CN117100912A - 一种肺脏脱细胞基质及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域、材料学领域，具体涉及一种肺脏脱细胞基质及其制备方法。具体地，所述方法通过Triton X‑100、SDS、Chaps依次灌流后使用PBS洗脱制备得到的脱细胞基质可以去除天然肺脏组织中95％以上的DNA成分、能够较好保留糖胺聚糖成分、具有较好的胶原纤维网络结构、纤连蛋白与层粘连蛋白的组成与结构保留较为完整，为利用肺脏脱细胞基质构建更为仿生的体外三维肺组织模型奠定了良好的材料学基础。

Description

一种肺脏脱细胞基质及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域、材料学领域，具体涉及一种肺脏脱细胞基质及其制备方法。
背景技术
利用生物材料与组织工程的策略可以在体外构建出能够模拟体内复杂微环境的体外三维模型，有助于更全面的了解宿主-病原体的相互作用。体外三维模型具有类似于在体的组织形态与生物学功能，其在疾病发病机制研究与药物筛选中具有明显优势。目前，亟需开发物理、化学及生物学特征更为仿生的新型生物支架材料用于体外三维模型的建立，使其具有天然组织或器官类似的结构与功能特性。
脱细胞策略的出现为制备更为仿生的生物支架材料提供的新的契机。细胞外基质是由细胞分泌的生物大分子所构成的复杂网络，为细胞的生存及活动提供适宜的场所。其不仅发挥支持、连接、保护等物理作用，而且能够动态的对细胞产生全方位影响。脱细胞策略的关键是去除天然组织与器官中全部的细胞成分和遗传物质，并最大程度的保留细胞外基质的三维结构与组成成分。脱细胞基质材料由于保留了天然组织特定的结构与成分，且具有与天然组织相类似的力学特性，可以提供组织特异性微环境来支持细胞的黏附、增殖和分化，从而在各类疾病的体外三维模型研究方面具有巨大的潜力。脱细胞策略主要包括物理、化学和酶学方法，及上述不同方法的组合应用。物理法如冷冻、超声和搅拌等，对组织的三维结构破坏较为严重。酶学法需使用蛋白酶、核酸酶等，不仅成本较高，而且会破坏纤连蛋白、层粘连蛋白和弹性蛋白。化学法由于具有洗脱效率高、成本低等优势，是目前使用最为广泛的脱细胞方法。
与其他实体组织不同，肺脏组织的结构疏松复杂，含有大量的支气管与肺泡结构，且包含气道和血管两套管路系统，这些复杂结构对肺脏脱细胞基质材料的制备提出了新的挑战。
发明内容
为解决以上制备肺脏脱细胞基质难的问题，本发明提供了一种肺脏脱细胞基质的制备方法。本发明所提供方法制备得到的肺脏脱细胞基质可以去除天然肺脏组织中95％以上的DNA成分、能够较好保留糖胺聚糖成分、具有较好的胶原纤维网络结构、纤连蛋白与层粘连蛋白的组成与结构保留较为完整，为利用肺脏脱细胞基质构建更为仿生的体外三维肺组织模型奠定了良好的材料学基础。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种制备肺脏脱细胞基质的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)取心肺组织，通过滞留针对肺脏进行PBS灌流；
2)PBS沿气管注入肺脏，使双肺膨胀；
3)动脉夹封闭气管，使PBS溶液留在肺部；
4)放气后继续使用PBS灌注；
5)使用Triton X-100、SDS、Chaps依次灌流后使用PBS洗脱。
优选地，所述Triton X-100是1％的Triton X-100。
优选地，所述SDS是0.1％的SDS。
优选地，所述CHAPS是8mM CHAPS。
优选地，所述步骤5)中1％ Triton X-100灌流1-4h(包括1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h)；优选地，2-3h；更优选地，2.5h(小时)。
优选地，所述步骤5)中0.1％SDS灌流0.5-3h(包括0.5、1、1.5、2、2.5、3h)；优选地，1-2h；更优选地，1.5h。
优选地，所述步骤5)中8mM CHAPS灌流0.5-3h(包括0.5、1、1.5、2、2.5、3h)；优选地，1-2h；更优选地，1.5h。
优选地，所述步骤5)中PBS洗脱持续至少8小时(包括8、9、10、11、12、13、14或更多小时)；优选地，至少10小时；更优选地，至少12h；更优选地，12h。
优选地，所述步骤5)中1％ Triton X-100灌流2.5h，0.1％SDS灌注1.5h，8mMCHAPS灌注1.5h，PBS洗脱12h。
更优选地，所述步骤5)中1％ Triton X-100灌流2.5h(前1h:3000μL/min,后1.5h:5000μL/min)，0.1％SDS灌注1.5h(5000μL/min)，8mM CHAPS灌注1.5h(5000μL/min)，PBS洗脱12h(5000μL/min)。
优选地，所述心肺组织取自模型生物。
优选地，所述模型生物包括哺乳动物或非哺乳动物。
优选地，所述模型生物包括大鼠、小鼠、羊、牛、马、猪、羊驼、兔子、鱼或猴等。
最优选地，本发明具体实施例中以大鼠为例制备了肺脏脱细胞基质。
优选地，所述心肺组织是通过本领域常规的取材方式取得的，具体如本发明通用方法1所示。
更优选地，本发明所提供的制备方法是在任意类型的脱细胞装置中进行的，具体地，本发明所使用脱细胞装置如图1所示意。
优选地，上述步骤1)在PBS灌流是通过蠕动泵进行的。
更优选地，所述蠕动泵控制的流速为1mL/min。
步骤1)中进行PBS灌注的目的是排出气泡。
