JP2008525005A - 新規の物質、および、それらの使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、癌細胞の増殖を阻害する物質を提供し、ここにおいて、該物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を阻害する。好ましい実施態様において、該物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の転写、翻訳および／または結合特性を変化させる。好ましくは、該物質は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７への結合親和性を有する化合物からなる群より選択される。本発明はさらに、患者における癌細胞の増殖を阻害する方法、加えて癌を診断するための方法およびキットを提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、癌の治療と診断に使用するための物質に関する。特に本発明は、癌細胞の増殖を阻害することができる物質を提供する。
抗菌性タンパク質は、先天性免疫システムにおける主要なエフェクターである。ヒトカテリシジン（ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）抗菌性タンパク質であるｈＣＡＰ１８は、ヒトでしか知られていないカテリシジンであるが、これは、保存されたカテリン（ｃａｔｈｅｌｉｎ）ドメインと、ＬＬ−３７と呼ばれる可変性のＣ末端とからなる（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ等，１９９６，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １２３８：３２５〜３２；Ｚａｎｅｔｔｉ等，１９９５，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３７４：１〜５）。ホロタンパク質の細胞外のタンパク質分解プロセシングによりＬＬ−３７ペプチドが放出されるが、これは、広範な抗菌活性（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ等，１９９５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：７０８５〜９；Ａｇｅｒｂｅｒｔｈ等，１９９５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１９５〜９９）を有し、加えて、宿主細胞に対して作用も有しそのうちのいくつかは、Ｇタンパク質結合受容体、ホルミルペプチド受容体様１（ＦＰＲＬ１）が介在する（Ｙａｎｇ等，２０００，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０６９〜７４；Ｋｏｃｚｕｌｌａ等，２００３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１１：１６６５〜７２）。ｈＣＡＰ１８は、白血球に存在し（Ｃｏｗｌａｎｄ等，１９９５，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３６８：１７３〜７６）、皮膚およびその他の上皮で発現され、そこで炎症に付随してアップレギュレートされる（Ｃｏｗｌａｎｄ等，１９９５，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３６８：１７３〜７６；Ｆｒｏｈｍ等，１９９７，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：１５２５８〜６３）、および、傷害（Ｄｏｒｓｃｈｎｅｒ等，２００１，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １１７：９１〜９７；Ｈｅｉｌｂｏｒｎ等，２００３，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２０：３７９〜８９）は、先天性のバリア保護における役割と一致する。近年、カテリシジンなどの抗菌性タンパク質は、腫瘍に対する非特異的な宿主側防御においても役割を果たすことが提唱されている（Ｗｉｎｄｅｒ等，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２４２：６０８〜１２；Ｏｈｔａｋｅ等，１９９９，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １８１：３９３〜４０３）。
本発明の第一の形態は、癌細胞の増殖を阻害するための物質を提供し、ここにおいて、該物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を阻害する（すなわち、インビボで阻害することができる）。
ここでは、「物質」には、あらゆる化学物質が含まれ、例えばオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド模倣剤、および、小さい化合物である。
従って、本発明は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を、直接的に（例えば、タンパク質の生物活性を減少させることによって）、または、間接的に（例えば、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の発現を減少させることによって）阻害することができる物質を提供する。
好ましい実施態様において、該物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の転写、翻訳および／または結合特性を変化させることによってｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を阻害する。
このような物質は、当業界周知の方法を用いて同定することができ、例えば：
（ａ）ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のｍＲＮＡの発現レベルに対する試験物質の作用を決定すること（例えばサザンブロッティング、または、関連するハイブリダイゼーション技術で）；
（ｂ）ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のタンパク質レベルに対する試験物質の作用を決定すること（例えば抗ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７抗体を用いたイムノアッセイで）；および、
（ｃ）ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の活性の機能的なマーカー（例えばＥｒｂＢ２のリン酸化）に対する試験物質の作用を決定すること、
によって同定することができる。
本発明の好ましい実施態様において、物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の転写阻害剤である。
本発明のその代わりの実施態様において、該物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の翻訳阻害剤である。
本発明のさらなる実施態様において、該物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の結合特性の阻害剤である。例えば、該物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７がその受容体に結合できなくなるように、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のコンフォメーションを変化させるものでもよい。
当業者であれば当然であるが、該物質はまた、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７受容体の機能を直接ブロックすることによって、すなわちｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７受容体アンタゴニストとして作用することによって、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を阻害するものでもよい。好ましくは、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７受容体は、ＦＰＲＬ１である。
さらに本発明のその他の実施態様において、該物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７またはそのｍＲＮＡの安定性を調節すること（例えば減少させること）によって、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を阻害する。
有利には、該物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を選択的に阻害することができる。
「選択的に」とは、ここでは、該物質は、癌細胞中の他のタンパク質の活性を調節するよりも大きい程度にｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を阻害することを意味する。好ましくは、該物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性だけを阻害するが、当然のことながら、癌細胞内のその他のタンパク質の発現や活性は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の選択的な阻害の下流の結果として変化している可能性がある。従って、我々は、遺伝子発現および／または癌細胞の増殖に非特異的な作用を有する物質を排除する。
当業者であれば当然であるが、本発明の物質によるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性の阻害は、全体的であってもよいし、または、部分的であってもよい。例えば、該物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を、該物質に晒されていない癌細胞におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または、９０％、最も好ましくは１００％阻害する可能性がある。好ましい実施態様において、該物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を、該物質に晒されていない癌細胞におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性と比較して５０％またはそれ以上阻害することができる。
好ましくは、該物質は、以下のタイプの物質から選択される：
（ａ）短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子；
（ｂ）アンチセンスオリゴヌクレオチド；および、
（ｃ）ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７への結合親和性を有する化合物、例えばポリペプチド。
あるいは、該物質は低分子量の阻害化合物であってもよく、例えば、ビタミンＤに対するアンタゴニスト、例えばＺＫ１５９２２２（シエーリング社（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ））、および、ＴＥＩ−９６４７（帝人医学研究所（Ｔｅｊｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），東京）、ならびに、ビタミンＡに対するアンタゴニスト、例えばＡＧＮ１９３１０９（アレルゲン・ファーマシューティカルズ（Ａｌｌｅｒｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））。
本発明の第一の形態の好ましい実施態様において、該物質は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である。
ＲＮＡ干渉は、２工程からなるプロセスである。第一の工程（開始工程と名付ける）は、入ってきたｄｓＲＮＡを２１〜２３個のヌクレオチド（ｎｔ）の短鎖干渉（ｓｉＲＮＡ）に消化するが、これは恐らく、ＡＴＰ依存性の様式で、ｄｓＲＮＡ（直接導入された、または、導入遺伝子またはウイルスを介して導入された）をプロセシングする（切断する）ｄｓＲＮＡに特異的なリボヌクレアーゼのＲＮアーゼＩＩＩファミリーの一種であるダイサーの作用によってなされる。連続的な切断現象によって、ＲＮＡを、それぞれ２個のヌクレオチドからなる３’オーバーハングを有する１９〜２１ｂｐの二重鎖（ｓｉＲＮＡ）にまで分解する（ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ，２００２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２：２２５〜２３２；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３〜３６６）。
エフェクター工程において、ｓｉＲＮＡ二重鎖はヌクレアーゼ複合体に結合して、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。ｓｉＲＮＡ二重鎖のＡＴＰ依存性の巻き戻しが、ＲＩＳＣの活性化に必要である。次に、活性ＲＩＳＣは、塩基対形成による相互作用で相同的に転写することを標的として、ｍＲＮＡを、ｓｉＲＮＡの３’末端から１２個のヌクレオチドからなるフラグメントに切断する（ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ，２００２，上記；Ｈａｍｍｏｎｄ等，２００１，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．２：１１０〜１１９（２００１）；Ｓｈａｒｐ，２００１，Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．１５：４８５〜９０）。切断メカニズムをさらに解明すべきであるが、調査によれば、ＲＩＳＣはそれぞれ、単一のｓｉＲＮＡ、および、ＲＮアーゼを含むことが示されている（ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ，２００２，上記）。
ＲＮＡｉの驚くべき効力を考慮して、ＲＮＡｉ経路内の増幅工程が示唆されている。増幅は、入ってきたｄｓＲＮＡをコピーしてより多くのｓｉＲＮＡを生成することによって起こる場合もあるし、または、形成されたｓｉＲＮＡの複製によって起こる場合もある。あるいは、または、それに加えて、増幅は、ＲＩＳＣの転換を複数行うことによって実行されてもよい（Ｈａｍｍｏｎｄ等，２００１，上記；ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ，２００２，上記）。ＲＮＡｉに関するさらなる情報は、以下の総論で見出すことができる：Ｔｕｓｃｈｌ，２００１，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２：２３９〜２４５，Ｃｕｌｌｅｎ，２００２，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５９７〜５９９およびＢｒａｎｔｌ，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔ．１５７５：１５〜２５。
本発明との使用に適したＲＮＡｉ分子の合成は、以下のように実行することができる。まず、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のｍＲＮＡ配列を、ＡＡジヌクレオチド配列に関してＡＵＧ開始コドンの下流でスキャンする。各ＡＡの出現と、３’に隣接する１９個のヌクレオチドの出現を、可能性があるｓｉＲＮＡ標的部位として記録する。好ましくは、調節タンパク質結合部位において非翻訳領域（ＵＴＲ）がより豊富であるため、ｓｉＲＮＡ標的部位はオープンリーディングフレームから選択される。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性がある（Ｔｕｓｃｈｌ，ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．２：２３９〜２４５）。しかし当然ながら、非翻訳領域に向けられたｓｉＲＮＡも、有効である可能性がある。
第二に、配列アライメントソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用いて、可能性がある標的部位を適切なゲノムデータベース（例えばヒト、マウス、ラットなど）と比較する。他のコード配列に対して有意な相同性を示す推定上の標的部位を、フィルターをかけて除外する。
条件にあった標的配列を、ｓｉＲＮＡ合成のためのテンプレートとして選択する。好ましい配列は、低いＧ／Ｃ含量を含む配列であり、なぜならこれらは、遺伝子サイレンシングの媒介において、５５％より高いＧ／Ｃ含量を有するものと比較してより有効であることが証明されているためである。好ましくは、評価するために、標的遺伝子の長さに従って数種の標的部位が選択される。選択されたｓｉＲＮＡをよりよく評価するために、好ましくは、ネガティブコントロールが一緒に用いられる。好ましくは、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡは、選択されたｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を含むが、ゲノムに対する有意な相同性はない。従って、好ましくは、ｓｉＲＮＡのスクランブル化したヌクレオチド配列が用いられる（ただしこれらは、その他のあらゆる遺伝子に対する有意な相同性をまったく示さない）。
好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、配列番号１のヌクレオチド配列のフラグメント、または、このようなフラグメントの変異体を含む。
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のｍＲＮＡ（登録番号ＭＮ００４３４５）
Figure 2008525005
あるいは、ｓｉＲＮＡ分子は、ＥＮＳＧ０００００１６４０４７（ゲノム配列）から誘導されたヌクレオチド配列のフラグメントを含む。
「フラグメント」は、ここでは、少なくとも１０個のヌクレオチド、例えば少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のヌクレオチドを意味する。
「変異体」は、ここでは、配列番号１のフラグメントと少なくとも９０％の配列同一性を共有するヌクレオチド配列、例えば少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％の配列同一性を共有するヌクレオチド配列を意味する。
２種のポリヌクレオチド間の配列同一性（％）は、適切なコンピュータープログラム、例えばウィスコンシン大学のジェネティック・コンピューティング・グループ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）のギャップ・プログラム（ＧＡＰ ｐｒｏｇｒａｍ）を用いて決定してもよく、当然のことながら、同一性（％）は、配列が最適に並べられたポリヌクレオチドに関して計算される。
このようなアライメントは、別の方法で行って、クラスタルＷプログラム（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ ｐｒｏｇｒａｍ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等，１９９４，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０で説明されている通り）を用いてもよい。
用いられるパラメーターは、以下のようなものが可能である：
Ｆａｓｔのペアワイズアライメントパラメーター：Ｋ−ｔｕｐｌｅ（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ：５、ギャップペナルティー；３、トップの対角線の数；５。スコア付けの方法：ｘパーセント。
マルチアライメントのパラメーター：ギャップオープンペナルティー；１０、ギャップ伸長ペナルティー；０.０５。
スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
あるいは、局所的な配列アライメントを決定するためには、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを用いてもよい。
ｓｉＲＮＡ分子が、長さが１９〜２３個のヌクレオチドであることが有利である。
本発明の第一の形態の好ましいその代わりの実施態様において、該物質はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のレベル／活性を効率的に減少させるのに用いることができるアンチセンス分子の設計には、アンチセンス法に重要な２つの観点の考察が必要である。第一の観点は、癌細胞の細胞質へのオリゴヌクレオチドの送達であり、一方で、第二の観点は、細胞内で指示されたｍＲＮＡの翻訳を阻害するようにして、それらに特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。
従来技術では、多種多様の細胞型にオリゴヌクレオチドを効率的に送達するのに用いることができる多数の送達方策を教示している（例えば、Ｌｕｆｔ，１９９８，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７６：７５〜６；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ等，１９９８，Ｂｌｏｏｄ ９１：８５２〜６２；Ｒａｊｕｒ等，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ８：９３５〜４０；Ｌａｖｉｇｎｅ等，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３７：５６６〜７１；Ａｏｋｉ等，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３１：５４０〜５を参照）。
加えて、標的ｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとの両方における構造的な変化のエネルギー論を明らかにする熱力学的なサイクルに基づき、それらの標的ｍＲＮＡに対して最高の予想された結合親和性を有する配列を同定するためのアルゴリズムが利用可能である（例えば、Ｗａｌｔｏｎ等，１９９９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６５：１〜９を参照）。
また、インビトロでのシステムを用いて特異的なオリゴヌクレオチドの効率を設計および予想するためのアプローチもいくつか知られている（例えば、Ｍａｔｖｅｅｖａ等，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：１３７４〜１３７５を参照）。
いくつかの臨床的な追跡によって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実行可能性および活性が実証されている。例えば、癌の治療に適したアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が成功している（Ｈｏｌｍｌｕｎｄ等，１９９９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １：３７２〜８５；Ｇｅｒｗｉｔｚ，１９９９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １：２９７〜３０６）。さらに近年、ヒトヘパラナーゼ遺伝子発現のアンチセンスが介在する抑制は、マウスモデルにおいて、ヒト癌細胞の胸膜の内転移を阻害することが報告されている（Ｕｎｏ等，２００１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１：７８５５〜６０）。
