CN111961137B - 仿生内皮细胞功能的融合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种仿生内皮细胞功能的融合蛋白及其应用，涉及生物活性物质技术领域。本发明提供了仿生内皮细胞的融合蛋白、重组表达载体、重组大肠杆菌以及在修饰心血管植入/介入材料中的应用。本发明将利用所述融合蛋白修饰心血管植入/介入材料，达到长期仿生内皮的效果，消除血栓形成的级联反应，抑制活化的血小板聚集，减少纤维蛋白粘附，抑制内膜增生，促进组织再生，加快内皮化的进程，降低炎症反应，可以用于心血管植入/介入材料的功能化修饰。

Description

仿生内皮细胞功能的融合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物活性物质技术领域，具体涉及仿生内皮细胞的融合蛋白及其应用。
背景技术
根据《中国心血管病报告2018》指出中国心血管病患病率仍处于上升阶段，推算心血管病现患人数2.9亿，心血管病死亡率居首位，占居民疾病死亡构成的40%以上。心血管病的疾病负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题。临床上，耐用的小口径血管移植物以及与血液（包括人造心脏，肾脏，肝脏和肺）相接触的永久可植入生物传感器和人造器官系统的开发仍然受到表面诱导的血栓形成反应的限制，主要原因在于血液遇到外源性介入物质后，体内的凝血系统被立即激活。然而，在被内皮细胞覆盖的血管内，血液并不凝结，这主要是由于内皮细胞表面存在的一些生物活性分子（例如血栓调节蛋白，thrombomodulin)或者产生一些活性分子（例如一氧化氮，Nitric oxide）抑制了血栓形成。
近年来，研究者尝试采用天然或合成高分子材料制备血管生物活性介入材料，但由于血栓和内膜增生等问题，导致血管通畅率较低。生物活性分子的表面修饰是改进介入材料和器械临床性能的主要策略。但是，介入材料和器械表面修饰的活性分子在体内环境中会发生降解或变性，进而限制了生物活性层的长期性能。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于仿生内皮细胞功能的融合蛋白及其应用，所述融合蛋白能够可逆修饰生物活性介入材料，实现融合蛋白在生物活性介入材料表面的反复更新，提高了融合蛋白修饰层的稳定性；经所述融合蛋白修饰后的生物活性介入材料同时具有抗凝血和促进血管损伤修复的作用，模拟内皮细胞的功能，消除血栓形成的级联反应，抑制活化的血小板聚集，减少纤维蛋白粘附，抑制内膜增生，改善组织再生，加快内皮化的进程，降低炎症反应。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种仿生内皮细胞功能的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸结构从N’到C’依次包括：人血栓调节蛋白表皮生长因子样结构域4-6、Linker、酶活性功能域和sortase A识别标签；
所述酶活性功能域来源于甲基化半乳糖苷酶、木糖苷酶或唾液酸酶；
所述人血栓调节蛋白表皮生长因子样结构域4-6的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述sortase A识别标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述甲基化半乳糖苷酶第363位的组氨酸变成丙氨酸，突变后的甲基化半乳糖苷酶GalSH363A的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选的，当所述酶活性功能域来源于甲基化半乳糖苷酶时，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
当所述酶活性功能域来源于木糖苷酶时，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示；
当所述酶活性功能域来源于唾液酸酶时，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示。
本发明还提供了所述融合蛋白的编码基因。
本发明还提供了一种包含所述编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体以pET22b（+）为基础载体，将所述编码基因插入到所述基础载体的NdeI和BamHI酶切位点之间。
本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌中包括所述重组表达载体。
本发明还提供了所述融合蛋白或利用所述重组大肠杆菌生产得到的融合蛋白在修饰生物活性介入材料中的应用，所述心血管植入/介入材料包括人工血管、带瓣管道、血管补片、心肌补片和心脏瓣膜。
本发明还提供了一种利用所述融合蛋白或上述重组大肠杆菌生产得到的融合蛋白修饰生物活性植入/介入材料的方法，包括以下步骤：将经过NH2-GGGGG修饰后的心血管植入/介入材料、eSrtA酶溶液、所述融合蛋白的溶液与Tris-HCl缓冲液混合反应32~40h，经Tris-盐酸吐温缓冲液冲洗、晾干，得到融合蛋白功能化可逆修饰的心血管植入/介入材料。
优选的，在重复使用所述融合蛋白功能化可逆修饰的心血管植入/介入材料时，还包括将所述融合蛋白功能化可逆修饰的心血管植入/介入材料与eSrtA酶溶液和氨基酸溶液混合反应24h，经Tris-盐酸吐温缓冲液冲洗后晾干，还原为NH2-GGGGG修饰后的心血管植入/介入材料。
本发明提供了一种仿生内皮细胞的融合蛋白，包括人血栓调节蛋白表皮生长因子样结构域4-6（TM46）和酶活性功能域的融合蛋白。本发明所述融合蛋白依据“凸凹互补”原理进行相应糖苷酶的分子设计，以此构建的糖苷酶能够靶向性催化以半乳糖、唾液酸、木糖保护的NO供体化合物实现以“低浓度长时程”方式定点催化底物释放NO，更好地发挥其作用和功能。
本发明所述融合蛋白中的TM46是血栓调节蛋白发挥抗凝以及促血管新生功能的核心片段，通过产生活化的蛋白C使因子Va和VIIIa失活，从而主动限制Xa和凝血酶的产生，而不是在凝血酶已经产生后使其失活；利用酶活性功能域设计酶-前药递送系统，可以为生物活性介入材料和器械定点定量传输一氧化氮（NO），可以持续按需地靶向性递送NO，进而达到模拟内皮的功能。
本发明所述融合蛋白的末端是sortase A （SrtA）识别的LPETGG标签序列，可将融合蛋白通过共价修饰到聚合物材料上，以此构建具有生物活性的心血管介入材料。同时，LPETGG多肽可以实现融合蛋白在心血管介入材料表面的重复可逆连接。通过循环系统递送反应底物，可以实现融合蛋白反复在心血管介入材料表面的装载和卸载，提高了心血管介入材料修饰层的稳定性。
本发明中利用所述融合蛋白修饰心血管介入材料，一方面使心血管介入材料表面具有血栓调节蛋白的活性，另一方面可以利用酶-前药递送系统靶向性持续按需递送NO，进而达到模拟内皮的功能，提高心血管介入材料的生物相容性。NO在治疗应用中具有较强的浓度依赖效应，高浓度的NO虽然具有较强的抗凝能力，但是容易诱导血管内皮细胞的凋亡，影响人工血管内皮化的进程。本发明将TM46片段与NO协同发挥作用，一方面可以减轻NO抗凝所需剂量，另一方面TM46可以提高血管内皮细胞活性，抑制高浓度NO所诱导的内皮细胞凋亡。
附图说明
图1为本发明实例2提供的融合蛋白修饰的人工血管体外催化NO的释放情况；
图2 为本发明实施例5提供的融合蛋白修饰人工血管原位催化NO产生的情况；
图3为本发明实例6提供的融合蛋白修饰的人工血管表面的抗血小板粘附的结果；
图4为本发明实施例7提供的融合蛋白修饰人工血管的BCI指数
图5为本发明实例8提供的融合蛋白修饰的人工血管在兔颈动静脉分流中的血栓形成情况；
图6为本发明实例9提供的融合蛋白修饰的人工血管在狗股动静脉分流中的血栓形成情况；
图7为本发明实例2提供的融合蛋白修饰的人工血管在大鼠颈动脉移植1个月后多普勒超声结果及取材后的体视照片；
图8为本发明实例2提供的融合蛋白修饰的人工血管在大鼠颈动脉移植1个月后CD31染色的免疫荧光照片。
实施方式
本发明提供了一种仿生内皮细胞功能的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸结构从N’到C’依次包括：人血栓调节蛋白表皮生长因子样结构域4-6、Linker、酶活性功能域和sortase A识别标签；所述酶活性功能域来源于甲基化半乳糖苷酶、木糖苷酶或唾液酸酶；所述人血栓调节蛋白表皮生长因子样结构域4-6的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述sortase A识别标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Linker的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
