CN117534729A - Tmem176b的竞争性多肽、药物组合物及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及TMEM176B的竞争性多肽、药物组合物及用途。具体地，本发明涉及一种分离的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的多肽能够有效地抗肿瘤，具有良好的应用前景。

Description

TMEM176B的竞争性多肽、药物组合物及用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种TMEM176B的竞争性多肽、药物组合物及用途。
背景技术
TMEM176B(本发明中也表示为Tmem176b)是四次跨膜结构蛋白MS4A家族成员之一，其定位于细胞内多种细胞器膜上，具有调节胞内Ca2+运输进而调节免疫细胞功能的作用。TMEM176B在淋巴细胞中多表达与单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞及RORγT+细胞。研究表明，降低树突状细胞中TMEM176B表达可激活Caspase-1/IL-1β信号通路并提高树突状细胞抗肿瘤免疫功能，进而提高机体对免疫检查点阻断(immune checkpoint blockade，ICB)治疗敏感性。另有报道显示，TMEM176B在人结直肠肿瘤组织中高表达，与肿瘤病人预后具有显著的负相关性，并与临床ICB治疗敏感性具有明确的相关性。
SHP-1(本发明中也表示为Shp1)是一种Src同源区2(src-homology domain 2，SH2)蛋白酪氨酸磷酸酶-1(SH2-containing protein tyrosine phosphatase，non-receptor type 6(PTPN6)，主要表达在造血源性细胞胞质中的酪氨酸磷酸酶蛋白，是调节胞内磷酸化水平的关键因子。该家族有2个蛋白，包括SHP-1和SHP-2。编码SHP-1的基因定位于12p13，有两个位于N末端的SH2结构域、一个磷酸化结构域和一个位于C末端的酪氨酸磷酸化位点。在T淋巴细胞中，SHP-1可以对TCR近端活化信号例如PLCγ1、SLP76进行去磷酸化，下调TCR信号，进而抑制T细胞活化、增殖及成熟等过程。研究表明，SHP-1表达缺陷的外周T细胞也表现出对TCR诱导的细胞凋亡反应加强。
目前尚需要开发新的抗肿瘤手段。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，发现肿瘤外泌体来源的TMEM176B在CD8+T细胞通过招募Shp1实现抑制TCR近端信号分子，进而抑制T细胞的活化、增殖及抗肿瘤功能，该相互作用在肿瘤免疫逃逸过程中具有重要的调节作用。针对该互作位点筛选设计的竞争性多肽可通过破坏TMEM176B招募Shp1，解除TMEM176B对TCR信号的抑制作用，具有显著的肿瘤抑制作用，与PD-1单抗联用可进一步提高肿瘤抑制功效。该候选多肽适用于黑色素瘤、结直肠癌、肝癌以及发生转移的癌种，具有显著的肿瘤抑制作用，由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种分离的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
ASLGLSLRSMYGRSS(SEQ ID NO:1)
本发明的另一方面涉及一种融合多肽，其含有本发明所述的分离的多肽；
优选地，还含有细胞穿梭肽；
优选地，所述细胞穿梭肽选自优选地，所述细胞穿梭肽选自SEQ ID NO:3所示的多肽、SEQ ID NO:4所示的多肽、TAT(49-57)、Polyargine、Penetratin、Rev、Gag、DPV1047、Prp6、MAP、Transportan、Pep-1、MPG、Bovine Prp、AFR、pVECVT5、SAP、Bac7、(PRR)n、Bip、C105Y、Pep-7、FGF和SG3。
本发明中，如果没有特别说明，融合蛋白也属于融合多肽的范畴。
在本发明的一些实施方式中，所述的融合多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
RXRRBRRXRRBRXBASLGLSLRSMYGRSS(SEQ ID NO:2)
