EA008824B1

EA008824B1 - Композиции экзотрансферазы c3 clostridium botulinum и способы лечения метастазирования опухолей

Info

Publication number: EA008824B1
Application number: EA200600687A
Authority: EA
Inventors: Лиза Маккеррахер; Дана Ласко
Original assignee: Биоаксон Терапетик Инк.
Priority date: 2003-09-29
Filing date: 2004-09-29
Publication date: 2007-08-31
Also published as: CN1886154A; WO2005030248A1; US20090142325A1; BRPI0414881A; IL174632A0; EA200600687A1; AU2004275449A1; EP1667709A4; EP1667709A1; US20060134140A1; US20090285833A1; US20080020000A1; NO20061873L; KR20070051766A; NZ546253A; CA2539694A1; JP2007506795A

Abstract

Предоставлены фармацевтические композиции, каждая из которых содержит проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum или его функциональный аналог. Композиции могут использоваться для предотвращения или ингибирования бесконтрольной пролиферации, распространения и миграции метастазирующей опухолевой клетки при злокачественной опухоли млекопитающего. Каждая из композиций может влиять на два или большее количество событий, таких как пролиферация, миграция опухолевых клеток, ангиогенез и секреция металлопротеиназ.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям и способам, которые могут использоваться для лечения злокачественных опухолей и предотвращения опухолевого роста, связанного с метастазирующей злокачественной опухолью. В частности, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим конъюгат слитого белка, способный проникать в клетку, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 Оойпбшш ЬоШйпит. или его функциональный аналог, которые могут использоваться для предотвращения или ингибирования неконтролируемой пролиферации и распространения или миграции метастазирующих опухолевых клеток при злокачественной опухоли млекопитающего.

Предшествующий уровень техники

Злокачественные опухоли млекопитающих характеризуются неконтролируемым делением популяции злокачественных клеток в ткани млекопитающего. Если популяция клеток расположена в ткани, такое неконтролируемое деление злокачественной или раковой клетки может приводить к образованию в ткани первичной злокачественной опухоли. Если одна или несколько злокачественных клеток или кластер клеток мигрирует из участка локализованной популяции, укореняясь и бесконтрольно прорастая во втором участке или в дополнительных участках ткани, которые могут находиться вблизи от первого участка опухоли или могут быть удалены от первого участка, находясь, например, в другом органе или ткани, анатомически удаленной или отличной от первой ткани, то может возникать вторая опухоль или дополнительные опухоли во втором участке или дополнительных участках, соответственно, в результате бесконтрольного деления мигрировавшей злокачественной клетки или клеток. Также может происходить миграция одной или нескольких злокачественных клеток из локуса растущих во втором участке клеток в другие участки, и так далее, с образованием злокачественных опухолей в одном или нескольких участках ткани млекопитающего. Рост таких злокачественных опухолей часто обуславливает характерный ангиогенез или процесс васкуляризации ткани вблизи развивающейся опухоли, включающий в себя развитие новых капиллярных кровеносных сосудов или прорастание сосудов и образование тубулярной сети, причем такие новые сосуды обеспечивают поступление различных факторов, таких как питательные вещества, и факторы роста, которые необходимы и обеспечивают непрерывный рост опухоли.

Опухоль представляет собой патологическую массу ткани, которая является результатом интенсивного деления клеток, которое является бесконтрольным и прогрессирует, и также называется новообразованием. Опухоли могут быть доброкачественными (нераковыми) и злокачественными.

В настоящее время для лечения злокачественных опухолей млекопитающих, таких как человек, используются различные способы, включая, например, хирургические процедуры, при которых, например, опухоль и обычно некоторую прилегающую или близлежащую к опухоли ткань иссекают из участка опухоли в ткани. После удаления опухоли оставшаяся или краевая ткань остается вблизи участка опухоли у млекопитающего. Однако только при хирургическом вмешательстве у многих пациентов, особенно, с определенными типами злокачественных опухолей, такими как злокачественная опухоль, выбранная из группы, включающей злокачественную опухоль молочной железы, головного мозга, кишечника, кожи (меланома), почки и печени, возникнет рецидив злокачественной опухоли в виде образования и роста по меньшей мере одной добавочной или вторичной опухоли, часто в краях, оставшихся после иссечения первой опухоли и иногда в другой ткани или органах и в местах, удаленных от участка первой опухоли. Поэтому кроме хирургических методов при многих злокачественных опухолях также проводят комбинированную терапию, такую как введение цитотоксических химиотерапевтических лекарственных препаратов (например, винкристин, винбластин, цисплатин, метотрексат, 5-Ρϋ и т.д.) и/или лучевую терапию. Одна из трудностей такого подхода, однако, заключается в том, что радиотерапевтический или химиотерапевтический агент может быть токсичным для нормальных тканей на уровнях вводимой дозы, и часто создает для пациента угрожающие для жизни побочные эффекты. Такие способы лечения злокачественных опухолей часто бывают безуспешными и могут иметь высокую вероятность ремиссии, что приводит к смерти пациента. Преимуществами некоторых наиболее современных методов лечения является нарушение регуляции клеточной передачи сигнала измененными или стимулированными генными продуктами в раковых клетках, например, применение тамоксифена при раке молочной железы и О1ееуес® (иматинибмезилат от Νονατίίκ) при хроническом миелоидном лейкозе (также обозначаемом как СМЬ).

Другим препятствием существующих способов является нацеленность на местный рецидив и на местный контроль заболевания при лечении злокачественных опухолей. Свыше 600000 пациентов ежегодно (в США) имеют локализованное злокачественное заболевание (без признаков отдаленного метастазирования) в момент его проявления, составляя около 64% всех пациентов с диагнозом злокачественной опухоли, исключая немеланомный рак кожи или карциному ίη δίΐιι. Для большинства таких пациентов хирургическая резекция заболевания является основным шансом на излечение, и свыше 400000 пациентов излечиваются после первичного лечения. К сожалению, примерно у 200000 (или около одной трети всех пациентов с локализованным заболеванием) возникает рецидив после первичного лечения. Число тех, у кого возникает местный рецидив заболевания, может составлять примерно до 133000 пациентов ежегодно (или около 21% от всех с локализованным заболеванием). Число тех, у кого рецидив возникает вследствие отдаленных метастазов заболевания, составляет около 68000 пациентов ежегодно (или

- 1 008824 около 11% пациентов с локализованным заболеванием). Приблизительно еще 100000 пациентов ежегодно умирают в результате неспособности контролировать местный рост заболевания.

Опухоли головного мозга являются особенно страшной формой злокачественных опухолей. Примерно одна треть первичных глиом (глиомы составляют примерно 1/3 всех опухолей головного мозга) приводит к смерти, и среднее время жизни пациентов с глиомой составляет примерно от 10 до 12 месяцев. У около 9% пациентов уровень жизни составляет 5 лет. Глиомы представляют собой нейроэктодермальные опухоли нейроглиального происхождения, и включают в себя астроцитому, происходящую из астроцитов, олигодендроглиому, происходящую из олигодендроглиоцитов, и эпендимому, происходящую из эпендимальных клеток. Некоторые исследования указывают на тот факт, что для лечения этих агрессивных опухолей необходимы комбинированные способы лечения. Наиболее частый тип опухоли головного мозга обусловлен метастазами, и в течение года в США диагностируют примерно от 100000 до 170000 опухолей головного мозга. Среднее время жизни составляет примерно от 2,9 месяцев до 3,4 месяцев. Лечение метастазирующих опухолей головного мозга, главным образом, осуществляют путем радиохирургии или резекции опухоли. Имеются сообщения, что наилучшим результатом лечения является сочетание хирургических методов с облучением, чем просто облучение. Первичными опухолями, которые чаще всего дают метастазы в головной мозг, включают в себя рак молочной железы, бронхиальный рак, карциному желудочно-кишечного тракта, карциному почки и злокачественную меланому. Метастазирующие опухоли головного мозга могут иметь бурное течение, особенно после удаления первичной опухоли. Больные, у которых подозревают злокачественную опухоль ЦНС (под которой в данном описании подразумевают и опухоли головного мозга, и рак головного мозга), могут быть идентифицированы по клиническим симптомам, таким как головная боль, кашель или рвота, припадки, изменение психического состояния, нарушение речи, нарушение зрения и/или паралич. Способ ингибирования метастазов первичной опухоли ЦНС у млекопитающего также входит в объем настоящего изобретения.

Ангиогенез

Большое количество механизмов, которые контролируют ангиогенез в нормальных тканях, изменены в присутствии злокачественных опухолей во время опухолевого роста. В образование и метастазирование опухолей вовлечен патологический ангиогенез. Как для здоровых тканей, для опухоли необходима связь с кровеносными сосудами для получения питательных веществ и кислорода и для удаления клеточных отходов. Таким образом, патологический ангиогенез важен для роста и распространения опухолей. Опухоли, для которых важен ангиогенез, включают в себя солидные злокачественные опухоли, а также доброкачественные опухоли, например, такие как нейрома слухового нерва, нейрофиброма, трахома и пиогенные гранулемы. В метастазах патологический ангиогенез важен по меньшей мере в двух аспектах. Образование кровеносных сосудов в опухолях позволяет опухолевым клеткам проникать в кровяное русло и циркулировать по организму. Ангиогенез поддерживает образование и рост новых опухолей, рассеянных опухолевыми клетками, которые покинули первичный участок или первичную опухоль, как это используется здесь.

Ангиогенез представляет собой комплексный процесс образования кровеносных сосудов. В этом процессе задействованы биохимические и клеточные события, в том числе (1) активация эндотелиальных клеток (ЕС) ангиогенным стимулом; (2) деградация внеклеточного матрикса, инвазия активированных ЕС в окружающие ткани, и миграция к источнику ангиогенного стимула; и (3) пролиферация и дифференцировка ЕС с образованием новых кровеносных сосудов (Ео1кшаи с1 а1., 1991, 1. ΒίοΙ. С1ет. 267: 10931-10934).

Контроль ангиогенеза является строго регулируемым процессом, в который вовлечены ангиогенные стимуляторы и ингибиторы. У здоровых людей и животных ангиогенез происходит в особых, ограниченных ситуациях. Например, ангиогенез в норме наблюдается при развитии плода и эмбриона, развитии и росте нормальных тканей и органов, заживлении ран, и при образовании желтого тела, эндометрия и плаценты.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к ингибированию ангиогенеза посредством проникающего в клетку конъюгата слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1ок1п6шт Ьо1и1тит, или его функциональный аналог, например, такой слитый белок как ВА-05.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к ингибированию ангиогенеза эффективным количеством фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1ок1п6шт Ьо1и1тит, или его функциональный аналог, например, такой слитый белок как ВА-05.

Передача сигнала КЬо и злокачественные опухоли

Семейство белков В1ю (также известных как гомологи Вак) были исследованы в отношении злокачественных опухолей. Вак (и В1оВ в качестве вторичной мишени) являются мишенями для лечения метастазирования молекулами, которые ингибируют посттрансляционные модификации. Однако исследования этих лекарственных средств сфокусированы на Вак и ограничены В1оВ среди других представителей семейства В1о, тогда как благодаря настоящему изобретению существует возможность воздействия

- 2 008824 на передачу сигнала ΡΙιοΛ. В1оВ и В1оС. В1оА, В1оВ и В1о С являются членами семейства В1о, специфично ингибируемыми слитым белком ВА-05. В некоторых исследованиях изофермент С3 применяли в качестве молекулярного зонда для определения вовлечения В1о, и были обнаружены значительные изменения в параметрах моделей ίη νίίτο, считающихся важными для злокачественных опухолей, например. для трансформации клеток. В таких исследованиях С3 использовали в различных способах. начиная длительной инкубацией в среде культуры ткани и заканчивая экспрессией гетерологичного гена. Преимуществом настоящего изобретения является тот факт. что способы по настоящему изобретению. композиции и такие как ВА-05 и введение ВА-05, вносят значительный вклад по сравнению с С3 за счет способности композиций по настоящему изобретению проникать внутрь опухолевых клеток и. таким образом, быстро инактивировать В1о при более низких дозах. Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что слитый белок по изобретению, такой как ВА-07, входящий в состав композиции, способен проникать как в опухолевые клетки, так и в эндотелиальные клетки, которые в отсутствие слитого белка могут образовывать новые кровеносные сосуды, поддерживающие рост опухоли.

Мутации регуляторных белков семейства В1о были обнаружены в клинических образцах злокачественных опухолей. Их примеры включают в себя ген ИЬС1 в гепатоцеллюлярной карциноме; р-190-А в геномной области, которая изменена в глиомах и астроцитомах; СВАЕ, который имеет мутации с потерей функции при лейкозе; и ЬАВС, обнаруженный в некоторых генных слияниях, найденных при остром миелоидном лейкозе. Точечные мутации, полученные методами генной инженерии активируют В1оА и вызывают трансформацию клеток ίη νίίτο.

Экспрессия генов семейства ВЬо при злокачественных опухолях человека

Малая ГТФаза В1о является клеточной мишенью ВА-05, и положительно регулируется при некоторых типах злокачественных опухолей, таких как злокачественная меланома и рак молочной железы.

В отличие от малой ГТФазы Вак, ГТФазы В1о не были идентифицированы обычными подходами как онкогены, хотя увеличивалось количество данных о нарушенной регуляции экспрессии гена В1о при злокачественных опухолях. Например, повышенные уровни мРНК В1оА наблюдали в опухоли зародышевых клеток яичек, а повышенные уровни мРНК В1оС наблюдали при воспалительном раке молочной железы и при аденокарциноме поджелудочной железы.

В проекте Сапсег Сспотс АпаЮту Рго)сс1 (ССАР) устанавливается взаимосвязь между экспрессией генов и участком малигнизирования. Данные доступны на транскрипционном уровне в библиотеках, полученных из злокачественных и нормальных клеток (ЫСВ1, 2002). Транскрипционные уровни измерены с использованием «меток Дад)», т.е., олигонуклеотидов длиной 10 оснований, которые уникально определяют ген. Имеющиеся данные по В1оА, В1оВ и В1оС I показывают положительную регуляцию В1оА и, в меньшей степени в этих исследованиях положительную реакцию В1оС в злокачественных опухолях головного мозга и молочной железы. Метки последовательности В1о А чаще присутствуют в библиотеках, полученных из злокачественных опухолей мозжечка и молочной железы, чем из соответствующей нормальной ткани. Уровни экспрессии повышаются в глиобластоме, но не в астроцитоме. Результат для астроцитомы соответствует снижению уровней белка В1оА в образцах астроцитарных опухолей. В злокачественных опухолях молочной железы и, в меньшей степени, в некоторых злокачественных опухолях головного мозга повышена экспрессия мРНК В1о С, а в аденокарциноме кишечника отмечается отрицательная ее регуляция.

Однако относительные уровни кДНК В1о в таких библиотеках могут не быть непосредственно связанными с действием В1 о в клетке, регуляция которой сложная и в нее вовлечено большое количество других продуктов генов.

Белки ВЬо в опухолях и опухолевых клеточных линиях

Экспрессия белка В1о была исследована в некоторых опухолевых участках у людей. Повышенные уровни белка были обнаружены в опухолях толстого кишечника, молочной железы и легких. Уровни В1оА и В1 оВ были обнаружены в срезах толщиной 5 мкм плоскоклеточных карцином головы и шеи с использованием поликлональных антител против этих белков, с последующей визуализацией с помощью набора Усс1а81ат (УссЮг ЬаЬк) и анализом изображения. Близлежащие «неопухолевые» области использовали в качестве контролей. Хотя уровни белка В1о А повышались при опухолевой прогрессии, уровни В1оВ снижались в инвазивных опухолях по сравнению с карциномой ίη кйи и хорошо дифференцированными опухолями. Состояние активации не исследовали.

Сверхэкспрессия В1оА и В1оВ может возникать в аденокарциномах молочной железы и легких по сравнению с нормальной тканью, тогда как экспрессия белков В1о снижена в астроцитарных опухолях и обратно коррелирует со злокачественными опухолями 11-1У степени.

ВЬо и метастазирование

В1о вовлечен в регуляцию миграции и движения клеток.

Клетки гепатомы крысы ММ1, трансфицировали мутантными конструкциями В1о А (Уа1¹⁴ или Уа1¹⁴11с⁴¹), в результате получали конститутивную активацию В1о. В анализе инвазии ίη νίΙΐΌ процент высеянных клеток, способных инфильтрировать слой мезотелиальных клеток, согласовывался с уровнем экспрессии трансфицированного В1оА Уа1¹⁴. Когда такие активированные клетки, трансфицированные В1оА, использовали в перитонеальной полости в анализе ίη νίνΌ, 6 из 10 имплантатов давали опухолевые

- 3 008824 узелки по сравнению с 2 из 8 при контрольной трансфекции. Эти результаты указывают на то, что активный Кйо связан с онкогенностью.

На основании детального исследования генной экспрессии, в котором сравнивали две модельные системы метастазирующей меланомы, одну человеческую и одну мышиную, и наблюдали общее сходство генной экспрессии посредством микрочипа, было сделано заключение, что экспрессия КйоС меняется при повышении уровня метастазирования (С1агк с1 а1., 2000). Более того, при экспериментальном контроле за генной экспрессией сверхэкспрессия КйоС индуцировала переключение клеточной линии меланомы человека от низкой способности к метастазированию к более высокому. Хотя не было отмечено свехэкспрессии КйоЛ, доминантная негативная мутация (Ν19Κ0οΑ) устраняла способность к метастазированию.

Был идентифицирован набор из 70 генов, экспрессия которых была связана с предрасположенностью к метастазированию рака молочной железы человека (ναη'ΐ Уеет с1 а1., 2002). Хотя гены Кйо не были обнаружены, уровень маркера заболевания как прогностического индикатора не обязательно был связан с его значением в качестве мишени для терапии. В случае передачи сигнала семейства Вйо имеется сложная регуляция ферментативной активности и белок-белковых взаимодействий, которая не очевидна только из исследований уровня транскрипции.

Сущность изобретения

Индивидуальные слитые белки по изобретению иногда обозначены, как ВА-05, ВА-07, и тому подобное.

Изобретение относится к способу предотвращения или ингибирования бесконтрольной пролиферации и распространения или миграции метастазирующих опухолевых клеток при злокачественной опухоли млекопитающего, предусматривающему введение млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о51г101ит Ьо!и1шит, или его функциональный аналог.

Изобретение относится к способу предотвращения или ингибирования неконтролируемой пролиферации и распространения или миграции в пределах края резекции ткани хозяина, прилегающей к участку иссечения злокачественной опухоли млекопитающего, метастазирующей опухолевые клетки, оставшейся в крае резекции, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С.’1о51пбшт Ьо!и1тит, или его функциональный аналог, причем указанное введение проводится непосредственно в край резекции или ниже поверхности края резекции или в ткань, приближенную к краю резекции, которая остается у млекопитающего, и указанное введение осуществляется во временном интервале перед или после иссечения или удаления опухоли, или перед и после иссечения или удаления опухоли.

Изобретение относится к способу предотвращения роста опухоли из злокачественной клетки в ткани хозяина у млекопитающего, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о8!пбшт Ьо!и1тит, или его функциональный аналог, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два явления, выбранных из миграции злокачественных клеток, пролиферации злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из злокачественной клетки.

Изобретение относится к способу предотвращения или роста внутри края резекции ткани хозяина вблизи участка иссечения или удаления первичной злокачественной опухоли у млекопитающего, вторичной опухоли, содержащей остаточную клетку злокачественной опухоли, причем данный способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о51пбшт Ьо!и1шит, или его функциональный аналог, причем указанное введение проводится непосредственно в край резекции или ниже поверхности края резекции или в ткань, приближенную к краю резекции, которая остается у млекопитающего, и указанное введение осуществляется во временном интервале перед или после иссечения или удаления первичной опухоли, или перед и после иссечения или удаления первичной опухоли, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции остаточных злокачественных клеток, пролиферации остаточных злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи остаточной злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из остаточной злокачественной клетки.

Изобретение, кроме того, относится к применению определенной выше фармацевтической композиции для осуществления описанного выше способа или для производства лекарственного средства для осуществления описанного выше способа.

- 4 008824

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования метастазов системной злокачественной опухоли в ЦНС (центральную нервную систему) млекопитающего, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 ΟοδΙπάίιιιη Ьо!и1шит, или его функциональный аналог, например, такой слитый белок, как ВА-05.

В одном из аспектов терапевтически эффективное количество фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 ΟοδΙπάίιιιη Ьо!и1шит, или его функциональный аналог, например, такой слитый белок, как ВА-05, может проявлять антиангиогенную активность и может использоваться для лечения злокачественных опухолей.

В одном из аспектов изобретение относится к способу предотвращения или ингибирования бесконтрольной пролиферации и распространения или миграции метастазирующей опухолевой клетки при злокачественной опухоли млекопитающего, предусматривающему введение млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 ΟοδΙπάίιιιη Ьо!и1тит, или его функциональный аналог.

Во втором аспекте изобретение относится к способу предотвращения или ингибирования бесконтрольной пролиферации и распространения или миграции в пределах края резекции ткани хозяина, прилегающей к участку иссечения злокачественной опухоли у млекопитающего, метастазирующей опухолевой клетки, оставшейся в крае резекции, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 ΟοδΙπάίιιιη Ьо!и1тит, или его функциональный аналог, причем указанное введение проводится непосредственно в край резекции или ниже поверхности края резекции или в ткань, приближенную к краю резекции, которая остается у млекопитающего, и указанное введение осуществляется во временном интервале перед или после иссечения или удаления опухоли, или перед и после иссечения или удаления опухоли.

В третьем аспекте изобретение относится к способу предотвращения роста опухоли из злокачественной клетки в ткани хозяина у млекопитающего, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 ΟοδΙπάίιιιη Ьοΐи1^ηит, или его функциональный аналог, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции злокачественных клеток, пролиферации злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из злокачественной клетки.

В четвертом аспекте изобретение относится к способу предотвращения роста внутри края резекции ткани хозяина вблизи участка иссечения или удаления первичной злокачественной опухоли у млекопитающего, вторичной опухоли, содержащей остаточную клетку злокачественной опухоли, причем данный способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 ΟοδΙπάίιιιη Ьοΐи1^ηит, или его функциональный аналог, причем указанное введение проводится непосредственно в край резекции или ниже поверхности края резекции или в ткань, приближенную к краю резекции, которая остается у млекопитающего, и указанное введение осуществляется во временном интервале перед или после иссечения или удаления первичной опухоли, или перед и после иссечения или удаления первичной опухоли, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции остаточных злокачественных клеток, пролиферации остаточных злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи остаточной злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из остаточной злокачественной клетки.

В пятом аспекте изобретение относится к применению фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 СШкйтбшт Ьοΐи1^ηит, или его функциональный аналог, для производства лекарственного средства для предотвращения или ингибирования бесконтрольной пролиферации и распространения или миграции метастазирующей опухолевой клетки при злокачественной опухоли млекопитающего.

В шестом аспекте изобретение относится к применению фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 СШкйтбшт Ьοΐи1^ηит, или его функциональный аналог, для производства лекарственного средства для предотвращения или ингибирования бескон

- 5 008824 трольной пролиферации и распространения или миграции в пределах края резекции ткани хозяина, прилегающей к участку иссечения злокачественной опухоли у млекопитающего, метастазирующей опухолевой клетки, оставшейся в крае резекции, подходящего для введения непосредственно в край резекции или ниже поверхности края резекции или в ткань, приближенную к краю резекции, которая остается у млекопитающего, во временном интервале перед или после иссечения или удаления опухоли, или перед и после иссечения или удаления опухоли.

В седьмом аспекте изобретение относится к применению фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о51пбшт Ьо1и1тит, или его функциональный аналог, для производства лекарственного средства для предотвращения роста опухоли из злокачественной клетки в ткани хозяина у млекопитающего, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции злокачественных клеток, пролиферации злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из злокачественной клетки.

В восьмом аспекте изобретение относится к применению фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о51пбшт Ьо1и1тит, или его функциональный аналог, для производства лекарственного средства для предотвращения роста внутри края резекции ткани хозяина вблизи участка иссечения или удаления первичной злокачественной опухоли у млекопитающего, вторичной опухоли, содержащей остаточную клетку злокачественной опухоли, путем введения непосредственно в край резекции или ниже поверхности края резекции или в ткань, приближенную к краю резекции, которая остается у млекопитающего, во временном интервале перед или после иссечения или удаления первичной опухоли, или перед и после иссечения или удаления первичной опухоли, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции остаточных злокачественных клеток, пролиферации остаточных злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи остаточной злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из остаточной злокачественной клетки.

В девятом аспекте изобретении относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором конъюгат слитого белка представляет собой ВА-05.

В десятом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором злокачественная опухоль выбрана из злокачественной опухоли молочной железы, головного мозга, толстого кишечника, кожи, опухоли почки и печени.

В одиннадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором злокачественная опухоль представляет собой опухоль головного мозга, выбранную из группы, включающей глиальные опухоли, нейрональные опухоли, опухоли шишковидной железы, менингеальные опухоли, опухоли оболочки нервов, лимфомы, недифференцированные опухоли, и метастазирующие опухоли, расположенные в головном мозге, происходящие от опухолей легких, молочной железы, меланомы, почки и желудочно-кишечного тракта.

В двенадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором злокачественная опухоль представляет собой опухоль головного мозга, выбранную из группы, включающей анапластическую астроцитому, мультиформную глиобластому, волосовидную астроцитому, олигодендроглиому, эпендимому, миксопапиллярную эпендимому, субэпендимому, папиллому хориоидного сплетения, нейробластому, ганглионейробластому, ганглионейрому и медуллобластому, пинеобластому и пинеоцитому, менингиому, менингеальную гемангиоперицитому, менингеальную саркому, шванному (нейролеммому) и нейрофиброму, ходжкинскую лимфому, неходжкинскую лимфому, ходжкинскую лимфому первичного и вторичного подтипов, неходжкинскую лимфому первичного и вторичного подтипов, краниофарингиому, эпидермоидные цисты, дермоидные цисты и коллоидные цисты.

В тринадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором терапевтически эффективное количество составляет примерно от 0,001 до 50 мкг на см³ ткани.

В четырнадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором терапевтически эффективное количество составляет примерно от 0,0001 мкг слитого белка на кубический сантиметр (см³) ткани до 100 мкг на кубический сантиметр ткани.

В пятнадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором терапевтически эффективное количество составляет примерно от 1 мкг на миллилитр до 10 мкг на мл и до 50 мкг на мл.

В шестнадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором введение осуществляется путем инъекции, местного нанесения или имплантации.

В семнадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором введение выбрано из группы, включающей внутрисуставное, внутриглазное, интраназальное, интраневральное, внутрикожное, внутрикостное, подъязычное, пероральное, местное, внутрипузырное, интра

- 6 008824 текальное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутричерепное, внутримышечное, подкожное введение, ингаляцию, распыление и ингаляцию непосредственно в опухоль, применение непосредственно в участок заболевания, применение непосредственно на края, оставшиеся после резекции или внутрь них, энтеральное, энтеральное введение при гастроскопической процедуре и ИСКР.

В восемнадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором полипептидный радикал транспорта через клеточную мембрану включает в себя пептид, содержащий примерно от 5 до 50 аминокислот.

В девятнадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором единица экзотрансферазы С3 С1о81пбшт ЬоиШпит. включает в себя аминокислотную последовательность, определяемой как последовательность слитого белка ВА-07.

В двадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором функциональный аналог содержит белок, отличающийся активностью в интервале от 50 до 500% по сравнению с активностью экзотрансферазы С3 С1о51пбшт ЬоиШгшт дикого типа.

В двадцать первом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель.

