CN114225115B - 无损修饰的含有活细胞的血管替代物及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于组织工程领域，具体涉及一种无损修饰的含有活细胞的血管替代物及其制备方法。无损修饰的含有活细胞的血管替代物包括含有活细胞的血管以及通过两亲性分子结合在所述的含有活细胞的血管PBs上的抗凝分子和/或促进内皮化分子；所述的两亲性分子为含有末端官能团的聚乙二醇‑磷脂。本发明将功能性分子(抗凝分子和/或促进内皮化分子)与两亲性分子结合，利用两亲性分子与血管替代物中活细胞细胞膜之间的疏水相互作用嵌入细胞表面，从而将功能性分子修饰在带有活细胞的血管替代物上。
Description
技术领域
本发明属于组织工程领域，具体涉及一种无损修饰的含有活细胞的血管替代物及其制备方法。
背景技术
心血管疾病是全球范围内死亡的首要原因。心血管疾病患病率仍处于持续上升阶段，造成了巨大的健康与经济负担，形成了严重的公共卫生问题。
血管置换手术是治疗血管严重狭窄和血管病变的有效手段，目前国内临床应用的血管移植材料主要为自体血管和人工血管。自体血管是最为理想的血管替代品，但自体血管的使用常常由于自身系统性血管疾病的存在、血管口径不匹配或能够获取的血管长度不足等问题而受到限制。临床上已经有可以使用的由高分子材料制成人工血管，如聚苯二甲酸乙二醇酯
和膨体聚四氟乙烯
临床表现良好，可保持较高的长期通畅率较高。但是，以上血管替代物缺乏组织再生性能，且材料与宿主整合能力差，当应用在心脏搭桥、膝关节以下或外周血管搭桥手术中时，由于这些部位的血管多处于高张力、低血流的特殊状态，体内植入后容易出现血栓、内膜增生、感染等问题导致移植失败。严重影响了临床治疗效果。因此，研究和开发一种新型可替代天然动脉的人工血管替代物，以满足临床需求，具有重要的现实意义。
利用机体对外来植入物自发的免疫包裹反应，可以有效的构建体内组织工程人工血管，这种由自体细胞和胞外基质(ECM)组成的血管替代物具有良好的生物相容性，但力学性能欠佳，无法有效维持管状形态。而在先前研究中我们利用人工聚合物材料在硅胶管表面制备纤维骨架，将纤维骨架连同硅胶管一同作为模板埋植在动物皮下，形成组织包裹，由此方法制备的纤维增强型组织工程血管(PBs)力学性能显著改善，同时展现了优良的血管再生能力，能够促进宿主和血管替代物的快速整合，快速实现血管功能，是受损或病变血管替代物的良好选择。但即便是这种相容性和再生能力十分良好的组织工程血管，由于其内层缺乏具有功能的血管内皮细胞，急性血栓的形成也是其难以避免的缺点。此外，由于国内器官捐献数量逐年增加，同种异体血管也成为血管重建的重要选择，常用于大血管感染性病变或缺乏自体血管的中小血管疾病等。然而，利用传统冻存的方式保存的血管组织，在冷冻过程中往往会由于细胞冰晶损伤等因素造成内皮细胞功能受损或丢失，导致血管移植通畅率降低。
小口径血管替代物植入体内后多处于高张力、低血流的特殊状态，极易发生急性血栓和内膜增生，进而导致移植失败。在血管材料表面修饰抗凝药物或促内皮化多肽，能够有效地提高血管材料通畅率，促进内皮化进程。体内工程化人工血管以及同种异体血管主要是由活细胞和ECM构成，常规用于血管替材料的表面修饰方法往往涉及高温加热、有机溶剂与化学催化剂的使用，反应条件剧烈，会引起细胞凋亡和ECM失活，不适于用于修饰体内工程化人工血管。因此，如何在保证细胞活力与ECM活性的前提下，利用无损的修饰手段，对含有活细胞血管替代物进行功能修饰，使其具有抗凝血或促内皮化的功能，提高血管替代物的长期通畅率，实现血管组织的完全再生具有重要的科学意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺点，提供一种无损修饰的含有活细胞的血管替代物及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种无损修饰的含有活细胞的血管替代物，包括含有活细胞的血管替代物以及通过两亲性分子修饰在所述的含有活细胞的血管替代物上的抗凝分子和/ 或促进内皮化分子；所述的两亲性分子为含有末端官能团的聚乙二醇-磷脂DP。