本发明的在一方面涉及一种核酸，其编码本发明的分离的多肽或者本发明中任一项所述的融合多肽。
本发明的再一方面涉及一种载体，其含有本发明的核酸。
本发明的再一方面涉及一种细胞，其含有本发明的核酸或者本发明中任一项所述的载体。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明的分离的多肽或者包含本发明中任一项所述的融合多肽，以及一种或多种药学上可接受的辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其中，本发明的分离的多肽或者本发明中任一项所述的融合多肽是活性成分(Active Pharmaceutical Ingredient，API)。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其中，本发明的分离的多肽或者本发明中任一项所述的融合多肽是唯一活性成分。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其由本发明的分离的多肽或者本发明中任一项所述的融合多肽，以及一种或多种药学上可接受的辅料组成。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其还包含一种或多种免疫检查点抑制剂；
优选地，所述免疫检查点抑制剂为靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、CD47、LAG-3、TIGHT、VISTA、STING、TREM2、PCSK9、CLDN18.2、DDR1、ICOS、CD137、GITR和/或OX40的抗体；
优选地，所述抗体为单克隆抗体或双特异性抗体；
优选地，所述抗体为阻断型单抗；
优选地，所述抗体为抗PD-1单体；
优选地，所述抗体为抗PD-1阻断型单抗或抗PD-L1阻断型单抗。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其中，本发明的分离的多肽或者本发明中任一项所述的融合多肽，以及所述免疫检查点抑制剂是活性成分。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其由本发明的分离的多肽或者本发明中任一项所述的融合多肽、所述免疫检查点抑制剂，以及一种或多种药学上可接受的辅料组成。
在本发明的一些实施方式中所述的药物组合物，其中，所述免疫检查点抑制剂与所述分离的多肽或者与所述融合多肽的质量比为(1：5)至(5：1)，优选为(1：2)至(2：1)，更优选为1：1。
本发明的再一方面涉及一种药物产品组合，包含第一药物产品和第二药物产品，其中：
所述第一药物产品包含本发明的分离的多肽或者包含本发明中任一项所述的融合多肽；
所述第二药物产品包含一种或多种免疫检查点抑制剂；
优选地，所述免疫检查点抑制剂为靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、CD47、LAG-3、TIGHT、VISTA、STING、TREM2、PCSK9、CLDN18.2、DDR1、ICOS、CD137、GITR和/或OX40的抗体；
优选地，所述抗体为单克隆抗体或双特异性抗体；
优选地，所述抗体为阻断型单抗；
优选地，所述抗体为抗PD-1单体；
优选地，所述抗体为抗PD-1阻断型单抗或抗PD-L1阻断型单抗。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物产品组合，其中，
其中，所述免疫检查点抑制剂与所述分离的多肽或者与所述融合多肽的质量比为(1：5)至(5：1)，优选为(1：2)至(2：1)，更优选为1：1。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物产品组合，其中，
所述第一药物产品和所述第二药物产品独立地包含一种或多种药学上可接受的辅料；
优选地，还包含药品说明书。
本发明的再一方面涉及本发明的分离的多肽、本发明中任一项所述的融合多肽、本发明的核酸、本发明的载体或者本发明的细胞在制备抗肿瘤的药物中的用途；
优选地，所述肿瘤为选自黑色素瘤、结直肠癌和肝癌中的一种或多种。
根据本发明的分离的多肽、本发明中任一项所述的融合多肽、本发明的核酸、本发明的载体或者本发明的细胞，其用于抗肿瘤；
优选地，所述肿瘤为选自黑色素瘤、结直肠癌和肝癌中的一种或多种。