В двадцать втором аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, выбранный из группы, включающей сополимер этилена и винилацетата, ПВА, частично гидролизованный сополимер этилена и винилацетата, сополимер этилена и винилацетата и винилового спирта, перекрестносвязанный сополимер этилена и винилацетата, перекрестно-связанный частично гидролизованный сополимер этилена и винилацетата, перекрестно-связанный сополимер этилена и винилацетата и винилового спирта, поли-Б,Ь-молочную кислоту, поли-Ь-молочную кислоту, полигликолевую кислоту, ПГА, сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, поликапролактон, поливалеролактон, поли(ангидриды), сополимеры поликапролактона и полиэтиленгликоля, сополимеры полимолочной кислоты и полиэтиленгликоля, полиэтиленгликоль; и их сочетания и смеси.

В двадцать втором аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, включающий водный желатин, водный белок, полимерный носитель, перекрестно-связывающий агент, или их сочетания.

В двадцать четвертом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, включающий матрикс.

В двадцать пятом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, включающий воду, фармацевтически приемлемую буферную соль, фармацевтически приемлемый буферный раствор, фармацевтически приемлемый антиоксидант, аскорбиновую кислоту, один или несколько фармацевтически приемлемых полипептидов с низкой молекулярной массой, пептид, содержащий примерно от 2 до 10 аминокислотных остатков, один или несколько фармацевтически приемлемых белков, одну или несколько фармацевтически приемлемых аминокислот, незаменимую для человека аминокислоту, один или несколько фармацевтически приемлемых углеводов, один или несколько материалов, производных от фармацевтически приемлемого углевода, невосстанавливающий сахар, глюкозу, сахарозу, сорбит, трегалозу, маннит, мальтодекстрин, декстрины, циклодекстрин, фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, ΕΌΤΑ, БТРА, хелатирующий агент для двухвалентного иона металла, хелатирующий агент для трехвалентного иона металла, глутатион, фармацевтически приемлемый неспецифический сывороточный альбумин, и их сочетания.

В двадцать шестом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция является стерильной.

В двадцать седьмом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция может быть стерилизована.

В двадцать восьмом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция стерилизована.

В двадцать девятом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция находится в пробирке в количестве одной лекарственной дозы или в интегральном множестве лекарственных доз.

В тридцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция является сухой.

В тридцать первом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция содержит дегидратированный матрикс.

В тридцать втором аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель.

В тридцать третьем аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция содержит слитый белок в лиофилизированном матриксе.

- 7 008824

Антагонизм КЬо и апоптоза

При злокачественных опухолях нарушена регуляция механизмов контроля клеточной пролиферации. Повышение апоптоза в клетках мышиной Т-клеточной лимфомы ЕЬ4 происходит после активации КЬо рекомбинантным экзоферментом С3. В клетках ΝΙΗ3Ι3 обработка ингибитором КЬо-киназы Υ-27632 значительно ингибирует независимый от прикрепления рост. В одном из вариантов осуществления инактивация КЬо может предотвращать пролиферацию опухолевых клеток, и настоящее изобретение относится к снижению или прекращению клеточной пролиферации или индукции апоптоза проникающим в клетку конъюгатом слитого белка, содержащим полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 ОоЧпбшт ЬоШйпит, или его функциональный аналог, например, слитым белком, таким как ВА-07. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к снижению или прекращению клеточной пролиферации или индукции апоптоза эффективным количеством фармацевтической композиции, предусматривающему проникновение в клетку конъюгата слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о51п6шт ЬоШйпит. или его функциональный аналог, например, слитого белка, такого как ВА-07.

Антагонизм КЬо и миграции клеток

Метастазирующие клетки в высокой степени склонны к миграции. Инактивация КЬо может предотвращать миграцию клеток в некоторых типах клеток. Трансфераза С3 и ингибитор КЬо-киназы Υ-27632 блокируют клеточную инвазию клеток рака толстой кишки человека НТ29. В ν-Сгк-индуцируемой клеточной линии фибробластов крысы 3Υ1 С3 и Υ-27632 ингибировали ν-Сгк, что приводило к снижению подвижности клеток. Повышенный уровень апоптоза в клетках КЬоВ -/-, в КЬоВ +/- или в КЬоВ -/- клетках МЕЕ, обработанных доксорубицином, облученных или обработанных таксолом, является результатом нехватки белка КЬоВ. В другом варианте осуществления антагонизм КЬо может снижать миграцию и метастазирование клеток, и настоящее изобретение относится к ингибированию миграции клеток проникающим в клетку конъюгатом слитого белка, содержащим полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1ойп6шт ЬоШйпит. или его функциональным аналогом, например, слитым белком, таким как ВА-07.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к ингибированию миграции клеток эффективным количеством фармацевтической композиции, предусматривающему проникновение в клетку конъюгата слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 ОоЧпбшт Ьо1и1тит, или его функциональный аналог, например, слитого белка, такого как ВА-05.

Антагонизм КЬо и матриксных металлопротеиназ (ММР)

Инвазивные опухолевые клетки способны деградировать окружающий их внеклеточный матрикс, секретируя протеазы, которые разрушают внеклеточный матрикс. Одним из важнейших классов протеаз, которые секретируются опухолевыми клетками, являются матриксные металлопротеиназы (ММР). Эти ферменты делают доступным путь в матриксе, через который происходит инвазия и распространение опухолевых клеток. Опухолевые клетки могут продуцировать различные типы ММР, и ММР часто синтезируются в виде проферментов, которые расщепляются и высвобождаются после активации. ММР-1 расщепляет коллагеновый матрикс. ММР-2 может играть важную роль при инвазии клеток рака легких. ММР-9 также вовлечена в инвазию опухолевых клеток. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к ингибированию экспрессии ММР, процессинга ММР или секреции ММР в опухолевой клетке, причем такое ингибирование осуществляется путем проникновения в клетку конъюгата слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 ОоЧпбшт Ьо1и1тит, или его функциональный аналог, например, слитого белка, такого как ВА-07.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к ингибированию экспрессии ММР, процессинга ММР или секреции ММР эффективным количеством фармацевтической композиции, предусматривающим проникновение в клетку конъюгата слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о8!п6шт ЬоШйпит. или его функциональный аналог, например, слитого белка, такого как ВА-05.

ВА-05 и ВА-07 в качестве антагонистов КЬо

ВА-05 и ВА-07 являются формами экзофермента С3, полученными методами генной инженерии. Экзофермент С3 представляет собой происходящий из бактериофага секретируемый белок, обнаруженный в некоторых штаммах С1о51п6шт Ьо1и1тит, который переносит группу ΑΌΡ-рибозы на аспарагиновый остаток малых регуляторных ГТФаз КЬоА, КЬоВ и КЬоС. С3 инактивирует КЬо, так как ΑΌΡрибозилирование препятствует активации КЬо. Новые модификации, которыми отличаются от ВА-05 и ВА-07, включают в себя С-концевой транспортный пептид, который обеспечивает эффективный вход в цитоплазму, что приводит к образованию более мощного антагониста КЬо. ВА-05 и ВА-07 отличаются молчащими мутациями в неферментативной области. ВА-07 обеспечивает экспрессию в векторе коммерческого масштаба для очистки белка, который может использоваться в качестве терапевтического лекарственного средства. В одном из аспектов изобретения слитый белок, такой как ВА-07, может рассматри

- 8 008824 ваться как проникающий в клетку агент, разрушающий белок-белковые взаимодействия, необходимые для передачи сигнала.

Настоящее изобретение относится к вариантам ВА-05 и ВА-07, таким как проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану, аминокислотная последовательность которого может изменяться, или укорачиваться, или удлиняться, или уменьшаться так, чтобы она содержала вариант ВА-05, и единицу экзотрансферазы С3 С1о81пбшт ЬоШИпит, аминокислотная последовательность которого может изменяться, или укорачиваться, или удлиняться, или уменьшаться с образованием варианта, или его функциональный аналог, в качестве против опухолевой композиции и композиции, препятствующей метастазированию, а также к способам и устройствам, в которых используют такие композиции для лечения злокачественной опухоли и других злокачественных заболеваний.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к композициям и способам, предназначенным для изменения последовательности ДНК ВА-07, экспрессируемой в плазмиде для усиления способности очищать большие количества ВА-07 для композиции в фармацевтически приемлемом носителе, безопасном для терапевтического применения.

ВА-05 и ВА-07 представляют собой слитые белки по изобретению

Изобретение относится к вариантам ВА-05, которые сохраняют богатую пролином транспортную последовательность и часть единицы трансферазы С3, достаточную для сохранения ферментативной активности для ΑΌΡ-рибозилирования ККо.

Настоящее изобретение относится к конъюгату или слитому белку, содержащему терапевтически активный агент, где активный агент может доставляться через клеточную мембрану, причем конъюгат и слитый белок содержит транспортный(-е) субдомен(-ы) или радикал(-ы) в дополнение к радикалу(-ам) активного агента. Более конкретно, настоящее изобретение относится к терапевтически активному агенту в виде конъюгата или слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С.'1о81пбшт Ьо1и1тит в качестве терапевтически активного агента или его функциональный аналог, где терапевтически активный агент может ингибировать миграцию опухолевых клеток, способствовать апоптозу опухолевых клеток, ингибировать ангиогенез и ингибировать продукцию металлопротеиназ, связанную с опухолевым ростом.

Преимуществом композиций и способов по настоящему изобретению является существенное улучшение по сравнению с предыдущими лекарственными средствами, сконструированными для предотвращения распространения опухоли или ее метастазирования, поскольку единственное соединение по изобретению может выполнять функцию комбинированной терапии и, таким образом, предотвращать несколько различных аспектов опухолевого роста и распространения. Преимуществом композиции по настоящему изобретению, например, композиции, содержащей ВА-07, является способность предотвращать, или задерживать, или ингибировать миграцию опухолевых клеток, пролиферацию опухолевых клеток, ангиогенез в участке опухоли и секрецию активных металлопротеиназ. Преимуществом настоящего изобретения является тот факт, что фармацевтически активные компоненты могут проникать в раковую клетку, не используя механизм транспорта через мембрану, основанный на рецепторах. Преимуществом настоящего изобретения является тот факт, что фармацевтически активные компоненты могут инактивировать ГТФазы, которые являются членами семейства Вйо. Преимуществом настоящего изобретения является тот факт, что фармацевтически активные соединения являются антагонистами ККо.

Изобретение относится к способу предотвращения или ингибирования бесконтрольной пролиферации и распространения или миграции метастазирующей опухолевой клетки при злокачественной опухоли млекопитающего, предусматривающему введение млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 ί.’1θ5ΐπάίι.ιιη ЬоШЮшт. или его функциональный аналог.

Изобретение относится к способу предотвращения или ингибирования бесконтрольной пролиферации и распространения или миграции в пределах края резекции ткани хозяина, прилегающей к участку иссечения злокачественной опухоли у млекопитающего, метастазирующей опухолевой клетки, оставшейся в крае резекции, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о81ибшт Ьо1и1тит, или его функциональный аналог, причем указанное введение проводится непосредственно в край резекции или ниже поверхности края резекции или в ткань, приближенную к краю резекции, которая остается у млекопитающего, и указанное введение осуществляется во временном интервале перед или после иссечения или удаления опухоли, или перед и после иссечения или удаления опухоли.

Изобретение относится к способу предотвращения роста опухоли из злокачественной клетки в ткани хозяина у млекопитающего, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о81пбшт Ьо1и1тит, или его функциональный аналог, где слитый белок одновременно предотвращает

- 9 008824 или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции злокачественных клеток, пролиферации злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из злокачественной клетки.

Изобретение относится к способу предотвращения роста внутри края резекции ткани хозяина вблизи участка иссечения или удаления первичной злокачественной опухоли у млекопитающего, вторичной опухоли, содержащей остаточную клетку злокачественной опухоли, причем данный способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о81пбшт Ьо1и1шит, или его функциональный аналог, причем указанное введение проводится непосредственно в край резекции или ниже поверхности края резекции или в ткань, приближенную к краю резекции, которая остается у млекопитающего, и указанное введение осуществляется во временном интервале перед или после иссечения или удаления первичной опухоли, или перед и после иссечения или удаления первичной опухоли, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции остаточных злокачественных клеток, пролиферации остаточных злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи остаточной злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из остаточной злокачественной клетки.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования метастазов системной злокачественной опухоли в ЦНС (центральную нервную систему), предусматривающему введение млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о81пбшт Ьо1и1шит, или его функциональный аналог, например, слитого белка, такого как ВА-07.

В одном из аспектов терапевтически эффективное количество фармацевтической композиции, содержит проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о81пбшт Ьо1и1шит, или его функциональный аналог, например, слитого белка, такого как ВА-07, может проявлять антиангиогенную активность и использоваться при лечении злокачественной опухоли.

По настоящему изобретению область активного средства слитого белка по изобретению содержит область ΑΌΡ-рибозилтрансферазы С3, или ее функциональный эквивалент. По настоящему изобретению предпочтительная ΑΌΡ-рибозилтрансфераза С3 может быть выбрана из группы, включающей ΑΌΡрибозилтрансферазу, происходящую из С1о81пбшт Ьо1и1тит, и рекомбинантную ΑΌΡрибозилтрансферазу.

Альтернативно, С3 может происходить из других источников, таких как С. Итокеит или 81арЫососсик аигеик. Очищенные из этих бактерий С3, обладают ферментативной активностью, как С3 из С. Ьо1ийпит, которая эффективна для ΑΌΡ-рибозилирования Р1ю и вызывает инактивацию Я1ю.

В одном из аспектов настоящего изобретения полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану может включать в себя богатый пролином транспортный домен. Примеры богатого пролином транспортного домена или радикала могут быть найдены в заявке на выдачу патента США 10/118079, полное описание которой включено здесь в качестве ссылки в полном объеме. Используемый здесь термин «богатая пролином область» относится к любой линейной последовательности из 10 аминокислот, связанных вместе пептидными амидными связями в молекуле, содержащей пептид или белок, где по меньшей мере 3 из 10 аминокислот в линейной последовательности представляют собой остатки пролина, где каждый пролин ковалентно связан пептидной амидной связью с участием атома азота и другой пептидной амидной связью с участием его карбоксильной (карбонильной) группы.

Богатая пролином область из любых 10 аминокислот в пептиде может содержать 2 или большее число пролиновых остатков и 9 или меньшее число непролиновых аминокислот.

Например, в одном из аспектов богатая пролином область, содержащая последовательность 10 аминокислот, в пептиде, содержащем 10 и более аминокислот, может содержать 2 пролиновых остатка и 8 непролиновых аминокислотных остатков, представленных в любом сочетании на протяжении этих 10 аминокислот.

В другом аспекте богатая пролином область, содержащая последовательность 10 аминокислот, в пептиде, содержащем 10 и более аминокислот, может содержать 3 пролиновых остатка и 7 непролиновых аминокислотных остатков, представленных в любом сочетании на протяжении этих 10 аминокислот.

В другом аспекте богатая пролином область, содержащая последовательность 10 аминокислот, в пептиде, содержащем 10 и более аминокислот, может содержать 4 пролиновых остатка и 6 непролиновых аминокислотных остатков, представленных в любом сочетании на протяжении этих 10 аминокислот.

В другом аспекте богатая пролином область, содержащая последовательность 10 аминокислот, в пептиде, содержащем 10 и более аминокислот, может содержать 5 пролиновых остатков и 5 непролиновых аминокислотных остатков, представленных в любом сочетании на протяжении этих 10 аминокислот.

- 10 008824

В другом аспекте богатая пролином область, содержащая последовательность 10 аминокислот, в пептиде, содержащем 10 и более аминокислот, может содержать 6 пролиновых остатков и 4 непролиновых аминокислотных остатков, представленных в любом сочетании на протяжении этих 10 аминокислот.

В другом аспекте богатая пролином область, содержащая последовательность 10 аминокислот, в пептиде, содержащем 10 и более аминокислот, может содержать 7 пролиновых остатков и 3 непролиновых аминокислотных остатка, представленных в любом сочетании на протяжении этих 10 аминокислот.

В другом аспекте богатая пролином область, содержащая последовательность 10 аминокислот, в пептиде, содержащем 10 и более аминокислот, может содержать 8 пролиновых остатков и 2 непролиновых аминокислотных остатка, представленных в любом сочетании на протяжении этих 10 аминокислот.

В другом аспекте богатая пролином область, содержащая последовательность 10 аминокислот, в пептиде, содержащем 10 и более аминокислот, может содержать 9 пролиновых остатков и 1 непролиновый аминокислотный остаток, представленных в любом сочетании на протяжении этих 10 аминокислот.

В другом аспекте богатая пролином область, содержащая последовательность 10 аминокислот, в пептиде, содержащем 10 и более аминокислот, может содержать 10 пролиновых остатков.

В другом аспекте «богатая пролином область» относится к области аминокислотной последовательности, содержащей больше пролинов, чем то количество, которое в основном наблюдается во встречающихся в природе белках (например, белках, кодируемых геномом человека).

«Богатая пролином область» пептида в композиции по настоящему изобретению может функционировать, усиливая скорость транспорта слитого белка по изобретению через клеточную мембрану.

Не богатая пролином область пептида или белка может включать в себя последовательность 10 аминокислот, ковалентно связанных пептидными связями, причем такая область содержит ноль или один пролиновый остаток.

Пептид, усиливающий транспорт через клеточную мембрану, в композиции по изобретению может содержать одну или несколько богатых пролином областей, каждая из которых может иметь одинаковую или различные последовательности аминокислот, и каждая из которых ковалентно связана пептидной связью или пептидными связями с одной или несколькими не богатыми пролином аминокислотными последовательностями, которые могут быть одинаковыми или различными, причем не богатая пролином аминокислотная последовательность включает в себя более 10 аминокислот.

В другом аспекте изобретения полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану, подходящий для применения в композициях и способах, включающий в себя слитый белок по изобретению, может быть получен, например, способами, модифицированными и адаптированными для применения по изобретению, как описано в Кщаь (1998) 16: 370-375 в отношении последовательности транслокации через мембрану; в УКе5 (1997) 272: 16010-16017 в отношении опосредованной Та! доставки белка; в Аспбсг е! а1. 2000, ΡΝΑ8 24:13003-13008 в отношении полиаргининовых последовательностей; в Эего551 (1996) 271: 18188-18193 в отношении Ап!епиареб1а; в патентном документе Канады 2301157 в отношении конъюгатов, содержащих гомеодомен Лп!епиареб1а; и в патентах США 5652122, 5670617, 5674980, 5747641 и 5804604 в отношении конъюгатов, содержащих аминокислоты белка Та! ВИЧ (здесь белок Та! ВИЧ иногда указывается как Та!); полное описание каждой из данных ссылок включено здесь в качестве ссылки в полном объеме.

Некоторые подходы опосредованного рецептором транспорта использовали с целью улучшения функции ΑΌΡ-рибозилаз. Эти подходы и способы включают в себя слияние последовательностей С2 и С3 (АПбе. е! а1. (2001) 276: 9537-9542) и применение опосредованного рецептором транспорта рецептора дифтерийного токсина (Аи11о, е! а1.(1993) 12: 921-31). Эти подходы не приводили к существенному усилению мощности активности С3, в отличие от активности, которая была обнаружена у ВА-05. Более того, эти подходы требуют опосредованного рецептором транспорта. Необходимо, чтобы клетки-мишени экспрессировали специфический рецептор, и они должны экспрессировать достаточные количества такого рецептора для существенного улучшения скорости транспорта. В случае дифтерийного токсина не все клетки экспрессируют подходящий рецептор, что ограничивает его возможное применение. В отличие от указанных подходов композиция по изобретению, содержащая полипептидный транспортный радикал, например, такой как ВА-05, способна проникать сквозь плазматическую мембрану клетки по независимому от рецепторов механизму.

В одном из аспектов изобретения предпочтительная композиция содержит проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий богатый пролином полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану, включающий в себя богатую пролином аминокислотную последовательность, добавленную к С-концевой области единицы экзотрансферазы С3 ОоЧпбшш Ьо!и1шит, или его функционального аналога, в конъюгате слитого белка. Особенно предпочтительная композиция представляет собой слитый белок, обозначенный ВА-05. Композиции слитого белка, содержащие богатую пролином аминокислотную последовательность, добавленную к Ν-концевой области единицы экзотрансферазы С3 С1о§!пбшт Ьо!и1шит, или его функционального аналога, обозначены здесь как аналоги ВА-05.

В другом аспекте изобретения предпочтительная композиция содержит проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий богатый пролином полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану, включающий в себя богатую пролином аминокислотную последовательность, добав

- 11 008824 ленную к Ν-концевой области единицы экзотрансферазы С3 С1о81пбшт Ьо1и1тит. или его функционального аналога, в конъюгате слитого белка. Композиции слитого белка. содержащие богатую пролином аминокислотную последовательность. добавленную к Ν-концевой области единицы экзотрансферазы С3 С1о81пбшт Ьо1и1тит. или его функционального аналога. обозначены здесь как варианты ВА-05.

Аналоги ВА-05 и варианты ВА-07 по настоящему изобретению содержат полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 ΟοδΙπάίιιιη Ьо1и1тит. или его функциональный аналог. Функциональные аналоги единицы экзотрансферазы С3 С1о81пбшт Ьо1и1тит могут содержать полипептиды. такие как биологически активные фрагменты и аналоги ВА-05 с измененной аминокислотной последовательностью. где биологическая активность таких фрагментов и аналогов ВА05 с измененной аминокислотной последовательностью осуществляется по механизму действия. по существу. сходного с таковым ВА-05. Такие фрагменты включают в себя или охватывают аминокислотные последовательности. имеющие укорочения (или удаления) одной или нескольких аминокислот. относящихся к аминокислотной последовательности ВА-05. где укорочение может происходить на Ν-конце. на С-конце или внутри белковой последовательности.

Аналоги и варианты ВА-05 по изобретению могут включать в себя вставку или замену одной или нескольких аминокислот. Композиции по изобретению включают в себя фрагменты. аналоги и варианты. которые могут использоваться по изобретению и обладают биологическими свойствами ВА-05. которые способны инактивировать ГТФазы Р1то и предпочтительно способны инактивировать более одной ГТФазы Р1ю.

В другом аспекте композиции и способы по изобретению включают в себя химерные полипептиды. содержащие аминокислотную последовательность ВА-05 или укороченную последовательность. слитые и содержащие гетерологичные аминокислотные последовательности. Такие гетерологичные последовательности включают в себя те. которые при образовании химеры с ВА-05 сохраняют одно или несколько биологических или иммунологических свойств ВА-05. более предпочтительно свойство способности к инактивации ГТФазы КЬо и. даже более предпочтительно. инактивации более одной ГТФазы Р1ю.

В другом варианте осуществления изобретение относится к клетке-хозяину. трансформированной или трансфицированной нуклеиновыми кислотами. кодирующими белок ВА-05 или химерный белок ВА07. В одном из аспектов может использоваться любая клетка-хозяин. которая продуцирует белок. содержащий полипептид. который проявляет по меньшей мере одно из биологических свойств ВА-05. наиболее предпочтительно. способность к инактивации ГТФазы Р1ю и. еще более предпочтительно. способность к инактивации более чем одной ГТФазы Р1ю. Характерные примеры типов клеток-хозяев включают в себя клетки бактерий. дрожжей. растений. насекомых и млекопитающих. Кроме того. белок ВА-05 или химерный белок ВА-05 может продуцироваться в трансгенных животных. Трансформированные или трансфицированные клетки-хозяева и трансгенные животные могут быть получены с использованием материалов и способов. которые хорошо известны и доступны специалисту в области молекулярной и клеточной биологии. Клетка-хозяин может содержать последовательность нуклеиновой кислоты. которая содержит полноразмерный ген. кодирующий белок ВА-05. и также может содержать лидерную последовательность и С-концевую последовательность мембранного якоря. Альтернативно. клетка-хозяин может содержать последовательность нуклеиновой кислоты. которая не содержит одну лидерную последовательность. или которая не содержит обе лидерные последовательности. или которая не содержит Сконцевую последовательность мембранного якоря. или которая не содержит комбинацию данных последовательностей. Кроме того. последовательности нуклеиновой кислоты. которые кодируют полипептидный фрагмент. полипептидный вариант или полипептидный аналог. каждый из которых способен сохранять биологическую активность ВА-05. также могут присутствовать в таких экспрессирующих системах хозяина.

Антагонист К.йо. представляющий собой рекомбинантный белок. может быть получен технологией рекомбинантных белков. известными в данной области. Белок по настоящему изобретению может быть получен из экстракта бактериальной клетки. или используя рекомбинантные способы. ВА-05 и родственные слитые белки по изобретению могут быть получены путем трансформации (например. путем трансфекции. трансдукции. инфекции) клетки-хозяина всем кодирующим ВА-05 фрагментом ДНК или его частью в подходящем экспрессирующем носителе или векторе. Подходящие экспрессирующие носители включают в себя: плазмиды. вирусные частицы и фаг. Для клеток насекомых подходят бакуловирусные экспрессирующие векторы. Целый экспрессирующий носитель или вектор. или его часть может интегрироваться в геном клетки-хозяина способами. известными в данной области. В одном из аспектов. предпочтительно. использовать индуцируемый экспрессирующий вектор.

Специалистам в области молекулярной биологии понятно. что любая из разнообразных экспрессирующих систем может использоваться для получения рекомбинантного белка. Конкретная используемая клетка-хозяин обычно не является важной для изобретения. Например. слитый белок ВА-05 и слитые белки. включающие в себя функциональные аналоги и варианты и фрагмент ВА-05 по изобретению. могут продуцироваться в прокариотическом хозяине (например. Е. сой или В. киЬйШ) или в эукариотическом хозяине (например. Бассйаготусек или Р1сЫа; в клетках млекопитающих. например. в клетках. обо

- 12 008824 значенных в данной области как клетки СОЗ. ΝΙΗ 3Т3, СНО, ВНК, 293, или НеЬа; или в клетках насекомых).

Для определения относительной и эффективной активности антагониста Кйо композиций по изобретению может использоваться система биологического анализа культуры ткани. ВА-05 может использоваться в интервале концентрации примерно от 0,01 до 10 мкг/мл и он не токсичен для клеток.

ВА-05 стабилен при 37°С по меньшей мере в течение 24 ч. Стабильность ВА-05 тестировали в культуре ткани в следующем эксперименте. ВА-05 разводили в среде культуры ткани, оставляли в инкубаторе при 37°С на 24 ч, затем добавляли к описанной здесь системе биоанализа, с использованием клеток ганглия сетчатки в качестве тестируемого клеточного типа. Данные клетки способны вытягивать нейриты на ингибиторных субстратах при обработке С3, и хранении в течение 24 ч при 37°С. Достигали минимальной стабильности, равной 24 ч.

В другом способе, подтверждающем, что соединение представляет собой антагонист Кйо, можно использовать радиоактивный анализ для выявления ферментативной активности.

В другом способе выявления активности можно использовать флуоресцентный анализ для выявления ферментативной активности. Например, ВА-05 обладает по меньшей мере двумя видами присущей ему ферментативной активности, включая активности гликогидролазы и ΑΌΡ-рибозилтрансферазы. Эти виды ферментативной активности могут действовать последовательно, проводя моно-ΑΌΡрибозилирование и инактивацию СТР-связывающего белка КйоА путем захвата ΑΌΡ-рибозилированного Кйо в комплекс с ингибитором диссоциации гуаниннуклеотида 1 (СЭ1-1). На первой стадии этой реакции активность гликогидролазы гидролизует Ν-гликозидную связь между никотинамидом и адениндинуклотидфосфатрибозой (ΑΌΡ-рибозой) в молекуле никотинамидадениндинуклеотида (ΝΑΌ⁺). Вторая стадия, катализируемая ΑΌΡ-рибозилтрансферазой, приводит к образованию Α^Ρ-рибозо-ΚйоΑ. Анализы ферментов могут измерять гликогидролазную активность слитого белка по изобретению, такого как ВА-05 и ВА-07, путем мониторинга образования ΑΌΡ-рибозы.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая может использоваться для подавления злокачественной трансформации и метастазирования, причем фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый растворитель или носитель и терапевтически эффективное количество композиции по изобретению, предпочтительно слитый белок по изобретению.