本发明所述酶活性功能域来源于甲基化半乳糖苷酶、木糖苷酶(xylosidase)或唾液酸酶（KDNase），所述甲基化半乳糖苷酶第363位的组氨酸突变成丙氨酸，突变后的甲基化半乳糖苷酶GalSH363A的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。在本发明中，当所述酶活性功能域来源于甲基化半乳糖苷酶时，所述融合蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.5所示；当所述酶活性功能域来源于木糖苷酶时，所述融合蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.6所示；当所述酶活性功能域来源于唾液酸酶时，所述融合蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.7所示。在本发明中，所述甲基化半乳糖苷酶、木糖苷酶或唾液酸酶可以催化外源性供体化合物分解，释放气体信号分子；所述气体信号分子包括：一氧化氮、硫化氢、一氧化碳或二氧化硫。
本发明利用Linker将酶活性功能域和人血栓调节蛋白表皮生长因子样结构域4-6（TM46）连接起来，所述Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：SGSG。
本发明在所述融合蛋白的末端添加sortase A（SrtA）识别标签，所述sortase A识别标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：LPETGG。本发明所述sortase A识别标签，可与eSrtA酶的催化活性口袋结合，催化中心的保守氨基酸残基Cys184作为亲核基团攻击底物LPETGG中的TG肽键将其断裂，与底物形成酰基-酶中间体，从而实现融合蛋白在生物活性介入材料表面的重复可逆连接。
本发明所述融合蛋白中，包括了两个活性结构，其中酶活性功能域可以设计酶-前药递送系统，为生物活性介入材料定点定量传输一氧化氮（NO），可以持续按需地靶向性递送NO，进而达到模拟内皮的功能；TM46作为发挥抗凝抗炎以及促血管新生功能的核心片段。本发明所述融合蛋白两个功能域协同发挥作用，NO在生物活性支架应用中具有较强的浓度依赖效应，高浓度的NO虽然具有较强的抗凝能力，但是容易诱导血管内皮细胞的凋亡，影响人工血管内皮化的进程。本发明将TM46与NO协同发挥作用，一方面可以减轻NO抗凝所需剂量，另外一方面TM46可以提高血管内皮细胞活性，抑制高浓度NO所诱导的内皮细胞凋亡。
本发明还提供了所述融合蛋白的编码基因，所述编码基因可编码上述融合蛋白。
本发明还提供了一种包含所述编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体以pET22b（+）为基础载体，将所述编码基因插入到所述基础载体的NdeI和BamHI酶切位点之间。
本发明对所述重组表达载体的构建方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法构建重组表达载体即可。本发明实施例中，以甲基化半乳糖苷酶GalSH363A为例进行说明，将融合蛋白TM46-GalSH363A对应的DNA序列由genewiz进行全基因合成，随后通过NdeI和BamHI酶切位点克隆至表达载体pET22b(+)；同时将携带启动子序列的二硫键氧化还原酶基因(dsbA) 通过BamHI和XhoI酶切位点克隆至上述载体，即得所述重组表达载体。
本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌中包括所述重组表达载体。本发明对所述重组大肠杆菌的构建方法并没有特殊限定，优选将上述重刻表达载体转化至BL21(DE3)感受态细胞中，即得所述重组大肠杆菌。
本发明还提供了所述融合蛋白或利用所述重组大肠杆菌生产得到的融合蛋白在修饰心血管植入/介入材料中的应用，所述生心血管植入/介入材料包括人工血管、带瓣管道、血管补片、心肌补片和人工瓣膜。本发明所述心血管植入/介入材料优选为天然或合成的高分子材料。在本发明中，所述融合蛋白可通过共价修饰的方式与所述心血管植入/介入材料进行结合，通过所述sortase A识别标签构建循环系统递送反应底物，可以实现融合蛋白在生物活性介入材料表面的反复更新，提高融合蛋白修饰层的稳定性。本发明所述心血管植入/介入材料的厚度优选为100~600μm，更优选为300~500μm。
本发明还提供了一种利用所述融合蛋白或上述重组大肠杆菌生产得到的融合蛋白修饰心血管植入/介入材料的方法，包括以下步骤：将经过NH2-GGGGG修饰后的心血管植入/介入材料、eSrtA酶溶液、所述融合蛋白的溶液与Tris-HCl缓冲液混合反应32~40h，经Tris-盐酸吐温缓冲液冲洗、晾干，得到融合蛋白功能化可逆修饰的心血管植入/介入材料。
本发明对所述NH2-GGGGG修饰的方法并没有特殊限定，优选包括静电纺丝方法或等离子体处理方法，其中静电纺丝方法优选包括：（a）将叠氮化修饰的聚合物、可降解的高分子聚合物与有机溶剂混合后搅拌，得电纺丝溶液；所述可降解的高分子聚合物的数均分子量为20000~200000Da；
（b）将所述电纺丝溶液经静电纺丝喷射在接收棒上，干燥后得心血管植入/介入材料；
（c）以所述心血管介入材料为底物，以无水硫酸铜和抗坏血酸钠为催化剂进行Click反应，结合炔基化修饰的五个甘氨酸，干燥后得NH2-GGGGG修饰后的心血管植入/介入材料；所述炔基化修饰的五个甘氨酸序列为NH2-GGGGG-CCH。
本发明所述聚合物优选包括聚四氟乙烯（PTFE），涤纶（PET），聚酯，聚氨酯的一种或多种的混合物。
本发明所述对聚合物进行等离子体处理条件优选为：放电功率为100W，氢气和氮气流速分别为 1 L/min 和0 .5 L/min，本底真空均为 2 Pa。
本发明所述将经过氨基表面修饰的聚合物材料投入10mg/ml的叠氮己酸溶液（pH值为5）。按照叠氮己酸：EDC的摩尔比为2：1的比例在叠氮己酸溶液中加入EDC，冰水浴中避光反应24小时。去离子水洗3次，并在室温下干燥。
本发明所述叠氮化修饰的聚合物优选包括PCL-N3，PLA-N3， PLCL-N3，PLGA-N3的一种或多种的混合物。本发明所述可降解的高分子聚合物优选包括聚己内酯、聚丙交酯、聚乙醇酸、聚(丙交酯-乙醇酸)共聚物、聚(丙交酯-己内酯)共聚物、聚羟基脂肪酸酯和聚对二氧六环己酮中一种或多种的混合物。本发明所述有机溶剂优选包括二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷、甲醇、乙醇、丙酮、三氟乙醇和六氟异丙醇中的一种或多种的混合物。在本发明中，所述叠氮化修饰的聚合物与可降解的高分子聚合物的质量比优选为1:1~100。本发明所述电纺丝溶液中叠氮化修饰的聚合物和可降解高分子聚合物的总质量与有机溶剂的体积比优选为 0.1~0.25 g:1 mL。本发明所述搅拌的时间优选优选为8~12h。
本发明所述电纺丝溶液的相对湿度优选为40~60%，更优选为50%。本发明所述静电纺丝的直流电压优选为10~20kV；所述静电纺丝的溶液流速优选为0.1~10mL/h；所述静电纺丝所用注射器针头与接收棒的距离优选为10~15cm。本发明所述接收棒的直径优选为0.5~10mm；所述接收棒的转速优选为1~500rpm；所述接收棒的移动速度优选为1~50mm/s。本发明将所述接收棒上的管状材料取下后干燥，所述干燥的方法优选为真空干燥，所述真空干燥的温度优选为15~25℃；所述真空干燥的压力优选为-0.1~-0.075 MPa；所述真空干燥的时间优选为3天以上。在本发明中，较长的真空干燥时间可以将制备的心血管介入材料内的残余有机溶剂彻底去除干净。本发明所述心血管介入材料的厚度优选为100~600μm。
本发明在进行所述Click反应前，优选首先配制GGGGG反应液，更优选的包括向炔基化修饰的五个甘氨酸溶液（多肽溶液）中加入CuSO4和抗坏血酸钠，所述多肽溶液中的多肽与CuSO4和抗坏血酸钠的摩尔比优选为1：0.1：1。本发明将所述GGGGG反应液与心血管介入材料混合后，优选在37℃摇床，避光孵育条件下进行所述Click反应，所述Click反应的时间优选为24h。
本发明将上述得到的NH2-GGGGG修饰后的心血管介入材料、eSrtA酶溶液、所述融合蛋白的溶液与Tris-HCl缓冲液混合反应32~40h，经Tris-盐酸吐温缓冲液（TBST）冲洗、晾干，得到融合蛋白功能化可逆修饰的心血管植入/介入材料。本发明在进行所述混合反应前，优选包括配制融合蛋白反应液，具体包括向Tris-HCl缓冲液中依次加入eSrtA酶和融合蛋白溶液，所述Tris-HCl缓冲液、eSrtA酶和融合蛋白溶液的体积比优选为7:2:1。本发明对所述eSrtA酶的来源并没有特殊限定，使用浓度可达8μg/μL即可。本发明所述融合蛋白溶液的浓度优选为1 μg/μL。本发明将所述融合蛋白反应液与所述NH2-GGGGG修饰后的心血管介入材料混合后，优选在37℃摇床孵育32~40h，更优选孵育36h。本发明对所述TBST冲洗的方法并没有特殊限定。本发明所述晾干优选为在室温（18~25℃）下晾干。