本发明的再一方面涉及一种抗肿瘤的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的本发明的分离的多肽、本发明中任一项所述的融合多肽、本发明的核酸、本发明的载体或者本发明的细胞或者阻断或者抑制Tmem176b与Shp1结合的试剂的步骤；
优选地，所述肿瘤为选自黑色素瘤、结直肠癌和肝癌中的一种或多种。
本发明的再一方面涉及阻断或者抑制Tmem176b与Shp1结合的试剂在制备抗肿瘤的药物中的用途；
优选地，所述肿瘤为选自黑色素瘤、结直肠癌和肝癌中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂可以是靶向Tmem176b和/或Shp1的抗体，例如单克隆抗体或者双特异性抗体。可以采用本领域技术人员知悉的技术来制备靶向Tmem176b和/或Shp1的抗体，包括但不限于：杂交瘤技术、抗体人源化技术，等等。可以筛选得到与Tmem176b和/或Shp1的亲和力EC50或者解离常数KD较小的抗体，优选地；所述抗体能够抑制Tmem176b与Shp1结合，甚至阻断或者基本阻断Tmem176b与Shp1结合。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂也可以是小分子化合物。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂是本发明的多肽或融合多肽。
本发明中，细胞穿梭肽(又称细胞穿透肽或细胞穿膜肽，CPP)是一类能够穿过细胞膜或组织屏障的短肽。CPP可通过内吞和直接穿透等机制运载蛋白质、RNA、DNA等生物大分子进入细胞内发挥其效应功能。包括但不限于：TAT(49-57)、Polyargine、Penetratin、Rev、Gag、DPV1047、Prp6、MAP、Transportan、Pep-1、MPG、Bovine Prp、AFR、pVECVT5、SAP、Bac7、(PRR)n、Bip、C105Y、Pep-7、FGF或SG3，等等(谢洋洋等，细胞穿膜肽研究应用的新进展。生物工程学报，2019,35(7):1162-1173.)。
在本发明中，术语“阻断型单抗”特指用于封闭免疫检查点与其配体或受体例如PD-1与PD-L1结合位点的单克隆抗体，用于肿瘤免疫治疗。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞穿梭肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQID NO:4所示。
RXRRBRRXRRBRXB(SEQ ID NO:3)
RXRRXRRXRRXRXB(SEQ ID NO:4)
SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中，R表示D-精氨酸，X为6-氨基己酸且B为β-丙氨酸。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，作为宿主的细胞是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的辅料”或者“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by GennaroAR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
本发明中，如果没有特别说明，所述“第一”(例如第一药物产品)或“第二”(例如第二药物产品)仅仅是为了指代上的区分，并不具有特别的次序上的含义。
发明的有益效果
本发明取得了如下技术效果(1)至(5)中的一项或者几项：
(1)本发明的多肽或融合多肽具有与Shp1的较高的亲和力。
(2)本发明的多肽或融合多肽能够有效地与TMEM176B竞争与Shp1的结合。
(3)本发明的多肽或融合多肽能够有效地解除TMEM176B对TCR信号的抑制作用。
(4)本发明的多肽或融合多肽能够有效地治疗或预防肿瘤。
(5)本发明的多肽或融合多肽与免疫检查点抑制剂(例如抗PD-1抗体)联用，具有协同增效的抗肿瘤效果。
附图说明
图1A至图1B：Tmem176b与Shp1相互作用验证。其中：
图1A：Tmem176b与Shp1共定位情况检测。免疫荧光分析EL4细胞中过表达Tmem176b与Shp1的共定位情况。