従って、当業者であれば、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の発現をダウンレギュレートするのに適したアンチセンス法を容易に設計および実施することができる。
好ましくは、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１に記載のヌクレオチドのフラグメント、または、このようなフラグメントの変異体を含む。
有利には、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１５〜３５個の塩基である。例えば、２０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドは、上皮増殖因子受容体のｍＲＮＡの発現を阻害することが示されており（Ｗｉｔｔｅｒｓ等，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ ５３：４１〜５０（１９９９））、さらに、２５−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドは、副腎皮質刺激ホルモンの発現を９０％を超えて減少させることが示されている（Ｆｒａｎｋｅｌ等，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ９１：２６１〜７（１９９９））。しかし当然ながら、この範囲外の長さを有するオリゴヌクレオチド、例えば１０、１１、１２、１３もしくは１４個の塩基、または、３６，３７，３８，３９もしくは４０個の塩基からなるオリゴヌクレオチドを使用することが望ましい場合がある。
さらに当業者であれば当然ながら、オリゴヌクレオチドは、細胞の内因性ヌクレアーゼによって分解されるか、または、不活性化される。この問題を克服するために、例えば、天然に存在するホスホジエステル結合がその他の結合で置き換えられた改変インターヌクレオチド結合を有する、改変オリゴヌクレオチドを使用することが可能である。例えば、Ａｇｒａｗａｌ等（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，７０７９〜７０８３では、ＨＩＶ−１の組織培養において、オリゴヌクレオチドホスホルアミデートおよびホスホロチオエートを用いたところ阻害が増加したことが示されている。Ｓａｒｉｎ等（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，７４４８〜７４５１では、オリゴヌクレオチドメチルホスホナートを用いたところ、ＨＩＶ−１の阻害が増加したことが実証されている。Ａｇｒａｗａｌ等（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，７７９０〜７７９４では、ヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドホスホロチオエートを用いたところ、初期に感染させた細胞培養と、慢性的に感染させた細胞培養の両方においてＨＩＶ−１複製が阻害されることが示されている。Ｌｅｉｔｈｅｒ等（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，３４３０〜３４３４は、組織培養において、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートによりインフルエンザウイルス複製が阻害されることを報告している。
人工的な結合を有するオリゴヌクレオチドは、インビボでの分解に耐性であることが示されている。例えば、Ｓｈａｗ等（１９９１）は、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，７４７〜７５０で、その他の改変されていないオリゴヌクレオチドが、所定のキャッピング構造によって３’末端でブロックされると、それらはヌクレアーゼに対してインビボでより耐性になること、さらに、キャッピングされていないオリゴヌクレオチドのホスホロチオエートが、インビボで分解されないことを報告している。
オリゴヌクレオチドのホスホロチオエートを合成することによるＨ−ホスホナート法の詳細な説明は、ＡｇｒａｗａｌおよびＴａｎｇ（１９９０）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３１，７５４１〜７５４４で示されており、そこでの教示は参照により本明細書に加入させる。オリゴヌクレオチドのメチルホスホナート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、架橋ホスホルアミデート、および、架橋ホスホロチオエートの合成は、当業界既知である。例えば、ＡｇｒａｗａｌおよびＧｏｏｄｃｈｉｌｄ（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８，３５３９；Ｎｉｅｌｓｅｎ等（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２９，２９１１；Ｊａｇｅｒ等（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７，７２３７；Ｕｚｎａｎｓｋｉ等（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８，３４０１；Ｂａｎｎｗａｒｔｈ（１９８８）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．７１，１５１７；ＣｒｏｓｓｔｉｃｋおよびＶｙｌｅ（１９８９）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０，４６９３；Ａｇｒａｗａｌ等（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１４０１〜１４０５を参照（これらの教示は、この参照により本明細書に含まれる）。また、その他の合成または生産方法も可能である。好ましい実施態様において、上記オリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であるが、リボ核酸（ＲＮＡ）配列を合成して適用してもよい。
好ましくは、本発明において有用なオリゴヌクレオチドは、内因性の核酸分解酵素による分解に耐性を有するように設計される。インビボでのオリゴヌクレオチドの分解により、長さが減少したオリゴヌクレオチドの分解産物が生産される。このような分解産物は、非特異的なハイブリダイゼーションに関わる可能性がより高く、さらに、それに相当する全長の対応物に比べて有効である可能性はより低い。従って、体内での分解に対して耐性であり、さらに、標的化した細胞に到達することができるオリゴヌクレオチドを使用することが望ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、天然型ホスホジエステル結合を１個またはそれ以上の内部の人工的なインターヌクレオチド結合で置換することによって、例えば、結合内のリン酸を硫黄で置換することによって、インビボでの分解に対してより耐性にすることができる。使用可能な結合の例としては、ホスホロチオエート、メチルホスホナート、スルホン、硫酸塩、ケチル、ホスホロジチオエート、様々なホスホルアミデート、リン酸エステル、架橋ホスホロチオエート、および、架橋ホスホルアミデートが挙げられる。その他のインターヌクレオチド結合は当業界周知であるため、このような例は制限するものではなく、例証である。これらのホスホジエステルインターヌクレオチド結合が置換された結合を１個またはそれ以上有するオリゴヌクレオチドの合成は当業界周知であり、例えば、混合型のインターヌクレオチド結合を有するオリゴヌクレオチドを製造する合成経路が挙げられる。
オリゴヌクレオチドは、「キャッピング」によって、または、５’または３’末端のヌクレオチドに類似の基を取り込むことによって、内因性の酵素による伸長に対して耐性にすることができる。キャッピングのための試薬は、アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ，フォスターシティー，カリフォルニア州）製のアミノ−リンクＩＩTM（Ａｍｉｎｏ−Ｌｉｎｋ IITM）として市販されている。キャッピングに関する方法は、例えば、Ｓｈａｗ等（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，７４７〜７５０およびＡｇｒａｗａｌ等（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８（１７），７５９５〜７５９９によって説明されている。
オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼの攻撃に対して耐性にするさらなる方法は、それらを「自己安定化させること」であり、例えば、Ｔａｎｇ等（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１，２７２９〜２７３５で説明されている通りである。自己安定化したオリゴヌクレオチドは、それらの３’末端でヘアピンループ構造を有し、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、および、ウシ胎児血清による分解に対して高い耐性を示す。このようなオリゴヌクレオチドの自己安定化した領域は、ハイブリダイゼーションの際に相補的な核酸に干渉せず、さらに、マウスにおける薬物動態学的研究および安定性の研究によれば、それらの直鎖状の対応物と比べて、自己安定化したオリゴヌクレオチドはインビボで持久性が増加することが示されている。
本発明の物質のさらなる好ましい実施態様において、該物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７への結合親和性を有する化合物であり、例えばタンパク質、および、炭水化物である。
「結合親和性を有する化合物」とは、ここでは、インビボで、すなわち癌細胞の内部にｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７が存在するような生理学的条件下で、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に結合することができる化合物を意味する。
例えば、本化合物は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の活性部位に実質的に可逆的に結合してもよいし、または、実質的に不可逆的に結合してもよい。さらなる例において、本化合物は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のリガンドまたは受容体への結合に干渉するように、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の活性部位ではない部分に結合してもよい。さらにその他の実施例において、本化合物は、アロステリック作用によってタンパク質活性を減少させるように、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の一部に結合してもよい。このアロステリック作用は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の活性の天然の調節であってもよく、例えば「上流の活性化因子」によるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の活性化に関与するアロステリック作用である。
試験化合物とｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７との相互作用を検出する方法は当業界周知である。例えば、イオンスプレーマススペクトロスコピー／ＨＰＬＣ法を用いた限外ろ過、またはその他の物理的方法や分析方法を用いてもよい。加えて、蛍光エネルギー共鳴移動（ＦＲＥＴ）法を用いてもよく、ここにおいて、２つの蛍光標識された物体の結合は、互いに近接した際の蛍光標識相互の作用を測定することによって測定することもできる。
高分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質およびリン脂質）へのポリペプチドの結合を検出する代替法としては、表面プラズモン共鳴分析が挙げられ、これは例えば、Ｐｌａｎｔ等，１９９５，Ａｎａｌｙｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２６（２），３４２〜３４８で説明されている通りである。例えば放射標識または蛍光標識で標識されたポリペプチドを利用する方法も可能である。
このようなポリペプチドに結合することができる化合物を同定するさらなる方法は、ポリペプチドを化合物に晒し、化合物の前記ポリペプチドへのあらゆる結合を検出および／または測定する方法である。化合物のポリペプチドへの結合に関する結合定数を決定してもよい。化合物のポリペプチドへの結合を検出および／または測定する（定量する）のに適切な方法は当業者周知であり、例えば、ハイスループット操作が可能な方法（例えばチップベースの方法）を用いて行ってもよい。ＶＬＳＩＰＳTMと呼ばれる新しい技術により、何十万またはそれを超える種類の様々な分子プローブを含む極めて小さいチップの生産が可能になっている。これらの生物学的なチップまたはアレイは、アレイ中に配置されたプローブを有し、それぞれのプローブには特定の位置が割り当てられている。それぞれの位置に例えば１０ミクロンの目盛りを有する生物学的なチップが生産されている。このようなチップは、チップ上で標的分子がプローブのいずれかと相互作用するかどうかを決定するのに用いることができる。選択した試験条件下でアレイを標的分子に晒した後、スキャン装置によってアレイ中の各位置を試験し、その位置において標的分子はプローブとの相互作用を有するかどうかを決定することができる。
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７への結合親和性を有する化合物を同定するその他の方法は、酵母２ハイブリッドシステムであり、ここにおいて、本発明のポリペプチドを、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に結合するタンパク質を「捕獲する」ために用いることができる。酵母２ハイブリッドシステムは、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５〜２４６（１９８９）で説明されている。
この本発明の形態の好ましい実施態様において、該物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７へのリガンド結合能力を有する化合物である。
例えば、該物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７受容体（例えばＦＰＲＬ１）の可溶性フラグメントが可能である。あるいは、該物質は、抗体を模擬する高い親和性を有する分子（いわゆる「アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）」）が可能である（例えば、ＵＳ５,８３１,０１２、および、www.affibody.seを参照）。これらのリガンドは、小さく単純なタンパク質であり、プロテインＡ（細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来の表面タンパク質）のＩｇＧ結合ドメインのうち１つの足場をベースとした３個のヘリックスバンドルで構成される。この足場は、親和性リガンドとして優れた特徴を有し、どのような所定の標的タンパク質にも高い親和性で結合するように設計することができる。
しかしながら、有利には、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７への結合親和性を有する化合物は、ポリペプチドであるか、または、ポリペプチドを含む。
例えば、本化合物は抗体であってもよく、例えばモノクローナル、または、ポリクローナル抗体、または、それらの抗原結合フラグメントである。
「抗体」には、ここでは、実質的に無傷の抗体分子、加えて、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体（ここにおいて、少なくとも１個のアミノ酸が、天然に存在するヒト抗体と比べて突然変異している）、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、および、抗原結合フラグメント、ならびに、それらの誘導体が含まれる。
「抗原結合フラグメント」は、ここでは、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に結合することができる抗体の機能的なフラグメントを意味する。
好ましくは、抗原結合フラグメントは、Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖ、および、ジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、および、Ｆ（ａｂ）2フラグメント）、単一の可変性ドメイン（例えば、ＶｈおよびＶｌドメイン）、ならびに、ドメイン抗体（ｄＡｂｓ、単鎖様式と二重鎖様式［すなわちｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ］を含む）からなる群より選択される。
抗体全体よりも抗体フラグメントを用いる利点は数倍にもなる。フラグメントの大きさがより小さいと、より優れた固形組織への貫入のような薬理学的特性が改善される可能性がある。さらに、抗原結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体フラグメントは、Ｅ．Ｃｏｌｉで発現させ、分泌させてもよく、従って、大量の前記フラグメントを容易に生産することができる。
また、抗体およびそれらの抗原結合フラグメントの改変型も本発明の範囲内でであり、例えば、ポリエチレングリコールまたはその他の適切なポリマーが共有結合したことによって改変された改変型である。
抗体および抗体フラグメントの製造方法は当業界周知である。例えば、抗体は、インビボでの抗体分子生産の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング（Ｏｒｌａｎｄｉ等，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：３８３３〜３８３７；Ｗｉｎｔｅｒ等，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３〜２９９）、または、培養中の細胞系によるモノクローナル抗体分子の生成を用いた数種の方法のいずれか一つによって製造することができる。これらとしては、これらに限定されないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、および、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）−ハイブリドーマ技術が挙げられる（Ｋｏｈｌｅｒ等，１９７５．Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５０４９７；Ｋｏｚｂｏｒ等，１９８５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１〜４２；Ｃｏｔｅ等，１９８３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２０２６〜２０３０；Ｃｏｌｅ等，１９８４．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６２：１０９〜１２０）。
選択された抗原に適したモノクローナル抗体は、既知の技術によって製造してもよく、例えば、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｈ Ｚｏｌａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８８）、および、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｊ Ｇ Ｒ Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８２）で開示された技術によって製造してもよい。
抗体フラグメントは、当業界周知の方法を用いて得ることができる（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）。例えば、本発明に係る抗体フラグメントは、抗体を加水分解によるタンパク質分解により、または、このフラグメントをコードするＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉまたは哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞の培養物、またはその他のタンパク質発現系）中で発現させることによって製造できる。あるいは、抗体フラグメントは、従来の方法による抗体全体のペプシンまたはパパイン消化により得ることができる。
当業者であれば当然であるが、ヒトの治療または診断法には、好ましくはヒト化された抗体が用いられる。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化された形態は、好ましくは、非ヒト抗体から誘導された部分が最も少ない遺伝操作されたキメラ抗体または抗体フラグメントである。ヒト化抗体としては、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補性決定領域が、望ましい官能性を有するマウス、ラットまたはウサギのようなヒト以外の種（ドナー抗体）の相補性決定領域由来の残基で置き換えられた抗体が挙げられる。場合によっては、ヒト抗体のＦｖフレームワークの残基は、それに対応する非ヒトの残基で置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体でも、導入された相補決定領域またはフレームワーク配列でも見出されていない残基を含んでいてもよい。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全てを含むと予想され、ここにおいて、全ての、または、実質的に全ての相補決定領域は、非ヒト抗体の相補決定領域に相当し、全ての、または、実質的に全てのフレームワーク領域は、関連するヒトコンセンサス配列のフレームワーク領域に相当する。また、ヒト化された抗体は、最適には、抗体の定常領域（例えばＦｃ領域）の少なくとも一部も含み、典型的にはヒト抗体から誘導された上記領域の少なくとも一部である（例えば、Ｊｏｎｅｓ等，１９８６．Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２９；Ｐｒｅｓｔａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６を参照）。
非ヒト抗体をヒト化する方法は当業界周知である。一般的に、ヒト化抗体は、１またはそれ以上のアミノ酸残基がヒト以外の源からそこに導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基（導入された残基と称されることが多い）は、典型的には、導入された可変ドメインから取り入れられる。ヒト化は、実質的に、説明されている通りにして、ヒト相補決定領域をそれに対応するげっ歯類の相補決定領域で置換することによって行うことができる（例えば、Ｊｏｎｅｓ等，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ等，１９８８．Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４〜１５３６ｌ；ＵＳ４，８１６，５６７を参照）。従って、このようなヒト化抗体はキメラ抗体であり、ここにおいて、実質的に無傷のヒト可変ドメイン以外は、非ヒトの種由来のそれに対応する配列で置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはヒト抗体が可能であり、ここにおいて、いくつかの相補決定領域残基、場合によってはいくつかのフレームワーク残基は、げっ歯類の抗体における類似した部位由来の残基で置換されている。
