CN114805484B - 一种自组装多肽、自组装纳米水凝胶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种自组装多肽、自组装纳米水凝胶及其应用。所述自组装多肽序列为Nap‑FFKGRGD，其中FFKGRGD为氨基酸序列，组成所述多肽的FF为D构型氨基酸或L构型氨基酸，将所述自组装多肽的溶液加热冷却后得到具有纳米级别的纤维网络结构的自组装纳米水凝胶，该水凝胶生物稳定性良好，可以较好的抵抗蛋白酶的降解作用；同时作为干细胞移植的载体生物材料，能够延长细胞移植后在体内的存活及滞留，进而提高干细胞对于组织损伤的治疗效果。

Description

一种自组装多肽、自组装纳米水凝胶及其应用

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种自组装多肽、自组装纳米水凝胶及其应用。

背景技术

干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，目前通过移植干细胞治疗组织损伤已经成为国内外再生医学和组织工程领域研究的热点。干细胞工程和现代组织工程学涉及几乎人体所有的组织和器官：如意外损伤后的植皮，肌肉、骨及软骨缺损的修补，髋、膝等关节的置换，血管疾病或损伤后的血管的替代，糖尿病患者的胰岛植入，心脏病患者的瓣膜置换，房室间隔缺损的修补，癌症患者手术后大剂量放疗、化疗后的造血与免疫重建，组织或器官切除后的替代治疗，肝、肾等重要脏器损伤和功能衰竭后的置换，部分遗传缺陷性疾病的治疗等。

然而越来越多的研究表明，将干细胞移植入损伤组织后，由于组织微环境的改变，其在体内的生存、滞留，以及促血管新生等旁分泌功能均受到影响，限制了它的治疗效果，不能发挥其最大的潜能。改善干细胞移植后的生存微环境，增加干细胞的存活和旁分泌能力对提高它的疗效具有重大意义，因此需要开发新的能为干细胞提供适宜生存环境的产品。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种自组装多肽、自组装纳米水凝胶，以及所述多肽和水凝胶在增强干细胞修复组织损伤效果中的应用。

第一个方面，本发明提供一种自组装多肽，序列为Nap-FFKGRGD，其中FFKGRGD为氨基酸序列。

进一步的，组成所述多肽的FF为D构型氨基酸或L构型氨基酸。

第二个方面，本发明提供一种自组装纳米水凝胶，由所述自组装多肽的溶液经加热冷却的方法制备而成，所述水凝胶具有纳米级别的纤维网络结构。

进一步的，所述自组装多肽的溶液浓度为1-2mg/mL。

更进一步的，所述加热冷却的方法具体是：将所述自组装多肽的溶液在95℃下加热5分钟，使所述自组装多肽完全溶解，之后自然冷却至室温。

第三个方面，本发明提供所述自组装纳米水凝胶的应用，所述自组装纳米水凝胶用于制备治疗组织损伤的干细胞的递送载体。

第四个方面，本发明提供所述自组装纳米水凝胶的另一种应用，所述自组装纳米水凝胶用于制备干细胞培养载体，所述培养载体能够促进干细胞增殖，抑制干细胞凋亡。

进一步的，所述干细胞选自胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞、内皮祖细胞或心脏干细胞，所述胚胎干细胞是利用未经过体内发育的受精14天以内的人类胚胎分离或者获取的。

进一步的，所述组织损伤包括下肢缺血性损伤、肾脏损伤、心肌梗死和皮肤缺损。

第四个方面，本发明提供所述自组装纳米水凝胶的另一种应用，用于制备组织工程修复材料。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

将本发明的自组装纳米水凝胶结合hP-MSCs通过直接注射的方式移植到损伤部位，观察受损部位组织学和功能学的恢复。当自组装纳米水凝胶与hP-MSCs共同移植到缺血肢体后，其一，因其特殊的纳米纤维网络结构，可网络微米级别的细胞，且RGD序列上有多个整合素结合位点，从而延长细胞在体内的滞留率。其二，自组装纳米纤维网络结构可以最大程度模拟细胞外基质，为干细胞提供一个适宜的三维生存环境，促进细胞增殖和血管新生相关因子的表达，以及对抗细胞凋亡。这种具有良好生物相容性、生物可降解性及治疗有效性的水凝胶可以安全应用。

附图说明

图1为自组装多肽Nap-FFKGRGD(A)和自组装多肽Nap-^DF^DFKGRGD(B)的结构式。

图2为不同浓度自组装纳米水凝胶Nap-FFKGRGD(A)和自组装纳米水凝胶Nap-^DF^DFKGRGD(B)对人胎盘来源的间充质干细胞(hP-MSCs)的体外增殖活性的影响。