图1B：免疫共沉淀检测EL4细胞中Tmem176b与Shp1互作情况。
图2A至图2E：Tmem176b与Shp1互作关键结合位点筛选与确定。其中：
图2A：构建Tmem176b不同氨基酸位点缺失过表达细胞系，利用免疫共沉淀测试和Shp1的互作情况，以确定Tmem176b和Shp1发生互作的关键位点。
图2B：候选短肽CPP-Pep在T细胞胞内与Shp1的结合情况。合成细胞穿梭肽CPP-Pep的嵌合短肽，并与过表达BFP-Shp1的EL4细胞系共孵育，观察候选短肽与Shp1的共定位情况。
图2C：候选短肽CPP-Pep抑制Tmem176b与Shp1互作。候选短肽CPP-Pep处理过表达Tmem176b-flag蛋白的EL4细胞，免疫共沉淀检测Tmem176b与Shp1的互作情况。
图2D：Tmem176b介导肿瘤生长抑制关键位点验证。在Tmem176b KO的B16F10细胞系中回补互作关键位点突变的Tmem176b蛋白，并在C57B6J小鼠上测试回补野生型Tmem176b和突变型Tmem176b后肿瘤生长情况。
图2E：肿瘤来源Tmem176b促进肿瘤生长作用依赖于T细胞内Shp1蛋白功能验证。构建Shp1fl/fl dLck Cre小鼠，并测试MC38野生型与Tmem176b KO细胞系皮下接种后肿瘤生长情况。
图3A至图3D：候选短肽抑制小鼠黑色素瘤B16F10肿瘤生长测试。在C57B6J小鼠皮下接种B16F10细胞，测试候选短肽及与α-PD1抗体联合使用对肿瘤生长抑制情况。其中：
图3A和图3B：嵌合短肽抑制B16F10皮下接种肿瘤生长及生存情况测试。
图3C和图3D：嵌合短肽联合α-PD1抑制B16F10肿瘤生长及小鼠生存情况测试。
图4A至图4D：候选短肽抑制小鼠结直肠肿瘤MC38肿瘤生长测试。在C57B6J小鼠皮下接种MC38细胞，测试候选短肽及与α-PD1抗体联合使用对肿瘤生长抑制情况。其中：
图4A和图4B：嵌合短肽抑制MC38皮下接种肿瘤生长及生存情况测试。
图4C和图4D：嵌合短肽联合α-PD1抑制MC38肿瘤生长及小鼠生存情况测试。
图5A至图5B：候选短肽抑制小鼠肝癌Hepa1-6肿瘤生长测试。在C57B6J小鼠肝脏原位接种Hepa1-6细胞，测试候选短肽对肝原位肿瘤生长的抑制情况。其中：
图5A：小鼠原位肝肿瘤生长情况。
图5B：小鼠原位肝肿瘤体积统计图。
图6A至图6B：候选短肽抑制小鼠B16F10肿瘤细胞肺转移能力测试。在C57B6J小鼠经尾静脉注射B16F10，构建肺转移小鼠模型，测试候选短肽对B16F10细胞在肺中转移的抑制作用。其中：
图6A：小鼠肺转移肿瘤病灶发生情况。
图6B：小鼠肺转移肿瘤病灶统计图。
图7A：plv-IRES-C-3×Flag-EGFP载体结构。
图7B：plv-EGFPL载体结构。
图7C：plv-EBFP载体结构。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：TMEM176B与Shp1的相互作用实验
1.实验材料和主要试剂
NP40 lysis buffer配方：(20mM tris-HCl(pH 7.5),150mM NaCl,1％NP-40,5mMEDTA(pH 8.0),5mM Na4P2O7,1mM Na3VO4,5mM NaF,and protease inhibitor cocktail).
2.实验方法
稳转质粒构建：质粒载体为plv-IRES-C-3×Flag-EGFP、plv-EGFPL、plv-EBFPL载体结构如图7A至图7C。首先，用XbaI/BamHI双酶切plv-IRES-C-3×Flag-EGFP载体得到载体回收产物，BamHI/SalI双酶切plv-EGFPL、plv-EBFPL载体，用以下面的表1中的引物扩增所需的Tmem176b和shp1基因CDS片段，将基因片段插入载体的酶切位点上，得到完整质粒。
表1：PCR引物
稳转病毒制备：六孔板中按1×106/孔接种293T细胞，待细胞密度至70-80％，200μl Opti-MEM中混入2μg表达质粒和包装质粒0.5μgpMD2.G(Addgene 12259)和1.5μg psPAX2(Addgene 12260)，8μlpolyethylenimine(PEI)(1mg/mL).轻微混匀后，静置15分钟，缓慢加入细胞中，至细胞培养箱中6-8小时后，更换培养基为预热的DMEM，24和48小时后收集上清，1000g离心3min，弃沉淀，收集上清至-80保存。