В одном из вариантов осуществления композиция по изобретению может содержать активный компонент, выбранный из группы, включающей описанную здесь конструкцию по доставке лекарственных средств, описанного здесь конъюгата с лекарственным средством, и описанного здесь слитого белка (например, включая его фармацевтически приемлемые химические эквиваленты).

Препарат ВА-05 и другие композиции по изобретению

Композиции и способы по изобретению могут включать в себя фармацевтически эффективное количество фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о81п6шт Ьо1и1шцт или его функциональный аналог. В одном из аспектов в препарате по изобретению могут использоваться разнообразные полимерные носители. Характерные примеры полимерных носителей включают в себя сополимер этилена и винилацетата (ПВА) и частично гидролизованный сополимер этилена и винилацетата, такой как сополимер этилена с винилацетатом и виниловым спиртом, любой из которых может необязательно перекрестно связан до 40% перекрестного связывания; полиΌ,Ε-молочную кислоту, в том числе ее олигомеры с низкой молекулярной массой и полимеры с высокой молекулярной массой; поли-Ь-молочную кислоту, в том числе ее олигомеры с низкой молекулярной массой и полимеры с высокой молекулярной массой; полигликолевую кислоту (ΡСΑ); сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты; поликапролактон; поливалеролактон; поли(ангидриды), сополимеры поликапролактона с полиэтиленгликолем; сополимеры полимолочной кислоты с полиэтиленгликолем, полиэтиленгликоль; и их комбинации и смеси. Сополимеры могут включать в себя примерно от 1 до 99% по массе мономерной единицы. Смеси первого полимера и второго полимера могут включать в себя примерно от 1 до 99% по массе от первого полимера и примерно от 99 до 1% от второго полимера.

Применение ВА-05 для прекращения распространения опухоли

Композиции по настоящему изобретению, такие как противоопухолевые композиции и композиции, препятствующие метастазированию, могут быть получены в различных формах. Например, в одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество проникающего в клетку конъюгата слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 ОоЦпбшт Ьо1и1тцт, или его функциональный аналог, может содержать микросферу, где слитый белок смешан или введен в матрикс, содержащий фармацевтически приемлемый полимерный носитель, необязательно, в присутствии воды (примерно от 0,1 до 15% в одном из вариантов осуществления; альтернативно, микросферу суспендируют в водной среде в другом варианте осуществления), фармацевтически приемлемую буферную соль, фармацевтически приемлемый поверхностный активный агент, фармацевтически приемлемый углевод, фармацевтически приемлемое смягчающее средство и тому подобное.

- 13 008824

В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество проникающего в клетку конъюгата слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о81п6шт ЬоШЮшт. или его функциональный аналог. может включать пасту. крем. мазь. суппозиторий. суспензию в фармацевтически приемлемом масле и тому подобное.

В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция. содержащая терапевтически эффективное количество проникающего в клетку конъюгата слитого белка. содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о81п6шт Ьо1и1тит. или его функциональный аналог. может включать пленку. например. в которой слитый белок смешивают с фармацевтически приемлемым носителем. таким как водный желатин или полимерный носитель. или их комбинацией. необязательно в присутствии молекулы перекрестно-связывающего агента. который может перекрестно связывать носитель. затем смесь помещают на пленку или ламинат. необязательно. в присутствии основы пленки. или подложки или матрикса. и сушат или обезвоживают. необязательно. нагреванием или путем лиофилизации. Пленки могут быть получены в единичных дозированных формах или в большом количестве. и могут быть разделены и нарезаны на единичные дозированные формы.

В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция. содержащая терапевтически эффективное количество проникающего в клетку конъюгата-слитого белка. содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о81п6шт Ьо1и1тит. или его функциональный аналог. может включать аэрозоль или распыляемую или аэрозольную композицию. например. суспензию или раствор слитого белка в фармацевтически приемлемой жидкости. например. водный раствор буфера. необязательно. с модификатором изотоничности; в фармацевтически приемлемой жидкости. такой как сверхкритическая жидкость или сжиженный газ. такой как диоксид углерода или пропан. или низкомолекулярный фторуглерод или фторуглеводород. или хлорфторуглерод и тому подобное. каждый из которых представляет собой газ при 37°С и давлении окружающей среды. причем данная композиция может использоваться. например. при ингаляции или в качестве аэрозоля. такого как спрей для применения на поверхности ткани.

В другом аспекте могут быть получены композиции по настоящему изобретению. содержащие слитый белок. такой как ВА-05. и дополнительный фактор или противоопухолевое средство. или композиции. препятствующие метастазированию.

В другом аспекте могут быть получены композиции по настоящему изобретению. содержащие различные дополнительные соединения для предоставления препаратов слитого белка с определенными физиологическими свойствами (например. эластичность. связанная с введением фармацевтически приемлемого пластификатора. конкретная температура плавления. такая как примерно 30°С. за счет применения полиэтиленгликоля. или конкретная скорость высвобождения. которая может быть связана со степенью перекрестного связывания или со скоростью гидратации матрикса или солюбилизации матрикса. или с предпочтительной солюбилизацией компонента матрикса. который может покидать поры в матриксе. за счет чего жидкий носитель. например вода. может способствовать транспорту слитого белка из матрикса и в требуемый участок организма млекопитающего или на него.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции можно комбинировать для достижения требуемого эффекта (например. две или несколько композиций в микросферах по изобретению можно комбинировать для достижения модифицированной суммарной скорости высвобождения слитого белка по изобретению. например. быстрого или медленного и продленного высвобождения одного или нескольких факторов против опухоли и метастазирования).

Композиции по настоящему изобретению. такие как те. что содержат ВА-05. могут вводиться отдельно или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. и/или фармацевтически и физиологически совместимыми наполнителями. растворителями. средствами модификации изотоничности. буферами и тому подобным. Предпочтительно. такие носители приемлемо нетоксичны для реципиента. при использовании в комбинации с дозировками и в терапевтически эффективных концентрациях используемого слитого белка.

В одном из аспектов препарат фармацевтической композиции по изобретению содержит сочетание терапевтически эффективного количества слитого белка по изобретению с одним или несколькими компонентами носителя. такими как вода; фармацевтически приемлемая буферная соль или буферный раствор. фармацевтически приемлемый антиоксидант. такой как аскорбиновая кислота. один или несколько фармацевтически приемлемых полипептидов с низкой молекулярной массой (например. пептид. содержащий примерно от 2 до 10 аминокислотных остатков). один или несколько фармацевтически приемлемых белков. одна или несколько фармацевтически приемлемых аминокислот. таких как незаменимая для человека аминокислота. один или несколько фармацевтически приемлемых углеводов или материалов. производных от фармацевтически приемлемого углевода. таких как глюкоза. сахароза. сорбит. трегалоза. маннит. мальтодекстрин. декстрины. циклодекстрин и их комбинации. причем в одном из аспектов такой углевод. предпочтительно включающий в себя невосстанавливающий углевод. такой как невосстанавливающий сахар во избежание реакции МаШатб (имеющей место. когда компоненты. такие как восстанавливающий сахар и аминокислота. или пептид. или белок взаимодействуют). является предпочтительным.

- 14 008824 или, в другом аспекте, такой углевод предпочтительно включает в себя восстановление углевода, такого как восстанавливающий сахар, когда требуется реакция МаШагб; фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, такой как ΕΌΤΆ или ΌΤΡΆ, являющийся хелатирующим агентом для иона металла, такого как двухвалентный ион металла (например, Са⁺², Ре⁺², и тому подобные) или трехвалентный ион металла (например, Ре⁺³, Υ⁺³, Ьп⁺³, Еи⁺³ и другие лантаниды, и тому подобные ионы, которые могут необязательно включать в себя радионуклиды); глутатион; и другие стабилизаторы и наполнители, известные в области получения препаратов из белковых веществ. Предпочтительные носители включают в себя стерильный буферный солевой раствор при рН в интервале примерно от 6 до 8, предпочтительно, примерно при рН 7,4, и стерильную изотоническую композицию, содержащую солевой раствор, смешанный с фармацевтические приемлемым неспецифическим сывороточным альбумином.

Фармацевтические композиции по изобретению могут быть стерильными, подлежащими стерилизации и стерилизованными. Предпочтительный способ стерилизации включает в себя фильтрование через 0,2-микронный фильтр в стерильной среде. Стерильная фильтрованная композиция может помещаться в пузырек, предпочтительно, в стерильный пузырек, в единичное дозированное объемное количество или в интегральное количество множественных единичных доз (например, в количестве 2 единичных доз, 3 единичных доз, 4 единичных доз, и т. д.), предпочтительно в инертной атмосфере, например, в стерильном азоте или аргоне, и пузырьки запечатывают фармацевтически приемлемой пробкой, необязательно, с зажимной крышкой. В другом аспекте фармацевтическую композицию сушат путем удаления воды, например, водную среду можно удалить из каждой пробирки в процессе сушки, например, лиофилизацией или упариванием, чтобы оставался сухой или обезвоженный матрикс, содержащий слитый белок по изобретению, перед закрыванием и запечатыванием пузырька. В другом аспекте носитель может включать в себя стерильный или стерилизуемый гипертонический раствор образующего фармацевтически приемлемый матрикс материала или наполнителя, который совместим со слитым белком, например, такого как фармацевтически приемлемый невосстанавливающий углевод, вместе с соединением или слитым белком по изобретению, причем гипертонический раствор может помещаться в пузырек и высушиваться (например, лиофилизацией) для предоставления матрикса, содержащего слитый белок и образующий матрикс наполнитель, который может запечатываться в пузырьке пробкой. Перед использованием в пузырек может добавляться стерильная вода, например, стерильным шприцом или канюлей, причем вода растворяется в матриксе с получением раствора или суспензии слитого белка.

Для получения восстановленного раствора или суспензии, в виде изотонического раствора, подходящего для применения путем инъекции или имплантации, может добавляться достаточное количество воды.

Фармацевтические композиции по изобретению могут быть получены подходящими для введения млекопитающему, например, пациенту, различными путями. Предпочтительные пути введения включают в себя, например, внутрисуставной, внутриглазной, интраназальный, интраневральный, внутрикожный, внутрикостный, подъязычный, пероральный, местный, внутрипузырный, интратекальный, внутривенный, внутрибрюшинный, внутричерепной, внутримышечный, подкожный, ингаляцию, распыление и ингаляцию, применение непосредственно в опухоль, применения непосредственно в участок заболевания, применения непосредственно на края, оставшиеся после резекции или внутрь них. Другие характерные пути введения включают в себя энтеральный, необязательно с гастроскопической процедурой, и колоноскопию, каждый из которых может осуществляться путем амбулаторной процедуры и не требует операционных процедур и длительной госпитализации, но может требовать присутствия медицинского персонала.

Предоставленные здесь фармацевтические композиции могут помещаться в контейнеры вместе с упаковочным материалом, в которых предоставляются инструкции по применению таких материалов. В общем, такие инструкции включают в себя описание концентрации активного средства, а также, в некоторых вариантах осуществления, относительных количеств или сущности наполнителей, ингредиентов или растворителей (например, воды, солевого раствора или ΡΒ8). Кроме того, может быть необходимым восстановление противоопухолевой композиции и композиции, препятствующей метастазированию, или фармацевтическую композицию с получением фармацевтически приемлемого раствора или суспензии добавлением воды и необязательно также при встряхивании и обработке ультразвуком.

Фармацевтические композиции по изобретению могут использоваться в разнообразных хирургических процедурах. Например, в одном из аспектов настоящего изобретения фармацевтическая композиция (например, в виде раствора, суспензии или порошка, подходящего для применения в распыленной форме, или в форме аэрозоля или спрея, или покрытая пленкой) может применяться путем распыления (форма спрея или образующая аэрозоль форма) или путем ламинирования (пленки) на поверхности ткани пациента, нуждающегося в лечении, перед, во время или после хирургического удаления опухоли, такой как первичная опухоль, и необязательно на некоторой площади нормальной ткани непосредственно вблизи от опухоли, до площади ткани, удаление которой оставляет край нормальной ткани вокруг участка иссечения опухоли (край опухоли). В одном из аспектов процедура может предотвращать или, по существу, замедлять или ингибировать метастазирующий рост вторичной в нормальных окружающих тканях после удаления первичной опухоли у пациента. В другом аспекте процедура может предотвращать

- 15 008824 распространение заболевания (например, злокачественной опухоли) на окружающие ткани. В других аспектах настоящего изобретения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению (например, в виде спрея или аэрозоля) может доставляться путем эндоскопической процедуры, в которой композицию распыляют внутри пациента для обеспечения покрытия, содержащего слитый белок по изобретению, на опухоли и/или окружающей ткани, ближайшей к опухоли внутри пациента, причем данная опухоль оценивается и визуализируется эндоскопическими методами. В другом аспекте покрытие фармацевтической композицией ткани вблизи опухоли или вблизи участка иссечения опухоли может ингибировать ангиогенез в области ткани, которая покрыта фармацевтической композицией.

В других аспектах настоящего изобретения фармацевтическая композиция по изобретению может быть нанесена на поверхность имплантируемого устройства, такого как хирургическая сетка, проволока, стент, протезное устройство и тому подобное с образованием покрытого устройства, причем покрытие содержит слитый белок по изобретению и необязательно полимерный носитель, и данное покрытое устройство может имплантироваться в ткань или орган пациента как часть хирургического лечения, например, хирургического удаления злокачественной или доброкачественной опухоли, причем фармацевтическая композиция может предотвращать, или ингибировать, или задерживать, или замедлять рост вторичной опухоли вблизи расположения устройства, и в другом аспекте может также предотвращать, или ингибировать, или задерживать, или замедлять рост вторичной опухоли в ткани или органе, удаленном от участка имплантированного устройства. Концентрация слитого белка может составлять примерно от 0,01 до 20% от массы носителя, который образует покрытие устройства, и толщина покрытия может составлять примерно от 20 мкм до 1 мм. Покрытие может осуществляться способами покрытия, известными в области покрытых устройств. Например, покрытие, содержащее фармацевтическую композицию по изобретению может применяться на поверхности устройства посредством спрея или аэрозольного аппликатора, в котором фармацевтическая композиция в виде раствора в жидкости или текучей среде, содержащей растворитель, или в виде суспензии в жидкости или текучей среде, причем данная жидкость или текучая среда может испаряться во время и после применения в качестве спрея или аэрозоля, распыляется на поверхности устройства.

Необязательно, композиция для покрытия может содержать реакционноспособные функциональные группы, такие как олефины, или ангидридные группы, или активные сложные эфиры, или акцепторы реакции Михаэля, такие как молекулы с двойной связью между двумя углеродами, конъюгированной с карбонильной группой, причем двойная связь может взаимодействовать с амином белка или пептида, или желатина, такого как белок-носитель, и данные реакционноспособные химические функциональные группы могут химически или фотохимически образовывать перекрестные связи в носителе, которые могут предотвращать солюбилизацию или ограничивать, или модифицировать, или контролировать набухание (как функция концентрации реакционноспособных групп или времени воздействия условий перекрестного связывания, таких как ультрафиолет или гамма-облучение покрытого устройства) покрывающего носителя водянистой жидкостью в ткани, в которую имплантируют устройство. Контроль набухания может использоваться для контроля скорости, с которой слитый белок по изобретению мигрирует с устройства в ткань, ближайшую к устройству, и далее в организм пациента. Различные химические способы перекрестного связывания, известные в данной области, могут использоваться в данном аспекте изобретения, при том, что биологическая активность слитого белка не отменяется или элиминируется. Если органический растворитель, или сверхкритическую жидкость, или сжиженный газ используют в процессе покрытия, то может быть выбран фармацевтически приемлемый носитель, который не растворяется в водной среде, присутствующей в ткани вблизи участка имплантации, немедленно, но обеспечивает проникание слитого белка в водную среду.

Могут использоваться другие способы покрытия, такие как покрытие за счет окунания в композицию, окрашивание, покрытие, наносимое поливом, и ламинирование фармацевтической композиции по изобретению.

В одном из вариантов осуществления поверхность устройства вначале может покрываться первым слоем покрытия или затравочным слоем, который впоследствии покрывают фармацевтической композицией по изобретению в качестве второго покрывающего слоя. Затравочный слой может быть выбран так, что он прилипает к поверхности металлического или полимерного устройства, и к нему прилипает носитель второго покрывающего слоя. Затравочный слой также может включать в себя химические функциональные группы (например, которые могут присоединяться к полимеру в затравочном слое) и которые могут образовывать перекрестные связи со вторым слоем. Затравочный слой может необязательно содержать относительно мобильные молекулы, включающие в себя, например, две или большее число реакционноспособных функциональных групп, причем данные молекулы могут мигрировать во второй слой и взаимодействовать там с химическими функциональными группами с образованием перекрестных молекулярных мостиков.

В другом варианте осуществления фармацевтически приемлемый третий слой может быть нанесен на второй слой, причем третий слой необязательно лишен слитого белка. Третий слой может служить в качестве контроля или модификации скорости высвобождения слитого белка из устройства, например, обладая способностью растворяться или набухать или повышать свою проницаемость для воды или для

- 16 008824 слитого белка в зависимости от времени воздействия на второй слой, содержащий фармацевтическую композицию по изобретению, водной среды из ткани.

В одном из вариантов осуществления изобретения хирургическое сетчатое устройство, содержащее фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, нанесенную на поверхность проволочной или полимерной сетки, может использоваться или имплантироваться пациенту, например во время хирургической процедуры резекции рака брюшной полости пациента (например, после резекции толстой кишки) для предоставления основы для оставшейся структуры ткани. Сетчатое устройство с покрытием может высвобождать терапевтически эффективное количество активного компонента (такого как ВА-07) фармацевтической композиции, достаточное для предотвращения рецидива злокачественной опухоли путем предотвращения роста вторичной опухоли вблизи участка имплантации устройства с покрытием. Слитый белок может мигрировать из устройства со скоростью, достаточной для предоставления интервала терапевтически эффективных концентраций в ткани вблизи устройства.

Может использоваться предпочтительный в настоящее время интервал концентраций, составляющий примерно от 0,0001 мкг слитого белка на кубический сантиметр (см³) ткани до 100 мкг на кубический сантиметр ткани. Более предпочтительно в настоящее время интервал терапевтически эффективных концентраций составляет примерно 0,001 мкг на см³ до 50 мкг на см³ ткани.

В другом варианте осуществления сетчатое устройство с покрытием может высвобождать терапевтически эффективное количество активного компонента (такого как ВА-07) фармацевтической композиции, достаточное для предотвращения рецидива злокачественной опухоли путем предотвращения роста вторичной опухоли вдали от участка имплантации устройства с покрытием.

В других аспектах настоящего изобретения предоставлены способы лечения пациента в участке ткани, оставшейся на краю иссечения первичной опухоли (в участке иссечения опухоли), предусматривающее введение фармацевтической композиции по изобретению в ткань, оставшуюся на краю резекции первичной злокачественной опухоли после иссечения первичной опухоли, так что рецидив второй злокачественной опухоли и образование новых кровеносных сосудов в участке оставшейся ткани на краю первичной опухоли ингибируется. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция по изобретению, например, фармацевтическая композиция, содержащая ВА-07, вводится непосредственно в оставшуюся ткань в участке иссечения опухоли (например, наносится помазком, кистью, окрашиванием, распылением, путем аэрозоля, инъекцией, смыванием, намыливанием, или другим покрытием краев резекции опухоли фармацевтической композицией. Альтернативно, фармацевтическая композиция по изобретению, например, фармацевтическая композиция, содержащая ВА-07 в виде хирургической пасты, мази, крема, суспензии, геля и тому подобного, может наноситься на поверхность ткани.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция по изобретению, содержащая слитый белок, такой как ВА-07, наносится на остаточную ткань в участок иссечения опухоли печени, например, после резекции злокачественной опухоли в печени.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция по изобретению, содержащая слитый белок, такой как ВА-07, наносится после нейрохирургической операции (например, связанной с удалением опухоли головного мозга).

В одном из аспектов настоящего изобретения фармацевтическая композиция по изобретению, содержащая слитый белок, такой как ВА-07, может вводиться в ткань, оставшуюся на краю резекции опухоли, относящуюся к различным опухолям, включая, например, опухоли молочной железы, кишечника, головного мозга и печени. Например, в одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция по изобретению, содержащая слитый белок, такой как ВА-05, может вводиться в оставшуюся ткань после удаления первичной неврологической злокачественной опухоли после иссечения первичной опухоли, так что распространение клеток злокачественной опухоли в оставшуюся ткань и образование вторичной опухоли, и образование новых кровеносных сосудов в оставшемся краевом участке первичной опухоли ингибируется.

В головном мозге наблюдается высокая функциональная локализация: т.е., каждая конкретная анатомическая область специализирована для выполнения конкретной функции. Расположение злокачественной опухоли в головном мозге пациента (и патология головного мозга) может быть более значимой, чем тип ткани или тип опухоли.

Относительно малая опухоль или очаг повреждения в важнейшей области головного мозга может быть намного более разрушительным, чем гораздо более крупный очаг повреждения в относительно менее важной области головного мозга. Очаг на поверхности головного мозга может быть относительно легко удален хирургическим путем, в то время как опухоль сравнимого размера, но локализованную глубоко в головном мозге, труднее удалить хирургическим путем, поскольку доступ к глубокой опухоли может потребовать разрушения лежащей на пути ткани, например, путем разреза многих жизненно важных структур для достижения доступа и удаления глубокой опухоли. Кроме того, опасными для пациента могут быть и доброкачественные опухоли головного мозга. Доброкачественная опухоль может возникнуть в важной области и вызывать значительное нарушение окружающих тканей головного мозга и функции. Хотя лечение доброкачественной опухоли может осуществляться хирургическим путем, уда

- 17 008824 ление опухоли из глубокой ткани может оказаться невозможным. Оставаясь незамеченной, доброкачественная опухоль может расти, увеличиваться в объеме и вызывать повышенное внутричерепное давление. Если такое состояние остается без лечения, то жизненно важные структуры головного мозга могут сдавливаться и приводить к гибели пациента. Частота возникновения злокачественных опухолей ЦНС (центральной нервной системы) составляет примерно от 8 до 16 случаев на 100000 людей. Прогноз первичной злокачественной опухоли головного мозга неутешителен, со средним временем выживания менее одного года, даже после хирургической резекции. Опухоли головного мозга, особенно глиомы, преимущественно представляют собой местное заболевание, которое может рецидивировать в пределах примерно 2 см от исходного места заболевания после хирургического удаления.

Характерные примеры опухолей головного мозга, которые могут подвергаться лечению с использованием описанных здесь композиций и способов, включают в себя глиальные опухоли, такие как анапластическая астроцитома, мультиформная глиобластома, волосовидная астроцитома, олигодендроглиома, эпендимома, миксопапиллярная эпендимома, субэпендимома, папиллома хориоидного сплетения; нейрональные опухоли, такие как нейробластома, ганглионейробластома, ганглионейрома и медуллобластома; опухоли эпифиза, такие как пинеобластома и пинеоцитома; менингеальные опухоли, такие как менингиома, менингеальная гемангиоперицитома, менингеальная саркома; опухоли клеток оболочки нервов, такие как шваннома (нейролеммома) и нейрофиброма; лимфомы, такие как ходжкинская лимфома, неходжкинская лимфома, первичный и вторичный подтип ходжкинской лимфомы, первичный и вторичный подтип неходжкинской лимфомы (включая многочисленные подтипы данных опухолей, первичный и вторичные); недифференцированные опухоли, такие как краниофарингиома, эпидермоидные цисты, дермоидные цисты и коллоидные цисты; и метастазные опухоли, расположенные в головном мозге, которые могут происходить практически из любой опухоли, причем чаще всего происходят из опухолей легких, молочной железы, меланомы, почки и желудочно-кишечного тракта.

В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция по изобретению может применяться локально, например, местно или путем местного применения, в единичном дозированном количестве. Такое введение может включать в себя применение фармацевтической композиции в отношении внешней части эпидермиса, местное введение в ткань, подлежащую местному введению через ротовую полость, и местное закапывание в экспонированную ткань глаза, уха и носа, так что не более чем примерно 10%, и предпочтительно не более чем 1% единичной дозы слитого белка по изобретению (такого как ВА-07) приникает в кровяное русло пациента непосредственно.

В другом варианте осуществления изобретения фармацевтические композиции по изобретению могут вводиться системно, например, путем инъекции в кровеносный сосуд или лимфатический сосуд, например путем внутривенной инъекции.

Дополнительные пути введения включают в себя внутрибрюшинный, подкожный, внутримышечный, ректальный (например, в виде дозированной формы в суппозиториях), вагинальный (например, в виде пессария) и пероральную доставку. Дозированные формы по изобретению могут действовать в качестве депо, включающих в себя слитый белок по изобретению, причем данный слитый белок может мигрировать в ткань вблизи участка депо.

Композиции для применения при местном введении включают в себя, например, жидкие препараты или препараты геля, предпочтительно, подходящие для проникновения через кожу, такие как кремы, жидкие мази (т.е., применяемые на кожу путем втирания), лосьоны, масла, мази, пасты, и капли, подходящие для доставки в ткань или органы, такие как глаз, ухо, нос.

В одном из вариантов осуществлении изобретения слитый белок может иметь молекулярную массу примерно от 240000 до 300000 Да.

В другом варианте осуществления предоставленные здесь композиции могут образовывать пленки с толщиной от 100 мкм до 2 мм, или термически активные композиции, представляющие собой жидкость при одной температуре (например, выше, чем примерно 25°С) и твердое или полутвердое вещество при другой (например, ниже, чем примерно 25°С).

В другом аспекте настоящего изобретения предоставлены способы лечения ткани, оставшейся в участке иссечения злокачественной опухоли, предусматривающие введение фармацевтической композиции по изобретению, содержащей слитый белок, такой как ВА-05, в края, оставшиеся после резекции у пациента опухоли, так что местный рецидив злокачественной опухоли и образование новых кровеносных сосудов в данном участке ингибируется.

В другом аспекте настоящего изобретения предоставлены способы лечения участка иссечения опухоли, предусматривающие введение фармацевтической композиции по изобретению, содержащей слитый белок, такой как ВА-05, в край резекции опухоли после иссечения, так что местный рецидив злокачественной опухоли и образование новых кровеносных сосудов в данном участке ингибируется.

Другой аспект изобретения включает в себя фармацевтическую композицию по изобретению в наборе частей, таком как набор, содержащий контейнер и фармацевтическую композицию по изобретению; набор, содержащий закупоренный пузырек и фармацевтическую композицию по изобретению; набор, содержащий стерильный шприц и фармацевтическую композицию по изобретению; набор, включающий в себя стерильный шприц, содержащий фармацевтическую композицию по изобретению; набор, содер

- 18 008824 жащий спрей или аэрозольный аппликатор и фармацевтическую композицию по изобретению; набор, содержащий кистевой аппликатор и фармацевтическую композицию по изобретению; набор, содержащий катетер и фармацевтическую композицию по изобретению; набор, содержащий порошковый аппликатор и фармацевтическую композицию по изобретению (причем порошковый аппликатор может использоваться для введения фармацевтической дозированной формы по изобретению в виде порошка путем посыпания сухим (например, лиофилизованным) порошком при местном применении на ткань); набор, содержащий покрытое имплантируемое устройство и фармацевтическую композицию по изобретению, причем введение осуществляется путем имплантации.

Предоставляются фармацевтические продукты, содержащие, например, слитый белок, такой как ВА-05, который нарушает передачу сигнала К1ю. в контейнере; и устройство, такое как шприц, или инструмент, или кисть, или устройство для нанесения (например, аппликатор спрея или аэрозоля) во втором контейнере, для использования при нанесении слитого белка, такого как ВА-05, на ткань, образующую стенки опухолевой полости после хирургического удаления опухоли, или нанесения на кожу, например после удаления злокачественной меланомы.