图3为采用Hoechst 33342染色检测的不同处理组hP-MSCs的荧光显微镜实拍图(A)和凋亡细胞统计结果(B)。

图4为Cleaved-caspase3免疫荧光染色检测的不同处理组hP-MSCs的荧光显微镜实拍图(A)和凋亡细胞统计结果(B)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例涉及用到的人胎盘来源的间充质干细胞(human placenta-derivedmesenchymal stem cells，hP-MSCs)购自于ATCC库，符合医学伦理学的要求，由本实验室负责培养和保管。

实施例1：自组装多肽的合成

利用标准固相多肽合成方法(standard solid phase peptide synthesis，SPPS)制备D构氨基酸^DF^DF构成的自组装多肽Nap-^DF^DFKGRGD(D-Gel)和L构型氨基酸FF构成的自组装多肽Nap-FFKGRGD(L-Gel)，结构式如图1所示，这两种多肽可以自组装成为纳米级别的纤维网络结构，且具有经典的RGD序列。合成之后再使用配置有分析柱和制备柱的高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography，HPLC)来纯化多肽。步骤如下：

1)用G3孔的分子筛将DMF、甲醇溶剂去除杂质。

2)将2.0g空白Wang树脂和15mLDMF一起放置于洁净干燥的反应管中，在室温下活化30分钟以使树脂充分溶胀。

3)室温下，上步溶剂用沙芯抽滤，首先将C端第一个氨基酸，DMAP和DIC放置于反应管中，反应3小时。反应结束后用DMF洗。随后加入体积占比为1:1的吡啶和乙酸酐，反应30分钟。反应结束后继续用DMF洗4至6次。

4)上步溶剂用沙芯抽滤，再将10mL20％的哌啶DMF溶液加到树脂中，随后N2搅拌10分钟后过滤，反复重复此操作3次。

5)合成是由C端至N端，需用哌啶去除Fmoc保护基团。使用茚三酮测试脱除效果。当反应呈蓝色后，同第一个氨基酸相结合。若茚三酮测试显示无色，则需使用哌啶再次除去Fmoc保护基团。

6)在反应管中放入C端第二个氨基酸，HBTU以及HOBT，随后加入适量DMF溶液使其完全溶解。完全溶解之后加入DIEA，室温下反应40分钟。再使用20％的哌啶DMF溶液脱去Fmoc保护基团，重复两次，反应时间分别为10分钟、5分钟。

以此类推，重复上述的步骤，直至合成到N端最后一个氨基酸。

7)最后用95％三氟乙酸(TFA)从树脂中分离多肽衍生物，再用乙醚分离多肽沉淀物。多肽沉淀物经HPLC脱盐纯化后，随后使用液相质谱色谱连用(LiquidChromotographywithMassSpectrometry，LC-MS)测量多肽的分子量。

小分子Phe-Phe(FF/^DF^DF)肽可以自组装成为超分子的纳米结构，包括纳米纤维和纳米球。所以本发明采用标准固相多肽合成法(SPSS)设计并合成了Nap-FFKGRGD和Nap-^DF^DFKGRGD自组装多肽，即将L构型氨基酸及其对映异构体D构型氨基酸的自组装序列引入RGD肽的N端，得到了两种多肽。然后使用质谱分析多肽的成分检验是否成功合成。结果证实了两种多肽的成功合成，并且通过高效液相色谱仪检测了两种多肽的纯度。

实施例2：自组装纳米水凝胶的制备及性能评价

1、自组装纳米水凝胶的制备

使用加热冷却的方法来制备自组装纳米水凝胶，使实施例1的自组装多肽由溶液状态转为凝胶状态。

1)分别将合成的自组装多肽Nap-FFKGRGD(2mg)/Nap-^DF^DFKGRGD(2mg)溶解在990μL纯水中，测PH值<7.7，加入10μL1mol/L的NaHCO₃溶液调节其酸碱度，使最终的PH值为7.4。

2)将得到的多肽溶液用金属浴在95℃下加热5分钟，使其完全溶解。之后慢慢的冷却到室温，自组装纳米水凝胶将在室温下形成。

2、透射电子显微镜观察

通过负染色的方法使用透射电子显微镜观察水凝胶的微观结构。

1)用移液枪取10uL的水凝胶至有碳膜的铜网上，静置大概1-2分钟后，再使用滤纸吸取多余的液体(仅留下一薄层溶液)。

2)水凝胶薄层用乙酸铀染色1分钟后，用吸水纸干燥。

3)最后，将铜网放置在覆盖有滤纸的皿中并在室温下彻底干燥后，即可使用透射电镜观察来水凝胶的微观结构。

3、生物稳定性实验

通过检测自组装纳米水凝胶在体外抗蛋白酶K的能力测试其生物稳定性。蛋白酶K作为一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，可以作用在脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键上。其不仅在尿素和SDS中可以保持稳定，而且还拥有降解天然蛋白质的性能。

