JP2008525479A - トレフォイル因子およびそれを用いた増殖性疾患の処置方法 - Google Patents
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Abstract
Description
動物における細胞の増殖および/または生存の調節および制御は、いくつかの細胞因子およびその互いとの相互作用を伴う複雑な過程である。任意の数のこれらの細胞因子における変異または発現の変化が、細胞の無制御の増殖または成長を引き起こし、最終的に腫瘍および癌の発現に至ることがある。
本発明は、トレフォイル因子(TFF)遺伝子産物の産生または腫瘍細胞でのそのような遺伝子産物の活性を減少させることにより、1つまたは複数の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。そのような方法で阻害される腫瘍は、正常な非癌性細胞に比べていっそう高いレベルのTFFを発現すると特徴づけられる腫瘍を含む。そのような腫瘍細胞の例としては、抗エストロゲン療法耐性の腫瘍などの薬物耐性の腫瘍およびエストロゲン感受性の乳癌などのホルモン感受性の腫瘍細胞(例えば、乳腺の腫瘍)ならびにその他、卵巣、頚部、前立腺などの生殖器の腫瘍; 胃腸管腫瘍(結腸、胃、肝臓、食道、膵臓); およびTFFが細胞増殖、生存および発癌性にとって重要なその他任意の腫瘍が挙げられる。その他のホルモン感受性の腫瘍は、アンドロゲン感受性の腫瘍、GH感受性の腫瘍、プロラクチン感受性の腫瘍、プロゲステロン感受性の腫瘍を含む。TFFを過剰発現する腫瘍に加えて、本発明の方法は、TFFが細胞増殖および生存にとって重要な腫瘍(TFF依存的な腫瘍)に適用できる。TFFを過剰発現する腫瘍は、正常な非腫瘍細胞と比較して、タンパク質または転写産物のレベルを測定する標準的な方法、例えば、ELISA法、逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)法、免疫組織化学法により同定される。すなわち、TFF依存的な腫瘍は、TFF阻害剤(例えば、ペプチドアンタゴニスト、TFF特異的な抗体)の存在下での、その非存在下と比べた増殖/生存の減少の検出により同定され; かつ、ホルモン感受性の腫瘍はホルモン阻害剤(例えば、ホルモン特異的なアンタゴニスト、抗体)の存在下での、その非存在下と比べた増殖/生存の減少の検出により同定される。
トレフォイル因子ファミリーのタンパク質は、3つの保存されたジスルフィド結合を含む40アミノ酸のトレフォイルモチーフによって特徴づけられる。3つの鎖内ジスルフィド結合がトレフォイルモチーフ(TFFドメイン)を形成する。トレフォイルモチーフは当技術分野、例えば、Taupin and Podolsky, Nat Rev Mol Cell Bio. 4(9):721-32, 2003; Hoffmann et al., Histol Histopathol 16(1):319-34, 2001; およびThim, Cell Mol Life Sci 53(11-12):888-903, 1997において公知である。
MCF-7 (HTB-22)およびMCF-10A (CRL-10317)細胞株はATCCから得た。MCF-7細胞(Kaulsay et al., Exp. Cell Res. 250:35-50, 1999)は、10%熱不活化ウシ胎仔血清(FBS)、100単位/mlのペニシリン、100 μg/mlのストレプトマイシン、および2 mM L-グルタミンを補充したRPMI中で5% CO2中37℃にて培養された。オリジナルのMCF7細胞はタモキシフェン感受性であり、タモキシフェンを含有する培地中で増殖することができない。タモキシフェン(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)の漸増濃度に漸進的に曝露された後、MCF-7細胞はそれ自体が最大で1 μMのタモキシフェンを含有する培地中で増殖するよう適合された。これらのタモキシフェン耐性MCF-7細胞(MCF-7-TamRと呼ぶ)は、実験の開始前に6ヶ月を超える間1 μMのタモキシフェンを含有する培地中で維持された。MCF-7-TamR細胞のタモキシフェン耐性は、同一の培地であるがしかしタモキシフェンなしで培養されたMCF7親細胞と比較することによって確立された。
全RNAを製造元の使用説明書にしたがってTRI-REAGENTを用いてMCF-7細胞から単離し、ピロ炭酸ジエチル処理水に再懸濁した。RNAの定量化および純度をA260/A280吸光度によって評価し、RNAの質をアガロースゲル電気泳動によって評価した。ハイブリダイゼーションのために標識化する前に、各細胞株から独立して得られた3つの全RNA試料をプールした。1.6よりも高い比率を有するRNA試料を、さらなる分析のため-80℃で保存した。