Фармацевтическая композиция, способ и их применение по настоящему изобретению предназначены для использования на млекопитающем. В некоторых вариантах осуществления термин млекопитающее, как подразумевается, включает в себя людей, тогда как в других вариантах осуществления термин млекопитающее, как подразумевается, означает не относящееся к человеку млекопитающее.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут понятны после ссылки на ассоциированное подробное описание и прилагаемые фигуры.

Краткое описание фигур

На фиг.1 проиллюстрирован эффект композиции по изобретению, содержащей слитый белок ВА07, на пролиферацию клеток человеческой аденокарциномы эндометрия НЕС 1В, измеренный включением тимидина с тритием. Носитель (10) представляет собой фосфатно-солевой буфер, и ВА-07 используется в концентрациях 1 мкг/мл (11), 10 мкг/мл (12) и 50 мкг/мл (13). Пролиферация раковых клеток снижается путем, зависимым от дозы.

На фиг. 2 проиллюстрирован эффект композиции по изобретению, содержащей слитый белок ВА07, на пролиферацию клеток человеческой меланомы 8К-МЕЬ-1, измеренный введением обработанного тритием тимидина. Носитель представляет собой фосфатно-солевой буфер, и ВА-07 используют в концентрации, равной 1 мкг/мл, 10 мкг/мл и 50 мкг/мл. Пролиферация раковых клеток снижается путем, зависимым от дозы.

На фиг. ЗА проиллюстрировано образование трубок эндотелиальными клетками НИУЕС, культивируемыми в матриксе Ма(пде1™. Этот анализ представляет собой анализ клеточной культуры для ангиогенеза. Образование может наблюдаться в контроле, который не содержит слитого белка по изобретению, фиг. ЗА (сектор 30).

На фиг. ЗВ проиллюстрировано снижение образования эндотелиальных клеток НИУЕС, культивируемых в матриксе Ма1пде1™. Культуры, обработанные композицией по изобретению, содержащей слитый белок ВА-07, содержат меньше трубок, демонстрирующих ингибированием ангиогенеза, как показано на фиг. ЗВ, сектор 31.

На фиг. 4 показано ингибирование роста клеток человеческой карциномы почки ТК-10 композицией по изобретению, содержащей слитый белок ВА-07, измеренное в анализе ингибирования роста сульфородамина В (8КВ). Слитый белок ВА-07 используется в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 мкг/мл. Во всех используемых концентрациях пролиферация раковых клеток снижается. Снижение пролиферации раковых клеток является зависимым от дозы. В концентрации слитого белка 100 мкг/мл композиция по изобретению индуцировала клеточную гибель раковых клеток.

На фиг. 5 показано ингибирование роста клеток немелкоклеточного рака легких НОР-62 композицией по изобретению, содержащей слитый белок ВА-07, измеренное в анализе ингибирования роста сульфородамина В (8КВ). Слитый белок ВА-07 используется в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 мкг/мл. Во всех используемых концентрациях пролиферация раковых клеток снижается. Снижение пролиферации раковых клеток является зависимым от дозы.

На фиг. 6 показано ингибирование роста клеток рака ЦН С8Е-286 композицией по изобретению, содержащей слитый белок ВА-07, измеренное в анализе ингибирования роста сульфородамина В (8КВ). Слитый белок ВА-07 используется в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 мкг/мл. Во всех используемых концентрациях пролиферация раковых клеток снижается. Снижение пролиферации раковых клеток является зависимым от дозы.

На фиг. 7 показано снижение уровня активированной Р1юЛ после инкубации с 10 микрограммами на миллилитр слитого белка через 1, 2, 4, 6 и 24 ч после введения фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

На фиг. 8 показано ингибирование роста (в виде % роста по сравнению с контролем-носителем) клеток карциномы почки Сак1-1 композицией, содержащей слитые белки, например, ВА-07, причем % рост измерен анализом 8КВ при относительных концентрациях слитого белка, равных 0,1, 1, 10 и 100.

- 19 008824

Подробное описание

Все приведенные здесь ссылки, которые более подробно описывают процедуры, устройства или композиции, имеющие отношение к изобретению включены в качестве ссылки в полном объеме.

Способ получения слитых белков по изобретению, таких как ВА-05

ВА-05 представляет собой обозначение, данное белку по изобретению, полученному путем лигирования последовательности кДНК, кодирующей С3, с полученным в результате слияния 19-членным пептидом. Для иллюстрации способа получения слитого белка по изобретению может использоваться пример последовательности Ап!еппаре41а, добавленной к С-концу полипептида С3.

Стоп-кодон на 3'-конце последовательности ДНК может замещаться участком ЕсоК! путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров 5'САА ТТС ТТТ АСС АТТ САТ АСС ТОТ ОСС 3' (8ЕЦ ГО N0: 1) и 5' СОТ ОСС САС САТ ССТ ССА ААА 3' (8ЕЦ ГО N0: 2). Продукт ПЦР может субклонироваться в вектор р8ТВ1ие-1 (Nονадеη, С11у), затем он клонируется в вектор рСЕХ-4Т с использованием участка рестрикции ВатН I и №1 I. Данный вектор может называться рСЕХ-4Т/С3. Последовательность Ап!еппареЛа, которая может использоваться для добавления с 3'-конца С3 в рСЕХ-4Т/С3 может создаваться путем ПЦР из вектора рЕТ-3а (В1осй-Са11едо (1993) 120: 485-492; и Бего551 (1994) 269: 10444-10450), субклонирования в вектор р8ТВ1ие-1 с тупыми концами, затем клонирования в рСЕХ4Т/С3, с использованием участков рестрикции ЕсоК I и 8а1 I, с образованием рСЕХ-4Т/С3АРЬ.

Анализ последовательности ДНК может проводиться на последовательности, продуцирующей наилучший ответ по изобретению.

Клон рСЕХ-4Т/С3АРЬ (8ЕЦ ГО N0: 3) представляет собой предпочтительную в настоящее время последовательность и предоставляет белок, который является предпочтительно композицией по изобретению.

Пример С3-подобного слитого белка обозначен как рСЕХ-4Т/С3АРЬТ (8ЕЦ ГО N0: 4).

Два ПЦР-праймера конструировали для переноса одной серии рекомбинантных конструкций (ВА05) в систему рЕТ:

верхний праймер 5' йда!с!цдйссцоц!еа!а!£!с!ацац!сцасс!ц 3' (8ЕЦ ГО N0: 38) нижний праймер 5' сйсцца!ссаИай11с1сс11с11ссас11с 3' (8ЕЦ ГО N0: 39) .

Участок ВатШ находится с 5'-конца 8ЕЦ ГО N0: 39 щцйссаНа; ТСА замещен на ТААТ (айа, в 8ЕЦ ГО N0: 39).

Программа, которая может использоваться для амплификации продукта с использованием полимеразы Р£и включает в себя: 95°С 5' 1 цикл, затем 94°С 2'^56°С 2'^70°С 2' 10 циклов, затем 94°С 2'^70°С 3' 30 циклов и выдерживание при 4°С. Набор ^IΑЕXII (Ц1адеп) может использоваться для очистки из кусочка агарозного геля, содержащего требуемую полосу ДНК. Вставку и вектор расщепляют ВатШ и МеБ следуя инструкциям производителя, очищают с использованием электрофореза в агарозном геле и набора Ц^ЕХП (Ц1адеп), и инкубируют вместе в течение ночи с ДНК-лигазой Т4, следуя инструкциям производителя.

Е. сой (БН5-альфа, или, предпочтительно, ХЫ-В1ие) трансформируют смесью лигирования. Клоны могут проверяться индукцией в малом масштабе и 808-РАСЕ, и могут подтверждаться иммуноблоттингом неочищенных лизатов с антителом против С3. Плазмидную ДНК очищают, и могут оценивать ее чистоту. Могут проводить секвенирование ДНК (например, технологией Б1Сог, в которой целую цепь секвенируют по всей длине клона).

Первая конструкция, полученная таким образом (рЕТ3а-ВА-07, 8ЕЦ ГО N0: 7), совпадала с теоретической последовательностью ДНК конструкции рСЕХ/АРБТ с небольшим изменением с 5'-конца.

Вторая конструкция рЕТ9а-ВА-07 может быть получена субклонированием вставки их рЕТ3а-ВА07 в вектор рЕТ9а путем расщепления конструкции рЕТ3а ВатШ и NάеI (№\ν Епд1апб ВюБаЬк, Веνе^1у, Миннесота) по инструкциям производителя. Плазмидная ДНК рЕТ9а может расщепляться теми же самыми ферментами. ДНК вставки и ДНК вектора могут очищаться электрофорезом в агарозном геле. Вставка может лигироваться в новый вектор с использованием ДНК-лигазы Т4 (№\ν Епд1апб ВюБаЬк, Ве\'ег1у. Миннесота). Лигированной ДНК могут трансформироваться клетки БН5-альфа, и ДНК может быть получена с использованием мини- и макси-наборов Ц^СЕ№ Клоны могут характеризоваться расщеплением рестриктазами, и секвенированием ДНК вставки во всех направлениях (например, Вю8 & Т. БасЫпе, Квебек). ДНК конструкции могут трансформироваться клетки ВБ21 (БЕ3) и клетки ВБ21 (БЕ3)/рБу58.

Экспрессия белка рЕТ9а-ВА-07 (8ЕЦ ГО N0: 57) была выше в ВБ21 (БЕ3) по сравнению с ВБ21 (БЕ3)/рБу58.

Белки по настоящему изобретению могут быть получены из экстрактов бактериальной клетки или путем использования рекомбинантных способов трансформации, трансфекции или инфекции клеткихозяина всем фрагментом ДНК, кодирующим слитый белок, или его частью, например, фрагментом ДНК, кодирующим ВА-05, транспортной последовательностью, происходящей из Ап!еппарей1а, в подходящем экспрессирующем носителе.

Специалисту в области молекулярной биологии понятно, что различные экспрессирующие системы могут использоваться для предоставления рекомбинантного белка по изобретению. Выбор конкретной

- 20 008824 клетки-хозяина обычно не важен для изобретения, и возможны варианты между различными клеткамихозяевами.

Слитый белок может очищаться с использованием способов очистки белка, известных в данной области, например, способов аффинной очистки или колоночной хроматографии с использованием смол, которые отделяют молекулы на основании свойств, таких как заряд, размер и гидрофобность. Подходящие способы аффинной очистки включают в себя те, которые используют антитело (например, С8Т), специфичное для экспрессируемого слитого белка. Помеченные гистидином белки могут селективно элюироваться имидазол-содержащими буферами. Альтернативно, рекомбинантный белок может сливаться с иммуноглобулиновым Ес-доменом. Такой слитый белок может легко очищаться с использованием колонки с белком А.

Любые из данных способов могут автоматизироваться и оптимизироваться для предоставления высокой воспроизводимости и производительности с использованием коммерчески доступного оборудования для жидкостной хроматографии, специализированного для очистки белка. Представляется, что малые молекулы, пептиды, или другие миметики описанных выше антагонистов, также относятся к изобретению.

Оценки биологической активности фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению, такой как ВА-05

Изменение инактивации Шю

Способность ВА-05 и ВА-07 инактивировать Шю может быть продемонстрирована с использованием анализа клеточной культуры. В данном анализе клеточную линию высевают в культуру ткани при соответствующих условиях. Например, клетки N0108 могут высеваться, и их оставляют пролиферировать до полусомкнутости. N0108 представляет собой нейробластому X глиому, образованную посредством индуцированного вирусом Сендай слияния клона нейробластомы Ν18ΤΟ-2 и клона глиомы крысы С6Ви-1. Затем клетки собирают, гомогенизируют, и проводят анализ осаждения Шю. Анализ осаждения использует «приманку», которая связывается с активным Шю. В анализе авторов изобретения они могут использовать, например, домен связывания с Шю (ШЮ) из Шю1ескш. Другие белки, такие как Штокиназа, также могут использоваться. «Наживка» связана с гранулой, так что она может осаждаться из гомогената. ШЮ связывается с СТР-Што в гомогенате и не связывается с СОР-Што. Таким путем может активный Шю в клеточной культуре может оцениваться количественно. Степень, с которой ВА-07 инактивирует Шю в клеточной линии может демонстрироваться путем обработки образца клеток клеточной линии до выполнения анализа осаждения.

Анализ осаждения может использоваться для определения количества активного Шю в солидной опухоли. Образец опухоли гомогенизируют в буфере, проводят анализ осаждения, и количество СТР Шю может сравниваться с количеством, обнаруженным в нераковой ткани. Данный анализ по выявлению активного Шю может использоваться для диагностики опухолей, при которой сравнивают клетки с высоко активированными уровнями Шю, и которые могут реагировать по изобретению, например, на терапию ВА-07. Измерение активированного Шю может быть более чувствительным, чем простое определение уровней экспрессии Шю.

Анализ осаждения ίη 8Йи может использоваться для выявления СТР-Што в гистологических срезах. Для данного анализа криосрезы (каждый примерно 16 мкм в толщину) образцов опухоли после фиксации 4% РЕА инкубировали с бактериальным лизатом, содержащим КВС-С8Т в течение ночи при 4°С. Срезы затем промывали 3 раза в ТВ8, блокировали в 3% В8А примерно в течение 1 ч при комнатной температуре и инкубировали с антителом против С8Т (СеЦЦдиаШид, Νε\ν ЕпДапс! Вю1аЬ§, Мкыккаида, Канада) и со специфичными в отношении клеточного типа антителами для идентификации специфичных клеток, и инкубировали в течение ночи при 4°С. Срезы промывали в ТВ8 и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с конъюгированным Е1ТС, Техасским красным или родамином вторичным антителом для выявления иммунореактивности (1аск5Оп1ттипоРс5сагс11. Мкыккаида, Канада).

Подробности последовательностей ДНК и белковых последовательностей ВА-05

В отношении изобретения подходящие слитый белок, обозначенный как ВА-05, имеет следующую кодирующую последовательность ДНК, показанную здесь с использованием общепринятой номенклатуры С, А, Т, и С. В олигонуклеотидных последовательностях по изобретению символы С, С, А и Т имеют их общепринятое значение.

ССАТССТСТА	САСТС6АССТ	ССАСССАТбС	ААТССТТАТТ	ССАТТААТСА	50
АААСССТТАТ	ТСАААТАСТТ	АССАССАСТТ	ТАСТААТАТТ	САТСААССАА	100
ААССТТСССС	ТААТССТСАС	ТАТАААААСТ	АТССАСТААС	САААТСАСАА	150
АААСААССТА	ТАСТАТСАТА	ТАСТААААСС	ССТАСТСААА	ТАААТССААА	200
ССТААСАСАА	ААТААСССАС	ТТАТСААТСС	АТТТССТТСА	ΑΑΤΤΤΑΆΤΑΑ	250

-21 008824

ААСААСТТСА АСТТТТАСАТ АААТСТТТТА АТААААТСАА САССССТСАА300

ААТАТТАТСТ ТАТТТАСАСС ССАССАСССТ ССТТАТТТАС ЕААСАСААТТ350

ТСАААА.САСТ СТТСТТААТТ САААТССТАС ААТТААТААА АС6ССТТТТС400

ААААСС-СТАА АССТААСТТТ ТТАААТАААС АТАСАСТТСА АТ АТ С С АТ АТ 450

АТТАСТАСТТ САТТААТСАА ТСТТТСТСАА ТТТССАССАА САССААТТАТ 500

ТАСААААТТТ ААА6ТАССАА АА6ССТСААА СССАССАТАТ АТТСАСССТА 550

ТТАСТССТТТ ТССАССАСАА СТТСАААТСТ ТССТТССТАС АСАТАСТАСТ600

ТАТСАТАТАС АС6АТАТСАС АТТСТСТТСТ САТССТАААС ΆΑΑΤΑΑΤΑΑΤ650

ТАСАССААСА АТСАТССССА САССТАТСАА ТССТАААСАА ТТССТСАТСА700

АТСССССААА СССССААССС АСАСАТАСАС ССССТАССА6 АСТСТА6АСС 750

ТАСАСААССА СТТТСАСТТС ААТСССТАСТ ТСА

783 [5Е0 10 N0: 56)

Кодирующая последовательность белка рСЕХ-4ТВА-05

С1у

Зег

Агд

νβΐ

Азр

Ьеи

Б1п

А1а

Суз

Азп

А1а

Туг

Зег

Не,

Азп

1

5

10

15

С1п

Ьуз

А1а

Туг

Зег

Азп

ТЬг

Туг

С1п

С1и

РЬе

ТЬг

Азп

11е

Азр

Б1п

20

25

30

А1а

Ьуз

А1а

Тгр

31 у

Азп

А1а

С1П

Туг

Ьуз

Туг

Б1у

Ьеи

Зег

Ьуз

35

40

45

Зег

С1и

Ьуз

Б1и

А1а

Не

Уа1

Зег

Туг

ТЬг

ьуз

Зег

А1а

Зег

С1и

Не

50

55

60

Азп

С1у

Ьуз

Ьеи

Агд

С1п

Азп

Ьуз

Б1у

Уа1

Не

Азп

С1у

РЬе

Рго

Зег

65

70

75

80

Азп

Ьеи

Не

Ьуз

С1п

Уа1

Е1и

Ьеи

Азр

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

Ьуз

МеЬ

В5

90

95

Ьуз

ТЬг

Рго

С1и

Азп

11е

МеЬ

Ьеи

РЬе

Агд

Б1у

Азр

Рго

А1а

Туг

100

105

но

Ьеи

С1у

ТЬг

С1и

РЬе

С1п

Азп

ТЬг

Ьеи

Азп

Зег

Азп

С1у

ТЬг

Не

115

120

125

Азп

Ьуз

ТЬг

А1а

РЬе

С1и

Ьуз

А1а

Ьуз

А1а

Ьуз

РЬе

Ьеи

Азп

Ьуз

Азр

130

135

140

Агд

Ьеи

С1и

Туг

С1у

Туг

Не

Зег

ТЬг

Зег

Ьеи

МеЬ

Азп

Уа1

Зег

С1п

145

150

155

160

РЬе

А1а

еху

Агд

Рго

Не

ТЬг

Ьуз

РЬе

Ьуз

Ца1

А1а

Ьуз

С1у

Зег

165

170

175

Ьуз

А1а

С1у

Туг

Не

Азр

Рго

11е

Зег

А1а

РЬе

А1а

С1у

61п

Ьеи

С1и

180

185

190

МеЬ

Ьеи

Рго

Агд

Н13

Зег

ТЬг

Туг

Н1з

Не

Азр

МеЬ

Агд

Ьеи

195

200

205

Зег

Азр

С1у

Ьуз

СЬп

Не

ТЬг

А1а

ТЬг

Ме£

МеЬ

С1у

ТЬг

210

215

220

А1а

Не

АЗП

Рго

Ьуз

Б1и

РЬе

Уа1

Ме£

АЗП

Рго

А1а

Азп

А1а

31п

Б1у

225

230

235

240

Агд

Ыз

ТЬг

Рго

С1у

ТЬг

Агд

Ьеи

245 (5ЕС Ю N0: 37

Праймер 1, который может использоваться для продукции ВА-07: ддаЬсЬддЕЕ ссдсдЕсаСа ЬдЬсЕададЕ сдассЕд (ЗЕО Ю N0: 38)

Праймер 2, который может использоваться для продукции ВА-07: сдсддаЬсса ЬЬадЬЪсЬсс ЬЬсЬЕссасЬ Ьс (ЗЕО Ю ЫО: 39)

-22008824

Кодирующая последовательность ДНК рЕТ9а-ВА-07 Последовательность белка рЕТ9а-ВА-07

МеЬ

Зег

Агд

УаЬ

Азр

Ьеи

6Ьп

АЬа

Суз

Азп

А1а

Туг

Зег

11е

Азп

С1п

1

5

10

15

Ьуз

АЬа

Туг

Зег

Азп

ТНг

Туг

С1п

СЬи

РЬе

ТНг

Азп

Не

Азр

С1п

А1а

20

25

30

Ьуз

АЬа

Тгр

СЬу

Азп

АЬа

С1п

Туг

Ьуз

Туг

С1у

Ьеи

Зег

Ьуз

Зег

35

40

45

С1и

Ьуз

С1и

АЬа

Не

УаЬ

Зег

Туг

ТЬг

Ьуз

Зег

АЬа

Зег

СЬи

11е

Азп

50

55

60

С1у

Ьуз

Ьеи

Агд

С1п

Азп

Ьуз

С1у

Уа1

Не

Азп

СЬу

РЬе

Рго

Зег

Азп

65

70

75

80

Ьеи

Не

Ьуз

С1п

Уа1

СЬи

Ьеи

Азр

Ьуз

Зег

РНе

Азп

Ьуз

МеЬ

Ьуз

85

90

95

ТЬг

Рго

С1и

Азп

Не

МеЬ

Ьеи

РЬе

Агд

СЬу

Азр

Рго

АЬа

Туг

Ьеи

100

105

110

С1у

ТНг

С1и

РЬе

С1п

Азп

ТЫ

Ьеи

Азп

Зег

Азп

СЬу

ТЬг

Не

Азп

115

120

125

Ьуз

ТНг

АЬа

РНе

СЬи

Ьуз

АЬа

Ьуз

АЬа

Ьуз

РЬе

Ьеи

Азп

Ьуз

Азр

Агд

130

135

140

Ьеи

21и

Туг

С1у

Туг

Не

Зег

ТЬг

Зег

Ьеи

МеЬ

Азп

УаЬ

Зег

СЬп

РЬе

145

150

155

160

АЬа

С1у

Агд

Рго

11е

Не

ТНг

Ьуз

РЬе

Ьуз

Уа1

АЬа

Ьуз

С1у

Зег

Ьуз

165

170

175

АЬа

СЬу

Туг

11е

Азр

Рго

Не

Зег

АЬа

РЬе

АЬа

СЬу

С1п

Ьеи

СЬи

Μθΐ

1В0

185

190

Ьеи

Рго

Агд

ΗΪ3

Зег

ТЬг

Туг

НЬз

Не

Азр

МеЬ

Агд

Ьеи

Зег

195

200

205

Зег

Азр

ОЬу

Ьуз

СЬп

Не

ТНг

АЬа

ТЬг

МеС

МеЬ

СЬу

ТЬг

АЬа

210

215

220

Не

Азп

Рго

ьуз

СЬи

РЬе

Уа1

меь

Азп

Рго

АЬа

Азп

АЬа

С1п

С1у

Агд

225

230

235

240

НЬз

ТНг

Рго

СЬу

ТНг

Агд

Ьеи

245 (ЗЕС ΙΠ N0: 57)

Аминокислотный остаток включает в себя группу -ΝΗ-ΟΚ.ιΒ.₂-0Ο-, причем аминокислотный остаток локализован внутри пептида. Остаток образован из соответствующей аминокислоты ΝΗ₂-0'Ε|[%СООН, где К.1 и К₂ представляют собой заместители, противолежащие у центрального углерода аминокислоты, составляя оставшуюся часть аминокислоты после потери Н₂О с образованием амидной или пептидной связи с другими аминокислотами, одну у атома азота и одну на карбониле карбоновой кислоты. Аминокислотный остаток с Ν-конца пептида включает группу ΝΗ₂-€.'Β| В₂-С О-. в которой карбонил связан пептидной связью с другим аминокислотным остатком в пептиде. Аминокислотный остаток с Сконца пептида включает в себя группу -ΝΗ-ΟΚιΚ₂-ΟΟΟΗ, в которой азот связан пептидной связью с другим аминокислотным остатком пептида.

Аминокислотные остатки, которые могут присутствовать в пептидных и белковых последовательностях по изобретению иногда обозначаются трехбуквенными кодами или однобуквенными кодами, обычно используемыми в данной области, причем данные коды включают в себя глицин как С1у или С; аланин как А1а или А;

валин как Уа1 или V; лейцин как Ьеи или Ь; изолейцин как Не или I; метионин как Ме! или М; фенилаланин как Рйс или Е;

триптофан как Тгр или XV: пролин как Рго или Р; серин как 8ег или 8; треонин как ТНг или Т; цистеин как Суз или С; тирозин как Туг или Υ; аспарагин как Азп или Ν; глутамин как С1п или ζ):

аспарагиновую кислоту как Азр или ϋ; глутаминовую кислоту как С1и или Е; лизин как Ьу8 или К; аргинин как Аг§ или К; и гистидин как Ηίβ или Н. Другие аминокислоты, которые не являются незаменимыми аминокислотами, могут вводиться с использованием способов пептидного синтеза, известных в данной области, или химической модификации, например, ацилирования (например, реакцией эпсилонаминогруппы лизина с активным эфиром, содержащим карбонильную группу, с образованием связи ме

-23 008824 жду эпсилонаминогруппой и карбонильной группой), алкилирования, образования мочевины, образованием уретана и тому подобного, с добавлением к пептидной цепи химических функциональных групп, содержащих гидрофобные группы (например, с С-1 по С-18 алкил и/или аралкил, который может быть насыщенным, ненасыщенным, или содержать карбоксильные группы, такие как пролинамид), с добавлением положительно заряженных групп, таких как группы четвертичных аминов алкилов или основные аминогруппы, которые могут быть протонированными при рН, имеющемся у пациента со злокачественной опухолью, или с добавлением обоих видов групп.

В пептидах и белках по изобретению относительно неполярные и гидрофобные аминокислотные остатки могут включать в себя С, А, V, Ь, I, Μ, Р, А и Р; относительно полярные и гидрофильные аминокислотные остатки могут включать в себя 8, Т, С, Υ, N и О; анионные и гидрофильные аминокислотные остатки могут включать в себя Ό и Е, где в каждом из Ό и Е функциональная группа карбоновой кислоты может находиться в депротонированной форме, такой как анионный карбоксилат; катионные гидрофильные аминокислотные остатки могут включать в себя К, в котором основная первичная эпсилонаминогруппа может быть в протонированной форме в виде катионной аминогруппы, Н, в котором азот имидазола может находиться в протонированной форме с обеспечением катионной группы имидазола, и К, который может включать в себя протонированную амидную группу.

Противометастазные свойства фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению

В одном из аспектов фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по изобретению, может вводиться, например, инъекцией или местным применением, например, способом покрытия или другим способом, описанным здесь, на ткань вблизи первичной опухоли, или на ткань самой этой опухоли, млекопитающему, нуждающемуся в лечении и может ингибировать миграцию метастазирующей опухолевой клетки в млекопитающем, причем данная опухолевая клетка происходит из участка первичной опухоли млекопитающего, в участок здоровой или нормальной ткани млекопитающего, которая функционально связана и расположена вблизи ткани, в которой находится первичная опухоль. Например, фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по изобретению, может вводиться в ткань почки вблизи опухоли почки млекопитающего или в ткань, содержащую эту опухоль, и может ингибировать миграцию метастазирующей опухолевой клетки почки из опухоли почки в здоровую ткань в той же почке, где находится первичная опухоль.

В другом аспекте фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по изобретению, может вводиться, например, путем инъекции, или покрытия, или другим описанным здесь способом, в ткань вблизи первичной опухоли или в содержащую опухоль ткань нуждающегося в этом лечении млекопитающего, и может ингибировать миграцию метастазирующей опухолевой клетки в млекопитающем, причем данная опухолевая клетка происходит из участка первичной опухоли млекопитающего, в участок здоровой или нормальной ткани млекопитающего, которая функционально отделена и расположена вдали от ткани, в которой находится первичная опухоль. Например, фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по изобретению, может вводиться в головной мозг, содержащий опухоль головного мозга, и может ингибировать миграцию метастазирующей опухолевой клетки в здоровые ткани по всему организму, например, в ткань печени, селезенки или легкого.

