CN111973805B - 抗菌肽hCAP18/LL-37在抗感染生物工程肺中的应用 - Google Patents

抗菌肽hCAP18/LL-37在抗感染生物工程肺中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了人工器官领域的抗菌肽hCAP18/LL‑37在抗感染生物工程肺中的应用。本发明将抗菌肽hCAP18/LL‑37应用在生物工程肺中，可解决器官移植术前和术后感染，避免抗生素滥用导致的抗药性问题。本发明提供的抗感染生物工程肺是表达抗菌肽hCAP18/LL‑37的肺脏干细胞移植到肺脏脱细胞支架所形成的肺脏。肺脏干细胞可以快速增殖，肺脏脱细胞支架的再细胞化时间为7天，大大缩短了生物工程肺的制备周期；表达的抗菌肽hCAP18/LL‑37使抗感染生物工程肺具有细菌清除能力，解决肺移植术前和术后的感染问题；本发明提供的抗感染生物工程肺可解决术后的排斥反应，避免免疫抑制剂对肝肾功能的影响。

Description

抗菌肽hCAP18/LL-37在抗感染生物工程肺中的应用
技术领域
本发明涉及人工器官领域，具体涉及抗菌肽hCAP18/LL-37在抗感染生物工程肺中的应用。
背景技术
肺移植是终末期肺部疾病的有效治疗方法，但是现阶段存在以下问题：
(1)肺来源受限。供肺的选择要符合标准：ABO血型相同，目前国际上公认肺移植HLA配型可以不完全一致；年龄＜50岁，既往无原发性肺部疾病及胸部手术史；血气交换正常，吸入氧浓度比值＞1.0，呼气末正压＞0.49kPa时，PaO2≥40kPa；支气管镜检查，支气管树结构正常，无脓性分泌物及血液或胃内容物；系列胸片正常，胸腔横径与纵径相匹配。
(2)肺移植术后排斥反应。反应发生率为50％-81％，常发生于术后3个月内，免疫抑制剂常用来控制术后排斥反应。但是，免疫抑制剂对肝肾功能影响很大。
(3)肺移植术后感染。从临床病例来看，目前感染已经成为移植手术失败的主要原因之一，且一旦出现感染很难控制，术后早期应用广谱抗生素是预防感染的一个重要措施。但是临床中抗生素的非理性使用而产生的耐药性和抗药性成为一个不可忽视的事实。
生物工程肺是临床肺移植手术中极具发展前景的替代器官来源。本领域技术人员以肺脱细胞支架为基础，添加健康的肺干细胞进行再细胞化培养，得到生物工程肺，来避免免疫排斥反应。但是，术前和术后感染仍是器官移植成功的主要障碍。术前污染是生物工程肺长期培养过程中常见的问题。术后，由于呼吸过程中接触微生物污染物，导致移植后肺部感染也有所增加。现有技术通过重建生物工程肺的免疫系统作为一种预防性的抗菌策略，具体地为，在生物反应器培养的第11天加入自体单核白细胞，并在移植前第30天加入自体血清、肺泡巨噬细胞和单核白细胞。由此可见，现有技术中抗感染生物工程肺的制备流程复杂，不具备持续的可调节的抗菌能力，且用于再细胞化的肺细胞几乎无增殖能力，具有一定的生命周期。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中抗感染生物工程肺的制备流程复杂，不具备持续的可调节的抗菌能力，且用于再细胞化的肺细胞几乎无增殖能力，具有一定的生命周期的技术问题，因此提供抗菌肽hCAP18/LL-37在抗感染生物工程肺中的应用。
Cathelicidins是一种古老而又庞大的抗菌肽家族，是哺乳动物防御系统的主要成员。人类阳离子抗菌蛋白18(human cationic antimicrobial protein 18，hCAP18)是迄今在人体中发现的cathelicidins家族的唯一成员。LL-37是hCAP18被蛋白酶水解后释放的有37个氨基酸的C端，因其N末端前两个氨基酸残基为亮氨酸(L)和氨基酸残基总数为37而得名，有的文献称之为LL-37/hCAP18。随着对LL-37研究的逐渐深入，发现LL-37作为一个固有免疫系统的重要组成成分，具有抗细菌、真菌，降解生物膜，抗病毒等多种抗微生物作用，除此之外LL-37还具有调节炎症反应，趋化免疫细胞，协调固有/获得性免疫系统，促进损伤修复等多种作用。LL-37具有广泛的抗革兰氏阳性和阴性菌的能力。许多研究表明，LL-37可以通过直接杀菌作用杀死铜绿假单胞菌、淋病奈瑟菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌等。
