CN1886154A - 治疗肿瘤扩散的肉毒梭菌c3外转移酶组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供药物组合物，每种药物组合物由多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物组成。所述组合物用于防止或抑制哺乳动物中癌症的转移性肿瘤细胞不受控制的增殖、扩散和迁移。所述组合物的每一种均能够影响或抑制肿瘤细胞增殖、迁移、血管发生、以及金属蛋白酶分泌中的两种或多种的组合。

Description

治疗肿瘤扩散的肉毒梭菌C3外转移酶组合物和方法
发明所属领域
本发明涉及用于治疗癌症和防止与转移性癌症相关的肿瘤生长的组合物和方法。具体地，本发明涉及包含可透过细胞的融合蛋白偶联物的组合物或其功能类似物，所述融合蛋白偶联物包含多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌(Clostridium botulinum)C3外转移酶单位，该组合物用于防止或抑制哺乳动物中癌症的转移性肿瘤细胞不受控制的增殖和扩散或迁移。
背景技术
哺乳动物中的癌症可由哺乳动物组织中恶性细胞群体不受控制的分裂来表征。如果所述细胞群体局部化于组织中，恶性或癌细胞的这种不受控制的分裂会导致组织中恶性第一肿瘤的形成。如果一种或多种恶性细胞或细胞簇从局部化群体部位转移到第二部位或额外的组织部位暂时停留或定植并不受控制地生长，所述第二部位或额外的组织部位可以靠近第一肿瘤部位或者可以远离第一肿瘤部位，例如处于解剖学上远离或明显区别于第一组织的另一器官或组织，那么，作为转移性恶性细胞不受控制的分裂的结果，在第二部位或额外的部位会分别出现第二肿瘤或额外的肿瘤。一种或多种恶性细胞从第二部位的生长细胞所在处向其他部位的转移等等也可以发生，在哺乳动物的一个或多个组织部位产生恶性肿瘤。与这样的恶性肿瘤生长相关的是靠近进展性肿瘤的组织常见的特征性血管发生(angiogenesis)或血管化(vascularisation)进程，包括新毛细管的发展或脉管系统的向内生长(in-growth)和管状网的形成，其中新的脉管系统提供了所需的各种各样的因子例如营养和生长因子，使肿瘤继续生长。
肿瘤是异常的组织块，源于不受控制的进展性过度细胞分裂，也称为瘤(neoplasm)。肿瘤可以是良性的(非癌)或恶性的。
目前利用多种方法治疗哺乳动物例如人的癌症，包括例如手术方法，其中将例如肿瘤通常还有一些邻近或靠近的非肿瘤组织从组织中的肿瘤部位切除。去除肿瘤后，残余的或边缘的组织仍然靠近哺乳动物中的肿瘤切除部位。然而如果只用手术治疗，许多患者，尤其是患某些具体类型癌症的患者将以至少一种额外的或第二肿瘤形成或成长的形式经历癌症复发，所述具体类型的癌症选自乳腺癌、脑癌、结肠癌(colon cancer)、皮肤癌(黑素瘤)、肾癌(肾脏癌症(renal))和肝癌(肝脏癌症(liver))所组成的组，所述复发通常在切除第一肿瘤后在残留的边缘中，有时候在其他组织或器官以及在离第一肿瘤很远(remote)或较远(distant)的部位。因此，除了手术之外，许多癌症还要结合例如涉及施用细胞毒化疗药物(例如，长春新碱、长春碱、氨甲蝶呤、5-FU等)和/或放射疗法的治疗手段来治疗。然而，用这种方法的一个困难是，在所施用的剂量水平，放疗和化疗试剂对正常组织也可能是毒性的，通常产生威胁患者生命的副作用。这些癌症治疗手段通常失败/缓解率(remission)也可能很高，因而导致患者死亡。一些更新近的治疗方法通过改变或上调控癌细胞中的基因产物而利用了细胞信号的调节障碍，例如使用三苯氧胺(tamoxifen)治疗乳腺癌，使用Gleevec(B)(来自Novartis的甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate))治疗慢性粒细胞白血病(也称为CML)。
当前方法的另一困难是局部再现和局部疾病控制仍然是恶性肿瘤治疗中的主要挑战。目前每年有超过600,000名病人(在美国)患局部化恶性肿瘤(没有远距离转移扩散的证据)，占诊断为患恶性肿瘤的所有患者的大约64％，但不包括原位非黑素瘤皮肤癌症或癌。对于大多数这些患者来说，疾病的手术切除提供了最大的治愈机会，在起初的治疗之后，超过400,000名患者会被治愈。不幸的是，大约200,000名(或者所有局部化疾病患者的约三分之一)在起初的治疗之后将会复发。在那些复发者中，每年将会因为疾病的局部再现而复发的数目可能达到约133,000名(或者所有局部化疾病患者的约21％)。将会由于疾病的远距离转移而复发的数目为大约每年68，000名(或者所有局部化疾病患者的约11％)。作为没有能力控制疾病的生长的直接结果，每年大约会有另外100,000名患者死亡。
脑瘤是尤其致命的癌症形式。所有原发性神经胶质瘤(神经胶质瘤占所有脑瘤的约1/3)中大约有三分之一是致命的，神经胶质瘤患者的平均存活率为大约10到大约12个月。五年存活率约为9％。神经胶质瘤为神经胶质起源的神经外胚层肿瘤，包括源于星形胶质细胞的星形细胞瘤、源于少突胶质细胞(oligodendrocytes)的少突胶质细胞瘤(oligodendroglioma)、和源于室管膜细胞的室管膜瘤。许多研究表明需要用组合疗法来治疗这些攻击性肿瘤。最常见的脑瘤类型由转移产生，在美国，每年诊断出大约100,000至大约170,000例脑瘤。转移性脑瘤主要通过放射外科或肿瘤切除来治疗。已经报导，当将手术与放射治疗结合时，得到了比单独使用放射治疗更好的结果。转移至脑的转移性肿瘤的最常见起源包含乳腺癌、支气管癌、胃肠癌、肾脏癌和恶性黑素瘤。转移性肿瘤可以是临床暴发性的，尤其是在去除原发性肿瘤后。可以通过检测临床症状如头疼、反胃或呕吐、癫痫发作(seizure)、精神状况改变、发声改变、视觉异常、和/或瘫痪来鉴定怀疑患CNS癌症(其包括此处所使用的脑瘤和脑癌)的个体。抑制哺乳动物原发性CNS癌症转移的方法也在本发明的范围之内。
血管发生(Angiogensis)
肿瘤生长期间，在恶性肿瘤存在的情况下，正常组织中许多控制血管发生的机制都改变了。肿瘤的形成和转移涉及病理学血管发生。像健康组织一样，肿瘤需要连接到血管以接收营养和氧并排除细胞废物。因此，病理学血管发生对于肿瘤的生长与扩张是至关重要的。血管发生在其中发挥重要作用的肿瘤包括实体恶性肿瘤以及良性肿瘤，例如听神经瘤、纤维神经瘤、沙眼和化脓性肉芽肿。在转移过程中，病理学血管发生至少在两个方面是重要的。肿瘤中血管的形成允许肿瘤细胞进入血流并在全身循环。血管发生支持由离开原来的部位或此处所用第一肿瘤的肿瘤细胞的定植所产生的新肿瘤的形成和生长。
血管发生是血管形成的复杂过程。该过程同时涉及生物化学和细胞学事件，包括(1)血管发生刺激激活内皮细胞(ECs)；(2)胞外基质降解，活化的Ecs侵袭入周围组织，以及向血管发生刺激物来源迁移；和(3)Ecs增殖分化形成新血管(Folkman等，1991，J.Biol.Chem.267：10931-10934)。
血管发生的控制是涉及血管发生刺激物和抑制物的高度调控的过程。在健康的人和动物体内，血管发生在具体限定的部位发生。例如血管发生经常发现于胎儿和胚胎发育、正常组织和器官的发育和生长、伤口愈合以及黄体、子宫内膜和胎盘的形成过程中。
本发明的另一实施方案包含用可透过细胞的融合蛋白偶联物或其功能类似物对血管发生的抑制，其中融合蛋白偶联物包含多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位，例如融合蛋白BA-05。
本发明的另一实施方案包含用有效量的包含可透过细胞的融合蛋白偶联物或其功能类似物的药物组合物抑制血管发生，其中融合蛋白偶联物包含多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位，例如融合蛋白BA-05。
Rho信号和癌症
已经研究了涉及癌症的Rho(也称为Ras同源物)家族蛋白。Ras(RhoB作为第二靶标)是通过抑制翻译后修饰的分子进行转移的靶标。然而，这些治疗学研究的焦点集中于Ras，并限于Rho家族成员中的RhoB，而本发明可能具有影响RhoA，RhoB，和RhoC信号的能力。RhoA，RhoB，和RhoC是被融合蛋白BA-05所特异性抑制的Rho家族成员。在一些研究中，C3外酶(exoenzyme)作为涉及Rho的分子探针使用，并且已经发现了体外模型参数的显著变化，这些参数在癌症例如细胞转化中被认为是重要的。在这些研究中，从组织培养培养基中的长期保温到异源基因表达的方法均使用C3。由于本发明组合物渗透到肿瘤细胞内部在较低的剂量使Rho快速失活，因而本发明的组合物和方法例如BA-05和施用BA-05提供了相对于C3的明显优势，这是本发明的优势所在。另一个优势，本发明提供了包含本发明的融合蛋白如BA-07的组合物，其中所述融合蛋白具有同时穿透肿瘤细胞和内皮细胞的能力，所述内皮细胞在不存在融合蛋白的情况下可以形成新的血管来供应肿瘤生长。
已经在恶性肿瘤临床样品中发现了Rho家族调控蛋白中的突变。例子包括肝细胞癌中的DLC1基因；p-190-A，位于神经胶质瘤和星形细胞瘤中改变的基因组区域；GRAF，其在白血病中具有丧失功能的突变；以及LARG，发现于急性骨髓白血病中所发现的一些基因融合体中。遗传工程点突变激活RhoA并在体外诱导细胞的转化。
人恶性肿瘤中Rho家族基因的表达
小型GTP酶Rho是BA-05的细胞目标，在某些癌症如恶性黑素瘤和乳腺癌中被上调控。
与小型GTP酶Ras相对照，Rho GTP酶尚未被传统手段鉴定为癌基因，尽管癌症中Rho基因调控障碍的证据越来越多。例如，已观察到睾丸生殖细胞肿瘤中RhoA mRNA水平升高，炎症性乳腺癌和胰腺癌中RhoC mRNA升高。
癌症基因组解剖学计划(CGAP)将基因表达与恶性肿瘤部位相关联。在由恶性和正常细胞所制成的文库中，可以获得转录水平的资料(NCBI，2002)。用“标签(tags)”，即唯一地确定基因的10个碱基的寡核苷酸测定转录水平。有关RhoA，RhoB和RhoC I的可获得的资料显示RhoA的上调，且在这些测量值中，脑和乳腺恶性肿瘤中的RhoC上调至更小的程度。发现RhoA序列标记在由小脑和乳腺恶性肿瘤制成的文库中比由相应的正常组织制成的文库中更为常见。表达水平在胶质母细胞瘤中得到提升而在星形细胞瘤中没有提升。星形细胞瘤的结果与星形细胞肿瘤样品中RhoA蛋白水平的减少一致。RhoC mRNA在乳腺恶性肿瘤中过表达，在一些脑恶性肿瘤中稍微过表达，在结肠腺癌中可以被下调。
然而这些文库中Rho cDNA的相对水平可能与细胞中的Rho活动不直接相关，其受到涉及众多其他基因产物的复杂调控。
肿瘤和肿瘤细胞系中的Rho蛋白
在人的几个肿瘤部位研究了Rho蛋白表达。在结肠、乳腺和肺肿瘤中发现了蛋白水平的升高。用直接针对这些蛋白的多克隆抗体，然后用VectaStain试剂盒(Vector Labs)显示并进行图像分析，从头和颈鳞状细胞癌的5μm切片中发现了RhoA和RhoB水平。附近的“非肿瘤”区域作为对照。尽管RhoA蛋白水平随着肿瘤的发展而升高，但与原位癌和分化良好的肿瘤相比，侵袭性肿瘤中RhoB水平下降。没有研究活化状态。
与正常组织相比，RhoA和RhoB的过表达可能发生在乳腺和肺腺癌中，然而在星形细胞肿瘤中Rho蛋白的表达下降并与II至IV级恶性肿瘤反相关。
Rho与转移
Rho涉及细胞迁移和运动的调控。用Rho A突变的构建体转染MM1大鼠肝细胞瘤细胞产生构成性的活化的Rho。在体外侵袭试验中，能够渗透到间皮细胞层中种植的细胞(seeded cell)的百分比与转染的RhoA Val的表达水平相关14。当这些活化的RhoA-转染细胞用于腹腔中的体内试验时，10次植入有6次产生了肿瘤结节，与之相比，对模拟转染体来讲8次中有2次。这些结果表明活性Rho与致癌性(Tumorigenicity)相关。
比较两个转移性黑素瘤模型系统，一个人和一个小鼠，和通过微阵列观察基因表达中的共有相似性的基因表达的全面性研究推测在升高的转移水平中RhoC表达发生改变(Clark等，2000)。另外，当用实验方法操作基因表达时，RhoC的过表达诱导人黑素瘤细胞系从低转移潜力转变为高转移潜力。尽管没有观察到RhoA过表达，但显性阴性突变(N19RhoA)还是减小了转移潜力。
鉴定了人乳腺癌中的一组其表达与转移倾向相关的70个基因(van’tVeer等，2002)。虽然没有发现Rho基因，但疾病标志作为预后指示物的价值不必然与其作为治疗目标的价值相关。在Rho家族信号的情况下，存在酶活性和蛋白-蛋白相互作用的复杂调控，其仅从转录水平的测定来看并不明显。
发明概述
本发明的各种融合蛋白有时候在命名上称为例如BA-05、BA-07和类似的名称。
本发明公开了防止或抑制哺乳动物中癌症的转移性肿瘤细胞不受控制的增殖和扩散或迁移的方法，包括给哺乳动物施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物。
本发明公开了防止或抑制残留于切除边缘的转移性肿瘤细胞在靠近哺乳动物中癌症的肿瘤切除部位的宿主组织切除边缘内不受控制的增殖和扩散或迁移的方法，包括给哺乳动物施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物，所述施用直接施用在切除边缘的表面上或者施用在切除边缘的表面下，或者施用至靠近仍残留在哺乳动物中的切除边缘的组织中，所述施用在切除或去除肿瘤之前或之后、或之前和之后的时间间隔中进行。
本发明公开了防止来自哺乳动物宿主组织中恶性细胞的肿瘤的生长的方法，包括为所述哺乳动物施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物，其中所述融合蛋白同时防止或抑制以下情况中的至少两种：恶性细胞迁移、恶性细胞增殖、靠近恶性细胞的血管发生或管状结构形成或毛细血管网生长，和从恶性细胞分泌活性金属蛋白酶。
本发明公开了防止包含癌症残留肿瘤细胞的第二肿瘤在靠近哺乳动物中癌症的第一肿瘤切除或去除部位的宿主组织切除边缘内生长的方法，该方法包括施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物，所述施用直接施用在切除边缘的表面上或者施用在切除边缘的表面下，或者施用至靠近仍残留在哺乳动物体内的切除边缘的组织中，所述施用在切除或去除第一肿瘤之前或之后、或之前和之后的时间间隔中进行，其中所述融合蛋白同时防止或抑制以下情况中的至少两种：残留肿瘤细胞迁移、残留肿瘤细胞增殖、靠近残留肿瘤细胞的血管发生或管状结构形成或毛细血管网生长，和从残留肿瘤细胞分泌活性金属蛋白酶。
本发明进一步提供上述定义的药物组合物用于实施上述方法或用于生产用于实施上述方法的药剂的用途。
一个方面，本发明包含抑制身体组织癌症转移至哺乳动物CNS(中枢神经系统)的方法，包括给哺乳动物施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物，例如BA-05融合蛋白。
一个方面，包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物，例如融合蛋白BA-05的治疗有效量的药物组合物能够显示抗血管发生活性，并可用于癌症的治疗。
一个方面，本发明公开了防止或抑制哺乳动物癌症中转移性肿瘤细胞不受控制的增殖和扩散或迁移的方法，包括给哺乳动物施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物。
