 망막병증 질환 진행의 이전 또는 이후 단계에서 투여될 것이다.

WNT 작용제 및 길항제 둘 모두는 단독 요법으로서 단독으로, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 망막에서 무혈관 영역을 나타내는 질병 발달의 초기 단계에서의 작용제의 투여는 혈관 형성을 자극/안정화시키고 혈관을 무혈관 인자로부터 보호할 것이다. 반면, 혈관신생을 나타내는 후기 단계에서의 길항제의 투여는 망막에서의 비정상적인 혈관 재생을 억제할 수 있다. 따라서, 작용제 및 길항제 둘 모두의 순차적 치료는 질환을 조절하기 위한 하나의 잠재적 옵션이다. 대표적인 투여 일정에서, 작용제를 혈관재개통 단계에서 먼저 투여한 후, 길항제를 혈관신생 단계에서 적용한다. 반대되는 역할을 시험하기 위해, WNT 작용제 및 길항제를 역순서로 대상체에게 투여한다. 그러나, 혈관 구조의 안정화에 대한 WNT의 잠재적 효과를 감안하면, 혈관신생 단계에서의 작용제의 투여도 고려된다.

망막 혈관 질환은: 가족성 삼출성 유리체망막병증(FEVR), 삼출성 유리체망막병증, 노리병, 당뇨병성 망막병증(DR), 노화 관련 황반 변성(AMD), 미숙아 망막병증(ROP), 골다공증-후신경교종 증후군(OPPG), 망막 정맥 폐색, 및 코트병을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명은 또한 FEVR 및/또는 DR에 대한 공지된 치료제와의 병용 치료를 제공한다. 예를 들어, WNT 길항제/작용제는 항-VEGF 항체를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 망막병증에 대한 현재의 요법과 조합하여 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-Ang2 항체는 WNT 작용제/길항제와 병용하여 대상체에게 투여될 것이다. 저산소증 유도 VEGF 및 Ang2 발현은 병리학적 혈관신생에 대한 중요한 신호이며, 실제로, 길항제 Ang2 항체는 망막병증 환자 치료를 위해 고려되어 왔다(Gadkar 외, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015년 8월; 56(9):5390-400). 항-VEGF 항체 또는 항-Ang2 항체는 본 발명의 분자와 함께 순차적으로 투여되거나 동시에 투여될 수 있다. VEGF 길항제는 베바시주맙, 라니비주맙, 애플리버셉트, 라무시루맙, 및 타니비루맙을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않고, Ang2 길항제는 네스바쿠맙, AMG780, 및 MEDI3617을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.

추가의 구현예에서, 길항제 및/또는 작용제 분자는 조직 표적화 모이어티, 예를 들어, 망막 조직 특이적 수용체 또는 세포 표면 분자를 인식하는 항체 또는 이의 단편을 또한 포함할 수 있다.

치료제(예를 들어, WNT 길항제/작용제)는 질환 또는 부상의 발병 전, 발병 중 또는 발병 후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 바람직하지 않은 임상 증상을 안정화시키거나 감소시키는, 진행 중인 질환의 치료는 특히 관심 대상이다. 이러한 치료는 바람직하게는 영향을 받은 조직에서의 기능의 완전한 상실 전에 수행된다. 대상체 요법은 바람직하게는 질환의 증상성 단계 동안 투여될 것이고, 일부 경우에는 질환의 증상성 단계 후에 투여될 것이다. 일부 구현예에서, 대상 방법은 예를 들어, 장애의 발병을 예방하고, 장애의 진행을 중단시키고, 장애의 진행을 역전시키는 등의 치료적 이점을 초래한다. 일부 구현예에서, 대상 방법은 치료적 이점이 달성되었음을 검출하는 단계를 포함한다. 당업자는, 이러한 치료 효능 측정이 변형되는 특정 질환에 적용될 것임을 이해할 것이고, 치료 효능을 측정하기 위해 사용되는 적절한 검출 방법을 인식할 것이다.

전술한 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 해외 특허, 해외 특허 출원, 및 본 명세서 및/또는 출원 데이터 시트에 열거된 비특허 공개물은 모두 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다.