本发明提供抗菌肽hCAP18/LL-37在抗感染生物工程肺中的应用。
本发明进一步提供一种具有抗菌能力的肺脏干细胞，其含有表达抗菌肽hCAP18/LL-37的重组载体。
进一步地，所述重组载体为病毒载体。
进一步地，所述抗菌肽hCAP18的表达框架为：5’到3’方向依次为启动子、抗菌肽hCAP18的编码基因；所述抗菌肽LL-37的表达框架为：5’到3’方向依次为启动子、信号肽的编码基因、抗菌肽LL-37的编码基因。
进一步地，所述hCAP18的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；LL-37的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述hCAP18的编码基因如SEQ ID NO.3所示；LL-37的编码基因如SEQ IDNO.4所示；所述信号肽的编码基因如SEQ ID NO.5所示。
进一步地，所述启动子为EF1a。
本发明还提供一种抗感染生物工程肺，为上述具有抗菌能力的肺脏干细胞移植到肺脏脱细胞支架所形成的肺脏。
进一步地，所述肺脏脱细胞支架为大鼠肺脏脱细胞支架或猪肺脏脱细胞支架。
本发明进一步提供上述抗感染生物工程肺的制备方法，包括步骤：
构建表达抗菌肽hCAP18/LL-37的肺脏干细胞；
构建肺脏脱细胞支架；
将所述表达抗菌肽hCAP18/LL-37的肺脏干细胞移植到所述肺脏脱细胞支架，构建再细胞化肺脏组织。
进一步地，表达抗菌肽hCAP18/LL-37的肺脏干细胞的构建方法为：
肺脏干细胞的获取：取离体活性支气管刷检组织进行消化处理，终止消化后收集细胞；取部分经消化处理后的细胞，利用铺被滋养层细胞的培养板对细胞进行铺板培养，收集细胞并利用铺被滋养层细胞的培养板对其进行扩增培养，待细胞长满至培养板表面积的85％-95％时，消化并收集贴壁细胞，即得；
重组载体的构建：构建表达抗菌肽hCAP18/LL-37的重组载体，并包装成为病毒颗粒；
肺脏干细胞的感染：用上述病毒颗粒感染上述肺脏干细胞，同时加入聚凝胺，培养24-48h，即得。
进一步地，所述组织消化液包含99v％的DMEM/F12、1-20ng/mL的DNA酶、0.1-4mg/mL蛋白酶和10-200ng/mL胰酶；所述消化处理的温度为37℃，时间为0.5-2h。
进一步地，肺脏干细胞培养基的配方为：225mL DMEM、225mL F12、20-70mL FBS、0.2-2mM L-glutamine、1-14ng/mL胰岛素、0.1-1ng/mL表皮生长因子、5-30ug/mL腺嘌呤、2-20ug/mL氢化可的松。
进一步地，所述终止液包含90v％DMEM和10v％FBS。
进一步地，铺板培养包括以下步骤：
取待进行铺板培养的细胞，用肺脏干细胞培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞的培养板中，培养板中加入抗生素；
在37℃，CO2浓度为4％-8％条件下培养，隔天更换培养基，待细胞呈克隆状生长至细胞聚集成团，细胞克隆长大至超过80％的克隆中有40-100个细胞，收集细胞。
进一步地，肺脏脱细胞支架的构建方法为：分别以0.01-0.5w/v％SDS溶液和0.2-5v％TritonX-100溶液经大鼠或猪的肺脏气管以5-25rpm灌注，最后用PBS冲洗。
进一步地，再细胞化肺脏构建的方法为：将所述表达抗菌肽hCAP18/LL-37的肺脏干细胞移植到大鼠或猪肺脏脱细胞支架，每日更换培养基，培养基经肺动脉以1-10mL/min持续灌流。
进一步地，所述培养基含有50ng/mL FGF10、5ug/mL转铁蛋白、20ng/mL HGF、2v％基质凝胶和5w/v％BSA。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明将抗菌肽hCAP18/LL-37应用在生物工程肺中，可解决器官移植术前和术后感染，避免抗生素滥用导致的抗药性问题。
