CN113544150A

CN113544150A - 眼部病症中wnt信号传导的调节

Info

Publication number: CN113544150A
Application number: CN202080018270.9A
Authority: CN
Inventors: 李阳; 涂圣江; 李圣真; 叶文琛
Original assignee: Surrozen Inc
Current assignee: Surrozen Inc
Priority date: 2019-02-11
Filing date: 2020-02-11
Publication date: 2021-10-22
Also published as: AU2020221797A1; US20220112278A1; EP3924381A1; WO2020167848A1; JP2022520084A; CA3129155A1; JP2024109749A; KR20210128434A; EP3924381A4

Abstract

本发明提供了用WNT信号传导路径的调节剂治疗眼部病症的方法。眼部病症特别是视网膜病变。本发明还提供了给药方法和药物组合物。

Description

眼部病症中WNT信号传导的调节

相关申请交叉引用

本申请要求2019年2月11日提交的美国临时申请第62/803,835号的优先权，所述临时申请以全文引用的方式并入本文中。

关于序列表的陈述

以文本格式代替纸本拷贝提供与本申请案相关的序列表，且在此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是：SRZN_013_01WO_ST25.txt。文本文件约为27KB，创建于2020年2月10日，正通过EFS-Web以电子方式提交。

技术领域

本发明提供了用于治疗各种眼部病症的WNT信号调节剂。特别地，提供了眼部血管疾病，也称为视网膜病变的治疗。

背景技术

椎体视网膜是眼睛背部的神经组织薄层。其负责检测视觉刺激且为视觉信息处理的第一站。为了实现其正常功能，视网膜血管系统是不可缺少的营养素和氧气来源。视网膜在代谢上高度活跃。由于光感受器消耗大量的氧气，所以一克视网膜的耗氧率比体内任何其它器官都要高。为了充当有效的营养素和氧气，视网膜血管系统在视网膜中定位为定型架构，所述定型架构由一侧上的三个平面血管丛和另一侧上的脉络膜毛细血管组成。内部血管形成最初始于视网膜的玻璃体表面上，从而产生初级血管丛。在血管丛的表面径向扩张之后，血管向视网膜中垂直渗透，在内丛状层(IPL)和外丛状层(OPL)形成两个另外的视网膜内毛细血管丛。由于血管和视网膜之间的功能和结构关系，异常血管发育或血管损伤与视网膜的功能直接相关，这引起各种类型的视网膜病变和变性。

WNT信号传导被认为是视网膜中血管发育的重要路径。来自人和啮齿类动物的研究的遗传证据日益增加，进一步支持WNT信号传导在视网膜血管系统中的重要性(Wang等人，2018，《视网膜与眼科研究进展(Prog Retin Eye Res.)》2018年12月1日pii:S1350-9462(18)30046-6)。编码WNT信号传导中涉及的受体(Fzd4、Lrp5、Tspan12)或配体(norrin)的基因中的人突变导致多种遗传性的玻璃体视网膜病变。基因(Fzd4、Lrp5、Tspan12、norrin)的个别遗传突变小鼠也已显示了在人视网膜病变中观察到的异常血管结构的典型表型。这不仅允许更好地理解视网膜病变疾病进展，而且还开启了通过WNT信号调节来治疗视网膜病变的可能性。

视网膜病变，特别是糖尿病性视网膜病变，可以分为早期和晚期。在早期，也称为非增生性视网膜病变，视网膜的小血管可能轻微恶化，部分血管可能肿胀并将流体泄漏到周围视网膜组织中。晚期视网膜病变涉及视网膜区域中的显著新生血管形成以及微动脉瘤和出血(参见例如根据立体彩色眼底照片的糖尿病性视网膜病变分级—修改后的AirlieHouse分类的扩展(1991)《眼科(Ophthalmology)》，98(5)，786-806)。

家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)是具有不良眼内血管结构形成的遗传眼病。超过50％的FEVR患者在编码Fzd4、Lrp5、Tspan12或norrin的基因之一中显示出突变。norrin是WNT信号配体，通过由Fzd4/Lrp5/Tspan12构成的受体复合物将信号传输到内皮细胞，用于眼中的正常视网膜血管形成。然而，在FEFR患者中，编码norrin、Fzd4、Lrp5或/和Tspan12之一的基因中的突变导致视网膜中的血管发育不成熟。由此形成的无血管区域将会产生视网膜缺血性区域，这是对视网膜的主要损伤。缺血性病状诱导产生血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素2(Ang2)，导致新生血管形成和血管簇形成。所形成的新产生的异常血管可以容易地破裂，导致由于渗出和出血而出现的视网膜的继发性损伤。糖尿病性视网膜病变(DR)的疾病进展也类似于FEVR或其它遗传性血管畸形或功能不全疾病的疾病进展。高血糖诱导视网膜血管损伤，导致血管阻塞、缺血、新生血管形成和出血，最终导致视网膜病变。

虽然遗传数据已表明WNT信号传导在建立眼中的适当血管结构中的重要性，但发育后WNT信号传导的激活是否会导致血管结构的改善尚不清楚。某些报告甚至表明，拮抗而不是激动WNT信号传导对于视网膜病变有益。因此，了解视网膜病变疾病进展和WNT信号的参与扩展到新治疗的可能性。为了正确治疗视网膜病变，需要根据疾病阶段来控制WNT激动剂和拮抗剂信号传导。本发明提供在视网膜病变疾病发展的不同阶段控制WNT信号传导激动和拮抗的方法。

发明内容

本发明部分地基于使用WNT信号传导激动剂和拮抗剂来调节视网膜病变适应症中的异常血管形成。

本发明提供了一种治疗患有视网膜病变的个体的方法，其包括向所述个体施用经工程化的WNT信号传导调节剂。在某些实施例中，WNT信号传导调节剂是经工程化的WNT激动剂或经工程化的WNT拮抗剂。在另外的实施例中，所述经工程化的WNT激动剂和WNT拮抗剂包含结合到一种或多种Fzd受体的结合组合物和结合到一种或多种LRP受体或Tspan12受体的结合组合物。在另外的实施例中，所述经工程化的WNT激动剂的结合组合物选自由以下组成的群组：Fzd4结合组合物、Lrp5结合组合物、Lrp6结合组合物、LRP5/6结合组合物和Tspan12结合组合物。

在一些实施例中，经工程化的WNT激动剂或WNT拮抗剂在视网膜病变的早期和/或晚期独立地施用。在替代实施例中，WNT激动剂和WNT拮抗剂在视网膜病变的早期和/或晚期依次施用，或WNT激动剂和WNT拮抗剂在视网膜病变的早期和/或晚期共同施用。在另外的实施例中，所述WNT激动剂在所述WNT拮抗剂之前或之后施用。

在一些实施例中，WNT促效剂和/或WNT拮抗剂与对VEGF和/或Ang2具有特异性的结合组合物一起施用。在某些实施例中，所述对VEGF或Ang2具有特异性的结合组合物是VEGF或Ang2活性的拮抗剂。在另外实施例中，VEGF拮抗剂选自：贝伐单抗、雷尼单抗、阿柏西普、雷莫芦单抗和塔尼比单抗。在其它实施例中，Ang2拮抗剂选自由以下组成的群组：奈斯伐单抗、AMG780和MEDI3617。

在某些实施例中，视网膜病变是视网膜血管疾病。在一些实施例中，视网膜血管疾病由血管发育抑制引起。在替代实施例中，视网膜血管疾病由过度血管生成引起。在特定实施例中，所述视网膜血管疾病选自由以下组成的组：熟悉的渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、渗出性玻璃体视网膜病变、诺里(Norrie)病、糖尿病性视网膜病变(DR)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、早产儿视网膜病变(ROP)、骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征(OPPG)、视网膜静脉阻塞和Coats病。

附图说明

图1A和1B提供了对所使用的WNT替代分子的描述。图1A显示了WNT替代分子的图形表示，并且图1B提供了WNT替代分子的各个组分的克隆名称和序列标识符。

图2A-2H是显示在用所示WNT替代分子和RSPO处理的细胞中通过SuperTop Flash(STF)测定测量的WNT信号传导活性的图。图2A-2D显示了在用各种mono-FZD4 WNT替代物和20nM RSPO处理的未转染的HEK293细胞中极少到无WNT信号传导活性。相比之下，图2E-2H显示了当用各种FZD4 WNT替代物和20nM RSPO处理时，用人FZD4基因转染的HEK293细胞具有WNT信号传导活性。

图3显示了FZD4过度表达的HEK293细胞的半定量PCR分析。

图4A-4P显示了含有由WNT反应性启动子控制的荧光素酶基因的bEnd.3细胞(血管研究中使用的小鼠脑部内皮细胞株)中WNT信号传导活性(图4A-4D)和Axin2表达(图4E-4H)；或含有由WNT反应性启动子控制的荧光素酶基因的HRMEC(原发性人视网膜微血管内皮细胞)中的WNT信号传导活性(图4I-4L)和Axin2表达(图4M-4P)。

图5A-5B显示了bEnd.3细胞(图5A)和HRMEC(图5B)中各种WNT受体基因表达的半定量PCR分析。

图6A-6F显示了在添加或不添加RSPO的情况下用各种FZD4 WNT替代物处理对bEnd.3细胞(图6A-6C)或对HRMEC细胞(图6D-6F)中的WNT信号传导活性的作用。

图7A-7B显示了在氧诱导的视网膜病变模型的大鼠模型中使用各种FZD4 WNT替代分子的实验设计。图7A显示了氧诱导的视网膜病变模型的时间表；并且图7B提供了关于研究组的细节。

图8A-8B显示了在用抗VEGF或FZD4 WNT替代分子处理后的视网膜血管生长和病理性的视网膜前新生血管形成。图8A显示了大鼠视网膜平铺片的荧光染色。图8B显示了通过计算机辅助图像分析对血管生长和新生血管形成进行的定量分析。

具体实施方式

如本文所用的，包含所附权利要求书在内，词语的单数形式如“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包含对应的其复数指代物，除非上下文中清楚地另有指明。

本文引用的所有参考文献均通过引用并入，达到如同明确地且单独地指示每个单独的出版物、专利申请或专利通过引用并入的相同程度。

I.定义.