RT-PCRは鋳型mRNA 0.2 μg、0.6 μMプライマー、酵素ミックス2 ml、400 μMの各dNTP、10反応緩衝液、および10 Q-溶液を含有する最終容量50 ml中にて、Qiagen One-step RT-PCRキットの使用により行った。鋳型RNAを50℃で30分間cDNAに逆転写し、ホットスタートTaqDNAポリメラーゼを95℃で15分間加熱することにより活性化し、変性された鋳型cDNAを以下のサイクルによって増幅した: 94℃/30秒、55℃/30秒、および72℃/60秒。最終の伸長を72℃で10分間行った。PCR産物を半定量的に比較するため、15〜40サイクルのPCR (アニーリング温度55℃)を行ってPCR増幅の直線性を判定し、増幅されたβ-アクチンcDNAをcDNAの量と質の内部対照として役立てた。全てのRNA試料はDNase Iで処理して、ゲノムDNAの混入を回避した。
ヒトTFF3 cDNAをクローニングするため、TRI-REAGENTを用いて全RNAをMCF-7細胞から抽出し、cDNAをプライマー
によって増幅し、PCR-script(商標) AmpSK+ベクターにクローニングした。TFF3 cDNA挿入物をプライマー
で再増幅し、プライマー内に挿入された酵素部位HindIIIおよびSacIIを利用してpcDNA3.1/Myc-His-Bベクターにフレーム内でクローニングし、配列を検証した。TFF3の発現をRT-PCRおよびウエスタンブロット分析によって検証した。
GenscriptのpRNA-U6.1/Hygroベクター中のヒトTFF3 RNAi構築体は、配列
を標的化して得られた。MCF-7細胞5×104個を6ウェルプレートに播種し、上記のように培養した。それらをRNAi構築体またはpRNA-U6.1/Hygroベクター1 μgで一過的トランスフェクションし、さらに18時間増殖させた。
Amersham BiosciencesのグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)遺伝子融合システムを用いて、大腸菌(E. coli)で組換えTFF1およびTFF3タンパク質を産生させた。成熟タンパク質をコードする完全長のヒトTFF1およびTFF3 cDNA断片をMCF-7細胞からRT-PCRによって増幅した。5' EcoRIおよび3' XhoI消化によりRT-PCR産物をpGEX 4T1ベクター(Amersham Biosciences)にクローニングして、大腸菌でのGST融合タンパク質の発現用のpGEX 4T1-TFF1およびpGEX 4T1-TFF3プラスミドを作出した。プラスミドの配列はDNA配列決定によって検出した。
Biogene, Germanyによるウサギ抗TFF1および抗TFF3ポリクローナル抗体の作製に、大腸菌で産生された組換えTFF1およびTFF3精製タンパク質を用いた。各タンパク質に対しウサギ2羽を免疫した。抗体を抗血清からアフィニティー精製した。産生された抗体は、溶液中でその天然の三次構造のTFFタンパク質を認識し、そのタンパク質に結合した。エピトープ特異性は三次構造(例えば、TFFの3次元構造において曝露される残基)によって規定される。
MCF-7細胞を各量(0、1、5および20 μg/ml)のアフィニティー精製ウサギ抗ヒトTFF1またはTFF3抗体および対照としてその免疫前血清とともに、96ウェル平底組織培養用マイクロプレートに入った10% FBS含有RPMI-1640培地 100 μlに細胞5×103個/ウェルの濃度で播種した。細胞を37℃、5% CO2の加湿インキュベーター内で2日または3日間インキュベーションした。インキュベーション時間の後、MTT (3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)標識化試薬10 μlを終濃度0.5 mg/mlで各ウェルに加え、細胞をインキュベーター内で5時間標識した。インキュベーション時間が終わったところで、培地を除去し、変換された色素を可溶化液(0.01 N HClの10% SDS水) 100 μlで可溶化した。次いで、プレートを密閉し、一晩37℃で放置し、紫色のホルマザン結晶を完全に可溶化した。変換された色素の吸光度はSpectra Max 250マルチプレートリーダーを用い、650 nmでのバックグラウンドを差し引いて570 nmの波長で測定した。