2、本发明提供的抗感染生物工程肺是表达抗菌肽hCAP18/LL-37的肺脏干细胞移植到肺脏脱细胞支架所形成的肺脏。(1)肺脏干细胞可以不断的自我更新，其生存的时间长；(2)肺脏干细胞可以快速增殖，使肺脏脱细胞支架的再细胞化时间为7天，大大缩短了生物工程肺的制备周期；(3)表达的抗菌肽LL-37使抗感染生物工程肺具有细菌清除能力，解决肺移植术前和术后的感染问题；(4)本发明提供的抗感染生物工程肺可解决术后的排斥反应，避免免疫抑制剂对肝肾功能的影响；(5)本发明抗感染生物工程肺的制备流程简单。
3、本发明利用表达hCAP18基因的肺脏干细胞构建生物工程肺，其产生抗菌肽可受环境需求的调控，当大量感染出现时，可以诱导hCAP18基因的表达和剪切从而产生大量的LL-37分泌到细胞外发生抗菌的作用。当感染解除，不需LL-37进行抗菌时，hCAP18表达并剪切形成LL-37的过程会受到抑制，产生的LL-37减少，从而避免过度表达LL-37带来的副反应。本发明提供的抗感染生物工程肺的具备持续的可调节的抗菌能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实验例1获取的肺脏干细胞的鉴定结果，从左到右依次为克隆形态、Krt5染色图、Ki67染色图和DAPI染色图；
图2是本发明实验例1构建的肺脏脱细胞支架的DAPI染色结果；
图3是本发明实验例1再细胞化的肺脏组织；
图4是本发明实验例2再细胞化的肺脏组织染色图，左图为NKX2.1染色图，右图为DAPI染色图；
图5是本发明实验例2再细胞化的肺脏组织染色图，左图为E-Cadherin染色图，右图为DAPI染色图；
图6是本发明实验例2再细胞化的肺脏组织染色图，左图为AQP5染色图，右图为DAPI染色图；
图7是本发明实验例3再细胞化肺脏组织的抗菌能力检测。
具体实施方式
本发明中FBS表示胎牛血清；
DMEM表示高糖型DMEM培养基；
F12表示F12营养混合物；
DPBS表示磷酸盐缓冲液；KRT5表示支气管基底层细胞的标记物；
Ki67表示增殖细胞的标记物；
NKX2.1和E-Cadherin表示肺脏细胞的标记物；
AQP5表示肺组织细胞的标记物。
实施例1
本实施例提供的抗感染生物工程肺，其制备包括如下步骤：
构建表达抗菌肽LL-37的人肺脏干细胞：
取离体活性支气管刷检组织备用。
取组织消化液和终止液备用；其中组织消化液中，99v％为DMEM/F12，其余为1-20ng/mL的DNA酶，0.1-4mg/mL蛋白酶和10-200ng/mL胰酶；终止液中90v％为DMEM，10v％为FBS。
利用组织消化液对上述刷检组织进行消化处理，利用终止液对经消化处理后的组织进行终止消化后收集细胞。
取培养基备用，其中培养基中225mL DMEM，225mL F12，20-70mL FBS，0.2-2mM L-glutamine，1-14ng/mL胰岛素，0.1-1ng/mL表皮生长因子，5-30ug/mL腺嘌呤，2-20ug/mL氢化可的松。
取部分经消化处理后的细胞，用培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞的6孔培养板中；每个孔加200ul双抗(10000u/mL青霉素和10000ug/mL链霉素)，在37℃，CO2浓度为4％-8％条件下培养，隔天更换培养基，一般在4-7天后即可见到细胞克隆出现，待细胞呈克隆状生长，细胞克隆长大至超过80％的克隆中有40-100个细胞，收集细胞,一半冻存，一半利用铺被滋养层细胞的6cm培养皿对收集细胞进行培养。
待培养细胞长满至培养皿表面积的85％-95％时，每个培养皿加入1×DPBS洗涤一次，加入2mL 0.25％(质量体积比0.25g/100mL)胰酶，在37℃中放置5-15min，待大部分细胞变圆变亮后，用1mL枪头轻轻将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液，再用2mL终止液终止消化，收集细胞悬液，1200rpm离心5min，去上清，并用肺干细胞培养基重悬细胞，即得肺脏干细胞。
