CN114949362B - 一种体内快速再细胞化组织工程血管及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种体内快速再细胞化组织工程血管及其制备方法，包括：将聚乙醇酸和聚乙二醇溶解于有机溶剂中制备成纺丝液，按照一定比例静电纺丝制备得到特殊管壁结构的管状聚合物复合支架，管壁支架外侧纤维含有更高比例聚乙二醇；将种子细胞种植于所述特殊管壁结构的管状聚合物支架，在一定培养条件下模拟机体动脉搏动流条件灌流培养3周~3月；将所得到的工程血管利用脱细胞方法脱去管壁细胞成分，获得由仿生结构的细胞外基质构成的组织工程血管。本发明的组织工程血管有特殊仿生细胞外基质的三维结构，能实现植入体内快速再细胞化，在体内原位重构新生血管，提升血管性能，满足临床“即需即用”要求。

Description

一种体内快速再细胞化组织工程血管及其制备方法
技术领域
本发明属于医疗器械技术领域，更具体地，涉及一种体内快速再细胞化组织工程血管及其制备方法。
背景技术
随着社会的发展和人类生活水平的提高，心血管疾病已经成为危害人类健康的第一死亡原因，其中小口径人工血管（内径小于6mm）的临床需求日益增加。目前，我国每年周围动脉疾病手术约87万例，美国每年周围动脉疾病手术则超过10万例；我国每年血管外伤手术15万例，美国每年血管外伤手术7.3万例；我国每年冠脉搭桥手术超过5万例，未来十年将达到每年15万例，美国每年冠脉搭桥手术50万例，每位患者平均需要桥血管约2.5根，由于自体静脉移植物需手术获取，常易导致患者手术时间延长、移植物切口感染、ICU时间延长，许多患者大隐静脉不能满足临床要求。全球每年约有超过350万例患者进行血液透析，每位患者需要安全且可重复使用的动静脉（AV）通道作为透析通路。中国血液透析病例信息登记系统(CNRDS)显示血液透析率逐年增加(13~14%/年)，我国现有慢性肾功能不全患者超过1.2亿，2020年注册慢性透析患者超过80万例，预计2030年将超过230万例，其中使用动静脉造瘘患者占87%，中心静脉置管占10%，人工血管通路约占1%；美国的慢性血透患者每年约60万例，其中使用动静脉造瘘的患者占65%，中心静脉置管占15%，人工血管通路占20%，且人工血管通路使用有增加趋势。行动静脉造瘘术的患者需等待3~6月后动静脉瘘才能作为透析通路使用，但其中约三分之一到一半患者动静脉瘘在等待3-6月后无法使用，且该通路易感染、易血栓形成或形成动脉瘤而衰败临床无法使用；中心静脉置管只能作为临时透析通路使用，病人年感染率达200%；传统膨体聚四氟乙烯（ePTFE）人工血管易感染，2年再次通畅率约50%，5年通畅率极低。
现有商业化小口径人工血管（如特氟龙、聚氨酯、同种异体或异种异体来源脱细胞血管）通畅率低、易形成血栓、感染而影响临床效果，主要原因是管壁无法有效再细胞化包括内皮化和管壁血管平滑肌细胞再细胞化，因此临床急需研发性能优异、可临床转化的小口径人工血管。
传统组织工程技术构建小口径组织工程血管移植物(tissue engineeringvascular graft, TEVG)需数月，制备费用高昂，人体内使用的安全性尚不确定，还需特殊方法贮存、运送直至手术，故该技术不适合临床推广应用。原位组织工程技术是将组织工程血管直接植入体内，招募内源性细胞原位再生血管，从而避免传统组织工程技术中体外细胞分离、培养、细胞-支架复合等一系列复杂过程，且满足临床“即需即用”，临床推广将具有极大优势。但目前原位组织工程研发存在明显不足，如血管内皮化不足导致血栓形成，管壁血管平滑肌细胞再细胞化不充分导致感染或动脉瘤形成等，远期通畅率不高，严重制约临床转化。
发明内容