分子的“活性”可以描述或指代分子与配体或受体的结合、催化活性、刺激基因表达的能力、抗原活性、对其它分子的活性的调节等。分子的“活性”还可以指调节或维持细胞间相互作用的活性(例如粘附)或保持细胞结构(例如细胞膜或细胞骨架)的活性。“活性”还可以指比活性，例如[催化活性]/[mg蛋白质]或[免疫活性]/[mg蛋白质]等。

如本文所用，术语“施用”或“引入”或“提供”是指将组合物递送到个体的一个细胞、多个细胞、组织和/或器官或递送到个体。此类施用或引入可以在体内、体外或离体发生。

如本文所用，术语“抗体”意指包含特异性结合抗原表位的必要可变区序列的分离的或重组的结合剂。因此，抗体是呈现所需生物学活性，例如结合特异性靶抗原的任何形式的抗体或其片段。因此，它在最广泛的意义上使用，并且确切地说涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、纳米抗体、双功能抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，包括(但不限于)scFv、Fab和Fab2，只要它们展现所需的生物活性即可。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；双功能抗体；线性抗体(例如Zapata等人,《蛋白质工程(Protein Eng.)》8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子(例如scFv)；及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点；以及残余“Fc”片段，命名反映了其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，所述片段具有两个抗原组合位点并且仍然能够交联抗原。

术语“抗原”是指能够由选择性结合剂例如抗体结合的分子或分子的一部分，以及另外能够用于动物中以产生能够与该抗原的表位结合的抗体的分子或分子的一部分。在某些实施例中，当结合剂(例如，WNT替代分子或其结合区或WNT拮抗剂)在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，所述结合剂被认为特异性结合抗原。

如本文所用，术语“抗原结合片段”是指含有免疫球蛋白重链和/或轻链、或VHH/sdAb(单结构域抗体)或

(Nab)的至少一个CDR的多肽片段，其结合至所关注的抗原，特别是结合至一种或多种Fzd受体、或结合至LRP5和/或LRP6。在这方面，本文所述的抗体的抗原结合片段可以包含来自结合一种或多种Fzd受体或LRP5和/或LRP6的抗体的VH和VL的1、2、3、4、5或所有6个CDR。

如本文所用，术语“生物活性”和“生物学活性”是指归于细胞中的特定生物元件的活性。举例而言，WNT激动剂或其片段或变体的“生物活性”是指模仿或增强WNT信号的能力。作为另一实例，多肽或其功能片段或变体的生物活性是指多肽或其功能片段或其变体执行其天然功能，例如结合、酶活性等的能力。作为第三实例，基因调节元件，例如启动子、增强子、Kozak序列等的生物活性是指调节元件或其功能片段或变体调节，即分别促进、增强或激活其可操作地连接的基因的表达的能力。

如本文所用，术语“双功能抗体”是指包含对一个抗原位点具有特异性的第一臂和对不同抗原位点具有特异性的第二臂的抗体，即双功能抗体具有双特异性。

“双特异性抗体”在本文中用于指通过四源杂交瘤技术(参见Milstein等人,《自然(Nature)》,305(5934):537-540(1983))，通过化学结合两种不同单克隆抗体(参见Staerz等人,《自然》,314(6012):628-631(1985))，或通过旋钮入孔(knob-into-hole)或类似方法产生的全长抗体，所述方法在Fc区中引入突变(参见Holliger等人，《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，90(14)：6444-6448(1993))，产生多种不同的免疫球蛋白物质，其中仅一种为功能双特异性抗体。双特异性抗体在其两个结合臂中的一个(一对HC/LC)上结合一个抗原(或表位)，并且在其第二臂(另一对HC/LC)上结合不同的抗原(或表位)。根据该定义，双特异性抗体具有两个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列两者中)，并且对于它与之结合的每种抗原是一价的。

“包含”意指在例如组合物、方法、试剂盒等中需要所述元件，但可包括其它元件以在权利要求书的范畴内形成例如组合物、方法、试剂盒等。举例而言，“包含”编码可操作地连接到启动子的治疗性多肽的基因的表达卡匣为如下表达卡匣，其除基因和启动子外还可包括其它元件，例如聚腺苷酸化序列、增强子元件、其它基因、连接子结构域等。

“基本上由……组成”意指将例如所描述的组合物、方法、试剂盒等的范围限制于并不实质上影响例如组合物、方法、试剂盒等的基本和新颖特征的指定材料或步骤。举例而言，“基本上由”编码可操作地连接到启动子和聚腺苷酸化序列的治疗性多肽的基因“组成”的表达卡匣可包括额外序列，例如连接子序列，只要其并不实质上影响基因的转录或翻译即可。作为另一实例，“基本上由所述序列组成的”变异或突变多肽片段具有所述序列的氨基酸序列加上或减去基于其衍生的全长天然多肽的序列的边界处的约10个氨基酸残基，例如比所述边界氨基酸残基少10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个残基，或比所述边界胺基酸残基多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基。

“由……组成”意指排除权利要求书中未指定的任何元件、步骤或成分的组合物、方法或试剂盒。举例而言，“由所述序列组成”的多肽或多肽结构域仅含有所述序列。

“控制元件”或“控制序列”是指参与分子相互作用的核苷酸序列，所述核苷酸序列有助于多核苷酸的功能调节，包含多核苷酸的复制、重复、转录、剪接、翻译或降解。所述调节可能影响过程的频率、速度或特异性，并且可能本质上是增强或抑制的。所属领域中已知的控制元件包括例如转录调节序列，如启动子和强化子。启动子是能够在某些条件下与RNA聚合酶结合并且启动通常位于启动子下游(3'方向)的编码区转录的DNA区。

“表达载体”是一种载体，例如本文讨论的或所属领域已知的质粒、小环、病毒载体、脂质体等，其包含编码所关注的基因产物的区域，并且用于实现基因产物在预期靶细胞中的表达。表达载体还包含与编码区可操作地连接的控制元件，例如启动子、增强子、UTR、miRNA靶向序列等，以促进基因产物在靶标中的表达。控制元件和其可操作地连接以进行表达的一个基因或多个基因的组合有时被称为“表达盒”，其中许多是所属领域已知的并可获得的，或者可以容易地由在所属领域可获得的组件建构。

如本文所用，术语“FR组”是指构成重链或轻链V区的CDR组的CDR的四个侧翼氨基酸序列。一些FR残基可以接触结合的抗原；然而，FR主要负责将V区折叠到抗原结合位点中，特别是直接邻近CDR的FR残基。在FR内，某些氨基残基和某些结构特征是极其高度保守的。在这方面，所有V区序列含有约90个氨基酸残基的内部二硫环。当V区折叠到结合位点中时，CDR显示为突出环基序，形成抗原结合表面。一般认为，FR存在保守的结构区，其影响CDR环的形状折叠成某些“规范”结构，而与精确的CDR氨基酸序列无关。此外，已知某些FR残基参与稳定抗体重链与轻链相互作用的非共价结构域间接触。

术语“个体”，“宿主”，“个体”和“患者”在本文中可互换使用，并且指哺乳动物，包含(但不限于)人类和非人灵长类动物，包含猿猴和人类；哺乳动物运动动物(如马)；哺乳动物农场动物(如绵羊，山羊等)；哺乳动物宠物(狗，猫等)；和啮齿动物(例如，小鼠，大鼠等)。

“单克隆抗体"是指均质抗体群体，其中单克隆抗体由与表位的选择性结合有关的氨基酸(天然存在和非天然存在)构成。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个表位。术语“单克隆抗体”不仅涵盖完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且涵盖它们的片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)，单链(scFv)，

它们的变体，包含单克隆抗体的抗原结合片段的融合蛋白，人源化单克隆抗体，嵌合单克隆抗体和包含具有所需的特异性和结合至表位的能力的抗原结合片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它修饰的构型，包括本文公开的WNT替代分子。并不打算对抗体的来源或制备抗体的方式作限制(例如通过融合瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)。所述术语包括上文在“抗体”定义下描述的全免疫球蛋白以及片段等。

如本文所用，术语“天然”或“野生型”是指存在于野生型细胞、组织、器官或生物中的核苷酸序列，例如基因或基因产物，例如RNA或蛋白质。如本文所用，术语“变体”是指参考多核苷酸或多肽序列，例如天然多核苷酸或多肽序列的突变体，即与参考多核苷酸或多肽序列具有小于100％的序列一致性。换句话说，变体包含相对于参考多核苷酸序列，例如天然多核苷酸或多肽序列的至少一个氨基酸差异(例如，氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失)。举例而言，变体可以是与全长天然多核苷酸序列具有50％或更多、60％或更多、或70％或更多的序列一致性的多核苷酸，例如与全长天然多核苷酸序列具有75％或80％或更大，例如85％、90％或95％或更大，例如98％或99％的一致性。作为另一实例，变体可以是与全长天然多肽序列具有70％或更多的序列一致性的多肽，例如与全长天然多肽序列具有75％或80％或更大的一致性，例如85％、90％或95％或更大，例如98％或99％一致性。变体还可包括参考序列，例如天然序列的变体片段，所述变体片段与参考序列，例如天然序列的片段共享70％或更大的序列一致性，例如与天然序列共享75％或80％或更大的一致性，例如85％、90％或95％或更大，例如98％或99％一致性。