В другом аспекте после введения пациенту, нуждающемуся в лечении, фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению, метастазирующая миграция злокачественной опухолевой клетки по изобретению предотвращается или ингибируется, и может существенно снижать или полностью предотвращать образование вторичной опухоли и может предотвращать распространение вторичной злокачественной опухоли у пациента.

Демонстрация того, что слитый белок по изобретению, такой как ВА-07, может снижать подвижность клеток.

Терапевтическая эффективность фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению (такой как ВА-05), в качестве средства против метастазирования может быть продемонстрирована, например, количественно, посредством анализа двухмерной инвазии клеток ΐπ νίΙΐΌ. В одном из таких анализов ингибирование способности к метастазирующей миграции злокачественной клетки может измеряться с использованием имеющихся в продаже камер Бойдена. Камеры Бойдена имеют два отделения, где верхнее и нижнее отделения разделены мембраной. Степень миграции клеток выявляется высеванием общего количества клеток в верхнее отделение, и подсчетом доли их общего количества, которые мигрируют в нижнее отделение. В нижнее отделение могут добавляться факторы роста для усиления миграции клеток. Данная модель может использоваться в качестве модели миграции клеток злокачественной опухоли ίπ у1уо у млекопитающего. Для тестирования способности фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению (такой как ВА-07 в стерильном фосфатно-солевом буфере, который изотоничен в отношении крови млекопитающего) блокировать миграцию опухолевых клеток, композицию, содержащую ВА-07, добавляют при различных концентрациях ВА-07 к клеткам злокачественной опухоли в верхнем отделении. Долю общего числа клеток, которые мигрируют в нижнее отделение в присутствии композиции слитого белка, подсчитывают и сравнивают с контролями, в которых слитый белок находится в нулевой концентрации.

- 24 008824

Число раковых клеток, которые мигрируют в контрольном эксперименте моделирует такую миграцию в пациенте со злокачественной опухолью, которого не лечат композицией по изобретению. Число раковых клеток, которые мигрируют в присутствии аликвоты композиции по изобретению, моделирует такую миграцию в пациенте со злокачественной опухолью, которого лечат аликвотой композиции по изобретению. Разница между последним числом и числом миграции клеток в контрольном эксперименте может выражаться в процентах и может изменяться от 100% (т.е., полное ингибирование миграции метастазирующей клетки) примерно до 5%, предпочтительно, примерно от 100 до 50%, более предпочтительно примерно от 100 до 75%, и, наиболее предпочтительно примерно от 100 до 90%. Количество 0% может наблюдаться, когда первый контрольный носитель сравнивают со вторым контрольным носителем, который может быть тем же, что и первый контрольный носитель. Вычисление данного процента дается решением выражения = {(число клеток, мигрирующих в контроле, минус число клеток, мигрирующих в присутствии слитого белка) разделить на (число клеток мигрирующих в контроле)}, умножить на 100%.

Терапевтическая эффективность фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению (например, ВА-05) в качестве средства против метастазирования может быть продемонстрирована, по меньшей мере, количественно и в одном аспекте посредством трехмерного анализа клеточной инвазии 1п νίΙΐΌ. В одном из таких анализов ингибирование способности к местастазирующей миграции злокачественной клетки может измеряться изменением относительной способности злокачественной клетки мигрировать через матрикс ΜΑΤΚ1ΟΕΕ™ после обработки клеток фармацевтически приемлемым препаратом, содержащим слитый белок по изобретению в носителе, по сравнению к способности злокачественной клетки мигрировать через матрикс ΜΑΤΚ1ΟΕΕ® после обработки клеток носителем в качестве контроля сравнения, причем носитель не содержит слитый белок. В одном из аспектов слитый белок по изобретению может ингибировать миграцию метастазирующей опухолевой клетки в модели тканевого матрикса с продукцией ингибиторного изменения в виде снижения скорости миграции клетки или в виде снижения расстояния миграции клеток в период времени.

Относительное изменение расстояния миграции злокачественной клетки через модельный матрикс равно разнице в расстоянии миграции клетки в присутствии слитого белка и носителя и расстоянию миграции клетки в присутствии контрольного носителя в отсутствие слитого белка, причем данная разница делится на расстояние миграции контрольного носителя. Относительные изменения могут выражаться в процентах и могут изменяться от 100% (полное ингибирование миграции метастазирующей клетки) примерно до 5%, предпочтительно от 100% примерно до 50%, более предпочтительно, примерно от 100 до 75%, и наиболее предпочтительно примерно от 100 до 90%. Количество 0% может наблюдаться, когда первый контрольный носитель сравнивают со вторым контрольным носителем, который может быть таким же как первый контрольный носитель.

В одном варианте осуществления сравнение эффективностей двух слитых белков А и В по изобретению, причем данные слитые белки отличаются один от другого по их аминокислотной последовательности, например, по их соответствующей повышающей проникновение через мембрану последовательности, может обеспечивать различные наблюдаемые процентные доли ингибирования миграции данного типа опухолевых клеток, вызванные воздействием А и В. Относительные различия (абсолютная процентная доля, такая как 100% для А, по сравнению с 80% для В, или качественные отличия, например А лучше В) по ингибированию могут быть одинаковыми от одного типа опухоли до другого или могут изменяться от одного типа опухоли до другого.

В одном из аспектов слитый белок по изобретению может существенно (100%) ингибировать метастазирующую миграцию по меньшей мере одного типа опухолевой клетки.

В другом аспекте слитый белок по изобретению может существенно (100%) ингибировать метастазирующую миграцию, по меньшей мере, двух типов опухолевой клетки.

Полезный анализ основан на наблюдаемой способности инвазивной опухолевой клетки мигрировать через искусственную базальную мембрану (МЛТК1СЕЬ™). В данном анализе изменение способности различных клеточных типов злокачественной опухоли, каждого с отличающейся способностью мигрировать через ΜΑΤΚ1ΟΕΕ™ в отсутствие обработки композицией по изобретению и, следовательно, с отличающейся метастазирующей инвазивностью оценивают воздействием интервалом концентрации или дозы слитого белка по изобретению от 0,1 мкг/мл до 100 мкг/мл. Предпочтительный интервал концентрации составляет примерно от 0,0001 мкг слитого белка на кубический сантиметр (см²) ткани до 100 мкг на кубический сантиметр ткани.

Матрикс Ма1пде1™ (ΒΌ Вюкшепсек) представляет собой солюбилизированную базальную мембрану, выделенную из мышиной саркомы ЕН8, опухоли, богатой белками ЕСМ. Его важнейшими компонентами являются ламинин, коллаген IV, гепарансульфатпротеогликаны, и энтактин. При комнатной температуре матрикс ΒΌ Ма!пде1™ полимеризуется с продукцией биологически активного матриксного материала, который может имитировать базальную мембрану клеток млекопитающих, где клетки могут вести себя ш У11го путем, сходным с условиями ш у1уо. Матрикс Ма1пде1™ может предоставлять биологически релевантной окружение для исследований клеточной морфологии, биохимической функции, миграции или инвазии и генной экспрессии.

- 25 008824

Ингибирование ангиогенеза фармацевтической композицией, содержащей слитый белок по изобретению, такой как ВА-05, и ее эффект на капилляроподобные или тубулярные структуры В одном из аспектов фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по изобретению, может вводиться, например, инъекцией или покрытием или другим описанным здесь способом в ткань вблизи первичной опухоли или в содержащую данную опухоль ткань нуждающемуся в лечении млекопитающему и может ингибировать процесс ангиогенеза метастазирующей опухолевой клетки или группы опухолевых клеток млекопитающего, причем опухолевая клетка или группа клеток происходит из участка первичной опухоли млекопитающего, в участок здоровой или нормальной ткани млекопитающего, которая функционально связана и расположена вблизи ткани, в которой находится первичная опухоль. Например, фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по изобретению, может вводиться в ткань почки вблизи опухоли почки млекопитающего или в ткань, содержащую эту опухоль, и может ингибировать процесс ангиогенеза метастазирующей опухолевой клетки почки из опухоли почки в здоровую ткань в той же почке, где находится первичная опухоль.

В другом аспекте фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по изобретению, может вводиться, например, путем инъекции, или покрытия, или другим описанным здесь способом, в ткань вблизи первичной опухоли или в содержащую опухоль ткань нуждающегося в этом лечении млекопитающего, и может ингибировать процесс ангиогенеза, ассоциированный с ростом метастазирующей опухолевой клетки в млекопитающем, причем данная опухолевая клетка происходит из участка первичной опухоли млекопитающего, в участок здоровой или нормальной ткани млекопитающего, которая функционально отделена и расположена вдали от ткани, в которой находится первичная опухоль. Например, фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по изобретению, может вводиться в головной мозг, содержащий опухоль головного мозга, и может ингибировать ангиогенез метастазирующей опухолевой клетки в здоровые ткани по всему организму, например, в ткань печени, селезенки или легкого.

В другом аспекте после введения пациенту, нуждающемуся в лечении, фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению, ангиогенез, ассоциированный с образованием метастазов и ростом злокачественной опухолевой клетки, может предотвращаться или ингибироваться. Введение пациенту, нуждающемуся в лечении, фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению, может существенно снижать или полностью предотвращать ангиогенез, ассоциированный с образованием вторичной опухоли и может предотвращать распространение и укоренение злокачественной опухоли у пациента.

Образование новых кровеносных сосудов при ангиогенезе важно для роста первичной опухоли и последующего роста вторичной опухоли, образованной из клетки или группы клеток первичной опухоли метастазированием. Ингибирование ангиогенеза фармацевтической композицией, содержащей слитый белок по изобретению, такой как ВА-07, может оцениваться в системе ίη νίΙΐΌ. которая может использоваться для исследования ангиогенеза при росте опухоли, т.е., в системе, включающей в себя культивирование эндотелиальных клеток в присутствии экстракта базальной мембраны (Ма1пде1). В условиях экспериментального наблюдения капилляроподобные структуры или тубулы, ассоциированные с ангиогенезом или образованием капилляров крови, могут наблюдаться в микроскопе. Ингибиторные эффекты слитого белка по изобретению, такого как ВА-05, в отношении прогрессирования ангиогенеза или образования тубулярной капиллярной сети или в отношении нарушения процесса или прогресса ассоциированного с опухолью ангиогенеза, может наблюдаться путем слежения за исчезновением тубулярных структур в анализе с использованием Ма1пде1.

В анализе с использованием Ма1пде1 его (примерно 12,5 мг/мл) оттаивают примерно при 4°С. Матрикс (примерно 50 мкл) добавляют в каждую лунку 96-луночного планшета и позволяют ему затвердевать примерно в течение 10 мин примерно при 37°С. Лунки, содержащие твердый Ма(г1де1, инкубируют примерно в течение 30 мин с клетками НИУЕС в концентрации примерно 15000 клеток на лунку. Когда клетки прилипают, среду удаляют и заменяют свежей средой, дополненной слитым белком по изобретению, таким как ВА-05, и инкубируют при 37°С примерно в течение 6-8 ч. Контрольные лунки инкубируют с одной средой. Для анализа роста образование трубок может визуализироваться микроскопией, например, при 50Х увеличении. Относительная средняя длина Υ_χ происходящей вследствие ангиогенеза капиллярной сети, наблюдаемой при оценке фармацевтической композиции, содержащей слитый белок х по изобретению, может подвергаться количественному анализу с использованием программного обеспечения Ыоййет ЕеНрке по инструкциям.

Данные обычного эксперимента по анализу с использованием Ма1пде1, например, относящиеся к эффекту фармацевтической композиции, содержащей слитый белок, обозначенный как ВА-05, в отношении длины происходящей вследствие ангиогенеза капиллярной сети, суммированы в табл. 1. Эти данные показывают, что образование сети ингибируется примерно на 13-20% при использовании условий дозы и препарата по сравнению с ингибированием, продуцируемым контрольным носителем, где нулевое ингибирование предоставляет 100% роста. Данное действие на ангиогенез может усиливаться с использованием более высоких доз слитого белка и предварительной инкубации клеток НИУЕС с ВА-05 перед добавлением клеток на МаРтдеЕ

- 26 008824

Таблица 1. Эффект против ангиогенеза фармацевтической композиции, содержащей слитый белок ВА05, в отношении средней длины капиллярной сети, в анализе с использованием матрикса Майтде!

Средняя длина капиллярной сети, ассоциированной с ангиогенезом	Относительная средняя длина капиллярной сети, продуцируемой в присутствии контрольного носителя	Относительная средняя длина капиллярной сети, продуцируемой в присутствии фармацевтической композиции, содержащей слитый белок ВА-05 в концентрации 10 микрограмм на миллилитр
Υ1	100	86, 4
Υ2	100	78,2
Υ3	100	86,7

Активность против пролиферации фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению, такой как ВА-07

Демонстрация того, что слитый белок по изобретению, такой как ВА-07, может воздействовать на множественные аспекты фенотипов злокачественных клеток, может быть проведена за счет мониторинга включения меченного тритием тимидина в пролиферирующие и растущие клетки, где меченный тритием тимидин, добавленный в среду для культивирования клеток, захватывает клетками и становится в них частью пула тимидинтрифосфатов, который используется каждой клеткой для синтеза ДНК. Меченный тритием тимидин становится ковалентно введенным в макромолекулы ДНК в каждой клетке. В клетки, которые не растут или в клетках, которые гибнут за счет апоптоза или некроза, меченный тритием тимидин не захватывается или высвобождается в среду после лизиса клеток. Включение меченного тритием тимидина может использоваться в качестве общего измерения эффекта слитого белка по изобретению, такого как ВА-07 в отношении роста клеток, деления клеток, покоя клеток и гибели клеток. Клеточные линии, в которых ВА-07 индуцирует снижение включения ³Н-тимидина, включают в себя клеточную линию рака эндометрия человека НЕС 1В, клеточную линию колоректального рака человека СаСо2, клеточную линию меланомы человека 8К-МЕБ-2, и клеточную линию злокачественной опухоли ЦНС человека А-172.

Данные в табл. 2 иллюстрируют эффекты изменений в дозированном количестве композиции, содержащей слитый белок по изобретению ВА-07, введенной к каждой из восьми репрезентативных раковых клеточных линий человека в отношении включения меченного тритием тимидина в клетки восьми раковых клеточных линий человека: НЕС1В, Сасо-2, 8К-МЕБ-1, НТ1080, МСЕ7, 8\¥480, 2938 и А172. Доза вводимого слитого белка ВА-07 изменялась 50-кратно примерно от 1 микрограмма на миллилитр до 10 микрограммов на миллилитр и до 50 микрограммов на миллилитр (мкг/мл).

Таблица 2. Данные по реакции опухолевых клеточных линий человека в отношении введения слитого белка ВА-07, измеренные по включению меченного тритием тимидина

	Доза ВА-07 в микрограммах на миллилитр
Раковая клеточная линия человека	50	10	1
	% роста в присутствии слитого белка относительно присутствия одного носителя в качестве контроля
НЕС 1В	10	13	30
Сасо-2	21	17	30
5К-МЕД-4	34	30	33

Неожиданно было обнаружено, что данные опухолевые клеточные линии характеризуются сниженной пролиферацией клеток в присутствии слитого белка. На табл. 2 показан процент роста по сравнению с контрольным значением, равным 100%.

Опухолевые клеточные линии могут подразделяться на три отдельных группы в отношении включения меченного тритием тимидина. Композиция по изобретению, содержащая слитый белок ВА-07, характеризуется выраженным эффектом на пролиферацию клеток в клеточной линии НЕС 1В, которая представляет собой клеточную линию карциномы эндометрия, с ингибированием пролиферации, относящимся к 50% ингибирующей концентрации (1С50), меньшей чем 1 мкг/мл. В дополнение к ингибированию имеет место зависимый от дозы эффект повышения ингибирования при более высоких концентрациях ВА-07.

-27008824

В клеточных линиях Сасо 2 и 8К-МЕЬ-1, показанных в табл. 2, слитый белок характеризуется сильным ингибирующим эффектом на клеточную пролиферацию, что подтверждается высоким уровнем включения меченного тритием тимидина в клетки каждой клеточной линии.

Аббревиатуры, используемые в данном описании

ΑΌΡ -адениндинуклеотидфосфат

АТСС - Американская коллекция типовых культур

АЭРС3 - экзотрансфераза С3; экзофермент С3; трансфераза С3

ЕВ8 - фетальная сыворотка теленка

НЕРЕ8 - буфер НЕРЕ8

ММР - матриксная металлопротеиназа

ΝΑΌ - никотинамидадениндинуклеотид

N0.4 - №Шопа1 Сапсег ΙηκΙίΙυΙο

РВ8 - фосфатно-солевой буфер

8КБ -сульфородамин В

ТСА - трихлоруксусная кислота

Изобретение далее иллюстрируется в различных вариантах осуществления и аспектах следующими неограничивающими примерами.

Пример 1. Общий способ, который может использоваться для получения слитого белка по изобретению

Для демонстрации способа, который может использоваться для получения слитого белка по изобретению, используется пример последовательности Αηΐеηηаρеά^а, добавленный к С-концу полипептида С3. Последовательность ДНК, подлежащая добавлению к С-концу, может представлять собой любую последовательность ДНК, которая в результате будет иметь добавление по меньшей мере одной аминокислоты с С-конца полипептида С3. Стоп-кодон с 3'-конца ДНК может замещаться участком ЕсоК1 за счет полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров 5'ΟΑΑ ТтС ТТТ ΑΟΟ АТТ ΟΑΤ ΑСС ТОТ ССС 3' (8ЕО ΙΌ N0: 1) и 5' СОТ ССС 6ΑС СΑΤ ССТ ССА ААА 3' (5ЕС ΙΌ N0: 2). Продукт ПЦР можно субклонировать в вектор р8ТВ1ие-1 (Nоνадеη, Майкоп, Висконсин), затем клонировать в вектор рСЕХ-4Т (Ате^Иат Вюкшепсек, Ва1е 6'ИгГе, Квебек) с использованием участка рестрикции ВатН I и №1 I. Данный вектор может называться рСЕХ-4Т/С3 и предоставляет общий способ для получения слитого белка по изобретению. Последовательность Αηΐеηηареά^а, которая может использоваться для добавления к 3'-концу С3 в рСЕХ-4Т/С3, может создаваться посредством ПЦР из вектора рЕТ-3а, содержащего последовательность Αηΐеηηареά^а (В1осЬ-Са11едо (1993) 120: 485-492; и Оего551 (1994) 269: 1044410450), субклонированную в вектор р8ТВ1ие-1 с тупыми концами, затем клонировали в рСЕХ-4Т/С3, с использованием участков рестрикции ЕсоК I и 8аИ, что создает рСЕX-4Τ/ВΑ-14. Манипуляции с целевой плазмидной последовательностью, такие как с использованием нуклеаз, присутствующих в плазмидной ДНК, или коммерчески доступных ферментов, что приводит к новым последовательностям ДНК, расщепление экзонуклеазой III или сайт-специфический мутагенез с использованием двух синтетических олигонуклеотидов, содержащих требуемую последовательность, введенную в рСЕX4Τ/ВΑ-14, может использоваться для продукции новых последовательностей ДНК, которые при экспрессии в подходящих системах продуцируют белки, которые могут очищаться стандартными способами, такими как аффинная хроматография или стандартная хроматография с использованием способов, таких как ионообменная хроматография для разделения по заряду, гель-фильтрация для разделения по размеру, и другие способы очистки белков. Белки тестируют в анализах на способность проникать в клетки, и белки тестируют в анализах на их способность противостоять активности КЬо. Анализ последовательности ДНК может проводиться на плазмидных последовательностях, которые продуцируют реакции более эффективно, чем С3-экзотрансфераза, каждый раз сравниваемая в качестве контроля. Клон рСЕX-4Τ/ВΑ-14 (8Е0 Ю N0: 3) представляет собой предпочтительную в настоящее время последовательность и предоставляет белок, который входит в состав предпочтительной композиции по изобретению. Пример С3-подобного слитого белка обозначен рСЕX-4Τ/ВΑ-05 (8Е0 Ю N0:37).

Белки по настоящему изобретению могут быть получены из экстрактов бактериальной клетки, или путем использования рекомбинантных способов за счет трансформации, трансфекции, или инфекции клетки-хозяина всем фрагментом ДНК, кодирующим слитый белок (таким как кодирующий ВА-05 фрагмент ДНК), или его частью с происходящей из Αηΐеηηареά^а транспортной последовательностью в подходящем экспрессирующем носителе.

Пример 2. Получение слитого белка ВА-05

Способ примера 1 может использоваться для получения слитого белка, обозначенного ВА-05, причем данный слитый белок содержит аминокислотную последовательность. ВА-05 представляет собой обозначение белка, полученного путем лигирования кДНК, кодирующей С3 с кДНК, кодирующей полученный в результате слияния 19-членный пептид.

Пример С3-подобного слитого белка обозначен как рСЕX-4Τ/ВΑ-05 (8Е0 Ю N0: 37).

Данный С3-подобный слитый белок получен способом, описанным для манипуляции ДНК ΑηΐеηпареЛа с использованием ДНК рСЕХ4Т/С3. Двадцать или большее число С3-подобных слитых белков

- 28 008824 экспрессированы и очищены, как описано производителем (Ашегейаш Вю8сюпсс5. ΒηίεΟ'ϋΓίο. Квебек). Двадцать белков оцениваются на предмет способности инактивировать Юю в системе ίη νίίτο. Белки, инактивирующие Юю в большей степени, что измерено по повышенному разрастанию нейритов по сравнению к контролем-нсоителем или контрольным белком глутатион-3-трансферазой (68Т), подвергали дальнейшему анализу. Продукты данного процесса могут включать в себя белки, такие как ВА-14, белок, описанный в общем примере, или новые слитые белки, продуцированные способом клонирования, причем данные слитые белки имеют свойства, такие как молекулярная масса и активность в биоанализах инактивации Юю, отличные от молекулы слитого белка ВА-14 или отличные от контроля, представляющего собой белок СЗ, не являющийся слитым белком. Новые слитые белки могут содержать аминокислотную последовательность СЗ, но изменены с С-конца из-за используемого способа.

Пример 3. Получение слитого белка ВА-07

Способ примера 1 может использоваться для получения ВА-07, который содержит следующую аминокислотную последовательность:

Мек

Зег

Агд

Уа1

Азр

Ьеи

С1п

А1а

Суз

Азп

А1а

Туг

Зег

Не

Азп

С1п

1

5

10

15

Ьуз

А1а

Туг

Зег

Азп

ТЬг

Туг

51п

ЗЬи

РЬе

ТЬг

Азп

Не

Азр

С1п

А1а

20

25

30

Ьуз

А1а

Тгр

С1у

Азп

А1а

61п

Туг

Ьуз

Туг

С1у

Ьеи

Зег

Ьуз

Зег

35

40

45

С1и

Ьуз

С1и

А1а

11е

Уа1

Зег

Туг

ТЬг

Ьуз

Зег

А1а

Зег

С1и

Не

Азп

50

55

60

С1у

Ьуз

Ьеи

Агд

СЬп

Азп

Ьуз

51у

Уа1

Не

Азп

С1у

РЬе

Рго

Зег

Азп

65

то

75

80

Ьеи

11е

Ьуз

С1п

Уа1

С1и

Ьеи

Азр

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

Ьуз

Мек

Ьуз

85

90

95

ТЬг

Рго

С1и

Азп

Не

Мек

Ьеи

РЬе

Агд

С1у

Азр

Рго

А1а

Туг

Ьеи

100

105

110

С1у

ТЬг

С1и

РЬе

С1п

Азп

ТЬг

Ьеи

Азп

Зег

Азп

С1у

ТЬг

11е

Азп

115

120

125

Ьуз

ТЬг

А1а

РЬе

61и

Ьуз

А1а

Ьуз

А1а

Ьуз

РЬе

Ьеи

Азп

Ьуз

Азр

Агд

130

135

140

Ьеи

С1и

Туг

С1у

Туг

Не

Зег

ТЬг

Зег

Ьеи

Мек

АЗП

7а1

Зег

С1п

РЬе

145

150

155

160

А1а

С1у

Агд

Рго

11е

Не

ТЬг

Ьуз

РЬе

Ьуз

Уа1

А1а

Ьуз

С1у

Зег

Ьуз

165

170

175

А1а

С1у

Туг

11е

Азр

Рго

Не

Зег

А1а

РЬе

А1а

С1у

С1п

Ьеи

С1и

Мек

180

185

190

Ьеи

Рго

Агд

ΗΪ3

Зег

ТЬг

Туг

ΗΪ3

Не

Азр

Мек

Агд

Ьеи

Зег

195

200

205

5ег

Азр

С1у

Ьуз

С1п

Не

ТЬг

А1а

ТЬг

Мек

61у

ТЬг

А1а

210

215

220

Не

Азп

Рго

Ьуз

С1и

РЬе

Уа1

Мек

Азп

Рго

А1а

Азп

А1а

С1п

С1у

Агд

225

230

235

240

НЬб

ТЬг

Рго

С1у

ТЬг

Агд

Ьеи

245

8ΕΩ

ЮНО

: 57)

Два ПЦР-праймера конструировали для переноса одной серии рекомбинантных конструкций (ВА05) в вектор рЕТ-9а (Νονηβοη. Майкоп. Висконсин) для создания белка ВА-07 при экспрессии в подходящей системе экспрессии: верхний праймер 5' §§а1с1§^1сс§с^са1а1^с1а§аё(с§асс1§ 3' (8Εζ) Ю N0: 38); нижний праймер: 5' с§сёёа1ссайа§йс1ссйсйссасйс 3' (8Εζ) Ю N0: 39); участок ВатН1 с 5'-конца 8Εζ) Ю N0: 39 §§а!ссайа; ТСА замещен ТААТ (айа, в 8Εζ) Ю N0: 39).

Программа, которая может использоваться для амплификации продукта с использованием полимеразы Р£и, включает в себя: 95°С 5' 1 цикл, затем 94°С 2' ®56°С 2' ®70°С 2' 10 циклов, затем 94°С 2' ®70°С 3' 30 циклов и держали при 4°С. Набор (ДАЕХП ((Да^си) может использоваться для очистки из ломтика агарозного геля, содержащего требуемую полосу ДНК. Вставку и вектор расщепляли ВаитН! и

-29008824

ΝάοΙ по инструкциям производителя (Νο\ν Епд1апй ВюЬаЬк, Веуег1у, Миннесота), очищали с использованием электрофореза в агарозном геле и набора Ц1АЕХ11 (Ц1адеп), и инкубировали вместе в течение ночи с ДНК-лигазой Т4 по указаниям производителя.

Е. со11 (ЭН5-альфа или, предпочтительно, ХЬ1-В1ие) трансформировали смесью лигирования. Клоны могут проверяться маломасштабной индукцией и 8Э8-РАСЕ, и могут быть подтверждены иммуноблоттингом грубых лизатов антителом против С3. Плазмидную ДНК очищают и могут оценивать на предмет чистоты. Может проводиться секвенирование ДНК (например, с использованием технологии Ь1Сог, в которой целая цепь секвенируется по полной длине клона).

Первая конструкция, полученная таким путем (рЕТ3а-ВА-07, 8ЕЦ ГО N0: 7), соответствовала теоретической последовательности ДНК конструкции рСЕХ/ВА-05 с небольшим отличием на 5'-конце из-за стратегии клонирования.