전술한 내용으로부터, 본 개시의 특정 구현예가 예시의 목적으로 본원에 설명되었지만, 본 개시의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 개시는 첨부된 청구범위에 의한 바를 제외하고는 한정되지 않는다.

본 발명의 넓은 범위는 다음의 실시예를 참조하여 가장 잘 이해되며, 이는 본 발명을 특정 구현예로 제한하도록 의도되지 않는다.

실시예 1

I. 일반 방법

분자 생물학의 표준 방법이 기술된다. Maniatis 외, (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Sambrook 및 Russell (2001) Molecular Cloning, 제3판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, Calif. 표준 방법은 또한, Ausbel 외, (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, N.Y.(박테리아 세포에서의 클로닝 및 DNA 돌연변이 유발(Vol. 1), 포유류 세포 및 효소에서의 클로닝(Vol. 2), 당접합체 및 단백질 발현(Vol. 3), 및 생물정보학(Vol. 4)를 기술함)에 기술되어 있다.

면역침전, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리, 및 결정화를 포함하는 단백질 정제 방법이 기술된다. Coligan 외, (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York. 화학적 분석, 화학적 변형, 번역 후 변형, 융합 단백질의 생산, 단백질의 당질화가 기술된다. 예를 들어, Coligan 외, (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel 외, (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3 John Wiley and Sons, Inc., NY, N.Y., pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, Mo.; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391 참조. 다클론 및 단클론 항체의 생산, 정제 및 단편화가 기술된다. Coligan 외, (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow 및 Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Harlow 및 Lane(상기 참조). 리간드/수용체 상호작용을 특성화하기 위한 표준 기술이 이용 가능하다. 예를 들어, Coligan 외, (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York 참조.

형광 활성화된 세포 분류 검출 시스템(FACS®)을 포함하는 유세포 계측법이 이용 가능하다. 예를 들어, Owens 외, (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.; Givan (2001) Flow Cytometry, 제2판; Wiley-Liss, Hoboken, N.J.; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J. 참조. 예를 들어, 진단 시약으로서 사용하기 위한 핵산 프라이머 및 프로브, 폴리펩티드, 및 항체를 포함하는 핵산을 변형시키기에 적합한 형광 시약이 이용 가능하다. Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, Mo.

면역 체계의 표준 조직학 방법이 기술된다. 예를 들어, Muller-Harmelink(편) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, N.Y.; Hiatt 외, (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, 및 Wilkins, Phila, Pa.; Louis 외, (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, N.Y. 참조.

예를 들어, 항원 단편, 리더 서열, 단백질 접힘, 기능적 도메인, 당질화 부위, 및 서열 정렬을 결정하기 위한 소프트웨어 패키지 및 데이터베이스가 이용 가능하다. 예를 들어, GenBank, Vector NTI® Suite(Informax, Inc, Bethesda, Md.); GCG Wisconsin Package(Accelrys, Inc., San Diego, Calif.); DeCypher®(TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nev.); Menne 외, (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne 외, (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren 외, (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690 참조.

II. FZD4 WNT 대리체

PCT 공개 번호 제WO2019126398호에 기술된 바와 같이 단일특이적 FZD4 WNT 대리체(3SD10-3, 3SD10-26, 3SD10-36, 4SD1-3, 4SD1-26, 및 4SD1-36)을 작제하였다. 도 1a는 사용된 WNT 대리 분자의 구조의 도식적 표현을 나타내고, 도 1b는 WNT 대리체에 존재하는 Fzd 결합 도메인 및 LRP 결합 도메인 및 표시된 WNT 대리체에 존재하는 서열을 제공하는 표이다. FZD4 수용체에 대한 특이성을 후술되는 바와 같이 시험하였다.