针对现有技术存在的人造血管管壁无法再细胞化或再细胞化缓慢、通畅率低、易感染、衰败率高等缺陷，本发明提供了一种体内快速再细胞化组织工程血管及其制备方法，其利用生物材料改性技术并结合组织工程仿生技术，显著增强种子细胞在可降解支架材料上粘附、生长和增殖，培养过程中可降解聚合物复合支架完全降解，缩短培养周期，并通过脱细胞技术，获得脱细胞基质组织工程血管，具有特殊仿生细胞外基质3D结构，该仿生细胞外基质结构允许血管植入体内实现体内快速再细胞化，在体内原位重构新生血管，提升血管性能，满足临床“即需即用”要求，推动临床转化。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种体内快速再细胞化组织工程血管的制备方法，包括:
S1:将聚乙醇酸和聚乙二醇分别溶解于有机溶剂中制备成纺丝液，将两种纺丝液按照一定比例静电纺丝制备得到特殊管壁结构的管状聚合物复合支架，所述管状聚合物复合支架内侧管壁的聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比高于外侧管壁聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比；
S2：将种子细胞种植于所述特殊管壁结构的管状聚合物复合支架，在一定培养条件下模拟机体动脉搏动流灌流培养3周-3月，获得由种子细胞和细胞外基质构成的工程血管；
S3：将所述工程血管利用脱细胞方法脱去管壁细胞成分，获得由细胞外基质构成的组织工程血管。
优选的，所述步骤S1中管状聚合物复合支架内侧管壁的聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比为15:1-50:1，外侧管壁的聚乙醇酸和聚乙二醇纺丝液的质量比为5:1-15:1。
优选的，所述管状聚合物支架内径为1~35mm，管壁厚度0.01~3.5mm，长度0.5~120cm，支架管壁孔隙率85~99.9%。
优选的，所述步骤S2中模拟机体动脉搏动流培养条件为：
先静态体外培养1-10天，再在10-90mmHg压力的动脉搏动流下培养6-8天，然后将动脉搏动流提高到90-10mmHg继续培养，在培养过程的最后一周，将动脉搏动流压力提高到110-160mmHg培养。
优选的，所述步骤S3中脱细胞的步骤为：
将所述培养管状组织放入配置好的脱细胞试剂中，室温下处理1～3h，然后每1～3h更换一次所述脱细胞试剂，共更换3～6次，最后获得脱细胞组织工程血管；
所述脱细胞试剂由3-[(3－胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、NaCl和NaOH和无菌去离子水制备而成。
优选的，所述管状聚合物复合支架长均匀接种0.1-3.0x106个细胞/厘米。
优选的，所述种子细胞包括但不限于：成体人或哺乳动物的血管平滑肌细胞、成纤维细胞、脐静脉/脐动脉血管平滑肌细胞、间充质干细胞和诱导多功能干细胞分化而来的血管平滑肌细胞、成纤维细胞。
优选的，所述种子细胞使用单一供体或细胞库来源，采用原代-10代细胞，优选原代-4代细胞。
按照本发明另一个方面，还提供了一种体内快速再细胞化的组织工程血管，所述人造血管由如下步骤制备而成：
S1:将聚乙醇酸和聚乙二醇分别溶解于有机溶剂中制备成纺丝液，将两种纺丝液按照一定比例静电纺丝制备得到特殊管壁结构的管状聚合物复合支架，所述管状聚合物复合支架内侧管壁的聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比高于外侧管壁聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比；
S2：将种子细胞种植于所述管状聚合物复合支架，在一定培养条件下模拟机体动脉搏动流条件灌流培养3周~3月，获得由种子细胞和细胞外基质构成的工程血管；