Вторая конструкция рЕТ9а-ВА-07 может быть получена субклонированием вставки из рЕТ3а-ВА07 в вектор рЕТ9а путем расщепления конструкции рЕТ3а ВатН1 и Ше1 (№\ν Епд1апй ВюЬаЬк, Веуег1у, Миннесота) по инструкциям производителя. Плазмидную ДНК рЕТ9а можно расщепить теми же ферментами. ДНК вставки и ДНК вектора может очищаться посредством электрофореза в агарозном геле. Вставку можно лигировать в новый вектор с использованием ДНК-лигазы Т4 (Νο\ν Епд1апй ВюЬаЬк, Веуег1у, Миннесота). Лигированную ДНК можно трансформировать в клетки ΌΗδ-альфа, и ДНК может быть получена с использованием мини- и макси-наборов 01АСЕК Клоны могут характеризоваться путем расщепления рестриктазами и секвенирования ДНК вставки в обоих направлениях (например, посредством Вю8&Т, ЬасЫпе, Квебек). ДНК конструкции могут трансформироваться клетки ВЬ21 (ЭЕ3), клетки ВЬ21 (ПЕ3)/рЬу58 (№уадеп, Майкоп, Висконсин) или другие подходящие системы экспрессии.

Пример 4. Общий способ для захвата меченного тритием тимидина в качестве меры пролиферации клеток, который может использоваться для демонстрации того, что слитый белок ВА-07 снижает пролиферацию раковых клеток

Анализы включения ³Н-тимидина Среда и клеточные линии

Клеточные линии тестировали на микоплазму, и подтверждали ее отсутствие перед началом исследований. Клеточные линии получают из АТСС. Линию НЕС-1В культивируют в Е-МЕМ, дополненной 10% РВ8 и 1% НЕРЕ8. Линию Сасо-2 культивируют в Е-МЕМ, дополненной 20% РВ8, 1% НЕРЕ8, 1 мМ пируватом натрия, и 0,1 мМ не незаменимой аминокислоты. Линию 8К-МЕЬ-1 культивируют в среде Маккоя, дополненной 10% РВ8 и 1% НЕРЕ8.

Объемы 100 мкл каждого из 2х рабочих растворов слитого белка, положительные и относящиеся к носителю контроли помещали в трех параллелях в 96-луночные планшеты для микротитрования, содержащие клетки (4х10³/100 мкл), с получение конечного объема 200 мкл. Планшеты помещали в инкубатор на 37°С с 100% влажностью и 5% С0₂. Примерно через 54 ч инкубации объем из 20 мкл меченного тритием тимидина (³Н-тимидина) (ΙΟΉ Моп£теа1, Канада), содержащий 1,0 мКи, добавляют в каждую лунку. ³Н-тимидин получают в ΚΡΜΙ-1640, дополненной 10% РВ8. Культуры инкубируют в тех же условиях, как указано выше, примерно в течение 18 ч. В конце инкубации клетки собирают автоматическим устройством для сбора клеток (Тот!ес), и включенный ³Н-тимидин в количестве импульсов в минуту (срт) измеряют в сцинтилляционном счетчике для микропланшетов (ТорСоип! ΝΧΤ, Раскагб).

Демонстрация того, что слитый белок по изобретению, такой как ВА-07, может влиять на множественные аспекты фенотипов злокачественных клеток, может осуществляться мониторингом включения меченного тритием тимидина в пролиферирующих и растущих клетках, где меченный тритием тимидин, добавленный к среде клеточной культуры, захватывается клетками и становится частью пула тимидинтрифосфатов, который используется там каждой клеткой для синтеза ДНК. Меченный тритием тимидин становится ковалентно введенным в макромолекулы ДНК в каждой клетке. В клетки, которые не растут, или в клетках, которые гибнут за счет апоптоза или некроза, меченный тритием тимидин не захватывается или высвобождается в среду после лизиса клеток. Включение меченного тритием тимидина может использоваться в качестве общего измерения эффекта слитого белка по изобретению, такого как ВА-07 в отношении роста клеток, деления клеток, покоя клеток и гибели клеток. Клеточные линии, в которых ВА-07 индуцирует снижение включения ³Н-тимидина, включают в себя клеточную линию рака эндометрия человека НЕС 1В, клеточную линию колоректального рака человека СаСо2, клеточную линию меланомы человека 8К-МЕЬ-2, и клеточную линию злокачественной опухоли ЦНС человека А-172.

Данные в табл. 2 иллюстрируют эффекты изменений в дозированном количестве композиции, содержащей слитый белок по изобретению ВА-07, введенной к каждой из восьми репрезентативных раковых клеточных линий человека в отношении включения меченного тритием тимидина в клетки восьми раковых клеточных линий человека: НЕС1В, Сасо-2, 8К-МЕЬ-1, НТ1080, МСР7, 8А480, 2938 и А172. Доза вводимого слитого белка ВА-07 изменялась 50-кратно примерно от 1 микрограмма на миллилитр до 10 микрограммов на миллилитр и до 50 микрограммов на миллилитр (мкг/мл).

Пример 5. Общий способ для определения ингибирования ангиогенеза

Образование новых кровеносных сосудов исследуют на модели клеточной культуры путем выращивания эндотелиальных клеток в присутствии матрикса базальной мембраны (Ма1пде1).

- 30 008824

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (НИУЕС) собирают из маточной культуры путем трипсинизации и ресуспендируют в среде роста. состоящей из ЕВМ-2 (С1опейс§). ЕВ8. гидрокортизона. 1ЕСЕ. УЕСЕ. В3-ЮЕ-1. аскорбиновой кислоты. 1ЕСЕ. СА-1000. гепарина. Ма(г1це1 (12.5 мг/мл) оттаивают при 4°С. и 50 мкл Ма1гфе1 добавляют в каждую лунку 96-луночного планшета и позволяют ему затвердевать примерно в течение 10 мин при 37°С. Клетки в среде роста добавляют в концентрации примерно 15000 клеток на каждую лунку. и им позволяют прилипать в течение 6 часов. Слитый белок ВА-07 добавляют в лунку в концентрации примерно 10 мкг/мл. и в другие лунки добавляют РВ8 как контроль. Клеткам позволяют расти в течение последующих 6-8 ч. Рост трубок может визуализироваться микроскопией при 50Х увеличении. и относительная средняя длина капиллярной сети подвергается количественному анализу с использованием программного обеспечения №г111егп Есйрке. Образование клеток в анализе Ма1гфе1 с использованием слитого белка ВА-07 снижает образование трубок (см. фиг. 3).

Пример 6. Общий способ демонстрации действия слитого белка на ингибирование пролиферации раковых клеток

Основанный на сульфородамине В (8КБ) анализ ингибировании роста

Основанный на сульфородамине В (8ВВ. доступен от Мо1еси1аг РгоЬек) анализ окрашивания белка для измерения ίη νίΙΐΌ содержания клеточного белка был разработан и затем адаптирован для рутинного использования в Νί,Ί для скрининга противоопухолевых средств ίη νίΙΐΌ (8кейап е1 а1.. 1990). 8РВ связывает с основными аминокислотами клеточного белка. и колориметрическая оценка обеспечивает оценку общей массы белка. которая связана с числом клеток. Данный анализ основан на допущении. что погибшие клетки лизируются и удаляются во время процедуры или по иным причинам не вносят вклад в конечную колориметрическую оценку. Анализ 8РВ может избыточно оценивать часть выживших клеток.

Протокол анализа 8КВ

Данные тесты проводили на панели клеточной линии Νί,Ί 60. Клетки выращивали в среде КМР1-Ь 640. дополненной 5% фетальной сыворотки теленка и Ь-глутамином по рекомендациям АТСС для каждой клеточной линии. Клетки в логарифмической фазе роста трипсинизировали и подсчитывали. Клетками инокулировали в 96-луночном микропланшете в зависимости от времени удвоения числа клеток отдельных клеточных линий 100 мкл среды роста. Микропланшеты инкубировали при 37°С. 5% СО₂ и 100% относительной влажности в течение 24 ч для достижения экспоненциального роста. Через 24 ч два планшета с каждой клеточной линией фиксируют ίη δίΐιι посредством ТСА для измерения клеточной популяции для каждой клеточной линии во время добавления тестового соединения (Т₀). ТСА удаляли и планшеты инкубировали при комнатной температуре по меньшей мере в течение 24 ч до высушивания.

Слитый белок по изобретению получают и хранят замороженным в виде лиофилизированного порошка. Он может восстанавливаться стерильной водой с образованием фармацевтической композиции примерно в концентрации 4.42 мкг слитого белка на микролитр в 10 мМ фосфате натрия. рН буфера 7.4. Для каждой дозы получают серийные разведения маточного раствора полной средой. содержащей 50 мкг/мл гентамицина. для предоставления слитого белка в концентрации 200. 20. 2 мкг/мл. 0.2 и 0.02 мкг/мл. Аликвоты по 100 мкл разведений тестируемого соединения добавляют к подходящей лунке. уже содержащей 100 мкл среды для достижения конечной серии доз с логарифмическими разведениями слитого белка.

После добавления слитого белка (т.е.. лекарственного средства) микропланшеты инкубировали в течение дополнительного периода при 37°С. 5% СО2 и 100% относительной влажности. Анализ заканчивали путем фиксации белка в клетках на дне лунок с использованием трихлоруксусной кислоты (ТСА). Планшеты сушат. а затем в каждую лунку добавляют 100 мкл 0.4% (мас./об.) раствора 8РВ в 1% уксусной кислоте. Планшеты инкубируют в связывающей белок краске в течение 10 мин при комнатной температуре.

После окрашивания несвязанный краситель удаляют путем промывки 1% уксусной кислотой. и планшеты сушат. Связанную краску растворяют добавлением 200 мкл 10 мМ основания Тпхта при осторожном перемешивании планшетов. Количество красителя измеряют считыванием оптической плотности 515 нм. Данные анализируют в таблице Ехсе1.

Т₀=среднее поглощение в момент добавления слитого белка (время 0)

С=среднее поглощение для контроля (не добавлено лекарственное средство. содержащее тестируемое соединение)

Т₁=среднее поглощение для слитого белка (различные дозы в серийных разведениях)

Рост в процентах рассчитывали для каждой из концентраций тестируемого соединения:

Рост. %=[ (Т₁-Т₀)/(С-Т₀)] х 100 для концентраций. в которых Т₁>Т₀

Ингибирование роста. %=[(Т₁-Т₀)/Т₀] х 100 для концентраций. в которых Т₁<Т₀

Ингибирование роста в % может использоваться для построения графика для сравнения эффекта различных доз. Строят графики роста в процентах. и точки. в которых кривые доза-ответ пересекают значения РС +50.0 и -50. используют для расчета С1₅₀. ТС1 и ЬС₅₀. С1₅₀. или концентрация. требуемая для ингибирования 50% роста. представляет собой параметр. характеризующий слитый белок.

- 31 008824

Пример 7. Конкретное применение анализа 8КВ для демонстрации ингибирования клеточного роста человеческих раковых клеточных линий

Таблица 3. 0150 (концентрация 50% ингибирования клеточного роста) после лечения слитым белком, измеренным путем анализа 8КВ

Клеточная линия	Тип злокачественной опухоли	С150 (мкг/мл)
Сак1-1	Почки	0, 054
ТК-10	Почки	0, 52

ЗГ-268	ЦНС	0,326
НОР-62	Νοη-ЗСЬС	0,269
ИС1-Н226	Ыоп-ЗСЪС	48,2
НЗ 578Т	Молочной железы	36, 6

Один из слитых белков по изобретению ВА-07 не оказывал действия на 4 из 6 человеческих опухолевых клеточных линий, тестированных посредством ³Н-тимидина, и оказывал действие примерно на 10% клеточных линий из скрина ΝΟΙ. В тесте с 8КВ он, как оказалось, обладал цитостатическими свойствами; рост ингибировался по сравнению с контролем, но общее количество белка не снижалось по сравнению с количеством, измеренным в нулевой момент времени (Τζ). Данные результаты согласуются с данными ίη νίνο, которые показывают, что трансфераза СЗ не является высоко токсичной в отношении животных. Наблюдаемые значения Сг1₅₀ относятся к интервалу от наномолярного до микромолярного за счет молекулярной массы слитого белка, равной примерно 27 кДа.

Пример 8. Определение активированной К1ю способом осаждения

Клетки линии N0108 культивируются в присутствии 5% фетальной сыворотки теленка (РВ8) и 1% смеси пенициллин-стрептомицин (Р/8). После осаждения клеток (3-6 ч при 37°С), в культуру добавляется ВА-05. Клетки промываются ледяным солевым буфером Тп§ (ΙΒ8) и лизируются в модифицированном буфере ΒΙΡΑ (50 мМ Тгк рН 7,2, 1% ΤπΙοη Х-100, 0,5% натрия дезоксихолат, 0,1% δϋδ, 500 мМ №С1, 10 мМ МдС1₂, 10 мкг/мл лейпептина, 10 мкг/мл апротинина, 1 мМ фенилметилсульфонила фторида (РМ8Р)). Клеточные лизаты очищаются центрифугированием при 13000 д в течение 10 мин при 4°С и хранятся при минус 80°С (-80°С).

Очищение С8Т-Я1ю-связывающсго домена (С8Т-ЯВБ) производится путем оттаивания и ресуспендирования клеточных лизатов в буфере ΒΙΡΑ из расчета 500 мкл буфера на 1 млн клеток. Для получения 68Т-В11О - связывающего домена (ΟδΤ-ΒΒϋ), бактерии, продуцирующие 68Т-ВВБ в векторе РОЕХ, выращиваются в Ь-отваре (ЬВ) в присутствии 100 мкл/мл ампициллина. После культивации в течение ночи культуры клеток разбавляются 3600 мл Ь-отвара в соотношении 1:10 и инкубируются при встряхивании в бактериальном инкубаторе в течение 2 ч при 37°С. Затем в культуры добавляется 0,5 мМ изопропил-З-О-тиогалактопиранозида и культуры инкубируются еще 2 ч. После этого бактерии выделяются центрифугированием при 5000 д в течение 15 мин. Осадок ресуспендируется в 40 мл лизирующего буфера (50 мМ Тп5 рН 7,5, 1% Тгйоп-Х, 150 мМ №1С1. 5 мМ МдС1₂, 1 мМ БТТ. 10 мкг/мл лейпептина, 10 мкг/мл апротинина, 1 мМ РМ8Е). После озвучивания, лизаты центрифугируются при 14000 об./мин 30 мин при 4°С.

Замороженная культура клеток гомогенизируется в буфере ΒΙΡΑ (50 мМ Тп5 рН 7,2, 1% ΤπΙοη X100, 0,5% натрия деоксихолат, 0,1% 8Б8. 500 мМ №1С1. 10 мМ МдС1₂, 10 мкг/мл лейпептина, 10 мкг/мл апротинина, 1 мМ РМ8Е). Гомогенаты и клеточные лизаты очищаются двукратным 10 минутным центрифугированием при 13000 д и 4°С. Затем они инкубируются 50 мин при 4°С с С8Т-РВБ и гранулами глютатион агарозы (81дша, ОакуШе, Сапаба). Гранулы отмывают 4-кратно и переносят в тот же буфер. СТР-связанная В1ю и общая Шю. представленные в тканевых гомогенатах, определяются с помощью вестерн-блота. Протеины переносятся на нитроцеллюлозу и определяются с помощью моноклональных ЮюА антител (8ап1а Сглг, 8ап1а Сглг, Калифорния). Полосы визуализируются связанными с пероксидазой вторичными антителами (Ргошеда, Мабкоп. Вайоминг) и основанной на НКР хемолюминисцентной реакцией (Р1егсе, Воск Го гб. Иллинойс). Денситометрический анализ применяется для количественной оценки сигнала в каждой полосе.

Пример 9. Использование способа осаждения К1ю как диагностического для диагностики или определения, какие опухоли могут быть чувствительны к терапии слитым белком, с применением ВА-07 как примера

Биопсийные образцы опухолей удаляются хирургическим путем из тканей млекопитающих (например, человека) с захватом участков здоровой ткани по краям иссекаемой опухоли. Образцы замораживаются на сухом льду или в жидком азоте. Образцы удаленной опухоли размером примерно 5 мм² гомогенизируются в 500 мкл буфера ΚΙΡΑ (50 мМ Тгк рН 7,2, 1% Тгйоп Х-100, 0,5% натрия деоксихолат, 0,1% 8Б8. 500 мМ ΝηΟΙ. 10 мМ МдС1₂, 10 мкг/мл лейпептина, 10 мкг/мл апротинина, 1 мМ РМ8Е). Гомогенаты очищаются двукратным центрифугированием при 13000 д и 4°С для подготовки образцов к даль

-32008824 нейшему анализу. Затем образцы инкубируются 50 мин при 4°С с СЗТ-ΒΒΩ и гранулами глютатион агарозы, как описано в примере 8. СТВ-связанная ВЬо и общая ВНо, представленные в тканевых гомогенатах, определяются с помощью вестерн-блота.

Для определения того, какие клетки в биоптатах содержат активированную ВЬо, готовят замороженные срезы. Бактериальные лизаты СЗТ-ВВИ очищаются центрифугированием при 14000 об./мин 30 мин при 4°С. Активированная В Но определяется инкубированием среза с бактериальным лизатом, содержащим СЗТ-ΚΒΌ. Замороженные срезы спинного мозга крысы (толщиной примерно 16 мкм) инкубируются, после фиксации 4% ΡΡΑ, с бактериальным лизатом в течение ночи при 4°С. Затем срезы трижды промываются в ТВЗ, фиксируются в 3% Β8Α в течение 1 ч при комнатной температуре и инкубируются с анти-СЗТ антителами (Се11 ЦдпаНпд, №\ν Епд1апб Вю1аЬ§, Мщкщкаида, Канада) и с антителами, специфичными для типа клеток. При опухоли мозга для определения типа клеток с активированной ВЬо, с целью диагностики опухоли, могут применяться антитела, специфичные для нейронов (№υΝ) или астроцитов (ΌΕΑΡ). Срезы промываются в ТВЗ и инкубируются 2 ч при комнатной температуре с Б1ТС, Техасским красным или родамин-конъюгированными вторичными антителами (1аск§оп 1ттипоВе8еагсН, М188188аида, Канада).

Пример 10. Общий способ для определения снижения металлопротеиназной активности (ММР)

Металлопротеиназная активность определяется зимографически, при этом протеолитическая активность ферментов разделяется на полиакриламидных гелях в невосстанавливающих условиях. Для определения металлопротеиназной активности, способом желатиновой зимографии изучается желатинолитическая активность в культуральной среде растущих клеток карциномы кишечника Сак1-1. Клетки Сак11 инкубируют 24 ч с ВА-07 в концентрации 0,1, 1,0 и 10 мкг/мл или с буфером в качестве контроля. Аликвота (25 мкл) культуральной среды подвергается электрофорезу (8^8/ΡΑСЕ) в 7,5% полиакриламиде с содержанием желатина 1 мг/мл, и полипептиды разделяются в невосстанавливающих условиях. Для изучения активности ММР, 8Ό8 удаляется инкубированием в 2,5% (ν/ν) ТгНоп Х-100 в течение 30 мин при комнатной температуре. Этот этап повторяется после 5-кратного промывания в бидистиллированной Н₂О. Далее, гель инкубируют 20 ч при 37°С в буфере, содержащем 50 мМ ТШ-НСТ рН 7,6, 0,2М №С1, 5 мМ СаС1₂ и 0,02% (ν/ν) Вту-35. Гель окрашивают Кумасси бриллиантовым синим В-250, и краситель удаляется. Ферментативная активность на желатиновом субстрате определяется как прозрачные полосы на синем фоне. Идентичность ММР и желатиназной активности оцениваются с помощью положительного контроля, такого как в данном эксперименте, НТ-1080.

Пример 11. Определение снижения металлопротеиназной активности после лечения ВА-07

Способ, описанный в примере 10, применяется с использованием слитого белка ВА-07. Наблюдается снижение активности металлопротеиназы.

Пример 12. Получение слитого белка в стерильном растворе

Терапевтически эффективное количество слитого белка, такого как примененный в данном изобретении ВА-07, разводится в единице объема стерильного изотонического раствора, например, стерильного изотонического ΡΒ8, для получения одной дозировки раствора, которая фильтруется в асептических условиях через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Фильтрат собирается в стерильный флакон в инертной атмосфере (азот или аргон). Флакон закрывается стерильной крышкой с фиксирующим колпачком и хранится при комнатной температуре. Одна дозировка раствора во флаконе, содержащая слитый белок, такой как ВА-07, может вводиться путем внутривенной инъекции, инфузии или инъекции непосредственно в опухоль млекопитающим, например, в опухоль больного человека, или инъекции в края ткани в месте удаления опухоли у млекопитающих, например, опухоли у человека.

Два или более флаконов, содержащих каждый разовую дозу, могут быть приготовлены сходным образом, и применяться в виде инъекций в ходе лечения у пациентов, нуждающихся в нем. Таким же образом разовая доза может вводиться многократно как непосредственно в ткань пациента, так и в ходе системного лечения. Например, разовая доза препарата слитого белка может назначаться пациенту один раз в день, или один раз в два дня, или один раз в неделю. Кроме того, терапевтически эффективная доза фармацевтического препарата, содержащего слитый белок, может один или более раз системно вводиться пациенту с опухолью перед удалением опухоли, и/или один или более раз вводиться в диагностически подтвержденные края опухоли перед ее хирургическим удалением, и/или непосредственно в ткань опухоли один или более раз перед удалением опухоли, и/или системно вводиться один или более раз после удаления опухоли, и/или непосредственно в оставшиеся края опухоли после ее удаления. Число повторных введений разовой дозы и количество слитого белка в разовой дозе может меняться от пациента к пациенту и от одного типа и размера опухоли к другому с целью предотвратить рост вторичной опухоли в присутствии первичной или после ее удаления.

Пример 13. Производство лиофилизированного препарата

Раствор, содержащий разовую дозу соединения, описываемого в данном изобретении, включающего слитый белок, такой как ВА-07, разводится в фармацевтически разрешенной изотонической водной среде, содержащей фармацевтически разрешенную буферную соль и/или полностью водорастворимый фармацевтически разрешенный углевод (предпочтительно фармацевтически разрешенный нередуцирующий сахар или циклодекстрин) стерилизуется фильтрацией (например, через фильтр с размером пор

- 33 008824

0,2 мкм) в асептических условиях, фильтрат помещается в стерильный флакон, замораживается, замороженный водный раствор лиофилизируется в асептических условиях при пониженном давлении в фармацевтически разрешенном лиофилизаторе до получения во флаконе сухого вещества, содержащего слитый белок, флакон возвращается под атмосферное давление в стерильной инертной атмосфере и закрывается стерильной крышкой (например, с фиксирующим колпачком). Закрытый флакон маркируется с указанием содержимого и дозировки и помещается в набор вместе с другим стерильным закрытым флаконом, который содержит стерильную воду для инъекций в количестве, необходимом для перенесения в первый флакон с лиофилизированным слитым белком с целью превращения порошка слитого белка в раствор как форму дозирования. В другом исполнении, слитый белок может быть растворен в исходном объеме гипертонической водной среды, раствор стерилизован фильтрацией, фильтрат помещен во флакон и лиофилизирован до состояния сухого вещества. Это сухое вещество может быть растворено или восстановлено в большем, чем обычно, объеме стерильной воды, достаточном для образования изотонического раствора для инъекций. С другой стороны, гипертонический раствор может применяться для введения путем инфузии в контейнер капельницы, содержащей больший объем изотонической водной среды, так что гипертонический раствор существенно разводится. При необходимости, флакон, содержащий стерильную воду в объеме, достаточном для восстановления сухого вещества в обычную форму дозирования, может распространяться в наборе с лиофилизированным белком. Предпочтительнее, чтобы восстанавливающее соединение содержало изотонический раствор. Слитый белок при этом способе производства может применяться для внутривенного введения, и/или инфузии, и/или прямой инъекции в опухоль так же, как это описано в предыдущем примере.

Пример 14. Получение препарата в полимере

Описываемое в данном изобретении соединение, содержащее слитый белок, такой как ВА-07, производится путем введения в сополимер, состоящий из полигликолевой кислоты (РОЛ) и полимолочной кислоты (РЬЛ). РСЛ/РЬЛ ко-полимер может разлагаться в течение 2-6 месяцев после имплантации, в зависимости от соотношения РОА к РЬА. При одном способе изготовления РСА/РЬА используются и растворяются неденатурирующем органическом растворителе в концентрациях 0,5-50%, преимущественно 1,0-3,0%. Далее раствор полимера может быть нанесен, или напылен, или накапан на поверхность пленки или губки на полисахаридной основе, или введен каким-либо иным способом, и затем высушен при удалении растворителя. Ячеистая структура, содержащая фармацевтически разрешенный растворимый и/или разлагающийся полимер, может применяться для введения слитого белка, такого как ВА-07, который будет высвобождаться по мере разложения структуры. Она может быть имплантирована в место хирургического удаления опухоли, и слитый белок будет высвобождаться для предотвращения метастазирования и роста оставшихся опухолевых клеток.

Пример 15. Общий способ лечения края удаленной опухоли

Описываемое в данном изобретении соединение, содержащее слитый белок, такой как ВА-07, изготовленное в виде фармацевтически разрешенного крема, может применяться для лечения иссеченных участков кожи. Примером является лечение злокачественной меланомы, когда такой крем наносится на кожу вокруг места удаления опухоли. Кроме того, такой состав крема, содержащий слитый белок, такой как ВА-07, может наноситься на кожу перед удалением опухоли и использоваться для лечения опухоли в период между первой биопсией и положительным гистологическим диагнозом. При нанесении на место опухоли крем может препятствовать распространению и метастазированию опухоли.

Пример 16. Предотвращение роста вторичной опухоли в крае опухоли

Описываемое в данном изобретении соединение, содержащее слитый белок, такой как ВА-07, например, водный раствор, описанный выше, или изготовленное в виде клейкого хирургического геля, такого как фибриновый или гидрогель, может применяться в лечении области хирургической резекции опухоли. Примером является лечение здорового кишечника после колонэктомии по поводу рака кишечника. Для воздействия на здоровую ткань кишечника, окружающую область опухоли перед удалением опухоли, может применяться препарат слитого белка, такого как ВА-07, после удаления опухоли и рядом расположенных тканей, в виде хирургического геля, такого как фибриновая паста, который может быть полезен для предотвращения образования дополнительных поражений в оставшейся ткани.

Пример 17. Общий способ для демонстрации преклинической эффективности у млекопитающих

Клетки меланомы имплантируются подкожно первой группе безволосых мышей (СЬат1е§ Ктует ЬаЬота1опе8). Опухоли, развившиеся у мышей первой группы, пересаживаются индивидуально (одна опухоль - одной мыши) мышам второй группы. Каждой мыши второй группы ежедневно вводится инъекция описываемого в данном изобретении фармацевтического соединения, содержащего эффективную дозу слитого белка, такого как ВА-07, рассчитанную в пределах 10-100 мкг/мл от объема опухоли, в фармацевтически разрешенном растворителе. Контрольные животные получают инъекции растворителя в качестве контроля. Отслеживается рост опухоли, гистология применяется для определения маркеров в злокачественных кератиноцитах, как, например, гамма-иммунопротеина 10 (1Р10). Соединение, содержащее слитый белок, предотвращает или существенно подавляет рост опухолей у мышей второй группы.

- 34 008824

Пример 18. Применение соединения, содержащего слитый белок, нанесенного на поверхность имплантата молочной железы, для предотвращения рецидива рака молочной железы

Терапевтически эффективным количеством фармацевтического соединения по изобретению, содержащим слитый белок, покрывают поверхность фармацевтически разрешенного имплантата молочной железы. Опухоль удаляется из ткани молочной железы пациента, желательно с сопутствующим назначением (пре- и/или постоперационным) фармацевтического соединения, описываемого в данном изобретении, как упомянуто выше. Полость, образующаяся после удаления опухоли, заполняется, хотя бы частично, имплантатом молочной железы, покрытым фармацевтическим соединением, содержащим слитый белок, и рана, образованная удалением опухоли и/или имплантацией, закрывается. Рост вторичной опухоли в оставшихся краях опухолевой ткани существенно подавляется или предотвращается.

