CN112566699A - 使用肽的联合疗法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种治疗肿瘤性疾病，特别是癌症的方法，该方法包括将寡肽化合物和检查点抑制剂的组合给药至受试者，所述寡肽化合物包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
Description
技术领域
本发明涉及一种寡肽化合物与检查点抑制剂的组合在癌症治疗中的用途。特别地，本发明提供一种对癌细胞具有选择性毒性(从而具有抗癌作用)的寡肽化合物，其与检查点抑制剂联合使用以用于治疗癌症。还提供包含这种寡肽化合物和检查点抑制剂的试剂盒和产品。
背景技术
肿瘤性疾病是以异常的细胞生长为特征的医学疾病。典型地，与肿瘤性疾病相关的异常细胞生长导致肿瘤(由于异常的细胞生长而形成的固体细胞团)的形成，尽管并非总是如此(特别是血液的肿瘤性疾病)。肿瘤性疾病可以是恶性的或良性的。良性肿瘤不能侵入邻近组织或转移(即不能扩散到所述肿瘤所存在的患者体内的其他位置)。然而，恶性肿瘤能够做到这两个事情。通常，恶性肿瘤被称为癌症。
在2010年(可获得详细统计数据的最近一年)，全世界死于癌症的人数(约800万人)比任何其他单一原因都要多(Lozano等，Lancet 380：2095-2128，2012)。此外，随着世界人口的老龄化，预计癌症发病率会增加。因此，迫切需要用于癌症的新的和改进的疗法。
WO 2011/092347公开了对肿瘤性细胞具有选择性细胞毒性的寡肽化合物。这些寡肽化合物包括由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(名为CyPep-1)组成的肽。如其中所详述的，并如以下实施例中所示，基于CyPep-1的肽具有巨大的潜力作为用于癌症的新治疗剂。CyPep-1不仅表明对体外癌细胞具有选择性细胞毒性，还表明在动物疾病模型中具有强大的抗肿瘤作用和良好的耐受性。
CyPep-1是一种融合肽，其基于与HIV-TAT细胞穿透肽的C末端偶联的肿瘤抑制蛋白Conductin/Axin2的片段。HIV-TAT细胞穿透肽是一种阳离子肽，并且不受理论的束缚，人们认为CyPep-1的选择性细胞毒性是由于癌细胞膜所具有的负电荷所致(相反，非癌性哺乳动物细胞倾向于具有带有更中性电荷的膜)。有益的是，CyPep-1还具有抗菌特性(也可能是由于许多细菌细胞膜具有负电荷)，并且已表明对与医学相关的革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的种类具有有效的杀菌作用(参见WO 2011/092347)。
免疫检查点抑制剂(以下简称“检查点抑制剂”)是一个相对较新的抗癌药物家族，其通过激活患者的免疫系统以攻击癌细胞来发挥作用。检查点抑制剂通过阻断免疫检查点的活性来起作用。免疫检查点通过防止杀死健康细胞和自身免疫来控制免疫系统。它们通过防止T细胞激活来充当免疫系统的“刹车”。检查点蛋白在免疫细胞表面表达，并与靶细胞或抗原呈递细胞表面的检查点配体结合，从而导致免疫细胞活性被抑制。
免疫检查点最著名的实例是PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)，其由T细胞表达并结合细胞(包括靶细胞、淋巴细胞和抗原呈递细胞)表面表达的PD-L1(程序性死亡配体1)和PD-L2。通过PD-L1或PD-L2的结合来激活PD-1会抑制T细胞的激活和增殖。因此，癌细胞对PD-L1和/或PD-L2的上调作为一种防止其被T细胞破坏的保护机制。肿瘤附近的健康细胞对PD-L1和/或PD-L2的上调对免疫反应具有类似的削弱作用。另一个重要的免疫检查点是CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞抗原-4)，它也在T细胞(主要是CD4+T细胞)的表面表达。CTLA-4与抗原呈递细胞表面的CD80和CD86结合。CD80和CD86也是T细胞共刺激受体CD28的配体。与CD28相比，CTLA-4对CD80和CD86的亲和力要高得多，这意味着T细胞对CTLA-4的高表达导致在与CD28对CD80/CD86结合竞争中会胜出，从而通过抑制共同刺激来下调T细胞活性。检查点抑制剂通过阻止(通常是阻断)免疫检查点与其配体之间的相互作用来起作用，从而上调免疫细胞的活性。免疫检查点及其在癌症治疗中的阻断作用已在Topalian等，Cancer Cell 27:450-461，2015中进行了综述。
尽管检查点抑制剂有很强的前景，但检查点抑制剂在癌症治疗中的临床试验结果好坏参半。尽管已经取得了显著成功，但通常仅在相对较小比例的患者中或仅在患有非常特定类型癌症的患者中观察到了对检查点抑制剂的反应。许多检查点抑制剂已经接受了试验，无论是作为单一疗法，还是在使用检查点抑制剂和第二抗癌治疗剂的联合疗法中。尽管已发现这些疗法的一些非常有效(参见例如Robert等，N Engl J Med 372：2521-2532，2015，其报道了抗PD-1抗体派姆单抗(pembrolizumab)在黑色素瘤治疗中的成功，以及Liu等，Nature Communications 8：14754，2017，其公开了检查点抑制剂与溶瘤病毒在动物模型中成功联合)，但许多试验都失败了(例如，小分子epacadostat(Incyte，美国)与派姆单抗联合用于黑色素瘤治疗的试验在未能改善受试者的无进展生存期后停止，请参见Incyte和MSD于2018年4月6日就此发布的新闻稿)。检查点抑制剂和特定的第二治疗剂的联合是否会成功是无法预测的。
发明内容
如本文所详述，本发明人惊奇地发现，使用CyPep-1和检查点抑制剂来治疗癌症的联合疗法会产生有益的效果。特别地，我们已经表明，通过联合使用可以增强检查点抑制剂的功效。此外，通过将CyPep-1与检查点抑制剂联合使用可增强其功效。例如，与使用CyPep-1的单一疗法相比，可以使用更低剂量的CyPep-1。因此，将CyPep-1肽与检查点抑制剂联合的组合与单独的肽或单独的检查点抑制剂相比会导致增强的治疗效果。特别地，在某些实施方案中，认为发生了协同效应，并且数据支持该联合引起两种药物效果的协同增强。已发现将检查点抑制剂疗法与CyPep-1疗法联合会增强小鼠模型中对肿瘤的免疫反应，这表现为淋巴细胞对肿瘤的浸润增加。这种联合非常有利，为许多癌症患者提供了一种新的增强的治疗选择。
特别令人感兴趣的是，在对单独用检查点抑制剂的疗法无反应的患有肿瘤的受试者中观察到对治疗的增强反应(例如协同反应)。与将检查点抑制剂与其他癌症治疗剂(例如化学治疗剂、免疫治疗剂或溶瘤病毒)联合的治疗相比，该联合具有多种优势。如上所述，CyPep-1在动物模型中具有良好的耐受性，因此比化学治疗剂和免疫治疗剂具有更少的副作用，并且与传染性的溶瘤病毒相比对患者和医护人员都更安全。因此，本发明提供一种用于癌症的新的并且高度有利的联合疗法。如WO 2011/092347中所述，可以制备基于CyPep-1的序列(SEQ ID NO:1)的寡肽化合物，其包括拟肽化合物和包含SEQ ID NO:1全部或部分的肽序列，或基于SEQ ID NO:1的序列变体。此外，寡肽化合物可包括一个或多个D-氨基酸，和/或一个或多个经化学修饰的氨基酸残基。
因此，在第一方面，本发明提供一种寡肽化合物，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，用于治疗肿瘤性疾病，其中所述寡肽化合物具有抑制肿瘤性细胞的生长和/或存活力的活性，并且所述治疗包括将所述寡肽化合物和检查点抑制剂给药至受试者。
在一个相关方面，本发明提供一种治疗肿瘤性疾病的方法，该方法包括将寡肽化合物和检查点抑制剂给药至需要的受试者，所述寡肽化合物包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。特别地，所述寡肽化合物和所述检查点抑制剂各自以有效量给药至所述受试者。更特别地，当联合给药时，有效量对于治疗肿瘤性疾病是有效的。
在另一个相关方面，本发明提供包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的寡肽化合物在制备用于治疗肿瘤性疾病的药物中的用途，其中所述肿瘤性疾病的治疗包括将所述药物和检查点抑制剂给药至受试者。