이전에 보고된 바와 같이, WNT-반응성 프로모터(293STF)에 의해 조절되는 루시페라아제 유전자를 함유하는 HEK293 세포주(293STF)를 사용하여 WNT 신호 전달 활성을 측정하였다(예를 들어, Janda 외, Nature 545:234-237(2017) 참조). 간략하게, 293STF 세포를 치료 24시간 전에 웰 당 10,000의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩한 다음, 20 nM의 Rspo와 함께 3SD10-3, 3SD10-26, 4SD1-3, 또는 4SD1-26으로 치료하였다. 세포를 루시퍼라제 세포 배양 용해 시약(Promega)으로 용해시키고, 벤더가 제안한 절차를 사용하여 루시퍼라제 분석 시스템(Promega)으로 활성을 측정하였다. 데이터를 3회 반복의 평균 -/+ 표준 편차로서 도표화하고, Prism(GraphPad 소프트웨어)을 사용하여 비선형 회귀로 피팅하였다. FZD4의 과발현에 대해, 세포를 CMV 프로모터(GenScript로부터의 OHu21807) 하에 인간 FZD4 유전자를 함유하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시킨 다음, STF 분석을 위해 형질감염 후 24시간 차에 96-웰 플레이트 내로 분할하였다. 도 2a 내지 2d는 형질감염되지 않은 293STF 세포에서는 WNT 신호 전달 활성이 나타나지 않는다는 것을 보여준다. 대조적으로, FZD4 수용체로 일시적으로 형질감염된 세포는 WNT 신호 전달을 나타냈다(도 2e 내지 2h).

모 또는 FZD4 과발현된 293STF 세포로부터의 RNA를 Qiagen RNeasy 마이크로 키트(Qiagen, 74004)를 사용하여 추출하였다. cDNA를 SuperScript^TM VILO^TM cDNA 합성 키트(ThermoFisher, 11754050)를 사용하여 생산하였다. 인간 FZD4 발현을 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(ThermoFisher, 4444963) 및 Hs00201853_m1 FZD4 프로브(ThermoFisher, 4331182)를 사용하여 측정하였다. Hs01060665_m1 프로브(ThermoFisher, 4331182)를 사용하여 구성적 ACTIN B 유전자의 발현에 대한 값을 정규화하였다. 도 3은 FZD4를 과발현하는 FZD4의 일시적으로 형질감염된 세포의 유전자 발현 레벨을 도시한다.

III. 추가 세포주에서의 WNT 활성

WNT 신호 전달 활성은 bEnd.3(혈관 연구에 사용된 마우스 뇌 내피 세포주) 또는 WNT-반응성 프로모터에 의해 조절되는 루시페라아제 유전자를 함유하는 HRMEC(일차 인간 망막 미세혈관 내피 세포) 세포를 사용하여 측정하였다. 세포를 최소 프로모터 및 7개 LEF/TCF 결합 부위의 연쇄체의 조절 하에 반딧불 루시퍼라아제 리포터를 암호화하는 STF 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 치료 24시간 전에 웰 당 10,000의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩한 다음, 3SD10-3, 3SD10-26, 4SD1-3, 4SD1-26, 또는 WNT3a로 치료하였다. 세포를 루시퍼라제 세포 배양 용해 시약(Promega)으로 용해시키고, 벤더가 제안한 절차를 사용하여 루시퍼라제 분석 시스템(Promega)으로 활성을 측정하였다. 데이터를 3회 반복의 평균 -/+ 표준 편차로서 도표화하고, Prism(GraphPad 소프트웨어)을 사용하여 비선형 회귀로 피팅하였다. 도 4a 내지 4h는 monoFZD4 WNT 대리체로 치료된 bEnd.3 세포에서의 증가된 WNT 신호 전달 활성 및 Axin2 발현을 나타낸다. 도 4i 내지 4p는 HRMEC 세포에서의 유사한 WNT 신호 전달 및 Axin2 발현 증가를 나타낸다.