取肺脏干细胞进行细胞免疫荧光染色。待干细胞克隆生长到20-30个细胞时，使用4w/v％多聚甲醛固定细胞10分钟。固定结束后，使用PBS洗涤3次，每次5分钟以去除残留的多聚甲醛。加入0.2v％Triton X-100对细胞进行通透处理20分钟，然后使用PBS洗涤3次，每次5分钟。加入含有5-10w/v％驴血清的PBS溶液，对细胞进行封闭处理30-60分钟。去除驴血清PBS溶液，加入含有一抗(Krt5和p63)的PBS溶液，4℃孵育过夜。去除含有一抗的PBS溶液，使用PBS洗涤3次，每次10分钟。加入含有能够识别一抗的二抗PBS溶液，室温孵育2小时。去除二抗PBS溶液，加入20ng/mL DAPI溶液进行细胞核染色，孵育10分钟。使用PBS洗涤3次，每次20分钟。封片后置于显微镜下观察细胞。观察到细胞克隆为Krt5和Ki67阳性，表明本实施例分离和获取的细胞为人肺脏干细胞。
根据如SEQ ID NO.2所示LL37的氨基酸序列以及编码密码子，如SEQ ID NO.5所示信号肽的氨基酸序列以及编码密码子，设计并人工合成如SEQ ID NO.4所示的LL37的编码基因，构建信号肽-LL37-pHIV质粒，并包装成为病毒。
将上述病毒溶液按MOI(感染复数)值为15加入到上述获取的肺脏干细胞中，同时加入10ug/mL聚凝胺(Polybrene)，培养24-48h，即得。
构建肺脏脱细胞支架：
取雄性SD大鼠(250-300g，>8周龄)肺脏，分别以0.1w/v％SDS溶液和1v％TritonX-100溶液经大鼠的肺脏气管以15rpm灌注，最后用PBS冲洗，即得。
构建再细胞化肺脏组织：
将10mL表达抗菌肽LL-37的人肺脏干细胞移植到大鼠肺脏脱细胞支架，每日更换含有50ng/mL FGF10(Peprotech,USA)、5ug/mL转铁蛋白Peprotech,USA)、20ng/mL HGF(Peprotech,USA)、2％基质凝胶和5％BSA的培养基，并经肺动脉以4mL/min持续灌流，再细胞化时间为7天。
实施例2
本实施例提供的抗感染生物工程肺，其制备包括如下步骤：
构建表达抗菌肽hCAP18的人肺脏干细胞：
取离体活性支气管刷检组织备用。
取组织消化液和终止液备用；其中组织消化液中，99v％为DMEM/F12，其余为1-20ng/mL的DNA酶，0.1-4mg/mL蛋白酶和10-200ng/mL胰酶；终止液中90v％为DMEM，10v％为FBS。
利用组织消化液对上述刷检组织进行消化处理，利用终止液对经消化处理后的组织进行终止消化后收集细胞。
取培养基备用，其中培养基中包含225mL DMEM，225mL F12，20-70mL FBS，0.2-2mML-glutamine，1-14ng/mL胰岛素，0.1-1ng/mL表皮生长因子，5-30ug/mL腺嘌呤，2-20ug/mL氢化可的松。
取部分经消化处理后的细胞，用培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞的6孔培养板中；每个孔加200ul双抗(10000u/mL青霉素和10000ug/mL链霉素)，在37℃，CO2浓度为4％-8％条件下培养，隔天更换培养基，一般在4-7天后即可见到细胞克隆出现，待细胞呈克隆状生长，细胞克隆长大至超过80％的克隆中有40-100个细胞，收集细胞,一半冻存，一半利用铺被滋养层细胞的6cm培养皿对收集细胞进行培养。
待培养细胞长满至培养皿表面积的85％-95％时，每个培养皿加入1×DPBS洗涤一次，加入2mL 0.25％(质量体积比0.25g/100mL)胰酶，在37℃中放置5-15min，待大部分细胞变圆变亮后，用1mL枪头轻轻将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液，再用2mL终止液终止消化，收集细胞悬液，1200rpm离心5min，去上清，并用肺干细胞培养基重悬细胞，即得肺脏干细胞。