在另一方面，本发明提供一种试剂盒，该试剂盒包括寡肽化合物和检查点抑制剂，所述寡肽化合物包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供一种产品，所述产品包括用于在受试者的肿瘤性疾病的治疗中单独、同时或顺序使用的寡肽化合物和检查点抑制剂，所述寡肽化合物包含SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
如上所述，已经观察到寡肽化合物和检查点抑制剂之间的协同作用(即，两种组分在联合时协同作用，或具有协同作用)。因此，在某些实施方案中，寡肽化合物和检查点抑制剂对治疗肿瘤性疾病协同有效。寡肽化合物和检查点抑制剂可以以获得协同作用的量给药至受试者(换言之，所述化合物和抑制剂可以以协同量使用)。特别地，可以观察协同作用，使得将寡肽化合物和检查点抑制剂联合的疗法的治疗效果大于单独使用相同量的检查点抑制剂的疗法和单独使用相同量的寡肽化合物的疗法的累积效果。可以基于例如肿瘤体积变化或本领域中用于测量肿瘤性疾病的治疗功效的任何其他可量化变量来量化治疗的效果。
如上所述，SEQ ID NO:1的寡肽化合物在WO 2011/092347中公开。SEQ ID NO:1由与HIV-TAT细胞穿透肽的C-末端偶联的肿瘤抑制蛋白Conductin/Axin2的片段组成。上述的Conductin/Axin2的片段具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:1的13-27号氨基酸)，并且HIV-TAT细胞穿透肽具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列(对应于SEQ IDNO:1的1-12号氨基酸)。
如本文所用，术语“寡肽化合物”是指由通过肽键或等效键连接在一起的氨基酸或等效亚单元构成的化合物。因此，术语“寡肽化合物”包括肽和拟肽。
“等效亚单元”是指在结构上和功能上与氨基酸相似的亚单元。亚单元的骨架部分可以不同于标准氨基酸，例如骨架部分可以包含一个或多个氮原子而不是一个或多个碳原子。
“拟肽”是指在功能上与肽等同或相似，并且可以采用类似于其肽对应物的三维结构的化合物，但所述化合物不是仅由通过肽键连接的氨基酸构成。一类优选的拟肽是类肽，即N-取代的甘氨酸。类肽与其天然的肽对应物密切相关，但它们在化学上的不同之处在于，它们的侧链是附着在沿着分子主链的氮原子上，而不是像他们在氨基酸中那样附着在α-碳上。
拟肽通常在患者体内具有更长的半衰期，因此在需要更持久效果的实施方案中它们是优选的。这可以帮助降低必须重复给药的组合物的频率。然而，出于生物安全的原因，在其他实施方案中，较短的半衰期可能是优选的；在那些实施方案中，肽是优选的。
优选地，所述寡肽化合物为寡肽。寡肽化合物可以包含二氨基酸和/或β-氨基酸。最优选地，寡肽化合物由α-氨基酸组成。
寡肽是由彼此之间通过肽键连接的氨基酸形成的聚合物。如本文所定义，寡肽包含至少三个氨基酸，尽管显然根据本发明使用的寡肽化合物包含三个以上的氨基酸。如本文所定义的寡肽化合物或寡肽没有特定的最大长度，例如其可以包含多达30、40、50或100个氨基酸或更多，但通常前缀“寡(oligo)”用于表示相对少量的亚单元(例如氨基酸)，即少于200个，优选少于100、90、80、70、60或50个亚单元。因此，本发明的寡肽化合物可以包含至少23个且不超过200个亚单元。在实施方案中，所述寡肽化合物包含至少24、25、26或27个亚单元。或者，定义其包含不超过50、45、40、35、30、29、28或27个亚单元。因此寡肽化合物可以包含一定范围内的多个亚单元，所述范围由上文所列出的最小亚单元数或最大亚单元数的任何整数构成。因此，代表性的亚单元范围包括23-150、23-100、23-80、23-50、23-40、23-30、25-150、25-100、25-80、25-50、25-40、25-30、26-150、26-100、26-80、26-50、26-40、26-30、27-150、27-100、27-80、27-50、27-40、27-30、27-29和27-28。
本文所定义的寡肽化合物可以简单地为寡肽，即由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物。或者，所述寡肽化合物可以包含额外的官能团、缀合物等。
根据本发明使用的寡肽化合物包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与其具有至少85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，所述寡肽化合物包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述寡肽化合物由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与其具有至少85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，所述寡肽化合物由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。
两个序列之间的序列同一性水平(例如寡肽序列和SEQ ID NO:1所示的序列)可以通过进行序列比对来确定。可以使用任何合适的方法来进行序列比对，例如计算机程序，例如EMBOSS Needle或EMBOSS Stretcher(均在Rice，P.等，Trends Genet.16(6)：276-277，2000中描述)可用于成对序列比对，而Clustal Omega(Sievers，F.等，Mol.Syst.Biol.7:539,2011)或MUSCLE(Edgar,R.C.,Nucleic Acids Res.32(5):1792-1797,2004)可以用于多序列比对。这样的计算机程序可以以标准输入参数进行使用，所述标准输入参数例如为标准Clustal Omega参数：矩阵Gonnet、空位开放罚分6、空位延伸罚分1；或标准EMBOSSNeedle参数：矩阵BLOSUM62、空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5。或者也可以使用任何其他合适的参数。
根据本发明使用的寡肽化合物可以仅包含蛋白原氨基酸(即，由标准遗传密码编码的L-氨基酸)。或者，根据本发明使用的寡肽化合物可以包含一个或多个非蛋白原氨基酸。例如，根据本发明使用的寡肽化合物可以包含一个或多个D-氨基酸(例如，至少1、2、3、4、5、6、7或8个D-氨基酸)、人类工程的氨基酸或天然的非蛋白原氨基酸，例如通过代谢过程形成的氨基酸。可以使用的非蛋白原氨基酸的实例包括鸟氨酸(尿素循环的产物)和人工修饰的氨基酸，例如9H-芴-9-基甲氧基羰基(Fmoc)-、叔丁氧基羰基(Boc)-和2,2,5,7,8-五甲基色烷-6-磺酰基(Pmc)-保护的氨基酸，以及具有羧基苄基(Z)基团的氨基酸。
本发明的寡肽化合物的体外和/或体内稳定性可以通过使用本领域已知的稳定手段或保护手段来改善或增强，例如添加保护基团或稳定基团、掺入氨基酸衍生物或类似物或化学修饰氨基酸，这种保护基团或稳定基团可以例如添加在N和/或C-末端。这种基团的一个实例是乙酰基和其他保护基团，或本领域已知的可以稳定肽的基团。
完全由L-氨基酸组成的肽在本领域中被称为L-肽，而完全由D-氨基酸组成的肽在本领域中被称为D-肽。术语“翻转肽(inverso-peptide)”用于表示具有与L-肽相同的氨基酸序列，但是完全由D-氨基酸组成的肽(即，具有与相应的L-肽相同序列的D-肽)。翻转肽具有与其相应的L-肽(即具有相同氨基酸序列的L-肽)对应的镜像结构。翻转肽能够有利于在临床环境中使用(相对于L-肽)，因为它们通常不易被血清蛋白酶降解(由于其非天然构象，翻转肽可能无法被蛋白酶识别)。在一个特定的实施方案中，根据本发明使用的寡肽化合物是翻转化合物，其每个氨基酸都是D-氨基酸。寡肽化合物可以特别包括由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列所组成的D-肽，或由所述D-肽组成。