优选地，上述步骤2)中需灌注足够量的PBS使双肺膨胀，同时还可以灌洗出残留血液并排出肺部空气；本发明中灌注了40mL的PBS。
优选地，上述步骤3)中PBS留在肺部至少20min，具体地包括20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多min(分钟)。
具体地，本发明中以停留30min为例进行了制备。
优选地，上述步骤4)中PBS灌注持续0-30min；优选地，10-20min；更优选地，15min。所述0-30具体地包括了0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30。
具体地，通过本发明制备方法所得到的肺脏脱细胞基质具有如下特点：去除天然肺脏组织中95％以上的DNA成分、能够较好保留糖胺聚糖成分、具有较好的胶原纤维网络结构、纤连蛋白与层粘连蛋白的组成与结构保留较为完整。
本发明所述PBS即为本领域所常规使用的PBS缓冲液(磷酸盐缓冲生理盐水，Phosphate buffered saline)，其配制方法为：将1.44g Na2HPO4，8g NaCl，0.24g KH2PO4，0.2g KCl溶于500mL蒸馏水后定容到1L，高压灭菌。
本发明所述Triton X-100即曲拉通X-100(Triton X-100，C14H22O(C2H4O)n)，是一种非离子型表面活性剂。所述1％Triton溶液的配置方法示例性的是：将10mL Triton溶于500mL1×PBS后定容到1L，高压灭菌。
本发明所述SDS即十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate)，本发明所述0.1％SDS溶液的配置方式是将1g SDS溶于500mL蒸馏水后定容到1L，高压灭菌。
本发明所述Chaps即3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨]-1-丙烷磺酸盐，另有别名为胆酰胺丙基-二甲基-氨基]-1-丙烷磺酸盐，本发明所述8mM Chaps溶液的配置方式是将4.92gChaps溶于500mL蒸馏水后定容到1L，高压灭菌。
另一方面，本发明还提供了制备方法处理得到的肺脏脱细胞基质。
本发明中所述肺脏脱细胞基质也可以称为肺脏脱细胞支架、肺脏脱细胞基质材料，凡通过本发明上述制备方法处理肺脏组织得到的产物皆纳入本发明所述肺脏脱细胞基质的范围。
同时，本发明还提供了所述肺脏脱细胞基质在构建体外肺脏模型中的应用。
优选地，所述应用中肺脏模型可以通过向上述肺脏脱细胞模型接种肺脏相关细胞获得。
优选地，所述肺脏相关细胞包括：肺血管周细胞、微血管平滑肌细胞、肺动脉成纤维细胞、肺癌细胞、肺血管内皮细胞。
优选地，所述肺癌细胞包括任意类型肺癌细胞，包括商品化细胞系或分离自肺癌患者肺部的细胞。
具体地，本发明中接种的细胞是人肺腺癌细胞A549或Calu-3。
另一方面，本发明还提供了使用前述肺脏脱细胞基质构建体外肺脏模型的方法，所述方法包括冻干、灭菌、加入细胞和细胞培养基并进行细胞培养的步骤。
更优选地，所述方法中需将肺脏脱细胞基质裁剪为厚度3mm和/或直径1cm的小片。
更优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)铺板：将制备好的肺脱细胞基质剪成直径1cm，厚度3mm的小片，平铺，置于容器中，
(2)冻干：将步骤1)中的小片放入－80℃冰箱过夜，次日取出放入冻干机冷冻干燥，
(3)辐照灭菌：采用钴60对冻干基质进行辐照灭菌，
(4)将细胞用完全培养基重悬细胞并接种于容器中(接种密度：2-3×105个细胞/mL)，
(5)将容器置于细胞培养箱中1.5h，然后加入2mL完全培养基进行三维培养，每24h换液一次。
优选地，所述步骤2)中冻干时间约5h。
优选地，所述细胞密度是2.5×105个细胞/mL。
更具体地，可以选用24孔板作为容器，则步骤4)中每孔中需加入细胞悬液50μL。
本发明所述体外肺脏模型可以被病毒感染，用作研究病毒感染肺部的模型。
优选地，所述病毒包括致人患病的病毒；所述致人患病的病毒包括中东呼吸综合征冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒2、H5亚型禽流感病毒、犬冠状病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒；
优选地，所述病毒包括SARS-CoV-2及其D614G、Alpha、Delta、Omicron、XBB、BA.5变异株。
附图说明
图1是本发明所使用的脱细胞装置。
图2是对大鼠脱细胞肺脏组织的大体观察结果，A：天然肺脏组织；B：Triton+SDS处理组；C：Triton+Chaps处理组；D：Triton+SDS+Chaps联合处理组。
图3是天然肺脏及脱细胞肺脏扫描电镜观察结果，A：天然肺脏组织；B：Triton+SDS处理组；C：Triton+Chaps处理组；D：Triton+SDS+Chaps联合处理组。
图4是天然肺脏及脱细胞肺脏的HE染色结果，A：天然肺脏组织；B：Triton+SDS处理组；C：Triton+Chaps处理组；D：Triton+SDS+Chaps联合处理组。
图5是DNA定量分析结果。
图6是天然肺脏及脱细胞肺脏的Alcian blue染色结果。
图7是GAG定量分析结果。
图8是天然肺脏及脱细胞肺脏中胶原蛋白的免疫组化染色结果。A：天然肺脏及脱细胞肺脏中Ⅰ型胶原蛋白的免疫组化染色；B：天然肺脏及脱细胞肺脏中III型胶原蛋白的免疫组化染色；C：天然肺脏及脱细胞肺脏中Ⅳ型胶原蛋白的免疫组化染色。