本发明在重复使用所述融合蛋白功能化可逆修饰的心血管介入材料时，优选还包括将所述融合蛋白功能化可逆修饰的心血管植入/介入材料与eSrtA酶溶液和氨基酸溶液混合反应24h，经TBST冲洗后晾干，还原为NH2-GGGGG修饰后的心血管植入/介入材料。
在本发明中，利用所述融合蛋白可逆修饰心血管植入/介入材料时，融合蛋白中的TM46片段通过与凝血酶、补体因子、脂多糖、促炎因子高迁移率族蛋白B1（HMGB1）等分子相互作用，防止促凝、促炎分子的扩散，发挥抗炎和抗凝的双重作用。此外，TM46片段也具有抗凋亡的作用。因此，TM46片段在保护血管内稳态，防止血管内血栓形成方面发挥重要作用。融合蛋白中的酶活性功能域片段，可以在病变区域高效特异性催化前药NO供体释放出NO。本发明制备得到的所述融合蛋白功能化可逆修饰的心血管植入/介入材料，如融合蛋白功能化可逆修饰的人工血管具有良好的通畅性和再生效果；融合蛋白功能化可逆修饰的心肌补片能够促进血管新生，有效改善血供，减少纤维化和炎症反应，抑制细胞凋亡，具有心肌保护作用。因此可将所述融合蛋白功能化可逆修饰的心血管植入/介入材料可用作动脉血管移植材料或用于治疗心肌梗死。
下面结合实施例对本发明提供的仿生内皮细胞的融合蛋白及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例
融合蛋白（TM- GalSH363A）的表达与纯化
（1）基因克隆：根据大肠杆菌密码子使用频率对Thermus thermophilus来源的半乳糖苷酶基因GalS（genbank# 1KWK_A）进行密码子优化并由genewiz公司进行全基因合成；将GalS 363位的His突变成Ala（GalSH363A）并通过一个4肽linker 与人thrombomodμlin表皮生长因子样结构域4-6（TM46）进行融合表达，融合蛋白（TM46-GalSH363A）末端添加可由sortase A（SrtA）识别的LPETGG标签序列，融合蛋白TM46-GalSH363A对应的DNA序列由genewiz进行全基因合成，随后通过NdeI和BamHI酶切位点克隆至表达载体pET22b(+)；同时将携带启动子序列的二硫键氧化还原酶基因(dsbA) 通过BamHI和XhoI酶切位点克隆至上述载体，转化至BL21(DE3)感受态细胞。
（2）扩大培养：37℃，220rpm，将含有目的基因的菌种接于LB培养基中（含50μg/mL的氨苄青霉素）扩大培养；当菌液OD600达到0.8时，加入IPTG（0.1mM），在18℃进行诱导表达。
（3）收集菌种：4℃ 5000rpm，20小时后，离心收集菌体，并重悬于溶菌buffer（10mMimidazole，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH8.0）。
（4）蛋白纯化：用5倍柱体积的上样buffer （10mM imidazole，0.5M NaCl，20mMTris-HCl，pH8.0）平衡镍柱；利用超声破碎仪破碎细胞，取上清上样，并用5倍柱体积的咪唑溶液（30mM imidazole，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH8.0）洗脱杂蛋白；最后用洗脱溶液（250mM imidazole，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH8.0）洗脱目标蛋白。
（5）蛋白鉴定：利用聚丙烯酰胺电泳（12% SDS-PAGE）检测目标蛋白分子量及纯度。
（6）蛋白定量：利用BCA试剂盒对目标蛋白进行定量，1L反应液最终获得蛋白量约为30mg。
实施例
融合蛋白（TM-GalSH363A）功能化修饰的人工血管（PCL-TM- GalSH363A）的制备：
（1）将2.25g数均分子量为80000Da的聚己内酯（PCL）和0.25g叠氮化可降解聚合物材料（PCL2000-N3）加入至10mL有机溶剂中，所述有机溶剂为体积比为5:1的氯仿和甲醇的混合溶剂，室温搅拌过夜，得到电纺丝溶液；
（2）在室温、相对湿度为50%的条件下，将所述电纺丝溶液装入直径为14.9mm的注射器中，并将高压直流电源与注射器针头相连，调整注射器针头对准圆柱接收器的中央，设置针头与接收器之间的距离为15cm，溶液流速为8mL/h，直流电压为13kV；以直径为1.2 mm的不锈钢圆柱为接收棒，接收棒的转速为400rpm，接收棒的移动速度为5mm/s；静电纺丝30min后，将所得管状材料从接收棒上取下，在温度为22℃、压力为-0.075MPa的条件下真空干燥，使溶剂彻底挥发，得到厚度为400μm的叠氮化的人工血管。
（3） 配制2.17mg/mL的炔基化修饰GGGGG多肽溶液。按照GGGGG：CuSO4：抗坏血酸钠的摩尔比为1：0.1:1的比例在多肽溶液中加入CuSO4和抗坏血酸钠，以配制GGGGG反应液。
（4）截取1cm的上述叠氮化人工血管置于500μL离心管中，并在离心管中充满上述的GGGGG反应液。封口膜封闭离心管，并置于37℃摇床，避光孵育24小时。经过Click反应，共价结合上炔基化修饰的五个甘氨酸（氨基酸序列NH2-GGGGG-CCH），去离子水洗人工血管3次，并在室温下干燥得到修饰后的人工血管PCL-GGGGG-NH2。
（5）利用Tris-HCl缓冲溶液配制酶连反应液，在1.5mL离心管中依次加入Tris-HCl缓冲溶液700μL，eSrtA酶（8μg/μL）200μL，融合蛋白溶液（1μg/μL，TM- GalsH363A）100μL。充分混匀，进而配制成融合蛋白反应液。
（6）将人工血管PCL-GGGGG-NH2置于500μL的离心管中，并在离心管中充满融合蛋白反应液，37℃摇床反应36小时。
（7）TBST洗人工血管3次，室温晾干，得到融合蛋白修饰的人工血管（PCL-TM-GalSH363A）。
实施例
融合蛋白（TM-GalSH363A）功能化修饰的补片（PTFE-TM- GalSH363A）的制备：
（1）将聚四氟乙烯（PTFE）补片置于等离子体处理装置中，设置等离子体处理条件如下：放电功率为100W，氢气和氮气流速分别为 1 L/min 和0 .5 L/min，本底真空均为 2Pa。在该条件下处理时间9 min，得到氨基化修饰的PTFE补片。
（2）配置10mg/ml的叠氮己酸溶液，冰水浴下搅拌溶解，并用1M的NaOH将溶液的pH调至5左右。按照叠氮己酸：EDC的摩尔比为2：1的比例在叠氮己酸溶液中加入EDC，以配制叠氮己酸反应液。将上述氨基化修饰的PTFE补片置于5ml离心管之中，并在离心管中充满上述叠氮己酸反应液。封口膜封闭离心管，冰水浴，避光反应24小时。去离子水洗补片3次，并在室温下干燥得到叠氮修饰后的PTFE补片。
（3）配制2.17mg/mL炔基封端的GGGGG（氨基酸序列NH2-GGGGG-CCH）多肽溶液。按照GGGGG：CuSO4：抗坏血酸钠的摩尔比为1：0.1：1的比例在多肽溶液中加入CuSO4和抗坏血酸钠，以配制GGGGG反应液。
（4）截取面积为1cm2的上述叠氮表面修饰补片为底物置于培养皿中，并在培养皿中充满GGGGG反应液。封口膜封闭培养皿，并置于37℃摇床，避光反应24小时。经过Click反应，共价结合五个甘氨酸多肽，去离子水洗心肌补片3次，并在室温下干燥得到修饰后的心肌补片PTFE-GGGGG-NH2。
（5）酶连反应采用Tris-HCl缓冲溶液作为反应底液，在离心管中依次加入Tris-HCl缓冲溶液1400μL，eSrtA酶（8μg/μL）400μL，融合蛋白溶液（1μg/μL）200μL。充分混匀，进而配制成融合蛋白反应液。
（6）将心肌补片置于培养皿中，并在培养皿中充满融合蛋白（2000μL）反应液，37℃摇床孵育36小时。
（7）TBST洗心肌补片3次，室温晾干，得到融合蛋白修饰的心肌补片（PTFE-TM-GalsH363A）。
实施例
融合蛋白（TM-GalSH363A）功能化修饰的人工血管（PCL-TM- GalSH363A）体外催化释放NO的测试：
（1）截取长度为1.0cm的融合蛋白修饰的人工血管（PCL-TM-GalSH363A），浸泡于10mL的半乳糖保护的NO供体溶液(MeGal-NO，1mg/mL)中， 37℃孵育，间隔一定时间吸取反应溶液，并对体系补充同体积MeGal-NO溶液使体系体积恒定。
（2）用Griess试剂法测定亚硝酸根的浓度。吸取50µL样品于96孔板中，顺序加入50µL GriessⅠ和50µL GriessⅡ以生成紫色偶氮化合物。用酶标仪测试540nm的吸光度以确定偶氮化合物的浓度。偶氮化合物的浓度与亚硝酸根的浓度成正比。