根据本发明使用的寡肽化合物具有抑制肿瘤性细胞的生长和/或存活力的活性。细胞的“抑制生长”是指细胞任何方面的生长(为细胞大小或其成分的量和/或体积的增加，但更特别为细胞数量的增加)被降低，更特别为可测量地降低。因此，术语“生长”明确地包括细胞的复制或增殖。细胞的生长速率，例如就细胞数增加的速率而言，可以被降低。举例来说，可以将生长(例如细胞数目或生长速率)降低至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。在某些情况下，生长可以降低100％，即生长可以被完全抑制并停止。因此，可以降低或抑制细胞的复制或增殖。如上所述，术语“抑制”包括任何程度的生长降低。
可以通过比较在标准实验室条件下并且在不存在感兴趣的寡肽化合物的情况下培养的对照细胞或细胞群的生长速率与在感兴趣的寡肽化合物存在下但在其他条件与对照细胞或细胞群相同的条件下培养的相同或相应细胞或细胞群的生长速率，来鉴定细胞生长的抑制作用。特别地，细胞复制或增殖的速率可以通过确定选定时间点的细胞数量来评估。在存在寡肽化合物的情况下培养的群体中的细胞数量相对于对照群体中的细胞数量减少表明，寡肽化合物具有抑制细胞生长的活性。可以通过细胞计数，例如使用血球计数器来确定细胞数目(并因此确定生长或其他)。
细胞的“抑制存活力”包括降低细胞存活力或使其难以存活或丧失存活力的任何作用。细胞的存活力可以被视为细胞在给定条件下存活的能力。抑制细胞存活力特别包括杀死或破坏细胞，即，使其死亡。细胞死亡可以通过任何标准实验室技术来评估。例如，细胞或细胞群不能生长，包括不能复制，或不能利用或吸收养分，则可以认为指示细胞死亡(即缺乏存活力)。也可以通过监测细胞或其中包含所述细胞的组织(例如肿瘤)的形态学变化来评估细胞存活力。可以通过显微镜来分析形态学变化，例如，在对细胞或组织进行视觉分析时，细胞坏死或细胞溶解可能是明显的，表明缺乏存活力。通常，如果细胞膜完整性丧失，就可以认为细胞死亡。
例如，可以通过比较在标准实验室条件下并且在不存在感兴趣的寡肽化合物的情况下孵育的对照细胞或细胞群的存活力与在感兴趣的寡肽化合物存在下但在其他条件与对照细胞或细胞群相同的条件下孵育的相同或相应细胞或细胞群的存活力，来鉴定存活力的抑制作用。如技术人员已知的，通常使用结晶紫试验来评估细胞存活力。在这样的试验中，使粘附于表面(例如培养板)的细胞单层与感兴趣的化合物接触(或不接触)。细胞死亡导致细胞从表面脱离。与感兴趣的化合物接触后，洗涤单层以除去脱离的细胞，然后用结晶紫染色，结晶紫结合蛋白质和DNA，从而染色细胞。染色水平可用于确定存活力，即，如果与感兴趣的化合物接触的细胞群的染色少于对照群体，则可以认为感兴趣的化合物抑制细胞的存活力。细胞群的结晶紫染色水平可以视觉确定(仅通过肉眼)，或通过使用甲醇进行染料提取，然后通过光谱法确定在570nm下甲醇提取的染料的光密度来定量地确定。
许多用于确定肿瘤性细胞的存活力或生长的其他方法是本领域公知的，并且许多常规试验可用于确定细胞是活的(有存活力的)还是死的。一种选择是视觉评估感兴趣细胞的细胞死亡的形态学特征，例如坏死的或凋亡小体、膜泡、核浓缩以及DNA裂解成规则大小的片段、细胞膜破裂并且细胞内含物泄漏到细胞外环境中。其他方法利用了死细胞中细胞膜完整性的特征丧失。膜不渗透性染料(例如台盼蓝和碘化丙啶)通常用于评估膜的完整性。这些染料被排除在完整的细胞之外，因此在这些细胞中不会发生染色。如果细胞膜完整性受到损害，则这些染料可以进入细胞并染色细胞内组分。替代地或另外地，只对具有完整膜的细胞染色的染料可用于指示细胞的存活力。可从赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)获得的LIVE/DEAD细胞存活力试验是一种使用两种不同颜色的染料的试验，一种染料对死细胞染色，另一种染料对活细胞染色，从而使每一种都能被鉴别。合适的活细胞特异性染料的实例包括钙黄绿素AM(绿色)和C12-刃天青(红色)；合适的死细胞特异性染料的实例包括乙锭均二聚物-1(ethidium homodimer-1)(红色)、碘化丙啶(红色)和SYTOXGreen。评估膜完整性的另一种方法是检测释放到培养基中的细胞组分，如乳酸脱氢酶。
另一个选择是测量细胞的代谢。这可以以多种方式常规完成，例如可以测量ATP水平。只有具有完整膜的活细胞才能合成ATP，因为ATP不存储在细胞中，所以在细胞死亡后ATP水平会迅速下降。因此，监测ATP水平可指示细胞状态。另一个选择是测量细胞的还原电位。代谢养分的活细胞产生还原剂(例如NADH和NADPH)，因此通过向细胞施用可以以还原形式或氧化形式给出不同输出的标记物(例如荧光染料)，从而可以评估细胞的还原电位。缺乏还原标记物能力的细胞可以被认为是死亡的。MTT和MTS试验是此类试验的方便实例。
如上所述，根据本发明使用的寡肽化合物具有抑制肿瘤性细胞的生长和/或存活力的活性。因此，寡肽化合物可以具有抑制肿瘤性细胞生长的活性，其可以具有抑制肿瘤性细胞存活力的活性，或者其可以具有抑制肿瘤性细胞的生长以及抑制肿瘤性细胞存活力的活性。优选地，所述寡肽化合物具有抑制肿瘤性细胞存活力的活性，更优选地具有抑制肿瘤性细胞的生长和存活力的活性(显然，具有抑制肿瘤性细胞存活力的活性的化合物可能也具有抑制肿瘤性细胞生长的活性，尽管反过来不一定如此)。
如本文所用，术语“肿瘤性细胞”是指相对于健康细胞表现出异常、过度生长的细胞。肿瘤性细胞源自肿瘤。肿瘤是一种组织生长，其以异常并且过度的方式生长，与周围健康组织的生长不协调。术语“肿瘤”涵盖癌症，特别地，肿瘤性细胞可以是癌细胞。因此，根据本发明使用的寡肽化合物具有抑制癌细胞的生长和/或存活力的活性。肿瘤性细胞以不受限制的方式分裂，并且可以是“永生的”，也就是说，端粒酶表达并因此能够继续无限分裂，而不是像健康细胞一样达到其Hayflick极限后死亡或衰老。技术人员能够确定一个特定细胞是肿瘤性的还是健康的。肿瘤性细胞通常表现出有区别的组织学特征，从而使其能够被鉴别，例如，细胞核大并且不规则，细胞质内异常。还可以通过基因测试来确定细胞是否为肿瘤性的。
根据本发明使用的寡肽化合物具有抑制体内和体外肿瘤性细胞的生长和/或存活力的活性。可以使用合适的细胞系在体外方便地确定这种活性。许多实验室细胞系是肿瘤性的，由于它们具有“永生性”，因此便于研究使用。任何这种肿瘤性细胞系都可以用于确定感兴趣的化合物的活性，例如细胞系A172(人胶质母细胞瘤)、GAMG(人胶质母细胞瘤)、U87(人胶质母细胞瘤)、4T1(鼠乳腺癌)、HOS(人骨肉瘤)和MC38(鼠结肠癌)。技术人员还已知许多其他细胞系。这种细胞可以从任何合适的来源获得，例如细胞保藏所，例如ATCC(美国)。优选使用哺乳动物肿瘤性细胞确定感兴趣的化合物的活性。可以使用人类肿瘤性细胞。
肿瘤性细胞也可以从受试者(例如，人类癌症患者)获得。肿瘤性细胞可以通过手术从癌症患者取出，并在其上测试感兴趣的寡肽化合物的活性。因此，肿瘤性细胞可以来自肿瘤性细胞系，或源自临床样品或兽医学样品。肿瘤性细胞可以源自肿瘤，并且可以是良性或恶性的。如果肿瘤性细胞是癌细胞，则它可能来自任何癌症。下面将对癌症进行更详细的描述。特别地，根据本发明使用的寡肽化合物具有抑制人类癌细胞的生长和/或存活力的活性。
在一个特定的实施方案中，根据本发明使用的寡肽化合物对癌细胞具有选择性细胞毒性。如本文所用，术语“细胞毒性”具有与如上所述的“抑制…的存活力”基本上相同的含义。换句话说，寡肽化合物选择性地抑制癌细胞的存活力或杀死癌细胞(或更优选地通常抑制肿瘤性细胞的存活力)。
如果一种化合物对癌细胞的细胞毒性作用大于对非癌细胞的细胞毒性作用，特别是如果该化合物对癌细胞的细胞毒性作用大于对健康细胞的细胞毒性作用，则可以说该化合物对癌细胞具有选择性细胞毒性。优选地，根据本发明使用的寡肽化合物对健康的非癌细胞没有影响或影响很小，但是对癌细胞具有细胞毒性。以这种方式，可以避免对非癌细胞的不需要的细胞毒性作用，从而降低了被给药寡肽化合物的患者的毒性和不需要的副作用。