取肺脏干细胞进行细胞免疫荧光染色。待干细胞克隆生长到20-30个细胞时，使用4w/v％多聚甲醛固定细胞10分钟。固定结束后，使用PBS洗涤3次，每次5分钟以去除残留的多聚甲醛。加入0.2v％Triton X-100对细胞进行通透处理20分钟，然后使用PBS洗涤3次，每次5分钟。加入含有5-10w/v％驴血清的PBS溶液，对细胞进行封闭处理30-60分钟。去除驴血清PBS溶液，加入含有一抗(Krt5和p63)的PBS溶液，4℃孵育过夜。去除含有一抗的PBS溶液，使用PBS洗涤3次，每次10分钟。加入含有能够识别一抗的二抗PBS溶液，室温孵育2小时。去除二抗PBS溶液，加入20ng/mL DAPI溶液细胞核染色，孵育10分钟。使用PBS洗涤3次，每次20分钟。封片后置于显微镜下观察细胞。观察到细胞克隆为Krt5和Ki67阳性，表明本实施例分离和获取的细胞为人肺脏干细胞。
根据如SEQ ID NO.1所示hCAP18的氨基酸序列以及编码密码子，设计并人工合成如SEQ ID NO.3所示的hCAP18的编码基因，构建hCAP18-pHIV质粒，并包装成为病毒。
将上述病毒溶液按MOI(感染复数)值为15加入到上述获取的肺脏干细胞中，同时加入10ug/mL聚凝胺(Polybrene)，培养24/48h，即得。
构建肺脏脱细胞支架：
取雄性SD大鼠(250-300g，>8周龄)肺脏，分别以0.1w/v％SDS溶液和1v％TritonX-100溶液经大鼠的肺脏气管以15rpm灌注，最后用PBS冲洗，即得。
构建再细胞化肺脏组织：
将10mL表达抗菌肽hCAP18的人肺脏干细胞移植到大鼠肺脏脱细胞支架，每日更换含有50ng/mL FGF10(Peprotech,USA)、5ug/mL转铁蛋白Peprotech,USA)、20ng/mL HGF(Peprotech,USA)、2％基质凝胶和5％BSA的培养基，并经肺动脉以4mL/min持续灌流，再细胞化时间为7天。
实验例1
为了便于观察，本实施例抗感染生物工程肺采用GFP标记，其制备包括如下步骤：
构建表达抗菌肽hCAP18的人肺脏干细胞(记为hCAP18-hDASCs)：
取离体活性支气管刷检组织备用。
取组织消化液和终止液备用；其中组织消化液中，99v％为DMEM/F12，其余为1-20ng/mL的DNA酶，0.1-4mg/mL蛋白酶XIV和10-200ng/mL胰酶；终止液中90v％为DMEM，10v％为FBS。
利用组织消化液对上述刷检组织进行消化处理，利用终止液对经消化处理后的组织进行终止消化后收集细胞。
取培养基备用，其中培养基中225mL DMEM，225mL F12，20-70mL FBS，0.2-2mM L-glutamine，1-14ng/mL胰岛素，0.1-1ng/mL表皮生长因子，5-30ug/mL腺嘌呤，2-20ug/mL氢化可的松。
取部分经消化处理后的细胞，用培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞的6孔培养板中；每个孔加200ul双抗(10000u/mL青霉素和10000ug/mL链霉素)，在37℃，CO2浓度为4％-8％条件下培养，隔天更换培养基，一般在4-7天后即可见到细胞克隆出现，待细胞呈克隆状生长，细胞克隆长大至超过80％的克隆中有40-100个细胞，收集细胞,一半冻存，一半利用铺被滋养层细胞的6cm培养皿对收集细胞进行培养。
待培养细胞长满至培养皿表面积的85％-95％时，每个培养皿加入1×DPBS洗涤一次，加入2mL 0.25％(质量体积比0.25g/100mL)胰酶，在37℃中放置5-15min，待大部分细胞变圆变亮后，用1mL枪头轻轻将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液，再用2mL终止液终止消化，收集细胞悬液，1200rpm离心5min，去上清，并用肺干细胞培养基重悬细胞，即得肺脏干细胞。