S3：将所述工程血管利用脱细胞方法脱去管壁细胞成分，获得由细胞外基质构成的组织工程血管。
优选的，所述组织工程血管的细胞外基质蛋白包括但不限于胶原蛋白I、胶原蛋白IIII。
按照本发明的第三个方面，还提供了一种上述组织工程血管的应用，所述应用包括用作食管、气管、输尿管、尿道、胆道、输卵管、输精管替代物，和/或制备同种异体生物心脏瓣膜，和/或用作外科手术补片。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
（1）本发明提供的一种体内快速再细胞化组织工程血管及其制备方法，选用聚乙醇酸含和聚乙二醇按照一定比例静电纺丝方法制备具有特殊管壁结构的可降解聚合物复合支架，管壁支架外侧纤维相比管壁内侧纤维含有更高比例聚乙二醇，将种子细胞种植于该支架，在一定条件下模拟机体动脉搏动流条件体外灌流培养，培养过程中可降解聚合物支架完全降解，获得由种子细胞和细胞外基质构成的工程血管，再通过脱细胞处理得到由仿生结构的细胞基质组成的组织工程血管，本发明获得的脱细胞基质组织工程血管由于具有特殊仿生细胞外基质3D结构，该仿生结构的细胞外基质允许植入体内后脱细胞基质血管快速再细胞化、分泌新生细胞外基质，促进血管管壁细胞外基质自我修复和更新，抵抗感染，同时脱细胞基质血管管腔快速内皮化（1周~1月），提高血管通畅率，优于传统人工血管。
（2）本发明提供的一种体内快速再细胞化组织工程血管及其制备方法，可降解聚合物复合支架在体外培养中复合支架纤维和单纯聚乙醇酸纤维相比，可促进细胞粘附，细胞种植成功率提高，该管壁结构较聚乙醇酸单一材料相比，培养过程中特别是培养早期阶段，种子细胞种植、粘附于含有聚乙二醇的支架纤维，细胞不易脱落；在静态和动态灌流培养过程中管壁外侧聚乙二醇比例高而优先降解，优先降解的孔隙更利于管壁种子细胞向管壁内侧迁移、增殖，管壁内侧聚乙醇酸比例高而持续缓慢降解，从而保持支架材料管壁的力学性能，克服了传统组织工程技术中种子细胞种植到支架材料存活数量不足、生长缓慢等缺点。
（3）本发明提供的一种体内快速再细胞化组织工程血管及其制备方法，采用静态培养和模拟机体动脉搏动流灌流培养结合的方式，促进种子细胞在管壁支架材料内外侧纤维表面均一生长、迁移、增殖，加快合成细胞外基质蛋白，细胞在支架上分泌细胞外基质蛋白包括但不限于I型、III型胶原纤维，管腔内壁结构光滑、均一，管壁不易破损，具有良好的力学性能，大大提高了血管体外培养成功率，节约培养成本，更具有商业化优势。
（4）本发明提供的一种体内快速再细胞化组织工程血管及其制备方法，其种子细胞包括但不限于：成体人血管平滑肌细胞、人成纤维细胞，人脐动脉、人脐静脉血管平滑肌细胞，以及人间充质干细胞包括人脂肪干细胞、人诱导多功能干细胞分化而来的人血管平滑肌细胞、人成纤维细胞，其他哺乳动脉来源（包括猪、牛、羊等）成体血管平滑肌细胞、成纤维细胞，以及间充质干细胞包括脂肪干细胞、诱导多功能干细胞分化而来的血管平滑肌细胞、成纤维细胞。其来源广泛不受限制，易于大规模商业化培养。
附图说明
图1是本发明实施例提供的管状支架的示意图；
图2是本发明实施例提供的管状支架外壁SEM形貌图；
图3是本发明实施例提供的管状支架内壁SEM形貌图；
图4是本发明实施例提供的管状支架截面SEM形貌图；
图5是本发明实施例提供的管状支架截面SEM形貌图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明利用静电纺丝技术构建聚乙醇酸和聚乙二醇具有特殊管壁结构的可降解聚合物复合支架，管壁支架外侧纤维含有更高比例聚乙二醇，将种子细胞种植于该支架，在一定条件下模拟机体动脉搏动流条件下体外灌流培养，培养过程中可降解聚合物降解，获得由种子细胞和细胞外基质构成的工程血管，再通过脱细胞处理得到由仿生结构的细胞外基质构成的组织工程血管，其具体制备方法步骤如下：