图9是天然肺脏及脱细胞肺脏中功能性蛋白的组织学染色结果。
图10是肺脏脱细胞基质的蛋白质组学分析结果，A：D-Lung和Matrigel中细胞内(IN)和细胞外蛋(EX)蛋白的Venn图和蛋白数量条形图；B：D-Lung和Matrigel中不同亚细胞定位下的蛋白数量百分比；D-Lung和Matrigel中五种亚细胞定位下的蛋白数量百分比条形图；C：D-Lung和Matrigel的蛋白GO分析。数据显示为平均值±标准差。n(D-Lung)＝3，n(Matrigel)＝3。
图11是D-Lung和Matrigel中Matrisome亚类蛋白的差异表达结果，A：D-Lung和Matrigel中匹配到Matrisome数据库中蛋白数量的差异分析；B：D-Lung和Matrigel中Matrisome亚类蛋白表达水平的差异分析；C：D-Lung与Matrigel中Matrisome亚类差异表达蛋白的火山图；D：D-Lung与Matrigel中Matrisome亚类差异表达蛋白的图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
本发明所涉及实验材料：
1、实验动物
Sprague-Dawley(SD)大鼠(200±20g，雌雄不限，清洁级，维通利华)。
实验动物编号：No.110011210102054843、No.110011200110639617、No.110011200110864916、No.110011200109563061、No.110011200110221041、No.110011210111962625、No.110011200108556256、No.110011210112632726、No.110011210105234658、No.110011210111042667。
2、主要试剂
表1、主要试剂
3、主要溶液配制
(1)1×PBS：将1.44g Na2HPO4，8g NaCl，0.24g KH2PO4，0.2g KCl溶于500mL蒸馏水后定容到1L，高压灭菌。
(2)0.1％SDS溶液：将1g SDS溶于500mL蒸馏水后定容到1L，高压灭菌。(3)1％Triton溶液：将10mL Triton溶于500mL1×PBS后定容到1L，高压灭菌。
(4)8mM Chaps溶液：将4.92g Chaps溶于500mL蒸馏水后定容到1L，高压灭菌。
(5)50U/mL肝素钠溶液：将8μL 6250U/mL肝素钠溶于500mL生理盐水后定容到1L。
(6)7％水合氯醛溶液：将0.7g水合氯醛溶于5mL蒸馏水后定容到10mL。
(7)酒精苏木精：将5g苏木精溶于100mL无水乙醇，微加热。
(8)Lugofs碘液：将80g碘化钾融于少量蒸馏水中，加入40g碘结晶后用蒸馏水定容到4L，避光保存。
(9)Verhoeffs苏木精：将酒精苏木精20mL，10％三氯化铁8mL和Lugofs碘液8mL序依次混合，现配现用。
(10)Van Gieson’s液：将1％酸性品红1mL和饱和苦味酸45mL混合，静置过夜。
本发明通用方法：
方法1、心肺取材
SD大鼠术前12h禁食，采用7％水合氯醛，根据大鼠体重以0.5mL/100g对大鼠进行麻醉，约2min进入麻醉期。将大鼠仰卧固定，用75％乙醇依次对颈部、胸部和腹部进行消毒。逐层分离颈部皮肤和肌肉并暴露气管，于第3/4气管软骨环间进行气管插管，连通小动物呼吸机进行机械通气，潮气量为6mL，呼吸频率为80次/min，观察大鼠呼吸平稳且呼吸频率与呼吸机保持一致后开始手术。
胸腹部正中处切口打开腹腔，将横膈膜剪开进入胸腔，将两侧肋骨垂直剪开，直至心肺完全暴露。右心房开口放血，注射器针头插入右心室底部，注射肝素钠溶液(50U/mL)15mL防止凝血。待肺脏颜色变淡后将气管与食道分离，将心肺整体取出。
方法2、SEM检测
将新鲜肺脏组织及上述三种方法获得的肺脏脱细胞组织通过真空冷冻干燥机冻干2h。取少量冻干样品直接粘到导电胶上，并使用Oxford Quorum SC7620溅射镀膜仪喷金45s，喷金为10mA；随后使用扫描电子显微镜拍摄样品形貌，形貌拍摄时加速电压为3kV。
方法3、DNA定量检测
(1)干燥：新鲜肺脏组织及三种肺脏脱细胞组织从冰箱取出后放入1.5mL的EP管中，标记，封口膜封口，放入真空冷冻干燥机中冻干2h。
(2)定量：每个组织称重、研磨并按10mg/mL的质量比匀浆。
(3)10,000rpm(～11,200×g)离心1min，倒尽上清，加200μL缓冲液GA，震荡至彻底悬浮。
(4)加入20μLProteinase K溶液混匀，后在56℃放置，直至组织溶解，瞬离以去除管盖内壁的水珠。
(5)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，瞬离以去除管盖内壁的水珠。
(6)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，瞬离以去除管盖内壁的水珠。
(7)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
(8)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
(9)向吸附柱CB3中加入700μL缓冲液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
(10)重复步骤(9)。