稳转细胞制备：将EL4悬浮细胞系以每孔2×105个细胞/100μL培养基铺于24孔板中，随后加入400μL病毒上清，病毒液需加入polybrene(终浓度10ng/μL)；2500rpm 37℃离心30min，升速6降速2；离心后培养箱中培养12h，换新鲜培养基继续培养48h，根据GFP荧光标记检测感染效率并分选目的细胞系。
免疫共沉淀(Co-IP)：收集所需EL4细胞，每组取1×107个细胞，500g离心5min去上清，用1×PBS洗涤一次，离心去上清；
加入1mL NP40 Lysis buffer，吹吸混匀，冰上裂解30min离心；
将裂解后蛋白混悬液超声数秒后，12000rpm 4℃离心10min，去沉淀，取80μL上清加入20μL 5×SDS loading buffer中，混匀后100℃金属浴10min，-20℃保存，做Input；
因为稳转的基因融合表达Flag标签，故用M2 Flag beads富集蛋白混悬液中的Flag，进而得到目的蛋白的蛋白复合体。将上一步骤剩余的蛋白混悬液全部转移至洗好的M2 Flag beads(每1×107个细胞/20μL M2Flag beads)中，4℃垂直混匀4h；
8000g 4℃离心30s，吸掉上清，向beads中加入1ml NP40 Lysis buffer，颠倒混匀，8000g 4℃离心30s，弃上清，重复洗涤5-6次；
每管beads中加入1.5μL 3×Flag peptide和28.5μL 2×SDS loading buffer，混匀后25℃金属浴振荡1200rpm 30min，竞争性洗脱带Flag标签的蛋白；
8000g 4℃离心30s，取上清，-20℃保存。
3.实验结果
在EL4细胞中同时过表达eGFP-Tmem176b和eBFP-Shp1融合蛋白，并利用共聚焦显微镜观察Tmem176b和Shp1在EL4细胞中的共定位情况。结果显示，Tmem176b与Shp1在EL4细胞的胞浆中具有明显的共定位发生(结果见图1A)。
进一步，在EL4细胞中过表达融合蛋白Tmem176b-flag，并利用免疫共沉淀(Co-IP)方法分析与Tmem176b可能存在相互作用的蛋白，结果显示：Shp1，一种T细胞内调节T细胞活化的磷酸酶，与Tmem176b具有明显的互作发生(结果见图1B)。
实施例2：竞争性多肽的筛选
1.实验材料和主要试剂
NP40 lysis buffer配方：(20mM tris-HCl(pH 7.5),150mM NaCl,1％NP-40,5mMEDTA(pH 8.0),5mM Na4P2O7,1mM Na3VO4,5mM NaF,and protease inhibitor cocktail).
CPP-Peptide RXRRBRRXRRBRXB-ASLGLSLRSMYGRSS
CPP-Scr Peptide RXRRBRRXRRBRXB-MLSGSRYSGLSARLS
FITC-CPP-Peptide FITC-RXRRBRRXRRBRXB-ASLGLSLRSMYGRSS
2.实验方法
稳转质粒构建：使用的质粒载体为plv-IRES-C-3×Flag-EGFP，载体结构如图7A。首先，用XbaI/BamHI双酶切载体得到载体回收产物，以下面的表2中的引物扩增所需的Tmem176b基因CDS全长片段以及各种突变体CDS片段，将基因片段插入载体的酶切位点上，得到完整质粒。
表2
稳转病毒制备：六孔板中按1×106/孔接种293T细胞，待细胞密度至70-80％，200μl Opti-MEM中混入2μg表达质粒和包装质粒0.5μgpMD2.G(Addgene 12259)和1.5μg psPAX2(Addgene 12260)，8μlpolyethylenimine(PEI)(1mg/mL).轻微混匀后，静置15分钟，缓慢加入细胞中，至细胞培养箱中6-8小时后，更换培养基为预热的DMEM，24和48小时后收集上清，并离心1000g×3min，弃沉淀，收集上清至-80保存。
稳转细胞制备：将EL4悬浮细胞系以每孔2×105个细胞/100培养基铺于24孔板中，随后加入400μL病毒上清，病毒液需加入polybrene(终浓度10ng/μL)；2500rpm 37℃离心30min，升速6降速2；离心后培养箱中培养12h后换新鲜培养基，培养48h后根据GFP荧光标记检测感染效率并分选目的细胞系。