“可操作地连接(operatively linked或operably linked)”是指基因元件的并置，其中所述元件处于允许其以预期方式操作的关系中。例如，如果启动子帮助启动对编码序列进行转录，则启动子与编码区域操作性地连接。只要保持这种功能关系，在启动子和编码区之间就可能存在间插残基。

如本文所使用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指任何长度的氨基酸的聚合物。术语还涵盖已经改性的氨基酸聚合物：例如包括双硫键形成、糖基化、脂化、磷酸化或与标记组分结合。

术语“多核苷酸”是指任何长度的聚合形式的核苷酸，包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以包括经过修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，并且可以间杂有非核苷酸组分。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以在组装聚合物之前或之后进行。如本文中所使用的术语多核苷酸可互换地指双股和单股分子。除非另外说明或需要，否则本文中所描述的本发明的任何实施例(其是多核苷酸)涵盖双股形式和已知或预测组成双股形式的两个互补单股形式中的每一种。

多核苷酸或多肽与另一种多核苷酸或多肽具有一定百分比的“序列一致性”，这意味着当比对时，碱基或氨基酸的百分比在与两种序列比较时是相同的。序列相似性可以以多种不同方式确定。为了确定序列一致性，可以使用包括可通过万维网ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得的BLAST的方法和计算机程序对序列进行比对。另一种比对算法是FASTA，在美国威斯康辛州麦迪逊的Genetics Computing Group(GCG)程序包中获得，所述公司是牛津分子集团有限公司(Oxford Molecular Group，Inc.)的全资子公司。用于比对的其它技术描述于Enzymology，第266卷：用于大分子序列分析的计算机方法(Computer Methods forMacromolecular Sequence Analysis)(1996)，编辑Dolittle，学术出版社(AcademicPress,Inc.)，美国加利福利亚州圣地亚哥(San Diego,Calif.，USA)的Harcourt Brace&Co.的子公司。特别感兴趣的是允许序列中存在间隙的比对程序。Smith-Waterman是一种允许序列比对中存在间隙的算法类型。参见《分子生物学方法(Meth.Mol.Biol.)》70:173-187(1997)。此外，使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序可以用于比对序列。参见《分子生物学期刊(J.Mol.Biol.)》48:443-453(1970)。

有趣的是使用Smith和Waterman的本地同源算法以确定序列一致性的BestFit程序(《应用数学进展(Advances in Applied Mathematics)》2：482-489(1981)。间隙产生罚分一般在1到5之间，通常为2到4，并且在许多实施例中将是3。间隙延伸罚分一般在约0.01到0.20范围内，并且在许多情况下为0.10。所述程序具有由输入以进行比较的序列确定的默认参数。优选地，使用由程序确定的默认参数来确定序列一致性。该程序也可从美国威斯康辛州麦迪逊市的Genetics Computing Group(GCG)程序包获得。

另一个感兴趣的程序是FastDB算法。FastDB描述于序列比较和分析中的现行方法(Current Methods in Sequence Comparison and Analysis)，大分子测序和合成(Macromolecule Sequencing and Synthesis)，选定方法和应用(Selected Methods andApplications)，第127-149页，1988，Alan R.Liss公司。序列一致性百分比由FastDB根据以下参数计算：不匹配罚分：1.00；间隙罚分：1.00；间隙大小罚分：0.33；和合并罚分：30.0。

如本文所用，“启动子”涵盖指导RNA聚合酶的结合并且由此促进RNA合成的DNA序列，即足以引导转录的最小序列。启动子和对应的蛋白质或多肽表达可为普遍存在的，意指广泛范围的细胞、组织和物种的强活性或细胞类型特异性、组织特异性或物种特异性。启动子可为“组成型”，意指持续活性，或“诱导型”，意指启动子可通过生物或非生物因子的存在或不存在活化或去活。本发明的核酸构建体或载体中还包括可与启动子序列邻接或不邻接的增强子序列。增强子序列影响启动子依赖性基因表达且可位于天然基因的5'或3'区域。

如应用于多核苷酸的“重组”是指多核苷酸是克隆、限制或连接步骤的各种组合的产物，以及产生不同于在自然界中发现的多核苷酸的构建体的其它程序。

术语“治疗(treatment、treating)”等在本文中通常用于意指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果在完全或部分地预防疾病或其症状方面可以是预防性的，例如降低个体体内发生疾病或其症状的可能性，和/或在部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的副作用方面可以是治疗性的。如本文所使用的“治疗”覆盖哺乳动物的疾病的任何治疗，且包括：(a)预防疾病在可能易患疾病但尚未诊断患有所述疾病的个体中发生；(b)抑制疾病，即，遏制其发展；或(c)缓解疾病，即，使疾病消退。治疗剂可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用。发展中的疾病的治疗为备受关注的，其中治疗稳定或减少患者的非所需临床症状。期望在受影响组织的功能完全丧失之前执行这种治疗。期望在疾病的有症状的阶段期间并且在一些情况下在疾病的有症状的阶段之后施用主题疗法。

如本文所用，短语“视网膜血管疾病”是眼部疾病，特别是由异常血管结构形成引起的视网膜疾病。在一些方面中，异常血管结构由血管结构发育的抑制引起，并且在其它方面中，异常血管结构由过度血管生成引起。

除非另有说明，否则本发明的实践将采用细胞生物学、分子生物学技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其在所属领域的技术人员的范围内。这类技术在例如以下文献中充分解释：“《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》”，第二版(Sambrook等人，1989)；“《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》”(M.J.Gait编，1984)；“《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》”(R.I.Freshney编，1987)；“《酶学方法(Methods in Enzymology)”(学术出版社(AcademicPress,Inc.))；“《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》”(D.M.Weir&C.C.Blackwell编)；“《哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells)》”(J.M.Miller&M.P.Calos编，1987)；“《分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》”(F.M.Ausubel等人编，1987)；“《PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》”，(Mullis等人编，1994)；和“《免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》”(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献各自以引用的方式明确并入本文。

以下参照用于说明目的的实例应用来描述本发明的若干方面。应理解，给出的许多具体细节、关系及方法提供了对本发明的完整理解。然而，相关领域的普通技术人员将易于认识到，本发明可以不遵照所述具体细节中的一或多个实施，或者用其它方法实施。本发明不受动作或事件的说明次序限制，因为一些动作可以与其它动作或事件按不同次序发生和/或同时发生。此外，根据本发明方法的实施不需要所有所说明的动作或事件。

本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而并不意欲限制本发明。如本文所使用，除非上下文另外明确指示，单数形式“一(a、an)”以及“所述”意欲还包括复数形式。此外，就具体实施方式和/或权利要求书中使用术语“包括(including、includes)”、“具有(has、with)”或其变化形式的程度而言，此类术语意欲以类似于术语“包含”的方式是包含性的。

术语“约”或“大约”意指在如由所属领域的一般技术人员测定的具体值的可接受的偏差范围内，其将部分取决于所述值如何测量或测定，即，测量系统的限制。举例而言，根据所属领域中的实践，“约”可意指在1或大于1个标准差内。替代地，“约”可意指至多给定值的20％，优选至多10％，更优选至多5％，且更优选仍至多1％的范围。替代性地，特别是对于生物系统或过程，术语可以表示处于一个数量级内，优选地在值的5倍内，并且更优选地在2倍内。在申请案和权利要求中描述具体值的情况下，除非另有说明，否则应当假设术语“约”意指处于具体值的可接受误差范围内。

本文中提及的所有公开案均以引用的方式并入本文中，从而公开和描述与所列公开案相关的方法和/或材料。应了解，在存在抵触的范围内，本公开取代了合并的出版物的任何公开。

应进一步注意，权利要求书可经起草而排除任何任选的元件。因而，本陈述意图与对所主张元件的引述结合而充当使用如“仅仅(solely)”、“仅(only)”等排他性术语或使用“负性”限制的前提基础。

除非另外指明，否则本文使用的所有术语的含义与它们对所属领域技术人员所具有的含义相同，并且本发明的实践将采用在所属领域技术人员的知识范围内的微生物学和重组DNA技术的常规技术。

II.概述.