タモキシフェン耐性MCF-7-TamR細胞を細胞5×103個/96ウェルプレート中のウェルの濃度で、デキストラン炭末処理済みの10% FBSの入ったフェノールレッド不含RPMI 1640培地100 μl中にて培養基で培養した。プレートを37℃で24時間インキュベーションして、細胞を再び付着させ、再び平衡化させた。いかなる培地も除去せずに、抗TFF3抗体および/またはタモキシフェンを培地100 μlの容量中その終濃度で2回加えた。48時間後、細胞像を位相差顕微鏡(Olympus IX70)下にて倍率10×で撮影した。
BrdUrdの取込みを測定することによって、有糸分裂誘発を直接的にアッセイした。BrdUrdの取込みのため、サブコンフルエントな細胞を20 mM BrdUrdで30分間パルス標識し、PBSで2回洗浄し、冷70%エタノール中で30分間固定した。BrdUrdの検出はZymed Laboratories Inc. (San Francisco, CA)のBrdUrd染色キットの使用により、製造元の使用説明書にしたがって行った。3×300個以上の細胞の全集団をいくつかの任意に選択された顕微鏡視野内で分析して、BrdUrd標識率(DNAを合成する細胞の割合)を判定した。
TFF3活性の増大の効果を検証するため、(5×104個の) MCF-7細胞を6ウェルプレートに播種し、上記のようにRPMI培地中で培養した。それらをTFF3-cDNA構築体またはpcDNA3.1/Myc-His-Bベクター1 μgで一過的トランスフェクションし、さらに18時間増殖させた。軟寒天コロニー形成アッセイのため、6ウェルプレートを寒天層(0.5%寒天および10% FBSの入ったRPMI 1640)で最初に覆った。上層には0.35%寒天および10% FBSの入ったRPMI 1640の中に細胞5×103個が含まれる。TFF3-cDNAまたはpcDNA3.1/Myc-His-Bでトランスフェクションされた細胞をトリプシン処理し、これを用いてTFF3の増大の効果を検証し、TFF3 RNAiまたはベクターpRNA-U6.1/Hygroトランスフェクション細胞を実験のなかで上記のように播種して、コロニー形成におけるTFF3の減少の効果を検証した。乾燥を防ぐため、培地を加えた。プレートを9日間(MCF-7細胞の場合)または14日間(MCF-10A細胞の場合)インキュベーションし、その後、培養物を検査し、写真に撮った。MCF10A-ベクターおよびMCF10A-TFF3細胞軟寒天コロニー形成アッセイを評価することは、上記のように、但しダルベッコ改変イーグル培地/F-12の中で行った。それらを37℃で9日間(MCF-7細胞)および14日間(MCF-10A細胞)インキュベーションした後にプレート中のコロニーを計測し、コロニーの相対数を計算した。MCF-7細胞のタモキシフェン処理の場合、1 μMタモキシフェンを寒天および培地層に加え、実験の間中、存在させた。
懸濁培養下の細胞(5×104個)を30 mm径のプラスチック製細菌用ディッシュ(Sterilin, Teddington, United Kingdom)の中で増殖させた。培養の後、細胞を回収し、計測した。
70%サブコンフルエント培養物からのMCF7-VECまたはMCF7-TFF3の単一細胞5000個を35 mm径のディッシュに三つ組で播種した。3日おきに培地を交換しながら、細胞を完全培地中で2週間培養した。70%エタノールを用いて細胞を固定し、その後、0.01%クリスタルバイオレットのPBSで1時間染色し、PBS中で脱染(3回洗浄)した。脱染は、黒く染まった形質転換細胞の不連続な病巣が倒立顕微鏡下にて倍率4×で視覚化されるまで続けた。35 mm径のディッシュ1枚につき形成された病巣の総数を計測し、三つ組の平均および平均に対する標準誤差を計算した。
c-Mycエピトープタグの付いたヒトTFF3発現ベクターpIRESneo3-TFF3-Mycは、以下のように構築された: ヒトTFF3 cDNAを、プライマーセット
を用いてPCRにより増幅し、PIRESneo3ベクター(Invitrogen)にクローニングした。2コピーのc-Myc tag EQKLISEEDL (SEQ ID NO:41)をコードする配列をTFF3の最後のアミノ酸とフレーム内で挿入した。TFF3のC57F変異体発現ベクターpIRESneo3-TFF3-C57F-Mycは、同一のセンスプライマーおよび
のアンチセンスプライマーを用いることによって同じように作出された。
を使用し、MCF-7細胞から精製されたヒトゲノムDNAを鋳型として用いたVent DNAポリメラーゼでのPCRによって増幅した。得られたDNA断片をSma I消化済みの、プロモーターを持たないルシフェラーゼレポーターpGL3基本ベクター(Promega)に導入した。