1)制备母液浓度为2mg/mL的自组装纳米水凝胶Nap-FFKGRGD和Nap-^DF^DFKGRGD。

2)将自组装纳米水凝胶的浓度稀释至0.1mg/mL，然后加入蛋白酶K(原液酶活力为30U/mg)，使混合物中最终的酶活力达到2.5U/mL。

3)将混合物在37℃下孵育，在不同的时间间隔内(0、1、2、4、8和12小时)吸取400μL的样品，通过UPLC和LC-MS分析水凝胶的降解速率。

4、流变学特性测试

使用流变仪检测自组装纳米水凝胶的机械性能。

1)实验在室温下进行，自组装纳米水凝胶Nap-FFKGRGD和Nap-^DF^DFKGRGD浓度均为0.5wt％。

2)将水凝胶放置于25mm的平板上，设置间距500μm，扫描频率为0.1-100rad/s，张力为1％。

结果：通过加热冷却法制备的L构型氨基酸自组装纳米水凝胶(L-Gel)和D构型氨基酸自组装纳米水凝胶(D-Gel)，透射电子显微镜观察到水凝胶呈现的纳米级别的纤维网络结构。接下来，使用体外抗蛋白酶K的方法来检测自组装纳米水凝胶L-Gel和D-Gel的生物稳定性，即用蛋白酶K在室温下(37℃)孵育水凝胶，然后观察两种水凝胶的体外降解速率。结果显示，L-Gel几乎在1小时内就被蛋白酶K完全降解，而D-Gel需要12小时才逐渐降解，这表明D-Gel比L-Gel具有更好的生物稳定性。随后，用流变仪测定了两种水凝胶的机械性能。当频率从0.1增加到100(rad/s)时，D-Gel的储能模量G’总是超过损耗模量G”，表明D构型氨基酸自组装纳米水凝胶具有更好的成胶性。这些结果表明，与天然的L构型氨基酸自组装纳米水凝胶L-Gel相比，D构型氨基酸自组装纳米水凝胶D-Gel具有更好的生物稳定性和机械性能。

实施例3：自组装纳米水凝胶的生物相容性

1、CCK-8实验

1)将96孔板、配置好的自组装纳米水凝胶的母液放置于超净工作台中紫外照射消毒30分钟。

2)用移液枪将D/L构型氨基酸自组装纳米水凝胶按照不同浓度(0-200nM)铺于96孔板中，使水凝胶在孔板中形成一个薄层，然后将96孔板移入细胞二氧化碳培养箱中孵育4-5个小时。

3)将96孔板转移入超净工作台中，将细胞传代入孔板中，每个孔约2×10³个细胞量。然后将96孔板放入细胞二氧化碳培养箱中培养48个小时。

4)实验分为3组：Control组为仅有DMEM/F12完全培养基培养，L-Gel组为添加了不同浓度的L构型氨基酸自组装纳米水凝胶(0-200nM)，D-Gel组为添加了不同浓度的D构型氨基酸自组装纳米水凝胶(0-200nM)。每个浓度重复5个孔以预防出现误差。

5)将96孔板移入到超净工作台中，向每个孔中加入10μL CCK-8溶液(注意在添加过程中不要有气泡形成)。轻轻晃动96孔板，使溶液充分混匀，然后将孔板放置于细胞二氧化碳培养箱中孵育4个小时。

6)将96孔板自细胞培养箱中取出，用锡纸包裹孔板以避光，再将孔板放置于酶标仪中测量细胞在450nm处的OD值。

结果：将细胞铺在添加了不同浓度的L-Gel、D-Gel以及未添加水凝胶仅有DMEM/F12完全培养基的96孔板中，在同样的条件下孵育48个小时，再进行CCK-8细胞增殖实验。结果显示，与单纯用DMEM/F12完全培养基来培养细胞相比较，在涂有水凝胶的孔板上培养的hP-MSCs增殖更快，证明了L/D构型氨基酸自组装纳米水凝胶与hP-MSCs良好的生物相容性(图2)。

实施例4：自组装纳米水凝胶保护hP-MSCs，抗细胞凋亡

1、Hoechst 33342染色

1)实验分为4组；Normal组、PBS对照组，添加了L构型氨基酸自组装纳米水凝胶的hP-MSCs/L-Gel组(浓度为10nM)，添加了D构型氨基酸自组装纳米水凝胶的hP-MSCs/D-Gel组(浓度为10nM)。