所述的聚乙二醇-磷脂DP为十四酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DMPE-PEG、十六酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DPPE-PEG、十八酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 DSPE-PEG中的一种，末端官能团为氨基、羧基、马来酰亚胺、炔基、叠氮中的一种。
与两亲性分子结合抗凝分子和与两亲性分子结合促进内皮化分子对含有活细胞的血管替代物进行无损修饰的摩尔比为1:1-1:2。
优选的，与两亲性分子结合抗凝分子和与两亲性分子结合促进内皮化分子对含有活细胞的血管替代物进行无损修饰的摩尔比为1:1。
所述的抗凝分子为水蛭素、比伐卢定、或者肝素中的一种；所述的促内皮化分子为TPS多肽、YIGSR多肽、CD34抗体、VEGFR-2抗体、NO缓释分子、有机硒SeCA中的一种。
本发明还包括一种所述的无损修饰的含有活细胞的血管替代物的制备方法，采用下述步骤：
将两亲性分子结合抗凝分子和/或促进内皮化分子制成带有功能基团的DP 粉末，将DP粉末溶于生理盐水，制备成5-20μM的DP-功能分子溶液；将DP- 功能分子溶液添加到含有活细胞的血管的管腔中；室温下孵育1-15min后，用生理盐水冲洗三次即得。
优选的DP-功能分子溶液的修饰浓度应为15μM；修饰时间为10min。
所述含有活细胞的血管为同种异体静脉血管、同种异体动脉血管、体内组织工程血管、体内组织工程血管、纤维增强型体内组织工程血管中的一种。
所述的活细胞为内皮细胞、干/祖细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、干/祖细胞分化的内皮细胞、干/祖细胞分化的平滑肌细胞、巨噬细胞、肌成纤维细胞中的至少一种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明将功能性分子(抗凝分子和/或促进内皮化分子)与两亲性分子结合，利用两亲性分子与血管替代物中活细胞细胞膜之间的疏水相互作用嵌入细胞表面，从而将功能性分子修饰在带有活细胞的血管替代物上，从而提供一种可用于含有活细胞血管替代物的无损功能修饰方法及具有抗凝或促进内皮化功能的活性血管代替物，所得产品能够用于血管移植和搭桥手术，解决现有人工血管植入体内后易出现血栓、内皮再生差、远期通畅率低的问题，还可以用于组织工程血管研究。
附图说明
图1为不同浓度DP-Cy7对PB修饰的影响图。(A)不同浓度DP-Cy7或P-Cy7修饰PB的代表性荧光图像。(B)平均荧光强度定量。
图2为不同修饰时间对PB修饰的影响图。(A)15μMDP-Cy7或P-Cy7对PB修饰不同时间后的代表性荧光图像。(B)荧光强度定量分析。
图3为不同比例DPT/DPB修饰后PBs的细胞活力图。
图4为不同比例DPT/DPB修饰PBs的血液相容性图。(A)不同比例DPT/DPB修饰 PBs内腔兔半体内动静脉分流实验结果。(B)不同比例DPT/DPB修饰PBs内腔米帕林染色。
图5为不同比例DPT/DPB修饰PBs对EPC选择性黏附效果。(A)EPCs/SMCs粘附数量比值统计结果。(B)EPCs/MNCs粘附数量比值统计结果。
图6为不同比例DPT/DPB修饰PBs促进大鼠腹主动脉移植血管内皮化进程。(A)CD31免疫荧光染色。(B)内皮覆盖率统计。
图7为7.5μMDPH+7.5μMDP-34修饰对PBs血液相容性的影响。(A)未修饰PBs 兔半体内动静脉分流实验结果。(B)7.5μMDPH+7.5μMDP-34兔半体内动静脉分流实验结果。
图8为7.5μMDPH+7.5μMDP-34修饰对PBs捕获EPCs能力的影响。(A)未修饰 PBs对EPC捕获情况。(B)7.5μMDPH+7.5μMDP-34修饰PBs对EPC捕获情况。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：1、纤维增强型体内组织工程血管(PBs)制备：