取肺脏干细胞进行细胞免疫荧光染色。待干细胞克隆生长到20-30个细胞时，使用4w/v％多聚甲醛固定细胞10分钟。固定结束后，使用PBS洗涤3次，每次5分钟以去除残留的多聚甲醛。加入0.2v％Triton X-100对细胞进行通透处理20分钟，然后使用PBS洗涤3次，每次5分钟。加入含有5-10w/v％驴血清的PBS溶液，对细胞进行封闭处理30-60分钟。去除驴血清PBS溶液，加入含有一抗(Krt5和p63)的PBS溶液，4℃孵育过夜。去除含有一抗的PBS溶液，使用PBS洗涤3次，每次10分钟。加入含有能够识别一抗的二抗PBS溶液，室温孵育2小时。去除二抗PBS溶液，加入20ng/mL DAPI溶液细胞核染色，孵育10分钟。使用PBS洗涤3次，每次20分钟。封片后置于显微镜下观察细胞。观察到细胞克隆为Krt5和Ki67阳性，表明分离和获取的细胞为人肺脏干细胞(如图1所示)。
根据如SEQ ID NO.1所示hCAP18的氨基酸序列以及编码密码子，设计并人工合成如SEQ ID NO.3所示的hCAP18的编码基因，构建hCAP18-pHIV-EGFP质粒，并包装成为病毒。同时以pHIV-EGFP病毒作为对照。
将上述病毒溶液按MOI(感染复数)值为15加入到上述获取的肺脏干细胞中，同时加入10ug/mL聚凝胺(Polybrene)，培养24-48h，即得。所得细胞分别记为hCAP18-hDASCs和WT-hDASCs。
构建肺脏脱细胞支架：
取雄性SD大鼠(250-300g，>8周龄)肺脏，分别以0.1w/v％SDS溶液和1v％TritonX-100溶液经大鼠的肺脏气管以15rpm灌注，最后用PBS冲洗，即得。
形态学和DAPI染色细胞核分析如图2B所示，表明细胞成分完全清除，细胞外基质保存良好。图2A表示细胞未完全清除(作为对照)，图2B表示细胞完全清除。
构建再细胞化肺脏组织：
将10mL WT-hDASCs和hCAP18-hDASCs(细胞数量为1×106)分别移植到大鼠肺脏脱细胞支架。每日更换含有50ng/mL FGF10(Peprotech,USA)、5ug/mL转铁蛋白Peprotech,USA)、20ng/mL HGF(Peprotech,USA)、2％基质凝胶和5％BSA的培养基，并经肺动脉以4mL/min持续灌流，灌流使肺再细胞化时间为7天(如图3)，并在体外仿生培养中维持带再细胞化的肺7天。
实验例2
分别取实验例1中再细胞化的肺叶，4％福尔马林固定过夜，进行梯度脱水,75％、75％、80％、90％、95％、95％、100％和100％各30—180分钟。之后经过二甲苯透明后(10—20分钟),进行石蜡组织包埋。再进行石蜡切片(5微米/片)。之后在37°烘箱中放置过夜。组织切片进行脱蜡,在二甲苯中脱蜡三次，每次10分钟。再用梯度酒精处理，即100％、100％、95％、80％、75％、50％中各放置5分钟。之后置于0.01M pH 6.0的柠檬酸钠缓冲液中进行抗原修复,即在微波炉中以高火处理4次，每次4分钟,再中火处理4分钟后取出，静置至室温。PBS清洗10分钟后,再用含10％正常驴血清(jackson)的1％BSA-PBS溶液在室温封闭2-3小时，然后将一抗(CK5,E-cadherin,或AQP5)滴加在切片组织上,室温孵育2小时后,4℃过夜孵育。PBS洗4次,每次5分钟。将含有ALEX Flora标记的二抗的PBS滴加在切片组织上,常温孵育2小时。滴加1：1000稀释过的DAPI溶液，室温孵育5分钟。之后用1％的苏丹黑溶液进行去背景理1到2分钟。PBS洗4次,每次5分钟。用Vector的封片剂滴加到组织上，然后用盖玻片进行封片。在荧光显微镜下观察。结果显示，再细胞化后，移植的细胞在支架上能够表达肺脏细胞的标记物NXK2.1(图4)和E-Cadherin(图5)。更进一步，我们发现再细胞化后，移植的干细胞能够表达AQP5(图6)，说明在支架中，干细胞能够分化形成肺上皮细胞，具有重建肺功能的潜能。
实验例3
分别取实验例1中WT-hDASCs和hCAP18-hDASCs再细胞化的肺叶切分,与铜绿假单胞菌(PAO1)或大肠杆菌(E.coli)(2×104CFU)在37℃孵化18h。分别以肺脏脱细胞支架的组织培养液在37℃孵化18h的培养液为空白对照，以肺脏脱细胞支架与PAO1或E.coli(2×104CFU)在37℃孵化18h的培养液作为阳性对照。收集孵化后的共培养液，利用梯度稀释方法，将培养液稀释到合适浓度，在10cm LB琼脂平板中加入100ul稀释液体，平板在37℃倒置孵化18h后，对菌落数进行统计，细菌密度＝菌落数×稀释倍数×10/mL。