S1:制备特殊管壁结构的管状聚合物复合支架
将聚乙醇酸和聚乙二醇分别溶解于有机溶剂中获得均一稳定的纺丝液，将两种纺丝液按照一定比例进行静电纺丝，利用特氟龙涂层金属杆接收，获得取向纤维管状聚合物复合支架，所述管状聚合物复合支架内侧管壁的聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比高于外侧管壁聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比；
具体的，纺丝液中聚乙醇酸浓度为1~500mg/ml，聚乙二醇浓度1~500mg/ml，管状聚合物复合支架内侧管壁的聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比为15:1-50:1，外侧管壁的聚乙醇酸和聚乙二醇纺丝液的质量比为5:1-15:1。静电纺丝纤维直径为5纳米~50微米；有机溶剂包括但不限于六氟异丙醇、三氯甲烷、等中的一种或多种。
在组织工程血管的制备中支架制备至关重要，在本申请中选用聚乙醇酸和聚乙二醇两种聚合物作为纺丝液制备具有特殊管壁结构的可降解聚合物复合支架，管壁支架外侧纤维含有更高比例聚乙二醇，其中在培养早期由于管壁细胞还未充分生长和增殖，聚乙醇酸纤维可保持支架的力学性能，聚乙二醇纤维能够在培养早期促进种子细胞的粘附、迁移和增殖，并保证静态和搏动流条件下管壁有足够种子细胞生长，两种复合材料纤维结构在培养和生长过程中逐渐降解，且聚乙二醇纤维降解快于聚乙醇酸，管壁外侧纤维聚乙二醇比例高会部分优先降解，优先降解形成的孔隙更利于管壁种子细胞向管壁内侧迁移、增殖，管壁内侧聚乙醇酸比例高而持续缓慢降解，从而维持支架材料管壁的力学性能，因此在不影响复合纤维支架管壁力学性能情况下进一步促进管壁中层、内层细胞快速迁移、生长，从而管壁细胞分泌更多、更快分泌细胞外基质，提高培养血管管壁力学性能，显著增加培养成功率，缩短培养时间。
如图2、图3所示分别是本发明实施例提供的管状支架外壁和内壁纤维的SEM形貌图，从图中可以看出管状支架的外壁纤维明显比内壁纤维细，这是由于内壁的聚乙醇酸比例高于外壁，培养过程中外壁纤维降解速度快，促进细胞生长，内壁纤维降解慢维持管壁力学性能，如图4、图5所示是本发明实施例提供的管状支架截面SEM形貌图，可以看出其管壁为高孔隙结构。
S2：工程血管体外培养
将种子细胞种植到管状聚合物复合支架，先静态培养1-10天，再模拟机体动脉搏动流灌流培养3周-3月，让种子细胞在复合支架充分生长、增殖，管壁聚合物逐渐降解，同时管壁细胞分泌细胞外基质逐渐增强管壁力学性能，最后获得由种子细胞和细胞外基质构成的工程血管；
具体的，模拟机体动脉搏动流培养条件为：先静态体外培养1-10天，再在10-90mmHg动脉搏动流下培养6-8天，然后将动脉搏动流提高到90-110mmHg继续培养，在培养过程的最后一周在支架材料完全降解后将动脉搏动流压力提高到110-160mmHg继续培养，显著提升管壁力学性能，体外培养周期为3周-3月，优选为6-12周，所有动态培养均为灌流培养。
种子细胞种植是组织工程血管制备中十分关键的步骤之一，在本申请中种子细胞包括但不限于：成体人血管平滑肌细胞、人成纤维细胞，人脐动脉、人脐静脉血管平滑肌细胞，以及人间充质干细胞包括人脂肪干细胞、人诱导多功能干细胞分化而来的人血管平滑肌细胞、人成纤维细胞，其他哺乳动脉来源（包括猪、牛、羊等）成体血管平滑肌细胞、成纤维细胞，以及间充质干细胞包括脂肪干细胞、诱导多功能干细胞分化而来的血管平滑肌细胞、成纤维细胞。