60〜80%コンフルエント時点のMCF-7細胞をSaint Mixトランスフェクション試薬により製造元の使用説明書(Syvolux therapeutics)にしたがってルシフェラーゼレポータープラスミドpGL3-CEACAM6に加えてTFF3ならびにTFF3-C57F変異体、hSAおよびTFF3-C57F-hSA融合タンパク質の発現プラスミドで同時にトランスフェクションした。トランスフェクションから36時間後、細胞を冷PBS中で3回洗浄し、凍結融解サイクルによって1×溶解緩衝液200 μlで溶解し、溶解物を卓上遠心分離機中14,000 rpmで2分間の遠心分離により回収した。キット(Promega)を用いたルシフェラーゼ活性のアッセイに、上清20マイクロリットルを用いた。ルシフェラーゼ活性を細胞溶解物中のタンパク質の量に対して規準化した。実験は3回繰り返して行った。
実施例1: 発癌性を増大し発癌性形質転換を刺激するTFF3; 発癌性を低減するTFFの阻害
TFF3は乳癌細胞の有糸分裂誘発や生存、それ故に細胞数を増大する。本発明者らは完全なヒトTFF3 cDNAをクローニングし、そのクローンを配列確認した。本発明者らはその後、TFF3の安定な発現を伴うヒト乳癌(MCF-7)細胞株を作出し、これらの細胞の挙動を、ベクターでトランスフェクションされた対照細胞と比較した。TFF3の発現はTFF3 mRNAに対するRT-PCRによって確認した(図1)。TFF3の発現によって、ヒト乳癌細胞の有糸分裂誘発が増大し(核の5'-ブロモ-2'-デオキシウリジン標識化で示されるように) (図2A)、血清枯渇条件での細胞生存が増大した(図2B)。その結果、TFF3は血清枯渇条件と血清含有条件の両方で乳癌細胞総数の増大をもたらした(図2C、D)。
MCF7細胞は内因性レベルのTFF3を産生することが明らかにされており、TFF3はエストロゲン受容体陽性の乳癌で過剰発現されることが明らかにされている。TFF3の発現がエストロゲン受容体の状態に関連するかどうかを判定することは、関心の対象であった。MCF7細胞を6ウェルプレート中にてデキストラン炭末処理済みのウシ胎仔血清10%の入ったフェノールレッド不含RPMI 1640中で24時間培養した。その後、細胞を10 nM E2または1 μM TAMの入った処理培地に移し換え、その培地中で24時間培養した。無血清培地中で培養された未処理細胞を対照として役立てた。図7Aは、エストラジオール(E2)で処理された細胞では非常に高いTFF3転写レベルの増大を、およびタモキシフェン(TAM)で処理された場合には同じほどではないが有意に高いTFF3転写レベルを示している。β-アクチンをRNA完全性の検査に使用し、添加対照としても役立てた。図7BはE2およびTAMによる処理から24時間後のTFF3プロモーター活性の増大を示す。*、p <0.05。これらの結果から、E2およびTAM処理がMCF7細胞においてTFF3の転写レベルの増大を誘導することは明らかである。
乳癌を処置するのに治療的に使用される薬剤に対するヒト乳癌細胞の反応性をTFF3が変えうるかどうかを判定するため、TFF3の強制発現の効果をタモキシフェンの存在下での軟寒天コロニー形成で試験した。TFF3の強制発現を伴うMCF-7細胞は、ベクターでトランスフェクションされた対照よりもタモキシフェンの存在下での軟寒天コロニー形成を4倍に増やして余りあった(図8)。TFF3はそれ故に、乳癌を処置するのに使用される抗エストロゲン物質の効果に対する細胞の感受性を低減する。
MCF7-VECTORおよびMCF7-TFF3細胞をデキストラン炭末処理済みのウシ胎仔血清10%入りのフェノールレッド不含RPMI 1640培地中で培養した。全細胞数のアッセイにより、培地からのエストロゲンの除去によって全細胞数が減少し、培地にエストロゲンを補充することによって全細胞数が、完全培地中で培養された対照細胞にまで回復することは明らかである(図10A)。軟寒天コロニー形成アッセイから、エストロゲン枯渇培地では、TFF3によって全コロニー数がほぼ10倍に増大し、培地にエストロゲンを加えることによってさらにMCF-TFF3において顕著にコロニー数が増大することは明らかである(図10B)。エストロゲン処理によって、コロニーサイズはその対照に比べMCF-TFF3細胞において有意に大きかった。*、p <0.05。これらの結果から、エストロゲンがTFF3を用いて細胞の増殖および足場非依存性を媒介することは明らかである。