また、ヒト抗体は、当業界既知の様々な技術を用いて同定することができ、このような技術としては、ファージディスプレイライブラリーが挙げられる（例えば、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ等，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１；Ｃｏｌｅ等，１９８５，Ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐｐ．７７；Ｂｏｅｒｎｅｒ等，１９９１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６〜９５を参照）。
適切な抗体が得られたら、それらを活性に関して試験してもよく、例えばＥＬＩＳＡで試験される。
本発明の第一の形態の具体的に好ましい実施態様において、該物質は、癌細胞に選択的に送達することができる、または、癌細胞によって選択的に活性化することができる。
「選択的に」は、ここでは、該物質のｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性に対する阻害作用が、癌細胞で、または、癌細胞内で選択的に作用することを意味する（ただし、該物質を癌細胞部位に局所投与することに起因する場合を除く）。
物質を癌細胞のような特定の細胞型に標的化する方法は当業界周知である（例えば、ＶａｓｉｒおよびＬａｂｈａｓｅｔｗａｒ，２００５，Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ．４（４）：３６３〜７４；Ｂｒａｎｎｏｎ−ＰｅｐｐａｓおよびＢｌａｎｃｈｅｔｔｅ，２００４，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．５６（１１）：１６４９〜５９およびＺｈａｏおよびＬｅｅ，２００４，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．５６（８）：１１９３〜２０４を参照）。
例えば、該物質は、標的細胞に特異的な部分を含んでいてもよい。
「標的細胞に特異的な」部分とは、ここでは、標的癌細胞上の物体を認識して結合する１またはそれ以上の結合部位を含む物質の部分を意味する。標的細胞と接触すると、標的細胞に特異的な部分は、阻害剤部分と共に内在化され得る。
標的細胞特異的な部分によって認識された物体は、標的癌細胞上で優勢に、好ましくは独占的に発現される。標的細胞に特異的な部分は、同じ標的細胞型で発現された異なる物体に対する１またはそれ以上の結合部位、または、２またはそれ以上の異なる標的細胞型で発現された異なる物体に対する１またはそれ以上の結合部位を含む可能性がある。
好ましくは、標的細胞特異的な部分は、高い結合活性を有する標的細胞を認識する。
「高い結合活性」は、ここでは、標的細胞特異的な部分が、少なくともＫd＝１０-6Ｍ、好ましくは少なくともＫd＝１０-9Ｍ適切にはＫd＝１０-10Ｍ、より適切にはＫd＝１０-11Ｍ、さらにより適切にはＫd＝１０-12Ｍ、より好ましくはＫd＝１０-15Ｍの結合定数を有する標的細胞を認識することを意味し、または、さらにＫd＝１０-18Ｍの結合定数を有する標的細胞を認識することも意味する。
認識される物体は、腫瘍細胞によって発現される適切なあらゆる物体が可能である。このような認識される物体は、抗原であることが多い。
抗原の例としては、表１で列挙したものが挙げられる。
Figure 2008525005
その他の抗原としては、アルファフェトプロテイン、Ｃａ−１２５、前立腺に特異的な抗原、および、上皮増殖因子受容体ファミリーの種類、すなわちＥＧＦＲ、ｅｒｂ Ｂ３およびｅｒｂ Ｂ４が挙げられる。
有利には、標的細胞に特異的な部分は、抗体（例えばモノクローナル抗体）、または、それらの抗原結合フラグメントである。好ましくは、このような抗体はヒト化抗体である。
都合のよい形態としては、標的細胞特異的な部分は、標的細胞に関する結合部位を２またはそれ以上を含み、ここにおいて、標的細胞に特異的な部分は、抗体またはそれらの２価フラグメントである。前記標的細胞に特異的な部分は、それぞれ互いに同じ物体を認識する「アーム」を有していてもよいし、または、異なる物体を認識する「アーム」を有していてもよい。
本発明の物質の一実施態様において、標的細胞に特異的な部分は、同じ標的細胞上で異なる分子を認識する２つの「アーム」を有し、ここにおいて、この同じ標的細胞上の分子は、その細胞型に限定されないが、２〜３種のその他の細胞型に存在する可能性がある。例えば、標的細胞特異的な部分の１つの「アーム」は、細胞型Ｉ、IIおよびIIIで分子を認識する可能性があるが、それに対して、他方の「アーム」は、細胞型Ｉ、IVおよびＶで分子を認識する可能性がある。従って、このような標的細胞特異的な部分を含む本発明の物質は、細胞型II、IIIおよびIVと比較して、細胞型Ｉへの大きい特異性を有すると予想される。この本発明の形態は、完全に標的細胞特異的な分子はほとんど発見されていないため特に有益であり、それに対して、いくつかの細胞型に存在し本発明のこの形態において有用な分子がよく知られている。このような分子は、一般的に、交叉反応性抗体が既知の細胞表面抗原である。
表１に列挙した抗原の多くに結合すると予想されるモノクローナル抗体はすでに既知であるが、どのような場合においても、モノクローナル抗体テクノロジーに関する現在の技術を用いれば、ほとんどの抗原（上記参照）に対する抗体を製造することができる。
認識される物体は抗原性であってもよいし、または、抗原性でなくてもよく、ただし、これらは、その他の何らかの方法で、認識し、選択的に結合してもよい。例えば上記物体は、特徴的な細胞表面受容体が可能であり、例えば、黒色腫細胞で大量に発現されるメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）に関する受容体である。あるいは、上記物体は、標的細胞中で誘導される物体であってもよい。続いて、細胞特異的部分は、非免疫的な意味で、例えば細胞表面酵素に関する基質またはそれらの類似体として、または、メッセンジャーとして、上記物体に特異的に結合する化合物またはそれらの一部であり得る。
好ましくは、高い結合活性の標的細胞に特異的な部分は、２またはそれ以上の異なる標的細胞に関する結合部位を含む。
標的細胞に関する異なる結合部位は、標的細胞上で発現された異なる物体に向けられた２種またはそれ以上の異なる抗体、または、それらのフラグメントであってもよいし、または、そうでなくてもよい。あるいは、標的細胞に関する異なる結合部位は、その他のいくつかの非免疫的な意味で、その標的細胞を認識し、選択的に結合することであってもよい。
当然のことながら、標的化部分は、本発明の阻害剤と、２つの部分の機能的な活性が保持されるようなあらゆる適切な手段で結合させてもよい。例えば、標的化部分と阻害剤部分がいずれもポリペプチドである場合、それらが互いに融合して融合ポリペプチドを形成してもよい。このような融合の例は当業者周知である。
本発明における選択的な阻害物質のその代わりの実施態様において、該物質は、癌細胞によって選択的に活性化されたプロドラッグである。
用語「プロドラッグ」は、本願で用いられる場合、癌細胞への細胞毒性が、親となる薬物と比較してより少なく、さらに、酵素による活性化またはより活性な親の形態への変換が可能な、医薬活性物質の前駆体または誘導体の形態を意味する（例えば、Ｄ．Ｅ．Ｖ．Ｗｉｌｍａｎ“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ” Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ １４，３７５〜３８２（６１５ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｂｅｌｆａｓｔ １９８６）ａｎｄ Ｖ．Ｊ．Ｓｔｅｌｌａ等“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ” Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒ．Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ等（編集）２４７〜２６７頁（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９８５）を参照）。
このようなプロドラッグ物質を生産する適切な方法は当業界周知である（例えば、Ｄｅｎｎｙ，２００４，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．２２（４）：６０４〜１９；Ｒｏｏｓｅｂｏｏｍ等，２００４，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ．２００４ ５６（１）：５３〜１０２；ＷＯ０３／１０６４９１を参照）。
プロドラッグ活性化のための酵素の選択には、数種の要素を考慮する必要がある。このような要素としては、酵素の分子量および物理特性、生理学的条件下でのそれらの活性および安定性、および、酵素が生成する薬物の性質が挙げられる。
これらの方策の適応性は、多数の機構的に別個の抗癌剤を放出し得る多種多様な酵素の使用に応じる。特に価値があるのは、単一のＭａｂ−酵素複合体が、相乗的な活性を有する治療上有効な用量の機構的に別個の抗癌剤を生成できることである。これは、免疫原性の理由で重要であることがわかる。このような観点において、多くのβ−ラクタマーゼは、それらの好ましい速度論と広範な基質の特異性、加えて、セファロスポリン基質の３’位に結合した置換基を除去するそれらの能力のために、多大な可能性を有している（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ等（１９９２）“Ｍａｂ−β−ｌａｃｔａｍａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ ｍｕｓｔａｒｄ ｐｒｏｄｒｕｇ”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３，１７６〜１８１を参照）。
多様なプロドラッグの活性化には、哺乳動物由来と非哺乳動物由来の酵素の両方が用いられている（Ｓｅｎｔｅｒ等，１９９３．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ４.３〜９；Ｓｅｎｔｅｒ等，１９９１．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ＶＩ，ｅｄ．Ｍ．Ｚ．Ａｔａｓｓｉ．Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，９７〜１０５頁）。哺乳動物由来の酵素は、減少した免疫原性のために有利である可能性があるが、それらが作用を与えるプロドラッグは、対応する内因性酵素の基質である可能性もある。
当業者であれば当然であるが、本発明の物質は、異なるタイプの癌細胞の増殖を阻害するのに用いてもよい。しかしながら、好ましい実施態様において、癌細胞（上皮性の癌細胞）は、上皮細胞または扁平細胞である。
有利には、癌細胞は、乳房、胆管、脳、結腸、胃、生殖器、肺および気道、皮膚、胆嚢、肝臓、上咽頭、神経細胞、腎臓、前立腺、リンパ腺、ならびに、消化管の癌細胞からなる群より選択される。
好ましくは、癌細胞は乳癌細胞である。より好ましくは、乳癌細胞はエルストン（Ｅｌｓｔｏｎ）のグレードがIIIの細胞である。最も好ましくは、乳癌細胞は転移性である。
本発明の第二の形態は、本発明の第一の形態に係る物質、および、製薬的に「許容できる賦形剤、希釈剤またはキャリアーを含む医薬組成物を提供する。従って、本発明はさらに、癌細胞の増殖を阻害するための医薬品を提供する。
本明細書で用いられるように、「医薬製剤」は、本発明に係る治療上有効な製剤を意味する。
本明細書で用いられる「治療有効量」または「有効量」または「治療上有効な」は、所定の条件および投与の処方計画で治療効果を提供する量を意味する。これは、必要な添加剤および希釈剤、すなわちキャリアーまたは投与用の基剤に関して望ましい治療効果が生じるように計算された活性物質の既定量である。さらに、これは、宿主の活性、機能および応答における臨床的に顕著な欠陥を減少させる、最も好ましくは予防するのに十分な量を意味することを目的とする。あるいは、治療有効量は、宿主の臨床的に顕著な状態に改善をもたらすのに十分な量である。当業者であれば当然であるが、化合物の量は、それらの特定の活性に応じて様々であってよい。適切な用量は、必要な希釈剤に関して望ましい治療効果が生じるように計算された既定量の活性組成物を含んでいてもよい。本発明の組成物の製造方法と使用において、治療有効量の活性成分が提供される。治療有効量は、通常の技術を有する医療または獣医学に関する作業者によって、患者の特徴、例えば年齢、体重、性別、状態、合併症、当業界周知のその他の病気などに基づき決定することができる。
従って、好ましい実施態様において、本発明は、癌細胞中のｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の活性を阻害するのに十分な量の本発明の物質、および、製薬上許容できるキャリアーを含む医薬製剤を提供する。
当業者であれば当然であるが、このような物質またはそれらの製剤の有効量は、単回大量投与（すなわち急性投与）として、または、より好ましくは長期にわたる連続した投与（すなわち長期にわたる投与）として送達してもよい。
本発明の物質は、使用される化合物の有効性／毒性、および、その使用される化合物の効能に応じて様々な濃度で製剤化することができる。好ましくは、この製剤は、本発明の物質を、０.１μＭ〜１ｍＭ、より好ましくは１μＭ〜１００μＭ、５μＭ〜５０μＭ、１０μＭ〜５０μＭ、２０μＭ〜４０μＭ、最も好ましくは約３０μＭの濃度で含む。インビトロでの用途の場合、製剤は、本発明の化合物を、より低い濃度で、例えば０.００２５μＭ〜１μＭで含んでいてもよい。
当業者であれば当然であるが、本発明の物質は、一般的に、目的とする投与経路および標準的な製薬上の実施を考慮して選択された適切な製薬用賦形剤、希釈剤またはキャリアーとの混合物として投与されると予想される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版，１９９５，Ａｌｆｏｎｓｏ Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，ペンシルベニア州，米国を参照）。
例えば、本発明の物質は、錠剤、カプセル、膣坐剤、エリキシル、溶液または懸濁液の形態で、経口、口腔または舌下投与することができ、これらはさらに、即時放出、遅延放出または制御放出の用途のための矯味矯臭薬剤または着色剤を含んでいてもよい。また、本発明の物質は、海綿体内注射によって投与してもよい。
このような錠剤は、賦形剤、例えば微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウムおよびグリシン、崩壊剤、例えばスターチ（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカスターチ）、ナトリウムスターチグリコレート、クロスカルメロースナトリウム、および、ある種のケイ酸塩複合体、および、顆粒結合剤（ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ ｂｉｎｄｅｒ）、例えばポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシ−プロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン、および、アラビアゴムを含んでいてもよい。加えて、潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルクが含まれていてもよい。
またゼラチンカプセルにおいては、充填剤として類似のタイプの固形組成物を用いてもよい。これに関する好ましい賦形剤としては、ラクトース、スターチ、セルロース、乳糖、または、高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁液および／またはエリキシルの場合、本発明の化合物は、様々な甘味剤または矯味矯臭薬剤、着色物質または色素、乳化剤および／または懸濁化剤、および、希釈剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリン、ならびに、それらの組み合わせと混合されていてもよい。
また、本発明の物質は、非経口投与することもでき、例えば、静脈内、関節内、動脈内、腹腔内、クモ膜下、心室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内または皮下に投与するか、または、輸液技術によって投与してもよい。これらは滅菌水溶液の形態で用いられることが最も良く、滅菌水溶液は、その他の物質を含んでいてもよく、例えば、溶液を血液と等張にするのに適した量の塩またはグルコースを含んでいてもよい。このような水溶液は、必要に応じて、適切に（好ましくはｐＨ３〜９に）緩衝化されているべきである。滅菌条件下での適切な非経口製剤の製造は、当業者周知の標準的な製薬技術によって容易に達成される。
非経口投与に適した製剤としては、水性および非水性滅菌注射液が挙げられ、これは、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、および、製剤を対象のレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでいてもよく；さらに、水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられ、これは、懸濁化剤および増粘剤を含んでいてもよい。このような製剤は、単位用量または複数回投与のための容器、例えば密封したアンプルおよびバイアルの中に入れてもよく、さらに、凍結乾燥した（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥した（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓｅｄ））状態でに保存してもよく、このような製剤は、使用直前に注射用の滅菌液状キャリアー（例えば水）を添加するだけでよい。即時型の注射液および懸濁液は、これまで説明した種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から製造することもできる。
人間の患者への経口および非経口投与のためには、本発明の物質の１日の用量レベルは、通常、成人一人当たり１〜１０００ｍｇ（すなわち約０.０１５〜１５ｍｇ／ｋｇ）と予想され、１回の用量で投与してもよいし、または、複数回の用量で投与してもよい。
また、本発明の物質は、鼻腔内投与してもよく、または、吸入法によって投与してもよく、都合のよい形態としては、乾燥粉末の吸入器の形態で送達されるか、または、加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー噴射の形態で適切な噴射剤を使用して送達され、ここにおいて、適切な噴射剤としては、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン、例えば１,１,１,２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４Ａ３または１,１,１,２,３,３,３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ２２７ＥＡ３）、二酸化炭素、またはその他の適切なガスが挙げられる。加圧されたエアロゾルの場合、投与単位は、定量を送達するバルブを提供することによって決定してもよい。加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーは、例えばエタノールと噴射剤（溶媒として）との混合物を用いた活性化合物の溶液または懸濁液を含んでいてもよく、この溶液または懸濁液は、加えて、潤滑剤（例えばトリオレイン酸ソルビタン）を含んでいてもよい。吸入器または注入器に使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えばゼラチンで製造された）は、本発明の化合物と、適切な粉末ベース（例えばラクトースまたはスターチ）との粉末混合物が含まれるように製剤化されてもよい。
エアロゾルまたは乾燥粉末製剤は、好ましくは、定量または「一吹き」それぞれが、患者に送達するための本発明の化合物を少なくとも１ｍｇ含むように調整される。当然のことながら、エアロゾルを用いた場合の総体的な１日用量は患者に応じて様々であると予想され、単回投与で投与してもよいし、または、より一般的には一日で複数回の用量で投与してもよい。
あるいは、本発明の物質は、坐剤または膣坐剤の形態で投与することができ、または、ローション、溶液、クリーム、軟膏または散粉剤の形態で局所に塗布してもよい。また、本発明の化合物は、例えば皮膚用パッチ剤の使用によって、経皮投与してもよい。また、これらは眼の経路で投与してもよい。
眼に使用する場合、本発明の物質は、等張のｐＨ調節した滅菌生理食塩水中の微粉化した懸濁液として、または、好ましくは、場合により塩化ベンザルコニウムのような保存剤と組み合わせた、等張のｐＨ調節した滅菌生理食塩水の溶液として、製剤化することができる。あるいは、本発明の物質は、ワセリンのような軟膏に製剤化しもよい。
皮膚に局所塗布するために、本発明の物質は、例えば以下：ミネラルオイル、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ろう、および、水のうち１種またはそれ以上の混合物に懸濁または溶解させた活性化合物を含む適切な軟膏として製剤化することができる。あるいは、本発明の物質は、例えば以下：ミネラルオイル、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および、水のうち１種またはそれ以上の混合物に懸濁または溶解させた適切なローションまたはクリームとして製剤化することができる。
口への局所投与に適した製剤としては、ロゼンジ（これは、フレーバーを付けた基剤、一般的にはスクロースおよびアラビアゴム、または、トラガカント中に活性成分を含む）；香錠（これは、不活性な基剤、例えばゼラチンおよびグリセリン、または、スクロースおよびアラビアゴム中に活性成分を含む）；および、うがい薬（これは、適切な液状キャリアー中に活性成分を含む）が挙げられる。
該物質がポリペプチドの場合、持続放出性の薬物送達システムを使用することが好ましい場合があり、例えばマイクロスフェアである。これらは特に、注射の頻度が少なくなるように設計される。このようなシステムの例は、ニュートロピン（Ｎｕｔｒｏｐｉｎ）デポー剤であり、これは、生分解性のマイクロスフェアに組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）をカプセル封入したものであり、一度注射されると、ある期間持続的にｒｈＧＨを徐放する。
あるいは、本発明のポリペプチド剤は、必要な部位に薬物を直接放出する外科的に埋め込まれた装置によって投与することができる。
また、タンパク質およびポリペプチドを投与するために、エレクトロポレーション治療（ＥＰＴ）システムを用いることもできる。細胞にパルス電場を送達する装置は、細胞膜の薬物に対する透過性を高め、それにより、細胞内薬物送達がかなり強化される。
また、タンパク質およびポリペプチドは、エレクトロインコーポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＥＩ）によって送達することもできる。皮膚表面上の直径３０ミクロン以下の小さい粒子が、エレクトロポレーションで用いられる電気パルスと同一な、または、それに類似した電気パルスを受けると、ＥＩが起こる。ＥＩにおいて、これらの粒子は角質層を通過して、皮膚のより深い層に侵入する。このような粒子は、薬物または遺伝子を充填していてもよいし、もしくはそれらで被覆されていてもよく、または、単に、皮膚に孔を生成する「弾丸」（そこを通過して薬物が入る）として作用してもよい。