免疫共沉淀(Co-IP)：
1)收集所需EL4细胞，每组取1×107个细胞，500g离心5min，去上清，用1×PBS洗涤一次，离心去上清；
2)加入1mL NP40 Lysis buffer，吹吸混匀，冰上裂解30min离心；
3)将裂解后蛋白混悬液超声数秒后，12000rpm 4℃离心10min，去沉淀，取80μL上清加入20μL 5×SDS loading buffer中，混匀后100℃金属浴10min，-20℃保存，做Input；
4)因为稳转的基因融合表达Flag标签，故用M2 Flag beads富集蛋白混悬液中的Flag，进而得到目的蛋白的蛋白复合体。将上一步骤剩余的蛋白混悬液全部转移至洗好的M2 Flag beads(每1×107个细胞/20μL M2 Flag beads)中，4℃垂直混匀4h；
5)8000g 4℃离心30s，吸掉上清，向beads中加入1ml NP40Lysis buffer，颠倒混匀，8000g 4℃离心30s，弃上清，重复洗涤5-6次；
6)每管beads中加入1.5μL 3×Flag peptide和28.5μL 2×SDS loading buffer，混匀后25℃金属浴振荡1200rpm 30min，竞争性洗脱带Flag标签的蛋白；
7)8000g 4℃离心30s，取上清，-20℃保存。
3.实验结果
基于Tmem176b与Shp1互作在T细胞功能失调过程中的关键作用，筛选二者发生互作的关键位点对于后续药物研发至关重要。本研究构建不同氨基酸位点删除的Tmem176b突变体过表达细胞系，并利用免疫共沉淀法筛选不同位点删除Tmem176b突变体和Shp1的互作情况，确定Tmem176b和Shp1发生互作的关键位点为218-227氨基酸序列(结果见图2A)。
基于以上对Tmem176b与Shp1互作关键位点的确定，本研究体外合成该候选短肽与细胞穿梭肽偶联的嵌合短肽(CPP-PEP)，并测试嵌合短肽在细胞内与Shp1的共定位情况(结果见图2B)。
为验证嵌合短肽竞争性抑制Tmem176b与Shp1互作效率，利用嵌合短肽CPP-Pep处理过表达Tmem176b-flag融合蛋白的EL4稳转细胞系，并利用Co-IP检测互作抑制效率，结果显示，筛选获得的CPP-Pep能够显著抑制胞内Tmem176b与Shp1的相互作用的发生(结果见图2C)。
进一步，为验证该突变位点对于肿瘤生长的影响，在Tmem176b敲除B16F10细胞系中回补野生型Tmem176b蛋白(B16-T8KO(T-OE))和互作关键位点突变型Tmem176b蛋白(B16-T8KO(Tmut-OE))，并测试皮下接种不同细胞类型肿瘤细胞生长情况，结果显示，该关键位点对于肿瘤生长抑制作用起关键作用(结果见图2D)。
为进一步确定Shp1在肿瘤细胞来源Tmp1调节T细胞抗肿瘤功能的关键作用，本研究构建T细胞条件性敲除Shp1转基因小鼠(Shp1fl/fl-dLck Cre)，并测试B16F10 Tmp1-KO在野生型及Shp1 KO小鼠上的生长，结果显示，Tmp1敲除后B16F10肿瘤生长抑制效应在Shp1敲除小鼠上消失，与野生型B16F10肿瘤生长速度一致(结果见图2E)。提示肿瘤来源Tmp1促进肿瘤生长作用依赖于T细胞内Shp1的功能。
实施例3：嵌合短肽的抗肿瘤实验(1)
1.实验动物和实验样品
C57B6J小鼠，B16F10(小鼠黑色素瘤)细胞。
嵌合短肽和对照短肽序列如下。
CPP-Peptide RXRRBRRXRRBRXB-ASLGLSLRSMYGRSS
(嵌合短肽) (SEQ ID NO:2)
CPP-Scr Peptide RXRRBRRXRRBRXB-MLSGSRYSGLSARLS
(对照短肽) (SEQ ID NO:29)
α-PD1阻断型单抗(抗PD-1阻断型单抗；MCE,RMP1-14)。
2.实验方法
野生型C57B6J小鼠皮下接种2×105B16F10细胞，待肿瘤生长10天或体积至100mm3，进行治疗，实验组CPP-Pep和对照组CPP-Scr给药剂量为10mg/kg/次，3天给药一次，连续给药3次，给药方式为尾静脉注射。α-PD1阻断型单抗给药剂量为10mg/kg/次，3天给药一次，连续给药3次，给药方式为腹腔注射。肿瘤生长测量为每2天测量一次。直至肿瘤体积达到2000mm3。
3.实验结果