MCF7細胞をデキストラン炭末処理済みのウシ胎仔血清10%入りのフェノールレッド不含RPMI 1640培地中のタモキシフェンの漸増濃度に漸進的に曝露させた。細胞を1 μM中で6ヶ月間培養し、タモキシフェンに対するその耐性を、MTTアッセイを利用して、対照として使われた、同じ培地中で培養された野生型MCF7細胞と比較して試験した。タモキシフェン感受性の野生型MCF7 (TAMS)細胞およびタモキシフェン耐性(TAMR)の細胞を6ウェルプレート中に同等に播種し、TFF3-ルシフェラーゼ構築体でトランスフェクションした。タモキシフェンを含まない培地中で24時間培養した。細胞を溶解し、promegaルシフェラーゼ基質キットを用いて、その酵素活性を測定した。TAMRではTAMS細胞に比べて2倍を超えるTFF3プロモーター活性の増大が明らかである(図11A)。図11Bは試験細胞でのTFF3転写レベルを示し、TAMR細胞での転写産物の上方制御を示している。β-アクチンをRNA完全性の検査に使用し、添加対照としても役立てた。*、p <0.05。これらの結果から、TFF3がタモキシフェン耐性(MCF-7)細胞で過剰発現されることは明らかである。
TFF iRNAがタモキシフェン感受性に及ぼす効果を判定するため実験を行った。TAMRおよびTAMS細胞をpRNA U6.1-siRNATFF3でトランスフェクションした。対照としてpRNA U6.1-VECTORトランスフェクション細胞を役立てた。各群からの細胞5000個を軟寒天に埋め込んだ。細胞をタモキシフェン有りでまたは無しで2週間培養した。コロニーを前述同様にスコア化した。図12Aから、TFF3がTAMR細胞においてタモキシフェン耐性を媒介しており、siRNAを用いたTFF3ノックダウンによって、これらの細胞でのタモキシフェン感受性が増大することは明らかである。*、p <0.05。これらの結果から、siRNAを用いたTFF3阻害またはノックダウンによって、タモキシフェン耐性細胞でのタモキシフェン感受性が増大することは明らかである。
TFF1/TFF3二量体はC57アミノ酸残基間の分子間ジスルフィド結合を介して形成され、それ故にこのアミノ酸残基の交換およびヒト血清アルブミンまたはβカゼインなどの別のタンパク質の付加によってTFF3が二量体を形成するのを阻止できよう。野生型のように二量体を形成することができない、TFF1およびTFF3の両方のC57からFへの点変異によって、内因性TFFの活性が阻害される。
ヒトTFF1およびTFF3成熟ペプチドをコードするcDNAをMCF-7細胞から単離されたRNAからRT-PCRによって増幅し、GST融合タンパク質発現ベクターpGEX 4T1にクローニングした(図15)。pGEX4T1-TFF1およびpGEX4T1-TFF3プラスミドをBL21-Gold細胞に形質転換した後に、GST-TFF1およびGST-TFF3の産生はIPTGでの誘導によって成功裏に達成された。しかしながら、GST-TFF1とTFF3の融合タンパク質はともに不溶性であり、したがって標準的な精製プロトコルの下では効率的に精製することができなかった。それ故に、改良されたプロトコルを用いて、GST融合タンパク質の溶解性およびその後のグルタチオンセファロース4Bマトリックスとの結合を最大限にした。TFF1およびTFF3をトロンビンによるカラム上での消化によりGSTから切断し、PBSで溶出させた。精製ヒトTFF1およびTFF3組換えタンパク質の完全性および純度を4〜12%のNuPAGE Bis-トリスゲルでのSDS-PAGEによって分析し、クマシーブルー染色によって可視化した。TFF1およびTFF3は、予想どおり、それぞれ9および7 kDのバンドとして示された。
MTTアッセイは、代謝的に活性な細胞だけが黄色のテトラゾリウム塩MTTを紫色のホルマザン結晶に切断することが可能で、その結晶を可溶化し、分光光度法によって定量化することに基づいている。それ故に、MTTアッセイは、細胞の増殖、生存能および外部因子への細胞集団の応答の活性化を定量的に測定するのに最も高感受性かつ高信頼性の細胞生物学的手法の1つとして受け入れられている。MCF-7細胞はTFF1とTFF3の両方を相対的に高いレベルで発現する。MTTアッセイを用いて、ウサギ抗TFF1および抗TFF3ポリクローナル抗体がMCF-7細胞の増殖に及ぼす効果を試験した。MCF-7細胞を各抗体0、1、5および20 μg/ml濃度のアフィニティー精製されたウサギ抗TFF1もしくは抗TFF3抗体または対照としてその免疫前血清とともに96ウェルマイクロプレートに播種した。同じ濃度を維持するため、併用効果を研究する場合には、各抗体または血清について示した濃度の半分を使用した。細胞を48時間または72時間インキュベーションし、細胞増殖をMTTアッセイによって材料と方法で記述した手順を用い測定した。CK-06、-07、-08および-09は、それぞれ、ヒトTFF1 (抗F1-06および-07)ならびにTFF3 (抗F3-08および-09)のウサギポリクローナル抗体に対する免疫前血清である。