（3）根据标准曲线计算出融合蛋白功能化修饰的人工血管（PCL-TM- GalSH363A）体外催化MeGal-NO供体释放产生的NO。
结果如图1所示，未修饰人工血管与NO底物MeGal-NO反应后，没有检测到NO的产生，证明NO底物MeGal-NO具有较好的稳定性；融合蛋白修饰人工血管与MeGal-NO反应后，可快速检测到NO的信号，因此融合蛋白修饰的人工血管可特异并高效识别NO底物，并产生NO。
实施例
融合蛋白（TM-GalSH363A）功能化修饰的人工血管（PCL-TM- GalSH363A）体外催化释放硫化氢的测试：
（1）截取长度为1.0cm的融合蛋白修饰的人工血管（PCL-TM-GalSH363A），浸泡于10mL的半乳糖保护的硫化氢（H2S）供体溶液(MeGal-H2S，1mg/mL)中， 37℃孵育，间隔一定时间吸取反应溶液，并对体系补充同体积MeGal- H2S溶液使体系体积恒定。
（2）用亚甲基蓝分光光度法测定H2S的浓度。吸取100µL样品于96孔板中，顺序加入150µL 1%醋酸锌和300µL 10%三氯乙酸。随后，加入100µL的对氨基二甲基苯胺盐酸盐及133µL的30mM三氯化铁。20分钟后，用酶标仪测试670nm的吸光度。
（3）根据标准曲线计算出融合蛋白功能化修饰的人工血管（PCL-TM- GalSH363A）体外催化MeGal-H2S供体释放产生的H2S。
实施例
融合蛋白（TM-GalSH363A）功能化修饰的人工血管（PCL-TM- GalSH363A）体内重复可逆连接性的测试：
按照如下方法分别对大鼠腹主动脉原位移植实施例2所得融合蛋白修饰的人工血管（PCL-TM- GalSH363A）：
截取长度为1.0cm的融合蛋白修饰的人工血管（PCL-TM- GalSH363A），利用大鼠腹主动脉移植模型，用9-0尼龙缝合线通过端端吻合术将人工血管植入大鼠的腹主动脉中，具体如下：
（1）SD（Sprague-DawLey）大鼠，体重 280~300g，经腹腔注射水合氯醛（10%，350mg/kg）诱导麻醉，腹部备皮；
（2）沿腹部中线剪开皮肤和肌肉层，将腹主动脉剥离，结扎其分支，用动脉夹夹住腹主动脉的两端，然后从中间剪开，用9-0带针缝合线原位缝合人工血管，每端8针；待两端缝好后，缓慢摘除动脉夹，恢复血流；
（3）用硫酸庆大霉素冲洗腹腔，将胃肠等器官复位，用3-0缝合线缝合肌肉层和皮肤，碘伏消毒；
（4）分别配制体内连接溶液和体内去连接溶液。
连接溶液：在1.5mL离心管中依次加入500μL肝素（50U/mL）+666μL esrtA（8μg/μL）+166μL融合蛋白（1mg/mL），充分混匀。
去连接溶液：在1.5mL离心管中依次加入500μL肝素（50U/mL）+200μL esrtA (8μg/μL）+300μLGGG（10μg/μL），充分混匀。
（5）将血管移植后的大鼠随机分为8组。
第一组：移植后第一天，通过尾静脉注射500μL的MeGal-NO (11mg/mL)溶液，并用气体信号分子检测仪TBR4100检测人工血管部位NO的水平变化；
第二组：移植后第七天，通过尾静脉注射500μL的MeGal-NO (11mg/mL)溶液，并用气体信号分子检测仪TBR4100检测人工血管部位NO的水平变化；
第三组：移植后第五天通过尾静脉注射去连接溶液，并在第六天通过尾静脉注射500μL的MeGal-NO (11mg/mL)溶液，并用气体信号分子检测仪TBR4100检测人工血管部位NO的水平变化；
第四组：移植后第五天通过尾静脉注射去连接溶液，并在第六天通过尾静脉注射连接溶液，第七天通过尾静脉注射500μL的MeGal-NO (11mg/mL)溶液，并用气体信号分子检测仪TBR4100检测人工血管部位NO的水平变化；
第五组：移植后第十四天通过尾静脉注射500μL的MeGal-NO (11mg/mL)溶液，并用气体信号分子检测仪TBR4100检测人工血管部位NO的水平变化；
第六组：移植后第十二天通过尾静脉注射去连接溶液，并在第十三天通过尾静脉注射500μL的MeGal-NO (11mg/mL)溶液，并用气体信号分子检测仪TBR4100检测人工血管部位NO的水平变化；
第七组：移植后第十二天通过尾静脉注射去连接溶液，并在第十三天通过尾静脉注射连接溶液，第十四天通过尾静脉注射500μL的MeGal-NO (11mg/mL)溶液，并用气体信号分子检测仪TBR4100检测人工血管部位NO的水平变化；
第八组：移植后第五天通过尾静脉注射去连接溶液，第六天通过尾静脉注射连接溶液，第十二天通过尾静脉注射去连接溶液，第十三天通过尾静脉注射连接溶液，第十四天通过尾静脉注射500μL的MeGal-NO (11mg/mL)溶液，并用气体信号分子检测仪TBR4100检测人工血管部位NO的水平变化；
记录8组大鼠人工血管部位NO水平变化，进而分析人工血管表面融合蛋白活性。
结果如图2所示，人工血管移植1天后（第一组），融合蛋白保持有较高的活性，底物可被迅速分解并在人工血管部位产生较高水平的NO。随着移植时间的延长，人工血管上融合蛋白活性逐渐降低（第二组，第五组），所产生NO的水平也逐渐下降，在14天时（第五组）已经检测不到NO的释放。体内去连接反应（第三组，第六组）可有效的将血管内表面的活性分子清除掉，使人工血管内表面不再表达融合蛋白的活性。去连接后的再连接反应可重新赋予人工血管融合蛋白的活性，与去连接前相比，去连接和再连接循环后的人工血管内表面融合蛋白的活性有了显著的提高，NO的释放水平也得到了明显的改善。
实施例
融合蛋白（TM-GalSH363A）功能化修饰的人工血管（PCL-TM- GalSH363A）体外抗血小板粘附的测试：
（1）从医院购入新鲜的富血小板血浆（PRP）。
（2）将未修饰的人工血管（PCL）和实施例2中融合蛋白修饰的人工血管（PCL-TM-GalSH363A）分别沿径向剖开，并固定于48孔培养底部，使其内表面朝上，接触富血小板血浆。
（3）每个样品上添加300μL PRP，用封口膜密封，37℃孵育2小时。
（4）PBS清洗三次，去除未粘附的血小板。
（5）加入2.5wt%的戊二醛溶液250μL，在4℃固定2~3小时，去离子水洗三次，梯度酒精脱水，晾干后，喷金，在扫描电子显微镜下观察血小板粘附情况，对八个随机选择的区域进行计数，并在高倍下观察血小板形态，并分析未修饰的人工血管（PCL）和融合蛋白修饰的人工血管（PCL-TM- GalSH363A）血小板的激活状态。
结果如图3所示，与未修饰的人工血管（PCL）相比，融合蛋白修饰的人工血管（PCL-TM- GalSH363A）在TM和NO双重的生物活性下，表现出了较强的抑制血小板粘附的能力，血管纤维表面粘附血小板数量显著降低。
实施例
融合蛋白（TM-GalSH363A）功能化修饰的人工血管（PCL-TM- GalSH363A）体外抗凝血的测试：
（1）截取1cm的未修饰的人工血管（PCL）和实施例2中融合蛋白修饰的人工血管（PCL-TM-GalSH363A）分别浸泡于生理盐水中，用离心机进行瞬离，将人工血管纤维间的空隙填满。
（2）取上述两组人工血管静置，取抗凝全血100μL分别加入到样品表面。
（3）在全血中加入10μL的0.2mol/L CaCl2溶液，充分混匀后开始计时。分别在10min、30min、50min，将人工血管以及表面的血液置于装有10mL去离子水的离心管中，静止30min。
（4）用紫外分光光度计在540nm处测定溶液中剩余游离血红蛋白的光密度值，绘制光密度-时间-动态凝血时间曲线，并于体视显微镜下观察材料表面形貌，分析未修饰的人工血管（PCL）和融合蛋白修饰的人工血管（PCL-TM- GalSH363A）的体外抗凝血效果。
结果如图4所示，与未修饰人工血管相比，融合蛋白修饰的人工血管表面游离的红细胞数量较多，在540nm处有更强的光吸收。融合蛋白修显著提高了人工血管抗血栓形成的能力。
实施例
融合蛋白（TM-GalSH363A）功能化修饰的人工血管（PCL-TM-GalSH363A）动物（兔子）体内抗血小板粘附的测试：
采用小动物兔颈动脉-颈静脉分流实验，评估融合蛋白功能化修饰的人工血管材料表面的血小板的粘附及激活状态，具体方法如下：
（1）将实施例2中融合蛋白功能化修饰（PCL-TM-GalSH363A）以及未修饰的人工血管（PCL）嵌于预抗凝的输血管内，两根人工血管之间相距10~15cm，在输血管的两端分别连一个24G的留置针。
（2）对体重为2kg兔子右后侧大腿肌肉的位置注射400μL陆眠宁，使兔子的肌肉松弛，待兔子稳定后，将兔子固定到手术板上，从耳缘静脉注射30%乌来糖5mL。
（3）待兔子被麻醉后，用剃须刀清理颈部的毛，然后用眼科剪轻轻剪开皮肤，分离动脉和静脉，然后将步骤（1）中串联好的装置的一端的留置针先插入动脉端，并固定。待血液流过整个输血管后，将另外一端的留置针插入静脉。
（4）血液循环1小时，之后取下装置，材料取出，用生理盐水轻轻冲洗，在体视显微镜下观察两组材料表面并拍照。