bEnd.3 및 HRMEC 세포로부터의 RNA를 Qiagen RNeasy 마이크로 키트(Qiagen, 74004)를 사용하여 추출하였다. cDNA를 SuperScript^TM VILO^TM cDNA 합성 키트(ThermoFisher, 11754050)를 사용하여 생산하였다. HMEC에서의 표시된 인간 유전자 발현은 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(ThermoFisher, 4444963) 및 Hs00268943_s1 FZD1, Hs00361432_s1 FZD2, Hs00184043_m1 FZD3, Hs00201853_m1 FZD4, Hs00258278_s1 FZD5, Hs00171574_m1 FZD6, Hs00275833_s1 FZD7, Hs00259040_s1 FZD8, Hs00268954_s1 FZD9, Hs00273077_s1 FZD10, Hs00182031_m1 LRP5, Hs00233945_m1 LRP6, Hs00610344_m1 AXIN2 프로브(ThermoFisher, 4331182)를 사용하여 측정하였다. Hs01060665_m1 프로브(ThermoFisher, 4331182)를 사용하여 구성적 ACTIN B 유전자의 발현에 대한 값을 정규화하였다. bEnd.3 세포에서의 표시된 마우스 유전자 발현은 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(ThermoFisher, 4444963) 및 Mm00445405_s1 Fzd1, Mm02524776_s1 Fzd2, Mm00445423_m1 Fzd3, Mm00433382_m1 Fzd4, Mm00445623_s1 Fzd5, Mm00433387_m1 Fzd6, Mm00433409_s1 Fzd7, Mm01234717_s1 Fzd8, Mm01206511_s1 Fzd9, Mm00558396_s1 Fzd10, Mm01227476_m1 Lrp5, Mm00999795_m1 Lrp6, Mm00443610_m1 Axin2 프로브(ThermoFisher, 4331182)를 사용하여 측정하였다. Mm02619580_g1 프로브(ThermoFisher, 4331182)를 사용하여 구성적 Actin B 유전자의 발현에 대한 값을 정규화하였다. Axin2 발현에 대한 데이터를 3회 반복의 평균 -/+ 표준 편차로서 도표화하고, Prism(GraphPad 소프트웨어)을 사용하여 비선형 회귀로 피팅하였다. 도 5a 및 도 5b는 각각 bEnd.3 세포 및 HRMEC에서의 WNT 수용체의 발현을 나타낸다.

IV. FZD4 WNT 대리체 활성에 대한 RSPO의 효과

WNT 신호 전달 활성은 WNT-반응성 프로모터에 의해 조절되는 루시페라아제 유전자를 함유하는 bEnd.3 또는 HRMEC 세포를 사용하여 측정하였다. 세포를 최소 프로모터 및 7개 LEF/TCF 결합 부위의 연쇄체의 조절 하에 반딧불 루시퍼라아제 리포터를 암호화하는 STF 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 치료 24시간 전에 웰 당 10,000의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩한 다음, 20 nM의 Rspo와 함께 또는 없이 R2M3-3, R2M3-26, 3SD10-3, 3SD10-26, 4SD1-3, 4SD1-26(예를 들어, WO2019126398 참조)으로 치료하였다. 세포를 루시퍼라제 세포 배양 용해 시약(Promega)으로 용해시키고, 벤더가 제안한 절차를 사용하여 루시퍼라제 분석 시스템(Promega)으로 활성을 측정하였다. 데이터를 3회 반복의 평균 -/+ 표준 편차로서 도표화하고, Prism(GraphPad 소프트웨어)을 사용하여 비선형 회귀로 피팅하였다. 도 6a 내지 6f는 두 가지 유형의 내피 세포 모두에서 상이한 FZD4 WNT 대리체를 갖는 RSPO의 첨가가 WNT 신호 전달 활성에 유의한 영향을 거의 미치지 않았음을 나타낸다.

V. 산소-유도 망막병증

출생 후 8시간 이내에, 스프래그-다울리 랫트 새끼 및 그 어미를 산소 노출 챔버로 옮기고, 24시간 간격의 50% 및 10% 산소의 교대로 14일 동안 노출시켰다(즉, P1 내지 P14). 출생 후 14일차, 또는 P14(0)에, 산소에 노출된 랫트를 실내 공기로 복귀시켰다. 이들은 추가로 6일 동안 실내 공기, P14(1) 내지 P14(6)에 노출시켰다. 대조군의 역할로서, 연령이 일치하는 랫트 새끼 또한 실내 공기(RA)에서 유지시켰다. 3개의 아암에서 랫트의 각 눈은 P7에서 3 ug 항-EGFP Ab, 0.3 ug 4SD1-03, 또는 3 ug 4SD1-03의 유리체내 주사를 받은 반면, 다른 아암의 눈은 P14(0)에서 항-VEGF 치료의 유리체내 주사를 받았다(예를 들어, 도 7a 및 7b에 도시된 연구 설계 참조).