2)将6孔板、配置好的自组装纳米水凝胶的母液放置于超净工作台中紫外照射消毒30分钟。

3)将L-Gel和D-Gel铺于6孔板中，然后将6孔板放置于二氧化碳培养箱孵育4-5个小时。

4)将6孔板转移入超净工作台中，将hP-MSCs接种于孔板中，每孔细胞量约3×10⁵个。然后将孔板放置在二氧化碳培养箱中孵育12个小时。

5)将6孔板转移到超净工作台，弃去旧的培养基，PBS溶液洗2次。PBS组，L-Gel组和D-Gel组加入含有H₂O₂溶液的DMEM/F12完全培养基(H₂O₂浓度为500μM)，Normal组加入同体积的DMEM/F12完全培养基。再将孔板转移到细胞二氧化碳培养箱中孵育4个小时。

6)将6孔板转移入超净工作台中，用吸管轻轻的吸取旧的培养基并弃入废液缸内，PBS溶液洗2次。再向每孔中加入1mL Hoechst 33342染液，轻轻的晃动孔板，尽量使所有的细胞能够被染液浸没。然后再将孔板放置于细胞二氧化碳培养箱中孵育10分钟。

7)将6孔板转移入超净工作台中，弃去染液，PBS溶液洗涤2次。然后用荧光显微镜观察孔板中的细胞，凋亡细胞的细胞核呈现明亮的蓝色。

2、Cleaved-caspase3免疫荧光染色

1)将hP-MSCs接种在24孔板中，每孔细胞量约5×10⁴个，诱导细胞凋亡步骤同Hoechst 33342染色一致。

2)将24孔板转移入实验操作台中，用吸管轻轻的吸取旧的培养基并弃入废液缸内，PBS溶液洗涤3次，每次3分钟。

3)向孔板中加入4％PFA(多聚甲醛)溶液固定细胞，10分钟。

4)弃去4％PFA溶液，PBS溶液洗3次，每次3分钟。

5)向孔板中加入适量0.1％TritonX-100溶液，透膜5分钟。PBS溶液洗3次，每次3分钟。

6)向孔板中加入适量即用型山羊血清以封闭抗原，室温下封闭1个小时后再用PBS溶液洗涤3次，每次3分钟。

7)向孔板中加入适量Cleaved-caspase3一抗(1：200)，然后将孔板放置于4℃冰箱中过夜孵育。

8)将孔板从4℃冰箱中取出放置于实验操作台上，室温下复温30分钟。

9)用移液枪回收孔板中的Cleaved-caspase3一抗，PBS溶液洗3次，每次3分钟。

10)向孔板中加入AlexaFluor594二抗(1：500)，室温下孵育2小时。整个操作流程注意避光。

11)用移液枪吸取二抗并弃入废液缸内，PBS溶液洗3次，每次3分钟。向孔板中加入适量DAPI溶液，室温下孵育10分钟。整个操作过程在避光下进行。

12)用移液枪吸取DAPI溶液并弃入废液缸内，PBS溶液洗3次，每次3分钟，向孔板中加入防荧光淬灭剂。然后用荧光显微镜观察孔板中的细胞。整个过程需要在避光的条件下进行。

结果：当细胞移植入缺血微环境后，由于活性氧的存在以及微环境的改变，细胞容易凋亡。因此在体外实验中，用H₂O₂溶液来诱导细胞的凋亡以检测水凝胶对hP-MSCs的的保护能力。所有培养条件一致的情况下，将H₂O₂溶液(500μM)分别加入PBS组、L-Gel组、D-Gel组，诱导4小时。当细胞凋亡之后，Hoechst33342染液可以将细胞核染成明亮的蓝色。Claved-caspase3是细胞凋亡的特异性标志物，因此可以用免疫荧光染色法来标记凋亡的细胞。结果表明，L-Gel和D-Gel均可保护hP-MSCs，抗细胞凋亡，且D-Gel效果较L-Gel好，可以发挥更好的保护hP-MSCs，抗细胞凋亡能力(图3和图4)。

实施例5：自组装纳米水凝胶提高了hP-MSCs在体内的存活和滞留

1、小鼠后肢缺血疾病及细胞治疗

1)实验分组：Sham组，假手术组，动物接受同其它组一致的手术程序，但既不损伤血管也无细胞和水凝胶的注射。PBS组，损伤组，动物接受后肢缺血手术后仅注射PBS溶液。hP-MSCs组，动物接受后肢缺血手术后仅注射hP-MSCs进行治疗。hP-MSCs/L-Gel组，动物接受后肢缺血手术后将hP-MSCs悬浮于L构型氨基酸自组装纳米水凝胶溶液进行注射治疗。hP-MSCs/D-Gel组，动物接受后肢缺血手术后将hP-MSCs悬浮于D构型氨基酸自组装纳米水凝胶溶液进行注射治疗。