(11)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(12)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
(13)使用超微量分光光度计测定出组织内DNA含量。
方法4、GAG定量检测
(1)样品预处理
1)取出新鲜肺脏组织及三种肺脏脱细胞组织，称重取200mg
2)放进预冷的15mL锥形离心管
3)加入3mLGENMED清理液清洗1次
4)移入到一个液氮冻存管
5)即刻放进液氮罐过夜
6)次日从液氮罐里取出，即刻(最快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状
7)放进一个1.5mL离心管
8)加入500μLGENMED萃取液
9)强力涡旋震荡1min，充分混匀
10)放进56℃恒温金属浴孵育16h
11)放进90℃恒温金属浴孵育10min
12)放进微型台式离心机离心10min，速度为13000rpm
13)小心移取上清液到新的1.5mL离心管
14)置于冰盒备用
(2)标准样品配制
1)准备好5个1.5mL离心管，标记为1至5号管
2)分别加入50μL GENMED清理液
3)移取50μL GENMED标准液到1号管，混匀
4)小心移取50μL 1号管稀释的GENMED标准液到2号管，混匀
5)小心移取50μL 2号管稀释的GENMED标准液到3号管，混匀
6)小心移取50μL 3号管稀释的GENMED标准液到4号管，混匀
7)将1至5号管放进冰盒里备用；标准管浓度见下表
表2、标准管浓度
(3)标准曲线测定
1)移取50μL上述配制的GENMED标准液到1.5mL离心管
2)加入1mLGENMED染色液
3)涡旋震荡15s
4)室温下孵育30min，避免光照，期间每隔5min漩涡震荡15s
5)即刻放进微型台式离心机离心10min，速度为13000rpm
6)小心抽去上清液，确保没有水滴残留，可见管壁或管底紫色或粉红色沉积
7)加入1mLGENMED解离液
8)涡旋震荡15s
9)室温下孵育5min，避免光照，确保充分溶解
10)转移到新的比色皿
11)即刻放进分光光度仪检测(波长656nm)：获得标准样品吸光读数，参考读数在0.2至1.0左右
12)重复实验步骤1至11四次
13)构建标准曲线：纵坐标(Y轴)为吸光度读上；横坐标(X轴)为标准糖胺多糖含量(μg)
(4)样品测定
1)移取50μL上述制备的待测样品到1.5mL离心管
2)加入1mLGENMED染色液
3)涡旋震荡15s
4)室温下孵育30min，避免光照，期间每隔5min漩涡震荡15s
5)即刻放进微型台式离心机离心10min，速度为13000rpm
6)小心抽去上清液，确保没有水滴残留，可见管壁或管底紫色或粉红色沉积
7)加入1mLGENMED解离液
8)涡旋震荡15s
9)室温下孵育5min，避免光照，确保充分溶解
10)转移到新的比色皿
11)即刻放进分光光度仪检测(波长656nm)：获得样品吸光读数
12)根据上述标准曲线获得样品对应糖胺多糖含量(μg)
(5)浓度计算
根据上述标准曲线样品对应糖胺多糖含量(μg)/0.050(样品容量；mL)＝μg糖胺多糖/mL
方法5、组织学检测
1、石蜡切片制备
(1)新鲜肺脏组织及三种肺脏脱细胞组织取材于4％多聚甲醛中固定24h。
(2)梯度脱水，将组织块取出依次放入70％，80％，90％，95％和100％乙醇溶液中各15min。
(3)透明，将组织块取出放入二甲苯中浸泡两次，10min/次。
(4)浸蜡，将组织块取出放入石蜡溶液中浸泡两次，每次1h。
(5)包埋，将组织块取出置于包埋盒中间位置包埋，置于冻台凝固。
(6)切片，待蜡块完全凝固后进行切片，厚度为4μm。
(7)展片，将切好的蜡片置于漂片机中展片。
(8)捞片，使用载玻片捞取切片并做好标记。
(9)烤片，将载玻片置于烤片机上2～3h。
(10)将载玻片置于37℃孵箱过夜。
(11)烘片，将载玻片置于烘烤箱2～3h，装入片盒备用。
2、HE染色
(1)脱蜡，将切片浸入二甲苯两次，每次10min，再依次浸入100％，95％，70％，和60％乙醇中各5min，最后脱蜡至蒸馏水5min。
(2)苏木素染色5min。
(3)1％盐酸分化5s，自来水冲洗5min。
(4)1％氨水复蓝，自来水冲洗5min。
(5)伊红染色5min，自来水冲洗5min。
(6)脱水，依次浸入60％、75％、95％和100％乙醇中各2s。
(7)浸入二甲苯两次，5min/次。
(8)中性树胶封片。
3、EVG染色
(1)脱蜡，将切片浸入二甲苯两次，每次10min，再依次浸入100％，95％，70％，和60％乙醇中各5min，最后脱蜡至蒸馏水5min。
(2)Verhoeffs苏木精染色30min，自来水冲洗5min。
(3)2％三氯化铁溶液分化，直至镜下观察见黑色纤维灰色背景，蒸馏水浸洗5s。
(4)5％硫代硫酸钠清除碘1min，蒸馏水浸洗5s。
(5)伊红染色5min，自来水冲洗5min。
(6)Van Gieson’s液复染5min。
(7)脱水，依次浸入60％、75％、95％和100％乙醇中各2s。
(8)浸入二甲苯两次，5min/次。
(9)中性树脂封片。
4、Alcian Blue染色
(1)脱蜡，将切片浸入二甲苯两次，每次10min，再依次浸入100％，95％，70％，和60％乙醇中各5min，最后脱蜡至蒸馏水5min。
(2)入Alcian酸化液浸泡3min。
(3)入Alcian染色液染色30min。
(4)流水冲洗。
(5)入核固红染色液复染5min。