第二个方面，本发明公开了防止或抑制残留于切除边缘中的转移性肿瘤细胞在靠近哺乳动物中癌症的肿瘤切除部位的宿主组织切除边缘内不受控制的增殖和扩散或迁移的方法，包括施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物，所述施用直接施用在切除边缘的表面上或者施用在切除边缘的表面下，或者施用至靠近仍残留在哺乳动物体内的切除边缘的组织中，所述施用在切除或去除肿瘤之前或之后、或之前和之后的时间间隔中进行。
第三个方面，本发明公开了防止来自哺乳动物宿主组织中恶性细胞的肿瘤的生长的方法，包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物，其中所述融合蛋白同时防止或抑制以下情况中的至少两种：恶性细胞迁移、恶性细胞增殖、靠近恶性细胞的血管发生或管状结构形成或毛细血管网生长，和从恶性细胞分泌活性金属蛋白酶。
第四个方面，本发明公开了防止包含癌症残留肿瘤细胞的第二肿瘤在靠近哺乳动物中癌症的第一肿瘤切除或去除部位的宿主组织切除边缘内生长的方法，该方法包括施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物，所述施用直接施用在切除边缘的表面上或者施用在切除边缘的表面下，或者施用至靠近仍残留在哺乳动物体内的切除边缘的组织中，所述施用在切除或去除第一肿瘤之前或之后、或之前和之后的时间间隔中进行，其中所述融合蛋白同时防止或抑制以下情况中的至少两种：残留肿瘤细胞迁移、残留肿瘤细胞增殖、靠近残留肿瘤细胞的血管发生或管状结构形成或毛细血管网生长，和从残留肿瘤细胞分泌活性金属蛋白酶。
第五个方面，本发明公开了包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物的药物组合物在生产药剂中的用途，所述药剂用于防止或抑制哺乳动物中癌症的转移性肿瘤细胞不受控制的增殖和扩散或迁移。
第六个方面，本发明公开了包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物的药物组合物在生产药剂中的用途，所述药剂用于防止或抑制残留于切除边缘中的转移性肿瘤细胞在靠近哺乳动物中癌症的肿瘤切除部位的宿主组织切除边缘内不受控制的增殖和扩散或迁移，其适合于直接施用于切除边缘的表面上或者施用于切除边缘的表面下，或者施用至靠近仍残留在哺乳动物体内的切除边缘的组织中，所述施用在切除或去除肿瘤之前或之后、或之前和之后的时间间隔中进行。
第七个方面，本发明公开了包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物的药物组合物在生产药剂中的用途，所述药剂用于防止来自哺乳动物宿主组织中恶性细胞的肿瘤的生长，其中所述融合蛋白同时防止或抑制以下情况中的至少两种：恶性细胞迁移、恶性细胞增殖、靠近恶性细胞的血管发生或管状结构形成或毛细血管网生长，和从恶性细胞分泌活性金属蛋白酶。
第八个方面，本发明公开了包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物的药物组合物在生产药剂中的用途，所述药剂用于防止包含癌症残留肿瘤细胞的第二肿瘤在哺乳动物中癌症的第一肿瘤切除或去除部位附近的宿主组织切除边缘内的生长，其直接施用于切除边缘的表面上或者施用于切除边缘的表面下，或者施用至靠近仍残留在哺乳动物体内的切除边缘的组织中，所述施用在切除或去除第一肿瘤之前或之后、或之前和之后的时间间隔中进行，其中所述融合蛋白同时防止或抑制以下情况中的至少两种：残留肿瘤细胞迁移、残留肿瘤细胞增殖、靠近残留肿瘤细胞的血管发生或管状结构形成或毛细血管网生长，和从残留肿瘤细胞分泌活性金属蛋白酶。
第九个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中融合蛋白偶联物是BA-05。
第十个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述癌症选自乳腺癌、脑癌、结肠癌、皮肤癌、肾癌和肝癌所组成的组。
第十一个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述癌症是选自神经胶质瘤、神经元瘤、松果体瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、淋巴瘤、畸形瘤(malformative tumor)、和位于脑中的衍生自肺、乳腺、黑素瘤、肾和胃肠道肿瘤的转移性肿瘤所组成的组的脑肿瘤。
第十二个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述癌症是选自间变型星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、毛发细胞型星形细胞瘤(pilocytic astrocytoma)、少突胶质细胞瘤(oligodendroglioma)、室管膜瘤(ependymoma)、粘液性乳头状室管膜瘤(myxopapillary ependymoma)、亚室管膜瘤(subependymoma)、脉络膜丛乳头状瘤(choroids plexus papilloma)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、神经节神经母细胞瘤(ganglioneuroblastoma)、神经节瘤(ganglioneuroma)，以及髓母细胞瘤(medulloblastoma)、松果体母细胞瘤(pineoblastoma)和松果体细胞瘤(pineocytoma)、脑膜瘤(meningioma)、脑膜血管外皮细胞瘤(meningeal hemangiopericytoma)、脑膜肉瘤(meningealsarcoma)、雪旺氏瘤(Schwannoma)(神经鞘瘤(neurolemmoma))和神经纤维瘤(neurofibroma)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发和继发亚型霍奇金淋巴瘤(primary and secondary subtypes of Hodgkin’s lymphoma)、原发和继发亚型非霍奇金淋巴瘤、颅咽管瘤(craniopharyngioma)、上皮样囊肿(epidermoid cysts)、皮样囊肿(dermoid cysts)和胶体囊肿(colloid cysts)所组成的组的脑肿瘤。
第十三个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述治疗有效量为约0.001微克每cc至约50微克每cc组织。
第十四个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述治疗有效量为每立方厘米(cc)组织约0.0001微克的融合蛋白至每立方厘米组织约100微克。
第十五个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述治疗有效量为每毫升约1微克至每毫升约10微克至每毫升约50微克。
第十六个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中通过注射、局部应用、或通过植入施用。
第十七个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述施用方式选自关节内、眼内、鼻内、神经内、皮内、骨内、舌下、口腔、局部、膀胱内、鞘内、静脉内、腹膜内、颅内、肌肉内、皮下、吸入、雾化吸入、直接应用于肿瘤内、直接应用于疾病部位、直接应用于肿瘤切除后的边缘上或边缘内、肠、肠和胃镜检方法一起、以及ECRP施用所组成的组。
第十八个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述多肽性细胞膜转运部分包含含有约5至50个氨基酸的肽。
第十九个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述肉毒梭菌C3外转移酶单位包含融合蛋白BA-05的序列所示的氨基酸序列。
第二十个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述功能类似物包含这样的蛋白，其显示的活性为野生型肉毒梭菌C3外转移酶活性的50％至500％。
第二十一个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述药物组合物包含可药用的载体。
第二十二个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述药物组合物包含可药用的载体，其选自乙烯-醋酸乙烯酯共聚物(poly(ethylene-co-cinyl acetate))、PVA、部分水解的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、乙烯-醋酸乙烯酯-乙烯醇共聚物、交联的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、交联的部分水解的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、交联的乙烯-醋酸乙烯酯-乙烯醇共聚物、聚-D，L-乳酸、聚-L-乳酸、聚乙醇酸、PGA、乳酸与乙醇酸共聚物、聚己内酯(polycaprolactone)、聚戊内酯(polyvalerolactone)、聚酸酐、聚己内酯与聚乙二醇的共聚物、聚乳酸与聚乙二醇的共聚物、聚乙二醇；及其组合物和混合物的所组成的组。
第二十三个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述药物组合物包含含有水明胶、水性蛋白、多聚体载体、交联剂及其组合的可药用的载体。
第二十四个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述药物组合物包含含有基质的可药用的载体。
第二十五个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述药物组合物包含可药用的载体，所述可药用的载体包含水，可药用的缓冲盐，可药用的缓冲溶液，可药用的抗氧化剂，抗坏血酸，一种或多种低分子量的可药用的多肽，包含约2至约10个氨基酸残基的肽，一种或多种可药用的蛋白，一种或多种可药用的氨基酸，人体必需的氨基酸，一种或多种可药用的碳水化合物，一种或多种可药用的碳水化合物衍生物质，非还原性糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、海藻糖、甘露醇、麦芽糊精、糊精、环式糊精，可药用的螯合剂，EDTA、DTPA、二价金属离子的螯合剂、三价金属离子的螯合剂、谷胱甘肽，可药用的非特异性血清白蛋白，及其组合。
第二十六个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述药物组合物是无菌的。
第二十七个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述药物组合物是可灭菌的。
第二十八个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述药物组合物是已灭菌的。
第二十九个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述药物组合物以单位剂量形式或以单位剂量的整倍数形式存在于小瓶中。
第三十个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述药物组合物是干燥的。
第三十一个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述药物组合物包含脱水基质。
第三十二个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述药物组合物包含可药用的载体。
第三十三个方面，本发明公开了前述方面的另一方面，其中所述药物组合物包含置于冻干基质中的融合蛋白。
Rho的拮抗作用与凋亡
癌症中控制细胞增殖的机制是有调节障碍的。用重组C3细胞外酶灭活Rho后，出现EL4鼠T淋巴瘤细胞凋亡增加。在NIH 3t3细胞中，用Rho激酶抑制剂Y-27632处理显著地抑制了不依赖于锚定的生长(anchorage-independent growth)。在一个实施方案中，灭活Rho能够防止肿瘤细胞增殖，本发明包括用含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物例如融合蛋白BA-07减少或抑制细胞增殖，或诱导凋亡。在另一实施方案中，本发明包括用包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物例如融合蛋白BA-07的药物组合物减少或抑制细胞增殖，或诱导凋亡。
Rho的拮抗作用与细胞迁移
转移性癌细胞是高度迁移性的。灭活Rho能够防止特定细胞类型中的细胞迁移。C3转移酶和Rho激酶抑制剂Y-27632阻断HT29人结肠癌细胞的细胞侵袭。在v-Crk-可诱导的大鼠纤维原细胞3Y1细胞系中，C3和Y-27632抑制v-Crk，导致细胞移动性降低。由于缺少RhoB蛋白，用阿霉素、放射性物质或Taxol处理减少了RhoB-/-细胞Rho B+/-或RhoB-/-MEF细胞的凋亡。在另一实施方案中，Rho的拮抗作用能够减少细胞迁移和转移，本发明包括用含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物例如融合蛋白BA-07抑制细胞迁移。
本发明的另一实施方案包括用包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物例如融合蛋白BA-05的有效量的药物组合物抑制细胞迁移。
Rho的拮抗作用与基质金属蛋白酶(MMPs)
侵袭性肿瘤细胞具有能够降解胞外基质的特性，胞外基质由降解胞外基质的分泌蛋白酶所包围。由肿瘤细胞分泌的一类重要的蛋白酶是基质金属蛋白酶(MMPs)。这些酶在基质中打开通路，癌细胞可以通过此通路侵袭扩散。肿瘤细胞能够生产不同类型的MMP，MMP通常作为通过活化而被切割和释放的酶前体生产。MMP1裂解胶原蛋白基质。MMP-2可能在肺癌细胞侵袭中扮演重要角色。MMP-9也参与肿瘤细胞侵袭。在另一实施方案中，本发明包括抑制肿瘤细胞的MMP表达、MMP加工或者MMP分泌，所述抑制通过含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物例如融合蛋白BA-07进行。
在另一实施方案中，本发明包括用包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物例如融合蛋白BA-05的有效量的药物组合物抑制MMP表达、MMP加工或MMP分泌。
作为Rho拮抗剂的BA-05和BA-07