Пример 19. Общий способ получения слитого белка

Последовательность репрезентативного слитого белка ВА-14

Нуклеотидная последовательность слитого белка ВА-14 (8Εζ) Ш N0: 3)

ддаьсс£с£а	дад£сдасс£	дсаддса£дс	аа£дс££а££	сса££аа£са	аааддс££а£	60
£сааа£ас££	ассаддадТ!	£ас£ааьа££	да£саадсаа	аадс££дддд	£аа£дс£сад	120
£а£ааааад£	а£ддас£аад	сааа£садаа	ааадаадс£а	£ад£а£са£а	£ас£аааадс	180
дс£ад£дааа	£ааа£ддааа	дс£аадасаа	аа£аадддад	££а£саа£дд	а£££сс££са	240
аа£££аз£аа	аасаад££да	ас££££ада£	ааа£с££££а	а£аааа£даа	дассссТдаа	300
аа£а££з£дг	£а£££ададд	сдасдасссГ	дс££а£££ад	даасадааЕЬ	£саааасас£	360
с££с££аа££	сааа£дд£ас	аа££аа£ааа	асддс££££д	ааааддсЪаа	адс£аад£££	420
ЪЬаааТааад	а£адас££да	а£а£дда£а£	а£Ьад£ас££	са££аа£даа	£д£с£с£саа	490
£££дсаддаа	дассаа££а£	£асасаа£££	ааадЬадсаа	ааддс£сааа	ддсадда£а£	540
а££дассс£а	££ад£дс£££	Есадддасаа	с££дааа£д£	£дс££сс£ад	аса£ад£ас£	600
£а£са£а£ад	асда£а£дад	а££д£с££с£	да£дд£ааас	ааа£аа£аа£	£асадсааса	660
а£да£дддса	садс£а£саа	ЬссЬааадаа	Ъ£сд£да£дд	ааЪсссдсаа	асдсдсзадд	720
садаса£аса	сссдд£асса	дас£с£адад	сТададаадд	ад£££сас££	саа£сдс£ас	790
££дасссд£с	ддсдаадда£	сдадаЬсдсс	еасдссс£д£	дссТсасдда	дсдссадаЬа	840
аада£££дд£	ГссадааЬсд	дсдсаГдаад	Гддаадаадд	адаас£да		888

Последовательность слитого белка ВА-14 (5Е<2 Ю N0: 4)

С1у

Зег

Агд

Уа1

Азр

Ьеи

С1л

А1а

Суз

Азп

А1а

Туг

Зег

Не

Азп

1

5

10

15

С1п

Ьуз

А1а

Туг

Зег

Аз η

ТА г

Туг

С1п

51и

РАе

ТЬг

Аз η

Не

Азр

С1п

20

25

30

А1з

Ьуз

А1а

Тгр

С1у

Аз η

А1а

С1п

Туг

Ьуз

Туг

С1у

Ьеи

Зег

Ьуз

35

40

45

Зег

С1и

Ьуз

С1и

А1а

Не

Уа1

Зег

Туг

ТА г

Ьуз

Зег

А1а

Зег

С1и

Не

55 60

-35 008824

Азп

С1у

Ьуз

Ьеи

Агд

С1п

Азп

Ьуз

С1у

УаЬ

Не

Азп

С1у

РЬе

Рго

Зег

65

70

75

80

Азп

Ьеи

Не

Ьуз

С1П

Уа1

С1и

Ьеи

Азр

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

Ьуз

МеЬ

65

90

95

Ьуз

ТЫ

Рго

С1и

Азп

Не

Мер

Ьеи

РЬе

Агд

С1у

Азр

Рго

А1а

Туг

100

105

110

Ьеи

С1у

ТЬг

С1и

РЬе

С1п

Азп

ТЫ

Ьеи

Азп

Зег

Азп

С1у

ТЬг

11е

115

120

125

Азп

Ьуз

ТЫ

А1а

РЬе

С1и

Ьуз

А1а

Ьуз

А1а

Ьуз

РЬе

Ьеи

Азп

Ьуз

Азр

130

135

140

Агд

Ьеи

С1и

Туг

61у

Туг

11е

Зег

ТЬг

Зег

Ьеи

Меь

Азп

Уа1

Зег

С1П

145

150

155

160

РЬе

А1а

С1у

Агд

Рго

Не

ТЬг

С1п

РЬе

Ьуз

νβΐ

А1а

Ьуз

С1у

Зег

165

170

175

Ьуз

А1а

С1у

Туг

Не

Авр

Рго

Не

Зег

А1а

РЬе

С1п

С1у

61П

Ьеи

61и

180

185

190

МеЬ

Ьеи

Рго

Агд

Н1з

Зег

ТЬг

Туг

Н1з

Не

Азр

МеЬ

Агд

Ьеи

195

200

205

Зег

Азр

С1у

Ьуз

61п

Не

ТЬг

А1а

ТЬг

МеЬ

Меб

С1 у

ТЬг

210

215

220

А1а

Не

Азп

Рго

Ьуз

С1и

РЬе

Уа1

Мер

С1и

Зег

Агд

Ьуз

Агд

А1а

Агд

225

230

235

240

С1п

ТЫ

Туг

ТЬг

Агд

Туг

С1п

ТЬг

Ьеи

С1и

Ьеи

С1и

Ьуз

С1и

РЬе

ΗΪ3

245

250

255

РЬе

Азп

Агд

Туг

Ьеи

ТЬг

Агд

Не

С1и

Не

А1а

Н1з

А1а

260

265

270

Ьеи

Суз

Ьеи

ТЬг

Б1и

Агд

61п

Не

Ьуз

Не

Тгр

РЬе

С1П

Азп

Агд

275

280

285

Ме1:

Ьуз

Тгр

Ьуз

С1и

Азп

2 90

295

Для демонстрации способа получения слитого белка по изобретению может использоваться пример последовательности Ап1епиаре<йа, добавленный к С-концу полипептида СЗ. Последовательность ДНК, которую добавляют к С-концу, может быть любой последовательностью ДНК, которая может обеспечивать добавление по меньшей мере одной аминокислоты к С-концу пептида, содержащего полипептид СЗ.

Во-первых, ДНК плазмиды рСЕХ2Т-СЗ получают стандартными способами Ν. Башатсйе, МсСШ ишуегайу. Стоп-кодон с 3'-конца ДНК замещают участком ЕсоК1 путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров 5' 6АА ТТС ТТТ А66 АТТ 6АТ А6С ТОТ 6СС 3' (8ЕЦ Ш N0: 1) и 5’ СОТ ССС САС САТ ССТ ССА ААА 3’ (8ЕЦ Ш N0: 2). Продукт ПЦР можно субклонировать в вектор р8ТВ1ие-1 (Νονηβοη. Масйзои, Висконсин), затем клонировать в вектор рСЕХ-4Т (Ашегзйаш Вю8С1еисе8, Ва1е сПМс. Квебек) с использованием участка рестрикции ВатпН I и Νοΐ I. Данный вектор может называться рСЕХ-4Т/СЗ, и он предоставляет общий способ для получения слитого белка по изобретению. Последовательность АЩсппарссйа. которая может использоваться для добавления к 3'-концу СЗ в рСЕХ4Т/СЗ, может создаваться путем ПЦР из вектора рЕТ-За, содержащего последовательность АЩсппарссйа (В1осй-Са11едо (1993) 120: 485-492; и ϋετοδδί (1994) 269: 10444-10450), субклонирования в вектор р8ТВ1ие-1 с тупыми концами, последующего клонирования в рСЕХ-4Т/СЗ, с использованием участков рестрикции ЕсоР I и 8а11, с образованием рСЕХ-4Т/ВА-14.

-36008824

Нуклеотидная последовательность ВА-14 (8Εζ) Ш N0: 3)

ддаЕссЕсЕа	СадЕсдассЕ	дсаддсаЕдс	ааЕдсЕЕаЕЕ	ссаЕЕааЕса	аааддсЕЕаЕ	60
ЕсаааьасЕЕ	АссаддадЕЕ	ЕасЕааЕаЕЕ	даЕсаадсаа	аадсЕЕдддд	ЕааЕдсЕсад	120
ЕаЕааааадЕ	АЕддасЕаад	саааЕсадаа	ааадаадсЕа	ЕадЕаЕсаЕа	ЕасЕаааадс	180
дсЕадЕдааа	ТаааЕддааа	дсЕаадасаа	ааЕаадддад	ЕЕаЕсааЕдд	аЕЕЕссЕЕса	240
ааЕЕЕааЕаа	АасаадЕЕда	асЕЕЕЕадаЕ	аааЕсЕЕЕЕа	аЕааааЕдаа	дассссЕдаа	300
ааЕаЕЕаЕдЕ	ТаЕЕЕададд	сдасдасссЕ	дсЕЕаЕЕЕад	даасадааЕЕ	ЕсаааасасЕ	360
сЕЕсЕЕааЕЕ	СаааЕддЕас	ааЕЕааЕааа	асддсЕЕЕЕд	ааааддсЕаа	адсЕаадЕЕЕ	420
ЕЕаааЕааад	АЕадасЕЕда	аЕаЕддаЕаЕ	аЕЕадЕасЕЕ	саЕЕааЕдаа	ЕдЕсЕсЕсаа	480
ЕЕЕдсаддаа	СассааЕЕаЕ	ЕасасааЕЕЕ	ааадЕадсаа	ааддсЕсааа	ддсаддаЕаЕ	540
аЕЕдасссЕа	ТЕадЕдсЕЕЕ	Есадддасаа	сЕЕдаааЕдь	ЕдсЕЕссЕад	асаЕадЕасЕ	600
ЕаЕсаЕаЬад	АсдаЕаЕдад	аЕЕдЪсЕЕсЕ	даЕддЕааас	аааЕааЕааЕ	Еасадсааса	660
аЕдаЕдддса	СадсЕаЕсаа	ЕссЕааадаа	ЕЕсдЕдаЕдд	ааЕсссдсаа	асдсдсаадд	720
садасаЕаса	СссддЕасса	дасЕсЕадад	сЕададаадд	адЕЕЕсасЕЕ	сааЕсдсЕас	780
ЕЕдасссдЕс	СдсдааддаЕ	сдадаЕсдсс	сасдсссЕдЕ	дссЕсасдда	дсдссадаЕа	840
аадаЕЕЕддЕ	ТссадааЕсд	дсдсаЕдаад	Еддаадаадд	адаасЕда		888

Последовательность слитого белка ВА-14 (8Εζ) Ш N0: 4)

С1у

Зег

Агд

Уа1

Азр

Ьеи

С1п

А1а

Суз

Азп

А1а

Туг

Зег

11е

Азп

1

5

10

15

С1п

Ьуз

А1а

Туг

Зег

Азп

ТЬг

Туг

С1П

С1и

РЬе

ТЬг

Азп

Не

Азр

С1п

20

25

30

А1а

Ьуз

А1а

Тгр

С1у

Азп

А1а

С1п

Туг

Ьуз

Туг

С1у

Ьеи

Зег

Ьуз

-37008824

35

40

45

Зег

С1и

Ьуз

С1и

А1а

Не

ν31

5ег

Туг

ТНг

Ьуз

Зег

А1а

Зег

С1и

Не

50

55

60

Азп

С1у

Ьуз

Ьеи

Агд

С1п

Азп

Ьуз

С1у

Уа1

Не

Азп

С1у

РНе

Рго

Зег

65

70

75

80

АЗП

Ьеи

Не

Ьуз

С1п

Уа1

С1и

Ьеи

Азр

Ьуз

Зег

РНе

Азп

Ьуз

МеС

85

90

95

Ьуз

ТНг

Рго

С1и

Азп

11е

МеН

Ьеи

РНе

Агд

С1у

Азр

Рго

А1а

Туг

100

105

110

Ьеи

01у

ТНг

61и

РНе

С1п

Азп

ТНг

Ьеи

Азп

Зег

Азп

Е1у

ТНг

Не

115

120

125

Азп

Ьуз

ТНг

А1а

РНе

С1и

Ьуз

А1а

Ьуз

А1а

Ьуз

РНе

Ьеи

Азп

Ьуз

Азр

130

135

140

Агд

Ьеи

С1и

Туг

С1у

Туг

Не

Зег

ТНг

Зег

Ьеи

МеС

Азп

Уа1

Зег

С1п

145

150

155

160

РНе

А1а

С1у

Агд

Рго

Не

ТНг

е1п

РНе

Ьуз

Уа1

А1а

Ьуз

С1у

Зег

165

170

175

Ьуз

А1а

С1у

Туг

11е

Азр

Рго

11е

Зег

А1а

РНе

С1п

С1у

С1п

Ьеи

С1и

180

185

190

МеЬ

Ьеи

Рго

Агд

Низ

Зег

ТНг

Туг

Η1Ξ

Не

Азр

МеЬ

Агд

Ьеи

195

200

205

Зег

Азр

С1у

Ьуз

С1п

Не

ТНг

А1а

ТНг

Мес

Мер

С1у

ТНг

210

215

220

А1а

Не

Азп

Рго

ьуз

61и

РНе

νβΐ

МеС

С1и

Зег

Агд

Ьуз

Агд

А1а

Агд

225

230

235

240

С1п

ТНг

Туг

ТНг

Агд

Туг

С1п

ТНг

Ьеи

С1и

Ьеи

С1и

Ьуз

С1и

РНе

ΗΪ3

245

250

255

РНе

Азп

Агд

Туг

Ьеи

ТНг

Агд

Не

61и

Не

А1а

Н13

А1а

260

265

270

Ьеи

Суз

Ьеи

ТНг

С1и

Агд

61п

11е

Ьуз

Не

Тгр

РНе

С1п

Азп

Агд

275

280

265

МеС

Ьуз

Тгр

Ьуз

С1и

Азп

2 90

295

Слитые белки по настоящему изобретению могут быть получены из экстрактов бактериальных клеток или путем использования рекомбинантных способов путем трансформации, трансфекции или инфекции клетки-хозяина всей ДНК, кодирующей слитый белок, или ее частью, таким как фрагмент ДНК, кодирующий слитый белок ВА-05, с происходящей из АЩсппарссйа транспортной последовательностью в подходящем экспрессирующем носителе.

Пример 20. Получение слитого белка ВА-05

Пример СЗ-подобного слитого белка обозначен рСЕХ-4Т/ВА-05 (§Εζ) Ш N0: 4).

ВА-05 является наименованием, данным здесь белку, полученному путем лигирования кДНК, кодирующей СЗ с кДНК, кодирующей полученный в результате слияния 19-членный пептид.

Способ примера 19 может использоваться для получения слитого белка ВА-05, который содержит следующую аминокислотную последовательность.

-38008824

Последовательность, кодирующая белок рСЕХ-4ТВ А-05 (ЗЕО Ю N0: 4)

61у

Зег

Агд

УаЬ

Азр

Ьеи

СЬп

А1а

Суз

Азп

АЬа

Туг

Зег

Не

Азп

1

5

10

15

С1п

Ьуз

АЬа

Туг

Зег

Азп

ТЬг

Туг

СЬп

61и

РЬе

ТЬг

Азп

Не

Азр

СЬп

20

25

30

АЬа

Ьуз

АЬа

Тгр

61у

Азп

АЬа

61п

Туг

Ьуз

Туг

СЬу

Ьеи

Зег

Ьуз

35

40

45

Зег

61и

Ьуз

61и

АЬа

Не

УаЬ

Зег

Туг

ТЬг

Ьуз

Зег

АЬа

Зег

СЬи

Не

50

55

60

Аз η

61у

ьуз

Ьеи

Агд

61п

Азп

Ьуз

СЬу

УаЬ

Не

Азп

СЬу

РЬе

Рго

Зег

65

70

75

80

Аз η

Ьеи

Не

Ьуз

61п

УаЬ

51и

Ьеи

Азр

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

Ьуз

Мер

85

90

95

ьуз

ТЬг

РГО

С1и

Азп

Не

Мер

Ьеи

РЬе

Агд

СЬу

Азр

Рго

АЬа

Туг

100

105

но

Ьеи

61у

ТЬг

61и

РЬе

61п

Азп

ТЬг

Ьеи

Азп

Зег

Азп

61у

ТЬг

Не

115

120

125

Азп

Ьуз

ты

А1а

РЬе

61и

Ьуз

АЬа

Ьуз

АЬа

Ьуз

РЬе

Ьеи

Азп

Ьуз

Азр

130

135

140

Агд

Ьеи

61и

Туг

61у

Туг

Не

Зег

ТЬг

Зег

Ьеи

Мер

Азп

УаЬ

Зег

6Ьп

145

150

155

16С

РЬе

АЬа

61у

Агд

Рго

Не

ТЬг

61п

РЬе

Ьуз

УаЬ

АЬа

Ьуз

61у

Зег

165

170

175

Ьуз

А1а

61у

Туг

Не

Азр

Рго

Не

Зег

А1а

РЬе

61п

61у

СЬп

Ьеи

СЬи

180

185

190

Мет

Ьеи

Рго

Агд

Н13

Зег

ТЬг

Туг

Ηί$

Не

Азр

Мер

Агд

Ьеи

195

200

205

Зег

Азр

61у

Ьуз

61п

Не

ТЬг

АЬа

ТЫ

Мер

61у

ТЬг

210

215

220

АЬа

Не

Азп

Рго

Ьуз

61и

РЬе

Уа1

МеЬ

СЬи

Зег

Агд

Ьуз

Агд

АЬа

Агд

225

230

235

240

С1п

Тог

Туг

ТЬг

Агд

Туг

61п

ТЬг

Ьеи

СЬи

Ьеи

6111

Ьуз

61и

ι РЬ

е ΗΪ5

245

250

25

5

РЬе

Азп

Агд

Туг

Ьеи

ТЬг

Агд

Не

61и

Не

АЬа

, ΗΪ

з АЬа

260

265

270

Ьеи

Суз

Ьеи

ТЬг

61и

Агд

61п

Не

Ьуз

Не

Тгр

РЬе

61п

Азп

ι Аг·

д Агд

275

280

285

Мер

Ьуз

Тгр

Ьуз

ьуз

СЬи

Азп

2 90

295

Данный СЗ-подобный слитый белок получен способом, который описан для введения ДНК АпЬепиаресйа в ДНК рСЕХ4Т/СЗ, с получением рСЕХ4Т/ВА-14. Отбирали клон с мутацией сдвига рамки считывания, и белок получали и тестировали. Когда культуры были позитивными несмотря на присутствие мутации, плазмидную ДНК повторно секвенировали для подтверждения мутации. Новый клон здесь называли ВА-05. Для подтверждения последовательности СЗАРЬТ, секвенировали кодирующие последовательности обоих штаммов. Последовательность данного клона дана здесь в примерах (нуклеотидная последовательность ВА-05; 8Εζ) ГО N0: 3, аминокислотная последовательность ВА-05; 8Εζ) ГО N0: 4).

Другой способ, который может использоваться для получения ВА-05, представляет собой получение рСЕХ-4Т/ВА-14, с последующим применением способа сайт-специфического мутагенеза с использованием двух комплементарных нуклеотидных праймеров, таких как (8Εζ) ГО N0: 58) 5'ССТАААСААТ ТС6Т6АТ6АА ТССС6САААС 6С6СА 3' и 8Εζ)' ГО N0: 59 5' Т6С6С6ТТТ6 С666АТТСАТ САССААТТСТ ТТАСС 3', содержащих делецию 1 пары оснований в ДНК рСЕХ4Т-ВА14. Набор ζ)ιιί1<Сйаиде (8!та!адепе, Ба Ло11а, Калифорния) используют для введения делеции с использованием продления праймеров в присутствии нуклеотидов. Следующий цикл температур может использоваться для получения ВА-05: 1 цикл в течение 30 с при 95°С, затем 18 циклов 95°С в течение 30 с, 55°С в течение 1 мин, и

-39008824 °С в течение 10,5 мин. Затем ДНК обрабатывают ферментом рестрикции Ирп1, как описано производителем. Частью реакционной смеси трансформируют Е. сой ИН5-альфа или ХЬ1-В1ие. Индивидуальные колонии Е. сой выделяют на агаровых чашках, содержащих селективный антибиотик, и выращивают в среде ЬВ + ампициллин. ДНК выделяют с использованием набора М1б1Ргер (01адеп). ДНК 5 клонов секвенируют, и подтверждают изменение последовательности. Белок экспрессируют из ДНК и очищают, как описано Ьейтапп е! а1., 1999. Очищенный белок затем может использоваться в качестве антагониста Кйо в биологических системах.

Для получения рекомбинантного ВА-05 (8ЕО ΙΌ N0: 3) плазмиды, содержащие соответствующую ДНК (рОЕХ-4Т/ВА-05) трансформируют в бактерии компетентного штамма Е. сой ХЬ-1 Ь1ие. Бактерии выращивают в Ь-бульоне (10 г/л бакто-триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л №1С1) с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл (ВМС-Яосйе), в качающемся инкубаторе в течение 1 ч при 37°С и 300 об./мин. Изопропил-бета-И-тиогалактопиранозид (1РТО) (01Ьсо) добавляют в конечной концентрации 0,5 мМ для индукции продукции рекомбинантного белка, и культуру выращивают в течение дальнейших 6 ч при 37°С и 250 об./мин.

Осадок бактерий получали центрифугированием в 250 мл центрифужных бутылках при 7000 об./мин в течение 6 мин при 4°С. Каждый осадок ресуспендировали в 10 мл буфера А (50 мМ Тп§, рН 7,5, 50 мМ №С1, 5 мМ МдС1₂, 1 мМ ИТТ) с 1 мМ РМ8Г. Все ресуспендированные осадки объединяли и переносили в 100 мл пластиковую мензурку на лед. Остатки буфера А с РМ8Е добавляли в объединенный образец. Образец бактерий обрабатывали ультразвуком 6х20 с с использованием зондового устройства для обработки ультразвуком Вгапкоп 8оп1йег 450. Бактерии и зонд охлаждали на льду 1 мин между импульсами ультразвука. Полученный в результате обработки ультразвуком образец центрифугировали в роторе 8огуа11 88-34 при 16000 об./мин в течение 12 мин при 4°С для осветления надосадочной жидкости. Надосадочную жидкость переносили в свежие пробирки 88-34 и повторно центрифугировали при 12000 об./мин в течение 12 мин при 4°С. До 20 мл гранул с глутатион-агарозой (81дта) добавляли к очищенному лизату и помещали во вращающийся планшет на 2-3 мин. Гранулы промывали 4 раза буфером В (буфер А, №1С’1 в концентрации 150 мМ, без Р8МР), затем 2 раза буфером С (буфер В +2,5 мМ СаС1₂). Конечную промывку сливали до образования гранулами густой суспензии. Для удаления последовательности глутатион-3-трансферазы с рекомбинантного белка добавляли 20 ед. тромбина (крупного рогатого скота, без плазминогена, Са1Ьюсйет), гранулы оставляли на вращающейся платформе в течение ночи при 4°С. После расщепления тромбином гранулы загружают на пустую 20 мл колонку. Примерно 20 аликвот по 1 мл собирают элюцией РВ8. Образцы каждой аликвоты по 0,5 мкл капают на нитроцеллюлозу и окрашивают Атйо В1аск для определения белкового пика. Аликвоты, содержащие слитые белки, объединяют и добавляют 100 микролитров гранул п-аминобензамидинагарозы (81дта) и оставляют смешиваться в течение 45 мин при 4°С. Данная последняя стадия удаляет тромбин с образца рекомбинантного белка. Рекомбинантный белок центрифугируют для удаления гранул и затем концентрируют с использованием концентратора сеп1пргер-10 (Аписон). Концентрированный рекомбинантный белок обессоливают на колонке РИ-10 (Рйагташа, содержит 8ерйабех О-25М), и собирают десять аликвот по 0,5 мл. На данных образцах проводят дот-блот для определения пика белка, и подходящие аликвоты объединяют, стерилизуют фильтрованием и хранят при -80°С. Анализ по определению белка (анализ ИС, Вюгаф используют для определения концентрации рекомбинантного белка. Чистоту образца определяют путем 8И8-РАОЕ, и биоактивность определяют путем биоанализа на клетках N0-108.

Продукты данной процедуры могут включать в себя слитые белки, такие как ВА-14, как описано в общем примере, или новые слитые белки, продуцированные данным способом клонирования, которые имеют свойства, такие как молекулярная масса и активность в биоанализах инактивации Кйо, отличные от молекулы ВА-14 или контрольного белка С3, например ВА-05. Данные новые слитые белки содержат последовательность С3 и могут изменяться с С-конца вследствие использованного способа.

Пример 21. Получение слитого белка ВА-07

Способ по примеру 1 может использоваться для получения слитого белка ВА-07, который содержит следующую аминокислотную последовательность:

- 40 008824

Мек

Зег

Агд

Уа1

Азр

Ьеи

С1п

А1а

Суз

Азп

А1а

Туг

Зег

Не

Азп

Б1п

1

5

10

15

Ьуз

А1а

Туг

Зег

Азп

ТЬг

Туг

61п

С1и

РЬе

ТЬг

Авп

Не

Азр

61п

А1а

20

25

30

Ьуз

А1а

Тгр

С1у

Азп

А1а

61П

Туг

Ьуз

Туг

61у

Ьеи

Зег

Ьуз

Зег

35

40

45

Б1и

Ьуз

С1и

А1а

Не

Уа1

Зег

Туг

ТЬг

Ьуз

Зег

А1а

Зег

С1и

11е

Азп

50

55

60

С1у

Ьуз

Ьеи

Агд

С1п

Азп

Ьуз

61у

Уа1

Не

Азп

61у

РЬе

Рго

Зег

Азп

65

70

75

80

Ьеи

Не

Ьуз

61п

Уа1

С1и

Ьеи

Азр

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

ьуз

Мек

Ьуз

85

90

95

ТЬг

Рго

Б1и

Азп

Не

Меб

Ьеи

РЬе

Агд

61у

Азр

Рго

А1а

Туг

Ьеи

100

105

НО

61у

ТЬг

61и

РЬе

61п

Азп

ТЬг

Ьеи

Азп

Зег

Азп

С1у

ТЬг

Не

Азп

115

120

125

Ьуз

ТЬг

А1а

РЬе

61и

ьуз

А1а

Ьуз

А1а

Ьуз

РЬе

Ьеи

Азп

Ьуз

Азр

Агд

130

135

140

Ьеи

61и

Туг

Б1у

Туг

Не

Зег

ТЬг

Зег

Ьеи

Мек

Азп

Уа1

Зег

Б1п

РЬе

145

150

155

160

А1а

С1у

Агд

Рго

Не

11е

ТЬг

Ьуз

РЬе

Ьуз

7а1

А1а

Ьуз

С1у

Зег

Ьуз

165

170

175

А1а

С1у

Туг

Не

Азр

Рго

Не

Зег

А1а

РЬе

А1а

61у

61п

Ьеи

С1и

Мек

180

195

190

Ьеи

Рго

Агд

ΗΪ3

Зег

ТЬг

Туг

ΗΪ3

Пе

Азр

Мек

Агд

Ьеи

Зег

195

200

205

Зег

Азр

С1у

Ьуз

С1п

Не

ТЬг

А1а

ТЬг

Мек

Б1у

ТЬг

А1а

210

215

220

Не

Азп

Рго

Ьуз

61и

РЬе

Уа1

Мек

Азп

Рго

А1а

Азп

А1а

51п

С1у

Агд

225

230

235

240

ΗΪ5

ТЬг

Рго

С1у

ТЬг

Агд

Ьеи

245

ЗЕ0(

Ю N0

: 57}

Два ПЦР-праймера конструировали для переноса одной серии рекомбинантных конструкций (ВА05) в вектор рЕТ-9а (Νονηβοη. Масйзоп, Висконсин) для создания белка ВА-07 при экспрессии в подходящей системе экспрессии.

Верхний праймер: 5' ООАТСТООТТССОСОТСАТАТСТСТАОАОТСОАССТО 3' (8ЕЦ ГО N0: 38) Нижний праймер: 5'СОСССАТССАТТАОТТСТССТТСТТССАСТТС 3' (8ЕЦ ГО N0: 39).