(6)流水冲洗1min。
(7)脱水，依次浸入60％、75％、95％和100％乙醇中各2s。
(8)浸入二甲苯两次，5min/次。
(9)中性树脂封片。
5、免疫组织化学染色
(1)脱蜡，将切片浸入二甲苯两次，每次10min，再依次浸入100％，95％，70％，和60％乙醇中各5min，最后脱蜡至蒸馏水5min。
(2)3％双氧水室温孵育15min，自来水，蒸馏水依次浸洗5s。
(3)浸入pH8.0 EDTA中，于140℃高温修复3min。
(4)PBS洗3次，5min/次。
(5)滴加山羊血清/兔血清，置于37℃恒温箱封闭20min。
(6)分别滴加一抗Rabbit Anti-Collagen TypeⅠ、Rabbit Anti-Collagen TypeⅢ、Rabbit Anti-Collagen TypeⅣ、Rabbit Anti-Elastin、Rabbit Anti-Fibronectin及Rabbit Anti-LAMININ，置于4℃冰箱过夜。
(7)PBS洗3次，5min/次。
(8)分别滴加上述一抗所对应二抗(见主要试剂)，置于37℃恒温箱孵育20min。
(9)PBS洗3次，5min/次。
(10)DAB显色，镜下观察并适时终止。
(11)苏木素染核3min，流水冲洗。
(12)1％盐酸分化5s，流水冲洗。
(13)1％氨水复蓝，流水冲洗。
(14)伊红浸染5min，流水冲洗。
(15)脱水，依次浸入60％、75％、95％和100％乙醇中各2s。
(16)浸入二甲苯两次，5min/次。
(17)中性树脂封片。
6、蛋白质组学分析
1)取材
脱细胞后，取肺脏脱细胞基质材料30mg×3，取对照组商品化Matrigel 30mg×3，低温(-80℃)保存。
2)蛋白提取
取出低温保存的样品，称取适量于预冷研钵中，加液氮充分研磨至粉末。各组样品分别加入适量裂解缓冲液(8M尿素，1％蛋白酶抑制剂)，超声裂解。4℃，12000g离心10min以去除细胞碎片，将上清移至新离心管，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。
3)蛋白浓度测定
取5μL蛋白样品，将标准品按0μL、5μL、10μL、15μL、20μL加到酶标条的样品孔中，加样品稀释液补足到20μL，各检测3个复孔；
将5μL待测蛋白样品加到酶标条的样品孔中，加样品稀释液补足到20μL，各检测3个复孔；
各孔加入200μL BCA工作液，37℃静置反应30min；
用酶标仪测定A570(最佳吸收波长为562nm，540-595nm之间的其他波长也可应用)；
根据标准曲线和使用的样品体积计算样品的蛋白浓度。
4)胰酶酶解
取等量的各样品蛋白进行酶解，用裂解液将终体积调至统一。缓慢加入20％的TCA，充分混匀，于4℃静置沉淀2h。4500g，离心5min，弃上清，用预冷的丙酮洗涤沉淀2～3次。晾干沉淀，加入200mM的TEAB后超声打散沉淀，以1:50的比例(蛋白酶：蛋白)加入胰酶过夜酶解。加入二硫苏糖醇(DTT)使终浓度为5mM，56℃还原30min。加入碘乙酰胺(IAA)使终浓度为11mM，室温孵育15min(避光)。
取5μL蛋白样品，将标准品按0μL、5μL、10μL、15μL、20μL加到酶标条的样品孔中，加样品稀释液补足到20μL，各检测3个复孔；
将5μL待测蛋白样品加到酶标条的样品孔中，加样品稀释液补足到20μL，各检测3个复孔；
各孔加入200μL BCA工作液，37℃静置反应30min；
用酶标仪测定A570(最佳吸收波长为562nm，540-595nm之间的其他波长也可应用)；
根据标准曲线和使用的样品体积计算样品的蛋白浓度。
5)液相色谱-质谱联用分析
用液相色谱流动相A溶解酶解后的肽段，使用EASY-nLC 1200超高效液相系统进行分离，流速稳定在550.00nL/min。流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。液相参数见表2-2。
表3、液相色谱参数
将分离后的肽段注入NSI离子源(2.3kV)中进行电离，质谱分析采用Exploris480，肽段母离子及其二级碎片的检测和分析使用高分辨的Orbitrap。一级质谱扫描范围设置为400～1200m/z，扫描分辨率为60000.00；二级质谱扫描范围固定起点设置为100m/z，扫描分辨率为15000.00。数据采集模式使用数据依赖型扫描(DDA)程序。为了提高质谱的有效利用率，参数设置如下：自动增益控制(AGC)为100％，信号阈值为5E4ions/s，最大注入时间为50ms；串联质谱扫描的动态排除时间设置为20s，以避免母离子的重复扫描。
6)数据库搜索
二级质谱数据使用PD 2.4进行检索。数据库为Rattus_norvegicus_10116(29951条序列)，并在该数据库中添加反库用以计算随机匹配造成的假阳性率(FDR)，同时在数据库中加入常见的污染库以消除鉴定结果中污染蛋白的影响；检索参数设置如下：酶切方式为Trypsin/P；漏切位点数为2；肽段最小长度为7个氨基酸残基；肽段最大修饰数为5；Firstsearch的一级母离子质量误差容忍度为20.0ppm、Main search的一级母离子质量误差容忍度为5ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为20.0ppm。设置半胱氨酸烷基化Carbamidomethyl(C)为固定修饰、['Acetyl(Protein N-term)','Oxidation(M)','Deamidation(NQ)']为可变修饰。定量方法设置为LFQ，蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1％。