本发明提供了调节WNT信号以治疗视网膜病变的方法，包括(但不限于)FEFR和其它遗传病症、DR和AMD。特别地，本发明提供WNT/b-连环蛋白激动剂和/或拮抗剂，以抑制视网膜病变进展中的异常新生血管形成。

WNT(“无翼相关整合位点”或“无翼和Int-1”或“无翼-Int”)配体及其信号在控制许多重要器官和组织的发育、稳态和再生中起关键作用，包括骨、肝、皮肤、胃、肠、肾脏、中枢神经系统、乳腺、味蕾、卵巢、耳蜗、肺以及许多其它组织(由Clevers、Loh和Nusse，2014；346:1248012综述)。对WNT信号传导路径的调节具有治疗退行性疾病和组织损伤的潜力。

调节WNT信号传导作为治疗的挑战之一是存在多个WNT配体和WNT受体，即卷曲受体(Frizzled)1-10(Fzd 1-10)，其中许多组织表达多个和重叠的Fzd。典型WNT信号除了涉及Fzd之外，还涉及作为共受体的低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5(LRP5)或低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白6(LRP6)，其在各种组织中广泛表达。

R-脊椎蛋白(R-spondin)1-4是扩增WNT信号的配体家族。每个R-脊椎蛋白通过受体复合物起作用，所述受体复合物一端含有锌和环指3(ZNRF3)或环指蛋白43(RNF43)，并且另一端含有含富亮氨酸的重复序列的G蛋白偶联受体4-6(LGR4-6)(例如由Knight和Hankenson 2014，基质生物学(Matrix Biology)；37：157-161综述)。R-脊椎蛋白也可通过其它作用机制发挥作用。ZNRF3和RNF43是两种膜结合的E3连接酶，专门靶向WNT受体(Fzd1-10和LRP5或LRP6)进行降解。R-脊椎蛋白与ZNRF3/RNF43和LGR4-6的结合引起三元复合物的清除或螯合，其从WNT受体去除E3连接酶并稳定WNT受体，导致WNT信号增强。每种R-脊椎蛋白含有两个弗林蛋白酶(Furin)结构域(1和2)，其中弗林蛋白酶结构域1与ZNRF3/RNF43结合，并且弗林蛋白酶结构域2与LGR4-6结合。含有弗林蛋白酶结构域1和2的R-脊椎蛋白的片段足以扩增WNT信号传导。虽然R-脊椎蛋白效应取决于WNT信号，但由于LGR4-6和ZNRF3/RNF43均在各种组织中广泛表达，R-脊椎蛋白的效应不是组织特异性的。

在一些实施例中，WNT/β-连环蛋白信号传导拮抗剂或激动剂可以包括结合一种或多种Fzd受体并抑制或增强WNT信号传导的结合剂或表位结合结构域。在某些实施例中，药剂或抗体特异性结合至与之结合的一种或多种人卷曲受体内的富含半胱氨酸结构域(CRD)。另外，还可以使用含有针对LRP的表位结合结构域的拮抗性结合剂。在一些实施例中，WNT/β-连环蛋白拮抗剂具有结合E3连接酶ZNRF3/RNF43和一个或多个FZD受体或一个或多个LRP共受体以促进FZD或LRP受体降解的结合剂或表位结合结构域，并且该分子还可以含有结合细胞类型特异性表位以进行靶向的结合结构域。E3连接酶激动剂抗体或其片段可以是单一分子或与其它例如Fzd受体拮抗剂、LRP受体拮抗剂等WNT拮抗剂组合。

如所属领域中众所周知，抗体为能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区上的表位结合结构域特异性结合于靶向物，如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等的免疫球蛋白分子。如本文所用，所述术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，而且涵盖其含有表位结合结构域的片段(例如，dAb、Fab、Fab'、(F(ab')₂、Fv、单链(scFv)、VHH或单结构域抗体(sdAb)、DVD-Igs、其合成变体、天然存在的变体、包含表位结合结构域的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体和包含具有所需特异性的抗原结合位点或片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰的构型。“双功能抗体”是通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；P.Holliger等人，《美国科学院院刊》90 6444-6448，1993)，其也是本文涵盖的特定形式抗体。本文还包括包含与CH3结构域连接的scFv的微型抗体(S.Hu等人，《癌症研究(Cancer Res.)》，56，3055-3061，1996)。参见例如Ward,E.S.等人，《自然》341，544-546(1989)；Bird等人，《科学(Science)》，242，423-426，1988；Huston等人，《美国科学院院刊》，85，5879-5883，1988)；PCT/US92/09965；WO94/13804；P.Holliger等人，《美国科学院院刊》90 6444-6448，1993；Y.Reiter等人，《自然生物技术(Nature Biotech)》，14，1239-1245，1996；S.Hu等人，《癌症研究》，56，3055-3061，1996。

蛋白水解酶番木瓜酶优先使IgG分子裂解以产生若干片段，其中两者(F(ab)片段)各自包含包括完整抗原结合位点的共价异二聚体。酶胃蛋白酶能够使IgG分子裂解以提供若干片段，包括F(ab')2片段，其包含两个抗原结合位点。根据本公开的某些实施例的Fv片段可以通过IgM，并且在罕见情况下通过IgG或IgA免疫球蛋白分子的优先蛋白水解裂解产生。然而，更通常地使用所属领域中已知的重组技术衍生Fv片段。Fv片段包括非共价VH::VL异二聚体，所述非共价VH::VL异二聚体包括保留天然抗体分子的大部分抗原识别和结合能力的抗原结合位点。Inbar等人(1972)《美国科学院院刊》69:2659-2662；Hochman等人(1976)《生物化学(Biochem)》15:2706-2710；和Ehrlich等人(1980)《生物化学》19:4091-4096。

在某些实施例中，涵盖了单链Fv或scFV抗体。例如，Kappa抗体(Ill等人，《蛋白质工程(Prot.Eng.)》10：949-57(1997))；微型抗体(Martin等人，《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J)》13：5305-9(1994))；双功能抗体(Holliger等人，《美国科学院院刊》90：6444-8(1993))；或Janusins(Trautecker等人，《欧洲分子生物学学会杂志》10：3655-59(1991)和Trautecker等人，《国际癌症杂志增刊(Int.J.Cancer Suppl.)》7：51-52(1992))可以使用标准分子生物学技术按照在本申请案关于选择具有所需特异性的抗体的教示来制备。在其它实施例中，可以制备涵盖本公开的配体的双特异性或嵌合抗体。例如，嵌合抗体可以包含来自不同抗体的CDR和构架区，而可以生成通过一个结合结构域特异性结合到一个或多个Fzd受体并通过第二结合结构域特异性结合到第二分子双特异性抗体。这些抗体可以通过重组分子生物学技术产生或可以物理方式结合在一起。

单链Fv(scFv)多肽是由基因融合物表达的共价连接的VH：VL异二聚体，所述基因融合物包括通过肽编码连接子连接的VH-和VL-编码基因。Huston等人(1988)《美国科学院院刊》85(16):5879-5883。已经描述了许多方法，以辨别用于将抗体V区的天然聚集但化学上分离的轻链和重链多肽链转换为scFv分子的化学结构，所述scFv分子将折叠成与抗原结合位点的结构大体上相似的三维结构。参见例如颁予Huston等人的美国专利第5,091,513号和第5,132,405号；和颁予Ladner等人的美国专利第4,946,778号。

在某些实施例中，如本文所述的抗体呈双功能抗体的形式。双功能抗体是多肽的多聚体，每种多肽包括包含免疫球蛋白轻链的结合区的第一结构域和包含免疫球蛋白重链的结合区的第二结构域，所述两个结构域被连接(例如，通过肽连接子连接)但无法彼此缔合形成抗原结合位点：抗原结合位点通过所述多聚体内一种多肽的第一结构域与所述多聚体内另一种多肽的第二结构域的缔合而形成(WO94/13804)。

抗体的dAb片段由VH结构域组成(Ward,E.S.等人，《自然》341，544-546(1989))。

在使用双特异性抗体时，这些可以是常规双特异性抗体，其可以各种方式制造(Holliger,P.和Winter G.，《生物技术新观点(Current Opinion Biotechnol.)》4，446-449(1993))，例如以化学方式或由杂交瘤制备，或可以是上文提及的任何双特异性抗体片段。双功能抗体和scFv能够在没有Fc区的情况下仅使用可变结构域构建而成，潜在地减少了抗个体基因型反应的影响。

相对于双特异性全抗体，双特异性双功能抗体也可能是特别有用的，因为它们可以容易地在大肠杆菌中构建和表达。可以使用噬菌体呈现(WO94/13804)从文库容易地选择具有适当结合特异性的双功能抗体(和许多其它多肽，如抗体片段)。如果双功能抗体的一个臂欲保持恒定，例如具有针对抗原X的特异性，则能够制备文库，其中另一臂被改变且选择具有适当特异性的抗体。双特异性全抗体可以通过旋钮入孔工程化来制备(J.B.Ridgeway等人，《蛋白质工程(Protein Eng.)》，9，616-621(1996))。

在某些实施例中，本文所述的抗体可以

的形式提供。

是去除铰链区的IgG4抗体(参见荷兰乌得勒支(Utrecht,The Netherlands)GenMab；还参见例如US20090226421)。这种专有的抗体技术产生稳定较小抗体型式，其治疗窗比当前小抗体型式预期更长。IgG4抗体被认为是惰性的，因此不与免疫系统相互作用。可以通过消除抗体的铰链区来修饰完全人IgG4抗体，以获得相对于对应的完整IgG4(乌得勒支GenMab)具有独特稳定性特性的半分子片段。使IgG4分子减半在

上仅留下一个可结合至同源抗原(例如，疾病靶标)的区域，因此

仅与靶细胞上的一个位点单价结合。

在某些实施例中，如本文所述的抗体及其抗原结合片段包括重链和轻链CDR组，所述重链和轻链CDR组分别插入为CDR提供支持并且限定CDR相对于彼此的空间关系的重链和轻链构架区(FR)组之间。如本文所用，术语“CDR组”是指重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N末端开始，这些区域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包括六个CDR，包含来自重链和轻链V区中的每一个的CDR组。包含单个CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在本文中称为“分子识别单元”。对许多抗原-抗体复合物的结晶分析已证实CDR的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3。因此，分子识别单元主要负责抗原结合位点的特异性。

如本文所用，术语“FR组”是指构成重链或轻链V区的CDR组的CDR的四个侧翼氨基酸序列。一些FR残基可以接触结合的抗原；然而，FR主要负责将V区折叠到抗原结合位点中，特别是直接邻近CDR的FR残基。在FR内，某些氨基残基和某些结构特征是极其高度保守的。在这方面，所有V区序列含有约90个氨基酸残基的内部二硫环。当V区折叠到结合位点中时，CDR显示为突出环基序，形成抗原结合表面。一般认为，FR存在保守的结构区，其影响CDR环形状折叠成某些“规范”结构，而与精确的CDR氨基酸序列无关。此外，已知某些FR残基参与稳定抗体重链与轻链相互作用的非共价结构域间接触。