BA-05和BA-07是遗传工程形式的C3细胞外酶。C3细胞外酶是发现于一些肉毒梭菌株系中的噬菌体来源的分泌蛋白，所述肉毒梭菌株系将ADP-核糖基转移到小型调节性GTP酶、RhoA、RhoB和RhoC的天冬氨酸残基。C3使Rho失活，因为ADP-核糖基化防止Rho的活化。区分BA-05和BA-07的新的修饰包括C-端转运肽，其允许有效地进入细胞质，产生更为有效的Rho拮抗剂。BA-05和BA-07在非酶学区域的沉默突变中有所不同。BA-07允许在用于纯化作为治疗药物的蛋白的商业规模载体中表达。本发明的一个方面，可以将融合蛋白如BA-07视为可透过细胞的蛋白-蛋白相互作用的破坏剂，其中蛋白-蛋白相互作用在信号转导中具有重要作用。
本发明提供作为抗肿瘤和抗转移组合物的BA-05和BA-07变异体，还提供利用这些组合物治疗癌症和其他恶性疾病的方法和装置，其中所述的BA-05和BA-07变异体为例如含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物，其中多肽性细胞膜转运部分的氨基酸序列可以被改变或缩短或加长或截短以包含BA-05的变异体，肉毒梭菌C3外转移酶单位为其氨基酸序列被改变、加长、缩短、或截短的变异体形式。
在本发明的一个方面，提供改变BA-07DNA序列在质粒中表达的组合物和方法，来增强纯化大量BA-07的能力，将其配制于可安全地用于治疗目的的可药用的载体中。
BA-05和BA-07是根据本发明的融合蛋白。
保留富含脯氨酸的转运序列和足够的C3转移酶单位的BA-05包括于本发明中，所述C3转移酶单位用于保留将Rho ADP核糖基化的酶活性。
依照本发明，提供了包含治疗学活性试剂的偶联物或融合蛋白，该活性试剂可以跨细胞壁膜运输，所述偶联物或融合蛋白除活性试剂部分外还包含转运亚结构域或部分。更具体地，依照本发明，以偶联物或融合蛋白形式提供的治疗学活性试剂含有多肽性细胞膜转运部分和作为治疗学活性单位的肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物，其中所述治疗学活性试剂能够抑制肿瘤细胞迁移、促进肿瘤细胞凋亡、抑制血管发生、以及抑制与肿瘤生长相关的金属蛋白酶生产。
本发明的组合物和方法的优势在于提供了相对于之前设计用于抑制肿瘤扩散或转移的药物的明显改进，因为本发明单一的化合物可以以采用治疗的方式起作用而抑制肿瘤生长和扩散的几个非常不同的方面。本发明的组合物例如包含BA-07的组合物的优势在于能够防止或阻滞或抑制：肿瘤细胞迁移、肿瘤细胞增殖、肿瘤部位的血管发生、和活性金属蛋白酶的分泌。本发明的优势在于，药物活性化合物能够穿透癌细胞而无需依赖基于受体的膜转运机制。本发明的优势在于，药物活性化合物能够灭活Rho GTP酶家族成员。本发明的优势在于，药物活性化合物为Rho拮抗剂。
本发明公开了防止或抑制哺乳动物中癌症的转移性肿瘤细胞不受控制的增殖和扩散或迁移方法，包括对哺乳动物施用治疗有效量的药物组合物，其包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物。
本发明公开了防止或抑制残留于切除边缘的转移性肿瘤细胞在靠近哺乳动物中癌症的肿瘤切除部位的宿主组织切除边缘内不受控制的增殖和扩散或迁移的方法，包括施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物，所述施用为直接施用于切除边缘的表面上或者施用于切除边缘的表面下，或者施用至靠近仍残留在哺乳动物体内的切除边缘的组织中，所述施用在切除或去除肿瘤之前或之后、或之前和之后的时间间隔中进行。
本发明公开了防止来自哺乳动物宿主组织中恶性细胞的肿瘤的生长的方法，包括为所述哺乳动物施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物，其中所述融合蛋白同时防止或抑制以下情况中的至少两种：恶性细胞迁移、恶性细胞增殖、靠近恶性细胞的血管发生或管状结构形成或毛细血管网生长，和从恶性细胞分泌活性金属蛋白酶。
本发明公开了防止包含癌症残留肿瘤细胞的第二肿瘤在靠近哺乳动物中癌症的第一肿瘤切除或去除部位的宿主组织切除边缘内生长的方法，该方法包括施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物，所述施用为直接施用在切除边缘的表面上或者施用在切除边缘的表面下，或者施用至靠近仍残留在哺乳动物体内的切除边缘的组织中，所述施用在切除或去除第一肿瘤之前或之后、或之前和之后的时间间隔中进行，其中所述融合蛋白同时防止或抑制以下情况中的至少两种：残留肿瘤细胞迁移、残留肿瘤细胞增殖、靠近残留肿瘤细胞的血管发生或管状结构形成或毛细血管网生长，和从残留肿瘤细胞分泌活性金属蛋白酶。
一个方面，本发明包含抑制身体组织癌症转移至哺乳动物CNS(中枢神经系统)的方法，包括给哺乳动物施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物，例如融合蛋白BA-07。
一个方面，包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物，例如融合蛋白BA-07的治疗有效量的药物组合物能够显示抗血管发生活性，并可用于癌症的治疗。
依照本发明，用于本发明的融合蛋白的活性试剂区域包含ADP-核糖转移酶C3区域，或其功能等价物。依照本发明，优选的ADP-核糖转移酶C3可以选自衍生于肉毒梭菌的ADP-核糖转移酶和重组核糖转移酶所组成的组。
可选地，C3可以衍生自其他来源如泥渣梭菌(C.limoseum)或金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus)。从这些细菌纯化的C3具有与来自肉毒梭菌的C3相同的酶活性，能够有效地将Rho ADP核糖基化并使Rho失活。
本发明的一个方面，多肽性细胞膜转运部分可以包含富含脯氨酸的转运结构域。富含脯氨酸的转运部分或结构域的例子可以参见美国专利申请10/118,079，此外将其全部内容整体合并作为参考。此处所用术语“富含脯氨酸的区域”指在包含肽或蛋白质的分子内通过肽酰胺键连接到一起的任何10个氨基酸的线性序列，其中线性序列中，10个氨基酸中至少3个为脯氨酸残基，其中每个脯氨酸共价连接于肽酰胺键的氮上和另一个肽酰胺键的羧基(羰基)位置。
肽内任何10氨基酸序列的富含脯氨酸区域可以包含两个或更多个脯氨酸残基和8个或更少的非脯氨酸的氨基酸。
例如，一个方面，在包含10个或更多个氨基酸的肽内，包含10氨基酸序列的肽中的富含脯氨酸区域可以包含在10个氨基酸中以任何组合分布的2个脯氨酸残基和8个非脯氨酸的氨基酸残基。
另一方面，在包含10个或更多个氨基酸的肽内，包含10氨基酸序列的肽中富含脯氨酸的区域可以包含在10个氨基酸中以任何组合分布的3个脯氨酸残基和7个非脯氨酸的氨基酸残基。
另一方面，在包含10个或更多个氨基酸的肽内，包含10氨基酸序列的肽中富含脯氨酸的区域可以包含在10个氨基酸中以任何组合分布的4个脯氨酸残基和6个非脯氨酸的氨基酸残基。
另一方面，在包含10个或更多个氨基酸的肽内，包含10氨基酸序列的肽中富含脯氨酸的区域可以包含在10个氨基酸中以任何组合分布的5个脯氨酸残基和5个非脯氨酸的氨基酸残基。
另一方面，在包含10个或更多个氨基酸的肽内，包含10氨基酸序列的肽中富含脯氨酸的区域可以包含在10个氨基酸中以任何组合分布的6个脯氨酸残基和4个非脯氨酸的氨基酸残基。
另一方面，在包含10个或更多个氨基酸的肽内，包含10氨基酸序列的肽中富含脯氨酸的区域可以包含在10个氨基酸中以任何组合分布的7个脯氨酸残基和3个非脯氨酸的氨基酸残基。
另一方面，在包含10个或更多个氨基酸的肽内，包含10氨基酸序列的肽中富含脯氨酸的区域可以包含在10个氨基酸中以任何组合分布的8个脯氨酸残基和2个非脯氨酸的氨基酸残基。
另一方面，在包含10个或更多个氨基酸的肽内，包含10氨基酸序列的肽中富含脯氨酸的区域可以包含在10个氨基酸中以任何组合分布的9个脯氨酸残基和1个非脯氨酸的氨基酸残基。
另一方面，在包含10个或更多个氨基酸的肽内，包含10氨基酸序列的肽中富含脯氨酸的区域可以包含10个脯氨酸残基。
另一方面，“富含脯氨酸的区域”指比一般在天然存在的蛋白质中观察到的包含更多脯氨酸的蛋白质的氨基酸序列区域(例如，由人基因组编码的蛋白)。
本发明的组合物中肽的“富含脯氨酸的区域”能够发挥功能以增强本发明的融合蛋白通过细胞膜的转运率。
肽或蛋白的非富含脯氨酸的区域可以包含由肽键共价连接的10个氨基酸的序列，此区域含有0或一个脯氨酸残基。
本发明组合物的细胞膜转运增强肽可以包含一个或多于一个的富含脯氨酸区域，其中每个区域可以具有相同或不同的氨基酸序列，其中每个区域通过肽键共价连接在一起，其中包含一个或多个非富含脯氨酸的氨基酸序列，当非富含脯氨酸的氨基酸序列包含多于10个的氨基酸时这些序列可以是每一个都相同的或不同的。
本发明的另一方面，适合用于包含本发明的融合蛋白的组合物和方法的多肽性细胞膜转运部分可以通过例如Rojas(1998)16：370-375中公开的涉及膜转位序列的方法；Vives(1997)272：16010-16017中公开的涉及蛋白运输的方法；Wender等，2000，PNAS 24：13003-13008中公开的涉及多精氨酸序列的方法；Derossi(1996)271：18188-18193中公开的涉及触角足基因(Antennapedia)的方法；加拿大专利文献2,301,157中公开的涉及包含触角足基因同源异型结构域(homeodomain)的偶联物的方法；以及美国专利5,652,122，5,670,617，5,674,980，5,747,641，和5,804604中公开的涉及包含Tat HIV蛋白(此处，Tat HIV蛋白有时候称为Tat)的氨基酸的偶联物的方法制备，这些方法经过改进适合用于本发明，其中每个文献中公开的全部内容此处整体合并作为参考。
几种受体介导的转运策略已用于尝试改善ADP核糖酶的功能。这些策略或方法包括融合C2和C3序列(Wilde，等(2001)276：9537-9542)并使用采用白喉毒素受体(Aullo，等(1993)12：921-31)的受体介导的转运。这些策略没有导致C3活性的效力急剧增加，不同于所发现的BA-05的活性。另外，那些策略需要受体介导的转运。这要求靶细胞必须表达特定的受体，必须表达足够数量的那种受体以显著提高转运率。在白喉毒素的例子中，并非所有细胞都表达适当的受体，因而限制了其潜在的用途。与这些策略相比，本发明包含多肽性转运部分的组合物例如BA-05能够通过不依赖于受体的机制跨过胞浆膜。
本发明的一个方面，优选的组合物包含可透过细胞的融合蛋白偶联物，所述融合蛋白偶联物含有富含脯氨酸的多肽性细胞膜转运部分，在融合蛋白偶联物中，多肽性细胞膜转运部分含有加至肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物之C端区域的富含脯氨酸的氨基酸序列。具体优选的组合物为称为BA-05的融合蛋白。此处，有时候将包含加至肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物之N端的富含脯氨酸的氨基酸序列的融合蛋白组合物称为BA-05的类似物。
本发明的另一方面，优选的组合物包含可透过细胞的融合蛋白偶联物，所述融合蛋白偶联物含有富含脯氨酸的多肽性细胞膜转运部分，在融合蛋白偶联物中，多肽性细胞膜转运部分含有加至肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物N端区域的富含脯氨酸的氨基酸序列。此处，有时候将包含加至肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物之N端区域的富含脯氨酸的氨基酸序列的融合蛋白组合物称为BA-05的变异体。
本发明的BA-05类似物和BA-07变异体各包含多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物。肉毒梭菌C3外转移酶单位的功能类似物可以包括多肽例如BA-05的生物活性片段和氨基酸序列改变的类似物，其中BA-05的这种片段和氨基酸序列改变的类似物的生物学活性源于本质上与BA-05的生物学活性类似的作用机制。这样的片段包含或含有相对于BA-05中的序列截短了一个或多个氨基酸的氨基酸序列。这样的片段包含或含有相对于BA-05中的氨基酸序列截短(或删除)了一个或多个氨基酸的氨基酸序列，其中截短可以从蛋白序列的氨基端或N端、羧基端或C端、或其内部发生。本发明的BA-05类似物和变异体可包含一个或多个氨基酸的插入或取代。含有用于本发明的片段、类似物和变异体的本发明的组合物具有BA-05的生物学特性，能够灭活Rho GTP酶，优选能够灭活多于一种的Rho GTP酶。
另一方面，本发明的组合物和方法包含含有BA-05氨基酸序列或截短序列的嵌合多肽，融合至并含有异源氨基酸序列。这样的异源序列包括那些当其与BA-05形成嵌合体时保留BA-05的一种或多种生物学或免疫学特性的异源序列，最优选所述保留的特性是能够灭活Rho GTP酶的特性，更加优选能够灭活多于一种Rho GTP酶的特性。
在另一实施方案中，本发明包含用编码BA-05蛋白或BA-07嵌合蛋白的核酸转化或转染的宿主细胞。一个方面，可以使用生产蛋白的任何宿主细胞，所述蛋白包含显示至少一种BA-05的生物学特性的多肽，最优选能够灭活Rho GTP酶的特性，更加优选能够灭活多于一种Rho GTP酶的特性。宿主细胞类型的代表性例子包括细菌、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞。另外，可以在转基因动物中生产BA-05蛋白或BA-05嵌合蛋白。可以使用分子与细胞生物学领域普通技术人员可依常规途径利用的材料和方法获得的转化的或转染的宿主细胞和转基因动物。宿主细胞可以包含含有编码BA-05蛋白的全长基因的核酸序列，其也可以包含前导序列和C端膜锚定序列。可选地，宿主细胞可以包含缺少一个前导序列的或同时缺少两个前导序列的或缺少C端膜锚定序列或缺少这些序列的组合的核酸序列。另外，编码多肽片段、多肽变异体、或多肽类似物的核酸序列都能够保持BA-05的生物学活性，也可以居留在这样的宿主表达系统中。
作为重组蛋白的Rho拮抗剂可以按照本领域已知的重组蛋白技术制备。本发明的蛋白可以从细菌细胞提取物制备，或者使用重组技术制备。依据本发明的BA-05和相关的融合蛋白可以通过转化(例如，通过转染、通过转导、通过感染)宿主细胞来生产，所述宿主细胞含有位于适合的表达媒介或载体中的全部或部分BA-05编码片段。适合的表达媒介包括：质粒、病毒颗粒、和噬菌体。对于昆虫细胞，杆状病毒(baculovirus)表达载体是合适的。完整的表达媒介或载体或其部分可以通过本领域已知的方法整合至宿主细胞基因组中。一个方面，使用可诱导的表达载体是优选的。
分子生物学领域的熟练技术人员将会理解，各种不同的表达系统中的任何一种都可用于提供重组蛋白。所用的具体宿主细胞对于本发明来讲一般不是至关重要的。例如，本发明的BA-05融合蛋白和包含BA-05的功能类似物和变异体和片段的融合蛋白可以在原核宿主(例如，E.coli或枯草牙孢杆菌(B.subtilis))或在真核宿主(例如，酵母或毕赤酵母；哺乳动物细胞，例如本领域称为COS、NIH 3T3、CHO、BHK、293、或HeLa细胞的细胞；或昆虫细胞)中生产。
为了测定本发明组合物的相对有效的Rho拮抗剂活性，可以使用组织培养物生物试验系统。约0.01至约10ug/ml浓度范围的BA-05是可用的，对细胞无毒性。