ヒト乳癌MCF-7細胞は、その他全ての癌細胞と同様に、軟寒天中でコロニーを形成する能力を有する。MCF-7細胞5×103個を5 μg/mlのウサギ抗ヒトTFF1抗体または抗ヒトTFF3抗体および対照として免疫前血清有りまたは無しの10% FBS含有RPMI 1640中の軟寒天(0.35%)中にて6ウェルプレートの培養基で培養した。クリスタルバイオレット染色から10時間後にコロニー形成を調べた。倍率10×で写真を撮った。
MCF-7細胞はエストロゲン受容体(ER)陽性であり、抗エストロゲン薬タモキシフェンは細胞の増殖を遮断する。MCF-7-TamR細胞はオリジナルのMCF-7細胞の派生物であり、タモキシフェンの漸増濃度に漸進的に曝露させることによって樹立された。細胞を5×103個の細胞/100 μl/96ウェルプレート中のウェルで、デキストラン炭末処理済みの10% FBSの入ったフェノールレッド不含RPMI 1640培地中にて培養基で培養した。24時間のインキュベーション後、抗TFF3抗体および/またはタモキシフェン(TAM)を100 μlの容量中その終濃度で2回加えた。細胞増殖をMTTアッセイによって測定した。CK-09はヒトTFF3のウサギポリクローナル抗体(抗09)に対する免疫前血清である。
細胞を5×103個の細胞/100 μl/96ウェルプレート中のウェルで、デキストラン炭末処理済みの10% FBSの入ったフェノールレッド不含RPMI 1640培地中にて培養基で培養した。24時間のインキュベーション後、抗TFF3抗体および/またはタモキシフェン(TAM)を100 μlの容量中その終濃度で2回加えた。その後、Olympus位相差顕微鏡を用いて倍率10×の下で細胞を写真撮影した。CK-09はヒトTFF3のウサギポリクローナル抗体(抗09)に対する免疫前血清である。
本明細書において記述されるTFF特異的な抗体を用いて、タモキシフェン感受性を増大させるか、ホルモンに基づく(例えば、抗エストロゲン)療法に対する感受性を増大させるか、腫瘍細胞の増殖を阻害するか、または腫瘍細胞を死滅させる。癌療法に加えて、その方法は前癌の状態もしくは病変または非癌性の過剰増殖性疾患に苦しむものあるいはそれらを発症する危険性があるものに臨床的有益性を与えるのに有用である。
TFF3のいくつかのアミノ酸残基(すなわち、Tyr 23、Pro 24、His 25、Pro 46、およびTrp 47)は、TFF3の構造および潜在的な機能に重要である。さらに、アミノ酸残基Cys 57は、分子間ジスルフィド結合を形成させるうえで重要である。したがって、ペプチドアンタゴニストは、天然のTFF3アミノ酸配列に基づく上記の1つまたは複数の部位に改変を含む。例えば、疎水性アミノ酸Tyr 23、Pro 24、またはTrp 47はArgまたはLysに置き換えられる。さらなる例は、Cys 57がPheに置き換えられたペプチドを含む。あるいは、Cys 57の後にヒトβカゼインまたは別のペプチド配列が続く; すなわち、TFF3タンパク質が切断され、異種のペプチドまたはタンパク質に融合される。
はTFF3前駆体開始配列に相当する。アミノ酸配列
はTFF3シグナルペプチド配列に相当する。アミノ酸配列
はTFF3ポリペプチドの成熟型に相当する。TFF阻害活性アンタゴニストは、TFF3に結合する、受容体結合をめぐってTFF3と競合する、TFF3もしくは受容体の二量体化を阻止する、TFF受容体の活性化を阻止するまたは細胞中でのTFF3の機能的効果を広く阻害するその能力を観察することによって判定される。
TFF1、2、および3のドメインおよびループ構造は、各タンパク質のアミノ酸配列の以下の注釈付きの叙述でさらに規定される。以下のアライメントで開示される成熟型ヒトTFF3配列は、SEQ ID NO:25と呼ばれる。以下のアライメントで開示される成熟型ヒトTFF1配列は、SEQ ID NO:36と呼ばれる。以下のアライメントで開示される成熟型ヒトTFF2配列は、SEQ ID NO:37と呼ばれる。以下のアライメントで開示される成熟型ブタTFF2配列は、SEQ ID NO:38と呼ばれる。
Claims (44)
- 腫瘍細胞の増殖および/または生存を阻害する方法であって、タモキシフェン耐性の腫瘍を含む対象を同定する段階、および該対象にTFF阻害性化合物を投与する段階を含む方法。
- 腫瘍細胞をトレフォイル因子(TFF)遺伝子の発現を阻害する化合物と接触させる段階を含む、腫瘍細胞の増殖および/または生存を阻害する方法であって、該TFF遺伝子はTFF1またはTFF2であり、該化合物は1つもしくは複数のiRNAまたは1つもしくは複数のiRNAをコードする1つもしくは複数のDNA分子を含み、発現されたiRNAはTFF1またはTFF2遺伝子のmRNAに干渉しかつ該TFF1またはTFF2遺伝子の発現を阻害し、それによって該細胞の増殖および/または生存を阻害する方法。