タンパク質およびポリペプチドを送達する代替法は、注射用の感熱性のＲｅＧｅｌである。体温より低温では、ＲｅＧｅｌは注射可能な液体であるが、体温では、それは即座にゲルの貯蔵所を形成し、それが既知の安全な生分解性ポリマーにゆっくり浸透し溶解する。バイオポリマーが溶解するにつれて、活性な薬物が長期にわたり送達される。
また、タンパク質およびポリペプチド医薬は、経口的に送達することもできる。このようなシステムの一つは、体内の経口によるビタミンＢ１２摂取のための天然のプロセスを用いて、タンパク質およびポリペプチドを共に送達するものである。ビタミンＢ１２摂取システムに便乗することによって、タンパク質またはポリペプチドは腸壁を通過して移動が可能になり、ビタミンＢ１２類似体と薬物との複合体が生産され、この複合体は、複合体のビタミンＢ１２部分における内因子（ＩＦ）への有意な親和性と、複合体の薬物部分の有意な生物活性との両方を保持する。
また、本発明のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド剤の投与方法は、当業界でもよく知られている（Ｄａｓｓ，２００２，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５４（１）：３〜２７；Ｄａｓｓ，２００１，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．８（４）：１９１〜２１３；Ｌｅｂｅｄｅｖａ等，２０００，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．５０（１）：１０１〜１９；Ｐｉｅｒｃｅ等，２００５，Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．５（１）：４１〜５５；ＬｙｓｉｋおよびＷｕ−Ｐｏｎｇ，２００３，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２００３ ２（８）：１５５９〜７３；Ｄａｓｓ，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０（Ｐｔ ２）：１１３〜２２；Ｍｅｄｉｎａ，２００４，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．１０（２４）：２９８１〜９を参照）。
例えば、本発明のコンストラクトは、レトロウイルスに関連する方法によってコンストラクトが細胞のゲノムに挿入されるようにして、細胞に導入することもできる。例えば、Ｋｕｒｉｙａｍａ等（１９９１）Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃ．ａｎｄ Ｆｕｎｃ．１６，５０３〜５１０では、精製したレトロウイルスが投与されている。上述のようなポリヌクレオチドを含むレトロウイルスのＤＮＡコンストラクトは、当業界周知の方法を用いて作製することができる。このようなコンストラクトから活性なレトロウイルスを生産するために、通常、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させたエコトロピック・サイ２（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ ｐｓｉ２）パッケージング細胞系を使用する。細胞系のトランスフェクションは、都合のよい形態として、リン酸カルシウムの共沈殿によってなされ、安定な形質転換株が、Ｇ４１８を最終濃度１ｍｇ／ｍｌまで添加することによって選択される（レトロウイルスのコンストラクトが、ｎｅｏＲ遺伝子を含むと仮定する）。独立したコロニーを単離し、拡張し、培養上清を除去し、孔サイズ０.４５μｍのフィルターでろ過し、−７０℃で保存する。腫瘍細胞にレトロウイルスを導入するためには、１０μｇ／ｍｌのポリブレンが添加されたレトロウイルス上清を直接注入することが便利である。直径１０ｍｍを超える腫瘍の場合、レトロウイルス上清を０．１ｍｌ〜１ｍｌ；好ましくは０．５ｍｌ注入することが適切である。
あるいは、Ｃｕｌｖｅｒ等（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６，１５５０〜１５５２で説明されているように、レトロウイルスを生産する細胞が注射される。このようにして導入されたレトロウイルス生産細胞は、腫瘍塊内でインサイチュでベクターの連続生産が起こるように、レトロウイルスベクター粒子を活発に生産するように加工される。従って、増殖中の細胞は、レトロウイルスベクター生産細胞と混合されると、インビボでうまく形質導入を起こすことができる。
また、標的化されたレトロウイルスも本発明での使用に利用可能である；例えば、特異的な結合親和性を付与する配列を、予め存在するウイルスｅｎｖ遺伝子に組み入れてもよい（このような標的化ベクターおよびその他の遺伝子治療のための標的化ベクターの総論として、ＭｉｌｌｅｒおよびＶｉｌｅ（１９９５）Ｆａｓｅｂ Ｊ．９，１９０〜１９９を参照）。
その他の方法は、限られた時間、または、ゲノムに組み込んだ後より長い時間、コンストラクトを細胞で発現させるための、コンストラクトの細胞への単純な送達に関する方法である。後者のアプローチの例としては、リポソームが挙げられる（Ｎaｓｓａｎｄｅｒ等（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２，６４６〜６５３）。
イムノリポソームの製造のために、ＭａｒｔｉｎおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，２８６〜２８８の方法に従って、ＭＰＢ−ＰＥ（Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル］−ホスファチジルエタノールアミン）が合成される。ＭＰＢ−ＰＥはリポソームの二重層に取り込まれ、抗体またはそれらのフラグメントを、リポソーム表面に共有結合させることができる。都合のよい形態としては、このようなリポソームは、標的細胞への送達のために本発明の物質（例えば、ＤＮＡまたはその他の遺伝学的なコンストラクト）が充填されており、これは例えば、上記物質の溶液中で前記リポソームを形成し、続いて、孔径０．６μｍおよび０．２μｍを有するポリカーボネートメンブレンフィルターを介して０．８ＭＰａ以下の窒素圧下で連続的に押出すことによってなされる。押出し後、捕獲されたＤＮＡコンストラクトは、８００００×ｇで４５分間超遠心分離することによって遊離のＤＮＡコンストラクトから分離される。脱酸素した緩衝液中で新たに製造されたＭＰＢ−ＰＥ−リポソームを、新たに製造された抗体（またはそれらのフラグメント）と混合し、窒素雰囲気中、４℃で一定して転倒回転させて、一晩カップリング反応を行う。イムノリポソームは、８００００×ｇで４５分間超遠心分離することによって未結合の抗体から分離される。イムノリポソームは、腹腔内に注射してもよいし、または、腫瘍に直接注射してもよい。
その他の送達方法としては、抗体−ポリリジン架橋を介したアデノウイルスを有する外来ＤＮＡ（Ｃｕｒｉｅｌ Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．４０，１〜１８を参照）、および、キャリアーとしてのトランスフェリン−ポリカチオン結合体（Ｗａｇｎｅｒ等（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，３４１０〜３４１４）が挙げられる。これらの方法はまず、本発明のオリゴヌクレオチド剤を用いてポリカチオン−抗体複合体を形成し（この抗体は、野生型アデノウイルス、または、変異型アデノウイルスのいずれかに特異的である）、この段階で抗体に結合する新しいエピトープが導入されている。このオリゴヌクレオチド剤に、リン酸骨格との静電的相互作用を介してポリカチオン部分が結合する。アデノウイルスは、変化していないファイバーとペントンタンパク質を含むため、細胞の内側に入り、自身と共に本発明のオリゴヌクレオチド剤を細胞に運搬する。ポリカチオンがポリリジンである場合が好ましい。
また、オリゴヌクレオチド剤はアデノウイルスによって送達されてもよく、ここにおいて、オリゴヌクレオチド剤は、例えば以下で説明されるようにアデノウイルス粒子内に存在する。
代替法で、受容体介在エンドサイトーシスを利用してＤＮＡ高分子を細胞に運搬する高効率の核酸送達システムが用いられる。これは、鉄−輸送タンパク質トランスフェリンを、核酸と結合するポリカチオンに結合させることによって達成される。ヒトトランスフェリン、もしくは、ニワトリ相同体コンアルブミン、またはそれらの組み合わせは、小さいＤＮＡ結合タンパク質プロタミンに、または、様々なサイズのポリリジンにジスルフィド結合を介して共有結合する。これらの改変トランスフェリン分子は、それらの同源の受容体と結合し、効率的な細胞への鉄輸送を媒介するそれらの能力を維持している。トランスフェリン−ポリカチオン分子は、核酸サイズとは無関係に（短いオリゴヌクレオチドから、２１キロ塩基対のＤＮＡに至る）、本発明のＤＮＡコンストラクトまたはその他の遺伝学的コンストラクトと共に電気泳動で安定な複合体を形成する。トランスフェリン−ポリカチオン複合体と、本発明のＤＮＡコンストラクトまたはその他の遺伝学的コンストラクトとが腫瘍細胞に供給されると、細胞中でコンストラクトからの高レベルの発現が期待される。
また、Ｃｏｔｔｅｎ等（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，６０９４〜６０９８の方法によって生産された欠陥のある、または化学的に不活性化されたアデノウイルス粒子のエンドソームの破壊活性を用いた、本発明のＤＮＡコンストラクトまたはその他の遺伝学的コンストラクトの高効率の受容体介在送達を用いてもよい。このアプローチは、アデノウイルスは、リソソームを経由する通路ではなく、例えば本発明のＤＮＡコンストラクトまたはその他の遺伝学的コンストラクトに結合しているトランスフェリンの存在下でエンドソームからそれらのＤＮＡが放出されるように適合されるという事実に依存するようであり、このコンストラクトは、アデノウイルス粒子と同じ経路で細胞に取り込まれる。
このアプローチは、複合型のレトロウイルスコンストラクトを使用するする必要がない；レトロウイルス感染に付随して起こるようなゲノムの永続的な改変が起こらない；および、標的化された発現系は、標的化された送達システムとカップリングされるため、その他の細胞型への毒性を減少させるという利点を有する。
当然のことながら、「裸のＤＮＡ」、および、カチオン性および中性脂質と複合体化したＤＮＡも、本発明のＤＮＡを治療しようとする個体の細胞に導入することにおいて有用であり得る。遺伝子治療への非ウイルスアプローチは、Ｌｅｄｌｅｙ（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６，１１２９〜１１４４で説明されている。
また、その代わりの標的化送達システムも既知であり、例えばＷＯ９４／１０３２３で説明されている改変アデノウイルスシステムであり、ここにおいて、ＤＮＡは、典型的にはアデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子内に保持されている。Ｍｉｃｈａｅｌ等（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２，６６０〜６６８では、ファイバータンパク質に細胞選択的な部分を付加するためのアデノウイルスの改変を説明している。また、Ｂｉｓｃｈｏｆｆ等（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４，３７３〜３７６で説明されているのような、ｐ５３欠失ヒト腫瘍細胞中で選択的に複製する突然変異アデノウイルスも、細胞に本発明の遺伝学的コンストラクトを運搬するのに有用である。従って、当然のことながら、本発明のさらなる形態は、本発明の遺伝学的コンストラクトを含むウイルスまたはウイルス様粒子を提供する。その他の適切なウイルスまたはウイルス様粒子としては、ＨＳＶ、ＡＡＶ、ワクシニア、および、パルボウイルスが挙げられる。
さらなる実施態様において、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の機能を選択的に予防する物質は、標的化ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のｍＲＮＡまたはＤＮＡを切断することができるリボザイムである。前記リボザイムを発現する遺伝子は、アンチセンス分子の場合と実質的に同様に、および、アンチセンス分子での賦形剤と実質的に同じ賦形剤を用いて投与してもよい。
本明細書で開示されたウイルスまたはウイルス様粒子のゲノムにコード可能なリボザイムは、ＵＳ５,１８０,８１８、ＵＳ５,１６８,０５３、ＵＳ５,１４９,７９６、ＵＳ５,１１６,７４２、ＵＳ５,０９３,２４６、および、ＵＳ４,９８７,０７１で説明されている。
当然のことながら、細胞特異的プロモーター構成要素から、アンチセンス分子またはリボザイムが発現されることが望ましい場合がある。
本発明の製剤の具体的に好ましい実施態様において、該製剤は、本発明の物質の癌細胞への標的化された送達が可能である。
さらに当業者であれば当然ながら、本発明の物質および医薬製剤は、医学分野と獣医学分野の両方において有用性を有する。従って、本発明の物質は、ヒトの治療で用いてもよいし、ヒト以外の動物（例えばウマ、イヌおよびネコ）の治療で用いてもよい。しかしながら、好ましくは患者はヒトである。
本発明の第三形態は、患者における癌細胞の増殖を阻害する方法を提供し、該方法は、患者に、本発明の第一の形態に係る物質、または、本発明の第二の形態に係る医薬製剤を投与することを含む。
好ましくは、患者はヒトである。
有利には、該物質は、癌細胞に選択的に送達されるか、または、癌細胞によって選択的に活性化される。
従って、本発明はさらに、医薬に使用するための、本発明の第一の形態に係る物質を提供する。
好ましくは、該物質は、癌の治療に使用するためである。
「治療」は、ここでは、患者の治療的処置と予防的処置の両方を含める。用語「予防」は、本明細書で説明されているポリペプチドまたは製剤を、患者または被検体において癌を予防する、または、癌の可能性を減少させるために使用することを包含するものとして用いられる。
上記で考察されたように、用語「有効量」は、本明細書において、治療される病気または状態に好都合な変化を起こすために使用可能な、本発明に係る化合物の濃度または量を説明するために用いられ、ここにおいて、このような変化は、治療された病気または状態に応じて、治療された病状または状態の緩和、好都合な生理学的な結果、回復または低減、状態または病状が発生する見込みの予防または減少である。本発明の物質が組み合わせて用いられる場合、それぞれの物質は、有効量で用いてもよく、ここにおいて、有効量は相乗効果を生じる量を含んでいてもよい。
本発明のさらにその他の形態は、癌細胞の増殖を阻害するための医薬品の製造における、本発明の第一の形態に係る物質を提供する。
有利には、癌細胞（上皮性の癌細胞）は上皮細胞である。あるいは、癌細胞は扁平細胞であってもよい。
都合のよい形態としては、癌細胞は、乳房、胆管、脳、結腸、胃、生殖器、肺および気道、皮膚、胆嚢、肝臓、上咽頭、神経細胞、腎臓、前立腺、リンパ腺、ならびに、消化管の癌細胞からなる群より選択される。
好ましくは、癌細胞は乳癌細胞である。より好ましくは、乳癌細胞はエルストン（Ｅｌｓｔｏｎ）のグレードがIIIの細胞である。最も好ましくは、乳癌細胞は転移性である。
本発明の第六の形態は、患者における癌細胞を検出する方法を提供し、該方法は、以下の工程を含む：
（ａ）試験しようとする患者からの細胞サンプルを提供する工程；
（ｂ）該細胞によって生産されたｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の量を（直接的または間接的に）測定する工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）で測定されたｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の量と、健康な細胞によって生産されたｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の量とを比較する工程（ここにおいて、該患者からの細胞サンプルにおけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生産のレベルが、健康な細胞におけるレベルと比較して高いことは、該細胞が癌細胞であることを示す）。
従って、本方法は、患者の癌を診断する方法を提供する。
好ましい実施態様において、工程（ａ）における細胞は、乳房、胆管、脳、結腸、胃、生殖器、肺および気道、皮膚、胆嚢、肝臓、上咽頭、神経細胞、腎臓、前立腺、リンパ腺、ならびに、消化管の細胞からなる群より選択される。
例えば、工程（ａ）における細胞サンプルは、腫瘍由来でもよいし、または、腫瘍の可能性がある組織由来でもよい。
好ましくは、工程（ｂ）は、該細胞サンプルと、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に結合する物質とを接触させること、続いて、それに結合したｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の量を検出することを含む。
サンプル中のタンパク質検出に適した方法は、当業界周知であり、例えばラジオイムノアッセイおよびＥＬＩＳＡである。
有利には、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に結合する物質は、抗体、または、それらの抗原結合フラグメントである。
一実施態様において、工程（ｂ）は、（ｉ）該細胞と、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に結合する物質とを接触させること、および、（ii）抗体、または、それらの抗原結合フラグメントを用いて、該物質に結合するｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の量を検出することを含む。例えば、工程（ｂ）は、ＥＬＩＳＡによって行ってもよい。
その代わりの実施態様において、工程（ｂ）は、該細胞中のｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のｍＲＮＡの量を測定することを含む。適切な方法は当業界周知である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照）。
都合のよい形態としては、工程（ｂ）は、サザンブロット、または、ＲＴ−ＰＣＲによって行われる。
本発明の第七の形態は、患者における癌の進行をモニターする方法を提供し、該方法は：
（ａ）第一の時点で患者から回収された細胞のサンプルを提供すること、および、本発明の第六の形態に記載の方法を用いて、そこに含まれる癌細胞を検出すること；
（ｂ）第二の時点で患者から回収された細胞のサンプルを提供すること’、および、本発明の第六の形態に記載の方法を用いて、そこに含まれる癌細胞を検出すること；および、
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）で測定された癌細胞の数を比較すること（ここにおいて、工程（ｂ）で測定された癌細胞の数が、工程（ａ）と比較して高いことは、癌が進行していることの指標である）、
を含む。
本発明のさらなる形態は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７、または、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のｍＲＮＡに結合する物質を含む、本発明の第六の形態に記載の方法を行うための診断キットを提供する。
好ましい実施態様において、本キットは、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に結合することができる抗体、または、それらの抗原結合フラグメントを含む（上記参照）。本キットは、例えばＥＬＩＳＡに使用するための、このような一次抗体に結合することができる二次抗体をさらに含んでいてもよい。
その代わりの実施態様において、本キットは、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドは、配列番号１に記載のヌクレオチドの配列フラグメント、または、それらの変異体を含む、または、それらからなる。当然のことながら、プローブは、高いストリンジェンシー条件下でｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズすることができるものと予想される。有利には、本キットは、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のｍＲＮＡのＰＣＲ増幅に適したプライマー対を含む。
標的ｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズすることができるＰＣＲプライマーおよびその他のハイブリダイゼーションプローブの設計、および、それらの使用方法は当業界周知であり、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌを参照。
好ましい実施態様において、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に結合する物質、および／または、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズすることができる物質は、検出可能な部分を含む。
「検出可能な」は、ここでは、検出可能な種の生産に直接的または間接的に関与する単一の原子および分子を含める。適切な検出可能な成分は医薬品化学において周知であり、これらの成分のポリペプチドおよびタンパク質への結合も当業界周知である。検出可能な成分の例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：放射性同位体（例えば、3Ｈ、14Ｃ、35Ｓ、123Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、99Ｔｃ、111Ｉｎ、90Ｙ、188Ｒｅ）、放射性核種（例えば、11Ｃ、18Ｆ、64Ｃｕ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド・リン（ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒ）、カルボシアニン）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光性のビオチニル基、および、第二のレポーターによって認識された既定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対の配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施態様において、標識は、立体障害が起こる可能性を減少させるために様々な長さのスペーサーアームによって取り付けられる。
好ましくは、本診断キットは、少なくとも１回の分析に十分な量の診断薬を、別々に包装された試薬として含む。また、包装された試薬の使用説明書も通常含まれる。このような説明書は通常、試薬濃度、および／または、少なくとも１つの分析法パラメーター、例えば、混合する試薬とサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物の維持期間、温度、緩衝液条件などを説明する具体的な表現を含む。
本発明の好ましい形態を、以下の図を参照しながら、以下の非限定的な実施例で説明する：
図１−ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は、乳癌で高度に発現される