2)对手术器械进行消毒灭菌，用酒精溶液擦拭手术台。

3)配置麻药：1.25％阿佛丁溶液，用量：0.1mL/10g，避光保存。

4)对要进行手术的小鼠称重，腹腔注射1.25％阿佛丁溶液进行麻醉，注射部位是下腹部腹白线稍向左或向右的位置。小鼠趾反射消失代表麻醉成功。

5)用推子和脱毛膏将小鼠右后肢腹股沟区至膝关节处的毛发去除，使手术部位充分暴露。

6)将小鼠呈仰卧位固定于手术台上，用酒精溶液消毒整个手术区域。

7)沿着小鼠右侧腹股沟区中点至膝关节处做一切口，在腹股沟区可以找到股动脉起始端，下行至膝关节处。用镊子轻轻钝性分离股动脉，注意区分和动脉伴行的股静脉和神经。用5/0号线分别依次结扎股动脉靠近腹股沟的近心端位置和靠近膝盖的远心端位置，然后剪断中间部位的血管。

8)根据实验分组分别将悬浮在75μL PBS、L-Gel或D-Gel中的1×10⁶个hP-MSCs或hP-MSCsRluc-RFP细胞轻轻的注射到缺血后肢的股四头肌和腓肠肌的3个随机部位(每组n＝10)。

9)清理切口，用间断缝合方法进行缝合。

10)将小鼠转移至加热垫或电热毯上，打上耳标做好标记，待苏醒之后再转移至鼠笼。

2、小动物活体成像技术

2.1标记hP-MSCs

应用海肾荧光素酶(ranillaluciferase，Rluc)和红色荧光蛋白(redfluorescentprotein，RFP)双融合(double-fusion，DF)报告基因来标记hP-MSCs(hP-MSCsRluc-RFP)细胞，即hP-MSCs被一个携带EF1α启动子的自灭慢病毒载体转染，该慢病毒载体可以驱动双融合报告基因。

2.2实验分组

hP-MSCs组，将hP-MSCsRluc-RFP细胞悬浮于PBS溶液中进行注射治疗。hP-MSCs/L-Gel组，将hP-MSCsRluc-RFP细胞悬浮于L构型氨基酸自组装纳米水凝胶溶液进行注射治疗。hP-MSCs/D-Gel组，将hP-MSCsRluc-RFP细胞悬浮于D构型氨基酸自组装纳米水凝胶溶液进行注射治疗。

2.3监测细胞移植后在体内的存活及滞留

1)使用VEGFR2-Fluc转基因小鼠建立后肢缺血模型。

2)在不同时间点(第1、3、7、11和14天)，将后肢缺血模型小鼠用异氟烷溶液气体麻醉后，通过尾静脉注射海肾荧光素酶(Rluc)的底物腔肠素25μL，使用小动物活体成像仪监测缺血后肢Rluc的信号。

3、荧光显微镜拍照

1)在术后第7天对各实验组小鼠缺血后肢进行取材，制作冰冻切片。

2)用DAPI溶液滴染冰冻切片上的肌肉组织，室温下孵育10分钟，PBS溶液洗3次，每次3分钟，注意避光。

3)向冰冻切片上滴加适量防荧光淬灭剂，使用荧光显微镜来观察组织并拍照，注意避光。

结果：生物发光成像技术可以监测移植后细胞的存活和滞留，使用了小动物活体成像仪来实时动态追踪移植的hP-MSCs在体内的命运。应用双融合报告基因来标记细胞，细胞的Rluc信号荧光量与细胞数量成线性正比关系。因此当注射了Rluc的底物腔肠素后，可以通过检测Rluc信号荧光量来确定细胞的数量。结果提示，在术后第1天各实验组小鼠缺血后肢存在无统计学差异的Rluc信号荧光量，表明成功移植了相同数量的细胞。随着时间的推移，BLI检测到所有实验组Rluc信号的荧光量均呈现逐渐下降的趋势，hP-MSCs/D-Gel组下降最慢，在第7天和第11天，hP-MSCs组和hP-MSCs/L-Gel组的Rluc信号的荧光量出现显著的降低，而hP-MSCs/D-Gel组仍然存在与这两组有统计学差异的荧光量，证明了hP-MSCs/D-Gel联合移植系统的细胞存活率和滞留率得到了改善，并且进一步增强了hP-MSCs治疗小鼠后肢缺血疾病的治疗效果。此外，通过对术后第7天的肌肉组织进行免疫荧光染色，检测移植到体内的RFP阳性的hP-MSCs，显示了与D-Gel共同移植入体内的hP-MSCs更好的存活和滞留。这些结果均表明，L-Gel/D-Gel与间充质干细胞共同移植后明显提高了细胞在体内的滞留率，而且D-Gel提高滞留率效果更好一些。