在某些实施例中，本公开的抗体可以采用

的形式。

技术最初是在发现和鉴定骆驼科动物(例如骆驼和羊驼)具有仅由重链组成并因此缺乏轻链的完全功能性抗体之后开发的。这些仅重链抗体含有单个可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2，CH3)。克隆和分离的单个可变结构域具有完全抗原结合能力并且是非常稳定的。这些具有其独特结构和功能特性的单个可变结构域构成

的基础。

由单一基因编码，并且在几乎所有原核和真核宿主中有效地产生，例如大肠杆菌(参见例如美国专利第6,765,087号)、霉菌(例如，曲霉或木霉)和酵母(例如，酵母(Saccharomyces)、克鲁维氏酵母(Kluyvermyces)、汉逊酵母(Hansenula)或毕赤酵母(Pichia))(参见例如，美国专利第6,838,254号)。生产过程是可扩展的，并且已经生产了数公斤量的

可配制为具有较长保质期的即用型溶液。

方法(参见例如WO 06/079372)是基于B细胞的自动高通量选择的针对所需靶标产生

的专用方法。

是仅骆驼科特异性重链抗体的单结构域抗原结合片段。

也称为VHH抗体，通常具有约15kDa的小尺寸。

设想的另一个抗体片段是双变体结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)是将两种单克隆抗体的功能和特异性在一个分子实体中组合的经工程化的蛋白质。DVD-Ig被设计为IgG样分子，不同之处在于每条轻链和重链含有通过短肽键串联的两个可变结构域，而不是IgG中的一个可变结构域。两个可变结构域的融合取向和连接子序列的选择对于分子的功能活性和有效表达至关重要。DVD-Ig可以由常规哺乳动物表达系统产生为用于制造和纯化的单一物质。DVD-Ig具有亲本抗体的特异性，在体内稳定，并且表现出IgG样物理化学和药代动力学特性。DVD-Ig及其制备方法描述于Wu,C.等人，《自然生物技术(Nature Biotechnology)》，25:1290-1297(2007))中。

在某些实施例中，如本文所公开的抗体或其抗原结合片段是人源化的。这是指一般使用重组技术制备的嵌合分子，所述嵌合分子具有衍生自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的分子的剩余免疫球蛋白结构。抗原结合位点可以包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或仅包含移植到可变结构域中的适当构架区上的CDR。表位结合位点可以是野生型的或由一个或多个氨基酸取代修饰。这消除了恒定区作为人类个体中的免疫原，但对外来可变区的免疫反应的可能性仍然存在(LoBuglio,A.F.等人，(1989)《美国科学院院刊》86:4220-4224；Queen等人，PNAS(1988)86:10029-10033；Riechmann等人，《自然》(1988)332：323-327)。用于本文公开的Fzd或LRP抗体的人源化的说明性方法包括美国专利第7,462,697号中所述的方法。

另一种方法不仅专注于提供人类衍生的恒定区，而且还修饰可变区，以便尽可能将它们重塑为人类形式。已知重链和轻链的可变区都含有三个互补决定区(CDR)，其响应于所讨论的表位而变化并且确定结合能力，侧接有给定物种中相对保守并且推定为CDR提供支架的四个框架区(FR)。当关于特定表位制备非人抗体时，可变区可以通过在待修饰的人抗体中存在的FR上移植衍生自非人抗体的CDR而“重塑”或“人源化”。已经报道了将该方法应用于各种抗体：Sato,K.等人，(1993)《癌症研究》53：851-856；Riechmann,L.等人，(1988)《自然》332：323-327；Verhoeyen,M.等人，(1988)《科学》239：1534-1536；Kettleborough,C.A.等人，(1991)《蛋白质工程》4：773-3783；Maeda,H.等人，(1991)《人抗体杂交瘤(HumanAntibodies Hybridoma)》2：124-134；Gorman,S.D.等人，(1991)《美国科学院院刊》88：4181-4185；Tempest,P.R.等人，(1991)《生物技术(Bio/Technology)》9：266-271；Co,M.S.等人，(1991)《美国科学院院刊》88：2869-2873；Carter,P.等人，(1992)《美国科学院院刊》89：4285-4289；和Co,M.S.等人，(1992)《免疫学杂志(J Immunol)》148：1149-1154。在一些实施例中，人源化抗体保留所有CDR序列(例如，含有来自小鼠抗体的所有六个CDR的人源化小鼠抗体)。在其它实施例中，人源化抗体具有相对于原始抗体改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，也称为“衍生自”原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。

在某些实施例中，本公开的抗体可以是嵌合抗体。在这方面，嵌合抗体由可操作地连接或以其它方式融合至不同抗体的异源Fc部分的抗体的抗原结合片段构成。在某些实施例中，异源Fc结构域具有人来源。在其它实施例中，异源Fc结构域可以来自与亲本抗体不同的Ig类别，包括IgA(包括亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(包括亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgM。在另外的实施例中，异源Fc结构域可以由来自一种或多种不同Ig类别的CH2和CH3结构域构成。如上文关于人源化抗体所述，嵌合抗体的抗原结合片段可以仅包含本文所述的抗体的一个或多个CDR(例如，本文所述的抗体的1、2、3、4、5或6个CDR)，或者可以包含整个可变结构域(VL、VH或两者)。

免疫球蛋白CDR和可变结构域的结构和位置可以通过参考以下来确定：Kabat,E.A.等人，《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest.)》第4版。美国卫生和公众服务部(US Department of Health and HumanServices)，1987年，及其更新版，现已在互联网上获得(immuno.bme.nwu.edu)。

在某些实施例中，拮抗剂或激动剂结合剂以约1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小、或约10nM或更小的解离常数(K_D)结合。例如，在某些实施例中，本文所述的与多于一个FZD结合的FZD结合剂或抗体以约l00 nM或更小、约20nM或更小、或约10nM或更小的K_D结合那些FZD。在某些实施例中，结合剂以约1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、或约1nM 20或更小的EC50结合至一种或多种其靶抗原。

本发明的抗体或其它药剂可以通过所属领域已知的任何方法进行特异性结合测定。可以使用的免疫测定包括(但不限于)使用如生物层干涉测量法(BLI)分析的技术的竞争性和非竞争性测定系统、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化学、蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定。此类测定是所属领域中常规且众所周知的(参见例如Ausubel等人，编辑，1994，《分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》，第1卷，纽约约翰·威利父子公司(JohnWiley&Sons,Inc.，New York)，其以全文引用的方式并入本文)。

例如，抗体与靶抗原的特异性结合可以使用ELISA来确定。ELISA测定包括制备抗原、用抗原涂布96孔微量滴定板的孔，将结合至如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的可检测化合物的抗体或其它结合剂添加到孔，培育一段时间并检测抗原的存在。在一些实施例中，抗体或药剂不与可检测化合物结合，而是将识别第一抗体或药剂的第二结合抗体添加到孔中。在一些实施例中，代替用抗原涂布孔，可以将抗体或药剂涂布到孔，并且在将抗原添加到经涂布的孔之后可以添加与可检测化合物结合的第二抗体。所属领域的技术人员将了解哪些参数可以修改以增加所检测到的信号以及所属领域中已知的ELISA的其它变化(参见例如Ausubel等人，编辑，1994，《分子生物学实验指南》，第1卷，纽约约翰·威利父子公司，11.2.1)。

抗体或另一种药剂与靶抗原的结合亲和力和抗体-抗原相互作用的解离速率可以通过竞争性结合测定来确定。竞争性结合测定的一个实例是放射性免疫测定，其包含在存在增加量的未标记的抗原的情况下，将标记的抗原(例如，Fzd、LRP)或其片段或变体与所关注的抗体一起培育，随后检测与标记的抗原结合的抗体。抗体的亲和力和结合解离速率可通过斯卡查德(scatchard)图分析从数据确定。在一些实施例中，BLI分析用于确定抗体或药剂的结合速率和解离速率。BLI动力学分析包含分析抗体与固定抗原在其表面上的芯片的结合和解离。

在某些实施例中，WNT激动剂选自PCT公开案第WO2019126398号中公开的那些，其以全文引用的方式并入本文中。在特定实施例中，WNT激动剂具有图1A中图示的结构和/或包含针对图1B中所公开的任一WNT激动剂公开的序列。在一些实施例中，WNT激动剂包含与SEQ ID NO：1-8中任一者所公开的序列具有至少90％一致性(例如95％、98％或100％一致性)的序列，其中前导序列以斜体表示，连接子序列加下划线，并且VHH/sdAb或VH或VL序列以粗体表示。

III.药物组合物

还公开了包含本文所述的WNT拮抗剂或激动剂分子和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂的药物组合物。

在另外的实施例中，还公开了包含多核苷酸和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂的药物组合物，所述多核苷酸包含编码本文所述的WNT拮抗剂/激动剂分子的核酸序列。在某些实施例中，多核苷酸为DNA或mRNA，例如经修饰mRNA。在特定实施例中，多核苷酸为进一步包含5'帽序列和/或3'加尾序列(例如，聚A尾)的经修饰的mRNA。在其它实施例中，多核苷酸是包含与编码序列可操作地连接的启动子的表达盒。

在一些实施例中，WNT拮抗剂/激动剂是并入有与WNT信号传导路径中的各种分子结合的各种表位结合片段的工程化重组多肽。例如，WNT拮抗剂可以是与Fzd4受体和/或LRP受体结合并抑制WNT信号传导的抗体或其片段。Fzd4和LRP抗体片段(例如Fab、scFv、VHH/sdAb等)可以直接或与各种大小的连接子在一个分子上连接在一起。