更具体的，细胞使用单一或多个供体，或细胞库来源，采用原代-10代细胞，最优选择原代-4代细胞，细胞体外培养3周-3月，最优体外培养6-12周。细胞培养液包含高糖、胰岛素(0.1-5.0mg/ml)、生长因子bFGF和（或）EGF，青霉素(1-300U/ml),链霉素(1-500mg/ml),维生素C (0.5-800mg/ml)，比如DMEM，培养0-4周培养基加入5-50%人或哺乳动物血清，以后每3-7天更换培养基时降低人或哺乳动物血清浓度1-20%，直至培养结束。
更具体的，每厘米长复合支架均匀接种0.1-3.0x106个细胞，最优化接种密度1.0-2.0x106个细胞/厘米。
在上述培养条件下可降解聚合物复合支架纤维逐渐降解，得到由种子细胞和种子细胞分泌的细胞外基质构成的工程血管。在本申请中采用静态培养加模拟机体动脉搏动流培养，促进种子细胞在管壁支架材料内外侧均一生长、增殖，合成细胞外基质，细胞在支架上分泌细胞外基质包括但不限于I型胶原纤维、III型胶原纤维，保证管壁具有良好的力学性能，其爆破压1000~5000mmHg，缝合张力100~250g，弹性模量0.5-3.0MPa，特别是早期动态培养过程中管壁不易破损，且管腔内壁结构光滑，体外培养成功率由传统技术80-85%提高到95-100%，更具有商业化优势。
S3：脱细胞处理
将所述工程血管利用脱细胞处理，获得比机体动脉管壁疏松细胞外基质的3D结构，有利于血管植入体内管壁再细胞化，又保证细胞外基质构成得管壁具有优异力学性能。
脱细胞后的组织工程血管主要由细胞外基质构成，可以残留微量聚乙醇酸和（或）聚乙二醇，该血管壁细胞外基质蛋白包括但不限于胶原蛋白I、胶原蛋白III，管壁细胞数量小于1-2%，若细胞完全脱除，细胞DNA含量低于0.1%-0.001%，同时脱细胞后对血管力学性能无影响，可以长期在常温保存，保证临床即需即用，不同于传统组织工程血管需要等待培养、还需特殊方法贮存和运送。
脱细胞技术可以采用化学试剂、电处理等脱细胞方式处理。在一个优选的实施例中，具体脱细胞步骤如下：
（1）配制脱细胞试剂：将3-[(3－胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸、EDTA -2Na、NaCl、NaOH和无菌去离子水制备成溶液，其摩尔浓度分别为1～40mmol/L、0.5～50mmol/L、0.01～1.0mmol/L和0.1～10.0mol/L，其中3-[(3－胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸试剂摩尔浓度优选为10mmol/L，EDTA-2Na2摩尔浓度优选为30mmol/L，NaCl摩尔浓度优选为0.15mmol/L、NaOH摩尔浓度优选为2mol/L；
(2)脱细胞处理：将所述工程血管放入脱细胞试剂中，室温下处理1～5h，然后每1～5h更换一次所述脱细胞试剂，共更换2～8次，优选3次，获得脱细胞基质组织工程血管；
（3）洗涤步骤：将步骤(2)中获取的脱细胞基质组织工程血管采用无菌PBS溶液充分洗涤，以洗脱残留的脱细胞试剂。
下面通过具体的不同实施例来对本发明提供的一种快速再细胞化组织工程血管及其制备方法进一步详细说明。以下为具体实施例：
实施例1
S1: 制备管状聚合物复合支架
将聚乙醇酸和聚乙二醇分别溶解于六氟异丙醇溶剂中，获得均一稳定的纺丝液，支架管壁厚度480μm，纺丝过程中采用两种质量比的纺丝液，内侧240微米厚度管壁聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比例为30:1，外侧240微米厚度管壁聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比例为5:1，获得取向纤维管状聚合物复合支架；
S2：管状聚合物复合支架种植种子细胞、体外灌流培养