对分流实验后取下的人工血管分别进行米帕林染色，P-selectin染色以及SEM观察评价融合蛋白功能化修饰人工血管（PCL-TM-GalSH363A）以及未修饰的人工血管（PCL）两组材料表面的血小板粘附及激活状态。
结果如图5所示，灌流1h后，未修饰人工血管（PCL）已形成了明显的血栓，人工血管发生了堵塞，融合蛋白修饰的人工血管表面血栓较少。通过SEM、米帕林染色以及P-selectin可以发现，与未修饰组相比，融合蛋白修饰的人工血管（PCL-TM-GalSH363A）表面血小板粘附较少，同时激活的血小板数量也较少。
实施例
融合蛋白（TM-GalSH363A）功能化修饰的人工血管（PCL-TM-GalSH363A）动物（犬）体内抗凝血性能的测试：
采用大动物狗股动脉-股静脉分流实验，评估融合蛋白功能化修饰的人工血管材料表面的血小板的粘附及激活状态。具体方法如下：
（1）将实施例2中融合蛋白功能化修饰人工血管（PCL-TM-GalSH363A）以及未修饰的人工血管（PCL）嵌于预抗凝的输血管内，两根人工血管之间相距10~15cm，在输血管的两端分别连一个18 G的留置针。
（2）对体重为10 kg比格犬腿部肌肉注射舒泰进行诱导麻醉，3分钟后，用异氟烷进行持续气体麻醉。
（3）待比格犬被麻醉后，用剃须刀刮掉右侧腿部的毛发，剪开皮肤肌肉，暴露出股动脉和股静脉，然后将步骤（1）串联好的装置先插入动脉端，并固定。待血液流过整个输血管后，将另外一端的留置针插入静脉。
（4）动静脉血液循环1h，之后取下装置，将材料取出，用生理盐水轻轻冲洗，在体视显微镜下观察。
（5）对取材的人工血管进行米帕林染色，P-selectin染色以及SEM观察评价融合蛋白功能化修饰人工血管（PCL-TM-GalSH363A）以及未修饰的人工血管（PCL）两组材料表面的血小板的粘附及激活状态。
结果如图6所示，灌流1h后，未修饰人工血管由于血栓的形成发生了堵塞，融合蛋白修饰的人工血管仍保持通畅，表面血栓较少。通过SEM、米帕林染色以及P-selectin可以发现，与未修饰组相比，融合蛋白修人工血管表面（PCL-TM-GalSH363A）血小板粘附较少，同时激活的血小板数量也较少。
实施例
融合蛋白（TM-GalSH363A）功能化修饰的人工血管（PCL-TM-GalSH363A）体内移植后通畅性的测试：
采用大鼠颈动脉移植模型体内评价融合蛋白功能化人工血管的血管植入后通畅性。分别截取长度为0.7cm的融合蛋白功能化修饰人工血管（PCL-TM-GalSH363A）以及未修饰的人工血管（PCL），利用大鼠颈总动脉移植模型，用10-0尼龙缝合线通过端端吻合术将人工血管植入自体大鼠的颈动脉中，具体如下：
（1）SD（Sprague-DawLey）大鼠，体重280~300 g，经腹腔注射水合氯醛（10%，350mg/kg）诱导麻醉，固定大鼠的四肢于手术板上，颈部备皮；
（2）颈部涂抹碘伏消毒以后，用眼科剪在大鼠颈部沿中线剪开长约2 cm的口子；用持针器和止血钳惰性分离两边的唾液腺，并将右侧唾液腺向外翻出，敷上湿纱布保湿；
（3）3-0的黑线将皮下肌肉向外拉出，使视野开阔；分离右侧颈总动脉，勿伤及与其并行的迷走神经和颈静脉；
（4）尾静脉注射100U的肝素，用止血夹分别夹住颈总动脉近心端和远心端，从中间剪开并用肝素冲洗端口的血液；
（5）用10-0尼龙缝合线通过端端吻合术将人工血管植入大鼠的右侧颈总动脉中，每端8针；待两端缝好后，缓慢摘除动脉夹，恢复血流；
（6）用硫酸庆大霉素冲洗颈部手术部位，之后3-0手术缝合线缝皮，碘伏消毒，并标记大鼠；
（7）PCL-TM-GalSH363A人工血管组颈总动脉移植后，每日通过尾静脉注射500μL的MeGal-NO (11 mg/mL)溶液。
由于颈动脉移植模型通畅率较低，容易引发急性血栓。术后2和4周观察，利用多普勒超声检测融合蛋白功能化修饰人工血管（PCL-TM-GalSH363A）以及未修饰的人工血管（PCL）的植入后血管的通畅情况，并计算血管的通畅率。通过彩色多普勒超声发现（图4），植入2周和4周后，实施例2所得融合蛋白功能化修饰人工血管（PCL-TM-GalSH363A）通畅良好，血管通畅率大于80%，没有发现渗血和动脉瘤，未修饰的人工血管（PCL）通畅性较差，血管通畅率小于40%。
实施例
融合蛋白（TM-GalSH363A）功能化修饰的人工血管（PCL-TM-GalSH363A）体内移植后对组织再生的影响：
人工血管移植后取材分析：
（1）在大鼠颈总动脉移植后术后2周和4周，将大鼠麻醉，尾静脉注射肝素进行全身肝素化，腹部和颈部备皮，打开皮肤肌肉层，再用生理盐水心脏灌注。然后剥离颈部植入的人工血管，进行取材；
（2）将人工血管两端天然血管用3-0缝合线结扎，剪下人工血管，迅速用50U/mL肝素钠生理盐水溶液冲洗血管内腔，并浸泡于50U/mL肝素钠生理盐水溶液中，用显微剪小心剥离血管外面的结蹄组织和脂肪层；
（3）取材后通过体视显微镜对移植血管内外进行整体观测，并在冷冻切片后进行组织学分析。通过扫描电子显微镜（SEM）观察、免疫荧光染色评价融合蛋白功能化的人工血管的血管组织再生的作用。
颈动脉移植的模型如图7所示，体视和HE染色结果显示未修饰人工血管（PCL）组通畅率较低，移植后经常出现由于急性血栓引发的血管堵塞。在通常的未修饰人工血管（PCL）组通畅率较低内皮化进程较慢，且只在外侧有一些从周围组织迁移过来的较少的平滑肌细胞，血管再生较差。SEM结果如图8所示，融合蛋白功能化修饰人工血管（PCL-TM-GalSH363A）内表面出现鹅卵石状内皮细胞，与未修饰人工血管相比，融合蛋白修人工血管表现出了较好的内皮化程度。通过CD31染色可以发现，融合蛋白修饰人工血管表面的内皮细胞之间形成了较好的连接，形成均匀的内皮层。α-SMA染色结果表明，融合蛋白修饰人工血管具有较好的平滑肌再生，同时通过共染可以发现，这些平滑肌细胞与内皮细胞之间很好的接触，证明融合蛋白修饰人工血管在TM和NO的调控下表现出了较好的再生行为。
实施例
融合蛋白（TM-GalSH363A）功能化修饰的心肌补片（PLCL/PCL-TM- GalSH363A）治疗心肌梗死的方法：
大鼠心肌梗死模型采用如下方法建立：
（1）SD(Sprague-Dawley)大鼠，体重280~300g，经腹腔注射水合氯醛(10%，350mg/kg)诱导麻醉，用脱毛膏移除胸部被毛；
（2）将大鼠仰卧位固定在手术台上，经口腔进行气管插管，设置呼吸机(HallowellEMC,Microvent 1)频率为110次/分钟，潮气量为6mL；
（3）碘伏消毒胸部皮肤，用剪刀沿剑突与腋中线起点的连线剪开皮肤，切口长度为2cm；用镊子钝性分离胸大肌和前锯肌交界处筋膜，找到肋骨，于第三肋和第四肋间切开肋间肌，打开胸腔，放置扩胸器牵开肋骨，暴露心脏；显微剪剪开心包膜，在肺动脉圆锥与左心耳交界下行2mm处用6-0丝线缝合冠状动脉左前降支。
心肌补片采用如下方法植入：
用8-0丝线将心肌补片沿梗死边界覆盖、固定、贴合在缺血心肌表面。
建立心肌梗死模型后，根据是否植入补片及植入补片的类型将实验动物分为4组：
Sham组，即假手术组，仅进行开胸手术，不缝合冠状动脉左前降支；
AMI组，即单纯的心肌梗死模型组，开胸并缝合冠状动脉左前降支；
PLCL补片组，即建立心肌梗死模型后，于缺血心肌外缝合未修饰单纯的聚(丙交酯-己内酯) 补片(PLCL补片)；
融合蛋白（TM-GalSH363A）功能化修饰的心肌补片组(即PLCL/PCL-TM- GalSH363A补片组)，即建立心肌梗死模型，并于缺血心肌外缝合实施例3所得心肌补片。
PLCL/PCL-TM- GalSH363A心肌补片组移植后，每日通过尾静脉注射500μL的MeGaL-NO (11mg/mL)溶液。
利用心脏超声检测心梗大鼠的心脏功能，统计分析其射血分数(EF)和缩短分数(FS)。在术后立即对各实验组大鼠做心脏超声，假手术组的EF值为61± 4％，FS值为36±3％，而AMI组、PLCL补片组和PLCL/PCL-TM- GalSH363A补片组与假手术组相比EF值和FS值均明显降低，而三组相互之间不存在明显差异，左心室内径无明显改变。术后28天时，心脏超声数据显示，PCL补片组大鼠的EF值和FS值下降到与AMI组大鼠同一水平，左心室内径也有很大程度的扩张，而PLCL/PCL-TM- GalSH363A补片组大鼠的EF值和FS值明显高于AMI组和PLCL组，左心室内径较后两组相比也明显减小。相比较假手术组，其余三组心肌梗死的大鼠均表现出不同程度的左室前壁振幅减弱，室腔膨大以及室壁变薄。由超声检测图可观察到心梗后左室前壁的振幅明显减弱，室壁变薄。这些结果表明，植入实施例3所制备的PLCL/PCL-TM- GalSH363A心肌补片释放NO后，改善了心肌缺血大鼠的心功能。
实施例
融合蛋白（TM-GalSH363A）功能化修饰的心肌补片（PLCL/PCL-TM- GalSH363A）调节心肌缺血后的炎症反应测试：