实施例6：自组装纳米水凝胶增强hP-MSCs的促血管新生作用

1、实时荧光定量PCR测定

1.1肌肉组织总RNA的提取

1)将手术器械灭菌消毒，从制冰机中取碎冰。术后14天，在冰上取材后肢缺血小鼠的腓肠肌。将肌肉组织放在EP管内，加入1mL的Trizol溶液，使肌肉组织完全浸没在其中，将EP管转移至-80℃冰箱中长期保存。

2)将肌肉组织从-80℃冰箱中取出，转移至实验操作台上。用消毒灭菌后的剪刀尽量将组织剪碎，放入无酶EP管内。用移液枪向EP管中加入100μL R1裂解液，研磨组织，再加入500μLR2裂解液，静置10分钟。

3)用移液枪(使用无酶枪头)将无酶EP管上清液转移到纯化柱，将纯化柱放于低温高速离心机内，12000rpm，1分钟。将纯化柱接液管的液体倒入废液缸内，再用移液枪向纯化柱中加入600μL洗液，继续离心，12000rpm，1分钟，重复2次。空的纯化柱继续离心，10000rpm，1分钟，然后将纯化柱转移至1.5mL无酶EP管中。使用移液枪向向纯化柱膜中央加入洗脱液30μL，静置1分钟。再将无酶EP管放入低温高速离心机中，12000rpm，1分钟。

4)弃去纯化柱，RNA即留存在无酶EP管中。

1.2cDNA的合成

1)检测RNA的浓度。

2)设置反转录体系(表1)。

表1反转录体系

3)使用掌上离心机将配置了反转录体系的8联排溶液混匀。

4)设置反转录程序：42℃60分钟，70℃5分钟。

5)反转录结束后，将cDNA保存在-20℃冰箱中。

1.3实时荧光定量PCR

1)设计引物(表2)。

表2引物序列信息

2)设置实时荧光定量PCR体系和反应程序(表3和表4)。

表3实时荧光定量PCR体系

表4实时荧光定量PCR反应程序

3)按照表3配置反应体系，然后放置于PCR仪中按照表4的程序完成实验。

2、免疫荧光染色

2.1取材

1)将小鼠麻醉之后，脱毛、固定、消毒，使用手术器械打开腹腔和胸腔，充分暴露心脏。将灌注针经心尖进入左心室，剪破右心耳，推注PBS溶液直至全身血液经右心耳全部流出。