相反，经工程化的WNT激动剂/拮抗剂也可以是并入有与WNT信号传导路径中的各种分子结合并增强WNT信号传导的表位结合片段的重组多肽。举例而言，WNT拮抗剂可以是与Fzd受体和/或LRP受体结合并促进WNT信号传导的抗体或其片段。Fzd和LRP抗体片段(例如Fab、scFv、VHH/sdAb等)可以直接或与各种大小的连接子在一个分子上连接在一起。

在另外的实施例中，还公开了包括包含多核苷酸的例如病毒载体的表达载体和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂的药物组合物，所述多核苷酸包含编码本文所述的WNT拮抗剂/激动剂分子的核酸序列。在某些实施例中，编码WNT拮抗剂分子的核酸序列和编码WNT激动剂的核酸序列在相同多核苷酸(例如表达盒)中。

本公开进一步涵盖一种包括包含表达载体的细胞和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂的药物组合物，所述表达载体包括包含与编码WNT拮抗剂/激动剂分子的核酸可操作地连接的启动子的多核苷酸。在特定实施例中，药物组合物进一步包括包含表达载体的细胞，所述表现载体包括包含与编码WNT拮抗剂和WNT激动剂的核酸序列可操作地连接的启动子的多核苷酸。在某些实施例中，编码WNT拮抗剂分子的核酸序列和编码WNT激动剂分子的核酸序列存在于相同的多核苷酸，例如表达盒和/或相同的细胞中。在特定实施例中，细胞是从待治疗的个体获得的异源细胞或自体细胞。

在特定实施例中，细胞是干细胞，例如脂肪来源的干细胞或造血干细胞。本公开涵盖药物组合物，其包含用于递送WNT拮抗剂分子作为第一活性剂的第一分子和作为第二分子的WNT激动剂。第一分子和第二分子可以是相同类型的分子或不同类型的分子。举例而言，在某些实施例中，第一和第二分子可各自独立地选自以下类型的分子：多肽、小有机分子、编码第一或第二活性剂的核酸(任选地DNA或mRNA，任选地改性RNA)、包含编码第一或第二活性剂的核酸序列的载体(任选地表达载体或病毒载体)，和包含编码第一或第二活性剂的核酸序列(任选地表达盒)的细胞。

单独的或组合的主题分子可以与可用于制备配制物的药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂和试剂组合，所述配制物通常安全、无毒且合乎需要并且包括可接受用于哺乳动物，例如人或灵长类动物使用的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体或气体(在气溶胶组合物的情况下)。所述载剂、稀释剂和赋形剂的实例包括(但不限于)水、盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。还可以将补充性活性化合物并入配制物中。用于配制物的溶液或悬浮液可以包括：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌化合物，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；洗涤剂，如用于防止聚集的吐温(Tween)20；以及用于调节张力的化合物，如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱调整，例如盐酸或氢氧化钠。在特定实施例中，药物组合物是无菌的。

医药组合物可以进一步包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，适合的载剂包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在一些情况下，所述组合物是无菌的，并且应当是流体的，使得其可以抽吸到注射器中或从注射器递送至个体。在某些实施例中，其在制造和存储条件下稳定且针对微生物(例如细菌和真菌)的污染作用而保存。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇以及液体聚乙二醇等)以及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用涂层(如卵磷脂)、在分散液情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。微生物作用的预防可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，优选在组合物中纳入等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。内部组合物的延长吸收可通过在组合物中纳入延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。

无菌溶液可以通过将WNT拮抗剂/激动剂抗体或其抗原结合片段(或编码多核苷酸或包含编码多核苷酸的细胞)以所需量根据需要与上文列举的成分之一或组合一起并入适当的溶剂中，随后进行过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物并入含有碱性分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其它成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这产生了来自其先前无菌过滤溶液的活性成分加上任何其它所希望的成分的粉末。

在一个实施例中，药物组合物用载剂制备，所述载剂将保护抗体或其抗原结合片段免于从身体快速消除，例如控制释放配制物，包括植入剂和微封装递送系统。可以使用可生物降解、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类配制物的方法对所属领域技术人员而言将是显而易见的。材料也可以商购获得。还可以使用脂质体悬浮液作为药学上可接受的载剂。这些悬浮液可以根据所属领域的技术人员已知的方法来制备。

可能有利的是将药物组合物配制成单位剂型以便于施用和剂量均一性。如本文所用的单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗个体的物理离散单位；每个单位含有与所需药物载剂结合，经计算以产生所期望的治疗效果的预定数量的活性抗体或其抗原结合片段。单位剂型的规格是由以下各项指示并且直接取决于以下各项：抗体或其抗原结合片段的独特特征和有待实现的具体治疗效果，以及在混配这种活性抗体或其抗原结合片段以治疗个体的领域中的固有局限性。

药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器(例如注射器，例如预填充注射器)中。

本公开的药物组合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯或此类酯的盐，或在施用于包含人的动物后能够(直接或间接地)提供生物活性抗体或其抗原结合片段的任何其它化合物。

本公开包括本文所述的WNT拮抗剂/激动剂分子的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”是指本公开化合物的生理学上和药学上可接受的盐：即，保留了亲本化合物的期望生物活性并且不对亲本化合物产生不期望的毒理效果的盐。多种药学上可接受的盐是所属领域已知的并且描述于例如“雷明顿的医药科学(Remington's PharmaceuticalSciences)”，第17版，Alfonso R.Gennaro(编)，美国宾夕法尼亚州伊斯顿马克出版公司(Mark Publishing Company,Easton,PA,USA)，1985(和其更近期的版本)，“制药技术百科全书(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology)”，第3版，James Swarbrick(编)，美国纽约美国医疗保健公司(Informa Healthcare USA(Inc.))，2007和《药物科学杂志(J.Pharm.sci.)》66：2(1977)。此外，有关合适的盐类的综述，请参见“药物盐手册：特性、选择和使用(Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use)”，由Stahl和Wermuth撰写(Wiley-VCH，2002)。用如碱金属和碱土金属或有机胺等金属或胺形成药学上可接受的碱加成盐。

用作阳离子的金属包含钠、钾、镁、钙等。胺包含N-N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因(参见例如Berge等人,“药用盐(Pharmaceutical Salts)”,《药学杂志(J.Pharma Sci)》,1977,66,119)。所述酸性化合物的碱加成盐通过使游离酸形式与足够量的所需碱接触来制备，从而以常规方式产生所述盐。游离酸形式可以通过使盐形式与酸接触并以常规方式分离游离酸来再生。游离酸形式在某些物理性质(如在极性溶剂中的溶解度)方面与其相应的盐形式略有不同，但另外，出于本公开的目的，盐等同于其相应的游离酸。

在一些实施例中，本文提供的药物组合物包含治疗有效量的WNT拮抗剂/激动剂分子或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂(例如盐水、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐和氨基酸)、聚合物、多元醇、糖、缓冲剂、防腐剂和其它蛋白质的掺合物。示例性氨基酸、聚合物和糖等为辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇单硬脂酸酯化合物、聚氧化乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露糖醇、葡聚糖、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、木糖醇、乳糖、海藻糖、牛或人血清白蛋白、柠檬酸盐、乙酸盐、林格氏和汉克氏溶液(Ringer's and Hank's solution)、半胱氨酸、精氨酸、肉碱、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸、白氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯和二醇。优选地，此配制物在4℃下稳定至少六个月。

在一些实施例中，本文提供的药物组合物包含缓冲剂，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或磷酸钠/硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷(tris)缓冲剂、甘氨酸缓冲剂、无菌水和所属领域的一般技术人员已知的其它缓冲剂，如由Good等人(1966)《生物化学(Biochemistry)》5：467所描述的那些。缓冲剂的pH可以在6.5至7.75的范围内，优选7至7.5，并且最优选7.2至7.4。

IV.使用方法

本公开还提供了用于使用WNT拮抗剂/激动剂分子，例如调节WNT信号传导路径，例如增加或减少WNT信号传导，以及在各种治疗环境中施用WNT拮抗剂/激动剂分子的方法。本文提供了使用WNT拮抗剂/激动剂分子的治疗方法。在一个实施例中，向患有涉及不适当或失调的WNT信号传导的疾病的个体提供WNT拮抗剂/激动剂分子。

在某些实施例中，WNT拮抗剂/激动剂分子可用于阻断或增强组织或细胞中的WNT信号传导路径。拮抗WNT信号传导路径可包括减少或抑制细胞或组织中的WNT信号传导。激动WNT信号传导路径可以包括例如增加组织或细胞中的WNT信号传导或增强WNT信号传导。因此，在一些方面，本公开提供了一种用于在细胞中拮抗/激动WNT信号传导路径的方法，其包含使组织或细胞与有效量的本文所公开的WNT拮抗剂/激动剂分子或其药学上可接受的盐接触，其中所述WNT拮抗剂/激动剂分子是WNT信号传导路径拮抗剂/激动剂。在一些实施例中，接触在体外、离体或体内发生。在特定实施例中，细胞是培养的细胞，并且接触在体外发生。

WNT拮抗剂/激动剂分子可用于治疗视网膜病变。特别地，WNT信号传导的活化对于眼中血管发育期间的视网膜血管形成是必要的。norrin、Fzd4、Lrp5或Tspan12的遗传缺失不仅使表面视网膜表面上的血管发育显著消退，而且还使血管渗透到视网膜的更深层中。另外，由于不成熟的血管形成而产生的无血管区域导致缺血诱导的新生血管形成。因此，WNT激动剂或/和拮抗剂的及时受控施用不仅将使视网膜病变疾病进展消退，而且还将导致疾病的改善。在特定实施例中，WNT激动剂/拮抗剂将在个体的视网膜病变疾病进展的早期或晚期施用。