将第3代人主动脉血管平滑肌细胞重新悬浮于10% FBS 的低糖DMEM培养液中，1.0x106/cm密度种植于管状聚合物复合支架，置于37℃、5％ CO2培养箱中静态培养5天，然后30mmHg搏动流培养1周，将搏动流提高到60mmHg培养1周，90mmHg培养1周，120mmHg培养3周获得工程血管，培养时间小于7周。
S3：脱细胞处理
(1)配制脱细胞试剂
Figure 449963DEST_PATH_IMAGE001
按照上表配方，将精准称量的试剂加入干净的广口玻璃瓶中，摇床上振荡2～3h，使试剂充分溶解，此时溶液变澄清，制备成脱细胞试剂，于4℃保存备用。
将工程血管放入无菌离心管中，脱细胞试剂室温下灌流处理5h脱细胞完成后，换用无菌PBS溶液灌流、洗涤3h，洗去脱细胞试剂，最后将处理好的脱细胞组织工程血管置入生理盐水4℃保存备用。
实施例2
S1: 制备管状聚合物复合支架
将聚乙醇酸和聚乙二醇分别溶解于六氟异丙醇溶剂中，获得均一稳定的纺丝液，支架管壁厚度480μm，纺丝过程中采用两种质量比的纺丝液，内侧240微米厚度管壁聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比例为15:1，外侧240微米厚度管壁聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比例为5:1，获得取向纤维管状聚合物复合支架；
S2：管状聚合物支架种植种子细胞、体外灌流培养将第3代人脐静脉血管平滑肌细胞，重新悬浮于10% FBS 的低糖DMEM培养液中, 0.8x106/cm密度种植于管状聚合物复合支架，置于37℃、5％ CO2培养箱中静态培养5天，然后给予30mmHg搏动流培养1周，将搏动流提高到60mmHg培养1周，90mmHg培养1周，120mmHg培养2周获得工程血管，培养时间不大于8周。
S3：脱细胞处理
脱细胞的步骤和实施例1中相同，参考实施例1。
实施例3
S1: 制备管状聚合物复合支架
将聚乙醇酸和聚乙二醇分别溶解于六氟异丙醇溶剂中，获得均一稳定的纺丝液，支架管壁厚度480μm，纺丝过程中采用两种质量比的纺丝液，内侧240微米厚度管壁聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比例为30:1，外侧240微米厚度管壁聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比例为5:1，获得取向纤维管状聚合物复合支架；
S2：管状聚合物支架种植种子细胞、体外灌流培养
将第3代人成纤维细胞，重新悬浮于10% FBS 的低糖DMEM培养液中，0.5x106/cm密度种植于管状聚合物复合支架，置于37℃、5％ CO2培养箱中静态培养5天，然后给予30mmHg搏动流培养1周，将搏动流提高到60mmHg培养1周，90mmHg培养1周，120mmHg培养2周获得工程血管，培养时间小于6周。
S3：脱细胞处理
脱细胞的步骤和实施例1中相同，参考实施例1。
实施例4
S1: 制备管状聚合物复合支架
将聚乙醇酸和聚乙二醇分别溶解于六氟异丙醇溶剂中，获得均一稳定的纺丝液，支架管壁厚度480μm，纺丝过程中采用两种质量比的纺丝液，内侧240微米厚度管壁聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比例为50:1，外侧240微米厚度管壁聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比例为5:1，获得取向纤维管状聚合物复合支架；
S2：管状聚合物支架种植种子细胞、体外灌流培养