2)剥离小鼠后肢的腓肠肌，修剪肌肉组织并放入PBS溶液中反复冲洗。

3)将腓肠肌依次放入15％，30％的蔗糖溶液中脱水(当肌肉组织下沉到溶液底部时代表脱水完成)。

4)脱水结束后，把肌肉组织从蔗糖溶液中取出，用吸水纸吸取多余的溶液，放入准备好的包埋盒上。记号笔标记肌肉组织的名称、取材时间及分组情况。

5)将肌肉组织放置于包埋盒的中间位置并注意其放置的切面使后续能够横切肌肉组织。

6)将OCT包埋剂缓缓没过肌肉组织(注意不要有气泡产生)，干冰凝固，再将包埋盒转移至-80℃冰箱保存。

2.2制作冰冻切片

1)打开冰冻切片机预冷，将温度设置为-20℃。

2)将各实验组的肌肉组织包埋快从-80℃冰箱中取出，将适量的OCT包埋剂滴加到组织块底拖上，再将包埋块固定在上面。

3)将固定有包埋块的底拖放置在切片位置，将切片厚度调整为15μm，切片至肌肉组织充分暴露。随后将切片厚度调整至6μm，开始连续切片。

4)将组织切片黏附于载玻片上，再转移至-80℃冰箱中保存。

2.3免疫荧光染色

1)将冰冻组织切片从-80℃冰箱中取出，室温下复温30分钟。

2)用冷丙酮溶液固定冰冻组织切片20分钟，PBS溶液洗涤3次，每次3分钟。

3)将载玻片上的组织切片用组化笔画圈，然后向肌肉组织上滴加适量0.1％TritonX-100溶液，透膜5分钟。PBS溶液洗涤3次，每次3分钟。

4)滴加适量即用型山羊血清至肌肉组织上以封闭抗原，室温下1小时，PBS溶液洗涤3次，每次3分钟。

5)向组织切片上滴加适量CD31一抗(1：200)，放置于4℃冰箱中孵育，过夜。

6)将冰冻组织切片从4℃冰箱中取出，室温下复温30分钟。

7)回收一抗，PBS溶液洗3次，每次3分钟。

8)向组织切片上滴加相应的AlexaFlour594二抗(1：500)，室温下孵育2个小时，PBS溶液洗涤3次，每次3分钟，此过程注意避光。

9)用适量DAPI溶液浸染肌肉组织，室温下孵育10分钟，PBS溶液洗涤3次，每次3分钟，操作过程注意避光。

10)向组织切片上滴加适量放荧光淬灭剂，然后在荧光显微镜下观察肌肉组织并拍照，此过程注意避光。

11)用ImageJ软件处理图片及分析数据。

3、三维高分辨率Micro-CT成像技术

为了评估后肢缺血小鼠的侧支血管新生情况，在术后第21天进行了血管造影，并使用三维高分辨率Micro-CT成像技术来分析结果。

1)配置血管造影剂：硫酸钡溶液(BaSO4)，将硫酸钡粉末溶于纯水(ddH₂O)

中，浓度0.1g/mL。

2)将小鼠称重、麻醉之后，仰卧位固定于手术台上，依次打开腹腔和胸腔，充分暴露心脏。

3)将灌注针经心尖进入左心室，剪破右心耳以允许血液和灌注液流出，将硫酸钡溶液经左心室灌注至全身，下肢和尾巴呈白色，使用剂量每只10-15mL。

4)使用高分辨率Micro-CT扫描小鼠后肢，并三维立体重建血管。

5)使用ImageJ软件分析各实验组数据。

结果：在术后第14天取材各实验组的缺血组织进行实时荧光定量PCR实验，分析血管新生相关因子的表达水平。包括血管内皮生长因子A(VEGFA)，能够特异性的促进血管内皮细胞的生长、增殖和迁移，并进一步介导新生血管的形成；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)，是血管内皮生长因子的特异性受体，在新生血管形成的过程中起着重要的作用；血管生成素1(Ang-1)、血管生成素2(Ang-2)，促进血管的发生、重塑、成熟，而且Ang-2可以与VEGFR2一起协同促进血管的新生。结果表明，与PBS组、hP-MSCs组相比，当L-Gel/D-Gel与hP-MSCs共同移植入小鼠缺血后肢进行治疗，血管新生相关因子的表达均显著上调了,且hP-MSCs/D-Gel组较hP-MSCs/L-Gel组效果更好。其次，同时将取材的缺血组织进行冰冻切片CD31免疫荧光染色，CD31为常用的血管内皮细胞的标志物。结果表明，术后第14天，hP-MSCs/L-Gel组和hP-MSCs/D-Gel组小鼠缺血后肢的毛细血管密度均明显增加，且hP-MSCs/D-Gel组效果更好。此外，在术后第21天取材了各实验组的小鼠缺血后肢，进行了血管造影术，并使用高分辨率Micro-CT成像技术对血管进行三维立体重建，这样就可以比较直观的观察血管的情况。结果表明，L-Gel/D-Gel和hP-MSCs联合移植均能显著促进侧支血管的新生，并进一步增加缺血后肢的血液灌注，且hP-MSCs/D-Gel组效果更好。这些结果均提示L-Gel/D-Gel均增强了hP-MSCs的促血管新生作用，且D-Gel效果更佳。

实施例7：自组装纳米水凝胶增强hP-MSCs的治疗潜能

苏木素&伊红(HE)染色和Masson染色

术后14天的肌肉组织进行苏木素&伊红(HE)染色和第28天的肌肉组织进行Masson染色。

1、制作石蜡切片

1)将腓肠肌取材后，固定在4％PFA(多聚甲醛)溶液，放置于4℃冰箱中24小时。

2)将肌肉组织从4％PFA溶液取出，放入石蜡包埋盒中，并用记号笔标记好实验分组。

3)设置自动脱水机程序(表5)