结果如图7所示，与WT-hDASCs再细胞化肺相比，hCAP18-hDASCs再细胞化肺具有更好的细菌清除能力。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州吉美瑞生医学科技有限公司
<120> 抗菌肽hCAP18/LL-37在抗感染生物工程肺中的应用
<130> 2019
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Lys Thr Gln Arg Asp Gly His Ser Leu Gly Arg Trp Ser Leu Val
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Gly Leu Val Met Pro Leu Ala Ile Ile Ala Gln Val
20 25 30
Leu Ser Tyr Lys Glu Ala Val Leu Arg Ala Ile Asp Gly Ile Asn Gln
35 40 45
Arg Ser Ser Asp Ala Asn Leu Tyr Arg Leu Leu Asp Leu Asp Pro Arg
50 55 60
Pro Thr Met Asp Gly Asp Pro Asp Thr Pro Lys Pro Val Ser Phe Thr
65 70 75 80
Val Lys Glu Thr Val Cys Pro Arg Thr Thr Gln Gln Ser Pro Glu Asp
85 90 95
Cys Asp Phe Lys Lys Asp Gly Leu Val Lys Arg Cys Met Gly Thr Val
100 105 110
Thr Leu Asn Gln Ala Arg Gly Ser Phe Asp Ile Ser Cys Asp Lys Asp
115 120 125
Asn Lys Arg Phe Ala Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu
130 135 140
Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe
145 150 155 160
Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
165 170
<210> 2
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu
1 5 10 15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val
20 25 30
Pro Arg Thr Glu Ser
35
<210> 3
<211> 522
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggggacca tgaagaccca aagggatggc cactccctgg ggcggtggtc actggtgctc 60
ctgctgctgg gcctggtgat gcctctggcc atcattgccc aggtcctcag ctacaaggaa 120
gctgtgcttc gtgctataga tggcatcaac cagcggtcct cggatgctaa cctctaccgc 180
ctcctggacc tggaccccag gcccacgatg gatggggacc cagacacgcc aaagcctgtg 240
agcttcacag tgaaggagac agtgtgcccc aggacgacac agcagtcacc agaggattgt 300