采用实施例12所述的方法进行分组、建立模型和植入补片。在术后28天采用巨噬细胞浸润免疫荧光染色的方法测试炎症反应。
巨噬细胞浸润免疫荧光染色的具体步骤：
(1)心肌冷冻切片室温晾干2h后，用流水冲洗5min，之后再用PBS漂洗2次，每次5min；
(2)视具体染色情况做通透性处理：将切片浸泡于0.5% TritonX-100中，室温放置10min，之后用PBS洗3次，每次5min；
(3)组织表面滴加封闭用山羊血清，将切片置于湿盒中，室温放置30min；
(4)一抗(CD68)孵育：甩去组织表面的封闭血清，不经PBS洗涤直接滴加抗体工作液，切片置于湿盒中，4℃孵育过夜(约14h)；
(5)复温和二抗孵育：取出切片复温，PBS洗3次，每次5min，在组织表面滴加二抗工作液，避光、室温反应2h，之后再用PBS洗3次，每次5min；
(6)DAPI封片，荧光显微镜下观察，取图。
通过免疫荧光检测并计数缺血后心肌内巨噬细胞浸润情况，数据分析显示，植入实施例3所得融合蛋白（TM-GalSH363A）功能化修饰的心肌补片（PLCL/PCL-TM-GalSH363A）后，TM和NO协同发挥作用，使得在缺血边界区，CD68标记的浸润的巨噬细胞的数量与AMI组和PLCL组相比，明显减少(p<0.001)。
本发明提供了一种仿生内皮细胞的融合蛋白，并将所述融合蛋白修饰在心血管植入/介入材料表面，并采用原位活性修饰的方法更新植入材料表面的活性分子，进而达到长期仿生内皮的效果，消除血栓形成的级联反应，抑制活化的血小板聚集，减少纤维蛋白粘附，抑制内膜增生，增强组织再生，加快内皮化的进程，促进血管新生，降低炎症反应，维持心血管稳态，可以为心血管植入/介入材料的制备与修饰提供新视角。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南开大学
<120> 仿生内皮细胞的融合蛋白及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr
1 5 10 15
Val Ala Gln Ala His His His His His His Val Glu Pro Val Asp Pro
20 25 30
Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr
35 40 45
Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu
50 55 60
Pro His Arg Cys Gln Leu Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp
65 70 75 80
Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile
85 90 95
Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly
100 105 110
Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys
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Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Gly Gln Ile Gly Thr Asp Cys
130 135 140
Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly
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<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Leu Pro Glu Thr Gly Gly
1 5
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Gly Ser Gly
1
<210> 4
<211> 644
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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20 25 30
Gly Glu Phe Ala Trp Ala Leu Leu Glu Pro Glu Pro Gly Arg Leu Glu
35 40 45
Trp Gly Trp Leu Asp Glu Ala Ile Ala Thr Leu Ala Ala Glu Gly Leu
50 55 60
Lys Val Val Leu Gly Thr Pro Thr Ala Thr Pro Pro Lys Trp Leu Val
65 70 75 80
Asp Arg Tyr Pro Glu Ile Leu Pro Val Asp Arg Glu Gly Arg Arg Arg
85 90 95
Arg Phe Gly Gly Arg Arg His Tyr Cys Phe Ser Ser Pro Val Tyr Arg
100 105 110
Glu Glu Ala Arg Arg Ile Val Thr Leu Leu Ala Glu Arg Tyr Gly Gly
115 120 125
Leu Glu Ala Val Ala Gly Phe Gln Thr Asp Asn Glu Tyr Gly Cys His
130 135 140
Asp Thr Val Arg Cys Tyr Cys Pro Arg Cys Gln Glu Ala Phe Arg Gly
145 150 155 160
Trp Leu Glu Ala Arg Tyr Gly Thr Ile Glu Ala Leu Asn Glu Ala Trp
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Gly Thr Ala Phe Trp Ser Gln Arg Tyr Arg Ser Phe Ala Glu Val Glu
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Val Glu Ile Leu Arg Ala His Ala Pro Gly Lys Phe Val Thr His Asn
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Phe Met Gly Phe Phe Thr Asp Leu Asp Ala Phe Ala Leu Ala Gln Asp
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Leu Asp Phe Ala Ser Trp Asp Ser Tyr Pro Leu Gly Phe Thr Asp Leu
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Met Pro Leu Pro Pro Glu Glu Lys Leu Arg Tyr Ala Arg Thr Gly His
275 280 285
Pro Asp Val Ala Ala Phe His His Asp Leu Tyr Arg Gly Val Gly Arg
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Gly Arg Phe Trp Val Met Glu Gln Gln Pro Gly Pro Val Asn Trp Ala
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Asp Ser Ala Pro Asp Gln Gly Phe Phe Glu Ala Lys Arg Val Ala Glu
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Glu Leu Ala Ala Leu Ala Leu Pro Pro Val Ala Gln Ala Pro Val Ala
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Leu Val Phe Asp Tyr Glu Ala Ala Trp Ile Tyr Glu Val Gln Pro Gln
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Gly Ala Glu Trp Ser Tyr Leu Gly Leu Val Tyr Leu Phe Tyr Ser Ala