Участок ВатН1 с 5’-конца 8Εζ) ГО N0: 39 щцйссаНа: Т6А замещена на ТААТ (айа, в 8Εζ) ГО N0: 39).

Программа, которая может использоваться для амплификации продукта с применением полимеразы Р£и включает в себя: 95°С 5’ 1 цикл, затем 94°С 2’ 56°С 2’—>70°С 2’ 10 циклов, затем 94°С 2’—>70°С 3’ 30 циклов и выдерживание при 4°С. Набор (ДАЕХП ((Даден) может использоваться для очистки из кусочка агарозного геля, содержащего требуемую полосу ДНК. Вставку и вектор расщепляют ВаптН1 и ΝάεΙ, следуя инструкциям производителя (Νε\ν Еид1аиб ВюЬаЬз, Вс\ сг1у. Минисота) очищают с использованием электрофореза в агарозном геле и набора (ДАЕХП ((Дадсп). и инкубируют вместе в течение ночи с ДНК-лигазой Т4, следуя инструкциям производителя.

Е. сой (ОН5-альфа, или, предпочтительно, ХЬ1-В1ие) трансформируют смесью лигирования. Клоны могут проверяться индукцией в малом масштабе и 808-РАСЕ, и могут подтверждаться иммуноблоттингом неочищенных лизатов с антителом против СЗ. Плазмидную ДНК очищают, и могут оценивать ее чистоту. Могут проводить секвенирование ДНК (например, технологией Ь1Сот, в которой целую цепь секвенируют по всей длине клона).

Первая конструкция, полученная таким образом (рЕТЗа-ВА-07, 8Εζ) ГО N0:7), совпадала с теоретической последовательностью ДНК конструкции рСЕХ/ВА-05 с небольшим изменением с 5'-конца вследствие процедуры клонирования.

-41 008824

Вторая конструкция рЕТ9а-ВА-07 может быть получена субклонированием вставки их рЕТ3а-ВА07 в вектор рЕТ9а путем расщепления конструкции рЕТ3а ВатН1 и Νώ4 (№\ν Епд1апб ВюЬаЬк. Веуег1у. Миннесота) по инструкциям производителя. Плазмидная ДНК рЕТ9а может расщепляться теми же самыми ферментами. ДНК вставки и ДНК вектора могут очищаться электрофорезом в агарозном геле. Вставка может лигироваться в новый вектор с использованием ДНК-лигазы Т4 (№\ν Епд1апб ВюЬаЬк. Веуег1у. Миннесота). Лигированной ДНК могут трансформироваться клетки БН5-альфа. и ДНК может быть получена с использованием мини- и максинаборов О1АСЕН Клоны могут характеризоваться расщеплением рестриктазами. и секвенированием ДНК вставки во всех направлениях (например. Вю8 & Т. ЬасЫпе. Квебек). ДНК конструкции могут трансформироваться клетки ВЬ21 (БЕ3). в клетки ВЬ21 (БЕ3)/рЬу58. Щоуадеп. Майкоп. Висконсин) или другая подходящая система экспрессии.

Пример 22. Общий способ для захвата меченного тритием тимидина в качестве меры клеточной пролиферации

Анализы включения ³Н-тимидина

Клеточные линии тестировали на микоплазму. и подтверждали ее отсутствие перед началом исследования. Клеточные линии получают из Атепсап Туре СиНиге Со11есйоп (АТСС) (КоскуШе. Мэриленд). Линию НЕС-1В культивируют в минимальной необходимой среде Игла (Е-МЕМ). дополненной 10% ЕВ8 и 1% НЕРЕ8. Линию Сасо-2 культивируют в Е-МЕМ. дополненной 20% ЕВ8. 1% НЕРЕ8. 1 мМ пируватом натрия. и 0.1 мМ не незаменимой аминокислоты. Линию 8К-МЕБ-1 культивируют в среде Маккоя. дополненной 10% ЕВ8 и 1% НЕРЕ8. Объемы 100 мкл каждого из 2-х рабочих растворов слитого белка. положительные и относящиеся к носителю контроли помещали в трех параллелях в 96-луночные планшеты для микротитрования. содержащие клетки (4х10³/100 мкл). с получением конечного объема 200 мкл. Планшеты помещали в инкубатор на 37°С с 100% влажностью и 5% СО₂. Примерно через 54 ч инкубации объем из 20 мкл меченного тритием тимидина (³Н-тимидина) (ΙΟΝ. Моп!геа1. Канада). содержащий 1.0 мКи. добавляют в каждую лунку. ³Н-тимидин получают в КРМ1-1640. дополненной 10% ЕВ8. Культуры инкубируют в тех же условиях. как указано выше. примерно в течение 18 ч. В конце инкубации клетки собирают автоматическим устройством для сбора клеток (Тот1ес). и включенный ³Нтимидин в количестве импульсов в минуту (срт) измеряют в сцинтилляционном счетчике для микропланшетов (ТорСоип! ΝΧΊζ Раскагб). Значения для лунок. обработанных слитым белком ВА-07. сравнивают со значениями для контроля-носителя. Данные строят с использованием числа импульсов в минуту (срт) по оси Υ и дозы слитого белка по оси X.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ предотвращения или ингибирования бесконтрольной пролиферации и распространения или миграции метастазирующих опухолевых клеток при злокачественной опухоли млекопитающего. предусматривающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции. содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка. содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о51пбшт Ьо1и1тит или его функциональный аналог.
2. Способ предотвращения или ингибирования неконтролируемой пролиферации и распространения или миграции в пределах края резекции ткани хозяина. прилегающей к участку иссечения злокачественной опухоли у млекопитающего. метастазирующей опухолевой клетки. оставшейся в крае резекции. предусматривающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции. содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка. содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 ОоЛпбшт ЬоШйпит. или его функциональный аналог. причем указанное введение проводится непосредственно на поверхность края резекции или ниже поверхности края резекции или в ткань. приближенную к краю резекции. которая остается у млекопитающего. и указанное введение осуществляется во временном интервале перед или после иссечения или удаления опухоли. или перед и после иссечения или удаления опухоли.
3. Способ предотвращения роста опухоли из злокачественной клетки в ткани хозяина у млекопитающего. предусматривающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции. содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка. содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 ОоЛпбшт Ьо1и1шит. или его функциональный аналог. где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два события. выбранные из миграции злокачественных клеток. пролиферации злокачественных клеток. ангиогенеза. или образования тубулярной структуры. или роста капиллярной сети вблизи злокачественной клетки. и секреции активной металлопротеиназы из злокачественной клетки.
4. Способ предотвращения роста внутри края резекции ткани хозяина вблизи участка иссечения или удаления первичной злокачественной опухоли у млекопитающего. вторичной опухоли. содержащей остаточную клетку злокачественной опухоли. причем данный способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции. содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка. содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и

- 42 008824 единицу экзотрансферазы С3 ОоЧпбшт Ьо1и1тит или его функциональный аналог, причем указанное введение проводится непосредственно в край резекции или ниже поверхности края резекции или в ткань, приближенную к краю резекции, которая остается у млекопитающего, и указанное введение осуществляется во временном интервале перед или после иссечения или удаления первичной опухоли, или перед и после иссечения или удаления первичной опухоли, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции остаточных злокачественных клеток, пролиферации остаточных злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи остаточной злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из остаточной злокачественной клетки.
5. Способ по п.1, где конъюгат слитого белка представляет собой ВА-05.
6. Способ по п.1, где злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей злокачественную опухоль молочной железы, головного мозга, толстого кишечника, кожи, опухоли почки и печени.
7. Способ по п.1, где злокачественная опухоль представляет собой опухоль головного мозга, выбранную из группы, включающей глиальные опухоли, нейрональные опухоли, опухоли шишковидной железы, менингеальные опухоли, опухоли оболочки нервов, лимфомы, недифференцированные опухоли, и метастазирующие опухоли, расположенные в головном мозге, источником которых являются опухоли легких, молочной железы, меланома, опухоли почки и желудочно-кишечного тракта.
8. Способ по п.1, где злокачественная опухоль представляет собой опухоль головного мозга, выбранную из группы, включающей анапластическую астроцитому, мультиформную глиобластому, волосовидную астроцитому, олигодендроглиому, эпендимому, миксопапиллярную эпендимому, субэпендимому, папиллому хориоидного сплетения, нейробластому, ганглионейробластому, ганглионейрому и медуллобластому, пинеобластому и пинеоцитому, менингиому, менингеальную гемангиоперицитому, менингеальную саркому, шванному (нейролеммому) и нейрофиброму, ходжкинскую лимфому, неходжкинскую лимфому, ходжкинскую лимфому первичного и вторичного подтипов, неходжкинскую лимфому первичного и вторичного подтипов, краниофарингиому, эпидермоидные цисты, дермоидные цисты и коллоидные цисты.
9. Способ по п.1, где терапевтически эффективное количество составляет примерно от 0,001 до 50 мкг на 1 см³ ткани.
10. Способ по п.1, где терапевтически эффективное количество составляет примерно от 0,0001 мкг слитого белка до 100 мкг на 1 см³ ткани.
11. Способ по п.1, где терапевтически эффективное количество составляет примерно от 1 до 10 и до 50 мкг/мл.
12. Способ по п.1, где введение осуществляется путем инъекции, местного нанесения или имплантации.
13. Способ по п.1, где введение выбрано из группы, включающей внутрисуставное, внутриглазное, интраназальное, интраневральное, внутрикожное, внутрикостное, подъязычное, пероральное, местное, внутрипузырное, интратекальное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутричерепное, внутримышечное, подкожное введение, ингаляцию, распыление и ингаляцию непосредственно в опухоль, применение непосредственно в участок заболевания, применение непосредственно на края, оставшиеся после резекции или внутрь них, энтеральное, энтеральное введение при гастроскопической процедуре и ЕСКР.
14. Способ по п.1, где полипептидный радикал транспорта через клеточную мембрану включает в себя пептид, содержащий примерно от 5 до 50 аминокислот.
15. Способ по п.1, где единица экзотрансферазы С3 ОоЧпбшт Ьо1и1шит включает в себя аминокислотную последовательность, определенную как последовательность слитого белка ВА-05.
16. Способ по п.1, где функциональный аналог включает в себя белок, отличающийся активностью в интервале от 50 до 500% по сравнению с активностью экзотрансферазы С3 С1ойп6шт Ьо1и1тит дикого типа.
17. Способ по п.1, где фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель.
18. Способ по п.1, где фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, выбранный из группы, включающей сополимер этилена и винилацетата, ПВА, частично гидролизованный сополимер этилена и винилацетата, сополимер этилена и винилацетата и винилового спирта, перекрестно-связанный сополимер этилена и винилацетата, перекрестно-связанный частично гидролизованный сополимер этилена и винилацетата, перекрестно-связанный сополимер этилена и винилацетата и винилового спирта, поли-Э,Ь-молочную кислоту, поли-Ь-молочную кислоту, полигликолевую кислоту, ПГА, сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, поликапролактон, поливалеролактон, поли(ангидриды), сополимеры поликапролактона с полиэтиленгликолем, сополимеры полимолочной кислоты с полиэтиленгликолем, полиэтиленгликоль; и их сочетания и смеси.
19. Способ по п.1, где фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, включающий водный желатин, водный белок, полимерный носитель, перекрестно-связывающий агент или их сочетания.

- 43 008824
20. Способ по п.1, где фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, включающий матрикс.
21. Способ по п.1, где фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, включающий воду, фармацевтически приемлемую буферную соль, фармацевтически приемлемый буферный раствор, фармацевтически приемлемый антиоксидант, аскорбиновую кислоту, один или несколько фармацевтически приемлемых полипептидов с низкой молекулярной массой, пептид, содержащий примерно от 2 до 10 аминокислотных остатков, один или несколько фармацевтически приемлемых белков, одну или несколько фармацевтически приемлемых аминокислот, незаменимую для человека аминокислоту, один или несколько фармацевтически приемлемых углеводов, один или несколько материалов, производных от фармацевтически приемлемого углевода, невосстанавливающий сахар, глюкозу, сахарозу, сорбит, трегалозу, маннит, мальтодекстрин, декстрины, циклодекстрин, фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, ΕΌΤΑ, ΌΤΡΑ, хелатирующий агент для двухвалентного иона металла, хелатирующий агент для трехвалентного иона металла, глутатион, фармацевтически приемлемый неспецифический сывороточный альбумин, и их сочетания.
22. Способ по п.1, где фармацевтическая композиция является стерильной.
23. Способ по п.1, где фармацевтическая композиция подлежит стерилизации.
24. Способ по п.1, где фармацевтическая композиция стерилизована.
25. Способ по п.1, где фармацевтическая композиция находится в пробирке в количестве одной лекарственной дозы или в интегральном множестве лекарственных доз.
26. Способ по п.1, где фармацевтическая композиция является сухой.
27. Способ по п.1, где фармацевтическая композиция содержит дегидратированный матрикс.
28. Способ по п.1, где фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель.
29. Способ по п.1, где фармацевтическая композиция содержит слитый белок в лиофилизированном матриксе.
30. Применение фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о81пбшт Ьо!и1тит, или его функциональный аналог, для предотвращения или для ингибирования неконтролируемой пролиферации и распространения или миграции метастазирующей опухолевой клетки у млекопитающего.
31. Применение фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о81пбшт Ьо!и1шит, или его функциональный аналог, для предотвращения или для ингибирования неконтролируемой пролиферации и распространения или миграции в крае резекции ткани хозяина вблизи участка иссечения злокачественной опухоли млекопитающего метастазирующей опухолевой клетки, оставшейся в крае резекции.
32. Применение фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о51пбшт Ьо!и1шит или его функциональный аналог, для предотвращения роста опухоли из злокачественной клетки в ткани хозяина-млекопитающего, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции злокачественных клеток, пролиферации злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из злокачественной клетки.
33. Применение фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 С1о51п<1шт Ьо!и1шит, или его функциональный аналог, для предотвращения роста внутри края резекции ткани хозяина вблизи участка иссечения или удаления первичной злокачественной опухоли у млекопитающего вторичной опухоли, содержащей остаточную клетку злокачественной опухоли, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции злокачественных клеток, пролиферации злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из злокачественной клетки.
34. Применение по любому из пп.30-33, где последовательность конъюгата слитого белка представляет собой 8ΕΟ ΙΌ N0: 4.
35. Применение по пп.30, 31 или 33, где злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей злокачественную опухоль молочной железы, головного мозга, толстого кишечника, кожи, опухоли почки и печени.
36. Применение по п.35, где злокачественная опухоль представляет собой опухоль головного мозга, выбранную из группы, включающей глиальные опухоли, нейрональные опухоли, опухоли шишковидной железы, менингеальные опухоли, опухоли оболочки нервов, лимфомы, недифференцированные опухоли,

- 44 008824 и метастазирующие опухоли, расположенные в головном мозге, источником которых являются опухоли легких, молочной железы, меланома, опухоли почки и желудочно-кишечного тракта.
37. Применение по п.35, где злокачественная опухоль представляет собой опухоль головного мозга, выбранную из группы, включающей анапластическую астроцитому, мультиформную глиобластому, волосовидную астроцитому, олигодендроглиому, эпендимому, миксопапиллярную эпендимому, субэпендимому, папиллому хориоидного сплетения, нейробластому, ганглионейробластому, ганглионейрому и медуллобластому, пинеобластому и пинеоцитому, менингиому, менингеальную гемангиоперицитому, менингеальную саркому, шванному (нейролеммому) и нейрофиброму, ходжкинскую лимфому, неходжкинскую лимфому, ходжкинскую лимфому первичного и вторичного подтипов, неходжкинскую лимфому первичного и вторичного подтипов, краниофарингиому, эпидермоидные цисты, дермоидные цисты и коллоидные цисты.
38. Применение по любому из пп.30-37, где фармацевтическая композиция представляет собой лекарственную форму с дозой примерно от 0,001 до 50 мкг на 1 см³ ткани.
39. Применение по любому из пп.30-37, где фармацевтическая композиция представляет собой лекарственную форму с дозой примерно от 0,0001 мкг слитого белка на 1 см³ ткани до 100 мкг слитого белка на 1 см³ ткани.
40. Применение по любому из пп.30-37, где фармацевтическая композиция представляет собой лекарственную форму с дозой примерно от 1 до 10 до 50 мкг/мл.
41. Применение по любому из пп.30-40, где фармацевтическая композиция предназначена для инъекции, местного нанесения или имплантации.
42. Применение по любому из пп.30-40, где введение выбрано из группы, включающей внутрисуставное, внутриглазное, интраназальное, интраневральное, внутрикожное, внутрикостное, подъязычное, пероральное, местное, внутрипузырное, интратекальное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутричерепное, внутримышечное, подкожное введение, ингаляцию, распыление и ингаляцию непосредственно в опухоль, применение непосредственно в участок заболевания, применение непосредственно на края, оставшиеся после резекции или внутрь них, энтеральное, энтеральное введение при гастроскопической процедуре и ЕСВΡ.
43. Применение по любому из пп.30-42, где полипептидный радикал транспорта через клеточную мембрану включает в себя пептид, содержащий примерно от 5 до 50 аминокислот.
44. Применение по любому из пп.30-43, где единица экзотрансферазы С3 С1ойп6шт ЬоШйпит включает в себя аминокислотную последовательность ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ: 4 слитого белка ВА-05.
45. Применение по любому из пп.30-44, где функциональный аналог включает в себя белок, отличающийся активностью в интервале от 50 до 500% по сравнению с активностью экзотрансферазы С3 ОоЦпбшт Ьо!и1тцт дикого типа.
46. Применение по любому из пп.30-45, где фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель.
47. Применение по п.46, где фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, выбранный из группы, включающей сополимер этилена и винилацетата, ПВА, частично гидролизованный сополимер этилена и винилацетата, сополимер этилена и винилацетата и винилового спирта, перекрестно-связанный сополимер этилена и винилацетата, перекрестно-связанный частично гидролизованный сополимер этилена и винилацетата, перекрестно-связанный сополимер этилена и винилацетата и винилового спирта, поли-Э,Ь-молочную кислоту, поли-Ь-молочную кислоту, полигликолевую кислоту, ПГА, сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, поликапролактон, поливалеролактон, поли(ангидриды), сополимеры поликапролактона с полиэтиленгликолем, сополимеры полимолочной кислоты с полиэтиленгликолем, полиэтиленгликоль; и их сочетания и смеси.
48. Применение по п.46, где фармацевтически приемлемый носитель включает в себя водный желатин, водный белок, полимерный носитель, перекрестно-связывающий агент или их сочетания.
49. Применение по п.46, где фармацевтически приемлемый носитель включает в себя матрикс.
50. Применение по п.46, где фармацевтически приемлемый носитель включает в себя воду, фармацевтически приемлемую буферную соль, фармацевтически приемлемый буферный раствор, фармацевтически приемлемый антиоксидант, аскорбиновую кислоту, фармацевтически приемлемый полипептид с низкой молекулярной массой, пептид, содержащий примерно от 2 до 10 аминокислотных остатков, фармацевтически приемлемый белок, фармацевтически приемлемую аминокислоту, незаменимую для человека аминокислоту, фармацевтически приемлемый углевод, материалов, производных от фармацевтически приемлемого углевода, невосстанавливающий сахар, глюкозу, сахарозу, сорбит, трегалозу, маннит, мальтодекстрин, декстрины, циклодекстрин, фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, Е^ТΑ, ΌΊΡΑ, хелатирующий агент для двухвалентного иона металла, хелатирующий агент для трехвалентного иона металла, глутатион и фармацевтически приемлемый неспецифический сывороточный альбумин.
51. Применение по любому из пп.30-50, где фармацевтическая композиция является стерильной.
52. Применение по любому из пп.30-50, где фармацевтическая композиция подлежит стерилизации.
53. Применение по любому из пп.30-50, где фармацевтическая композиция стерилизована.

- 45 008824
54. Применение по любому из пп.30-53, где фармацевтическая композиция находится в пробирке в единичной лекарственной дозе или в интегральном множестве лекарственных доз.
55. Применение по любому из пп.30-54, где фармацевтическая композиция является сухой.
56. Применение по любому из пп.30-54, где фармацевтическая композиция содержит дегидратированный матрикс.
57. Применение по любому из пп.30-54, где фармацевтическая композиция содержит слитый белок в лиофилизованном матриксе.
58. Применение фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 ΟοδΙπάίιιιη Ьοΐи1^ηит, или его функциональный аналог, для производства лекарственного средства для предотвращения или ингибирования неконтролируемой пролиферации и распространения или миграции метастазирующей опухолевой клетки при злокачественной опухоли млекопитающего.
59. Применение фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 ΟοδΙπάίιιιη Ьοΐи1^ηит, или его функциональный аналог, для производства лекарственного средства для предотвращения или ингибирования неконтролируемой пролиферации и распространения или миграции в пределах края резекции ткани хозяина вблизи участка иссечения злокачественной опухоли млекопитающего метастазирующей опухолевой клетки, оставшейся в крае резекции.
60. Применение фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 ΟοδΙπάίιιιη Ьοΐи1^ηит, или его функциональный аналог, для производства лекарственного средства для предотвращения роста опухоли в ткани хозяина-млекопитающего, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции злокачественных клеток, пролиферации злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи злокачественной клетки и секреции активной металлопротеиназы из злокачественной клетки.
61. Применение фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С3 ΟοδΙπάίιιιη Ьοΐи1^ηит, или его функциональный аналог, для производства лекарственного средства для предотвращения роста в пределах края резекции ткани хозяина вблизи участка иссечения или удаления первой злокачественной опухоли млекопитающего второй опухоли, содержащей оставшуюся клетку злокачественной опухоли, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции злокачественных клеток, пролиферации злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из злокачественной клетки.
62. Применение по любому из пп.58-61, где последовательность конъюгата слитого белка представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 4.
63. Применение по пп.58, 59 или 61, где злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей злокачественную опухоль молочной железы, головного мозга, толстого кишечника, кожи, опухоли почки и печени.
64. Применение по п.63, где злокачественная опухоль представляет собой опухоль головного мозга, выбранную из группы, включающей глиальные опухоли, нейрональные опухоли, опухоли шишковидной железы, менингеальные опухоли, опухоли оболочки нервов, лимфомы, недифференцированные опухоли, и метастазирующие опухоли, расположенные в головном мозге, источником которых являются опухоли легких, молочной железы, меланома, опухоли почки и желудочно-кишечного тракта.
65. Применение по п.63, где злокачественная опухоль представляет собой опухоль головного мозга, выбранную из группы, включающей анапластическую астроцитому, мультиформную глиобластому, волосовидную астроцитому, олигодендроглиому, эпендимому, миксопапиллярную эпендимому, субэпендимому, папиллому хориоидного сплетения, нейробластому, ганглионейробластому, ганглионейрому и медуллобластому, пинеобластому и пинеоцитому, менингиому, менингеальную гемангиоперицитому, менингеальную саркому, шванному (нейролеммому) и нейрофиброму, ходжкинскую лимфому, неходжкинскую лимфому, ходжкинскую лимфому первичного и вторичного подтипов, неходжкинскую лимфому первичного и вторичного подтипов, краниофарингиому, эпидермоидные цисты, дермоидные цисты и коллоидные цисты.
66. Применение по любому из пп.58-65, где фармацевтическая композиция представляет собой лекарственную форму с дозой примерно от 0,001 до 50 мкг на 1 см³ ткани.
67. Применение по любому из пп.58-65, где фармацевтическая композиция представляет собой лекарственную форму с дозой примерно от 0,0001 до 100 мкг слитого белка на см³ ткани.
68. Применение по любому из пп.58-65, где фармацевтическая композиция представляет собой лекарственную форму с дозой примерно от 1 до 10 мкг/мл и до 50 мкг/мл.

- 46 008824
69. Применение по любому из пп.58-68, где фармацевтическая композиция предназначена для инъекции, местного нанесения или имплантации.
70. Применение по п.1, по любому из пп.58-68, где введение выбрано из группы, включающей внутрисуставное, внутриглазное, интраназальное, интраневральное, внутрикожное, внутрикостное, подъязычное, пероральное, местное, внутрипузырное, интратекальное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутричерепное, внутримышечное, подкожное введение, ингаляцию, распыление и ингаляцию непосредственно в опухоль, применение непосредственно в участок заболевания, применение непосредственно на края, оставшиеся после резекции или внутрь них, энтеральное, энтеральное введение при гастроскопической процедуре и ЕСКР.
71. Применение по любому из пп.58-70, где полипептидный радикал транспорта через клеточную мембрану включает в себя пептид, содержащий примерно от 5 до 50 аминокислот.
72. Применение по любому из пп.58-71, где единица экзотрансферазы С3 С1ойпйшт Ьо!и1тит включает в себя аминокислотную последовательность 8ЕО Ш N0: 4 слитого белка ВА-05.
73. Применение по любому из пп.58-72, где функциональный аналог включает в себя белок, отличающийся активностью в интервале от 50 до 500% по сравнению с активностью экзотрансферазы С3 С1о§!п4шт Ьо!и1тит дикого типа.
74. Применение по любому из пп.58-73, где фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель.
75. Применение по п.74, где фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, выбранный из группы, включающей сополимер этилена и винилацетата, ПВА, частично гидролизованный сополимер этилена и винилацетата, сополимер этилена и винилацетата и винилового спирта, перекрестно-связанный сополимер этилена и винилацетата, перекрестно-связанный частично гидролизованный сополимер этилена и винилацетата, перекрестно-связанный сополимер этилена и винилацетата и винилового спирта, поли-Э,Ь-молочную кислоту, поли-Ь-молочную кислоту, полигликолевую кислоту, ПГА, сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, поликапролактон, поливалеролактон, поли(ангидриды), сополимеры поликапролактона с полиэтиленгликолем, сополимеры полимолочной кислоты с полиэтиленгликолем, полиэтиленгликоль; и их сочетания и смеси.
76. Применение по п.74, где фармацевтически приемлемый носитель включает в себя водный желатин, водный белок, полимерный носитель, перекрестно-связывающий агент или их сочетания.
77. Применение по п.74, где фармацевтически приемлемый носитель включает в себя матрикс.
78. Применение по п.74, где фармацевтически приемлемый носитель включает в себя воду, фармацевтически приемлемую буферную соль, фармацевтически приемлемый буферный раствор, фармацевтически приемлемый антиоксидант, аскорбиновую кислоту, фармацевтически приемлемый полипептид с низкой молекулярной массой, пептид, содержащий примерно от 2 до 10 аминокислотных остатков, фармацевтически приемлемый белок, фармацевтически приемлемую аминокислоту, незаменимую для человека аминокислоту, фармацевтически приемлемый углевод, материал, производный от фармацевтически приемлемого углевода, невосстанавливающий сахар, глюкозу, сахарозу, сорбит, трегалозу, маннит, мальтодекстрин, декстрины, циклодекстрин, фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, ЕЭТА, ЭТРА, хелатирующий агент для двухвалентного иона металла, хелатирующий агент для трехвалентного иона металла, глутатион и фармацевтически приемлемый неспецифический сывороточный альбумин.
79. Применение по любому из пп.58-78, где фармацевтическая композиция является стерильной.
80. Применение по любому из пп.58-78, где фармацевтическая композиция подлежит стерилизации.
81. Применение по любому из пп.58-78, где фармацевтическая композиция стерилизована.
82. Применение по любому из пп.58-81, где фармацевтическая композиция находится в пробирке в количестве одной лекарственной дозы или в интегральном множестве лекарственных доз.
83. Применение по любому из пп.58-82, где фармацевтическая композиция является сухой.
84. Применение по любому из пп.58-82, где фармацевтическая композиция содержит дегидратированный матрикс.
85. Применение по любому из пп.58-82, где фармацевтическая композиция содержит слитый белок в лиофилизованном матриксе.