BA-05在37℃至少24小时是稳定的。用下述的试验在组织培养物中测试BA-05的稳定性。在组织培养基中稀释BA-05，37℃放置在保温器中24小时，然后加至此处所述的生物试验系统，视网膜神经节细胞用作测试细胞类型。当用37℃存放24小时的C3处理时，这些细胞能够在抑制性底物上伸出神经突。得到了24小时的最小稳定性。
另一种确定化合物是Rho拮抗剂的方法可以利用放射活性试验来检测酶活性。
另一种检测活性的方法可以利用荧光试验来检测酶活性。例如，BA-05具有至少两种固有的酶活性，糖苷水解酶(glycohydrolase)和ADP-核糖转移酶。这些酶活性能够以连续的方式起作用，通过用鸟苷解离抑制剂-1(GDI-1)捕获复合体中的ADP核糖基化Rho使GTP结合蛋白单-ADP-核糖基化并失活。在反应的第一个步骤，糖苷水解酶活性水解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)分子中烟碱和腺苷二磷酸核糖(ADP-核糖)之间的N-糖苷键。第二个步骤，通过ADP-核糖转移酶催化，导致ADP-核糖-RhoA的形成。ADP-核糖形成以后，酶试验可以测定本发明的融合蛋白例如BA-05和BA-07的糖苷水解酶活性。
一个方面，本发明包含用于抑制恶性转化和转移的药物组合物，所述药物组合物包含可药用的稀释剂或载体和治疗有效量的本发明的组合物，优选本发明的融合蛋白。
在一个实施方案中，本发明组合物可以包含选自此处所述的药物递送构建体、此处所述的药物偶联物、此处所述的融合蛋白(例如包括其可药用的化学等同物)所组成的组的或活性成分。
本发明的BA-05和其他组合物的制剂
本发明的组合物和方法可以包含可药用的载体和治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物。一个方面，多种的多聚体载体可用于本发明的制剂中。多聚体载体的代表性例子包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物(PVA)和作为乙烯-醋酸乙烯酯-乙烯醇共聚物的部分水解的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物，其中任何一种可以是任选达到约40％交联的；聚-D，L-乳酸，包括其低分子量的寡聚体和高分子量的多聚体；聚-L-乳酸，包括其低分子量的寡聚体和高分子量的多聚体；聚乙醇酸；乳酸与乙醇酸的共聚物；聚己内酯、聚戊内酯、聚酸酐、聚己内酯与聚乙二醇的共聚物、聚乳酸与聚乙二醇的共聚物、聚乙二醇；及其组合物和混合物。共聚物可以包含以重量计约1％至约99％的单体单位。第一多聚体和第二多聚体的混合物可以包含以重量计约1％至约99％的第一多聚体和约99％至约1％的第二多聚体。
BA-05抑制肿瘤扩散的应用
本发明的组合物，例如抗肿瘤和抗转移组合物，可以以多种形式配制。例如，在一个实施方案中，包含治疗有效量的可透过细胞的融合蛋白偶联物的药物组合物可以包含微球(microsphere)，该融合蛋白偶联物含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物，其中所述融合蛋白与包含可药用的多聚体载体的基质混合，或者包含于该基质中，可选地存在水(在一个实施方案中从约0.1％至约15％；可选地，在另一实施方案中，所述微球悬浮于水性介质中)、可药用的缓冲盐、可药用的表面活性剂、可药用的碳水化合物、可药用的湿润剂等类似物质。
在另一实施方案中，包含治疗有效量的可透过细胞的融合蛋白偶联物的药物组合物可以包含糊、乳膏、药膏、栓剂、可药用的油中的悬浮液及类似制剂形式，该融合蛋白偶联物含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物。
在另一实施方案中，包含治疗有效量的可透过细胞的融合蛋白偶联物的药物组合物可以包含薄膜，该融合蛋白偶联物含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物，例如其中所述融合蛋白与可药用的载体例如水明胶或水性蛋白或多聚体载体或其组合物掺合(blend)或混合，任选存在可交联载体的交联试剂种类，然后在任选存在薄膜基料或支持物或基质的情况下，将混和物涂覆(coating)于薄膜中或者碾压，任选通过加热或冻干法干燥或脱水。可以以单位剂量形式制备薄膜，或者以大量形式制备并分离切割成单位剂量的形式。
在另一实施方案中，包含治疗有效量的可透过细胞的融合蛋白偶联物的药物组合物可以包含气雾剂或可喷射的或可气雾剂化的组合物，所述融合蛋白偶联物含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物，其中气雾剂或可喷射的或可气雾剂化的组合物为溶于可药用的液体如缓冲液的水溶液中的融合蛋白悬浮液或溶液，其中可选地含有张力修饰剂；溶于可药用的液体如超临界或液化气体例如二氧化碳或丙烷或低分子量氟碳化合物或代氟碳氢化合物(fluorohydrocarbon)或溴氟碳化合物或氯氟碳化合物及类似气体中，其中每一种在37℃和常压状态下均为气体，所述组合物适合用于例如吸入或作为气雾剂如组织表面喷雾用途。
另一方面，本发明组合物可以配制为含有融合蛋白如BA-05和额外的抗肿瘤和抗转移因子或试剂的组合物。
另一方面，本发明组合物可以配制为含有多种额外的化合物的组合物，以使所配制的融合蛋白制剂具有特定的物理特性(例如，与加入可药用的可塑化试剂相关的弹性，例如通过使用聚乙二醇而获得的特定熔点例如30℃，或者特定的释放率，其可能与交联程度或在基质中的水合率有关，或者与基质的溶解有关，或者与基质中一种成分的优先溶解有关，该成分的优先溶解在基质中留下小孔，液态载体如水可以穿过小孔以协助融合蛋白转运到基质外，到达哺乳动物体内所需的部位中(上))。
在本发明的某些实施方案中，可以将组合物联用以获得所需的效果(例如，可以将两种或多种本发明的组合物微球联用以获得本发明融合蛋白经改进的净释放率，例如一种或多种抗肿瘤和抗转移因子的释放既被加快又被减慢或延长)。
本发明的组合物例如那些包含BA-05的组合物可以单独施用或者与药物上可接受的载体，和/或药物上及生理学上容许的赋形剂、稀释剂、张力改变剂、缓冲液、及类似物质组合施用。优选地，当与所述剂量组合并以所用融合蛋白的治疗学上有效浓度使用时，这些载体对受药者来说是可接受的，无毒的。
一个方面，本发明药物组合物的制备包括将治疗有效量的本发明的融合蛋白与一种或多种载体成分例如水；可药用的缓冲盐或缓冲溶液；可药用的抗氧化剂如抗坏血酸；一种或多种低分子量的可药用的多肽(例如，包含约2至约10个氨基酸残基的肽)；一种或多种可药用的蛋白；一种或多种可药用的氨基酸例如人体必须的氨基酸；一种或多种可药用的碳水化合物或碳水化合物衍生物质例如葡萄糖、蔗糖、山梨醇、海藻糖、甘露醇、麦芽糊精、糊精、环状糊精及其组合，一个方面，当需要避免Maillard反应(其在例如还原性糖和氨基酸或肽或蛋白一起反应时发生)时，这样的碳水化合物优选包含非还原性碳水化合物如非还原性糖，或者另一方面，当需要Maillard反应时，这样的碳水化合物优选包含还原性碳水化合物例如还原性糖；可药用的螯合剂如EDTA，DTPA，其为金属离子如二价金属离子(例如，Ca+2，Fe+2及类似离子)的螯合剂或三价金属离子(例如，Fe+3，Y+3，Ln+3，Eu+3和其他稀土元素及类似离子，其可以任选包含放射性核素(radionuclide))；谷胱甘肽；及蛋白材料配制领域已知的其它稳定剂和赋形剂组合。优选的载体包含无菌缓冲盐溶液，pH在约6至8范围内，优选pH为约7.4，以及包含与可药用的非特异性血清白蛋白混合的盐溶液的无菌等渗组合物。
本发明的药物组合物可以是无菌的，可灭菌的以及已灭菌的。优选的灭菌方法包括在无菌环境中将药物组合物通过0.2微米过滤器过滤。可以将无菌的过滤过的组合物以单位剂量的量或以完整的多单位剂量的量(例如，以2个单位剂量的量、以3个单位剂量的量、以4个单位剂量的量等等)填充到瓶子中，优选填充到无菌的瓶子中，优选在惰性空气如无菌的氮或氩中进行，用可药用的塞子密封瓶子，任选使用螺丝盖。另一方面，在瓶子密封和加盖前，通过去除水使药物组合物干燥，例如通过干燥过程如冻干或蒸发从每个瓶子中去除水介质，留下包含本发明的融合蛋白的干燥或脱水基质。另一方面，所述载体可以包含无菌的或可灭菌的可药用的基质形成材料或赋形剂的高渗溶液，所述基质形成材料或赋形剂与所述的融合蛋白相容，例如可药用的非还原性碳水化合物，所述载体与本发明的化合物或融合蛋白一起，其中高渗溶液可以置于瓶子中并干燥(例如通过冻干)，以获得包含融合蛋白和成基质赋形剂的基质，可以用盖子将其密封在瓶子中。使用前，可以向瓶子例如瓶状无菌注射器或套管中加入无菌水，其中水将把基质溶解以得到融合蛋白的溶液或悬浮液。可以加入足够的水以获得适合于注射或灌输用途的等渗溶液形式的重建溶液或悬浮液。
可以将本发明的药物组合物制备为适于以多种不同途径施用于哺乳动物，如需要治疗的病人的药物组合物。优选的施用途径包括例如关节内、眼内、鼻内、神经内、皮内、骨内、舌下、口服、局部、膀胱内、鞘内、静脉内、腹膜内、颅内、肌肉内、皮下、吸入或雾化吸入，或者直接施用于肿瘤内或疾病部位或肿瘤切除后残留的边缘上或内。其他的代表性施用途径包括肠镜检，其任选与胃镜检方法及结肠镜检一起，其中每一种都可以是门诊方法，而不需要完全的手术室方法和冗长的住院治疗，但可能需要有医护人员在场。
此处提供的药物组合物可以同包装材料一起置于容器中，包装材料提供有关使用这些材料的说明。通常，这样的说明将包括活性试剂含量的描述，以及在某些实施方案中赋形剂成分或稀释剂(例如，水、盐溶液或PBS)的相对量或成分(identities)。另外，也可能需要通过加入水以及任选同时摇动或超声震动而将抗肿瘤和抗转移组合物、或药物组合物重建为可药用的溶液或悬浮液。
本发明的药物组合物可以用于很多种手术方法中。例如，本发明的一个方面中，可以在手术去除肿瘤例如第一肿瘤之前、期间或之后，药物组合物(例如，溶液或悬浮液形式的，或适合于以雾化或气雾剂或喷雾剂形式应用的粉末形式，或者包被于膜中的形式)通过喷雾(可喷射的或成气雾剂形式)或碾压(clamination)(成膜)用于需要治疗的病人的组织区域的表面上，任选所述组织区域中有许多正常组织紧靠所述肿瘤，在该组织区域中，肿瘤的去除在肿瘤切除部位(肿瘤边缘)周围留下正常组织的边缘。一方面，该方法可以在去除病人的第一肿瘤后防止或足以阻滞或抑制第二肿瘤在周围的正常组织中转移性生长。另一方面，该方法可以防止疾病(例如，癌症)向周围组织扩散。本发明的其他方面，可以通过窥镜方法递送本发明的药物组合物(例如，喷雾剂或气雾剂形式的)，其中将所述组合物喷射或雾状分散到病人体内，在病人体内的肿瘤周围或附近的肿瘤和/或组织上形成包含本发明的融合蛋白的覆层，通过窥镜手段可接近或看到所述肿瘤。另一方面，靠近肿瘤或靠近肿瘤切除部位的组织上的药物组合物覆层能够抑制由药物组合物所涂覆的组织区域中的血管发生。
本发明的其他方面，可以将本发明的药物组合物涂覆于可植入装置如手术筛网、金属丝、支架、假肢器官装置(prosthetic device)等类似装置的表面上，形成被涂覆的装置，所述覆层包含本发明的融合蛋白并任选包含多聚体载体，可以作为手术治疗如手术去除癌性肿瘤或良性肿瘤的一部分，将所述被涂覆的装置植入到病人的组织或器官中，所述药物组合物能够防止或抑制或延缓或阻滞靠近所述装置位置的第二肿瘤的生长，另一方面，也能够防止或抑制或延缓或阻滞远离所述植入装置部位的组织或器官中第二肿瘤的生长。所述融合蛋白的含量以重量计可以为在所述装置上形成覆层的载体的0.01％至约20％，覆层的厚度可以为约20微米至约1毫米。可以通过涂覆装置领域已知的涂覆手段使用所述覆层。例如，可以以喷雾剂或气雾剂施药器具的方式将包含本发明的药物组合物的覆层涂覆于装置的表面，在施药器具中，药物组合物以包含溶剂的液体或流体中的溶液形式存在，或者以液体或流体中的悬浮液的形式存在，在以喷雾剂或气雾剂形式喷射或雾状分散至装置表面上期间或之后，所述液体或流体能够蒸发掉。任选地，所涂覆的组合物可以包含反应性化学功能基团如烯烃基或酸酐基或活性酯或Michael反应接受者如偶联至羰基的碳-碳双键，该双键能够与蛋白质或肽或凝胶如载体蛋白中的胺反应，反应性化学功能基团能够在载体中以化学或光化学方式形成交联，所述交联能够在植入所述装置的组织中防止溶解或限制或改变或控制水性流体所引起的涂覆载体的膨胀(为反应性功能基团含量的函数或被涂覆的装置暴露于交联条件如紫外线或γ射线下的时间的函数)。膨胀的控制可用于控制本发明的融合蛋白从所述装置迁移至靠近该装置的组织中并进一步迁移至病人体内的速率。本领域已知的很多种交联化学品均可用于本发明的该方面，只要融合蛋白的生物学活性不被排除或消除。如果将有机溶剂或超临界流体或液化气用于所述的涂覆过程，那么可以选择不会立即溶解于靠近植入部位的组织中所存在的水介质中，但允许融合蛋白渗入水介质中的可药用的载体。
可以使用其他的涂覆方法例如组合物的浸渍涂覆、本发明药物组合物的漆涂、幕式淋涂(curtain coating)以及碾压。
在一个实施方案中，装置的表面可以首先用第一覆层或首层(primerlayer)涂覆，然后将本发明的药物组合物作为第二覆层涂覆第一覆层或首层。可以选择粘附于金属或多聚体装置表面，并粘附于第二覆层的载体上的首层。所述首层也可以包含固定的化学功能基团(例如，可以在附着于首层中的多聚体的基团)，其可以与第二层形成交联键。任选首层可以包含含有例如两个或多个反应性功能基团的相对移动性分子，这些分子能够迁移到第二层中，与其中的化学功能基团反应形成交联分子桥。
在另一实施方案中，可药用的第三层可以涂覆在第二层上，任选第三层不含融合蛋白。第三层可以控制或改变装置中融合蛋白的释放速率，例如可溶解或膨胀或增加水或融合蛋白的渗透性，作为包含本发明的药物组合物的第二层暴露于组织中的含水介质的时间的函数。
在本发明的一个实施方案中，可以在例如对患者实施腹部癌症切除手术操作过程中(例如，在结肠切除之后)使用包含涂覆于金属丝或多聚体筛网表面的本发明的药物组合物的手术筛网装置，或将其植入到患者体内，为残留的组织结构提供支撑。所述涂覆的筛网装置能够释放足够的治疗有效量的药物组合物的活性成分(例如BA-07)，通过防止靠近涂覆装置植入部位的第二肿瘤的生长来防止癌症的复发。所述融合蛋白能够以足够的速率从装置迁移，在靠近所述装置的组织中提供治疗有效量的浓度范围。
目前优选的浓度范围每立方厘米(cc)组织约0.0001微克融合蛋白至每立方厘米组织约100微克是可用的。目前更优选的治疗学上有效浓度范围为每cc约0.001微克至每cc组织约50微克。
在另一实施方案中，涂覆的筛网装置可以释放足够的治疗有效量的所述药物组合物的活性成分(例如BA-07)，通过防止远离涂覆的装置的植入部位的第二肿瘤的生长来防止癌症的复发。
在本发明的更多方面，提供了处理患者第一肿瘤切除边缘(肿瘤切除部位)处遗留的残留组织的方法，包括在切除第一肿瘤之后向癌症第一肿瘤切除边缘的残留组织施用本发明的药物组合物，使第一肿瘤边缘残留组织部位的第二癌症肿瘤复发和新血管形成得到抑制。在本发明的一个实施方案中，本发明的药物组合物例如包含BA-07的药物组合物直接施用至肿瘤切除部位的残留组织(例如，通过擦洗、刷、涂布、喷雾、气雾剂化(aerosolization)、注射、灌洗、浸泡敷用，或用所述药物组合物涂覆肿瘤切除边缘)。可选地，可以将手术用糊、药膏、乳膏、悬浮液、凝胶等类似形式的本发明的药物组合物例如包含BA-07的药物组合物敷用于组织的表面。