（Ａ）グレードIIIの乳管内乳癌（患者番号７，表２）の切片であり、島状の間質（ｓｔ）を取り囲んで腫瘍細胞中のｈＣＡＰ１８タンパク質に関する強い免疫反応性を示す（赤色の沈殿）。（Ｂ）インサイチュハイブリダイゼーションは、同じ組織からの切片中のｈＣＡＰ１８のｍＲＮＡに適合するシグナルを示す。強いオートラジオグラフィーシグナルは、暗視野照明下では白色の粒子のように見える。（Ｃ）癌細胞の高出力の表示は、免疫反応性を欠いている腫瘍細胞に隣接する免疫反応細胞を強く実証している。（Ｄ）血管内のｈＣＡＰ１８免疫反応性の乳癌細胞である。（Ｅ）カテリン組換えペプチドを用いた免疫吸着法によって、ｈＣＡＰ１８の免疫反応性が完全になくなった（図１Ａと同じ組織）。（Ｆ）免疫吸着法の際のポジティブコントロールとしての、ｈＣＡＰ１８に関する一般的な免疫染色である（図１Ａと同じ組織）。（Ｇ）正常な乳腺上皮は、ｈＣＡＰ１８に対して弱い免疫反応性を示す。顕微鏡写真（Ａ，Ｃ〜Ｇ）は、ｈＣＡＰ１８抗体（１：５００希釈）を用いて得られた結果を示す。スケールバー（Ａ，Ｂ）＝１００μｍ；（Ｃ，Ｄ）＝２５μｍ；（Ｅ，Ｆ，Ｇ）＝１０μｍ。
図２−乳癌において、ｈＣＡＰ−１８／ＬＬ−３７は免疫ブロッティングで検出される
患者の臨床データは表２に示す（サンプル１〜１０）。組換えカテリン（Ｃ）とＬＬ−３７ペプチド（Ｌ）を大きさの参照として用いた。正常な乳房組織は、レーン１に示される。エルストングレードＩの腫瘍は、レーン２、４および５に示される。グレードIIの腫瘍は、レーン３に示され、グレードIIIの腫瘍は、レーン６〜１０に示される。全ての組織において、無傷の未加工の１８ｋＤａのホロタンパク質に相当する免疫反応を示すバンドが見つかった。５種のグレードIIIの腫瘍（番号７〜１０）のうち４種に、加工したＬＬ−３７ペプチド（４ｋＤ）が見られた。
図３−上皮細胞におけるｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現は、細胞増殖を高める
（Ａ）上のパネル、左のレーン；ＨＥＫ２９３抽出物における抗ＬＬ３７抗血清での免疫ブロッティングである。バイシストロン性のベクターｈＣＡＰ１８＋ＥＧＦＰ（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）でトランスフェクションされた細胞は、ｈＣＡＰ１８タンパク質の発現を示す。上のパネル、右のレーン；ＥＧＦＰ（Ｅ）のみでトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞である。下のパネル；ＨＥＫ２９３細胞（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）は、コントロール細胞（Ｅ）と比較してより有意に高い増殖速度を示した（フローサイトメトリーで評価）。ポンソー染色は、ローディング用のコントロールとして示される。（Ｂ）上のパネル、左のレーン；（Ａ）で説明されているようなトランスフェクションされたＨａＣａＴ細胞である。下のパネル；ｈＣＡＰ１８でトランスフェクションされたＨａＣａＴ細胞は、コントロール細胞と比較してより有意に高い増殖速度を示す（3Ｈ−チミジン取り込みで評価）。
図４−合成ＬＬ−３７ペプチドを用いた治療により、上皮細胞の細胞増殖が増加する
血清飢餓によって７２時間同調させ、次に、１０μｇ／ｍｌの合成の生物学的に活性なＬＬ−３７ペプチドで３６時間処理した（ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳ＋ＰＥＳＴ中で）ＨａＣａＴ細胞は、未処理の（コントロール）ＨａＣａＴ細胞と比較して有意に増加した細胞増殖を示す。増殖速度を［3Ｈ］−チミジンの取り込みを用いて評価した。
図５−ＬＬ−３７受容体ＦＰＲＬ１は、乳癌および正常な乳腺上皮で発現される
（Ａ）腫瘍細胞中のＦＰＲＬ１受容体に対して顕著な免疫反応性を有する、エルストンのグレード２の乳管内乳癌（患者番号１２、表２）の切片（赤色の沈殿）である。（Ｂ）管内領域でＦＰＲＬ１に対する免疫反応性を示す正常な乳腺上皮の切片である（赤色の沈殿）。顕微鏡写真は、１：４００で希釈したＦＰＲＬ１抗血清を用いてで得られた結果を示す。スケールバー（Ａ）＝５０μｍ；（Ｂ）＝１０μｍ。（Ｃ）免疫ブロッティングにより、ＬＬ−３７受容体、ＦＰＲＬ１が、正常な（Ｎ）組織と乳癌（Ｔ）組織の両方で発現されたことが明らかになった。（Ｄ）リアルタイムＰＣＲにより、バイシストロン性のベクターｈＣＡＰ１８＋ＥＧＦＰ（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）でトランスフェクションされたＨａＣａＴは、ＦＰＲＬ１受容体ｍＲＮＡの有意に増加した発現を示す。ＥＧＦＰ（Ｅ）のみでトランスフェクションされたＨａＣａＴ細胞を、コントロールとして利用した。
図６−エストロゲン受容体（ＥＲ）、および、リンパ節（Ｎ）陽性の乳房腫瘍における、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の発現の増加（対数目盛で表示）である
ＲＮＡを、１４０種の乳房腫瘍と４種の罹患していない乳房組織サンプルから抽出し、プライマーとしてランダムヘキサマーを用いて逆転写した。ｈＣＡＰ１８転写物の発現を、標準的なプロトコールに従ってリアルタイムＰＣＲでｃＤＮＡ１０ｎｇを用いて決定した。このサンプルを１８Ｓ−ＲＮＡの定量化によって標準化した。罹患していないサンプルの平均の発現を、任意に１に設定した。平均および偏差はＡｎｏｖａ統計によって評価される。
図７−ＨＥＫ細胞（Ａ）およびＨａＣａｔ細胞（Ｂ）において、ＬＬ−３７は、カンプトテシンにより誘導されたアポトーシスを阻害する
Ａ．サブコンフルエントな細胞を、様々なＬＬ−３７（１／２および４μＭ）濃度で２４時間処理した。培地単独で処理した細胞をコントロール細胞（ａ）として用いた。次に、この細胞を、６μＭカンプトテシンの非存在下（ａ〜ｄ）または存在下（ｅ〜ｈ）でさらに２４時間培養した。回収した細胞を、２色のアポトーシス分析とフローサイトメトリーで加工し、蛍光強度に従い象限解析によって、生存可能（蛍光がない、または、ほんのわずか）、アポトーシス（ＦＬ−１ＹＯＰＲＯ色素に関して陽性）、および、壊死（ＦＬ−１とＰＩ蛍光の両方に関して陽性）と分類した。この図は、それぞれ３連で行われた３つの独立した実験の代表を示す。
Ｂ．アポトーシス細胞の定量分析である。
図８−ＨＥＫｎ細胞をＬＬ−３７で前処理することによって、カンプトテシンにより誘導されたアポトーシスから保護することを示すＨＥＫｎ細胞のフローサイトメトリー解析である
１または２μＭのＬＬ−３７で２４時間処理した細胞（ｂ，ｃ，ｅ，ｆ）、および、未処理細胞（ａ，ｄ）を、２４時間カンプトテシンで処理してアポトーシスを受けるように誘導した（ｄ〜ｆ）。次に、非アポトーシス群（２Ｎ〜４Ｎ）、および、アポトーシス群（ｓｕｂ２Ｎ）を検出するために、細胞をフローサイトメトリーで解析した。グラフは、それぞれ三連で行われた３つの実験の代表的な結果である。
図９−ＬＬ−３７は、ＨＥＫｎ細胞においてカスパーゼ−３のカンプトテシンの活性化を減少させる
この細胞を、ＬＬ−３７およびカンプトテシン存在または非存在下で培養し、次に、回収し、インビトロでＶＤＶＡＤ−ＡＭＣを加水分解することによってカスパーゼ−３の活性に関して解析した。カンプトテシンと２４時間インキュベートすることにより誘導されたカスパーゼ活性化は、この細胞をＬＬ−３７で処理することによって減少した。値は、それぞれ三連で行われた３つの異なる実験の平均である。
図１０−ＬＬ−３７の処理は、ＩＡＰ２の発現を高める
ＨＥＫｎ細胞を２μＭのＬＬ−３７で処理し、刺激後の異なる時点で回収した。これらの細胞からのＲＮＡを逆転写し、ＩＡＰ−２の発現をリアルタイムＰＣＲによって決定した。各時点でのＩＡＰ−２の転写レベルは、１８Ｓ−ＲＮＡに対して、未処理細胞（コントロールであり、各時点における１として設定される）に相対的に標準化して示される。
図１１−ＬＬ−３７は、ＨＥＫ細胞におけるプロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ−２（ＣＯＸ−２）の発現を高める
ＨＥＫｎ細胞を２μＭのＬＬ−３７で処理し、刺激の６、１２および２４時間後に回収した。未処理細胞を、各時点におけるコントロールとして用いた（薄灰色のカラム）。これらの細胞からのＲＮＡを逆転写し、コントロールに対するＣＯＸ−２の相対的な発現を、上述したようにｑＰＣＲによって決定した。
図１２−ＣＯＸ−２阻害は、ＬＬ−３７によって誘導されたＩＡＰ−２の増加に反対に作用する
ＨＥＫｎ細胞を、特異的なＣＯＸ−２阻害剤ＳＣ−７９１（２５ｎＭ）を用いて、または、それを用いないで処理し、さらに６時間、ＬＬ−３７（２μＭ）と共に、または、それを用いないでインキュベートした。ＩＡＰ−２のｍＲＮＡ遺伝子のレベルをＲＴ−ＰＣＲによって解析したところ、未処理コントロールサンプルと関連することが示された。
実施例Ａ−抗菌性タンパク質ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は乳癌で高度に発現され、上皮細胞の増殖因子と推測される
序論
この実施例において、一連の乳癌におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の発現パターンを調査したところ、腫瘍細胞ではｈＣＡＰ１８のｍＲＮＡとタンパク質は著しいアップレギュレーションを示したが、隣接する間質では示さなかった。興味深いことに、最高の組織学的なグレードを有する腫瘍のなかでも、最高のレベルのｈＣＡＰ１８タンパク質が検出されたが、それに対していくつかの低いグレードの腫瘍では、そのｈＣＡＰ１８レベルは正常な乳房組織で検出されたレベルと等しかった。これらの発見は、抗菌性ペプチドに関して提唱されている仮説の抗腫瘍作用とは明らかに対照的であるが、上皮の修復および血管新生におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に関する役割を示唆する近年の発見と一致する（５，１０）。さらにｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７が増殖促進因子であると裏付けるために、我々はここにおいて、合成の生物学的に活性なＬＬ−３７ペプチドでの処理と、ｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現の両方によって上皮細胞の増殖が有意に強化されたことを示す。
材料および方法
組織
２８人の乳癌患者からの凍結させた腫瘍組織を、ダンデリード病院病理学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｄｅｒｙｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ストックホルム，スウェーデン）から得た（表２）。これらの腫瘍を、確立されたガイドライン（１３）に従ってエルストン（Ｅｌｓｔｏｎ）およびエリス（Ｅｌｌｉｓ）のＩ〜ＩＩＩに沿ってスコア付けした。サイクリンＡを、増殖マーカーとして用いた（ノボカストラ・ラボラトリーズ，ニューキャッスル・アポン・タイン，イギリス）。エストロゲン受容体の状態を、慣例的手順で加工したパラフィン切片で評価した。乳癌に罹った８人の患者、および、乳房の縮小手術を受けた２人の健康な個体からの非浸潤性の乳房組織を、コントロールとして利用した。全てのサンプルを同じ病理学者（Ｂ．Ｓ．）が試験し、正常と分類した（表２）。記入されたインフォームド・コンセントを全ての患者に提出してもらった。この研究は、倫理地方委員会（Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｅｔｈｉｃｓ）によって承認された。
ｈＣＡＰ１８に関するインサイチュハイブリダイゼーション
サンプル０〜１７については、本質的に８で説明されている通りに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした４３５ｂｐのｈＣＡＰ１８全長ｃＤＮＡを用いて、インビトロで［35Ｓ］で標識されたアンチセンスおよびセンスプローブを転写し、インサイチュハイブリダイゼーションを行った（表２）。
免疫組織化学
サンプル０〜１７で免疫組織化学を行った（表２）。以前に１０で説明されている通りに、間接ペルオキシダーゼ法に従って、ベクタステイン（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ）キット（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），バーリンゲーム，米国）を用いて、組換えｈＣＡＰ１８１４に対するカテリンの親和性で精製したウサギ抗血清を１：５００の希釈度で用いた。その染色の特異性を確認するために、以前に１０で報告されている通りにして免疫吸着法を行った。ＦＰＲＬ１受容体を検出するために、間接ペルオキシダーゼ法に従って、親和性によって精製したヤギポリクローナル抗体（サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），サンタクルーズ，カルフォルニア州）を１：４００の希釈度で用いた。
タンパク質抽出およびウェスタンブロット解析
凍結させた腫瘍組織１６〜６０ｍｇを、電気ホモジナイザーを用いてリシン緩衝液中でホモジナイズした。標準的なプロトコール（１５）に従って、ＳＤＳ含有サンプル緩衝液中で腫瘍組織および細胞系由来のタンパク質を抽出した。タンパク質濃度を分光光度分析によって決定し、ＳＤＳ含有サンプル緩衝液で等しいタンパク質濃度になるように調節した（１６）。ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７を検出するために、抽出物を１６.５％トリス−トリシンの即席ゲル（Ｒｅａｄｙ ｇｅｌ，バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ハーキュリーズ，カリフォルニア州）上で分離した。組換えカテリン１７と合成ＬＬ−３７ペプチドを大きさの参照として用いた。ＥＲＫ１／２およびＦＰＲＬ１を検出するために、タンパク質を、それぞれ１２％および８％のトリス−グリシンゲル上で分離した。各サンプル中でほぼ等量のタンパク質がブロットされたことを確認するために、一次抗体でインキュベートする前に、フィルターを３％ポンソーＳ（Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓ）の３％ＴＣＡ溶液（シグマ・アルドリッチ，米国）で可逆的に染色した。親和性で精製した抗カテリン抗血清（１７）、親和性で精製した抗ＬＬ−３７抗血清（１０）、抗ＦＰＲＬ１抗血清（ｓｃ１８１９１，サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー，カリフォルニア州）、および、モノクローナル抗ＥＲＫ１／２抗体（セル・シグナリング・テクノロジー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），ビバリー，マサチューセッツ州）はいずれも、１：１０００の希釈度で用いられた。ニトロセルロースフィルター（シュライヒャー＆シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ），ダッセル，ドイツ）上にエレクトロブロッティングし、一次抗体と、ＩｇＧに結合したホースラディッシュペルオキシダーゼ（サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー，サンタクルーズ，カルフォルニア州）とで連続的にインキュベートした後、強化された化学発光（ＥＣＬ，アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ピスカタウェイ，ニュージャージー州）からのシグナルを、ＣＣＤカメラ（ＬＡＳ１０００，フジフィルム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ），東京，日本）で捕捉した。
ＥＬＩＳＡ
これまで説明されている（１７）サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、正常な乳腺および腫瘍組織からのタンパク質抽出物中のｈＣＡＰ１８を定量した。
リアルタイムＰＣＲによるｈＣＡＰ１８の発現解析
４種の正常なサンプルと４種の腫瘍からのＲＮＡを、キアゲン（Qiagen）のＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）キット（オペロン・バイオテクノロジーズ（Ｏｐｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），コローニュ，ドイツ）で抽出し、第一の鎖の合成キット（アマシャム・バイオサイエンス，ノーウォーク，コネチカット州）を用いて逆転写した。ＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲによって、標準的なプロトコールに従って、ＡＢＩプリズム７７００（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００，アプライド・バイオシステムズ）でｃＤＮＡ（１０ｎｇ）を用いて定量した。このサンプルを３連で評価した。プライマーの配列は、５’−ＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＡＣＴＴＣＡＡ−３’［配列番号２］、および、５’−ＴＴＧＡＧＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＣＣＣＡＴＡ−３’［配列番号３］であり、蛍光原性プローブの配列は、６−ＦＡＭ−５’−ＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＣＣＧＴＣＣＴＴ−３’−ＢＨＱ１［配列番号４］である。このサンプルを１８Ｓ−ＲＮＡの定量化によって標準化した（アッセイ・オン・デマンド（Ａｓｓａｙ ｏｎ Ｄｅｍａｎｄ），アプライド・バイオシステムズ）。正常なサンプルの平均の発現を、任意に１に設定した。
合成ＬＬ−３７ペプチド
ＬＬ−３７ペプチドを合成し、ＨＰＬＣによって９８％の純度まで精製した（ポリペプチド・ラボラトリーズ社（ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ａ／Ｓ、Ｈｉｌｌｅｒoｄ，デンマーク）。ペプチドの生物活性を抗菌分析（１８）で確認した。
上皮細胞のＬＬ−３７ペプチドの治療
自然に不死化したヒトケラチノサイト細胞系（ＨａＣａＴ）（１９）を、１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清、ハイ−クローン（Ｈｙ−Ｃｌｏｎｅ），ブール・ノルディック社（Ｂｏｕｌｅ Ｎｏｒｄｉｃ ＡＢ），フッディンゲ，スウェーデン）、および、抗生物質（ＰＥＳＴ＝ペニシリン５０Ｕ／ｌ、および、ストレプトマイシン５０ｍｇ／ｍｌ，ギブコ・ＢＲＬ）が補足されたＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地，ギブコ・ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ），ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），スコットランド）中で培養した。細胞を７０％の密集度で回収し、培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、および、ＰＥＳＴ）１００μｌ中で２０００個の細胞を９６ウェルプレートにシーディングした。１２時間後に、培地を血清非含有の培地（ＤＭＥＭ＋ＰＥＳＴ）に交換し、細胞を血清飢餓によってＧ０／Ｇ１に７２時間同調させ、次に、合成の生物学的に活性なＬＬ−３７ペプチドを１０μｇ／ｍｌ含む培地（ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳ＋ＰＥＳＴ）１００μｌで処理した。ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳおよびＰＥＳＴのみで処理した細胞を、コントロールとして利用した。この実験を四連で行った。細胞増殖を、［3Ｈ］−チミジン取り込みによって評価した。細胞を、１２時間の間に、１μＣｉ／ウェルの［3Ｈ］−チミジン（２０.００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，パーキン・エルマー・ライフサイエンス社（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．），ボストン，マサチューセッツ州）で処理し、グラスファイバーフィルター（ワラック（Ｗａｌｌａｃ）Ｏｙ Ｔｕｒｋｕ，フィンランド）上に回収した（ハーベスター９６（Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ ９６），トムテック（Ｔｏｍｔｅｃ），Ｏｒａｇｅ，コネチカット州）。液体シンチレーションカウンター（マイクロベータ・プラス（Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｐｌｕｓｓ），Ｗａｌｌａｃ Ｓｖｅｒｉｇｅｓ ＡＢ）を用いて、［3Ｈ］−チミジンの取り込みを決定した。この実験を６連で２回繰り返した。
ＨＥＫ２９３、および、ＨａＣａＴ細胞中のｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現
１６ｂｐの５’非翻訳領域を含む全コード配列を含むイメージクローン（Ｉｍａｇｅ ｃｌｏｎｅ）３０５７９３１由来のＢｆａｌフラグメント（２０）を、バイシストロン性ベクターｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），ベッドフォード，マサチューセッツ州）のＳｍａ１部位にサブクローニングした。
標準条件下でフージーン（Ｆｕｇｅｎｅ，ロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ），インディアナポリス，インディアナ州）を用いて、ＨＥＫ２９３とＨａＣａＴ細胞をトランスフェクションし、２週間で、４００ｎｇ／ｍｌのＧ４１８（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ペーズリー，イギリス）を用いて選択した。ＭｏＦｌｏ(Ｒ) 高速セルソーティングフローサイトメーター（ダコ・サイトメーション（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ），フォートコリンズ，コロラド州）で、データ解析のためのＳｕｍｍｉｔTMソフトウェアを用いて、細胞をＥＧＦＰ発現に関してソートし、それらのＣＡＰ１８発現を免疫ブロッティングによって定量した。同様にして、コントロール細胞系を、ＥＧＦＰのみを発現するベクターでのトランスフェクションによって確立した。この細胞系は、数ヶ月の連続培養中ずっと、選択をまったくしなくてもＣＡＰ１８の安定な発現を維持した。この実験を３０連で２回繰り返した。
ｈＣＡＰ１８で安定してトランスフェクションされたＨＥＫ２９３およびＨａＣａＴ細胞の増殖分析
ｈＣＡＰ１８でトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞を７０％の密集度で回収し、２４ウェルプレートにシーディングした。２４時間後に、培地を交換し、細胞を、５％ＦＣＳおよびＰＥＳＴが補足された培地（Ｏｐｔｉｍｅｍ，ギブコ・ＢＲＬ，ライフ・テクノロジーズ，スコットランド）２ｍｌ中で培養した。６日目に細胞を回収し、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），ベッドフォード，マサチューセッツ州）で計数した。トリパンブルーを用いて細胞生存率を測定した；いずれの条件下でも、トリパンブルー陽性の細胞は５％未満であった。全ての条件は３連で行われた。ＥＧＦＰのみを発現するベクターでトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞をコントロールとして利用した。