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Leu Arg Arg Leu Gly Leu Asp Val Asp Val Val Pro Pro Gly Ala Ser
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Leu Arg Gly Tyr Ala Phe Ala Val Val Pro Ser Leu Pro Ile Val Arg
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Gly Pro Arg Ser Gly Ser Lys Thr Glu Thr Phe Gln Ile Pro Lys Glu
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Gly Arg Phe Pro Leu Gly Leu Trp Arg Glu Trp Val Glu Ala Pro Leu
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Gly Arg Tyr Leu Tyr Leu Ala Ala Trp Pro Ser Pro Glu Leu Ala Gly
565 570 575
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595 600 605
Phe Asn Tyr Gly Pro Glu Ala Val Glu Ala Pro Ala Ser Glu Gly Ala
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Arg Phe Leu Leu Gly Ser Arg Arg Val Gly Pro Tyr Asp Leu Ala Val
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Trp Glu Glu Ala
<210> 5
<211> 808
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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1 5 10 15
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Val Asp Arg Glu Gly Arg Arg Arg Arg Phe Gly Gly Arg Arg His Tyr
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Val Arg Ala Phe Asn Arg Leu Gln Val Glu Ile Leu Arg Ala His Ala
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<210> 6
<211> 748
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Met Met Thr Asp Pro Thr Gln Lys Asp
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Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln
65 70 75 80
Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile
85 90 95
Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val
100 105 110
Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser
115 120 125
Ala Leu Ala Gly Gln Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser Gly Lys Val Asp
130 135 140
Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Met Met Thr Ser His Ser Pro Phe Ser
145 150 155 160
Arg Arg Arg Leu Pro Ala Leu Leu Gly Ser Leu Pro Leu Ala Ala Thr
165 170 175
Gly Leu Ile Ala Ala Ala Pro Pro Ala His Ala Val Pro Thr Ser Asp
180 185 190
Gly Leu Ala Asp Val Thr Ile Thr Gln Val Asn Ala Pro Ala Asp Gly
195 200 205
Leu Tyr Ser Val Gly Asp Val Met Thr Phe Asn Ile Thr Leu Thr Asn
210 215 220
Thr Ser Gly Glu Ala His Ser Tyr Ala Pro Ala Ser Thr Asn Leu Ser
225 230 235 240
Gly Asn Val Ser Lys Cys Arg Trp Arg Asn Val Pro Ala Gly Thr Thr
245 250 255
Lys Thr Asp Cys Thr Gly Leu Ala Thr His Thr Val Thr Ala Glu Asp
260 265 270
Leu Lys Ala Gly Gly Phe Thr Pro Gln Ile Ala Tyr Glu Val Lys Ala
275 280 285
Val Glu Tyr Ala Gly Lys Ala Leu Ser Thr Pro Glu Thr Ile Lys Gly
290 295 300
Ala Thr Ser Pro Val Lys Ala Asn Ser Leu Arg Val Glu Ser Ile Thr
305 310 315 320
Pro Ser Ser Ser Gln Glu Asn Tyr Lys Leu Gly Asp Thr Val Ser Tyr
325 330 335
Thr Val Arg Val Arg Ser Val Ser Asp Lys Thr Ile Asn Val Ala Ala
340 345 350
Thr Glu Ser Ser Phe Asp Asp Leu Gly Arg Gln Cys His Trp Gly Gly
355 360 365
Leu Lys Pro Gly Lys Gly Ala Val Tyr Asn Cys Lys Pro Leu Thr His
370 375 380
Thr Ile Thr Gln Ala Asp Val Asp Ala Gly Arg Trp Thr Pro Ser Ile
385 390 395 400
Thr Leu Thr Ala Thr Gly Thr Asp Gly Ala Thr Leu Gln Thr Leu Thr
405 410 415
Ala Thr Gly Asn Pro Ile Asn Val Val Gly Asp His Pro Gln Ala Thr
420 425 430
Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser
435 440 445
Gln Ala Gln His Leu Ala Ala Asn Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile
450 455 460
Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp
465 470 475 480
Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro
485 490 495
Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser
500 505 510
Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly
515 520 525
Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe
530 535 540
Asn Phe His Val Lys Ser Tyr Asp Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly
545 550 555 560
Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr
565 570 575
Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp
580 585 590
Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln
595 600 605
Gly Ile Gln Ile Gln His Gly Pro His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln
610 615 620
Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr
625 630 635 640
Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr
645 650 655
Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met
660 665 670
Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His
675 680 685
Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn
690 695 700
Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn
705 710 715 720
Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser
725 730 735
Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser Arg Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser
740 745 750
Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro
755 760 765
Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly
770 775 780
Leu Leu Ser Glu Asp Ala His Asn Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp
785 790 795 800
Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys
805 810 815
Pro Ala Glu Pro Ser Pro Ala Pro Ser Pro Thr Ala Ala Pro Ser Ala
820 825 830
Ala Pro Thr Glu Lys Pro Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Glu Pro
835 840 845
Thr Gln Ala Pro Ala Pro Ser Ser Ala Pro Glu Pro Ser Ala Ala Pro
850 855 860
Glu Pro Ser Ser Ala Pro Ala Pro Glu Pro Thr Thr Ala Pro Ser Thr
865 870 875 880
Glu Pro Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ser Ser Ala Pro Glu Gln Thr Asp
885 890 895
Gly Pro Thr Ala Ala Pro Ala Pro Glu Thr Ser Ser Ala Pro Ala Ala
900 905 910
Glu Pro Thr Gln Ala Pro Thr Val Ala Pro Ser Val Glu Pro Thr Gln
915 920 925
Ala Pro Gly Ala Gln Pro Ser Ser Ala Pro Lys Pro Gly Ala Thr Gly
930 935 940
Arg Ala Pro Ser Val Val Asn Pro Thr Gly Gly Ala Ser Ala Pro Ser
945 950 955 960
Ala Ala Pro Thr Gln Ala Ala Lys Lys Ala Thr Gly Ala Ala Thr Glu
965 970 975
Pro Gly Thr Pro Ser Ser Ser Ala Ser Pro Ala Pro Ser Arg Asn Ala
980 985 990
Ala Pro Thr Pro Lys Pro Gly Met Glu Pro Asp Glu Ile Asp Arg Pro
995 1000 1005
Ser Asp Gly Thr Met Ala Gln Pro Thr Gly Gly Ala Ser Ala Pro Ser
1010 1015 1020
Ala Ala Pro Thr Gln Ala Ala Lys Ala Gly Ser Arg Leu Ser Arg Thr
1025 1030 1035 1040
Gly Thr Asn Ala Leu Leu Ile Leu Gly Leu Ala Gly Val Ala Val Val
1045 1050 1055
Gly Gly Tyr Leu Leu Leu Arg Ala Arg Arg Ser Lys Asn Leu Pro Glu
1060 1065 1070
Thr Gly Gly His His His His His His
1075 1080

Claims (4)

1.一种仿生内皮细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.5所示。
2.一种编码权利要求1所述融合蛋白的编码基因。
3.一种包含权利要求2所述编码基因的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体以pET22b(+)为基础载体，将所述编码基因插入到所述基础载体的NdeI和BamHI酶切位点之间。
4.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌中包括权利要求3所述重组表达载体。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103037893A (zh) * 2010-06-14 2013-04-10 帕昂德国有限公司 具有纤溶亢进的凝血病的治疗
WO2013052915A2 (en) * 2011-10-05 2013-04-11 Genelux Corporation Method for detecting replication or colonization of a biological therapeutic
CN109498839A (zh) * 2018-11-13 2019-03-22 南开大学 一种生物复合人工血管和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103037893A (zh) * 2010-06-14 2013-04-10 帕昂德国有限公司 具有纤溶亢进的凝血病的治疗
WO2013052915A2 (en) * 2011-10-05 2013-04-11 Genelux Corporation Method for detecting replication or colonization of a biological therapeutic
CN109498839A (zh) * 2018-11-13 2019-03-22 南开大学 一种生物复合人工血管和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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In situ regeneration of bioactive coatings enabled by an evolved Staphylococcus aureus sortase A;Ham HO等;《NATURE COMMUNICATIONS》;20160413;第13卷(第7期);全文 *

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