在本发明的优先实施方案中，将包含融合蛋白如BA-07的本发明的药物组合物应用于肝脏肿瘤切除部位的残留组织，例如在肝恶性肿瘤切除后。
在本发明的另一优选实施方案中，在神经手术操作(例如涉及脑肿瘤的去除)后应用包含融合蛋白如BA-07的本发明的药物组合物。
本发明的一个方面，可以将包含融合蛋白例如BA-07的本发明的药物组合物施用于很多种肿瘤的肿瘤切除边缘残留组织，包括例如，乳腺、结肠、脑和肝肿瘤。例如，在本发明的一个实施方案中，可以在切除第一肿瘤之后将包含融合蛋白例如BA-05的本发明的药物组合物施用于靠近神经学癌症的第一肿瘤切除部位的残留组织，以使癌症细胞向残留组织中的扩散以及第一肿瘤残留边缘部位的组织中第二肿瘤的形成和新血管的形成被抑制。
脑是高度功能性局部化的：例如，每个特定的解剖学区域都专门执行特定的功能。患者脑中癌症(和脑病理学)位置可能比组织类型或肿瘤类型更加重要。脑关键区域中相对小一些的肿瘤或损伤可能远比脑相对不太重要的区域中的较大的损伤更具破坏性。脑表面上的损伤可能相对容易手术切除，而大小相当却位于脑深处的肿瘤可能相对不太容易手术切除，因为接近深层肿瘤可能需要破坏相关的组织，例如通过切入许多重要的结构以到达或接近并去除此深层肿瘤。另外，脑中的良性肿瘤对患者来说也可能是危险的。良性肿瘤可能生长于关键区域并对周围的脑组织和功能产生显著的损害。尽管良性肿瘤可以治愈并手术切除，但从深层组织去除肿瘤是不可能的。如果不再检查，良性肿瘤会生长，增加体积并导致颅内压升高，如果放任这样的症状不予处理，脑中的重要结构可能会受压迫，导致患者死亡。CNS(中枢神经系统)恶性肿瘤的发病率为每100,000人约8至16个病例。脑原发性恶性肿瘤的预后是不容乐观的，平均存活率不超过一年，即便是在手术切除之后。脑肿瘤尤其是神经胶质瘤是主要的局部性疾病，手术去除后，可能会在原始病灶约2厘米范围内复发。
可以利用此处所述的组合物和方法治疗的脑肿瘤的代表性例子包括神经胶质肿瘤例如间变型星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、毛发细胞型星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、粘液性乳头状室管膜瘤、亚室管膜瘤、脉络膜丛乳头状瘤；神经肿瘤例如神经母细胞瘤、神经节神经母细胞瘤、神经节瘤、和髓母细胞瘤；松果体肿瘤例如松果体母细胞瘤和松果体细胞瘤；脑膜肿瘤例如脑膜瘤、脑膜血管外皮细胞瘤、脑膜肉瘤；神经鞘细胞肿瘤例如雪旺氏瘤(神经鞘瘤)和神经纤维瘤；淋巴瘤例如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、原发和继发亚型霍奇金淋巴瘤、原发和继发亚型非霍奇金淋巴瘤(并包括众多的这些亚型，同时包括原性和继发的)；畸形肿瘤例如颅咽管瘤、上皮样囊肿、皮样囊肿和胶体囊肿；以及实质上源于任何肿瘤的位于脑中的转移性肿瘤，最常见的源于肺、乳腺、黑素瘤、肾、和胃肠道肿瘤。
在本发明的一个实施方案中，可以以单位剂量的形式局部应用本发明的药物组合物，例如局部地或通过局部应用。这样的施用可以包括将药物组合物应用于表皮的外部，局部施用至口腔中暴露于局部施用的组织，以及局部滴注到眼、耳和鼻中暴露的组织上，使不超过约10％优选不超过1％的单位剂量的本发明的融合蛋白(如BA-07)直接进入病人的血流。
在本发明的另一实施方案中，可以通过例如注射至血管或淋巴管中，如通过静脉内注射而全身性地施用本发明的药物组合物。
其他的施用方式包括经腹腔内、皮下、肌肉内、直肠(例如，作为栓剂剂量形式)、阴道(例如，作为阴道栓剂)施用、以及经口腔递送。本发明的剂量形式可以作为包含本发明融合蛋白的储存库形式起作用，融合蛋白能够迁移至靠近储存库部位的组织中。
用于局部施用的组合物包括，例如，优选适于渗过皮肤的液体或凝胶制品，如乳膏、擦剂(例如，通过摩擦施用至皮肤)、洗液、油、药膏、糊、以及适于递送至例如眼、耳、鼻等器官组织的滴液。
在本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白可以具有约240,000道尔顿至约300,000道尔顿的分子量。
在另一实施方案中，可以将此处所提供的组合物制成厚度在100微米至2毫米之间的薄膜，或者制成在某一温度(例如约25℃以上)为液体和固体或半固体(例如，约25℃以下)的热学活性组合物。
本发明的另一方面，提供处理残存在恶性肿瘤切除部位的残留组织的方法，包括在切除患者的肿瘤之后将包含融合蛋白如BA-05的本发明的药物组合物施用于患者肿瘤的残留切除边缘，以抑制该部位癌症的局部复发和新血管形成。
本发明的另一方面，提供了处理肿瘤切除部位的方法，包括在切除之后将包含BA-05的组合物施用至肿瘤切除边缘，以抑制该部位癌症的局部复发和新血管形成。
本发明的另一方面包含置于试剂盒组件中的本发明的药物组合物，例如包含容器和本发明的药物组合物试剂盒；包含密封的瓶子和本发明的药物组合物试剂盒；包含无菌注射器和本发明的药物组合物的试剂盒；包含含有本发明的药物组合物的无菌注射器的试剂盒；包含喷雾剂或气雾剂施药器具和本发明的药物组合物的试剂盒；包含施药刷和本发明的药物组合物的试剂盒；包含套管和本发明的药物组合物的试剂盒；包含粉末施药器具和本发明的药物组合物的试剂盒(其中粉末施药器具可以通过在局部应用中喷撒干燥的(例如冻干的)粉末将本发明的药物剂量形式作为粉末施用至组织)；包含经涂覆的可植入装置和本发明的药物组合物的试剂盒，其中施用通过植入进行。
提供了药学产品，例如在容器中包含破坏Rho信号的如BA-05的融合蛋白；和装置例如注射器或工具或刷子或施药器具装置(例如第二容器中的喷雾剂或气雾剂施药器具装置)，其用于在手术去除肿瘤后将融合蛋白如BA-05应用于形成肿瘤腔壁的组织，或者例如在去除恶性黑素瘤后将融合蛋白如BA-05应用于皮肤。
根据本发明的药物组合物、方法及其应用将应用于哺乳动物。在一些实施方案中，术语哺乳动物将包括人，而在其他的实施方案中，术语哺乳动物意思是指非人哺乳动物。
参考相关的发明详述和附图，本发明的这些以及其他方面将会是显而易见的。
附图简述
图1例示用氚标记胸苷掺入法测定包含融合蛋白BA-07的组合物对HEC1B人子宫内膜腺癌细胞增殖的影响。媒介(10)为磷酸缓冲盐溶液，以1μg/ml(11)，10μg/ml(12)和50μg/ml(13)的浓度使用BA-07。癌细胞增殖以剂量依赖的方式减少。
图2例示用氚标记胸苷掺入法测定包含融合蛋白BA-07的组合物对SK-MEL-1人黑素瘤细胞增殖的影响。媒介为磷酸缓冲盐溶液，以1μg/ml，10μg/ml和50μg/ml的浓度使用BA-07。癌细胞增殖以剂量依赖的方式减少。
图3A例示由培养于MatrigelTM基质中的HUVEC内皮细胞形成管状物。该试验是针对血管发生的细胞培养试验。在不含本发明的融合蛋白的对照中可以看到管状物形成，图3A(方框30)。
图3B例示培养于MatrigelTM基质中的HUVEC内皮细胞管状物形成减少。用包含融合蛋白BA-07的本发明的组合物处理培养物具有更少的管状物，表明对血管发生的抑制，如图3B方框31所示。
图4显示通过磺酰罗丹明B(SRB)生长抑制试验测定包含融合蛋白BA-07的本发明的组合物对TK-10人肾脏癌细胞生长的抑制。以1μg/ml，10μg/ml，50μg/ml和100μg/ml的浓度使用融合蛋白BA-07。在所用的所有浓度，癌细胞都得到减少。癌细胞增殖的减少是剂量依赖的。在100μg/ml的融合蛋白浓度，本发明的组合物诱导癌细胞的细胞死亡。
图5显示通过磺酰罗丹明B(SRB)生长抑制试验测定包含融合蛋白BA-07的本发明的组合物对HOP-62非小细胞肺癌细胞生长的抑制。以0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml，100μg/ml的浓度使用融合蛋白BA-07。在所用的所有浓度，癌细胞都得到减少。癌细胞增殖的减少是剂量依赖的。
图6显示通过磺酰罗丹明B(SRB)生长抑制试验测定包含融合蛋白BA-07的本发明的组合物对SF-286CNS癌细胞生长的抑制。以0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml，100μg/ml的浓度使用融合蛋白BA-07。在所用的所有浓度，癌细胞都得到减少。癌细胞增殖的减少是剂量依赖的。
图7显示在施用包含本发明的融合蛋白的药物组合物和可药用的媒介之后，与每毫升10微克的融合蛋白一起保温1小时、2小时、4小时、6小时以及24小时后，活化的RhoA水平的降低。
图8显示包含融合蛋白BA-07的组合物对Caki-1肾脏癌细胞生长的抑制(其中％生长为相对于作为参考的媒介对照)，用SRB试验在0.1，1，10，和100的融合蛋白相对浓度下测定％生长。
发明详述
此处所列出的更为详细地描述涉及本发明的方法、装置或组合物的所有参考文献整体合并作为参考。
制备本发明的融合蛋白如BA-05的方法
BA-05是给予通过将编码C3的cDNA序列连接到致融合性19聚肽而制得的本发明的蛋白质的名称。为了说明制备本发明融合蛋白的方法，可以使用将触角足序列(antennapodia sequence)添加至C3多肽C端的例子。
可以使用引物5’GAA TTC TTT AGG ATT GAT AGC TGT GCC 3’(SEQID NO：1)和5’GGT GGC GAC CAT CCT CCA AAA 3’(SEQ ID NO：2)通过多聚酶链式反应(PCR)用EcoR1位点置换DNA序列3’端的终止密码子。可以用BamH I和Not I限制性位点将PCR产物亚克隆到pSTBlue-1载体(Novagen，city)，然后亚克隆到pGEX-4T载体。该载体可称作pGEX-4T/C3。可以通过PCR从pET-3a载体(Bloch-Gallego(1993)120：485-492；和Derossi(1994)269：10444-10450)制得可用于添加至pGEX-4T/C3中C3 3’端的触角足序列，亚克隆至pSTBlue-1平端(blunt)载体中，然后用限制性位点EcoR I和Sal I克隆至pGEX-4T/C3中，得到pGEX-4T/C3APL。
可以在依据本发明产生最好反应的序列上进行DNA序列分析。
pGEX-4T/C3APL克隆(Seq ID NO：3)目前是优选的序列，其提供的蛋白是本发明优选的组合物。
C3样融合蛋白的例子以pGEX-4T/C3APLT(Seq ID NO：4)表示。
设计了两个PCR引物以将一个系列的重组构建体(BA-05)转移到pET系统中：上游引物：5′ggatctggttccgcgt catatgtctagagtcgacctg 3′(Seq ID NO：38)下游引物：5′cgcgga tccattagttctccttcttccacttc 3′(SEQ ID NO：39)。
SEQ ID NO：395′端的BamHI位点为 ggatccatta；TGA由TAAT所置换(atta，SEQ ID NO：39中)。
用于使用Pfu聚合酶扩增所述产物的程序包括：95℃5′1个循环，然后94℃2′→56℃2′→70℃2′10个循环，然后94℃2′→70℃3′30个循环4℃保温。可以使用QIAEXII试剂盒(Qiagen)纯化含有所需DNA条带的琼脂糖凝胶片段。按照生产商的使用说明，用BamHI和NdeI消化插入序列和载体，用琼脂糖凝胶电泳和QIAEXII试剂盒(Qiagen)纯化，按照生产商的使用指导，与T4DNA连接酶一起保温过夜。
用连接混合物转化大肠杆菌(E.coli)(DH5alpha，或优选，XL1-Blue)。可以通过小规模诱导和SDS-GAGE检查克隆，并使用抗C3抗体进行粗制溶菌液的免疫印迹来确定。纯化质粒DNA，并可评估纯度。可以进行DNA测序(例如，使用LiCor技术，该技术中对整条链的克隆全长进行测序)。
以此方式(pET3a-BA-07，SEQ ID NO：7)制备的第一构建体与构建体pGEX/APLT的理论DNA序列相匹配，在5`端稍有变化。
可以按照生产商的使用说明，通过使用BamHI和NdeI(New EnglandBioLabs，Beverly，MA)切割pET3a构建体，从pET3a-BA-07中将插入序列亚克隆到pET9a载体中，由此可以制备第二构建体pET9a-BA-07。可以用同样的酶切pET9a质粒DNA。可以通过琼脂糖凝胶电泳纯化插入的DNA和载体DNA。可以用T4DNA连接酶(New England BioLabs，Beverly，MA)将插入序列连接到新的载体中。连接的DNA可以转化到DH5alpha细胞中，可以用QIAGEN mini和maxi试剂盒制备DNA。可以同时在两个方向通过限制性消化和DNA测序来定性克隆(例如，BioS & T，Lachine，Quebec)。可以将构建体DNA转化到BL21(DE3)细胞和BL21(DE3)/pLysS细胞中。
与BL21(DE3)/pLysS相比，pET9a-BA-07蛋白表达在BL21(DE3)中更好。
本发明的蛋白质可以从细菌细胞提取物制备，或者在适合的表达媒介中，由源于触角足的转运序列用全部或部分融合蛋白编码DNA片段如BA-05编码DNA片段转化、转染、或感染宿主细胞，通过使用这样的重组技术来制备。
分子生物学领域的熟练技术人员将会理解，很多种表达系统中的任何一种都可用于提供本发明的重组蛋白。所使用的具体的宿主细胞通常对本发明并不重要，但是预期一种宿主细胞类型与另一种之间在产量上会有差异。
可以通过利用本领域已知的蛋白质纯化技术例如使用树脂的亲合纯化技术或柱层析纯化融合蛋白，这些技术以例如电荷、大小和疏水性为基础来分离分子。可用的亲合技术包括那些利用特异于所表达的融合蛋白的抗体(例如，GST)的技术。带组氨酸标签的蛋白质可以用含咪唑的缓冲液洗脱。可选地，可以将重组蛋白融合于免疫球蛋白Fc区。这样的融合蛋白可以很容易地用蛋白A柱子纯化。
这些技术中的任何一种都可以通过使用商业上可用的专门用于蛋白质纯化的液相层析设备而实现自动化和最优化，以提供最好的可重复性和高通量。可以想像小分子、肽或上述拮抗剂的其他模拟物也包含于本发明。
包含本发明的融合蛋白如BA-05的药物组合物的生物活性评估
Rho灭活中的变化
可以用细胞培养物试验来证实BA-05和BA-07灭活Rho的能力。此试验中，在所要采用的条件下将癌细胞系在组织培养物上划平板。例如，可以用NG108细胞划平板并使之增殖直至半汇合。NG108是由仙台病毒(Sendai virus)诱导的小鼠神经母细胞瘤克隆N18TG-2与大鼠神经胶质瘤克隆C6BU-1的融合而形成的神经母细胞瘤X神经胶质瘤。然后收获细胞，匀浆化(homogenized)，进行Rho Pull-Down试验。所述Pull-Down试验使用结合于活性Rho的“诱饵”。在我们的试验中，我们可以使用例如来自Rhoteckin的Rho结合结构域(RBD)。也可以使用其他的蛋白质例如Rho激酶。所述的“诱饵”连接到珠子上以使之能够从匀浆物中沉淀出来。RBD结合于匀浆中的GTP-Rho，而不结合于GDP-Rho。以这种方式，可以定量评估细胞培养物中的活性Rho。可以在实施Pull-Down试验前，通过处理细胞系的细胞样品来证实BA-07灭活细胞系中Rho的程度。
Pull-Down试验可用于测定实体瘤中活性Rho的量。在缓冲液中匀浆肿瘤样品，实施Pull-Down试验，可以将GTP Rho的量与非癌组织中所发现的量相比较。检测活性Rho的试验可用作诊断肿瘤的方法，所述肿瘤包含具有高度活化水平的Rho，其能够根据本发明对例如BA-07治疗作出反应。活化Rho的测定可能比简单检测Rho表达水平更为敏感。