WNT激动剂和拮抗剂可以作为单药疗法单独施用或依次施用。在显示出视网膜中无血管区域的疾病发展的更早期施用激动剂将刺激/稳定血管形成并保护血管免受无血管因素的影响。另一方面，在显示新生血管形成的后期施用拮抗剂可以抑制视网膜中的异常血管再生。因此，激动剂和拮抗剂两者的依次治疗是调节疾病的一种潜在选择。在代表性的给药时程中，首先在无血管形成期施用激动剂，然后接着在新生血管形成期施用拮抗剂。为了测试相反的作用，WNT激动剂和拮抗剂将按相反顺序施用于个体。然而，鉴于WNT对血管结构稳定的潜在影响，还考虑在新生血管形成期施用激动剂。

视网膜血管疾病可以包括(但不限于)：熟悉的渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、渗出性玻璃体视网膜病变、诺里(Norrie)病、糖尿病性视网膜病变(DR)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、早产儿视网膜病变(ROP)、骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征(OPPG)、视网膜静脉阻塞和Coats病。

本发明还提供了用已知治疗剂组合治疗FEVR和/或DR。例如，WNT拮抗剂/激动剂可以与针对视网膜病变的当前疗法组合施用，包括(但不限于)抗VEGF抗体。在一些实施例中，抗Ang2抗体还将与WNT激动剂/拮抗剂组合施用于个体。缺氧诱导的VEGF和Ang2表达是病理新生血管形成的重要提示，并且实际上，已经考虑将拮抗剂Ang2抗体用于治疗视网膜病变患者(Gadkar等人，《眼科研究与视力学(Invest Othylmol Vis Sci.)》2015年8月；56(9)：5390-400)。抗VEGF抗体或抗Ang2抗体可以与本发明的分子依次或并行施用。VEGF拮抗剂可以包括(但不限于)：贝伐单抗、雷尼单抗、阿柏西普、雷莫芦单抗和塔尼比单抗，并且Ang2拮抗剂可以包括(但不限于)：奈斯伐单抗、AMG780和MEDI3617。

在另一实施例中，拮抗剂和/或激动剂分子还可以并入组织靶向部分，例如识别视网膜组织特异性受体或细胞表面分子的抗体或其片段。

可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂(例如WNT拮抗剂/激动剂)。发展中的疾病的治疗为备受关注的，其中治疗稳定或减少患者的非所需临床症状。期望在受影响组织的功能完全丧失之前执行这种治疗。期望在疾病的有症状的阶段期间并且在一些情况下在疾病的有症状的阶段之后施用主题疗法。在一些实施例中，本发明方法产生治疗效益，例如预防病症发展，中断病症进展，逆转病症进展等。在一些实施例中，本发明方法包含检测已获得的治疗效益的步骤。所属领域的一般技术人员将了解，此类治疗功效的量度将适用于正在改变的特定疾病，且将认识到用于测量治疗功效的适当的检测方法。

本说明书中所提到和/或本申请数据表中所列出的所有以上美国专利、美国专利申请公开案、美国专利申请案、外国专利、外国专利申请案以及非专利出版物以其全文引用的方式并入本文中。

从前述内容应了解，尽管本文中已出于说明的目的描述了本公开的特定实施例，但可以在不脱离本公开的精神和范围的情况下做出各种修改。因此，本公开不受所附权利要求书的限制。

最好参考以下实例来理解本发明的广泛范围，该实例不旨在将本发明限制于特定实施例。

实例1

I.一般方法

描述了分子生物学中的标准方法。Maniatis等人(1982)《分子克隆，实验室手册》，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约州冷泉港(ColdSpring Harbor,N.Y.)；Sambrook和Russell(2001)《分子克隆(Molecular Cloning)，第3版，冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港；Wu(1993)《重组DNA(Recombinant DNA)》，第217卷，学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥。标准方法也出现在Ausbel等人(2001)《分子生物学实验指南》，第1-4卷，纽约州纽约约翰·威利父子公司，其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖结合物和蛋白质表达(第3卷)以及生物信息学(第4卷)。

描述了蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱、电泳、离心和结晶。Coligan等人(2000)《蛋白质科学实验指南(Current Protocols in Protein Science)》，第1卷，纽约约翰·威利父子公司。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化。参见例如Coligan等人(2000)《蛋白质科学实验指南》，第2卷，纽约约翰·威利父子公司；Ausubel等人(2001)分子生物学实验指南，第3卷，纽约州纽约约翰·威利父子公司，第16.0.5-16.22.17页；西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Co.)(2001)《生命科学研究的产物(Products for Life Science Research)，密苏里州圣路易斯(St.Louis,Mo.)；第45-89页；安玛西亚制药生物技术公司(Amersham Pharmacia Biotech)(2001)BioDirectory，新泽西州皮斯卡特维(Piscataway,N.J.)，第384-391页。描述了多克隆和单克隆抗体的生产、纯化和片段化。Coligan等人(2001)免疫学实验指南，第1卷、纽约约翰·威利父子公司；Harlow和Lane(1999)《使用抗体(Using Antibodies)》，冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港；Harlow和Lane，同上。可获得用于表征配体/受体相互作用的标准技术。参见例如Coligan等人(2001)免疫学实验指南，第4卷，纽约约翰·威利公司。

可获得用于流式细胞术的方法，包括荧光激活的细胞分选检测系统

参见例如，Owens等人(1994)《临床实验室实践的流式细胞术原理(Flow CytometryPrinciples for Clinical Laboratory Practice)》，约翰·威利父子公司，新泽西州霍博肯(Hobooken,N.J.)；Givan(2001)《流式细胞术(Flow Cytometry)》，第2版；Wiley-Liss，新泽西州霍博肯；Shapiro(2003)《实用流式细胞术(Practical Flow Cytometry)》，约翰·威利父子公司，新泽西州霍博肯。可获得荧光试剂，其适用于修饰核酸，包括核酸引物和探针、多肽和抗体，用于例如作为诊断试剂。《分子探针(Molecular Probes)(2003)目录(Catalogue)，分子探针公司(Molecular Probes,Inc.)，俄勒冈州尤金(Eugene,Oreg.)；西格玛-奥德里奇(2003)目录，密苏里州圣路易斯。

描述了免疫系统的组织学的标准方法。参见例如，Muller-Harmelink(编)(1986)《人胸腺：组织病理学和病理学(Human Thymus:Histopathology and Pathology)》，施普林格(Springer Verlag)，纽约州纽约；Hiatt等人(2000)《组织学的彩色图谱(Color Atlasof Histology)》，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams,andWilkins)，费城(Phla,Pa.)；Louis等人(2002)《基本组织学：文本和图谱(BasicHistology:Text and Atlas)》，麦格劳-希尔(McGraw-Hill)，纽约州纽约。

可获得用于确定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库。参见例如GenBank，Vector

Suite(Informax有限公司，马里兰州贝塞斯达(Bethesda,Md.))；GGC Wisconsin Package(Accelrys有限公司，加利福利亚州圣地亚哥)；

(TimeLogic公司，内华达州水晶湾(Crystal Bay,Nev.))；Manne等人(2000)《生物信息学(Bioinformatics)》16：741-742；Menne等人(2000)《生物信息学应用笔记(Bioinformatics Applications Note)》16：741-742；Wren等人(2002)《生物医学中的计算机方法和程序(Comput.Methods Programs Biomed.)》68：177-181；von Heijne(1983)《欧洲生物化学学会联合会杂志(Eur.J.Biochem)》133：17-21；vonHeijne(1986)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》14:4683-4690。

II.FZD4 WNT替代物

按照PCT公开第WO2019126398号中所述构建单特异性FZD4 WNT替代物(3SD10-3、3SD10-26、3SD10-36、4SD1-3、4SD1-26和4SD1-36)。图1A提供了所使用的WNT替代分子的结构的图形表示，图1B是指示存在于WNT替代物中的Fzd结合结构域和LRP结合结构域的表，并且提供了存在于所示WNT替代物中的序列。如下所述测试了FZD4受体的特异性。

使用先前报道的含有由WNT响应启动子(293STF)控制的荧光素酶基因的HEK293细胞系(293STF)测量WNT信号传导活性(参见例如，Janda等人(2017)《自然》545：234-237)。简言之，在处理前24小时，以每孔10,000个的密度将293STF细胞接种在96孔板中，然后用3SD10-3、3SD10-26、4SD1-3或4SD1-26连同20nM的Rspo处理。用荧光素酶细胞培养裂解试剂(普洛麦格公司(Promega))裂解细胞，并使用供应商建议的程序用荧光素酶测定系统(普洛麦格公司)测量活性。将数据绘制为一式三份的平均值-/+标准偏差，并且使用Prism(GraphPad软件)通过非线性回归拟合。对于FZD4的过度表达，用含有在CMV启动子下的人FZD4基因(来自金思特公司(GenScript)的OHu21807)的质粒瞬时转染细胞，然后在转染后24小时分装到96孔板用于STF测定。图2A-2D显示未转染的293STF细胞中无WNT信号传导活性。相比之下，用FZD4受体瞬时转染的细胞显示出WNT信号传导(图2E-2H)。

使用Qiagen RNeasy微试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，74004)提取来自亲本或FZD4过度表达的293STF细胞的RNA。使用SuperScript^TM VILO^TM cDNA合成试剂盒(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)，11754050)产生cDNA。通过使用

快速高级主混合物(FastAdvanced Master Mix)(赛默飞世尔公司，4444963)和Hs00201853_m1FZD4探针(赛默飞世尔公司，4331182)测量人FZD4表达。使用Hs01060665_m1探针(赛默飞世尔公司，4331182)将值相对于组成型肌动蛋白B基因的表达标准化。图3示出了过度表达FZD4的FZD4瞬时转染的细胞的基因表达水平。