表5脱水、透明、浸蜡流程

浸蜡温度设置为60℃。

4)将石蜡包埋盒放到自动脱水机中并按照表5的流程进行梯度脱水，透明以及浸蜡。

5)提前打开生物组织自动包埋机预热(60℃)，生物组织自动包埋机冷台预冷。

6)将浸蜡完成的肌肉组织放入自动包埋机。

7)将肌肉组织从包埋盒中取出，放置于包埋铁盒中央部位，调整组织切面使后续能够横切肌肉组织。

8)向包埋铁盒中滴加融化的石蜡溶液，完全浸没肌肉组织，包埋框标记好分组信息后放在铁盒上面，再迅速转移到冷台上冷却。

9)冷却完成后，将石蜡组织与包埋铁盒分离。

10)修整组织块周围多余的石蜡，蜡块在室温下可长期保存。

11)将待切片的石蜡组织块放在生物组织自动包埋机冷台上冷却2小时。

12)将摊片机预热至水温40℃，使用纯水，烤片机预热至60℃。

13)将石蜡组织块固定在切片机上，调整切片机厚度为10μm，切片至肌肉组织充分暴露。随后将切片厚度调整至6μm，开始连续切片。

14)用小毛笔和镊子将肌肉组织的切片放入摊片机中，待组织完全展开后，使用载玻片捞片。将粘附有肌肉组织的载玻片放置在烤片机上进行烤片，6个小时。

15)待烤片结束后，将石蜡切片放置于片盒中，在室温下保存。

2HE染色

1)将各实验组的石蜡切片在通风橱内进行脱蜡、复水，具体流程如表6所示。

表6脱蜡、复水流程

2)向肌肉组织上滴加适量苏木素溶液，2.5分钟，自来水冲洗3分钟。3)将肌肉组织用1％的盐酸酒精分化1秒，自来水冲洗2分钟。

4)用伊红溶液浸染组织，3分钟，自来水冲洗5分钟。

5)将石蜡切片脱水、透明，具体步骤如表7。

表7脱水、透明流程

6)将石蜡切片用吸水纸吸取多余的溶液，中性树胶封片，注意树胶要覆盖载玻片上所有的组织并且不要产生气泡。

7)将石蜡切片在通风橱内风干2小时，然后用光学显微镜观察和拍照。

3、Masson染色

1)脱蜡、复水同HE染色一致。

2)用Bouin酶染液浸染石蜡切片，室温下孵育，过夜。

3)流水下冲至切片上黄色的酶染液完全消失。

4)用天青石蓝染液滴染肌肉组织，2分钟，自来水冲洗1分钟。

5)用Mayer苏木素滴染肌肉组织，2分钟，自来水冲洗1分钟。

6)将肌肉组织用1％的盐酸酒精分化1秒，自来水冲洗2分钟。

7)用丽春红溶液浸染肌肉组织，2分钟，蒸馏水冲洗5分钟。

8)用磷钼酸溶液分化肌肉组织，10分钟，弃去分化液。

9)用苯胺蓝溶液浸染肌肉组织，5分钟。

10)用弱酸工作液冲洗肌肉组织，2次，每次2分钟。

11)将石蜡切片脱水、透明，具体步骤如表8。

表8脱水、透明流程

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12)将石蜡切片用中性树胶封片，在通风橱内风干2小时，然后用光学显微镜观察和拍照。

13)用ImageJ软件处理图片和分析数据。

结果：为了研究Nap-FFKGRGD序列自组装纳米水凝胶(L-Gel和D-Gel)促进hP-MSCs的组织修复作用，在术后第14天取材了缺血的肌肉组织进行HE染色。结果表明，hP-MSCs/L-Gel组和hP-MSCs/D-Gel组的肌纤维变性、坏死及炎症细胞浸润情况均减少，且hP-MSCs/D-Gel组效果更好。同时，为了评估缺血肌肉组织的纤维化程度，于术后第28天取材肌肉组织进行Masson染色，结果显示，当L-Gel/D-Gel与hP-MSCs共同移植后缺血肌肉组织的纤维化程度均减少，且hP-MSCs/D-Gel组纤维化程度最少。此外，通过分析各实验组中缺血后肢的肢体丢失、肢体坏疽、肢体保留的情况来评估hP-MSCs的功能恢复作用，结果提示，在hP-MSCs/L-Gel组和hP-MSCs/D-Gel组中肢体丢失和肢体坏疽的概率均减少，具hP-MSCs/D-Gel组具有较好的保肢能力。这些结果均表明，L-Gel/D-Gel均提高了hP-MSCs治疗小鼠下肢缺血性疾病的治疗潜能，且D-Gel效果更佳。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 新乡医学院

<120> 一种自组装多肽、自组装纳米水凝胶及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggttgtctcc tgcgacttca 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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<210> 7

<211> 20

<212> DNA

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<400> 7

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<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

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<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

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<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cttctttacg gatagcaacc gag 23

Claims (3)

1.一种自组装纳米水凝胶在制备治疗下肢缺血性损伤的药物中的应用，其特征在于，所述药物是将人胎盘来源的间充质干细胞悬浮于所述自组装纳米水凝胶制得，所述自组装纳米水凝胶是由序列为Nap-FFKGRGD的自组装多肽的溶液经加热冷却的方法制备而成，所述自组装纳米水凝胶具有纳米级别的纤维网络结构，其中FFKGRGD为氨基酸序列，组成所述自组装多肽的FF为D构型氨基酸。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述自组装多肽的溶液浓度为1-2mg/mL。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述加热冷却的方法具体是：将所述自组装多肽的溶液在95℃下加热4-5分钟，使所述自组装多肽完全溶解，之后自然冷却至室温。