ｈＣＡＰ１８でトランスフェクションされたＨａＣａＴ細胞を７０％の密集度で回収し、１０％ＦＣＳ＋ＰＥＳＴを含むＤＭＥＭ中で、ウェルあたり２０００個の細胞で９６ウェルプレートにシーディングした。１２時間後に、培地を、５％ＦＣＳ＋ＰＥＳＴが補足されたＤＭＥＭに交換した。２４時間培養した後に、この細胞を１μＣｉ／ウェルの［3Ｈ］−チミジンで１２時間処理し、回収し、上述のようにして解析した。ＥＧＦＰのみを発現するベクターでトランスフェクションされたＨａＣａＴ細胞をコントロールとして利用した。
ＦＰＲＬ１の発現解析
ＨａＣａＴ細胞からのＲＮＡをＲＮイージーキット（キアゲン）で抽出し、第一の鎖の合成キット（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）−ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いて逆転写した。ＦＰＲＬ１のＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲによって定量し、上述のように１８Ｓ−ＲＮＡに対して標準化した。プライマーの配列は、５’−ＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＴＣＴＧＣ−３’［配列番号２］、および、５’−ＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧ−３’［配列番号３］であり、蛍光原性プローブの配列は、６−ＦＡＭ−５’−ＣＣＣＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＡＧＧＡ−３’−ＢＨＱ１［配列番号４］である。
百日咳毒素の分析
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７により誘導された上皮細胞増殖の刺激を媒介することにＦＰＲＬ１が関与するかを評価するために、ＨａＣａＴ細胞を、Ｇタンパク質結合受容体阻害剤である百日咳毒素で処理した。ＬＬ−３７処理の２４時間前に、細胞を百日咳毒素（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、スイス）でプレインキュベートした（最終的な毒素濃度は２０ｎｇ／ｍｌ）。細胞をシーディングして４８時間後に培地を交換し、ＨａＣａＴ細胞を、合成の生物学的に活性なＬＬ−３７ペプチドをそれぞれ５または１０μｇ／ｍｌ含む培地（ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳ、および、ＰＥＳＴ）１００μｌで処理した。ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳ、および、ＰＥＳＴのみで処理した細胞を、コントロールとして利用した。
ＬＬ−３７で処理したＨａＣａＴ細胞におけるリン酸化ＥＲＫ１／２の分析
ＨａＣａＴ細胞を１０％の密集度でシーディングし、０.２％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で３６時間維持した。さらに４８時間、細胞を、それぞれ１％または５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で、ＬＬ−３７の存在下（１０μｇ／ｍｌ）または非存在下で、培地を毎日交換して培養した。１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを、ポジティブコントロールとして利用した。リン酸化ＥＲＫ１／２の発現を、マウスモノクローナル抗体（セル・シグナリング・テクノロジー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），ビバリー，マサチューセッツ州）を用いたウェスタンブロット解析によって評価した。
統計的分析
値は、細胞の平均数、または、カウント毎分（ＣＰＭ）±ＳＤとして示される。群と群との比較は、両側ｔ検定で解析した。結果は、Ｐ値が０.０５未満の場合に統計学的に有意とみなした。腫瘍における発現を解析するために、有意性のレベルを０.０５未満として、ｈＣＡＰ１８タンパク質レベルで片側ｔ検定を行った。
結果
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は乳癌で発現される
患者の詳細は表２に示す。
インサイチュハイブリダイゼーションによれば、健康なコントロール（図１Ｇ）からの乳房組織、および、非浸潤性の乳癌（示さず）において、ｈＣＡＰ１８のｍＲＮＡに関する低いシグナル（示さず）、および、ｈＣＡＰ１８タンパク質に関する弱い免疫反応性がみられた。全ての乳癌組織において、腫瘍細胞ではｈＣＡＰ１８に対する免疫反応性を示し、間質では示さなかった（図１Ａ，Ｃ，Ｄ）。腫瘍細胞個体群はｈＣＡＰ１８の免疫反応性に関して均一ではなく、強い陽性を示す細胞は、検出可能なｈＣＡＰ１８を欠いている細胞に隣接していることがわかった（図１Ｃ）。カテリン組換えタンパク質を用いた免疫吸着法では、ｈＣＡＰ１８の免疫反応性は無効になった（図１Ｅ，Ｆ）。インサイチュハイブリダイゼーションによって、ｈＣＡＰ１８のｍＲＮＡに関する陽性シグナルが、免疫組織化学で得られた発現パターンとぴったりと適合する同じ領域で検出された（図ＩＢ）。シグナル強度は様々であり、高いグレードの腫瘍のなかでも最も顕著であった。コントロール切片は、ｈＣＡＰ１８のｍＲＮＡに特異的なシグナルを欠失したセンスｈＣＡＰ１８ｃＲＮＡプローブとハイブリダイズした（示さず）。
ＥＬＩＳＡによる乳癌組織抽出物中のｈＣＡＰ１８タンパク質の定量化によって、エルストンＩグレードの腫瘍とIIグレードの腫瘍とで差がないことが解明されたが、最高の悪性腫瘍グレードの腫瘍におけるｈＣＡＰ１８レベルは明らかにそれらより高かった（表２）。エルストンIIIグレードと、それ以外の腫瘍との差は統計学的に有意であった（ｐ＜０．０１）。１３のグレードＩＩＩの腫瘍のうち１０におけるｈＣＡＰ１８の濃度が、５ｎｇ／ｍｇ総タンパク質に達するか、または、それを超過していた。それ以外の１８の腫瘍サンプルのうちこのレベルに達したのは、わずか２つだけだった。また我々は、エルストンＩまたはIIの腫瘍と類似したレベルであることが解明された健康な乳房組織の４つの試料も分析した。ＥＬＩＳＡにより得られた発現パターンを確かめるために、我々は、４つの正常なサンプルと、４つの腫瘍サンプルにリアルタイムＰＣＲを行った。転写を定量した結果は、タンパク質発現に関するデータと一致していた（表２）。
免疫ブロッティングによって、調査した全ての腫瘍と正常な乳房組織は、無傷の未加工の１８ｋＤａのホロタンパク質に相当する免疫反応を示すバンドを示した（図２）。５つの調査したグレードIIIの腫瘍のうち４つにおいて（表２，サンプル６〜１０）、我々はまた、ＬＬ−３７、加工したｈＣＡＰ１８タンパク質に相当するバンドも検出した（図２）。用いられた抗血清はｈＣＡＰ１８ホロタンパク質に対して上昇し、ＬＬ−３７はカテリンペプチドに対する親和性で精製されたにもかかわらず、ＬＬ−３７が高濃度で検出された（１０）。
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は、上皮細胞の増殖を高める
ｈＣＡＰ１８（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）発現ベクターでトランスフェクションされたＨＥＫ２９３およびＨａＣａＴ細胞は、ＥＧＦＰのみを発現するベクターでトランスフェクションされたコントロール細胞（Ｅ）よりも有意に高い増殖速度を示した（図３ＡおよびＢ）。トランスフェクションされたＨＥＫ２９３、および、ＨａＣａＴ細胞からのタンパク質抽出物を免疫ブロッティングすることによって、我々は、これらのｈＣＡＰ１８ベクターを含む細胞は、ホロタンパク質を生産することを確認した（図３ＡおよびＢ）、および、この細胞培地中で、ＬＬ−３７に相当する４ｋＤの免疫反応を示すバンドを検出した（データ示さず）。加えて、５％ウシ胎仔血清で培養し、１０μｇ／ｍｌの合成の生物学的に活性なＬＬ−３７ペプチドで処理したＨａＣａＴ細胞から、細胞増殖が有意に増加することが示された（図４）。
Figure 2008525005
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ＬＬ−３７受容体ＦＰＲＬ１は乳癌で発現される
Ｇタンパク質結合受容体、ＦＰＲＬ１は、真核生物細胞においてＬＬ−３７によって誘導された作用に介在することが示されており（４，５）、本発明の設定において、それらの考えられる役割を評価するために、我々は、乳房組織におけるＦＰＲＬ１タンパク質の発現調査したところ、乳癌細胞と正常な腺上皮の両方でＦＰＲＬ１に関する強い免疫反応性が見出された（図５Ａ，Ｂ）。免疫ブロッティングにより、ＦＰＲＬ１は両方の組織で発現されたことを確認した（図５Ｃ）。加えて、ＨａＣａＴ細胞において、ｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現は、ＦＰＲＬ１のｍＲＮＡの発現を有意に増加させ（図５Ｄ）、これは、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７シグナル伝達のＦＰＲＬ１の関与をさらに裏付ける可能性がある。しかしながら、百日咳毒素でのＨａＣａｔ細胞の前処理は、これらの細胞の増殖を止めなかったが、約５０％抑制し（示さず）、これは、ＦＰＲＬ１は、これらの細胞において、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の増殖刺激作用の媒介に特異的に関与していない可能性を示す。上皮細胞増殖の活性化におけるＥＲＫ１／２の関与の可能性を試験するために、我々は、ＨａＣａＴ細胞を合成の生物学的に活性なＬＬ−３７で処理したが、ＥＲＫ１／２の有意な活性化はみられず、これは、ＥＧＦＲは、ＨａＣａＴ細胞増殖においてＬＬ−３７の刺激作用の媒介に関与しないことを示す。
考察
本発明の研究において、我々は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は、正常な乳腺上皮で構成的に生産されることを実証している。これは、ヒトの抗菌バリア保護におけるＬＬ−３７の役割と一致しており、さらに、正常な静止状態の上皮におけるＬＬ−３７の構成的発現は、傷害や炎症に付随して観察される顕著な発現に対して低いことが見出されたという初期の報告とも一致する（７〜１０）。これまでに、抗菌性ペプチドの構成的発現は、様々な外分泌腺で検出されており、例えば、ヒトカテリシジンＬＬ−３７が汗腺で、カテリシジンＣＲＡＭＰがマウス唾液腺で、ベータ−デフェンシンがヒト唾液腺で検出されている（２１〜２３）。Ｂａｌｓ等（１９９８）によって、乳腺におけるヒトベータ−デフェンシン−２（ｈＢＤ−２）のｍＲＮＡの発現が報告されており、近年他のグループが、非授乳婦の乳腺組織において構成的なｈＢＤ−１発現を見出し、加えて授乳中の乳房組織や母乳においても見出した（２６）。
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は、乳癌細胞で発現されるという我々の発見は新規である。興味深いことに、ｈＣＡＰ１８の生産は、正常な乳房の上皮、または、低いグレードの腫瘍と比較して、高いグレードの腫瘍の乳房上皮において最も顕著に増加した。しかしながら、ｈＣＡＰ１８の発現は普遍的でもなければ一様でもなく、すなわち、全ての癌細胞がｈＣＡＰ１８に関して陽性というわけではなく、明らかに、陽性細胞は検出可能なｈＣＡＰ１８のｍＲＮＡとタンパク質を欠いている細胞に隣接して見出され（図１Ｃ）、発現の程度は、あらゆる腫瘍タイプの細胞のなかでも相当ばらつきがあった。これは、腎細胞癌においてヒトアルファ−デフェンシンに関して示唆されているように、ｈＣＡＰ１８の複雑だが厳密に制御された調節を反映している可能性がある。
我々の研究において、最高の組織学的なグレードを有する腫瘍のなかでも、最高のｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のレベルが検出された。一方では高いグレードの腫瘍と、低いグレードの乳房組織や正常な乳房組織とのｈＣＡＰ１８発現の差は統計学的に有意であるにもかかわらず、厳密な相関はない。全ての群で、ｈＣＡＰ１８を発現する腫瘍が健康なサンプルのレベルで観察され、グレードＩの腫瘍のうち２つは、別の方法でのみ観察されたグレードIIIの腫瘍のなかでも比較的高い発現を示した。しかしながら、このサンプル番号に限定すると、我々の観察は、悪性腫瘍の程度と、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の発現との相関がある可能性を示唆する。乳癌におけるｈＣＡＰ１８の過剰発現は、ｈＣＡＰ１８の調節に影響を及ぼす細胞内経路の欠陥が原因で起こる可能性があること、さらに、ｈＣＡＰ１８の発現は、腫瘍に増殖の利益を提供するよりむしろ、これらの変化を反映する、と主張することもできる。しかしながら、本明細書で示したインビトロでの研究を組み合わせて、我々は、これらのデータは、腫瘍増殖の促進においてＬＬ−３７が役割を有する可能性を強調していると考える。
癌腫における抗菌性ペプチドの生物学的な役割は不明瞭である。様々な口腔癌で、ヒトアルファ−およびベータ−デフェンシンの両方における高いｈＢＤ−２タンパク質濃度と著しい免疫反応性が見出されており、これらの抗菌性ペプチドの高いレベルは、感染および／またはサイトカイン刺激の結果の可能性があると示唆されている（２８〜３０）。その他の研究では、昆虫から単離された抗菌性ペプチド、例えばメリチンおよびセクロピン関連ペプチドは、哺乳動物の腫瘍細胞に抗腫瘍作用を発揮することが提唱されている（３１〜３４）。その上、ヒト膀胱癌細胞系におけるセクロピンおよびメリチンに関するコード配列のベクターが介在する送達と発現は、ヌードマウスで腫瘍原性を抑制した（１１）。同様に、ブタカテリシジンＰＲ−３９のトランスジェニック発現は、ヒト肝細胞癌の浸潤能を減少させた。
癌における抗菌性ペプチドの機能を解明するためにさらなる研究が必要であるが、これらのペプチドの多機能の役割はますます明らかになりつつある。直接的な膜作用による病原体不活性化に加えて、ＬＬ−３７は、インビトロで走化性効果を発揮し、ヒト好中球、単球、Ｔ細胞の部分集合および肥満細胞の移動を誘導する（４，３５，３６）。この走化性活性は、ＬＬ−３７の、ＦＰＲＬ１、百日咳毒素感受性の膜結合型Ｇタンパク質結合受容体への結合に依存する（４）。ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に関してさらに示唆された機能としては、皮膚創傷の再上皮化および新血管形成を促進することによる、上皮修復および血管新生における役割が挙げられる（５，１０）。
従って、本明細書で示された乳癌細胞における著しいｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７発現は、これらの腫瘍細胞における増殖の利益を反映している可能性がある。この仮説を検証するために、我々は、ヒト上皮細胞系ＨＥＫ２９３とＨａＣａＴを、ｈＣＡＰ１８発現ベクターでトランスフェクションしたところ、トランスフェクションされた細胞の増殖が有意に増加することを見出した。加えて、合成の生物学的に活性なＬＬ−３７ペプチドは、ＨａＣａＴ細胞の増殖を有意に増加させた。これらの発見は、明らかに、抗菌性ペプチドに関して提唱されている示唆された抗腫瘍作用とは対照的であるが、Ｍuｅｌｌｅｒ等による、ヒトアルファ−デフェンシンは、腎細胞癌（ＲＣＣ）の進行を調節する可能性があるという近年の発見と一致する。これらのデフェンシンは、ＲＣＣの腫瘍細胞、加えて腎臓の正常な尿細管上皮細胞中に見出されており、さらに、生理学的な濃度で腫瘍細胞増殖を刺激した。
我々のインビトロでの研究によれば、ＬＬ−３７は、部分的にＦＰＲＬ１を介して上皮細胞の増殖を刺激することが示唆され、これは、受容体を百日咳毒素でブロックすることによって、外因性のＬＬ−３７の増殖作用を約５０％減少させるためであり、場合によっては、その他の受容体の関与も示されている。近年の研究において、ＬＬ−３７は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節性キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ＝ＭＥＫ）を、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の転写促進を介して活性化することによって気道上皮細胞を活性化することが示唆されている（３７）。しかしながら、我々の実験において、我々は、ＥＲＫ１／２の有意な活性化をまったく検出しなかった。
すなわち、本明細書で示された結果から、ＬＬ−３７は、腫瘍の増殖を促進することが示される。
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実施例Ｂ−エストロゲン受容体（ＥＲ）およびリンパ節（Ｎ）陽性乳房腫瘍におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７発現の増加
材料および方法
１４０種の乳房腫瘍、および、４種の罹患していない乳房組織サンプルからＲＮＡを抽出し、プライマーとしてランダムヘキサマーを用いて逆転写した。ｈＣＡＰ１８転写物の発現を、標準的なプロトコールに従って（上述した通り）ｃＤＮＡ１０ｎｇを用いてリアルタイムＰＣＲによって決定した。
結果および考察
結果を図６に示す。罹患していないサンプルの平均の発現を、任意に１に設定した。平均および偏差をＡｎｏｖａ統計によって評価した。
ｈＣＡＰ１８の発現は、ＥＲ陽性の腫瘍で、リンパ節が発達している場合、リンパ節が無い場合よりも有意に高い（約５倍）。
実施例Ｃ−ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７活性を阻害する物質の同定
多数の明確なインビトロおよびインビボでの分析を用いて、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の腫瘍発達への寄与の様々な観点を実証することができ、すなわち、マウスにおける、周知のシグナル伝達経路の誘導、細胞増殖の刺激、および、アポトーシス抑制、コロニー増殖の刺激、および、増殖から独立した定着、基底膜を越える浸潤の刺激、および、最終的に、腫瘍増殖と転移形成の促進を実証することができる。
上述の特徴は、これまで一次ケラチノサイトおよび上皮細胞系においてはｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に原因があると考えられているが、これらも乳癌細胞系で実証することができた。適切な標的細胞系はＭＣＦ−７であり、これは、ｈＣＡＰ１８を発現しない悪性が低いエストロゲン受容体陽性細胞系である。上記の観点を調査するために、組換えプラスミドからｈＣＡＰ１８を発現するＭＣＦ−７誘導体を確立した。ｈＣＡＰ１８タンパク質とパラ分泌型ＬＬ−３７の自己分泌活性は異なると予想されるため、インビトロでの分析はまた、この細胞において、実験の性質上ＬＬ−３７を外的に添加することが内因性の生産の代わりに許容される場合、ＬＬ−３７を外的に添加することによって行われた。
上記の実験は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の全体の腫瘍形成性の可能性を評価するために行われるが、これらの作用の抗ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７活性を有する物質による阻害を実証するためにさらなる実験を行うことができる。例えば、合成された活性タンパク質ＬＬ−３７は、抗体による阻害の標的としてみなされる可能性がある。その上、このタンパク質の生産は、プロモーターのブロックを介したｈＣＡＰ１８遺伝子の転写を阻害することによって阻害することができ、加えて、ＲＮＡ干渉による転写の転写後のダウンレギュレーションによっても阻害することができる。
従って、インビトロで作用のメカニズムと標的を実証するための実験と、インビボで、マウスにおける腫瘍において体内での作用を実証するための実験を両方行ってもよい。このようなインビトロでの実験は上述のＭＣＦ−７誘導体で行ってもよい。ｈＣＡＰ１８遺伝子における調節の実験のために、ｈＣＡＰ１８を低いが明らかに検出可能なレベルで発現する乳癌細胞系ＺＲ７Ｓ−１が用いられた。
以下で説明する実験については、特に他の指定がない限り以下の条件が用いられた：細胞は、１０％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地で増殖させた。トランスジェニック系のための培地は、導入遺伝子を維持するために１５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン、および、４００μｇ／ｍｌのゲネチシンを含む。実験を３日間未満継続させる場合、この細胞の使用の２４時間前に抗生物質を除去し、ウシ胎仔血清濃度を、それぞれ特定の実験に応じて必要な濃度に調節した。ＬＬ−３７を２μＭの濃度で添加した。
細胞増殖の刺激（Ｈｅｉｌｂｏｒｎ ２００５を参照）
トランスジェニック細胞系および細胞系は７０％の密集度で回収し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で、ウェルあたり２０００個で９６ウェルプレートにシーディングした。２４時間後、培地を、ＬＬ−３７が添加された、または、添加されていない５％ＦＣＳを含む培地に交換した。２４時間培養した後、この細胞を１μＣｉ／ウェルの［3Ｈ］−チミジン２０Ｃｉ／ｍｍｏｌで１２時間処理し、グラスファイバーフィルター（ワラック，Ｔｕｒｋｕ，フィンランド）上に回収した（ハーベスター９６；トムテック，Ｏｒａｇｅ，コネチカット州）。［3Ｈ］−チミジンの取り込みは、液体シンチレーションカウンター（マイクロベータ・プラス，ワラック）を用いて決定した。実験の統計的な有意性を確認するために、各条件／細胞系あたり２４ウェルを用いた。
細胞増殖分析（Ｌｕ ２００５，Ｌｕｄｅｓ−Ｍｅｙｅｒｓ ２００２を参照）
この分析は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７により細胞増殖が刺激されるかどうかを決定するために、［3Ｈ］−チミジン取り込み分析の補足として行われた。ＭＣＦ−７誘導体を、各時点において三連で、５０細胞／ｍｍ2の密度で平板培養した（６ウェルプレート中、約５００００細胞／ウェル）。総細胞数を血球計数器で２日毎に定量した。細胞生存率は、トリパンブルーを用いることによって評価した。
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７によるアポトーシスの阻害
アポトーシス誘導のために、５％ＦＣＳを含む６ウェルプレートの培地にこの細胞を２５０００細胞／ウェルでシーディングし、トポイソメラーゼＩ阻害剤カンプトテシン（ＣＡＭ）（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．），セントルイス，ミズーリ州）で、６μＭで２４時間処理した。
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７によるアポトーシス抑制を確認するために、２つのアポトーシスのパラメーター、ＤＮＡ含量およびカスパーゼ−３活性を評価した。統計的な有意性を確認するために、全ての実験を６連で行った。
フローサイトメトリーによるＤＮＡ含量の解析（Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ ２００５を参照）
この解析のために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）／ＲＮアーゼ染色緩衝液（ベクトン・ディッキンソン，サンノゼ，カリフォルニア州）を用いた。冷７０％（Ｖ／Ｖ）エタノール中でトリプシン処理した細胞を固定し、それを使用するまで４℃で保存した。ＰＩのＤＮＡへの取り込みによってＤＮＡ含量を測定した。蛍光解析は、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ベクトン・アンド・ディッキンソン，マウンテンビュー，カリフォルニア州，米国）を用いて行われた。細胞のサイズと粒度を決定するために、粒子のＦＳＣ（前方光散乱）とＳＳＣ（側方光散乱）を同時に測定した。ＰＩで染色された核の赤色の蛍光は、ＦＬ−４ウィンドウ（６００ｎｍのバンドパスフィルター、および、３５ｎｍの帯域幅）で検出した。蛍光強度は、細胞のＤＮＡ含量に比例する。各ヒストグラムは、２部に分割される：（１）非同調の非アポトーシス性の生きた細胞を示すＭ１領域（２Ｎ〜４Ｎに等しいＤＮＡ含量を有するＧ１、ＳおよびＧ２相における細胞）；および、（２）生きた細胞に比べて少量のＤＮＡを含むアポトーシス細胞を示すＭ２領域。