(1)利用熔融纺丝技术制备纤维骨架。其具体操作步骤为：称取10.0g聚己内酯(PCL，分子量为80000)，置入熔融纺丝用不锈钢注射器中，100℃加热 1h使其充分融化；将适合口径的不锈钢接受棒插入外径2mm的硅胶管中，并与旋转接收器相连；在硅胶管表面制备网状纤维骨架，其纤维直径为60μm，网格状纤维的较差角度为50°，管状纤维骨架壁厚为300μm。随后，经过热处理增加纤维间的粘连程度。
(2)利用机体对外来材料的免疫包裹反应制备纤维PBs。将纤维骨架制备成长度为2cm的小段，经医用酒精消毒与无菌生理盐水清洗后，将纤维骨架埋植在大鼠背部皮层与肌肉之间，将切口缝合消毒后饲养。埋植28天后，将大鼠麻醉，通过手术将被组织充分包裹的纤维骨架与周围组织剥离后取出，随后取出支架中的硅胶管芯抽出即可获得PBs。本申请中采用的皮下移植的手段制备含有活细胞的血管替代物，也可以采用体外模拟等其他形式得到含有活细胞的PBs 或者其他含有活细胞的血管替代物。
2、利用荧光分子DP-Cy7修饰PBs：
(1)将3mgDMPE-PEG-NH2溶于270μL双蒸水中，用1M碳酸氢钠溶液调pH 值为8.5，将1mgCy7-NHS溶于30μLDMSO中。将充分溶解的Cy7-NHS溶液加入 DMPE-PEG-NH2溶液中，在4℃下过夜反应。随后用3500分子量的透析袋在去离子水中将产物透析3天，冻干，即可获得荧光修饰分子DP-Cy7粉末。P-Cy7(不含有两亲性分子的PEG-NH2为原料)的合成方式同上。
(2)将DP-Cy7或P-Cy7粉末溶于生理盐水，制备成20μM、15μM、10μM 和5μM的DP-Cy7或P-Cy7溶液。将30μL不同浓度的DP-Cy7或P-Cy7溶液添加到长度为1cm的PBs管腔中。室温下孵育10min后，用生理盐水冲洗三次。随后立即用IVIS小动物活体成像系统(Xenogen,American)对修饰后的PBs进行成像。
(3)将DP-Cy7或P-Cy7粉末溶于生理盐水，制备成15μM的DP-Cy7或P-Cy7 溶液。将30μL不同浓度的DP-Cy7或P-Cy7溶液添加到长度为1cm的PBs管腔中。室温下分别孵育1min、5min、10min、15min后，用生理盐水冲洗三次。随后立即用IVIS小动物活体成像系统(Xenogen,American)对修饰后的PBs进行成像。
实验结果1如附图1和附图2所示：
图1不同浓度DP-Cy7对PB修饰的影响图。(A)不同浓度DP-Cy7或P-Cy7 修饰PB的代表性荧光图像。(B)平均荧光强度定量。图2不同修饰时间对PB修 饰的影响图。(A)15μMDP-Cy7或P-Cy7对PB修饰不同时间后的代表性荧光图像。 (B)荧光强度定量分析。由附图1可知，在5-15μM浓度范围内，MFI随着DP-Cy7 浓度增加而升高，进一步提高修饰浓度至20μM并不能显著增加PB内腔的荧光 强度。而即使在最高浓度(20μM)也无法观察到对照分子P-Cy7修饰组的荧光 信号。由以上结果可知，DP-Cy7修饰PB的有效浓度为5-15μM，高于此浓度则出现修饰分子的浪费，15μM为饱和修饰浓度。
由附图2可知，只需1min的修饰，DP-Cy7的荧光信号就足以覆盖PB内腔。荧光定量数据显示，15μMDP-Cy7修饰15min时的荧光强度与修饰10min的荧光强度相当，这表明修饰在10min时达到饱和，超出此时间则并不会使修饰分子数量增加。且即使经过20min孵育，仍看不到PEG-Cy7的荧光信号。
由以上结果可知，基于两亲性分子DMPE-PEG的修饰分子优选修饰浓度为 5-15μM，1-10min，其中，优选地饱和修饰条件是15μM，修饰10min。因此，优选饱和修饰条件进行后续实验。
结果2评价基于两亲性分子DMPE-PEG结合功能性分子的修饰手段对PBs活性的影响。