上文描述了可以分析感兴趣的化合物对细胞生长和存活力的影响的方法。可以通过所述方法确定感兴趣的化合物是否对癌细胞具有选择性细胞毒性。但是，与其将暴露于感兴趣的化合物的肿瘤细胞群的存活力与未暴露于感兴趣的化合物的相应细胞群的存活力进行比较，不如将与感兴趣的化合物接触的癌细胞群的存活力和与感兴趣的化合物接触的健康细胞群的存活力进行比较。如果在相同条件下与感兴趣的化合物接触后，癌细胞群的存活力比健康细胞群的存活力降低得更多，则可以说该感兴趣的化合物对癌细胞具有选择性细胞毒性。
根据本发明使用的寡肽化合物还可以具有抑制微生物细胞，特别是细菌细胞的生长和/或存活力的活性。也就是说，寡肽化合物可以特别具有抑菌或杀菌活性。寡肽化合物的抗菌活性可以通过抗生素敏感性测试的任何标准方法来确定。这样的方法包括例如，盘扩散法(disc diffusion)(在WO 00/55357中描述)，并且在本领域中是公知的。
感兴趣的寡肽化合物的抗菌活性可以通过测试其对任何细菌种类的活性来确定。革兰氏阳性和革兰氏阴性种类均合适，包括致病性和非致病性种类。可以确定感兴趣的化合物的抗菌活性的示例性种类包括大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。根据本发明使用的寡肽化合物还可以对其他形式的微生物(例如，古生菌和真菌)具有抗微生物活性。这种活性可以类似于上述活性进行测试。由于诸如恶性肿瘤本身导致的虚弱以及因化疗或其他侵袭性治疗对免疫系统造成损害等因素，癌症患者比一般人群更容易受到微生物感染。因此寡肽化合物的抗菌活性是高度有利的，因为给药所述寡肽化合物对癌症患者提供了针对感染的保护，并且对其癌症是有治疗活性的。
本文所述的寡肽化合物可以由技术人员使用标准生化技术合成。如果寡肽化合物是仅包含蛋白原氨基酸的L-肽，则其可以通过重组DNA技术合成。也就是说，可以克隆编码所述寡肽化合物的DNA序列，并且将其引入表达载体。编码根据本发明使用的寡肽化合物的DNA序列包含编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，或由编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列组成。这样的核苷酸序列可以由技术人员毫无困难地产生和合成。
编码本文所述的寡肽化合物的DNA序列可以使用本领域已知的标准方法通过由模板扩增产生，例如通过PCR，或通过人工基因合成。然后可以使用标准分子克隆技术，例如限制酶或Gibson组装，将编码所述寡肽化合物的DNA序列引入表达载体。合适的表达载体是本领域已知的。然后可以使用标准技术将表达载体引入细胞表达系统。合适的表达系统可以包括细菌细胞和/或真核细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。鉴于本文所述的寡肽化合物可能对细菌细胞有毒性(如上所述)，真核细胞可能是更合适的用于生产所述寡肽化合物的细胞表达系统。
无细胞的体外蛋白质表达系统可以代替细胞表达系统用于合成根据本发明使用的L-肽化合物。在这样的系统中，在体外将编码所述寡肽化合物的核苷酸序列转录成mRNA，并将所述mRNA翻译成蛋白质。无细胞表达系统试剂盒可广泛商购获得，并且可以从例如赛默飞世尔科技(美国)购买。
或者，根据本发明使用的寡肽化合物可以在非生物系统中化学合成。特别是包含D-氨基酸或其他非蛋白原氨基酸的寡肽化合物可以被化学合成，因为在这种情况下通常不可能生物合成。液相蛋白合成或固相蛋白合成可用于产生可形成或被包含在用于本发明的寡肽化合物内的多肽。这些方法是技术人员公知的，技术人员可以使用本领域常见的适当方法容易地生产寡肽化合物。
本发明提供如上所述的寡肽化合物，其用于治疗受试者的肿瘤性疾病。如本文所定义的“肿瘤性疾病”是一种以一种或多种肿瘤的发展为特征的医学状况。因此，术语“肿瘤性疾病”涵盖非恶性(即良性)肿瘤、恶性前肿瘤和恶性肿瘤(即癌症)。根据本发明，给药寡肽化合物和检查点抑制剂的受试者是患有肿瘤性疾病的受试者。
根据本发明，上文定义的寡肽化合物与检查点抑制剂联合使用以治疗肿瘤性疾病。如上所述，检查点抑制剂是与免疫检查点结合并且抑制其功能的试剂。
免疫检查点是免疫系统的调节剂，其功能是促进免疫细胞的抗原特异性激活并实现自我耐受，从而支持针对抗原靶标的免疫活性，并且防止自身免疫性疾病和针对宿主组织的异常免疫系统活性。免疫检查点可以是刺激性的或抑制性的。刺激性免疫检查点通过与其同源配体或激动剂结合时刺激增殖和效应子反应，从而起到增强针对抗原靶标的免疫细胞活性的作用。刺激性免疫检查点的实例包括CD28，其作为T细胞活性的共刺激因子，并且在与其配体(CD80和CD86)结合后启动T细胞的增殖。
抑制性免疫检查点在通过其同源配体或激动剂结合后下调或抑制免疫细胞功能，从而促进自我耐受并防止可能对宿主造成损害的自身免疫活性或过度且异常的免疫反应，例如细胞因子风暴。但是，如上所述，激活抑制性免疫检查点可以阻止免疫系统靶向癌细胞。如上所述，这种抑制性免疫检查点的实例包括PD-1和CTLA-4。如本文(通常为本领域)所定义的检查点抑制剂是一种抑制抑制性免疫检查点活性的试剂。除了明确定义其含义的以上段落以外，在整个本公开中，术语“免疫检查点”是指抑制性免疫检查点。
如本文所定义，检查点抑制剂是指结合免疫检查点或免疫检查点配体并且直接起到防止免疫检查点激活的作用的任何试剂。因此，检查点抑制剂可以是免疫检查点的拮抗剂。所有目前可用的检查点抑制剂均通过阻断其靶标免疫检查点(即与免疫检查点或其配体结合)并且因此防止检查点与配体之间的相互作用(一种称为免疫检查点阻断的机制)而起作用。然而，用于本发明的检查点抑制剂与寡肽化合物联合可以通过任何机制起作用，包括免疫检查点阻断、免疫检查点的非竞争性抑制、免疫检查点(或其配体)的共价或结构改变等。理想地，检查点抑制剂应使癌细胞暴露于免疫系统，而不会引起所述系统攻击健康组织。
因此，检查点抑制剂可以是结合免疫检查点或免疫检查点配体并且抑制免疫检查点活性的任何试剂。检查点抑制剂可以是例如小分子、配体拮抗剂、affimer或抗体。如本文所指，抗体可以是天然抗体或合成抗体，或其片段或衍生物。术语“抗体”在本文中广泛使用以包括任何类型的抗体或基于抗体的分子。这不仅包括天然抗体分子，而且包括修饰的、合成的或重组的抗体，及其衍生物或片段。因此，抗体可以是具有一个或多个基于抗体的结合区(即一个或多个衍生自抗体的结合域)的任何分子或实体或构建体。因此，抗体可以选择性地定义为包含从抗体获得或衍生的抗原结合域的结合分子。所述抗体可以是任何方便的或所期望的种类、类别或亚型的抗体，或者可以源自/基于任何方便的或所期望的种类、类别或亚型的抗体。如上所述，所述抗体可以是天然的、衍生的或合成的。它可能是单克隆的或多克隆的。因此，所述抗体可以与单个表位结合，也可以是与不同表位结合的抗体(或抗体分子)的混合物。
因此，检查点抑制剂可以是结合分子，其包含来自对免疫检查点或其配体具有特异性(或针对)的抗体的抗原结合域。这种“抗体”(即基于抗体的结合分子)的实例包括单克隆抗体和多克隆抗体、抗体片段(包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段以及缺少Fc区的任何片段)、嵌合的(例如人源化的或CDR接枝的)抗体、单链抗体(例如scFv抗体)、从噬菌体展示中鉴定或者获得的抗体等。在一个特定的实施方案中，所述检查点抑制剂是单克隆抗体。
Affimer是经过工程改造的非抗体蛋白，其模拟抗体与靶标的结合。Affimer衍生自半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)蛋白家族，并且具有位于反平行β-折叠顶部的α-螺旋的共同结构。在WO 2009/136182中描述了Affimer及其生成方法。
在本发明的一个特定实施方案中，检查点抑制剂抑制PD-1的活性。检查点抑制剂可以特别阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用(或PD-1和PD-L2之间的相互作用)，从而阻止PD-1激活(如上所述，PD-1激活会抑制T细胞效应子功能)。阻断PD-1和PD-L1/PD-L2之间相互作用的检查点抑制剂与这些蛋白中的一种结合，并防止两种蛋白之间发生相互作用。因此，阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂可以与PD-1结合或者可以与PD-L1或PD-L2结合。在优选的实施方案中，检查点抑制剂与PD-1或PD-L1结合。特别是，这种检查点抑制剂可以与PD-1的PD-L1结合位点或PD-L1的PD-1结合位点结合。为了阻断PD-1与PD-L1和PD-L2两者之间的相互作用，使用结合PD-1以阻断PD-1与其配体之间的相互作用的检查点抑制剂可能是有利的。