カスパーゼ-３活性分析
蛍光基質ＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ（１００μＭ）、および、ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（５０μＭ）を用いて、カスパーゼ−３酵素活性を測定した。細胞溶解産物は、反応緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％スクロース、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０〜６％のＮＰ−４０および０.１％ＣＨＡＰＳ（ｐＨ７.２５））と合わせ、マイクロタイタープレートに添加した。蛍光発生基質の切断は、フルオロスキャンII（Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ II）プレートリーダー（ラボシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ），ストックホルム，スウェーデン）でＡＭＣの解離によってモニターした。蛍光単位は、遊離のＡＭＣから作製した標準曲線を用いてＡＭＣのｐｍｏｌに変換した。データは、線形回帰によって解析した。
コロニー形成分析（Ｌｕｄｅｓ−Ｍｅｙｅｒｓ ２００２，Ｗａｎｇ ２００５を参照）
この分析は、近接する支持細胞がない場合の持続的に増殖する細胞の能力を決定するために用いた。この特性は、この細胞の腫瘍を形成する能力を反映するとみなされる。
トランスジェニック細胞を、サブコンフルエントな状態で維持し、最大７０％の密集度でトリプシン処理し、続いて５、１０および２５細胞／ｍｌ増殖培地の濃度に希釈した。細胞を３〜７日間（基本的に３〜４倍になるのに十分な日数で）増殖させ、コロニー一つあたりの細胞数を決定した。組換えプラスミドが緑色蛍光タンパク質を発現すると、蛍光顕微鏡で細胞およびコロニーを計数することができる。コロニー形成の結果は、コロニー一つあたりの蛍光性の細胞の分布として表示され、培地中にＬＬ−３７が存在する場合と存在しない場合における、様々なトランスジェニック系の間の分布を比較するために、ウィルコクソンの順位和検定が用いた。ＭＣＦ−７細胞は、β−エストロゲンの存在下でのみ腫瘍を形成することがわかっているため、トランスジェニック細胞の増殖に対する１〜５ｎＭエストロゲンの作用を分析することができる。
増殖から独立した定着の分析（Ｆｉｕｃｃｉ ２００２を参照）
この分析は、この細胞の転移を形成する能力を反映する。細胞は、３００μ／ｍｌトリプシン、２０μ／ｍｌエラスターゼ、および、１ｍＭのＥＤＴＡの混合物を用いた処理によって製造した。エラスターゼの存在は、単一の細胞懸濁液への細胞の解離を容易にする。細胞を増殖培地に懸濁し、最終濃度５００細胞／ｍｌの溶融した０．７％シープラーク（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ）低融点アガロース、および、０．３５％アガロースを含む増殖培地を１：１で混合した。この混合液１ｍｌを、６ウェルプレートで、凝固した培地／０．６％アガロースの２ｍｌの層上で平板培養した。この細胞を、３〜４日毎に、増殖培地１００μｌを添加して供給した。２週間後、培養の上部層を、０.２％ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（シグマ）で染色し、そして、直径が１００μｍより大きいコロニーを計数した。この分析は３連で行われ、２回繰り返した。
浸潤の誘導（Ｆｉｕｃｃｉ ２００２を参照）
マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）は基底膜とみなされ、これはＥＨＳ肉腫から生成された。マトリゲルは、基底膜成分（コラーゲン、ラミニンおよびプロテオグリカン）だけでなく、マトリックス分解酵素／それらの阻害剤および増殖因子もを含む。腫瘍細胞のマトリゲルへの浸潤は、腫瘍進行において役割を果たす細胞外マトリックス受容体とマトリックス分解酵素の関与を特徴付けるために用いられた。
マトリゲルを血清非含有の冷増殖培地で２ｍｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌを２４−ウェルのトランスウェルの上部チャンバーに置き、ゲル化のために３７℃で一晩インキュベートした。細胞を回収し、１％ＦＣＳを含む培地に１０6／ｍｌの濃度で再懸濁した。マトリゲルを蠕虫血清非含有の培地で洗浄した後、この細胞懸濁液１００μｌを上に置いた。下部のチャンバーを化学誘引物質として調整培地を含む増殖培地６００μｌで充填した。このチャンバーを、細胞インキュベーターで６時間〜２４時間インキュベートした。トランスウェルを染色し（ディフ−クイック染色溶液，フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、非浸潤性の細胞を綿棒で削り取った後、光学顕微鏡で浸潤された細胞を計数した。
ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍増殖（Ｗａｎｇ ２００５ Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ ２００５を参照）
サブコンフルエントに増殖させた細胞を回収し、２.５×１０7細胞／ｍｌで冷ＰＢＳに懸濁した。そのうち２００μｌ分を、４〜６週齢の雌ＳＣＩＤマウスの脂肪体または尾部の静脈に皮下注射した。通常、ＭＣＦ−７細胞の腫瘍形成はエストロゲンに依存するため、６０日にわたりβ−エストラジオールを１日あたり１．７ｍｇ放出されるようにペレットを皮下に埋め込んだ。これらのマウスを１週間あたり２回触診し、触診でわかる最初の腫瘍が見出された日付を記録した。腫瘍の増殖を手動でモニターし、最後に腫瘍の直径が１ｃｍになったらマウスを殺した。腫瘍の数、サイズおよび分布を記録した。マウスを切片化することによって小さい転移が検出される、組換えプラスミドから発現されたＧＦＰから蛍光を誘導するためにスキャンした。加えて、脾臓および肝臓をコラーゲン化して、蛍光性の細胞の数を決定するためにＦＡＣＳソーターで単一の細胞懸濁液を評価した。
ｈＣＡＰ１８転写に対するアンタゴニストを用いた阻害の研究（Ａｇａｒｗａｌ １９９８，Ａｎｄｅｌａ ２００４，Ｔｏｅｌｌ ２００１，Ｉｓｈｉｚｕｋａ ２００５，Ｗｅｂｅｒ ２００５を参照）
現在既知のｈＣＡＰ１８転写の最も強い誘導物質はビタミンＤである。ビタミンＤ受容体は、ｈＣＡＰ１８プロモーターにおける反応要素に結合することによってｈＣＡＰ１８転写を直接活性化する。このようにして低分子物質はｈＣＡＰ１８の発現を制御できるため、阻害化合物を系統的にスクリーニングすることは有意義である。初期の研究によれば、エストロゲンとその代謝産物のいくつかは作用を有さないことが示された。ビタミンＡは、皮膚ケラチノサイトにおける転写を阻害するが、乳癌細胞系ＺＲ−７５−１における転写を刺激する。これらの発見に基づいて、ビタミンＤに対するアンタゴニスト、例えばＺＫ１５９２２２（シエーリング社（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ））、および、ＴＥＩ−９６４７（帝人医学研究所，東京）、および、ビタミンＡに対するアンタゴニスト、例えばＡＧＮ１９３１０９（アレルゲン・ファーマシューティカルズ）は、本発明の方法に使用するための可能性がある物質である。
ｈＣＡＰ１８転写阻害剤のスクリーニング（Ｗｅｂｅｒ ２００５を参照）
ＺＲ７５−１細胞を２５％の密集度で平板培養し、イソプロパノールまたはＤＭＳＯに１００μＭで溶解させた可能性がある阻害剤（最終濃度１００ｎＭ）で処理した。２４時間後、ＲＮＡを、キアゲンＲＮイージーキット（オペロン・バイオテクノロジーズ，コローニュ，ドイツ）で抽出し、第一の鎖の合成キット（アマシャム・バイオサイエンス，ノーウォーク，コネチカット州）を用いて逆転写した。ＲＮＡは、リアルタイムＰＣＲによって、標準的なプロトコールに従って、ＡＢＩプリズム７７００（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００）（アプライド・バイオシステムズ）でｃＤＮＡ（５ｎｇ）を用いて定量した。このサンプルは３連で評価した。プライマーの配列は、５’−ＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＡＣＴＴＣＡＡ−３’［配列番号２］、および、５’−ＴＴＧＡＧＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＣＣＣＡＴＡ−３’［配列番号３］であり、蛍光原性プローブの配列は、６−ＦＡＭ−５’−ＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＣＣＧＴＣＣＴＴ−３’−ＢＨＱ１［配列番号４］である。このサンプルを、１８Ｓ−ＲＮＡの定量化によって標準化する（アッセイ・オン・デマンド，アプライド・バイオシステムズ）。
阻害の調節メカニズムを調査するために、プロモーターの活性は、ｈＣＡＰ１８プロモーターがルシフェラーゼレポーター遺伝子を制御する組換えプラスミドの使用によって決定した。ＺＲ７５−１細胞を２５％の密集度で６ウェルプレート中で平板培養し、ｊｅｔＰＥＩ（ｑＢｉｏｇｅｎｅ）６μｌと複合体化したレポータープラスミドをウェルあたり３μｇで用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの１４時間後、上述したように阻害剤を添加した。２４時間後、この細胞を溶解させ、分析システム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））でルシフェラーゼ活性を測定した。コトランスフェクションされたプラスミド（ｐＥＦ１／ｌａｃＺ，インビトロジェン）２００ｎｇから発現されたβ−ガラクトシダーゼに対して、活性を標準化した。各実験は、分析ごとに少なくとも２回、３連で行った。
転写後の阻害研究（Ｗａｎｇ ２００５，Ｚｈａｎｇ ２００５，Ｒｏｈ ２０００を参照）
現在最も有効な転写後の阻害は、ＲＮＡ干渉であり、これは基本的には、標的ｍＲＮＡの配列特異的で触媒性の分解を誘導するものである。短鎖干渉ＲＮＡがトランスフェクションされる細胞系において、転写における最も有効な標的部位が、最も容易にスクリーニングすることができる。ＲＮＡ干渉の効率は、定量ＰＣＲとウェスタンブロット解析によってモニターした。次に、うまくいく標的部位は、腫瘍部位で標的分子を発現するように設計された組換えベクターで発現することができる。
短鎖干渉ＲＮＡは、ｈＣＡＰ１８のコード配列に基づき設計、合成した。このＲＮＡは、二本鎖の１９−ｍｅｒと、いずれかの末端に２塩基のｄＴｄＴ−オーバーハングとからなる。設計のために、商業的なｓｉＲＮＡデータベースが、最も簡単に利用することができ、ここにおいて、標的部位は予め選択されている（ｈＣＡＰ１８の場合、例えば、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のｓｉＲＮＡ番号１４５８６、１４４０２、１４６３６５）。ＺＲ７５−１細胞またはトランスジェニックＭＣＦ−７細胞は、インターフェロン関連の経路のような非特異的な応答を回避するために最終濃度は最大１０ｎＭでｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。コントロールｓｉＲＮＡは、標的配列に２〜３個のミスマッチを含む。トランスフェクションの２４〜７２時間後に細胞を回収し、ｈＣＡＰ１８の発現を、上述のようなリアルタイムＰＣＲと定量的なウェスタンブロット解析によって決定した。ウェスタンブロット解析のために、ＳＤＳ含有サンプル緩衝液中でタンパク質を抽出し、１５％トリス−グリシンゲルで分離し、上述のようなニトロセルロースフィルターにエレクトロブロッティングした。フィルターを３％ポンソーＳで可逆的に染色し、その後、親和性で精製した抗ＬＬ−３７抗血清と１／１０００の希釈度でインキュベートした。強化された化学発光を用いた、ＨＲＰに結合した二次ＩｇＧからのシグナルを捕捉し、上述のようにして評価した。
インビボでの実験は、ｈＣＡＰ１８発現の最も有効な転写阻害剤にあわせて組み立てた。１２匹のマウスに、トランスジェニックｈＣＡＰ１８を発現するＭＣＦ−７細胞を注射した。そのマウスの半分に、毎日、オリーブ油（シグマ）５０μｌに溶解させた阻害剤３０ｍｇを皮下注射した。腫瘍形成の発生、サイズおよび分布は、上述したように分析した。インビボでのアプローチに有効なｓｉＲＮＡは、ｈＣＡＰ１８発現を少なくとも９０％ダウンレギュレートすると予想される。
マウスにおいて腫瘍形成を妨害するために、ｈＣＡＰ１８発現のダウンレギュレーションを数週間維持する必要がある。大量のｓｉＲＮＡを尾部の静脈に毎日注射することが可能であると証明されたが、治療アプローチとしての現実性はほとんどないようである。その代わりとしては、生物／腫瘍細胞におけるｓｉＲＮＡの安定な発現が挙げられる。ＲＮＡをヘアピンとして発現し、次にこれをｓｉＲＮＡに細胞内で変換するプラスミドが設計された（例えばｐＳｕｐｅｒ、オリジーン社（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｉｎｃ））。我々の最初のアプローチとして、上記実験によって決定された標的ｓｉＲＮＡ配列をｐＳｕｐｅｒにクローニングし、このコンストラクトで腫瘍細胞をトランスフェクションし、その後、マウスに埋め込んだ。現在、治療アプローチ、すなわち腫瘍形成後の発現ベクターの送達はまだ開発されていないが、リポソームを用いたプラスミドの送達、および、レトロウイルスの構築、および、この目的のためのアデノウイルス発現ベクターは世界的に研究されている。
ＲＮＡｉの代替法は、「古典的な」アンチセンス法である。標的転写物に相補的な、長さが２０〜３ｂｐの一本鎖オリゴヌクレオチドは、この細胞培地に直接添加されるか、または、マウスに注射した。このオリゴヌクレオチドの主鎖は、一般的には、キャリアー基質をまったく用いなくても、その分解が阻害され、さらにその摂取が容易になるように改変される。しかしながら、阻害メカニズムは非触媒性であり、主鎖の改変は、細胞毒性や非特異的な副作用を高めるため、本方法では、高い用量を必要とする。マウス実験において、典型的な投与範囲は、１００〜５００μｇ／動物／日である。
抗体を用いたＬＬ−３７活性の阻害（Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ ２００５を参照）
ニワトリ抗体を生産し、計画した実験に十分なラージスケールで親和性で精製した。ＬＬ−３７に対する抗体は、ＬＬ−３７活性を阻害できることがこれまでに示されている。それゆえにインビトロでの実験は必要ではない。
インビボでの実験のために、上述したようにマウスで腫瘍を誘導した。腫瘍が触診可能である場合、用いて抗体を、最初は１〜１００ｍｇ／ｋｇ抗体で週２回注射した。
次に、腫瘍の発達における抗体の作用を評価した。
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実施例Ｄ−培養ヒトケラチノサイトにおいて、ヒト抗菌性ペプチドＬＬ−３７はアポトーシスを阻害し、アポトーシスタンパク質の阻害剤（ＩＡＰ−２）の発現をアップレギュレートする
序論
カテリシジンは、多くの哺乳動物種に見出される抗菌性ペプチドファミリーである。これらは、高度に保存されたアミノ末端ドメイン、カテリン、および、タンパク質分解によって放出されて抗菌活性を付与する可変性カルボキシ末端ドメインからなる（１，２）。このファミリーのうち、１８ｋＤａのヒト陽イオン性抗菌タンパク質であるヒトカテリシジン（ｈＣＡＰ１８）だけが、主として、好中球、数種の上皮および粘膜細胞（皮膚、気管支、頬粘膜、食道、子宮頚、膣、精巣上体および唾液腺）によって生産される（３〜８）。Ｃ末端の３７個のアミノ酸ドメイン、ＬＬ−３７は、膜安定性を破壊することによって（１１，１２）広範囲の微生物に対する抗菌活性（９、１０）を示す。
抗菌性の機能のほかに、このペプチドは、その他の生物活性にも関与しており、例えば、走化性、および、血液および上皮細胞におけるサイトカイン放出（８，１３）、上皮細胞増殖の誘導（１４）、および、血管新生（１５）に関与している。近年の研究によれば、ＬＬ−３７は創傷治癒の際に高度に発現され、インビトロでのヒトケラチノサイトの増殖に影響を与え、創傷の再上皮化に関与することが示されている（１６，１７）。
材料および方法
細胞培養
包皮の表皮ケラチノサイトを、カスケード・バイオロジクス（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）（カスケード・バイオロジクス，ユージーン，オレゴン州）から得て、０，０６ｍＭのカルシウム、０.２％ｖ／ｖＢＰＥ、５μｇ／ｍｌのウシインスリン、０.１８μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、５μｇ／ｍｌのウシトランスフェリン、０.２ｎｇ／ｍｌのヒト上皮増殖因子、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、および、０.２５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ（全てカスケード・バイオロジクス）が補足されたエピライフ（ＥｐｉＬｉｆｅ）基礎培地（カスケード・バイオロジクス）中で、３７℃、および、５％ＣＯ２で培養した。細胞を、０.０２５％（ｗ／ｖ）トリプシン、および、０.０１％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ（カスケード・バイオロジクス）を用いて週１回継代させた。
ＨａＣａＴケラチノサイトを、１０％ウシ胎仔血清（ハイクローン，ブール・ノルディック社，フッディンゲ，スウェーデン）、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（５０Ｕ／Ｌ，ギブコ−ＢＲＬ）、および、ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ，ギブコ−ＢＲＬ）が補足されたＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地；ギブコ−ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）テクノロジー，ペーズリー，イギリス）中で培養した。
細胞の処理
２５,０００細胞／ウェルを６ウェルプレート培養皿で平板培養した。平板培養して４８時間後に、細胞を、０、０.２３、０.４６、０.６９、０.９、１.１５、２.３、４.６および１１.５μＭのＬＬ−３７で処理した。各処理は三連で行った。これらのペプチドを、培地（ＨａＣａＴ細胞には５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ、および、ＨＥＫｎ細胞には０.１％ＦＣＳが補足されたエピライフ基礎培地）で希釈した。この細胞を合計で２４時間にわたり処理した。ＬＬ−３７の刺激の後、この細胞に、トポイソメラーゼＩ阻害剤であるカンプトテンシン（ＣＡＭ）（シグマ・ケミカル社，セントルイス，ミズーリ州）のジメチルスルホキシド溶液を最終濃度６μＭまで添加した。解析の前に、細胞をさらに２４時間インキュベートした。
フローサイトメトリーによるアポトーシスの評価
２種のアポトーシスのパラメーター、すなわち膜の完全性の喪失とＤＮＡの減少を、フローサイトメトリーによって評価した。
膜の完全性の評価：ＬＬ−３７での刺激、および、ＣＡＭを用いた処理の後に、細胞をトリプシン処理によって回収した。次に、この細胞を冷ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、血球計数器（ホイザー・サイエンティフィック（Ｈａｕｓｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ），ホーシャム，ペンシルベニア州）で計数した。細胞濃度をＰＢＳ中で１×１０6細胞／ｍｌに調節した。ヨウ化プロピジウムとＹＯ−ＰＲＯ−１（モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ），ユージーン，オレゴン州）色素で染色することによってアポトーシスを検出した。染色された細胞をＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン−ディッキンソン，サンノゼ，カリフォルニア州）で解析した。前方光散乱（ＦＳＣ）および側方光散乱（ＳＳＣ）特性に基づき解析するために、細胞をゲーティングした。ＹＯ−ＰＲＯおよびＰＩ陽性細胞のパーセンテージを示すセルクエスト（Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ）ソフトウェア（ベクトン・ディッキンソン）を用いて、ＹＯ−ＰＲＯとヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を示す細胞の解析を行った。ＹＯ−ＰＲＯで緑色に染色された細胞をアポトーシスとみなした。ヨウ化プロピジウムで赤色に染色された細胞を壊死とした。生きている生存可能な細胞は、色素をわずかしか吸収しないか、または、まったく吸収しなかった。
フローサイトメトリーによるＤＮＡ含量の解析：この解析のために、ＰＩ／ＲＮアーゼ染色緩衝液（ベクトン・ディッキンソン）を用いた。冷７０％（ｖ／ｖ）エタノール中でトリプシン処理した細胞を固定し、それらを使用するまで４℃で保存した。ヨウ化プロピジウムのＤＮＡへの取り込みによってＤＮＡ含量を測定した。蛍光解析を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン、マウンテンビュー，カリフォルニア州，米国）を用いて行った。細胞のサイズと粒度を決定するために、粒子のＦＳＣ（前方光散乱）およびＳＳＣ（側方光散乱）を同時に測定した。ＰＩで染色された核の赤色の蛍光を、ＦＬ−４ウィンドウ（６００ｎｍバンドパスフィルター、および、３５ｎｍの帯域幅）で検出した。蛍光強度は、細胞のＤＮＡ含量に比例していた。各ヒストグラムを２部に分割した：（１）非同調の非アポトーシス性の生きた細胞を示すＭ１領域（２Ｎ〜４Ｎに等しいＤＮＡ含量を有するＧ１、ＳおよびＧ２相における細胞）；および、（２）生きた細胞に比べて少量のＤＮＡを含むアポトーシス細胞を示すＭ２領域。
カスパーゼ−３活性分析
上述したようにして蛍光基質ＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ（１００μＭ）、および、ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（５０μＭ）を用いてカスパーゼ−３酵素活性を概算した。簡単に言えば、細胞溶解産物を反応緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％スクロース、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０〜６％のＮＰ−４０および０.１％ＣＨＡＰＳ（ｐＨ７.２５））と合わせ、マイクロタイタープレートに添加した。蛍光発生基質の切断を、フルオロスキャンIIプレートリーダー（ラボシステムズ，ストックホルム，スウェーデン）でＡＭＣの解離によってモニターした。蛍光単位を、遊離のＡＭＣから作製した標準曲線を用いてＡＭＣのｐｍｏｌに変換した。データを線形回帰によって解析し、１分あたり放出されたＡＭＣのｐｍｏｌとして表示した。
ＲＴ−ＰＣＲ
様々な処理の後、キアゲンのＲＮアーゼイ（ＲＮａｓｙ）キット（オペロン・バイオテクノロジーズ，コローニュ，ドイツ）を製造元の指示に従って用いることによって細胞からトータルＲＮＡを単離した。第一鎖合成キット（アマシャム・バイオサイエンス）を用いて逆転写を行った。
結果
ＣＡＭで誘導されたアポトーシスのＬＬ−３７による阻害