III.其它细胞系中的WNT活性

使用含有由WNT响应启动子控制的荧光素酶基因的bEnd.3(用于血管研究的小鼠脑内皮细胞系)或HRMEC(原代人视网膜微血管内皮细胞)细胞测量WNT信号传导活性。在最小启动子和七个LEF/TCF结合位点的串联体的控制下，用编码萤火虫荧光素酶报告基因的STF质粒瞬时转染细胞。在处理之前24小时，将经转染的细胞以每孔10,000个的密度接种在96孔板中，然后通过3SD10-3、3SD10-26、4SD1-3、4SD1-26或WNT3a处理。用荧光素酶细胞培养裂解试剂(普洛麦格公司)裂解细胞，并使用供应商建议的程序用荧光素酶测定系统(普洛麦格公司)测量活性。将数据绘制为一式三份的平均值-/+标准偏差，并且使用Prism(GraphPad软件)通过非线性回归拟合。图4A-4H显示了用monoFZD4 WNT替代物处理的bEnd.3细胞中增加的WNT信号传导活性和Axin2表达。图4I-4P显示了在HRMEC细胞中类似的WNT信号传导和Axin2表达增加。

使用Qiagen Rneasy微试剂盒(凯杰公司，74004)提取来自bEnd.3和HRMEC细胞的RNA。使用SuperScript^TM VILO^TMcDNA合成试剂盒(赛默飞世尔公司，11754050)产生cDNA。通过使用

快速高级主混合物(赛默飞世尔公司，4444963)和Hs00268943_s1 FZD1、Hs00361432_s1 FZD2、Hs00184043_m1 FZD3、Hs00201853_m1 FZD4、Hs00258278_s1 FZD5、Hs00171574_m1 FZD6、Hs00275833_s1 FZD7、Hs00259040_s1 FZD8、Hs00268954_s1 FZD9、Hs00273077_s1 FZD10、Hs00182031_m1 LRP5、Hs00233945_m1 LRP6、Hs00610344_m1 AXIN2探针(赛默飞世尔公司，4331182)测量HRMEC中的所示人基因表达。使用Hs01060665_m1探针(赛默飞世尔公司，4331182)将值相对于组成型肌动蛋白B基因的表达标准化。通过使用

快速高级主混合物(赛默飞世尔公司，4444963)和Mm00445405_s1 Fzd1、Mm02524776_s1 Fzd2、Mm00445423_m1 Fzd3、Mm00433382_m1 Fzd4、Mm00445623_s1 Fzd5、Mm00433387_m1 Fzd6、Mm00433409_s1 Fzd7、Mm01234717_s1 Fzd8、Mm01206511_s1 Fzd9、Mm00558396_s1 Fzd10、Mm01227476_m1 Lrp5、Mm00999795_m1 Lrp6、Mm00443610_m1Axin2探针(赛默飞世尔公司，4331182)测量bEnd.3细胞中的所示小鼠基因表达。使用Mm02619580_g1探针(赛默飞世尔公司，4331182)将值相对于组成型肌动蛋白B基因的表达标准化。将Axin2表达的数据绘制为一式三份的平均值-/+标准偏差，并且使用Prism(GraphPad软件)通过非线性回归拟合。图5A和5B分别显示了WNT受体在bEnd.3细胞和HRMEC中的表达。

IV.RSPO对FZD4 WNT替代物活性的作用

使用含有由WNT响应启动子控制的荧光素酶基因的bEnd.3或HRMEC细胞测量WNT信号传导活性。在最小启动子和七个LEF/TCF结合位点的串联体的控制下，用编码萤火虫荧光素酶报告基因的STF质粒瞬时转染细胞。在处理之前24小时，将经转染的细胞以每孔10,000个的密度接种在96孔板中，接着通过R2M3-3、R2M3-26、3SD10-3、3SD10-26、4SD1-3、4SD1-26(参见例如WO2019126398)连同或不连同20nM Rspo一起处理。用荧光素酶细胞培养裂解试剂(普洛麦格公司)裂解细胞，并使用供应商建议的程序用荧光素酶测定系统(普洛麦格公司)测量活性。将数据绘制为一式三份的平均值-/+标准偏差，并且使用Prism(GraphPad软件)通过非线性回归拟合。图6A-6F显示，在两个类型的内皮细胞中添加RSPO与不同的FZD4WNT替代物对WNT信号传导活性几乎没有显著影响。

V.氧诱导的视网膜病变

在出生后8小时内，将一窝斯普拉格-道利(Sprague-Dawley)大鼠幼崽及其母亲转移到氧气暴露室，其中它们经受24小时的交替的50％和10％氧气周期14天(即P1-P14)。在出生后第14天或P14(0)时，将暴露于氧气的大鼠送回到室内空气。它们在室内空气中再保持六天，P14(1)至P14(6)。年龄匹配的一窝大鼠也在室内空气(RA)中维持以充当对照。三组中的大鼠的每只眼睛在P7接受3μg抗EGFP Ab、0.3μg 4SD1-03或3μg 4SD1-03的玻璃体内注射，而在P14(0)，另一组中的大鼠接受抗VEGF处理的玻璃体内注射(参见例如图7A和7B中描绘的研究设计)。

在治疗后，在P14(6)处死所有大鼠，此时使用高分辨率数字图像的计算机辅助图像分析，在经同工凝集素-B4染色的视网膜平铺片中评估正常视网膜内血管生长和病理性视网膜前新生血管生成(NV)。TA：总面积。图8A-8B显示0.3μg 4SD1-3抑制新生血管簇形成的程度与抗VEGF治疗类似。这证明，在该视网膜病变模型中，FZD4 WNT替代物治疗具有与抗VEGF治疗类似的作用。

上文所描述的各种实施例可以组合以提供另外的实施例。本说明书中所提到和/或本申请数据表中所列出的所有美国专利、美国专利申请公开案、美国专利申请案、外国专利、外国专利申请案以及非专利出版物以其全文引用的方式并入本文中。必要时，可以修改这些实施例的各方面以使用各种专利、申请案以及公开案的观点来提供另外的实施例。可以根据以上详细描述对实施例进行这些和其它改变。

总体而言，在以下权利要求书中，所使用的术语不应理解为将权利要求书限制于本说明书和权利要求书中所公开的具体实施例，但应理解为包括所有可能的实施例以及这份权利要求书所有权获得的等效物的全部范围。因此，权利要求书不受本公开限制。

序列表

<110> 瑟罗泽恩公司(Surrozen, Inc.)

李阳(Li, Yang)

涂圣江(Tu, Shengjiang)

李圣真(Lee, Sungjin)

叶文琛(Yeh, Wen-Chen)

<120> 眼部病症中WNT信号传导的调节

<130> SRZN-013/01WO

<150> US 62/803,835

<151> 2019-02-11

<160> 8

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实验室制造-合成的WNT激动剂

<400> 1

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ser Ser Ala

35 40 45

Asn Ile Asn Ser Ile Glu Thr Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly

50 55 60

Lys Gln Arg Glu Leu Ile Ala Asn Met Arg Gly Gly Gly Tyr Met Lys

65 70 75 80

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Claims

1.一种治疗个体的视网膜病变的方法，其包含向所述个体施用经工程化的WNT信号传导调节剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述WNT信号传导调节剂是经工程化的WNT激动剂或经工程化的WNT拮抗剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述经工程化的WNT激动剂和经工程化的WNT拮抗剂包含结合到一种或多种Fzd受体的结合组合物和结合到一种或多种LRP受体或Tspan12受体的结合组合物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述经工程化的WNT激动剂的结合组合物选自由以下组成的组：Fzd4结合组合物、Lrp5结合组合物、Lrp6结合组合物、LRP5/6结合组合物和Tspan12结合组合物。

5.根据权利要求1所述的方法，包含施用经工程化的WNT激动剂和经工程化的WNT拮抗剂，其中所述经工程化的WNT激动剂和经工程化的WNT拮抗剂在视网膜病变的早期和/或晚期独立地施用。

6.根据权利要求1所述的方法，包含施用经工程化的WNT激动剂和经工程化的WNT拮抗剂，其中所述经工程化的WNT激动剂和所述经工程化的WNT拮抗剂在所述视网膜病变的早期和/或晚期依次施用。

7.根据权利要求1所述的方法，包含施用经工程化的WNT激动剂和经工程化的WNT拮抗剂，其中所述经工程化的WNT激动剂和经工程化的WNT拮抗剂在视网膜病变的早期和/或晚期共同施用。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述WNT激动剂在所述WNT拮抗剂之前或之后施用。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，包含施用经工程化的WNT激动剂和经工程化的WNT拮抗剂，其中所述WNT激动剂和/或所述WNT拮抗剂与对于VEGF和/或Ang2具有特异性的结合组合物一起施用。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述对VEGF或Ang2具有特异性的结合组合物是VEGF或Ang2活性的拮抗剂。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述VEGF拮抗剂选自由以下组成的组：贝伐单抗、雷尼单抗、阿柏西普、雷莫芦单抗和塔尼比单抗。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述Ang2拮抗剂选自由以下组成的组：奈斯伐单抗、AMG780和MEDI3617。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述视网膜病变是视网膜血管疾病。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述视网膜血管疾病由血管发育的抑制引起。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述视网膜病变由过度血管生成引起。

16.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述视网膜血管疾病选自由以下组成的组：熟悉的渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、渗出性玻璃体视网膜病变、诺里(Norrie)病、糖尿病性视网膜病变(DR)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、早产儿视网膜病变(ROP)、骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征(OPPG)、视网膜静脉阻塞和Coats病。