在本发明的特定实施方案中，阻断PD-1和PD-L1/PD-L2之间相互作用的检查点抑制剂是结合PD-1的抗体(优选单克隆抗体，或其衍生物或片段)。在其他实施方案中，阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂是结合PD-L1的抗体(优选单克隆抗体，或其衍生物或片段)。许多这样的抗体是本领域已知的，例如纳武单抗(Nivolumab)(百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb))，一种人单克隆抗PD1 IgG4抗体；派姆单抗(Pembrolizumab)，一种人源化IgG4抗PD-1抗体(默克(Merck))；阿特珠单抗(Atezolizumab)，一种完全人源化的抗PD-L1抗体(基因泰克(Genentech))；度伐单抗(Durvalumab)，一种人抗PD-L1抗体(Medimmune/Astrazeneca)，均已获得监管部门批准，并且可以根据本发明使用。许多其他这样的抗体目前正在开发/试验中，例如替雷利珠单抗(Tislelizumab)，一种人源化抗PD-1抗体(百济神州(BeiGene))；Avelumab，一种完全人抗PD-L1抗体(辉瑞/默克公司(Pfizer/Merck))，并且也可以根据本发明使用。类似地，结合PD-L2的抗体(优选单克隆抗体，或其衍生物或片段)可以用于阻断PD-1和PD-L2之间的相互作用。
如上所述，可以由检查点抑制剂靶向的另一个免疫检查点是CTLA-4。因此，在另一个实施方案中，检查点抑制剂阻断CTLA-4与其配体CD80和CD86之间的相互作用。如以上关于PD-1/PD-L1相互作用所详细描述的，阻断CTLA-4和CD80/CD86之间相互作用的试剂与这些蛋白质中的一种结合并阻止CTLA-4与CD80和/或CD86相互作用。这样的试剂可以结合CTLA-4、CD80或CD86。然而，如上所详述的，CD80和CD86也通过与CD28结合而起到T细胞的共刺激分子的作用。因此，任何阻断CTLA-4与CD80/CD86之间相互作用的检查点抑制剂均不得阻断CD28与CD80/CD86之间的相互作用。因此，阻断CTLA-4和CD80/CD86之间相互作用的检查点抑制剂优选结合CTLA-4而不是CD80和/或CD86。特别地，检查点抑制剂可以在与CD80或CD86相互作用的结合位点结合CTLA-4。
在一个特定的实施方案中，阻断CTLA-4和CD80/CD86之间相互作用的检查点抑制剂是结合CTLA-4的抗体(优选单克隆抗体，或其衍生物或片段)。许多这样的抗体是本领域已知的，例如伊匹单抗(Ipilimumab)，一种人IgG1单克隆抗体(百时美施贵宝)，已获得监管部门批准。其他此类抗体正在研发/试验中，例如替西利姆单抗(Tremelimumab)，一种人IgG2单克隆抗体(Medimmune/Astrazeneca)。
如上所述，PD-1和CTLA-4在T细胞上表达。PD-1和CTLA-4抑制作用被设计为促进T细胞活性，因此如果将靶向PD-1或CTLA-4的抗体用作检查点抑制剂，则可能优选的是所述抗体与其靶标的结合不会引发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，抗体依赖性细胞毒性可能导致靶标T细胞死亡。ADCC主要由天然杀伤(NK)细胞介导，天然杀伤细胞表达Fc受体(例如CD16)，该受体识别并结合与靶抗原结合的抗体的Fc(即恒定)结构域。NK细胞的Fc受体与抗原结合抗体的Fc结构域的结合导致NK细胞激活，NK细胞释放出细胞毒性剂，杀死与抗体结合的细胞。
能够结合靶细胞而不诱导ADCC的抗体可以是不与ADCC活性相关的特定IgG亚类，或者可以通过引入点突变来抑制Fc受体结合而合理设计的。对于技术人员而言，这种合理设计是简单的。例如，人IgG4恒定区中第228位的突变可以阻止抗体的Fc受体结合。因此，纳武单抗(Nivolumab)和派姆单抗(Pembrolizumab)(如上所述，二者都是人IgG4抗体)在其恒定区中均含有S228P突变，该突变阻止Fc受体结合，这意味着这两种抗体均不介导ADCC。用作根据本发明的检查点抑制剂的针对PD-1的任何抗体可以包含相同或等效的突变。等效突变是指在不同残基(或不同抗体亚型的恒定区中的相应残基)处具有相同作用(即抑制Fc受体结合)的突变。
然而，在其他情况下，检查点抑制剂能够介导ADCC可能是优选的。已表明抗CTLA-4抗体伊匹单抗介导针对Treg细胞的ADCC，由非典型CD16表达单核细胞介导，从而提供防止免疫效应细胞下调的第二种机制(Romano等，PNAS 112(19)6140-6145，2015)。
尽管不太突出，但除PD-1和CTLA-4以外的其他免疫检查点也是已知的，并且可以被检查点抑制剂靶向。例如，LAG-3(也称为CD223)是由T细胞表达的免疫检查点，其结合MHCII类蛋白(比CD4具有更高的亲和力)。LAG-3与MHC II类的结合下调细胞增殖和效应子功能。还认为LAG-3在激活Treg细胞的免疫抑制作用中发挥作用。抑制LAG-3活化的试剂可以用作根据本发明的检查点抑制剂。这种试剂可以阻断LAG-3与MHC II类之间的相互作用。特别地，这种试剂可以是结合LAG-3的抗体，许多此类抗体正在开发中，例如BMS-986016(百时美施贵宝)。
在另一可替代的方法中，杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的抑制剂可以用作检查点抑制剂。KIR是NK细胞上的一种受体，其下调NK细胞的细胞毒性。HLAI类等位基因特异性KIR受体在溶细胞性(CD56dimCD16+)NK细胞中表达，而CD56brightCD16-NK亚型缺乏这些KIR。沿着这些思路，抑制性KIR似乎在瘤周NK细胞浸润中选择性表达，因此似乎是一种类似于PD-L1的被肿瘤所采用的检查点路径。因此，对特定KIR的抑制应引起NK细胞持续的体内激活。特别地，针对KIR的抗体可用作根据本发明的检查点抑制剂。例如，利瑞鲁单抗(Lirilumab)(百时美施贵宝)是针对KIR的完全人单克隆抗体，其可以用作根据本发明的检查点抑制剂。
可以被本发明的检查点抑制剂靶向(以防止其激活，例如通过阻断其与其同源配体的相互作用)的其他免疫检查点包括B7-H3(也称为CD276)、BTLA(也称为CD272)、VISTA和TIM-3(也称为HAVCR2)。在适当情况下，这些检查点的配体也可以被检查点抑制剂靶向，以阻断配体与其免疫检查点受体的相互作用。例如，TIM-3的配体可以被检查点受体靶向。TIM-3的配体包括半乳凝素-9和磷脂酰丝氨酸(PS)，磷脂酰丝氨酸是存在于健康细胞质膜内膜中的磷脂。PS在细胞凋亡过程中转移到膜的外膜上，并在外膜上与T细胞上的TIM-3结合，从而抑制了过度的免疫激活，否则这种免疫激活会在处理和清除腐烂的细胞物质过程中发生。PS的外在化(Externalisation)间接刺激巨噬细胞，导致树突状细胞抗原呈递受到抑制。像PD-L1一样，某些肿瘤细胞和肿瘤衍生的微泡异常表达外在化的PS。因此，PS被认为被肿瘤利用以防止适应性抗肿瘤免疫(Birge等，Cell Death&Differentiation 23，962-978，2016)。因此，PS可以被检查点抑制剂靶向以阻断其与TIM-3的相互作用，例如使用抗PS抗体。这样的抗体的一个实例是巴维昔单抗(Bavituximab)(Oncologie公司)，目前正在开发中。
根据本发明，可以使用任何检查点抑制剂。如上所详述的，许多检查点抑制剂是技术人员已知的，或者可以通过例如合理设计或产生针对适当靶标的抗体来进行开发。在特定的实施方案中，可以将一种以上的检查点抑制剂与寡肽化合物联合使用。例如，可以使用两种或更多种不同的检查点抑制剂，其各自抑制不同的免疫检查点的激活。例如，可以将阻断PD-1激活的检查点抑制剂与阻断CTLA-4激活的检查点抑制剂联合使用。先前已表明，相对于使用任何单一的检查点抑制剂，多种检查点抑制剂联合使用在某些癌症中产生改善的治疗效果(Wolchok等，N Engl J Med 369：122-133,2013)。