我々は、アポトーシス誘導物質として広く用いられている薬物であるＣＡＭにより誘導された細胞死およびアポトーシスに対するＬＬ−３７の作用を試験した。処理後、膜の完全性とＤＮＡ断片化を２つの方法を用いてフローサイトメトリーで解析した。第一の方法は、細胞膜の透過性の増加を区別することが可能な２種の染色システムであり；未処理細胞を、染色強度に関して解析し（図７）、３タイプ：生存可能な染色されていない細胞、アポトーシスのＹＯ−ＰＲＯで染色された細胞、および、ＹＯ−ＰＲＯとＰＬの両方で染色された壊死の細胞に分類した。第二の方法では、エタノールで透過させた細胞におけるＤＮＡ含量をＰＩで解析した。アポトーシス細胞は、断片化のために、より少ないＤＮＡ量を示した。
ＨａＣａＴおよびＨＥＫｎ細胞においてアポトーシスが誘導された用量および時間を選択するために、前もって濃度および時点の実験を行った（データ示さず）。６μＭのＣＡＭに２４時間晒した場合、ＨａＣａＴとケラチノサイトの両方が、アポトーシスに特徴的な形態学的な変化、例えば膜の完全性とＤＮＡのプロファイルにおける変化を示した（図７）。この細胞を、ＬＬ−３７単独で、または、ＬＬ−３７およびＣＡＭで同時に２４時間処理した場合、アポトーシス細胞の量の変化は観察されなかった（データ示さず）。しかしながら、高濃度のＬＬ−３７（４.６および１１.５μＭ）は細胞毒性り、壊死の（ただしアポトーシス細胞ではない）分画が増加した。同時に処理する代わりに、ＣＡＭによるアポトーシス誘導前にこの細胞をＬＬ−３７に２４時間晒した場合は、この結果は異なる。ＬＬ−３７は、ＨＥＫｎおよびＨａＣａＴ細胞において、０.２３μＭから２，３μＭまでの濃度で、ＤＮＡ断片化と膜透過性の喪失の両方を阻害した（図７および８）。これらの条件下でも、ＬＬ−３７は、より高い濃度で（４.６μＭ、および、１１.５μＭ）細胞死を引き起こした。毒性濃度でさえも、アポトーシス細胞分画は低いままであり、これは、ＬＬ−３７による細胞死は、非アポトーシスのメカニズムによって生じることを示す。
ＬＬ−３７は、ＨａＣａＴおよびＨＥＫｎ細胞におけるＣＡＭによるカスパーゼ−３の誘導を阻害する
カスパーゼ−３はアポトーシス経路における主要なタンパク質の１つであり、アポトーシスの初期の指標であることから、我々は、ＬＬ−３７で治療した、または処理していないケラチノサイトにおけるカスパーゼ−３活性を測定することにした。ケラチノサイトにおいて、最初の１２時間のＣＡＭ処理の間カスパーゼ活性は有意に増加し、２４時間でピークに達した。２.３μＭのＬＬ−３７での前処理によって、カンプトテンシンで誘導されたカスパーゼの活性化が減少した（図９ａ、および、ｂ）。これらのデータによれば、ＬＬ−３７は、カスパーゼ活性を減少させることによってヒトケラチノサイトにおけるアポトーシスを阻害することが示唆される。
ＬＬ−３７は、ヒトケラチノサイトにおいてＩＡＰ−２発現を誘導する
アポトーシスタンパク質の阻害剤（ＩＡＰ）の種類は、主要なアポトーシスの調節因子と説明されている。このファミリーは、カスパーゼ−３活性を阻害する能力を有する。ブタカテリシジン種のＰＲ３９の抗アポトーシス機能は、ＩＡＰ−２発現の誘導と関連を示している。それゆえに、我々は、ＲＴ−ＰＣＲによって、異なるＬＬ−３７濃度、異なる時点で処理したケラチノサイトにおけるＩＡＰ−２のＨＥＫｎ細胞における発現を解析した。２.３μＭのＬＬ−３７での刺激により、刺激後６時間から１２時間にかけてＩＡＰ−２のｍＲＮＡが増加した（図１０）。２.３μＭより低い濃度のＬＬ−３７は、ｃ−ＩＡＰ−２レベルに影響を与えなかった（データ示さず）
ＬＬ−３７で刺激されたケラチノサイトは、ＣＯＸ−２をアップレギュレートする
以前の研究では、上皮細胞におけるＣＯＸ−２の阻害によりＩＡＰ−２の発現が減少するため、ＣＯＸ−２はＩＡＰ−２発現のレギュレーターと同定されている。それゆえに、我々は、２.３μＭのＬＬ−３７で処理したＨＥＫｎにおけるＣＯＸ−２の発現を解析した。ｍＲＮＡレベルの時間依存性の増加が見出され（図１１）、１２時間後に明らかに最高のレベルに達した。ＬＬ−３７刺激の後に、ＣＯＸ−２がＩＡＰ−２発現の増加を媒介するかどうかを分析するために、ＨＥＫｎ細胞を、２５ｎＭの特異的なＣＯＸ−２阻害剤ＳＣ−７９１で１２時間前処理し、次に、２μＭのＬＬ−３７で刺激した。これらの条件下で、ＬＬ−３７処理は、これまで観察されたようにＩＡＰ−２のｍＲＮＡレベルを増加させなかった（図１２）。これらのデータによれば、ＬＬ−３７は、ＣＯＸ−２酵素の発現の増加によってＩＡＰ−２レベルを増加させることが示唆される。
考察
皮膚の傷害後に抗菌性ペプチドＬＬ−３７発現が増加することが報告されている。このペプチドの発現は、感染の予防だけでなく、走化性、移動、血管新生および再上皮化のような様々な創傷治癒関連プロセスへの活発な関与によって、創傷治癒の促進に関連している。
本発明のデータによれば、ＬＬ−３７も、アポトーシスへの阻害作用によってケラチノサイトにおける細胞生存の促進に関与することが示される。
略語
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７，ヒトカテリシジン抗菌性ペプチド１８ｋＤａ／ＬＬ−３７；ＩＡＰ−２，アポトーシスタンパク質−２阻害剤；ＣＯＸ−２，シクロオキシゲナーゼ−２；ＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ，カスパーゼ３基質；ＨＥＫｎ，新生児由来ヒト表皮ケラチノサイト；ＤＭＥＮ，ダルベッコ改変イーグル培地；ＰＢＳ，リン酸緩衝生理食塩水；ＤＥＶＤアーゼ（ＤＥＶＤａｓｅ），Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐプロテアーゼ活性ＣＨＡＰＳ；３−［（３−コラミドプロピル）ジメチル−アンモニオ］プロパン−１−スルホン酸，ＣＡＭ：カンプトテシン。
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実施例Ｅ−本発明の標的化した物質の生産およびインビボでの使用
抗ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７抗体／抗ＨＭＦＧｌ抗体融合体の発現
阻害剤部分（抗ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７抗体）、および、標的化部分（抗多形性の上皮のムチン抗体、ＨＭＦＧ１）を含む融合タンパク質を、ＮＳＯ骨髄腫細胞で発現させた。
簡単に言えば、ＮＳＯ骨髄腫細胞は、エレクトロポレーションによって、融合タンパク質の軽鎖および重鎖成分をコードする発現ベクターでコトランスフェクションした。次に、トランスフェクトマス（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａｓ）を選択し、ＥＬＩＳＡ分析で抗体産生に関してスクリーニングした。
患者への投与
このような融合タンパク質を滅菌注射用水溶液に製剤化した。
次に、このような製剤を、乳癌に罹った患者に静脈内（ＩＶ）輸液によって９０分間かけて投与した。
用量は、医師によって決定される各患者それぞれの必要条件に従って選択した。しかしながら、典型的には、４ｍｇ／ｋｇの初期用量が用いられ、続いて、週１回、２ｍｇ／ｋｇの維持量が用いられる。
病気の進行のモニター
次に、融合タンパク質を用いた処理の乳癌の進行に与える影響を、従来のマンモグラフィーによってモニターした。
グレードIIIの乳管内乳癌（患者番号７，表２）の切片である。 乳癌におけるｈＣＡＰ−１８／ＬＬ−３７は免疫ブロッティングの結果である。 （Ａ）上のパネル、左のレーン；ＨＥＫ２９３抽出物における抗ＬＬ３７抗血清での免疫ブロッティングである。上のパネル、右のレーン；ＥＧＦＰ（Ｅ）のみでトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞である。（Ｂ）上のパネル、左のレーン；トランスフェクションされたＨａＣａＴ細胞である。下のパネル；ｈＣＡＰ１８でトランスフェクションされたＨａＣａＴ細胞である。 ＨａＣａＴ細胞の増殖速度を、(3Ｈ(−チミジンの取り込みを用いて評価した結果である。 （Ａ）エルストンのグレード２の乳管内乳癌（患者番号１２、表２）の切片（赤色の沈殿）である。（Ｂ）管内領域でＦＰＲＬ１に対する免疫反応性を示す正常な乳腺上皮の切片である（赤色の沈殿）。（Ｃ）免疫ブロッティングの結果である。（Ｄ）リアルタイムＰＣＲの結果である。 各種乳房組織サンプルからのＲＮＡを１８Ｓ−ＲＮＡの定量化によって標準化した結果である。 Ａは様々なＬＬ−３７濃度で２４時間処理した細胞を、２色のアポトーシス分析とフローサイトメトリーで加工し、蛍光強度に従い象限解析によって分類した結果であり、Ｂはアポトーシス細胞の定量分析である。 ＬＬ−３７で処理した細胞（ｂ，ｃ，ｅ，ｆ）、および、未処理細胞（ａ，ｄ）をフローサイトメトリーで解析した結果である。 ＬＬ−３７およびカンプトテシン存在または非存在下で培養した細胞をカスパーゼ−３の活性に関して解析した結果である。 ＬＬ−３７で処理したＨＥＫｎ細胞からのＲＮＡを逆転写し、ＩＡＰ−２の発現をリアルタイムＰＣＲによって決定した結果である。 ＬＬ−３７で処理したＨＥＫｎ細胞からのＲＮＡを逆転写し、コントロールに対するＣＯＸ−２の相対的な発現をｑＰＣＲによって決定した結果である。 特異的なＣＯＸ−２阻害剤ＳＣ−７９１（２５ｎＭ）を用いて、または、それを用いないで処理し、ＬＬ−３７（２μＭ）と共に、または、それを用いないでインキュベートしたＨＥＫｎ細胞の、ＩＡＰ−２のｍＲＮＡ遺伝子のレベルをＲＴ−ＰＣＲによって解析した結果である。

Claims (68)

  1. 癌細胞の増殖を阻害するための物質であって、ここにおいて、該物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を阻害する、上記物質。
  2. 物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の転写、翻訳および／または結合特性を変化させることによってｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を阻害する、請求項１に記載の物質。
  3. 物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の転写阻害剤である、請求項１または２に記載の物質。
  4. 物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の翻訳阻害剤である、請求項１または２に記載の物質。
  5. 物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の結合特性の阻害剤である、請求項１または２に記載の物質。
  6. 物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７受容体アンタゴニストである、請求項１に記載の物質。
  7. ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７受容体は、ＦＰＲＬ１である、請求項６に記載の物質。
  8. 物質は、癌細胞中のｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を選択的に阻害することができる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の物質。
  9. 物質は、該物質に晒されていない癌細胞におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性と比較して、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物活性を５０％またはそれ以上阻害することができる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の物質。
  10. 物質は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７への結合親和性を有する化合物、および、低分子量の阻害化合物からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の物質。
  11. 物質は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の物質。
  12. ｓｉＲＮＡ分子は、配列番号１に記載のヌクレオチドの配列のフラグメント、または、それらの変異体を含む、請求項１１に記載の物質。
  13. ｓｉＲＮＡ分子は、長さが１９〜２３個のヌクレオチドである、請求項１１または１２に記載の物質。
  14. 物質は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の物質。
  15. アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１に記載のヌクレオチドのフラグメント、または、それらの変異体を含む、請求項１４に記載の物質。
  16. アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１５〜３５個のヌクレオチドである、請求項１４または１５に記載の物質。
  17. 物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７への結合親和性を有する化合物である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の物質。
  18. 物質は、低分子量の阻害化合物である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の物質。
  19. 化合物はポリペプチドである、請求項１７に記載の物質。
  20. ポリペプチドは、抗体、または、それらの抗原結合フラグメントである、請求項１９に記載の物質。
  21. 抗体、または、それらの抗原結合フラグメントは、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ様フラグメント、単一の可変性ドメイン、および、ドメイン抗体からなる群より選択される、請求項２０に記載の物質。
  22. 抗体、または、それらの抗原結合フラグメントは、ヒト化されている、請求項２０または２１に記載の物質。
  23. 化合物は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７へのリガンド結合能力を有する、請求項１７に記載の物質。
  24. 物質は、癌細胞に選択的に送達することができる、または、癌細胞によって選択的に活性化することができる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の物質。
  25. 物質は、標的細胞に特異的な部分を含む、請求項２４に記載の物質。
  26. 標的細胞に特異的な部分は、抗体、または、それらの抗原結合フラグメントである、請求項２５に記載の物質。
  27. 抗体、または、それらの抗原結合フラグメントは、ヒト化されている、請求項２６に記載の物質。
  28. 抗体、または、それらの抗原結合フラグメントは、癌細胞の表面で発現された抗原への特異性を有する、請求項２６または２７に記載の物質。
  29. 癌細胞の表面で発現された抗原は、Ｃ４６、８５Ａ１２、Ｈ１７Ｅ２、ＮＲ−ＬＵ−１０、ＨＭＦＧ１、ＳＭ−３（ＩｇＧ１）、Ｗ１４、Ｌ６（ＩｇＧ２ａ）、１Ｆ５（ＩｇＧ２ａ）、アルファフェトプロテイン、Ｃａ−１２５、前立腺に特異的な抗原、および、上皮増殖因子受容体ファミリーの種類からなる群より選択される、請求項２８に記載の物質。
  30. 物質は、癌細胞によって選択的に活性化されたプロドラッグである、請求項２４に記載の物質。
  31. 癌細胞は上皮細胞である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の物質。
  32. 癌細胞は扁平細胞である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の物質。
  33. 癌細胞は、乳房、胆管、脳、結腸、胃、生殖器、肺および気道、皮膚、胆嚢、肝臓、上咽頭、神経細胞、腎臓、前立腺、リンパ腺、ならびに、消化管の癌細胞からなる群より選択される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の物質。
  34. 癌細胞は乳癌細胞である、請求項３３に記載の物質。
  35. 乳癌細胞はエルストン（Ｅｌｓｔｏｎ）グレードIIIの細胞である、請求項３４に記載の物質。
  36. 乳癌細胞は転移性である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の物質。
  37. 請求項１〜３６のいずれか一項に記載の物質、および、製薬上許容できる賦形剤、希釈剤またはキャリアーを含む医薬組成物。
  38. 非経口投与に適した、請求項３７に記載の医薬組成物。
  39. 組成物は、癌細胞を標的とした物質の送達が可能である、請求項３７または３８に記載の医薬組成物。
  40. 患者における癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、該患者に、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の物質、または、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、上記方法。
  41. 患者はヒトである、請求項４０に記載の方法。
  42. 物質は、癌細胞に選択的に送達されるか、または、癌細胞によって選択的に活性化される、請求項４０または４１に記載の方法。
  43. 医薬用途のための、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の物質。
  44. 癌の治療に使用するための、請求項４３に記載の物質。
  45. 癌細胞の増殖を阻害するための医薬品の製造における、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の物質の使用。
  46. 癌細胞は上皮細胞である、請求項４０〜４２に記載の方法、または、請求項４５に記載の使用。
  47. 癌細胞は扁平細胞である、請求項４０〜４２に記載の方法、または、請求項４５に記載の使用。
  48. 癌細胞は、乳房、胆管、脳、結腸、胃、生殖器、肺および気道、皮膚、胆嚢、肝臓、上咽頭、神経細胞、腎臓、前立腺、リンパ腺、ならびに、消化管の癌細胞からなる群より選択される、請求項４０〜４２に記載の方法、または、請求項４５に記載の使用。
  49. 癌細胞は乳癌細胞である、請求項４８に記載の方法または使用。
  50. 乳癌細胞はエルストングレードIIIの細胞である、請求項４９に記載の方法または使用。
  51. 乳癌細胞は転移性である、請求項４９または５０に記載の方法または使用。
  52. 患者における癌細胞を検出する方法であって、該方法は、
    （ａ）試験しようとする患者からの細胞サンプルを提供する工程；
    （ｂ）該細胞によって生産されたｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の量を測定する工程；および、
    （ｃ）工程（ｂ）で測定されたｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の量と、健康な細胞によって生産されたｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の量とを比較する工程
    を含み、ここにおいて、患者からの細胞サンプルにおけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生産のレベルが、健康な細胞におけるレベルと比較して高いことは、該細胞が癌細胞であることを示す、上記方法。
  53. 工程（ａ）における細胞は、乳房、胆管、脳、結腸、胃、生殖器、肺および気道、皮膚、胆嚢、肝臓、上咽頭、神経細胞、腎臓、前立腺、リンパ腺、ならびに、消化管の細胞からなる群より選択される、請求項５２に記載の方法。
  54. 工程（ａ）における細胞サンプルは、腫瘍由来であるか、または、腫瘍の可能性がある組織由来である、請求項５２または５３に記載の方法。
  55. 工程（ｂ）は、細胞サンプルと、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に結合する物質とを接触させること、続いて、それに結合したｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の量を検出することを含む、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に結合する物質は、抗体、または、それらの抗原結合フラグメントである、請求項５５に記載の方法。
  57. 工程（ｂ）は、（ｉ）細胞と、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に結合する物質とを接触させること、および、（ii）抗体、または、それらの抗原結合フラグメントを用いて、該物質に結合するｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の量を検出することを含む、請求項５５または５６に記載の方法。
  58. 工程（ｂ）は、ＥＬＩＳＡによって行われる、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 工程（ｂ）は、細胞中のｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のｍＲＮＡの量を測定することを含む、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
  60. 工程（ｂ）は、サザンブロット、または、ＲＴ−ＰＣＲによって行われる、請求項５９に記載の方法。
  61. 患者における癌の進行をモニターする方法であって、該方法は、
    （ａ）第一の時点で該患者から回収された細胞のサンプルを提供すること、および、請求項５２〜６０のいずれか一項に記載の方法を用いて、そこに含まれる癌細胞を検出すること；
    （ｂ）第二の時点で該患者から回収された細胞のサンプルを提供すること、および、請求項５２〜６０のいずれか一項に記載の方法を用いて、そこに含まれる癌細胞を検出すること；および、
    （ｃ）工程（ａ）および（ｂ）で測定された癌細胞の数を比較すること
    を含み、ここにおいて、工程（ｂ）で測定された癌細胞の数が、工程（ａ）と比較して高いことは、癌が進行していることの指標である、上記方法。
  62. ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７、または、それらをコードするｍＲＮＡに結合する物質を含む、請求項５２〜６１のいずれか一項に記載の方法を行うための診断キット。
  63. ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に結合することができる抗体、または、それらの抗原結合フラグメントを含む、請求項６２に記載の診断キット。
  64. ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に結合することができる抗体、または、それらの抗原結合フラグメントに結合することができる二次抗体をさらに含む、請求項６３に記載の診断キット。
  65. 物質は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドである、請求項６２に記載の診断キット。
  66. オリゴヌクレオチドは、配列番号１に記載のヌクレオチドの配列のフラグメント、もしくは、それらの変異体を含む、または、それらからなる、請求項６５に記載の診断キット。
  67. オリゴヌクレオチドは、検出可能な部分を含む、請求項６６に記載の診断キット。
  68. 検出可能な部分は、放射性同位体、放射性核種、蛍光標識、酵素標識、化学発光法による、ビオチニル基、および、第二のレポーターによって認識された既定のポリペプチドエピトープからなる群より選択される、請求項６７に記載の診断キット。
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