gacttcaaga aggacgggct ggtgaagcgg tgtatgggga cagtgaccct caaccaggcc 360
aggggctcct ttgacatcag ttgtgataag gataacaaga gatttgccct gctgggtgat 420
ttcttccgga aatctaaaga gaagattggc aaagagttta aaagaattgt ccagagaatc 480
aaggattttt tgcggaatct tgtacccagg acagagtcct ag 522
<210> 4
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctgctgggtg atttcttccg gaaatctaaa gagaagattg gcaaagagtt taaaagaatt 60
gtccagagaa tcaaggattt tttgcggaat cttgtaccca ggacagagtc ctag 114
<210> 5
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgagagaga acatggccag gggcccttgc aacgcgccga gatgggcgtc cctgatggtg 60
ctggtcgcca taggcaccgc cgtgacagcg gcc 93

Claims (11)

1.含有表达抗菌肽hCAP18/LL-37的重组载体的肺脏干细胞在制备抗感染生物工程肺中的应用。
2.一种抗感染生物工程肺，为具有抗菌能力的肺脏干细胞移植到肺脏脱细胞支架所形成的肺脏，所述具有抗菌能力的肺脏干细胞含有表达抗菌肽hCAP18/LL-37的重组载体。
3.根据权利要求2所述的抗感染生物工程肺，其特征在于，所述重组载体为病毒载体。
4.根据权利要求2所述的抗感染生物工程肺，其特征在于，所述抗菌肽hCAP18的表达框架为：5’到3’方向依次为启动子、抗菌肽hCAP18的编码基因；所述抗菌肽LL-37的表达框架为：5’到3’方向依次为启动子、信号肽的编码基因、抗菌肽LL-37的编码基因。
5.根据权利要求4所述的抗感染生物工程肺，其特征在于，所述hCAP18的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；LL-37的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述hCAP18的编码基因如SEQID NO.3所示；LL-37的编码基因如SEQ ID NO.4所示；所述信号肽的编码基因如SEQ IDNO.5所示。
6.根据权利要求4所述的抗感染生物工程肺，其特征在于，所述启动子为EF1a。
7.根据权利要求2所述的抗感染生物工程肺，其特征在于，所述肺脏脱细胞支架为大鼠肺脏脱细胞支架或猪肺脏脱细胞支架。
8.权利要求2-7中任一所述抗感染生物工程肺的制备方法，包括步骤：
构建表达抗菌肽hCAP18/LL-37的肺脏干细胞；
构建肺脏脱细胞支架；
将所述表达抗菌肽hCAP18/LL-37的肺脏干细胞移植到所述肺脏脱细胞支架，构建再细胞化肺脏组织。
9.根据权利要求8所述抗感染生物工程肺的制备方法，其特征在于，肺脏脱细胞支架的构建方法为：分别以0.01-0.5w/v％SDS溶液和0.2-5v％TritonX-100溶液经大鼠或猪的肺脏气管以5-25rpm灌注，最后用PBS冲洗。
10.根据权利要求8所述抗感染生物工程肺的制备方法，其特征在于，再细胞化肺脏构建的方法为：将所述表达抗菌肽hCAP18/LL-37的肺脏干细胞移植到大鼠或猪肺脏脱细胞支架，每日更换培养基，培养基经肺动脉以1-10mL/min持续灌流。
11.根据权利要求10所述抗感染生物工程肺的制备方法，其特征在于，所述培养基含有50ng/mL FGF10、5μg/mL转铁蛋白、20ng/mL HGF、2v％基质凝胶和5w/v％BSA。
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