将第3代由人诱导多功能干细胞分化而来的血管平滑肌细胞，重新悬浮于10% FBS的低糖DMEM培养液中，1.0x106/cm密度种植于管状聚合物复合支架，置于37℃、5％ CO2培养箱中静态培养5天，然后30mmHg搏动流培养1周，将搏动流提高到60mmHg培养1周，90mmHg培养1周，120mmHg培养3周获得工程血管，培养时间小于7周。
S3：脱细胞处理
脱细胞的步骤和实施例中相同，参考实施例1。
实施例5
将实施例1-4中所述的工程血管脱细胞处理前、后分别进行爆破压、缝合张力以及最大拉伸应力和最大拉伸应变分别进行检测和比较，检测结果脱细胞前、后差异均不具有统计学意义，具体测试方法及结果如下：
(1)爆破压检测
爆破压力由自制的、带有精密压力表的测压系统完成。测压系统中填满PBS缓冲液，将长度为8cm待测样本连接于测压系统，缓慢增加测压系统压力，直至压力骤降，检测视频发现管道出现破口，记录下最大压力值，此值即为爆破压。
(2)缝合张力检测
缝合张力是指缝线将组织撕裂时的力量，此处依照ANSI/AAMI/ISO 7198标准进行测定。准备2cm长的待测样本，将6-0Prolene线缝于管道的一端，边距为2mm，间隔120度角另缝一根，总共缝3针，将每根缝线单独打结形成一个环，将管道的无缝线端和其中1根缝线分别固定在万能拉力试验机上，调节拉伸速度为30mm/min，记录下最大拉力，依次固定另外2根缝线进行测试，将3次测试结果取平均值所得结果即为缝合张力。
(3)最大拉伸应力和最大拉伸应变
将待测组织管道剪成5mm宽的圆环，测定并记录其厚度和直径。将其两端挂在回型针上，然后将2根回型针固定在万能拉伸试验机上，初始拉伸长度为拉断长度的10％左右，调节拉伸速度为30mm/min，直到血管环被拉断，即为最大拉伸应力和最大拉伸应变。
脱细胞前：
表1 实施例1-4中的组织工程血管脱细胞处理前的力学性能测试结果
Figure 101524DEST_PATH_IMAGE002
脱细胞后：
表2 实施例1-4中的组织工程血管脱细胞处理后的力学性能测试结果
Figure 474737DEST_PATH_IMAGE003
由表1和表2数据可知本发明制备的组织工程血管生物相容性好，具有较好的力学性能，易缝合，能承受较大的爆破压力以及拉伸力，可以应用于临床，且本发明脱细胞处理方法对工程血管壁的力学性能影响不大。
综上所述，本发明提供的一种体内快速再细胞化的组织工程血管具有以下优点：
（1）即需即用：避免血管培养等待时间，也无需通过外科手术方式从患者体内获取种子细胞；
（2）具有再生和自我修复功能：血管植入体内后，患者自身细胞重构脱细胞基质血管，促进血管再生并具有自我修复功能；
（3）无免疫排斥反应：不需要供体组织配型或终生使用免疫抑制剂来抑制免疫反应；
（4）抗感染：自身细胞重构血管官腔和管壁，细胞外基质自我更新，可在血管穿刺后自动恢复自身结构，抵抗感染，防止血管衰败；
（5）通畅率高：作为透析管道植入机体，可以即刻穿刺使用，无需等待，同时可抵抗血栓形成，耐久性好，长期使用。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种体内快速再细胞化组织工程血管的制备方法，其特征在于，包括:
S1:将聚乙醇酸和聚乙二醇分别溶解于有机溶剂中制备成纺丝液，将两种纺丝液按照一定比例静电纺丝制备得到管状聚合物复合支架，所述管状聚合物复合支架内侧管壁的聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比高于外侧管壁的聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比；所述管状聚合物复合支架内侧管壁的聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比为15:1-50:1，外侧管壁的聚乙醇酸和聚乙二醇纺丝液的质量比为5:1-15:1；