原位Pull-Down试验可用于检测组织切片中的GTP-Rho。该试验中，在用4％PFA固定后，将肿瘤样品的冷冻切片(cryosections(每一个的厚度约16μm)与含RBG-GST的细菌溶菌液一起4℃保温过夜。然后在TBS中洗涤所述部分三次，在室温于3％BSA中封闭约1hr，与抗GST抗体(Cellsignalling，New England Biolabs，Mississauga，Canada)一起保温，并与细胞类型特异的抗体以鉴定特定的细胞，在4℃保温过夜。在TBS中洗涤所述切片，室温与FITC，Texas Red或罗丹明(Rhodamine)偶联的第二抗体一起保温2hr以显示免疫反应性(Jackson ImmunoResearch，Mississauga，Canada)。
BA-05的具体DNA和蛋白质序列
对于本发明，称为BA-05的可用融合蛋白具有下述的DNA编码序列，此处采用传统的G， A，T，和C命名法。在本发明的寡核苷酸序列中，符号G ，C，A，和T具有其常见意义。
GGATCCTCTA GAGTCGACCT GCAGGCATGC AATGCTTATT CCATTAATCA  50
AAAGGCTTAT TCAAATACTT ACCAGGAGTT TACTAATATT GATCAAGCAA  100
AAGCTTGGGG TAATGCTCAG TATAAAAAGT ATGGACTAAG CAAATCAGAA  150
AAAGAAGCTA TAGTATCATA TACTAAAAGC GCTAGTGAAA TAAATGGAAA  200
GCTAAGACAA AATAAGGGAG TTATCAATGG ATTTCCTTCA AATTTAATAA  250
AACAAGTTGA ACTTTTAGAT AAATCTTTTA ATAAAATGAA GACCCCTGAA  300
AATATTATGT TATTTAGAGG CGACGACCCT GCTTATTTAG GAACAGAATT  350
TCAAAACACT CTTCTTAATT CAAATGGTAC AATTAATAAA ACGGCTTTTG  400
AAAAGGCTAA AGCTAAGTTT TTAAATAAAG ATAGACTTGA ATATGGATAT  450
ATTAGTACTT CATTAATGAA TGTTTCTCAA TTTGCAGGAA GACCAATTAT  500
TACAAAATTT AAAGTAGCAA AAGGCTCAAA GGCAGGATAT ATTGACCCTA  550
TTAGTGCTTT TGCAGGACAA CTTGAAATGT TGCTTCCTAG ACATAGTACT  600
TATCATATAG ACGATATGAG ATTGTCTTCT GATGGTAAAC AAATAATAAT  650
TACAGCAACA ATGATGGGCA CAGCTATCAA TCCTAAAGAA TTCGTGATGA  700
ATCCCGCAAA CGCGCAAGGC AGACATACAC CCGGTACCAG ACTCTAGAGC  750
TAGAGAAGGA GTTTCACTTC AATCGCTACT TGA                    783
(SEQ ID N0：56)
pGEX-4T BA-05蛋白编码序列
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
 1               5                  10                  15
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
             20                 25                  30
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                 105                 110
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly
225                 230                 235                 240
Arg His Thr Pro Gly Thr Arg Leu
                245             (SEQ ID NO：37)
可用于制备BA-07的引物1：
ggatctggtt ccgcgtcata tgtctagagt cgacctg(SEQ ID NO：38)
可用于制备BA-07的引物2：
Cgcggatcca ttagttctcc ttcttccact tc(SEQ ID NO：39)
pET9a-BA-07DNA编码序列
pET9a-BA-07蛋白质序列
Met Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn Gln
 1               5                  10                  15
Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln Ala
            20                  25                  30
Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys Ser
        35                  40                  45
Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile Asn
    50                  55                  60
Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser Asn
65                  70                  75                  80
Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met Lys
                85                  90                  95
Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr Leu
            100                 105                 110
Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile Asn
        115                 120                 125
Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp Arg
    130                 135                 140
Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln Phe
145                 150                 155                 160
Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser Lys
                165                 170                 175
Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gln Leu Glu Met
            180                 185                 190
Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu Ser
        195                 200                 205
Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr Ala
    210                 215                 220
Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly Arg
225                 230                 235                 240
His Thr Pro Gly Thr Arg Leu
                245        (SEQ ID N0：57)
当氨基酸残基位于肽的内部时，氨基酸残基包含基团-NH-CR1R2-CO-。所述残基由相应的氨基酸NH2-CR1R2-COOH所构成，其中R1和R2为位于氨基酸中央碳原子相对方向(subtended)的取代基以包含其余氨基酸，通过失去H2O与其他氨基酸形成酰胺或肽键，一个位于氮上一个位于羧酸的羰基上。肽N端的氨基酸残基包含基团NH2-CR1R2-CO-，在该基团中，羰基通过肽键与肽中另一氨基酸残基结合。肽的C端氨基酸残基包含-NH-CR1R2-COOH，在该基团中，氮通过肽键与肽中另一氨基酸残基结合。
能够在本发明的肽或蛋白质中存在的氨基酸残基有时候以本领域常用的三字母代码或单字母代码表示，这些代码包括：甘氨酸为Gly或G；丙氨酸为Ala或A；缬氨酸为Val或V；亮氨酸为Leu或L；异亮氨酸为Ile或I；蛋氨酸为Met或M；苯丙氨酸为Phe或F；色氨酸为Trp或W；脯氨酸为Pro或P；丝氨酸为Ser或S；苏氨酸为Thr或T；半胱氨酸为Cys或C；酪氨酸为Tyr或Y；天冬酰胺为Asn或N；谷氨酰胺为Gln或Q；天冬氨酸为Asp或D；谷氨酸为Glu或E；赖氨酸为Lys或K；精氨酸为Arg或R；以及组氨酸为His或H。其他的非必需氨基酸可以采用本领域已知的肽合成法引入，或通过化学修饰如酰化(例如通过赖氨酸的ε酰胺基与包含羰基的活性酯反应得到ε酰胺与羰基之间的键)、烷基化、脲形成、氨基甲酸酯形成等类似方法在肽链上添加含有疏水基团(例如，C-1至C-18烷基和/或芳烷基，其可以是饱和的、不饱和的、或者是包含碳环基如脯氨酸酰胺基)的化学功能基团、和/或正电荷基团如季铵烷基或碱性氨基来引入，其中发现癌症患者中，在一定pH时所添加的正电荷基团能够质子化。
在本发明的肽和蛋白质中，相关的非极性和疏水性氨基酸残基可以包括G， A，V，L，I，M，F，W，和P；相关的极性和亲水性氨基酸残基可以包括S，T，C，Y，N，和Q；阴离子氨基酸和亲水性氨基酸残基可以包括D和E，其中在D和E中，羧酸功能基团都可以以阴离子羧酸盐的去质子化形式存在；阳离子和亲水性氨基酸残基可以包括K，其中碱性ε伯氨基可以以阳离子铵基的质子化形式存在，其中咪唑氮中的H可以为质子化形式，以提供咪唑阳离子基团，R可以包含质子化的酰胺基。
包含本发明的融合蛋白的药物组合物的抗转移特性
一个方面，包含本发明的融合蛋白的药物组合物可以通过例如注射，或通过例如此处所述的涂覆的方法或其他方法局部应用而施用于需要此种治疗的哺乳动物中靠近或包含第一肿瘤的组织，其能够抑制起源于哺乳动物第一肿瘤部位的哺乳动物转移性肿瘤迁移至哺乳动物的健康或正常组织部位，该部位与第一肿瘤所在的组织在功能上相关或与之接近。例如，包含本发明的融合蛋白的药物组合物可以施用于靠近或包含哺乳动物肾脏肿瘤的肾组织，其能够抑制转移性肾肿瘤细胞从肾中的肿瘤转移至第一肿瘤所在的同一肾的健康组织中。
另一方面，包含本发明的融合蛋白的药物组合物可以通过例如注射或通过此处所述的涂覆或其他方法施用于需要此种治疗的哺乳动物中靠近或包含第一肿瘤的组织，其能够抑制起源于哺乳动物第一肿瘤部位的哺乳动物转移性肿瘤迁移至哺乳动物的健康或正常组织部位或器官，该部位与第一肿瘤所在的组织在功能上分离或远离该组织。例如，将包含本发明的融合蛋白的药物组合物施用于脑中包含脑肿瘤的组织，能够抑制转移性脑肿瘤细胞转移至身体任何部分的健康组织例如肝、脾或肺组织中。
另一方面，给需要治疗的患者施用包含本发明的融合蛋白的药物组合物后，恶性肿瘤细胞的转移性迁移得到防止或抑制，能够大幅减少或完全防止继发性肿瘤的形成，且能够防止患者体内恶性癌症的扩散。
对本发明的融合蛋白如BA-07能够降低细胞移动性的证实
包含本发明的融合蛋白(如BA-05)的药物组合物作为抗转移试剂的治疗效果可以通过体外二维细胞侵袭试验手段证明，如定量证明。在这样的一个试验中，可以通过使用所购买的Boyden小室测定对恶性细胞转移性迁移能力的抑制。Boyden小室有两个区室(compartment)，其中上面的和下面的区室被膜所分开。通过将总数目的细胞在上面的区室铺板，计算迁移至下面区室的细胞总数的分数来测定细胞迁移的程度。可以向下面的区室加入生长因子以增强细胞迁移。该模型可用作哺乳动物体内癌细胞迁移的模型。为了测试包含本发明的融合蛋白(例如与哺乳动物血液等渗的无菌磷酸缓冲盐溶液中的BA-07)的药物组合物阻断肿瘤细胞迁移的能力，将包含BA-07的组合物以不同的BA-07浓度加至上面区室中的癌细胞。在融合蛋白组合物的存在下，计数迁移至下面区室中的细胞总数的分数并将其与对照比较，该对照中融合蛋白为0浓度。在对照试验中迁移的癌细胞数模拟没有用本发明组合物治疗的患者癌症中的这种迁移。在存在本发明组合物部分样品的情况下迁移的癌细胞数模拟用本发明组合物部分样品治疗的患者病症中的这种迁移。后者和对照试验细胞迁移数的差异可以用百分数表示，范围可能在100％(例如，转移性细胞的迁移被完全抑制)至约5％，优选100％至约50％，更优选100％至约75％，最优选100％至约90％。当第一对照媒介与可能与第一对照媒介相同的第二媒介比较时，可以观察到0％的量。该百分数的计算方法＝{(对照中的细胞迁移数减去存在融合蛋白时的细胞迁移数)除以(对照中的细胞迁移数)}乘以100％。
作为抗转移试剂的包含本发明融合蛋白的药物组合物的治疗效果至少可以定性证实，一个方面，用体外三维细胞侵袭试验手段来证实。在这样的一个试验中，可以通过用载体媒介中包含本发明融合蛋白的本发明的可药用的制剂处理细胞后，恶性细胞迁移通过MATRIGELTM基质相对于用作为参考对照的载体媒介治疗后恶性细胞迁移通过MATRIGELTM基质的相对能力的变化来测定对恶性细胞转移性迁移能力的抑制，所述载体媒介不包含融合蛋白。一个方面，本发明的融合蛋白能够抑制组织基质模型中转移性肿瘤细胞的迁移，从而在一定时期内产生细胞迁移率降低或细胞迁移距离减小的抑制性变化。
恶性细胞通过模型基质的迁移距离的相对变化等于存在融合蛋白和媒介时细胞迁移距离与存在对照媒介而不存在融合蛋白时细胞迁移距离的差除以对照媒介的迁移距离。相对变化可以用百分数表示，范围可能为100％(转移性细胞的迁移被完全抑制)至约5％，优选100％至约50％，更优选100％至约75％，最优选100％至约90％。当第一对照媒介与可能与第一对照媒介相同的第二媒介比较时，可以观察到0％的量。