치료 후, 모든 랫트를 P14(6)에서 희생시키고, 이때, 고해상도 디지털 이미지의 컴퓨터 보조 이미지 분석을 사용하여, 이솔렉틴-B4-염색 망막 편평도에서 정상적인 망막 내 혈관 성장 및 병적 망막-전 혈관신생(NV) 둘 모두를 평가하였다. TA: 총 면적. 도 8a 및 8b는 0.3 μg의 4SD1-3이 항-VEGF 치료와 유사한 정도로 신생혈관 다발 형성을 억제함을 나타낸다. 이는 이 망막병증 모델에서 FZD4 WNT 대리체 치료가 항-VEGF 치료와 유사한 효과를 갖는다는 것을 입증한다.

전술한 다양한 구현예는 추가 구현예를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 해외 특허, 해외 특허 출원, 및 본 명세서 및/또는 출원 데이터 시트에 열거된 비특허 공개물은 모두 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다. 구현예의 양태는, 필요한 경우, 추가의 구현예를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 공개의 개념을 사용하기 위해 수정될 수 있다. 이들 및 다른 변경은 전술한 상세한 설명에 비추어 실시예들에 대해 이루어질 수 있다.

일반적으로, 다음의 청구범위에서, 사용된 용어는 청구범위를 본 명세서 및 청구범위에 개시된 특정 구현예로 한정하는 것으로 해석되어서는 안되지만, 이러한 청구범위가 부여된 균등물의 전체 범위와 함께 모든 가능한 구현예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시에 의해 제한되지 않는다.

SEQUENCE LISTING <110> Surrozen, Inc. Li, Yang Tu, Shengjiang Lee, Sungjin Yeh, Wen-Chen <120> MODULATION OF WNT SIGNALLING IN OCULAR DISORDERS <130> SRZN-013/01WO <150> US 62/803,835 <151> 2019-02-11 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 358 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in lab - synthesized WNT agonist <400> 1 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 20 25 30 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ser Ser Ala 35 40 45 Asn Ile Asn Ser Ile Glu Thr Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly 50 55 60 Lys Gln Arg Glu Leu Ile Ala Asn Met Arg Gly Gly Gly Tyr Met Lys 65 70 75 80 Tyr Ala Gly Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Thr Glu Ser Ala 85 90 95 Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Val Lys Leu Arg Asp Asp Asp Tyr Val Tyr 115 120 125 Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser 130 135 140 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 145 150 155 160 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 165 170 175 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 180 185 190 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Leu Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 195 200 205 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 210 215 220 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Thr Pro Trp 225 230 235 240 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 245 250 255 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 260 265 270 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 275 280 285 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 290 295 300 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 305 310 315 320 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 325 330 335 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 340 345 350 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 355 <210> 2 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in lab - 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synthesized WNT agonist <400> 3 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 20 25 30 Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Gly Ser Gly 35 40 45 Arg Ile Phe Ala Ile Tyr Asp Ile Ala Trp Tyr Arg His Pro Pro Gly 50 55 60 Asn Gln Arg Glu Leu Val Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile 65 70 75 80 Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn 85 90 95 Ala Met Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp 100 105 110 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp 115 120 125 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 145 150 155 160 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser 165 170 175 Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 180 185 190 Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Leu Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe 195 200 205 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 210 215 220 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Thr 225 230 235 240 Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val 245 250 255 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 260 265 270 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 275 280 285 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 290 295 300 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 305 310 315 320 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 325 330 335 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 340 345 350 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 355 360 <210> 4 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in lab - 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synthesized WNT agonist <400> 5 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 20 25 30 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ser Ser Ala 35 40 45 Asn Ile Asn Ser Ile Glu Thr Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly 50 55 60 Lys Gln Arg Glu Leu Ile Ala Asn Met Arg Gly Gly Gly Tyr Met Lys 65 70 75 80 Tyr Ala Gly Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Thr Glu Ser Ala 85 90 95 Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Val Lys Leu Arg Asp Asp Asp Tyr Val Tyr 115 120 125 Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser 130 135 140 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 145 150 155 160 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 165 170 175 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 180 185 190 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 195 200 205 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 210 215 220 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 225 230 235 240 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 245 250 255 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 260 265 270 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 275 280 285 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 290 295 300 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 305 310 315 320 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 325 330 335 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 340 345 350 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 355 <210> 6 <211> 472 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in lab - 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synthesized WNT agonist <400> 7 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 20 25 30 Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Gly Ser Gly 35 40 45 Arg Ile Phe Ala Ile Tyr Asp Ile Ala Trp Tyr Arg His Pro Pro Gly 50 55 60 Asn Gln Arg Glu Leu Val Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile 65 70 75 80 Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn 85 90 95 Ala Met Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp 100 105 110 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp 115 120 125 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 145 150 155 160 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser 165 170 175 Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 180 185 190 Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 195 200 205 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 210 215 220 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr 225 230 235 240 Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val 245 250 255 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 260 265 270 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 275 280 285 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 290 295 300 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 305 310 315 320 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 325 330 335 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 340 345 350 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 355 360 <210> 8 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in lab - synthesized WNT agonist <400> 8 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly 20 25 30 Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 35 40 45 Arg Ile Phe Ser Ile Tyr Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly 50 55 60 Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Gly Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ser 65 70 75 80 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala 85 90 95 Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Ser Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 115 120 125 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 145 150 155 160 Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu 180 185 190 Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 210 215 220 Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr 225 230 235 240 Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 245 250 255 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 260 265 270 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 275 280 285 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 290 295 300 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 305 310 315 320 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 325 330 335 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 340 345 350