在一个可替代的方面，本发明提供了如上所述的寡肽化合物，其与活化的免疫检查点的激动剂联合使用用于治疗肿瘤性疾病，特别是癌症(如下所述)。如上所述，配体或激动剂与刺激性免疫检查点的结合起到增强针对抗原靶标的免疫细胞活性的作用。除上述CD28外，刺激性免疫检查点还包括CD27、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR和ICOS。因此，可以将根据本发明使用的寡肽化合物与任何刺激性免疫检查点的激动剂(例如CD28、CD27、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR或ICOS的激动剂)联合给药至受试者。这样的激动剂可以是抗体，特别是单克隆抗体。
根据本发明，可以通过将寡肽化合物和检查点抑制剂单独、同时或顺序给药至受试者来治疗肿瘤性疾病。如本文所用，“单独”给药是指将寡肽化合物和检查点抑制剂同时或至少基本上同时但通过不同的给药途径给药至受试者。如本文所用，“同时”给药是指将寡肽化合物和检查点抑制剂同时或至少基本上同时通过相同的给药途径给药至受试者。如本文所用，“顺序”给药是指将寡肽化合物和检查点抑制剂在不同时间给药至受试者。特别地，在开始给药第二治疗剂之前完成第一治疗剂的给药。当顺序给药至受试者时，可以通过相同的给药途径或通过不同的给药途径来给药第一治疗剂和第二治疗剂。
在受试者的治疗过程中，寡肽化合物和/或检查点抑制剂的给药可以反复进行(即两次或更多次)。例如，受试者可以接受若干个周期的治疗，其中寡肽化合物和检查点抑制剂均被给药。或者，受试者可以接受单剂量的一种治疗剂和重复剂量的另一种治疗剂。
如果将多种检查点抑制剂与寡肽化合物联合给药至受试者，则两种或更多种检查点抑制剂可以相对于彼此单独、同时或顺序给药。
寡肽化合物和检查点抑制剂可以通过任何合适的途径给药。这样的途径可以由熟练的医师确定并且可以取决于待治疗的疾病。可能的给药途径包括口腔、直肠、鼻、外用、阴道和肠胃外给药。本文所用的口腔给药包括颊和舌下给药。本文所用的外用给药包括经皮给药。如本文所定义的肠胃外给药包括皮下、肌内、静脉内、腹膜内和皮内给药。特别地，寡肽化合物可以例如通过口腔或肠胃外给药途径给药至受试者以进行全身递送，或局部给药至待治疗的肿瘤性疾病的部位，例如局部给药至肿瘤。局部给药的可能途径包括外用给药、通过直接给药进行递送(例如通过注射或输注到瘤(例如肿瘤)部位)以及吸入，当然取决于癌症(肿瘤)的部位。在一个特定的实施方案中，通过肿瘤内给药将寡肽化合物给药至受试者。
如上所述，可以通过与给药检查点抑制剂相同的途径或不同的途径将寡肽化合物给药至受试者，并且如果将两种或更多种检查点抑制剂给药至受试者，则两种或更多种检查点抑制剂可以通过相同或不同的途径给药至受试者。在一个特定的实施方案中，检查点抑制剂经肠胃外给药至受试者。例如，检查点抑制剂可以静脉内给药至受试者。
寡肽化合物和检查点抑制剂优选在药物组合物中给药至受试者。药物组合物可以采用本领域已知的任何适当形式，例如液体形式，例如溶液、悬浮液、糖浆或乳剂，或固体形式，例如片剂、胶囊、包衣片剂、粉剂、丸剂或颗粒剂。药物组合物可以采用乳膏、软膏或药膏的形式，或吸入剂、冻干物(lyophilisate)或喷雾剂的形式，或本领域中通常使用的任何其他形式的组合物。可以例如作为抗胃液制剂提供和/或以持续作用的形式提供。它可以是适合于口腔、肠胃外、外用、直肠、生殖器、皮下、经尿道、经皮、鼻内、腹膜内、肌内和/或静脉内给药和/或通过吸入进行给药的形式。寡肽化合物和检查点抑制剂可以在单一的药物组合物中进行给药，或者每种可以在单独的药物组合物中进行给药。
所述药物组合物优选还含有一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。合适的药学上可接受的稀释剂、载体和赋形剂是本领域公知的。例如，合适的赋形剂包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或其盐、植物油、蜡、脂肪和多元醇。合适的载体或稀释剂包括羧甲基纤维素(CMC)、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、右旋糖(dextrose)、海藻糖、脂质体、聚乙烯醇、医药级淀粉、甘露醇、乳糖、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖(glucose)、蔗糖(和其他糖类)、碳酸镁、明胶、油、酒精、清洁剂和乳化剂(如聚山梨酸酯)。也可以使用稳定剂、湿润剂、甜味剂等。
液体药物组合物，无论是溶液、悬浮液还是其他类似剂型，都可以包括以下一种或多种：无菌稀释剂，例如水、盐溶液(优选是生理性的，即等渗的)、林格氏液(Ringer'ssolution)、不挥发性油(fixed oil)(例如合成的单甘酯或双甘酯，其可以用作溶剂或悬浮介质)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如EDTA；缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可以装入安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。可注射的药物组合物优选为无菌的。
寡肽化合物和检查点抑制剂(或包含它们的药物组合物)可以以适合于待治疗的肿瘤性疾病的方式给药至受试者。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，但是给药的量和频率将由诸如患者的状况以及患者疾病的类型和严重性等因素来确定。方便地，寡肽化合物和/或检查点抑制剂可以以每天、每周或每月的剂量或以中等频率的剂量提供给受试者，例如，可以每2、3、4、5或6天，每2、3、4、5或6周，每2、3、4、5或6个月，每年或每半年提供一次剂量。如上所述，可以使用相同的剂量方案或不同的剂量方案将寡肽化合物和检查点抑制剂给药至受试者。
可以以取决于受试者大小的量来剂量给药。根据本发明的联合疗法进行给药的寡肽化合物和检查点抑制剂的量在治疗上是有效的。寡肽化合物可以以10μg/kg体重至100mg/kg体重的剂量给药，例如以10μg/kg体重至50mg/kg体重，10μg/kg体重至10mg/kg体重，10μg/kg体重至5mg/kg体重，10μg/kg体重至2.5mg/kg体重，100μg/kg体重至5mg/kg体重，100μg/kg体重至2.5mg/kg体重，500μg/kg体重至5mg/kg体重或1mg/kg体重至5mg/kg体重的剂量给药。在一个特定的实施方案中，寡肽化合物以约2mg/kg体重的剂量给药，例如以1mg/kg体重至2.5mg/kg体重，1.5mg/kg体重至2.5mg/kg体重或1.8mg/kg体重至2.2mg/kg体重的剂量给药。熟练的临床医生将能够基于所有相关因素，如年龄、身高、体重、待治疗的疾病及其严重程度，计算出患者的合适剂量。
检查点抑制剂可以以与寡肽化合物相同的剂量给药，或者可以以相对于寡肽化合物更高的剂量或特别是更低的剂量给药。例如，检查点抑制剂可以以100μg/kg体重至100mg/kg体重，例如500μg/kg体重至50mg/kg体重或1mg/kg体重至10mg/kg体重的剂量给药。示例性剂量包括1mg/kg体重、2mg/kg体重、3mg/kg体重、4mg/kg体重、5mg/kg体重、6mg/kg体重、7mg/kg体重、8mg/kg体重、9mg/kg体重和10mg/kg体重。检查点抑制剂可以以固定剂量给药，例如以100mg到1.5g的剂量给药。检查点抑制剂的示例性剂量包括100mg、200mg、240mg、250mg、300mg、400mg、480mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg、1100mg、1200mg、1300mg、1400mg和1500mg。