为了检测功能性修饰分子与两亲性分子结合后，修饰在PBs内腔表面的修饰方式是否会对PB内腔细胞的正常生物活性造成影响，对修饰后PBs的细胞活力进行检测。其具体步骤如下：
具有内皮捕获能力的功能性分子TPS与DMPE-PEG结合，制备功能性修饰分子DMPE-PEG-TPS(DPT)
将DMPE-PEG-MAL(50mg)和TPS(30mg)溶解在2mL二甲基甲酰胺(DMF)中，滴加三乙胺进行调节至pH8.0。在室温和氮气保护下将反应24小时。使用分子量为3500的透析袋将产物在去离子水透析3天，随后冻干以获得DPT粉末。
具有抗凝能力的功能性分子BVLD与DMPE-PEG结合，制备功能性修饰分子 DMPE-PEG-BVLD(DPB)。
将BVLD(25mg)与交联剂EDC(10mg)和NHS(5.75mg)共同溶解在2mLDMF溶液中活化。随后，将DMPE-PEG-NH2(30mg)加入上述溶液中。将反应物在室温搅拌 24小时。使用分子量为3500的透析袋将产物在去离子水透析3天，随后冻干以获得DPB粉末。
检测修饰手段及修饰分子DPT、DPB对PBs细胞活性的影响。
用不同比例的DPT/DPB修饰PBs(15μMDPT、10μMDPT+5μMDPB、7.5μ MDPT+7.5μMDPB、5μMDPT+10μMDPB和15μMDPB),修饰方法如上文描述。用未修饰的PBs作为对照。
使用CCK-8试剂分析修饰后的组织细胞活力。将用不同比例的DPT/DPB修饰的PB称量重量后置于48孔板中，并在添加有50μLCCK-8溶液的500μL完全培养基中孵育。4小时后，将100μL上清液转移到96孔板中，并使用酶标仪测量450nm处的光密度(OD)。修饰后PB的活力表示为样品在450nm处的OD与其重量(mg)之间的比率(OD450/mg)。
实验结果如附图3所示。由附图3可知，不同比例的DPT/DPB修饰对PBs 中所含有的细胞活性没有显著性影响。
结果3不同比例DPT/DPB修饰对PBs血液相容性的改善。
为了检测功能性分子DPT/DPB修饰对PBs血液相容性的改善，优选出能够在人工血管植入体内后有效抵御血小板聚集激活和急性凝血发生的DPT/DPB修饰比例，对不同比例DPT/DPB修饰PBs的血液相容性进行评价。其具体方法如下：
3.1半体内动静脉分流实验：用不同比例的DPT/DPB修饰PBs(15μMDPT、 10μMDPT+5μMDPB、7.5μMDPT+7.5μMDPB、5μMDPT+10μMDPB和15μMDPB), 修饰方法如上文描述。用未修饰的PBs作为对照。
将用不同比例的DPT/DPB修饰PBs并联，随后连接在用医用输液管组建而成的环状通路中，在保证密闭的情况下，将通路两端通过留置针与兔子动脉和静脉分别连接起来，构成一个体外血液循环回路。循环过程中不使用任何抗凝剂。血液循环2h后，将不同比例的DPT/DPB修饰PBs取下，用生理盐水清洗，随后用体式显微镜拍照。
3.2血小板黏附测定：用不同比例的DPT/DPB修饰PBs(15μMDPT、10μ MDPT+5μMDPB、7.5μMDPT+7.5μMDPB、5μMDPT+10μMDPB和15μMDPB),修饰方法如上文描述。用未修饰的PBs作为对照。
将不同比例DPT/DPB修饰的PBs(1cm长)沿纵向切开成两份，管腔侧向上放入48孔板中，向每孔中加入从血液中心购得的富血小板血浆(PRP)200μL， 37℃下静态孵育2h。孵育后，用PBS洗涤3次，随后使用mepacrine染液在37℃下染色30min，随后经过清洗、封片等步骤制备成可用于荧光拍照的样品，在共聚焦激光扫描显微镜下观察。
实验结果如附图4所示。由附图4可知，在不给予任何抗凝剂的情况下，未修饰PBs组和15μMDPT修饰组在兔半体内动静脉分流实验中发生血栓，堵塞血管。10μMDPT+5μMDPB修饰组与未修饰PBs组和15μMDPT修饰组相比，未形成堵塞血管的严重血栓，但仍有明显的凝血斑块形成，与血液长时间接触后有发生凝血堵塞血管的可能。而随着DPB所占比例提高，7.5μMDPT+7.5μMDPB组、 5μMDPT+10μMDPB组和15μMDPB组在血管内腔几乎没有明显血栓形成(图4A)。通过米帕林染色结果可知(图4B)，DPB修饰组分的引入显著减少了PBs内腔血小板的粘附，并且随着DPB在修饰分子中所占比例的增加，粘附血小板在数量减少的同时，形态也由伸出明显的伪足状态转变为相对圆润的形态，这种形态上的不同是由于DPB的修饰抑制了血小板的激活导致的。