Claims

대상체에서 망막병증을 치료하는 방법으로서, 조작된 WNT 신호 전달 조절제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 WNT 신호 전달 조절제는 조작된 WNT 작용제 또는 조작된 WNT 길항제인, 방법.
제2항에 있어서, 상기 조작된 WNT 작용제 및 조작된 WNT 길항제는 하나 이상의 Fzd 수용체에 결합하는 결합 조성물 및 하나 이상의 LRP 수용체 또는 Tspan12 수용체에 결합하는 결합 조성물을 포함하는, 방법.
제3항에 있어서, 상기 조작된 WNT 작용제의 결합 조성물은 Fzd4 결합 조성물, Lrp5 결합 조성물, Lrp6 결합 조성물, LRP5/6 결합 조성물, 및 Tspan12 결합 조성물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항에 있어서, 조작된 WNT 작용제 및 조작된 WNT 길항제를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조작된 WNT 작용제 및 조작된 WNT 길항제는 상기 망막병증의 초기 및/또는 후기 단계에서 독립적으로 투여되는, 방법.
제1항에 있어서, 조작된 WNT 작용제 및 조작된 WNT 길항제를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조작된 WNT 작용제 및 상기 조작된 WNT 길항제는 상기 망막병증의 초기 및/또는 후기 단계에서 순차적으로 투여되는, 방법.
제1항에 있어서, 조작된 WNT 작용제 및 조작된 WNT 길항제를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조작된 WNT 작용제 및 상기 조작된 WNT 길항제는 상기 망막병증의 초기 및/또는 후기 단계에서 공동 투여되는, 방법.
제6항에 있어서, 상기 WNT 작용제는 상기 WNT 길항제의 투여 전 또는 후에 투여되는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 WNT 작용제 및 조작된 WNT 길항제를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 WNT 작용제 및/또는 상기 WNT 길항제는 VEGF 및/또는 Ang2에 특이적인 결합 조성물과 함께 투여되는, 방법.
제9항에 있어서, 상기 VEGF 또는 Ang2에 특이적인 결합 조성물은 VEGF 또는 Ang2 활성의 길항제인, 방법.
제10항에 있어서, 상기 VEGF 길항제는 베바시주맙, 라니비주맙, 애플리버셉트, 라무시루맙, 및 타니비루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제10항에 있어서, 상기 Ang2 길항제는 네스바쿠맙, AMG780, 및 MEDI3617로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 망막병증은 망막 혈관 질환인, 방법.
제13항에 있어서, 상기 망막 혈관 질환은 혈관 발달의 억제에 의해 야기되는, 방법.
제13항에 있어서, 상기 망막병증은 과도한 혈관신생에 의해 야기되는, 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 망막 혈관 질환은 가족성 삼출성 유리체망막병증(FEVR), 삼출성 유리체망막병증, 노리병, 당뇨병성 망막병증(DR), 노화 관련 황반 변성(AMD), 미숙아 망막병증(ROP), 골다공증-후신경교종 증후군(OPPG), 망막 정맥 폐색, 및 코트병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.