许多检查点抑制剂的合适剂量方案是已知的。例如，当单独使用纳武单抗(nivolumab)时，按照每2周静脉注射240mg或每4周静脉注射480mg的剂量方案给药；当伊匹单抗单独用于黑色素瘤治疗时，按照每3周以3mg/kg静脉注射的剂量方案给药。这些以及许多其他的此类检查点抑制剂剂量方案对技术人员而言是已知的，并且可以在由诸如FDA和EMA之类的监管机构发布的许可批准中找到。
如上所述，向其给药寡肽化合物和检查点抑制剂的受试者是患有肿瘤性疾病的受试者。受试者是动物，优选是哺乳动物。受试者可以是啮齿动物，例如小鼠、大鼠、兔子或豚鼠。受试者可以是宠物，例如猫或狗，或农场动物，例如马、牛、绵羊、猪或山羊。受试者可以是野生动物，例如动物园或游戏公园中的动物。在一个特定的实施方案中，受试者是灵长类动物，例如猴子或猿。最优选地，受试者是人类。因此，本文公开的疗法可以用于兽医或临床目的，但是优选用于临床目的，即用于治疗患有肿瘤性疾病的人类受试者(例如癌症患者)。
如本文所用，术语“治疗”广义上是指有益于临床疾病的管理的任何作用或步骤(或干预)。治疗可以包括，相对于治疗前的疾病或症状，减轻、缓解、改善、减缓正接受治疗的疾病或其一种或多种症状的发展，或消除正接受治疗的疾病或其一种或多种症状，或以任何方式改善受试者的临床状况。治疗可以包括有助于治疗计划或方案或成为治疗计划或方案一部分的任何临床步骤或干预措施。因此，如本文所用的“治疗”涵盖治愈性治疗(或旨在治愈的治疗)，以及仅延长生命或缓解的治疗(即仅旨在限制、减轻或改善疾病的症状)。
根据本发明的寡肽化合物和检查点抑制剂用于治疗受试者的肿瘤性疾病。如上所详述的，肿瘤性疾病可以是良性的或恶性的。然而，在一个特定的实施方案中，肿瘤性疾病是恶性疾病，即，寡肽化合物和检查点抑制剂用于治疗癌症。
待治疗的癌症可以是任何癌症，并且可以是原发性肿瘤或转移瘤(即继发性癌症)。可以使用本文公开的联合疗法治疗的示例性癌症包括宫颈癌、肛门癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、黑素瘤、肺癌、头颈癌、膀胱癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、鳞状细胞癌和默克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)。这些癌症可以由技术人员使用标准技术来诊断。
待治疗的癌症可以选择性地基于其遗传同一性来定义，而不是基于其原发部位或起始组织类型来定义。特别地，使用本文公开的联合疗法治疗的癌症可以是微卫星不稳定性高的和/或错配修复缺陷的。
微卫星(也称为“短串联重复序列”)是分散在整个基因组(包括编码区和非编码区)中的DNA序列，其由重复单元序列组成。单个微卫星通常包含10至60个拷贝的重复单元，重复单元的长度范围为1至6个碱基对。由于微卫星的重复性，DNA聚合酶在这些区域比在基因组的其他区域更容易出错。在具有功能性错配修复(MMR)系统的细胞中，MMR机制“校对”新合成的DNA链，从而纠正聚合酶造成的错误。具有MMR机制缺陷的癌细胞无法纠正这些错误，因此其微卫星中的点突变增加了100到1000倍。微卫星中突变率的这种增加称为微卫星不稳定性(MSI)(Dudley等，Clin Cancer Res 22(4)：813-820，2016年)。“微卫星不稳定性高”的癌症是表现出MSI的癌症。“错配修复缺陷”的癌症是缺乏功能性MMR机制的癌症。
MSI可以遗传，也可以自发发展。林奇综合症(Lynch syndrome)是一种常染色体显性疾病，其中个体在编码MMR机制的基因中具有一个或多个种系突变，从而导致MMR缺陷。林奇综合症患者罹患癌症的风险很高。根据本发明使用的寡肽化合物和检查点抑制剂可用于治疗患有林奇综合症的患者的癌症。非遗传性MSI通常是由一种或多种涉及MMR的基因表达的表观遗传沉默引起的，或者有时是由这些基因中的功能丧失性突变引起的。
MSI可以通过基因检测在癌症中被鉴定。关于MSI测试的详细信息，请参见Dudley等(同上)，通过引用并入本文。如其中所详述的，在肿瘤组织和健康组织中均扩增了一组由五个特定的微卫星组成的组。五个微卫星中至少两个的大小发生变化被认为可诊断为MSI。仍如Dudley等中详述的，可以通过免疫组织化学检查肿瘤样品中MMR机制蛋白的表达缺失来诊断MMR缺陷。当前的指南建议通过对肿瘤同时进行的基于DNA的MSI分析、MMR蛋白的免疫组织化学以及BRAF基因(其编码丝氨酸/苏氨酸激酶B-Raf)突变筛查来筛查MSI。BRAF的突变与林奇综合症/MSI的某些病例有关。
MSI与癌症中增加的突变负荷(由于MMR机制的缺陷)有关，导致癌细胞中肿瘤抗原的产生增加，从而增加了对癌症的免疫反应。相对于其他癌症，MSI高的癌细胞与PD-L1表达增加有关，因为它们需要下调免疫表达以避免T细胞介导的破坏，因此被认为是检查点抑制剂治疗的特别强的靶标。2017年，派姆单抗(上文所讨论的)获得FDA许可，用于治疗MSI高的和/或MMR缺乏的肿瘤。这是首次一种癌症药物被批准用于仅基于特定的生物标志物而不是肿瘤在体内的起源位置治疗癌症。
MSI与结肠直肠癌最相关，尽管也与胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肝胆道癌、泌尿道癌、脑癌和皮肤癌有关。本文公开的联合疗法可用于治疗任何此类MSI-高的癌症。
在另一个实施方案中，本文公开的联合疗法用于治疗与人乳头瘤病毒(HPV)相关的癌症。HPV是乳头瘤病毒家族的DNA病毒。HPV是一种性传播的感染，其只影响人类。HPV的某些菌株是致癌的。HPV介导的致癌作用是通过病毒性致癌基因E6和E7发生的，E6和E7分别促进肿瘤抑制蛋白p53的降解以及结合并抑制肿瘤抑制蛋白pRb(Narisawa-Saito&Kiyono，Cancer Science 98(10)：1505-1511，2007)。HPV尤其与子宫颈癌、肛门癌、阴茎癌、外阴癌、阴道癌以及头颈癌(包括喉癌和口咽癌)有关。
因此，本文公开的联合疗法可以用于治疗HPV阳性的受试者的癌症，特别是上述与HPV特别相关的癌症。可在个体中检测HPV的方法在Abreu等，2012年(Virology Journal 9：262)中进行了综述，其通过引用并入本文。此类方法通常依赖于与HPV相关的DNA序列的鉴定，包括通过杂交(印迹杂交(Southern blot))和扩增实验(包括qPCR和基于微阵列的分析)。用于HPV检测的多种试剂盒可商购获得，包括例如
(Greiner Bio-One，奥地利)。
如上所述的本发明可以被视为一种治疗受试者的肿瘤性疾病的方法，其包括将寡肽化合物和检查点抑制剂给药至有此需要的受试者。这样的受试者可以由医师鉴别，并且如上所述是患有肿瘤性疾病的受试者。寡肽化合物、检查点抑制剂、受试者、治疗和肿瘤性疾病可以各自如上所述。
类似地，所提供的本发明可视为寡肽化合物在制备用于治疗肿瘤性疾病的药物中的用途，其中所述肿瘤性疾病的治疗包括将所述药物和检查点抑制剂给药至受试者。同样地，寡肽化合物、检查点抑制剂、受试者、治疗和肿瘤性疾病可以各自如上所述。
在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含如上所定义的寡肽化合物和检查点抑制剂。合适的检查点抑制剂如上所述。所述试剂盒可以包含第一容器和第二容器，所述第一容器包含寡肽化合物，所述第二容器包含检查点抑制剂。或者，所述试剂盒可以包含单个容器，该容器同时包含寡肽化合物和检查点抑制剂。寡肽化合物和检查点抑制剂可以以任何合适的形式提供在试剂盒中。例如，如上所述，寡肽化合物和/或检查点抑制剂可以药物组合物的形式提供。所述试剂盒可以用于治疗受试者的肿瘤性疾病。肿瘤性疾病和受试者如上所述。或者，所述试剂盒可以用于研究，例如用于疾病的动物模型。
在另一方面，本发明提供一种产品，其包含用于单独、同时或顺序地用于治疗受试者的肿瘤性疾病的如上所定义的寡肽化合物和检查点抑制剂。检查点抑制剂、肿瘤性疾病、治疗和受试者可以如上文所定义。
从以下非限制性实施例并参考附图，可以更充分地理解本发明，其中：
附图说明