7)生物信息学分析
亚细胞定位：真核生物的细胞被细分为功能不同的膜结合区。真核细胞的一些主要成分是：细胞外空间、细胞质、细胞核、线粒体、高尔基体、内质网(ER)、过氧化物酶体、空泡、细胞骨架、核质、核小体、核基质和核糖体。我们使用Wolfpsort亚细胞定位预测软件对亚细胞定位进行分析。Wolfpsort软件是用于预测真核生物序列的PSORT/PSORT II的更新版本。
二级质谱数据使用PD 2.4进行检索。数据库为Rattus_norvegicus_10116(29951条序列)，并在该数据库中添加反库用以计算随机匹配造成的假阳性率(FDR)，同时在数据库中加入常见的污染库以消除鉴定结果中污染蛋白的影响；检索参数设置如下：酶切方式为Trypsin/P；漏切位点数为2；肽段最小长度为7个氨基酸残基；肽段最大修饰数为5；Firstsearch的一级母离子质量误差容忍度为20.0ppm、Main search的一级母离子质量误差容忍度为5ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为20.0ppm。设置半胱氨酸烷基化Carbamidomethyl(C)为固定修饰、['Acetyl(Protein N-term)','Oxidation(M)','Deamidation(NQ)']为可变修饰。定量方法设置为LFQ，蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1％。
方法6、统计学分析
采用SPSS17.0及GraphPad Prism8软件进行数据处理与分析，各组计量资料以“均数±标准差”的形式表示。两组间统计学差异用t检验分析；两组以上的组间比较用One-WayANOVA联合最小显著差数(LSD)检验分析。p<0.05为差异显著。
实施例1、肺脏脱细胞基质的制备
制备方法：
将取出的心肺组织放入10cm细胞培养皿中，将留置针(22号)沿心脏导管通入肺动脉，动脉夹固定留置针，用蠕动泵以1mL/min的速度通过留置针对肺脏进行PBS灌流，排出气泡。再用注射器将40mLPBS沿气管注入肺脏，使双肺膨胀，灌洗出残留血液并排出肺部空气。灌洗完毕后用动脉夹封闭气管，使PBS溶液留在肺部30min。30min后取下气管动脉夹，使肺部进一步放气，继续灌流PBS15min。15min后分别采用以下三种方法对肺脏进行脱细胞处理。脱细胞装置见图1。
方法一，Triton X-100+SDS处理组：1％ Triton X-100+灌流2.5h(前1h:3000μL/min,后1.5h:5000μL/min)，0.1％SDS灌注3h(5000μL/min)，PBS洗脱12h(5000μL/min)。
方法二，Triton X-100+Chaps处理组：1％ Triton X-100灌流2.5h(前1h:3000μL/min,后1.5h:5000μL/min)，8mM Chaps灌注3h(5000μL/min)，PBS洗脱12h(5000μL/min)。
方法三，Triton X-100+SDS+Chaps联合处理组(即本发明所提供的制备方法)：1％Triton X-100灌流2.5h(前1h:3000μL/min,后1.5h:5000μL/min)，0.1％SDS灌注1.5h(5000μL/min)，8mM CHAPS灌注1.5h(5000μL/min)，PBS洗脱12h(5000μL/min)。
形态观察：
经三种方法脱细胞处理后，肺脏组织大体形态没有明显改变。随着洗脱程序的进行，三种肺脏脱细胞方法均能去除天然肺脏组织中的血液与细胞成分，肺脏组织逐渐透明。
Triton+SDS+Chaps联合处理组(以上方法三)制备的脱细胞肺脏透明度最佳，可清晰的观察到存在于肺叶中密集的支气管与血管等脉管结构，表明该方法能够较好的保留肺脏的组织结构。而Triton+Chaps组和Triton+SDS组中仅能观察到少量脉管结构(图2，Scalebar＝10mm)。
实施例2、SEM检测结果
肺脏组织与脱细胞肺脏组织的截断面SEM结果可见，天然肺脏的微组织结构组织有序，肺脏细胞分布于细胞外基质所构成的网络结构中。Triton+SDS处理组的脱细胞肺脏的微组织结构破坏较为严重，无可见细胞成分；Triton+Chaps处理组的脱细胞肺脏的微组织结构保留较好，但在细胞外基质网络结构中可见部分细胞残留；Triton+SDS+Chaps联合处理组不仅能够有效的保留天然肺脏的微组织结构，而且无明显的细胞成分(图3，Scalebar＝50μm)。
上述结果表明，Triton+SDS+Chaps联合洗脱法对天然肺脏细胞外基质的三维结构保留效果最好。
实施例3、HE染色及DNA定量分析
HE染色结果可见，与天然肺脏相比，Triton+SDS处理组中无可见细胞残留，但肺组织结构破坏严重，几乎没有完整保留的肺泡和脉管结构。Triton+Chaps处理组中肺组织结构保留较好，但存在较多的细胞残留。Triton+SDS+Chaps联合处理组既能较好的保留天然肺脏的组织结构，又能有效的去除细胞成分(图4，Scale bar＝200μm)。