由以上结果可知，当DPT：DPB修饰比例大于2:1时，由于没有充分的抗凝分子发挥抗凝作用，可能导致血管植入后血栓形成堵塞血管。因此，优选7.5 μMDPT+7.5μMDPB、5μMDPT+10μMDPB和15μMDPB修饰PBs作为较优组，进行后续检测。
结果4不同比例DPT/DPB修饰对EPCs选择性黏附的影响。
为了检测功能性分子DPT/DPB修饰对PBs选择性黏附EPCs能力的影响，优选出能够在人工血管植入体内后能够有效促进内皮化的DPT/DPB修饰比例，对不同比例DPT/DPB修饰PBs的EPCs选择性捕获能力进行评价。
其具体方法如下：
4.1EPCs的分离与纯化：利用淋巴细胞分离液，从人外周血中通过密度梯度离心的方式分离单核细胞(MNCs)。收集分离的MNCs并在纤连蛋白包被的培养瓶红用EGM-2培养基培养，培养环境为37℃、5％CO2。48小时后更换培养基以去除未贴壁细胞，然后每3天更换一次培养基。培养10天后，收集并扩增具有鹅卵石样形态的EPCs，用于进一步实验。
4.2EPCs选择性捕获检测：用不同比例的DPT/DPB修饰PBs(7.5μMDPT+7.5 μMDPB和5μMDPT+10μMDPB),修饰方法如上文描述。用未修饰的PBs作为对照。使用正常生理状态中外周血中含量更高的单核细胞(MNCs)和血管中大量存在的平滑肌细胞(SMCs)作为对照细胞。将EPCs用DiO溶液标记(1:1000稀释)，MNCs和SMCs用DiI溶液标记(1:1000稀释)。随后将DiO标记的EPCs和 MNCs细胞悬液混合，混合细胞液中EPCs浓度为2×105细胞/mL，MNCs细胞浓度为1×106细胞/mL，此为细胞混合液1。对于EPCs和SMCs，取等量DiO标记的 EPCs和MNCs细胞悬液混合，混合细胞液中EPCs和SMCs的浓度均为2×105细胞 /mL，此为细胞混合液2。
将不同比例的DPT/DPB修饰的PBs连接到流动培养生物反应器中，将上述混合细胞悬液放入培养瓶中，利用无菌硅胶管连接培养瓶、PBs血管和蠕动泵。设置蠕动泵转速使培养基流动流速为12.41cm/s，以模拟体内血液流动状态。在 37℃和5％CO2培养2小时后，收集样品并用多聚甲醛固定，在共聚焦显微镜下观察样品管腔表面捕获的细胞。实验结果如附图5所示。
由附图5可知，未修饰PBs管腔表面的EPCs/MNCs的粘附细胞比(0.23± 0.09)与混合细胞悬液中的EPCs/MNCs比值相当，随着PBs经过7.5μMDPT+7.5 μMDPB和5μMDPT+10μMDPB修饰后，其对于EPCs的选择性黏附能力明显增加，而15μMDPB修饰没有增加PBs对于EPCs的选择性粘附能力。对于SMCs与EPCs 的竞争黏附结果同样说明，经过7.5μMDPT+7.5μMDPB和5μMDPT+10μMDPB修饰后，PBs对于EPCs的选择性黏附能力明显增加，而15μMDPB修饰没有增加PBs对于EPCs的选择性粘附能力。
由以上结果可知，7.5μMDPT+7.5μMDPB和5μMDPT+10μMDPB修饰能够有效提高PBs在模拟体内血液流动环境下对EPCs的选择性捕获能力，而当修饰比例小于1:2时，由于没有足够的DPT发挥内皮捕获功能，15μMDPB修饰PBs对 PBs的EPCs捕获性能没有增强，无法有效促进PBs的快速内皮化。因此，优选 7.5μMDPT+7.5μMDPB和5μMDPT+10μMDPB修饰作为较优修饰比例进行后续实验。
结果5不同比例DPT/DPB修饰对血管快速内皮化的影响。
用不同比例DPT/DPB修饰PBs对大鼠腹主动脉进行移植，对其短期内皮化效果进行评价，以优选出能够在人工血管植入体内后，在实现短期抗凝的同时实现快速内皮化的最佳DPT/DPB修饰比例。其具体方法如下：