图1显示相对于单独用CyPep-1或单独用抗体治疗，用CyPep-1与抗PD-1抗体联合治疗对小鼠结肠癌模型中肿瘤体积的影响。第0天对应于小鼠接受第二次和最终CyPep-1剂量(或相应的对照)的日期，即，在x轴上的“后处理”是指用CyPep-1进行后处理。图中显示了向小鼠给药第一剂抗PD-1抗体(或等效对照)的日期。误差棒表示平均值的标准误差(SEM)。
图2显示单独用抗PD-1抗体(A)处理和抗PD-1抗体与CyPep-1联合处理(B)的小鼠死后取出的肿瘤的显微镜图像。可以看出，来自用抗PD-1抗体和CyPep-1联合处理的小鼠的肿瘤比从单独用抗PD-1抗体处理的小鼠取出的肿瘤含有数量大得多的TIL(即具有较大的、染色深的细胞核的细胞)。
具体实施方式
实施例
材料
CyPep-1肽由巴亨公司(Bachem AG)(瑞士)合成。CyPep-1是由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的全D-氨基酸肽。抗小鼠PD-1抗体从Bio X Cell(美国)获得。使用的单克隆抗体是Clone RMP1-14，一种亚型IgG2a的大鼠抗体，已知其会阻断PD-L1和PD-L2与PD-1的结合。
方法
雌性C57/BL6N小鼠在预定的肿瘤接种部位剃毛。4天后，将在50％PBS和50％基质胶的混合物中的5×105个MC38结肠癌细胞植入小鼠，总注射量为100μl。
用卡尺测量肿瘤大小。当中位肿瘤体积达到100mm3时，将40只小鼠随机分为四组：1)Ctr_IT；2)Ctr_IT_PD1；3)CyPep_IT；和4)CyPep_IT_PD1。
Ctr_IT组在第1天和第2天肿瘤内给药0.05ml/kg PBS。
Ctr_IT_PD1组在第1和第2天肿瘤内给药0.05ml/kg/天的PBS，在第4、8、11和15天腹膜内给药5mg/kg的抗PD-1抗体。抗PD-1抗体在PBS中以1mg/ml的浓度给药。
CyPep_IT组在第1和第2天给药2mg/kg CyPep-1。在PBS中以40mg/ml的浓度瘤内给药。
CyPep_IT_PD1组在第1天和第2天肿瘤内给药2mg/kg CyPep-1，CyPep-1以40mg/ml的浓度存在于PBS中；并在第4、8、11和15天腹膜内给药5mg/kg的抗PD-1抗体，抗PD-1抗体以1mg/ml的浓度存在于PBS中。
通过在第三天排除肿瘤+/->2X平均的动物，所有组在给药检查点抑制剂之前被标准化。一旦肿瘤体积达到1500mm3，当发生肿瘤溃疡或注射肿瘤6周后，处死小鼠。从死后的小鼠中取出肿瘤。各组的平均肿瘤体积通过未配对的双尾t检验(unpaired two-tailed t-test)进行分析，并且还对肿瘤进行组织学分析。
结果
如图1所示，与仅接受PBS的对照组相比，单独用CyPep-1处理或单独用抗PD-1抗体处理的小鼠在肿瘤生长方面没有观察到统计学上的显著差异。然而，与对照相比，接受CyPep-1和抗PD-1抗体二者的小鼠表现出显著的肿瘤生长降低(P＝0.02)。相对于对照小鼠，接受CyPep-1和抗PD-1抗体二者的小鼠表现出肿瘤体积平均减少52％。
组织学结果如图2所示。通过显微镜对肿瘤进行分析，发现用CyPep-1和抗PD-1抗体联合处理的小鼠的肿瘤(图2B)包含的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)数量显著多于单独用抗PD-1抗体处理的小鼠的肿瘤(图2A)。TIL数量是针对肿瘤的免疫活性的指标。
序列表
<110> 西托瓦申公司
<120> 使用肽的联合疗法
<130> FSP1V204065ZX
<150> GB1810058.6
<151> 2018-06-19
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CyPep-1肽序列
<400> 1
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Lys Thr Leu Arg
1 5 10 15
Val Ala Lys Ala Ile Tyr Lys Arg Tyr Ile Glu
20 25
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Lys Thr Leu Arg Val Ala Lys Ala Ile Tyr Lys Arg Tyr Ile Glu
1 5 10 15
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)
<400> 3
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly
1 5 10
Claims (21)
1.一种寡肽化合物，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，用于治疗肿瘤性疾病，其中所述寡肽化合物具有抑制肿瘤性细胞的生长和/或存活力的活性并且所述治疗包括将所述寡肽化合物和检查点抑制剂给药至受试者。
2.根据权利要求1所述用途的寡肽化合物，其中所述寡肽化合物包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1或2所述用途的寡肽化合物，其中所述寡肽化合物为翻转化合物，其每个氨基酸均为D-氨基酸。
4.根据权利要求1至3任一项所述用途的寡肽化合物，其中所述寡肽化合物对癌细胞具有选择性细胞毒性。
5.根据权利要求1至4任一项所述用途的寡肽化合物，其中所述检查点抑制剂阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用。
6.根据权利要求5所述用途的寡肽化合物，其中所述检查点抑制剂是与PD-1结合的抗体或与PD-L1结合的抗体。
7.根据权利要求1至4任一项所述用途的寡肽化合物，其中所述检查点抑制剂阻断CTLA-4和CD80或CD86之间的相互作用。
8.根据权利要求7所述用途的寡肽化合物，其中所述检查点抑制剂是与CTLA-4结合的抗体。
9.根据权利要求1至8任一项所述用途的寡肽化合物，其中所述治疗包括将所述寡肽化合物和所述检查点抑制剂单独、同时或顺序给药至所述受试者。
10.根据权利要求1至9任一项所述用途的寡肽化合物，其中所述受试者是哺乳动物，优选地是小鼠、大鼠、豚鼠、猫、狗、猪、马、牛、绵羊、山羊、猴子或猿。
11.根据权利要求10所述用途的寡肽化合物，其中所述受试者是人类。
12.根据权利要求1至11任一项所述用途的寡肽化合物，其中所述肿瘤性疾病是癌症。
13.根据权利要求12所述用途的寡肽化合物，其中所述癌症是宫颈癌、肛门癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、黑素瘤、肺癌、头颈癌、膀胱癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤、鳞状细胞癌或默克尔细胞癌。
14.根据权利要求12或13所述用途的寡肽化合物，其中所述癌症是微卫星不稳定性高的或错配修复缺陷的。
15.根据权利要求12至14任一项所述用途的寡肽化合物，其中所述受试者是HPV阳性。
16.一种治疗肿瘤性疾病的方法，其包括将寡肽化合物和检查点抑制剂给药至需要的受试者，其中所述寡肽化合物、检查点抑制剂、受试者、治疗和肿瘤性疾病如权利要求1至15任一项中定义。
17.寡肽化合物在制备用于治疗肿瘤性疾病的药物中的用途，其中所述肿瘤性疾病的治疗包括将所述药物和检查点抑制剂给药至受试者，并且所述寡肽化合物、检查点抑制剂、受试者、治疗和肿瘤性疾病如权利要求1至15任一项中定义。
18.一种试剂盒，其包含如权利要求1中定义的寡肽化合物和检查点抑制剂。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述寡肽化合物如权利要求2至4任一项中定义并且所述检查点抑制剂如权利要求5至8任一项中定义。
20.一种产品，其包含在受试者的肿瘤性疾病治疗中单独、同时或顺序使用的如权利要求1中定义的寡肽化合物和检查点抑制剂。
21.根据权利要求20所述的产品，其中所述寡肽化合物、检查点抑制剂、肿瘤性疾病、治疗和受试者如权利要求2至15任一项中定义。
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