- 腫瘍細胞をトレフォイル因子3 (TFF3)遺伝子の発現を阻害する化合物と接触させる段階を含む、腫瘍細胞の増殖および/または生存を阻害する方法であって、該化合物は、SEQ ID NO:9〜11からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む1つもしくは複数のiRNA、またはSEQ ID NO:9〜11からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む1つもしくは複数のiRNAをコードする1つもしくは複数のDNA分子を含み、発現されたiRNAはTFF3遺伝子のmRNAに干渉しかつ該TFF3遺伝子の発現を阻害し、それによって該細胞の増殖および/または生存を阻害する方法。
- 腫瘍細胞をTFFのペプチドアンタゴニストと接触させる段階を含む、腫瘍細胞の増殖または生存を阻害する方法であって、該アンタゴニストは(a) 23、24、25、46、47または57位において非同一アミノ酸を含むSEQ ID NO:25のTFFの機能干渉性の変異体および(b) SEQ ID NO:25のTFFの断片からなる群より選択され、該アンタゴニストは該細胞中での内因性TFFとTFF受容体との結合を阻害するかまたはTFFの二量体化、凝集もしくは機能活性を阻害する方法。
- 対象由来の組織試料においてTFF3発現レベルを検出する段階を含む、タモキシフェン耐性または該耐性を発症する素因を診断する方法であって、正常の対照レベルと比較した該レベルの増大は、該対象がタモキシフェン耐性の腫瘍を含むことまたは該腫瘍を発症する危険性があることを示す方法。
- 1つもしくは複数のiRNAまたは1つもしくは複数のiRNAをコードする1つもしくは複数のDNA分子を含む組成物を投与することにより、TFF1またはTFF2である、トレフォイル因子(TFF)遺伝子の発現を調節する段階を含む、癌または細胞増殖性および/もしくは生存性の疾患をその必要がある対象において処置または予防する方法であって、発現されたiRNAはTFF1またはTFF2遺伝子のmRNAに干渉しかつ該TFF1またはTFF2遺伝子の発現を調節し、それによって該癌または細胞増殖性および/もしくは生存性の疾患を処置または予防する方法。
- SEQ ID NO:9〜11からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む1つもしくは複数のiRNA、またはSEQ ID NO:9〜11からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む1つもしくは複数のiRNAをコードする1つもしくは複数のDNA分子を含む組成物を投与することにより、トレフォイル因子3 (TFF3)遺伝子の発現を調節する段階を含む、癌または細胞増殖性および/もしくは生存性の疾患をその必要がある対象において処置または予防する方法であって、発現されたiRNAはTFF3遺伝子のmRNAに干渉しかつ該TFF3遺伝子の発現を調節し、それによって該癌または細胞増殖性および/もしくは生存性の疾患を処置または予防する方法。
- 1つもしくは複数のペプチドアンタゴニストまたは1つもしくは複数のペプチドアンタゴニストをコードする1つもしくは複数のDNA分子を含む組成物を投与することにより、トレフォイル因子(TFF)タンパク質の発現または活性を調節する段階を含む、癌または細胞増殖性および/もしくは生存性の疾患をその必要がある対象において処置または予防する方法であって、発現されるペプチドアンタゴニストはTFFタンパク質の発現または活性に干渉し、それによって該癌または細胞増殖性および/もしくは生存性の疾患を処置または予防する方法。
- 同定する段階が、正常の対照レベルと比較したTFF3発現レベルの増大を検出することによって行われる、請求項1記載の方法。
- ペプチドアンタゴニストが(a) 23、24、25、46、47または57位において非同一アミノ酸を含むSEQ ID NO:25のTFFの機能干渉性の変異体、(b) SEQ ID NO:25のTFFの断片、およびc) その他任意のタンパク質と融合されたSEQ ID NO:25のTFFの全体もしくは断片もしくは変異体のキメラからなる群より選択され、該アンタゴニストは該細胞中での内因性TFFとTFF受容体との結合を阻害するかまたはTFFの二量体化、凝集もしくは機能活性を阻害する、請求項8記載の方法。
- TFFがTFF1、TFF2、およびTFF3からなる群より選択される、請求項1、4または8記載の方法。