大鼠腹主动脉移植：用不同比例的DPT/DPB修饰PBs(7.5μMDPT+7.5μMDPB 和5μMDPT+10μMDPB),修饰方法如上文描述。用未修饰的PBs作为对照。
使用雄性SD大鼠进行腹主动脉血管原位移植。用异氟烷进行气体麻醉并在术前使用肝素(50U.I/kg剂量)进行全身肝素化处理，彻底麻醉后对腹部进行备皮，将其固定于手术台，用碘酒进行消毒。接着沿中线剪开腹部皮肤及肌肉,使腹主动脉暴露,随后使用钝性分离器剥离,长度约为1.0cm，并对动脉小分支进行结扎。然后用动脉夹夹住动脉的两端,剪断腹主动脉,用9-0带针尼龙缝合线原位植入小口径人工血管。缝合人工血管长度约1.2cm，内径2.0mm，采用端端吻合术，缝合时以米字法缝合，每端8针。两端均缝好后，缓慢移除动脉夹以恢复血流,用棉花压住缝合处止血,该过程总缺血时间不超过30min。最后用庆大霉素冲洗伤口，3-0缝合线缝合腹部肌肉层和皮肤,碘酒消毒。术后不采取抗凝措施。
在2周时，将实验动物用异氟烷气体麻醉后取材，取材后对样品进行清洗、 OCT包埋、冰冻切片。随后采用CD31抗体免疫荧光染色观察血管支架的内皮化进程，评价其内皮化程度。
实验结果如附图6所示。由附图6可知，植入2周后，7.5μMDPT+7.5μMDPB 修饰的PBs的大部分管腔区域已被CD31阳性的EC覆盖，5μMDPT+10μMDPB修饰的PBs在吻合口处和血管中部观察到CD31阳性的EC覆盖。然而未修饰的PBs 仅在吻合口部位显示出EC覆盖。统计分析(图6B)显示，7.5μMDPT+7.5μMDPB 修饰PBs的内皮细胞覆盖率为84.01±4.50％，是未修饰组(34.21±5.20％)的 2倍以上，也显著高于5μMDPT+10μMDPB修饰的PBs(59.26±5.94％)。由以上结果可知，7.5μMDPT+7.5μMDPB修饰PBs是能够实现短期有效抗凝血和长期促进快速内皮化的最优修饰方案
实施例2：其他修饰分子对PBs的修饰：为了检测其他功能性修饰分子也可与两亲性分子结合并修饰在PBs内腔表面，利用抗凝分子肝素与两亲性分子 DSPE-PEG合成了DSPE-PEG-Heparin(DPH)；并利用两亲性分子DPPE-PEG与促进内皮化分子CD-34抗体合成了DPPE-PEG-antiCD34(DP-34)。并分别检测了DPH 修饰PBs的抗凝性能与DP-34的促进EPC捕获性能。其具体步骤如下：
具有抗凝能力的功能性分子肝素与DSPE-PEG结合，制备功能性修饰分子 DPH。将肝素钠(50mg)与交联剂EDC(10mg)和NHS(5mg)共同溶解在2mLDMF溶液中活化。随后，将DSPE-PEG-NH2(10mg)加入上述溶液中。将反应物在室温搅拌 24小时。使用分子量为8000的透析袋将产物在去离子水透析3天，随后冻干以获得DPH粉末。
具有内皮捕获能力的功能性分子anti-CD34与DPPE-PEG结合，制备功能性修饰分子DP-34；将等摩尔量的DPPE-PEG-NHS和anti-CD34在0.1M碳酸氢钠溶液(pH8.3-8.5)中共同孵育，4℃过夜反应。使用分子量为100kDa的超滤管将产物在PBS缓冲液中超滤浓缩，随后冻干以获得DP-34粉末。
DPH与DP-34修饰PBs内腔
为了检测功能性分子DPH修饰对PBs血液相容性及促进内皮化能力的改善，用7.5μMDPH+7.5μMDP-34，反应10min，修饰PBs内腔，具体修饰方法与前文相同。
7.5μMDPH+7.5μMDP-34修饰对PBs血液相容性的影响：将7.5μMDPH+7.5 μMDP-34修饰PBs与未修饰PBs并联，随后连接在用医用输液管组建而成的环状通路中，在保证密闭的情况下，将通路两端通过留置针与兔颈动脉和颈静脉分别连接起来，构成一个体外血液循环回路。循环过程中不使用任何抗凝剂。血液循环2h后，将7.5μMDPH+7.5μMDP-34修饰PBs与未修饰PBs取下，用生理盐水清洗，随后用体式显微镜拍照。实验结果如附图7所示。