为测试候选嵌合短肽对肿瘤生长的抑制作用，在野生型C57B6J小鼠皮下接种肿瘤模型中测试该竞争性抑制性短肽对肿瘤生长的抑制作用，结果显示，与对照组短肽相比，该嵌合短肽能有效抑制B16F10皮下肿瘤生长(结果见图3A、图3B)。联合使用α-PD1阻断型单抗能够进一步抑制皮下肿瘤生长，且联合使用后肿瘤抑制效果强于单独使用嵌合短肽或PD1单抗效果，统计分析具有显著性差异，具有一定的协同作用效果(结果见图3C、图3D)。提示该候选短肽可以与现存免疫治疗方案进行联合治疗，具有进一步提高治疗功效的潜力。
实施例4：嵌合短肽的抗肿瘤实验(2)
1.实验动物和实验样品
C57B6J小鼠，MC38(小鼠结直肠癌)细胞。
嵌合短肽和对照短肽序列如下。
CPP-Peptide RXRRBRRXRRBRXB-ASLGLSLRSMYGRSS
(嵌合短肽) (SEQ ID NO:2)
CPP-Scr Peptide RXRRBRRXRRBRXB-MLSGSRYSGLSARLS
(对照短肽) (SEQ ID NO:29)
α-PD1阻断型单抗(抗PD-1阻断型单抗；Leinco technologies，P362)。
2.实验方法
野生型C57B6J小鼠皮下接种1×106MC38细胞，待肿瘤生长12天或体积至100mm3，进行治疗，实验组CPP-Pep和对照组CPP-Scr给药剂量为10mg/kg/次，3天给药一次，连续给药3次，给药方式为尾静脉注射。α-PD1阻断型单抗给药剂量为10mg/kg/次，3天给药一次，连续给药3次，给药方式为腹腔注射。肿瘤生长测量为每4天测量一次。直至肿瘤体积达到2000mm3。
3.实验结果
为测试候选嵌合短肽对结直肠肿瘤生长的抑制作用，在野生型C57B6J小鼠皮下接种肿瘤模型中测试该竞争性抑制性短肽对肿瘤生长的抑制作用，结果显示，与对照组短肽相比，该嵌合短肽能有效抑制MC38皮下肿瘤生长(结果见图4A、图4B)。联合使用α-PD1阻断型单抗能够进一步抑制皮下肿瘤生长(结果见图4C、图4D)，且联合使用后的肿瘤抑制效果显著强于单独使用嵌合短肽或PD1单抗效果，统计分析具有显著性差异，具有一定的协同作用效果。提示该候选短肽可以与现存免疫治疗方案进行联合治疗，具有进一步提高治疗功效的潜力。
实施例5：嵌合短肽的抗肿瘤实验(3)
1.实验动物和实验样品
C57B6J小鼠，Hepa1-6(小鼠肝癌)细胞。
嵌合短肽和对照短肽序列如下。
CPP-Peptide RXRRBRRXRRBRXB-ASLGLSLRSMYGRSS
(嵌合短肽) (SEQ ID NO:2)
CPP-Scr Peptide RXRRBRRXRRBRXB-MLSGSRYSGLSARLS
(对照短肽) (SEQ ID NO:29)
2.实验方法
野生型C57B6J小鼠皮下接种2×106Hepa1-6细胞，待肿瘤生长10天后，取皮下肿瘤并切成1mm3肿瘤组织块，手术麻醉待接种C57B6J小鼠，并按每只小鼠肝脏包埋2块肿瘤块，并进行手术缝合。3周后对荷瘤C57B6J小鼠进行治疗，实验组CPP-Pep和对照组CPP-Scr给药剂量为10mg/kg/次，3天给药一次，连续给药3次，给药方式为尾静脉注射。肿瘤生长6周后取样进行肿瘤大小测量与分析。
3.实验结果
为测试候选嵌合短肽对肝癌生长的抑制作用，在野生型C57B6J小鼠肝脏接种Hepa1-6肿瘤模型中测试该竞争性抑制性短肽对肿瘤生长的抑制作用，结果显示，与对照组短肽相比，该嵌合短肽能有效抑制Hepa1-6肝原位肿瘤生长(结果见图5A、图5B)。提示该候选短肽具有治疗肝肿瘤生长的潜力。
实施例6：嵌合短肽的抗肿瘤实验(4)
1.实验动物和实验样品
C57B6J小鼠，B16F10(小鼠黑色素瘤)细胞，嵌合短肽和对照短肽序列如下。
CPP-Peptide RXRRBRRXRRBRXB-ASLGLSLRSMYGRSS
(嵌合短肽) (SEQ ID NO:2)
CPP-Scr Peptide RXRRBRRXRRBRXB-MLSGSRYSGLSARLS
(对照短肽) (SEQ ID NO:29)
2.实验方法
B16F10是小鼠黑色素瘤细胞，本实验用该细胞经尾静脉注射后建立了黑色素瘤的肺转移模型。
野生型C57B6J小鼠经尾静脉注射1×106B16F10细胞，注射肿瘤细胞3天后开始给药治疗，实验组CPP-Pep和对照组CPP-Scr给药剂量为10mg/kg/次，3天给药一次，连续给药3次，给药方式为尾静脉注射。14天后取小鼠肺组织，对转移病灶进行计数统计分析。
3.实验结果