- 組成物が薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項1および5〜8のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数のiRNAをコードする1つまたは複数のDNA分子が細胞内で転写される、請求項2、3、6または7記載の方法。
- 1つまたは複数のiRNAがsiRNAとして細胞内で転写される、請求項13記載の方法。
- TFF遺伝子の発現が低減されるまたは阻害される、請求項2、3、6または7記載の方法。
- TFFタンパク質の発現が低減されるまたは阻害される、請求項4または8記載の方法。
- 腫瘍または癌が肺癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、黒色腫、多発性骨髄腫、血液腫瘍、およびリンパ腫瘍からなる群より選択される、請求項1〜4および6〜8のいずれか一項記載の方法。
- 癌がタモキシフェン耐性の癌である、請求項17記載の方法。
- 増殖性および/または生存性の疾患がケラチノサイト過剰増殖、炎症性細胞浸潤、サイトカイン変化、表皮嚢腫および類皮嚢腫、脂肪腫、腺腫、毛細血管性血管腫および皮膚血管腫、リンパ管腫、母斑病変、奇形腫、腎腫、筋線維腫症、骨形成腫瘍 、ならびにその他の形成異常塊からなる群より選択される、請求項6〜8のいずれか一項記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項1および5〜8のいずれか一項記載の方法。
- 化学療法薬または抗新生物薬である第2の化合物の投与をさらに含む、請求項6〜8のいずれか一項記載の方法。
- SEQ ID NO:3〜11からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
- SEQ ID NO:3〜11からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸を含む、薬学的組成物。
- ヌクレオチド配列がTFF3転写産物に対するiRNAである、請求項22または23記載の単離された核酸。
- SEQ ID NO:1および2からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
- SEQ ID NO:1および2からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸を含む、薬学的組成物。
- ヌクレオチド配列がTFF1転写産物に対するiRNAである、請求項25または26記載の単離された核酸。
- SEQ ID NO:5および6からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
- SEQ ID NO:5および6からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸を含む、薬学的組成物。
- ヌクレオチド配列がTFF2転写産物に対するiRNAである、請求項28または29記載の単離された核酸。
- 化学療法薬に対する薬物耐性腫瘍の感受性を増大させる方法であって、該薬物耐性腫瘍を、TFF遺伝子産物に結合する抗体組成物と接触させる段階を含む方法。
- TFF遺伝子産物がTFF1である、請求項31記載の方法。
- TFF遺伝子産物がTFF3である、請求項31記載の方法。
- 抗体組成物が、TFF1に結合する抗体およびTFF3に結合する抗体を含む、請求項31記載の方法。
- 薬物耐性腫瘍がタモキシフェン耐性である、請求項31記載の方法。
- 薬物耐性腫瘍が乳癌である、請求項31記載の方法。
- 化学療法薬がタモキシフェンである、請求項31記載の方法。
- 化学療法薬がホルモンアンタゴニストである、請求項31記載の方法。
- ホルモンアンタゴニストが抗エストロゲン化合物である、請求項38記載の方法。
- SEQ ID NO:36 (TFF1)の20、21、42、43、または58位において非同一アミノ酸を含むTFF変異体を含む、TFFのペプチドアンタゴニスト。
- SEQ ID NO:37 (TFF2)の21、22、43、または44位において非同一アミノ酸を含むTFF変異体を含む、TFFのペプチドアンタゴニスト。
- SEQ ID NO:37 (TFF2)の70、71、92、93、または103位において非同一アミノ酸を含むTFF変異体を含む、TFFのペプチドアンタゴニスト。
- アンタゴニストが異種ポリペプチドに連結される、請求項40、41、または42記載のアンタゴニスト。
- 異種ポリペプチドに連結されたTFF1、2、または3の断片を含む、TFFのペプチドアンタゴニスト。
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