7.5μMDPH+7.5μMDP-34修饰对PBs促进EPCs捕获的影响：将EPCs用DiO 溶液标记，在培养基中重悬，制备成浓度为2×105细胞/mL的细胞悬液。将7.5 μMDPH+7.5μMDP-34修饰的PBs与未修饰的PBs分别接到流动培养生物反应器中，将混合细胞悬液放入培养瓶中，利用无菌硅胶管连接培养瓶、PBs血管和蠕动泵。设置蠕动泵转速使培养基流动流速为12.41cm/s，以模拟体内血液流动状态。在37℃和5％CO2培养2小时后，收集样品并用多聚甲醛固定，在共聚焦显微镜下观察样品管腔表面捕获的EPCs细胞。实验结果如附图8所示。
由附图7可知，在不给予抗凝的情况下，未修饰PBs组在兔半体内动静脉分流实验中形成明显的血栓，血管内腔完全堵塞(图7A)，而经过7.5μMDPH+7.5 μMDP-34修饰后，血管内腔维持通畅，几乎没有明显的血栓形成(图7B)。以上结果证明7.5μMDPH+7.5μMDP-34修饰能够有效发挥抗凝作用，提高PBs的血液相容性。
由附图8可知，未修饰PBs管腔表面对于模拟血液流动状态下EPCs的捕获能力较差(图8A)，而随着PBs经过7.5μMDPH+7.5μMDP-34修饰后，其对于 EPCs的捕获能力明显增加(图8B)。由以上结果可知，7.5μMDPH+7.5μMDP-34 修饰能够有效提高PBs的EPCs捕获性能，从而促进PBs快速内皮化进程。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种无损修饰的含有活细胞的血管替代物，其特征在于，包括含有活细胞的血管替代物以及通过两亲性分子修饰在所述的含有活细胞的血管替代物上的抗凝分子和促内皮化分子；所述的两亲性分子为含有末端官能团的聚乙二醇-磷脂DP；
与两亲性分子结合抗凝分子和与两亲性分子结合促内皮化分子的摩尔比为1:1-1:2；
所述的无损修饰的含有活细胞的血管替代物的制备方法，采用下述步骤：
将两亲性分子结合抗凝分子和促内皮化分子制成带有功能基团的DP粉末，将DP粉末溶于生理盐水，制备成5-20μM的DP-功能分子溶液；将DP-功能分子溶液添加到无损修饰的含有活细胞的血管替代物的管腔中；室温下孵育1-15 min后，用生理盐水冲洗三次即得。
2.根据权利要求1所述的无损修饰的含有活细胞的血管替代物，其特征在于，所述的聚乙二醇-磷脂DP为十四酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DMPE-PEG、十六酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DPPE-PEG、十八酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DSPE-PEG中的一种，末端官能团为氨基、羧基、马来酰亚胺、炔基、叠氮中的一种。
3.根据权利要求1所述的无损修饰的含有活细胞的血管替代物，其特征在于，所述的抗凝分子为水蛭素、比伐卢定、或者肝素中的一种；所述的促内皮化分子为TPS多肽、YIGSR多肽、CD34抗体、VEGFR-2抗体、NO缓释分子、有机硒SeCA中的一种。
4.根据权利要求1所述的无损修饰的含有活细胞的血管替代物，其特征在于， DP-功能分子溶液的修饰浓度应为15μM；修饰时间为10min。
5.根据权利要求1所述的无损修饰的含有活细胞的血管替代物，其特征在于，所述无损修饰的含有活细胞的血管替代物为同种异体静脉血管、同种异体动脉血管、体内组织工程血管、纤维增强型体内组织工程血管中的一种。
6.根据权利要求1所述的无损修饰的含有活细胞的血管替代物，其特征在于，所述的活细胞为内皮细胞、干/祖细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、干/祖细胞分化的内皮细胞、干/祖细胞分化的平滑肌细胞、巨噬细胞、肌成纤维细胞中的至少一种。
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