DNA定量结果可见，与天然肺脏相比，三个脱细胞处理组均可以去除天然肺脏中95％以上的DNA成分(p<0.01)。Triton+Chaps组42.73±1.54ng/mg，Triton+SDS+Chaps组22.51±1.20ng/mg，Triton+SDS组11.36±0.62ng/mg。经比较，三个脱细胞处理组DNA含量为Triton+Chaps组>Triton+SDS+Chaps组>Triton+SDS，组间差异显著(p<0.01)(图5，**表示p<0.01)。
实施例4、Alcian Blue染色及GAG定量分析
Alcian blue染色可将细胞外基质中的多糖成分蓝染，将细胞成分红染。染色结果显示，与天然肺脏组织相比，Triton+SDS处理组的脱细胞基质中多糖的组织结构破坏较为严重，且多糖成分损失较多，无明显可见的细胞成分。Triton+Chaps处理组的脱细胞基质中多糖的组织结构保留较好，但有部分细胞残留。Triton+SDS+Chaps联合处理组的脱细胞基质中多糖的组织结构保留完好，多糖含量较为丰富，无可见细胞残留(图6，Scale bar＝100μm)。
GAG定量结果显示，与天然肺脏组织相比，三个脱细胞组的GAG含量均显著减少(p<0.01)。Triton+Chaps组的GAG含量为37.91±1.52μg/mg，Triton+SDS+Chaps组的GAG含量为23.48±0.93μg/mg，Triton+SDS组的GAG含量为11.11±0.78μg/mg。经比较，三个脱细胞处理组GAG含量为Triton+Chaps组>Triton+SDS+Chaps组>Triton+SDS，组间差异显著(p<0.01)(图7，**表示p<0.01)。
实施例5、结构性蛋白的免疫组化染色
我们对大鼠肺脏和脱细胞肺脏中细胞外基质主要结构性蛋白中的胶原成分进行了免疫组化染色。结果表明，三个脱细胞处理组所获得的脱细胞基质均表达I型胶原、III型胶原和IV型胶原。其中，Triton+SDS处理组的肺脏脱细胞基质中胶原纤维所构成的网络结构破坏较为严重；Triton+Chaps处理组与Triton+SDS+Chaps联合处理组的肺脏脱细胞基质能够较好的保留胶原纤维网络结构，但在Triton+Chaps处理组中存在较多的细胞残留(图8，Scale bar＝100μm)。
上述结果表明，Triton+SDS+Chaps联合处理组所获得的肺脏脱细胞基质具有较好的胶原纤维网络结构。
实施例6、功能性蛋白的组织学染色
EVG染色可使胶原纤维呈红色，弹性纤维呈蓝黑色。染色结果显示，Triton+SDS处理组的肺脏脱细胞基质以弹性纤维为主，胶原纤维含量较少，且纤维结构破坏严重。Triton+Chaps处理组的肺脏脱细胞基质以胶原纤维为主，弹性纤维含量较少，纤维结构保留较好。Triton+SDS+Chaps联合处理组的肺脏脱细胞基质中胶原纤维与弹性纤维含量均较为丰富，且纤维结构保留完好(图9A，Scale bar＝100μm)。Elastin免疫组化染色结果与EVG染色中弹性纤维的染色结果一致，同样证明了Triton+SDS+Chaps联合处理组的肺脏脱细胞基质中弹性纤维的组成与结构保留较为完整(图9B)。Fibronectin与Laminin的免疫组化染色结果表明，三个脱细胞处理组所获得的脱细胞基质均表达纤连蛋白与层粘连蛋白。同样，Triton+SDS+Chaps联合处理组的肺脏脱细胞基质中纤连蛋白与层粘连蛋白的组成与结构保留较为完整(图9C-D)。
实施例7、蛋白质组学分析
肺脏脱细胞基质的蛋白质组学分析
通过蛋白质组学研究进一步分析了肺脏脱细胞基质和Matrigel之间蛋白组成的差异性。根据Huanjing Bi等报道的分析方法，可以将所有鉴定的蛋白归类为细胞内蛋白和细胞外蛋白[30,31]。分析结果表明，D-Lung(本发明所制备方法得到的肺脏脱细胞基质)的总蛋白数量比Matrigel多，其中从D-Lung样本中共鉴定出3333种蛋白，包含742种细胞外蛋白；从Matrigel样本中鉴定出了3127种蛋白，包括588种细胞外蛋白。Venn图显示D-Lung和Matrigel的共有蛋白包括2234种细胞内蛋白和533种细胞外蛋白(图10A)。我们进一步对蛋白的亚细胞定位进行了分析，发现在所有识别的蛋白中，D-Lung和Matrigel中的质膜蛋白、细胞外基质蛋白、核蛋白、胞质蛋白及其他蛋白的数量百分比差异较小，D-Lung与Matrigel中的细胞外基质蛋白的数量分别占各自总蛋白数量的11.7％与10.5％(图10B)。GO分析表明，在细胞成分(CC)，生物过程(BP)和分子功能(MF)类别中，D-Lung中相关蛋白的数量百分比均高于Matrigel(图10C)。
D-Lung和Matrigel中Matrisome亚类蛋白的差异表达
为了更细致的分析D-Lung和Matrigel的成分差异性，我们使用Matrisome数据库对识别蛋白中的细胞外基质蛋白进行进一步注释。Matrisome数据库可以将细胞外基质蛋白分为核心ECM蛋白和ECM相关蛋白，其中核心ECM蛋白包括胶原蛋白、ECM糖蛋白和蛋白多糖三类，ECM相关蛋白包括ECM附属蛋白、ECM调节因子和分泌因子三类。
我们在Matrisome数据库中匹配到225个蛋白，其中核心ECM蛋白115个，包括胶原蛋白22个，ECM糖蛋白83个，蛋白多糖10个；ECM相关蛋白107个，包括ECM附属蛋白29个，ECM调节因子52个，分泌因子26个。