S2：将种子细胞种植于所述管状聚合物复合支架，在一定培养条件下模拟机体动脉搏动流条件培养3周~3月，获得由种子细胞和细胞外基质构成的工程血管；
S3：将所述工程血管利用脱细胞方法脱去管壁细胞成分，获得由细胞外基质构成的组织工程血管。
2.如权利要求1所述的体内快速再细胞化组织工程血管的制备方法，其特征在于，所述管状聚合物支架内径为1~35mm，管壁厚度0.01~3.5mm，长度0.5~120cm，支架管壁孔隙率85~99.9%。
3.如权利要求1所述的体内快速再细胞化组织工程血管的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中模拟机体动脉搏动流培养条件为：
先静态体外培养1-10天，再在10-90mmHg压力的动脉搏动流下培养6-8天，然后将动脉搏动流提高到90-110mmHg继续培养，在培养过程的最后一周将动脉搏动流压力提高到110-160mmHg培养。
4.如权利要求1所述的体内快速再细胞化组织工程血管的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中脱细胞的步骤为：
将所述工程血管放入配置好的脱细胞试剂中，室温下处理1～3h，然后每1～3h更换一次所述脱细胞试剂，共更换3～6次，最后获得由细胞外基质构成的组织工程血管；
所述脱细胞试剂由3-[(3－胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、NaCl和NaOH和无菌去离子水制备而成。
5.如权利要求1所述的体内快速再细胞化组织工程血管的制备方法，其特征在于，所述管状聚合物复合支架接种密度为0.1-3.0x106个细胞/厘米。
6.如权利要求1所述的体内快速再细胞化组织工程血管的制备方法，其特征在于，所述种子细胞包括但不限于：成体人或哺乳动物的血管平滑肌细胞、成纤维细胞、脐静脉/脐动脉血管平滑肌细胞、间充质干细胞和诱导多功能干细胞分化而来的血管平滑肌细胞、成纤维细胞。
7.如权利要求1所述体内快速再细胞化组织工程血管的制备方法，所述种子细胞使用单一或多个供体或细胞库来源，采用原代-10代细胞。
8.一种体内快速再细胞化的组织工程血管，其特征在于，所述组织工程血管由如下步骤制备而成：
S1:将聚乙醇酸和聚乙二醇分别溶解于有机溶剂中制备成纺丝液，将两种纺丝液按照一定比例静电纺丝制备得到特殊管壁结构的管状聚合物复合支架，所述管状聚合物复合支架内侧管壁的聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比高于外侧管壁的聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比；所述管状聚合物复合支架内侧管壁的聚乙醇酸纺丝液和聚乙二醇纺丝液的质量比为15:1-50:1，外侧管壁的聚乙醇酸和聚乙二醇纺丝液的质量比为5:1-15:1；
S2：将种子细胞种植于所述管状聚合物复合支架，在一定培养条件下模拟机体动脉搏动流条件灌流培养3周~3月，获得由种子细胞和细胞外基质构成的工程血管；
S3：将所述工程血管利用脱细胞方法脱去管壁细胞成分，获得由细胞外基质构成的组织工程血管。
9.如权利要求8所述体内快速再细胞化的组织工程血管，其特征在于，所述组织工程血管的细胞外基质蛋白包括但不限于胶原蛋白I、胶原蛋白III。
10.如权利要求8所述的组织工程血管的应用，所述应用包括用作食管、气管、输尿管、尿道、胆道、输卵管、输精管替代物，和/或制备同种异体生物心脏瓣膜，和/或用作外科手术补片。
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