为测试候选嵌合短肽对肿瘤转移的抑制作用，在野生型C57B6J小鼠上构建B16F10肿瘤细胞肺部转移模型，测试该竞争性抑制性短肽对肿瘤生长的抑制作用。结果显示，与对照组短肽相比，该嵌合短肽能有效抑制B16F10肿瘤细胞肺部转移发生(结果见图6A、图6B)。提示该候选短肽对肿瘤转移具有潜在的抑制作用。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (14)

1.一种分离的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种融合多肽，其含有权利要求1所述的分离的多肽；
优选地，还含有细胞穿梭肽；
优选地，所述细胞穿梭肽选自SEQ ID NO:3所示的多肽、SEQ ID NO:4所示的多肽、TAT(49-57)、Polyargine、Penetratin、Rev、Gag、DPV1047、Prp6、MAP、Transportan、Pep-1、MPG、Bovine Prp、AFR、pVECVT5、SAP、Bac7、(PRR)n、Bip、C105Y、Pep-7、FGF和SG3。
3.根据权利要求2所述的融合多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.一种核酸，其编码权利要求1所述的分离的多肽或者权利要求2至3中任一权利要求所述的融合多肽。
5.一种载体，其含有权利要求4所述的核酸。
6.一种细胞，其含有权利要求4所述的核酸或者权利要求5所述的载体。
7.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的分离的多肽或者包含权利要求2至3中任一权利要求所述的融合多肽，以及一种或多种药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其还包含一种或多种免疫检查点抑制剂；
优选地，所述免疫检查点抑制剂为靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、CD47、LAG-3、TIGHT、VISTA、STING、TREM2、PCSK9、CLDN18.2、DDR1、ICOS、CD137、GITR和/或OX40的抗体；
优选地，所述抗体为单克隆抗体或双特异性抗体；
优选地，所述抗体为阻断型单抗；
优选地，所述抗体为抗PD-1阻断型单抗或抗PD-L1阻断型单抗。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述免疫检查点抑制剂与所述分离的多肽或者与所述融合多肽的质量比为(1：5)至(5：1)，优选为(1：2)至(2：1)，更优选为1：1。
10.一种药物产品组合，包含第一药物产品和第二药物产品，其中：
所述第一药物产品包含权利要求1所述的分离的多肽或者包含权利要求2至3中任一权利要求所述的融合多肽；
所述第二药物产品包含一种或多种免疫检查点抑制剂；
优选地，所述免疫检查点抑制剂为靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、CD47、LAG-3、TIGHT、VISTA、STING、TREM2、PCSK9、CLDN18.2、DDR1、ICOS、CD137、GITR和/或OX40的抗体；
优选地，所述抗体为单克隆抗体或双特异性抗体；
优选地，所述抗体为阻断型单抗；
优选地，所述抗体为抗PD-1阻断型单抗或抗PD-L1阻断型单抗。
11.根据权利要求10所述的药物产品组合，其中，
其中，所述免疫检查点抑制剂与所述分离的多肽或者与所述融合多肽的质量比为(1：5)至(5：1)，优选为(1：2)至(2：1)，更优选为1：1。
12.根据权利要求10至11中任一权利要求所述的药物产品组合，其中，
所述第一药物产品和所述第二药物产品独立地包含一种或多种药学上可接受的辅料；
优选地，还包含药品说明书。
13.权利要求1所述的分离的多肽、权利要求2至3中任一权利要求所述的融合多肽、权利要求4所述的核酸、权利要求5所述的载体或者权利要求6所述的细胞在制备抗肿瘤的药物中的用途；
优选地，所述肿瘤为选自黑色素瘤、结直肠癌和肝癌中的一种或多种。
14.阻断或者抑制Tmem176b与Shp1结合的试剂在制备抗肿瘤的药物中的用途；
优选地，所述肿瘤为选自黑色素瘤、结直肠癌和肝癌中的一种或多种。
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