D-Lung中匹配到Matrisome数据库的蛋白数量比Matrigel中的多，其中除了ECM调节因子和ECM糖蛋白，D-Lung中其余细胞外基质亚类蛋白的数量都高于Matrigel(图11A)。我们进一步对蛋白的差异表达进行分析，与Matrigel相比，共鉴定出1170种差异表达的D-Lung蛋白质，包括964种上调蛋白。与Matrisome匹配后，D-Lung蛋白中的胶原蛋白、ECM附属蛋白、ECM糖蛋白和蛋白多糖的平均表达水平均明显高于Matrigel，ECM调节因子表达水平低于Matrigel，而分泌因子表达水平无明显差异(图11B)。火山图显示D-Lung与Matrigel的Matrisome亚类蛋白表达水平存在显著差异，尤其是胶原类蛋白显著上调表达，如Col1a1、Col4a4、Col5a2、Col6a6和Col12a1等，有少数蛋白下调，如Col8a1(图11C)。热图显示，D-Lung中Matrisome蛋白不同亚类的表达水平均高于Matrigel，其中胶原蛋白、ECM附属蛋白、ECM糖蛋白、蛋白多糖和分泌因子亚类差异更为明显(图11D)。

Claims (10)

1.一种制备肺脏脱细胞基质的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)取心肺组织，对肺脏进行PBS灌流；
2)PBS沿气管注入肺脏，使双肺膨胀；
3)动脉夹封闭气管，使PBS溶液留在肺部；
4)放气后继续使用PBS灌注；
5)使用Triton X-100、SDS、Chaps依次灌流后使用PBS洗脱。
2.如权利要求1所述的方法，所述Triton X-100是1％的Triton X-100，所述SDS是0.1％的SDS，所述CHAPS是8mM CHAPS；
优选地，所述步骤5)中1％Triton X-100灌流1-4h；优选地，2-3h；更优选地，2.5h；
优选地，所述步骤5)中0.1％SDS灌流0.5-3h；优选地，1-2h；更优选地，1.5h；
优选地，所述步骤5)中8mM CHAPS灌流0.5-3h；优选地，1-2h；更优选地，1.5h；
优选地，所述步骤5)中PBS洗脱持续至少8小时；优选地，至少10小时；更优选地，至少12h；更优选地，12h；
优选地，所述步骤5)中1％Triton X-100灌流2.5h，0.1％SDS灌注1.5h，8mM CHAPS灌注1.5h，PBS洗脱12h；
更优选地，所述步骤5)中1％Triton X-100灌流2.5h，前1h:3000μL/min,后1.5h:5000μL/min；0.1％SDS灌注1.5h，5000μL/min)；8mM CHAPS灌注1.5h，5000μL/min；PBS洗脱12h，5000μL/min。
3.如权利要求1所述的方法，所述心肺组织取自模型生物；
优选地，所述模型生物包括哺乳动物或非哺乳动物；
优选地，所述模型生物包括大鼠、小鼠、羊、牛、马、猪、羊驼、兔子、鱼或猴。
4.如权利要求1所述的方法，上述步骤1)在PBS灌流是通过蠕动泵进行的；
更优选地，所述蠕动泵控制的流速为1mL/min；
优选地，上述步骤3)中PBS留在肺部至少20min；更优选地30min；
优选地，上述步骤4)中PBS灌注持续0-30min；优选地，10-20min；更优选地，15min。
5.权利要求1所述方法处理得到的肺脏脱细胞基质；
优选地，所述肺脏脱细胞基质中去除了天然肺脏组织中95％以上的DNA成分；
优选地，所述肺脏脱细胞基质能够较好保留糖胺聚糖成分；
优选地，所述肺脏脱细胞基质具有较好的胶原纤维网络结构；
优选地，所述肺脏脱细胞基质纤连蛋白与层粘连蛋白的组成与结构保留较为完整。
6.权利要求5所述肺脏脱细胞基质在构建体外肺脏模型中的应用。
7.使用权利要求5所述肺脏脱细胞基质构建体外肺脏模型的方法，所述方法包括将肺脏脱细胞基质冻干、灭菌，并加入细胞和细胞培养基进行细胞培养的步骤。
8.如权利要求7所述方法，所述细胞包括肺脏相关细胞；
优选地，所述肺脏相关细胞包括：肺血管周细胞、微血管平滑肌细胞、肺动脉成纤维细胞、肺癌细胞、肺血管内皮细胞；
优选地，所述肺癌细胞包括任意类型肺癌细胞，包括商品化细胞系或分离自肺癌患者肺部的细胞；
优选地，所述细胞是人肺腺癌细胞A549或Calu-3；
优选地，所述方法中需将肺脏脱细胞基质裁剪为厚度3mm和/或直径1cm的小片；
更优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)铺板：将制备好的肺脱细胞基质剪成直径1cm，厚度3mm的小片，平铺，置于容器中，
(2)冻干：将步骤1)中的小片放入－80℃冰箱过夜，次日取出放入冻干机冷冻干燥，
(3)辐照灭菌：采用钴60对冻干基质进行辐照灭菌，
(4)将细胞用完全培养基重悬细胞并接种于容器中(接种密度：2-3×105个细胞/mL)，
(5)将容器置于细胞培养箱中1.5h，然后加入2mL完全培养基进行三维培养，每24h换液一次；
优选地，所述步骤2)中冻干时间约5h；
优选地，所述细胞密度是2.5×105个细胞/mL。
9.权利要求7所述方法制备得到的体外肺脏模型。
10.权利要求9所述体外肺脏模型在研究病毒感染中的应用；
优选地，所述病毒包括致人患病的病毒；所述致人患病的病毒包括中东呼吸综合征冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒2、H5亚型禽流感病毒、犬冠状病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒及以上病毒的变异株；
优选地，所述病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2及其D614G、Alpha、Delta、Omicron、XBB、BA.5变异株。
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