在一个实施方案中，对本发明的两种融合蛋白A和B功效的比较，可能会观测到由A和B所导致的给定肿瘤细胞类型不同的迁移抑制百分数，两种融合蛋白在氨基酸序列上相互之间有所不同，例如各自的膜渗透增强序列。肿瘤类型与肿瘤类型之间抑制上的相对差异(或者完全是百分数如A的100％对B的80％，或者是定性差异例如A优于B)可能相同或者有变化。
一个方面，本发明的融合蛋白能够大幅(substantially)(100％)抑制至少一种类型的肿瘤细胞的转移性迁移。
另一方面，本发明的融合蛋白能够大幅(100％)抑制至少两种类型肿瘤细胞的转移性迁移。
有用的试验基于所观测到的侵袭性肿瘤细胞迁移通过人工基膜(MATRIGELTM)的能力。在该试验中，不同癌细胞类型能力有变化，每种癌细胞类型在未用本发明的组合物处理的情况下具有不同的迁移通过MATRIGELTM的能力，因此通过暴露于0.1μg/ml至100μg/ml的浓度或剂量范围的本发明的融合蛋白，来评估不同的转移性侵袭。优选的浓度范围为每立方厘米(cc)组织大约0.0001微克的融合蛋白至每立方厘米组织大约100微克。
MatrigelTM基质(BD Biosciences)是从EHS小鼠肉瘤这种富含ECM蛋白的肿瘤中提取的可溶性基膜制品。其主要成分是层粘连蛋白(laminin)、胶原蛋白IV、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans)、和副层连蛋白(entactin)。在室温，BD MatrigelTM Matrix多聚化得到生物学活性的基质材料，其可以模拟哺乳动物细胞基膜，其中细胞在体外的行为方式与在体内条件下类似。MatrigelTM基质可以提供用于生理学相关的环境供细胞形态学、生化功能、迁移或侵袭、以及基因表达研究。
包含本发明的融合蛋白如BA-05的药物组合物对血管发生的抑制，及其对毛细管样或细管状结构的影响。
一方面，包含本发明的融合蛋白的药物组合物可以通过例如注射或通过此处所述的涂覆或其他方法施用于需要此种治疗的哺乳动物中靠近或包含第一肿瘤的组织，其能够抑制哺乳动物转移性肿瘤细胞或肿瘤细胞群的血管发生进程，所述肿瘤细胞或细胞群起源于哺乳动物第一肿瘤部位，血管发生部位位于与第一肿瘤细胞所在的组织功能上相关的或与之靠近的哺乳动物健康或正常组织部位。例如，包含本发明的融合蛋白的药物组合物可以施用于靠近或包含哺乳动物肾肿瘤的肾组织，其能够抑制来自肾中的转移性肾脏肿瘤细胞在第一肿瘤所在的同一肾健康组织中的血管发生进程。
另一方面，包含本发明的融合蛋白的药物组合物可以通过例如注射或通过此处所述的涂覆或其他方法施用于需要此种治疗的哺乳动物中靠近或包含第一肿瘤的组织，其能够抑制与哺乳动物转移性肿瘤细胞的生长相关的血管发生进程，所述肿瘤细胞起源于哺乳动物第一肿瘤部位，血管发生部位位于与第一肿瘤细胞所居留的组织在功能上分离或远离该组织的哺乳动物健康或正常组织或器官部位。例如，将包含本发明的融合蛋白的药物组合物施用于脑中包含脑肿瘤的组织，能够抑制转移性脑肿瘤细胞在身体任何部位的健康组织例如肝、脾或肺组织中的血管发生。
另一方面，将包含本发明融合蛋白的药物组合物施用于需要治疗的患者后，与恶性肿瘤细胞的转移性形成和生长相关的血管发生能够被防止或抑制。将包含本发明融合蛋白的药物组合物施用于需要治疗的患者，能够大幅减少或完全防止与继发性肿瘤相关的血管发生，并且能够防止患者恶性癌症的扩散与固着。
由血管发生引起的新血管的形成在第一肿瘤的生长和由第一肿瘤的细胞或细胞群通过转移形成的第二肿瘤随后的生长中起重要作用。可以在用于研究肿瘤生长中的血管发生的体外系统，例如包括在基膜(Matrigel)提取物的存在下培养内皮细胞的系统中，评估包含本发明融合蛋白如BA-07的药物组合物对血管发生的抑制。在试验性观测条件下，可以在显微镜下观察与血管发生或血管毛细管形成相关的毛细管样结构或微管。在Matrigel试验中管状结构消失后，可以观测到本发明的融合蛋白如BA-05对血管发生进程或对管状毛细血管网形成或对所述过程的破坏或肿瘤相关血管发生进程的抑制性影响。
在Matrigel试验中，于大约4℃解冻Matrigel(约12.5mg/mL)。所述基质(约50uL)加至96孔板的每一个孔，使之于37℃固化约10分钟。将含有固体Matrigel的孔与浓度为每孔约15,000个细胞的HUVEC细胞一起保温约30分钟。细胞粘附时，去除培养基，用添加有本发明的融合蛋白如BA-05的新鲜培养基置换，37℃保温约6至约8小时。对照孔只与培养基一起保温。为了分析所述的生长，用显微镜放大例如约50X观察血管形成。在评估包含本发明融合蛋白x的药物组合物的过程中所观测到的源于血管发生的毛细血管网的相对平均长度Yx可以按照使用说明用Northern Eclipse软件来量化。
由典型的Matrigel测试试验得到的数据，例如涉及包含本发明称为BA-05的融合蛋白的药物组合物对源于血管发生的毛细血管网长度的影响的数据总结于表1。这些数据显示，与0抑制产生100％生长的对照媒介所产生的抑制相比，在所用的剂量和制剂条件下，毛细血管网的形成被抑制大约13％至约20％。可以通过使用更高剂量的融合蛋白，并通过在细胞加至Matrigel前将HUVEC细胞与BA-05一起预保温，来增强对血管发生的影响。
表1
Matrigel基质试验中包含融合蛋白BA-05的药物组合物对毛细血管网平均长度的抗血管新生影响
  与血管发生相关的毛细血管网平均长度   在媒介对照存在下产生的毛细血管网相对平均长度   在包含浓度为每毫升10微克的融合蛋白BA-05的药物组合物存在下产生的毛细血管网相对平均长度
  Y1   100   86.4
  Y2   100   78.2
  Y3   100   86.7
包含本发明的融合蛋白如BA-07的药物组合物的肿瘤细胞抗增殖活性
对本发明的融合蛋白如BA-07能够影响恶性细胞多方面表型的证明可以通过监测增殖和生长细胞中的氚标记胸苷掺入来显示，其中添加到细胞培养基的氚标记胸苷被摄入细胞，成为每个细胞中用于合成DNA的胸苷三磷酸池的一部分。每个细胞中，氚标记胸苷共价掺入到DNA大分子中。在不生长的细胞中或由于凋亡或坏死而即将死亡的细胞中，氚标记的胸苷或者不被摄入细胞，或者由于细胞的裂解而释放到细胞培养基中。氚标记胸苷掺入法可以用于全面测定本发明的融合蛋白如BA-07对细胞生长、细胞分裂、细胞休眠、和细胞死亡的影响。BA-07诱导3H-胸苷减少的细胞系包括：人子宫内膜癌细胞系HEC 1B、人结肠直肠癌细胞系CaCo2、人黑素瘤癌细胞系SK-MEL-2、和人CNS癌细胞系A-172。
表2的数据例示施用于八种代表性人癌细胞系中每一种的包含本发明融合蛋白BA-07的组合物剂量变化对氚标记胸苷掺入八种人癌细胞系的影响，八种人癌细胞系为：HEC 1B，Caco-2，SK-MEL-1，HT1080，MCF7，SW480，293S，和A172。所施用的融合蛋白BA-07的剂量范围相差50倍，从每毫升大约1微克至每毫升大约10微克至每毫升大约50微克(ug/mL)。
表2
通过掺入氚标记胸苷测得的人肿瘤细胞系对施用融合蛋白BA-07的响应数据
  BA-07的剂量，微克每毫升
  人癌细胞系   50   10   1
  存在融合蛋白时相对于只存在作为对照的媒介时的生长百分数％
  HEC 1B   10   13   30
  Caco-2   21   17   30
  SK-MEL-1   34   30   33
意外地观察到存在所述融合蛋白时，这些人肿瘤细胞系显示细胞增殖减少。表2显示与100％的对照数值相比较的生长百分数。
掺入了氚标记胸苷的包含融合蛋白BA-07的本发明的组合物在HEC1B细胞系中对细胞增殖显示出显著的影响，所述HEC 1B细胞系为子宫内膜癌细胞系，对增殖的抑制相对于50％抑制浓度(IC50)小于1ug/mL，据此可以将肿瘤细胞系分为三个不同的组。除了抑制之外，在更高的BA-07浓度时，还有抑制增强的剂量响应效果。
在表2所示的Caco 2和SK-MEL-1细胞系中，融合蛋白对细胞增殖显示出强烈的抑制作用，这通过低水平氚标记胸苷掺入到每个细胞系细胞中得到证实。
本说明书中使用的缩写
ADP                    腺苷二磷酸(adenine dinucleotide phosphate)
ATCC                   美国典型培养物保藏中心
ADPC3                  C3外转移酶；C3细胞外酶；C3转移酶
FBS                    胎牛血清
HEPES                  HEPES缓冲液
MMP                    基质金属蛋白酶
NAD                    烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
NCI                    国家癌症研究院
PBS                    磷酸缓冲盐溶液
SRB                    磺酰罗丹明(sulforhodamine)B
TCA                    三氯乙酸
通过以下的非限制性实施例以不同的实施方案和方面进一步阐述本发明。
实施例1
用于制备根据本发明的融合蛋白的一般方法
为了阐明用于制备本发明的融合蛋白的方法，使用了添加到C3多肽C端的触角足序列的例子。要添加到C端的DNA序列可以是能够导致在C3多肽C端添加至少一个氨基酸的任何的DNA序列。可以使用引物5’GAATTC TTT AGG ATT GAT AGC TGT GCC 3’(SEQ ID NO：1)和5’GGT GGCGAC CAT CCT CCA AAA 3’(SEQ ID NO：2)通过多聚酶链式反应(PCR)用EcoR1位点置换DNA 3`端的终止密码子。PCR产物可以亚克隆到pSTBlue-1载体(Novagen，Madison，Wisconsin)中，然后用BamH I和Not I限制性位点克隆到pGEX-4T(Amersham Biosciences，Baie d’UrFE，Quebec)载体中。该载体可以称为pGEX-4T/C3，其提供了制备本发明的融合蛋白的一般方法。可以通过PCR从含有触角足序列的pET-3a载体中制备用于添加到pGEX-4T/C3中的C33`端的触角足序列(Bloch-Gallego(1993)120：485-492；和Derossi(1994)269：10444-10450)，亚克隆到pSTBlue-1平端载体中，然后用限制性位点EcoR I和Sal I克隆到pGEX-4T/C3中，制得pGEX-4T/BA-14。例如利用存在于质粒DNA中的核酸酶或所购买的酶对目标质粒序列进行操作以产生新的DNA序列，用含有掺入到pGEX4T/BA-14中的两个所需的合成寡核苷酸进行核酸外切酶III消化或定点诱变，可用于制备新的DNA序列，当其在适当的系统中表达时产生蛋白质，可以用标准方法例如亲和层析，或利用例如依据电荷的离子交换分离方法、依据大小的大小排阻层析分离的标准层析方法，以及其他的蛋白质纯化方法纯化。在测试穿透细胞的能力的试验中检测蛋白质，试验中检测蛋白质拮抗Rho活性的能力。可以在产生的响应优于C3外转移酶所产生的响应的质粒序列上进行DNA序列分析，每种C3外转移酶都作为对照比较。pGEX-4T/BA-14克隆(Seq ID NO：3)目前是优选序列，其提供的蛋白质是本发明的优选组合物。C3样融合蛋白的例子定名为pGEX-4T/BA-05(SEQ ID NO：37)。
可以从细菌细胞提取物中制备本发明的蛋白质，或者通过使用以全部或部分融合蛋白编码DNA片段如BA-05编码DNA片段转化、转染、或感染宿主细胞的重组技术，所述DNA片段处于适合的表达媒介中，具有触角足基因衍生的转运序列。
实施例2
融合蛋白BA-05的制备
可以使用实施例1的方法制备称为BA-05的融合蛋白，该融合蛋白包含氨基酸序列。BA-05是给予通过将编码C3的cDNA连接到编码融合19聚肽的cDNA而制得的蛋白质的名称。
C3样融合蛋白的例子命名为pGEX-4T/BA-05(SEQ ID NO：37)。
该C3样融合蛋白通过所描述的将触角足基因DNA操作至pGEX4T/C3DNA中的方法制备。表达了20或更多种的C3样融合蛋白，并按生产商(Amersham BioSciences，Baie D’Urfé，Québec)所述方法纯化。检测了20种蛋白质在体外系统中灭活Rho的能力。灭活Rho程度更强的蛋白质用于进一步的分析，蛋白质灭活Rho的程度通过与媒介对照或作为对照的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)蛋白相比较所得到的神经突触生长增强来测定。该过程的产物可以包括蛋白质如一般例子中所描述的蛋白质BA-14，或由克隆方法生产的新的融合蛋白，所述融合蛋白可以具有不同于融合蛋白BA-14分子或不同于作为对照的非融合蛋白C3蛋白的特性如分子量和Rho灭活生物试验中的活性。新的融合蛋白可以包含C3氨基酸序列，但由于所使用的方法，可能在羧基端有变化。
实施例3
融合蛋白BA-07的制备
实施例1的方法可用于制备BA-07，其包含下述的氨基酸序列：
Met Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn Gln
 1               5                  10                  15
Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln Ala
            20                  25                  30
Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys Ser
        35                  40                  45
Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile Asn
    50                  55                  60
Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser Asn
65                  70                  75                  80
Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met Lys
                85                  90                  95
Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr Leu
            100                  105                  110
Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile Asn
        115                 120                 125
Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp Arg
    130                 135                 140
Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln Phe
145                 150                 155                 160
Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser Lys
                165                 170                 175
Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gln Leu Glu Met
            180                 185                 190
Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu Ser
        195                 200                 205
Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr Ala
    210                 215                 220
Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly Arg
225                 230                 235                 240
His Thr Pro Gly Thr Arg Leu
                245         (SEQ ID N0：57)
设计了两个PCR引物以将一个系列的重组构建体(BA-05)转移到pET-9a载体(Novagen，Madison，Wisconsin)中，当在适当的表达系统中表达时制得BA-07蛋白：上游引物：5′ggatctggttccgcgtcatatgtctagagtcgacctg 3′(SeqID NO：38)下游引物：5′cgcggatccattagttctccttcttccacttc 3′(SEQ ID NO：39)。序列Seq ID NO：395′端的BamHI位点为ggatccatta；TGA由TAAT所置换(atta，SEQ ID NO：39中)。
用于使用PFU聚合酶扩增所述产物的程序包括：95℃5′1个循环，然后94℃2′56℃2′70℃2′10个循环，然后94℃2′70℃3′30个循环，4℃保温。可以使用QIAEXII试剂盒(Qiagen)纯化含有所需DNA条带的琼脂糖凝胶片段。按照生产商的使用说明，用BamHI和NdeI消化插入序列和载体，用琼脂糖凝胶电泳和QIAEXII试剂盒(Qiagen)纯化，按照生产商的使用指导，与T4DNA连接酶一起保温过夜。
用连接混合物转化大肠杆菌(DH5alpha，或优选，XL1-Blue)。可以通过小规模诱导和SDS-GAGE检查克隆，并使用抗C3抗体进行粗制溶菌液的免疫印迹来确定。纯化质粒DNA，并可评估纯度。可以进行DNA测序(例如，使用LiCor技术，该技术中对整条链的克隆全长进行测序)。
以此方式(pET3a-BA-07，SEQ ID NO：7)制备的第一构建体与构建体pGEX/BA-05的理论DNA序列相匹配，由于克隆策略，在5`端稍有变化。
可以按照生产商的使用说明，通过使用BamHI和NdeI(New EnglandBioLabs，Beverly，MA)切割pET3a构建体，从pET3a-BA-07中将插入序列亚克隆到pET9a载体中，由此可以制备第二构建体pET9a-BA-07。可以用同样的酶切割pET9a质粒DNA。可以通过琼脂糖凝胶电泳纯化插入的DNA和载体DNA。可以用T4DNA连接酶(New England BioLabs，Beverly，MA)将插入序列连接到新的载体中。连接的DNA可以转化到DH5alpha细胞中，可以用QIAGEN mini和maxi试剂盒制备DNA。可以同时在两个方向通过限制性消化和DNA测序鉴定克隆(例如，BioS&T，Lachine，Quebec)。可以将构建体DNA转化到BL21(DE3)细胞和BL21(DE3)/pLysS细胞(Novagen，Madison，WI)或另一适合的表达系统中。
实施例4
用于测量细胞增殖的氚标记的胸苷吸收的一般方法，用于证明融合蛋白BA-07减少癌细胞的增殖
3H-胸苷掺入试验
培养基和细胞系
检测细胞系的支原体，发现在研究开始前是阴性的。细胞系从ATCC获得。HEC-1B细胞系培养于添加有10％FBS和1％HEPES的E-MEM中。Caco-2细胞系培养于添加有20％FBS，1％HEPES，1mM丙酮酸钠和0.1mM非必需氨基酸的E-MEM中。SK-MEL-1细胞系培养于添加有10％FBS和1％HEPES的McCoy’s中。
体积为100μl的每种2X融合蛋白工作溶液、阳性和媒介对照在含有细胞(4×103/100μl)的96孔微板上划平板，三个重复，得到200μl的终体积。将这些平板放置于37℃、湿度为100％以及5％CO2的保温器中。保温约54小时后，将含1.0μCi，体积为20μl的氚标记胸苷(3H-胸苷)(ICN，Montreal，Canada)加至每个孔中。3H-胸苷于添加有10％FBS的RPMI-1640中制备。如上述在相同条件下将培养物再保温18个小时。保温结束时，用自动细胞收集器(Tomtec)收获细胞，用微孔板闪烁发光计数仪(microplate scintillationcounter)(TopCount NXT，Packard)测定3H-胸苷的每分钟掺入数(cpm)。
对本发明的融合蛋白如BA-07能够影响恶性细胞多方面表型的证明可以通过监测增殖和生长细胞中的氚标记胸苷掺入来显示，其中添加到细胞培养基的氚标记胸苷被摄入细胞，成为细胞中用于每个细胞合成DNA的胸苷三磷酸池的一部分。每个细胞中，氚标记胸苷共价掺入到DNA大分子中。在不生长的细胞中或由于凋亡或坏死而即将死亡的细胞中，氚标记的胸苷或者不被摄入细胞，或者由于细胞的裂解而释放到细胞培养基中。氚标记胸苷掺入法可以用于全面测定本发明的融合蛋白如BA-07对细胞生长、细胞分裂、细胞休眠、和细胞死亡的影响。其中BA-07诱导3H-胸苷减少的细胞系包括：人子宫内膜癌细胞系HEC 1B、人结肠直肠癌细胞系CaCo2、人黑素瘤癌细胞系SK-MEL-2、和人CNS癌细胞系A-172。
表2的数据例示施用于八种代表性人癌细胞系中每一种的包含本发明融合蛋白BA-07的组合物剂量变化对氚标记胸苷掺入八种人癌细胞系的影响，八种人癌细胞系为：HEC 1B，Caco-2，SK-MEL-1，HT1080，MCF7，SW480，293S，和A172。所施用的融合蛋白BA-07的剂量范围相差50倍，从每毫升大约1微克至每毫升大约10微克至每毫升大约50微克(ug/mL)。
实施例5
测定对血管发生的抑制的一般方法
通过在基膜基质(Matigel)存在下培养内皮细胞在细胞培养物模型中研究新血管的形成。通过胰蛋白酶化(trypinization)从母培养物(stock culture)中收集脐静脉内皮细胞(HUVEC)，重悬于包含EBM-2(Clonetics)、FBS、氢化可的松、hFGF、VEGF、R3-IGF-1、抗坏血酸、hEGF、GA-1000、肝素的生长培养基中。4℃解冻Matrigel(12.5mg/mL)，将50mL的Matrigel加至96孔板的每个孔中，使之于37℃固化10分钟。将生长培养基中浓度为15,000个细胞/孔的细胞加至每个孔中，使之粘附6小时。以约10mg/ml向孔中加入融合蛋白BA-07，其他孔中加入PBS作为对照。使培养物再生长6至8小时。用显微镜放大50X观察血管的生长，毛细血管网的平均长度用Northern Eclipse软件量化。在Matrigel试验中用融合蛋白BA-07处理细胞减少了血管的形成(参见图3)。
实施例6
证明融合蛋白对癌细胞增殖抑制的影响的一般方法
磺酰罗丹明B(SRB)生长抑制试验
已开发出了用于细胞蛋白含量测定的磺酰罗丹明B(SRB，可由Molecular Probes获得)蛋白染色试验，此后在NCI中被用于抗肿瘤筛选的常规用途(Skehan等，1990)。SRB结合到细胞蛋白质的碱性氨基酸上，比色评估提供了总蛋白量的估计值，其与细胞数目有关。该试验基于以下假设：假设死亡细胞或者裂解并在实验期间被去除，或者以其他方式不对比色终点作出贡献。SRB有可能高估细胞的存活分数。
SRB试验的方案
这些测定在NCI 60细胞系板(panel)上进行。依据ATCC对每种细胞系的推荐，将细胞培养于添加5％胎牛血清和L-谷氨酰胺的RMPI-L 640培养基中。对数生长的细胞经胰蛋白酶作用并计数。根据各细胞系加倍的时间，将细胞接种在100μL生长培养基中的96孔微板上。微板于37℃、5％CO2和100％相对湿度条件下保温24小时，重新开始指数生长。24小时后，用TCA原位固定每个细胞系的两个板，以供在加入测试品(T0)时测定每个细胞系的细胞数之用。去除TCA，将微板在室温保温至少24小时至干燥。
制备本发明的融合蛋白并将其以冻干粉末的形式冷冻存储。可以用无菌水在10mM磷酸钠、pH 7.4的缓冲液中将其重建形成约每毫升4.42微克融合蛋白的药物组合物。对于每个剂量点，用含有50μg/mL庆大霉素的完全培养基制备母液(stock solution)的系列稀释液，得到200μg/mL、20μg/mL、2μg/mL、0.2μg/mL、和0.02μg/mL的融合蛋白。将100μL的那些测试品稀释液的部分样品加至已含有100μL培养基的合适的孔中，得到融合蛋白的最终对数(log)稀释系列剂量。
加入融合蛋白(例如，药物)后，于37℃、5％CO2和100％的相对湿度条件下将所述微板额外保温一段时间。用三氯乙酸(TCA)将细胞中的蛋白质固定在孔底以终止试验。干燥微板，然后向每个孔中加入1％醋酸中浓度为0.4％(w/v)的100μL SRB溶液。室温下将微板同蛋白结合染料一起保温10分钟。
染色后，用醋酸洗涤去除未结合的染料，干燥微板。加入200μL 10mMTrizma碱时轻轻混合微板以溶解结合的染料。于515nm波长处通过用微板读数器读取光密度值来测定染料的量。
在Excel电子数据表中分析数据。
T0＝加入融合蛋白时(时间0)的平均吸光值
C＝对照的平均吸光值(没有含药物的测试品)
Ti＝融合蛋白产品的平均吸光值(稀释系列中的不同剂量点)
计算了每个测试品浓度的平均生长：
Figure A20048003533200611
用于Ti＞T0的浓度
用于Ti＜T0的浓度。
％生长抑制可用于绘制图表以比较不同剂量的影响。绘制了生长百分数图，剂量响应曲线与+50、0、和-50的PG值交叉的点用于计算GI50，TGI和LC50.GI50，或抑制50％生长所需的浓度，其是融合蛋白的相关参数。
实施例7
SRB试验用于说明人癌细胞系细胞生长抑制的特定用途
表3
用融合蛋白处理后通过SRB试验测定的GI50(用于抑制50％细胞生长的浓度)
  细胞系   癌症类型   GI50(μg/mL)
  Caki-1   肾脏癌   0.054
  TK-10   肾脏癌   0.52
  SF-268   CNS   0.326
  HOP-62   非SCLC   0.269
  NCI-H226   非SCLC   48.2
  HS 578T   乳腺癌   36.6
一种本发明的融合蛋白BA_0_对用3H-胸苷试验的6种人肿瘤细胞系中的4个有影响，对NCI筛选的细胞系中约10％有影响。在SRB试验中，其显示出抑制细胞(生长)的特性；与对照相比生长受到抑制，但与时间零时(Tz)的量相比蛋白质总量没有减少。这些结果与体内数据一致，显示C3转移酶对动物不是高度毒性的。所观测到的GI50值在纳摩尔到微摩尔范围内，得出融合蛋白约27kDa的分子量。
实施例8
通过pull-down试验检测活化的Rho
NG108细胞生长于存在5％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素(P/S)的细胞培养物中。细胞稳定后(3-6小时，37℃)，将BA-05加至培养物。为裂解细胞，细胞用冰冷Tris缓冲盐溶液(TBS)洗涤，将其裂解于RIPA缓冲液(50mM Tris pH 7.2，1％Triton X-100，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，500mMNaCl，10mM MgCl2，10μg/ml亮抑酶肽(leupeptin)，10μg/ml抑肽酶(aprotinin)，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF))中。4℃13,000g离心10分钟，使细胞溶解产物澄清，-80℃保存。
用细胞溶解产物纯化GST-Rho结合结构域(GST-RBD)，将细胞溶解产物解冻并以每1百万细胞500uL的RIPA缓冲液重悬。为了制备GST-Rho结合结构域(GST-RBD)，将表达PGEX载体中的GST-RBD的细菌培养于含100μl/ml氨苄青霉素的L-肉汤(LB)中。将过夜的培养物1∶10稀释到3600mlLB中，37℃于摇动细菌孵育器中保温2小时。然后往孵育培养物中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)(0.5mM)2小时。然后5,000g离心15分钟，收集细菌。然后将颗粒重悬于40ml裂解缓冲液(50mM Tris pH 7.5，1％Triton-X，150mM NaCl，5mM MgCl2，1mM DTT，10μg/ml亮抑酶肽，10μg/ml抑肽酶，1mM PMSF)中。超声波处理后，4℃14,000rpm离心30分钟。
在RIPA缓冲液(50mM Tris pH 7.2，1％Triton X-100，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，500mM NaCl，10mM MgCl2，10μg/ml亮抑酶肽，10μg/ml抑肽酶，1mM PMSF)中匀浆冷冻的细胞培养物。4℃通过两次10-分钟13,000g离心，澄清匀浆和细胞裂解产物。然后将其与偶联在谷胱甘肽谷胱甘肽琼脂糖珠子(Sigma，Oakville，Canada)上的GST-RBD一起4℃保温50分钟。然后洗涤珠子4次，在样品缓冲液中洗脱。以western印迹测定存在于组织匀浆中的GTP-结合Rho和总Rho。将蛋白质转移到硝化纤维素(nitrocellulose)上，用单克隆RhoA抗体(Santa Cruz，Santa Cruz，California)探测。用过氧化物酶连接的第二抗体(Promega，Madison，Wyoming)和基于HRP的化学发光(Chemiluminescence)反应(Pierce，Rockford，Illinois)显示条带。进行Densitometry分析以量化每个条带上的信号。
实施例9
pull-down试验作为诊断手段诊断或测定哪些肿瘤能够对融合蛋白治疗作出最佳反应的用途，以BA-07为例
通过从手术切除的哺乳动物(例如，病人)组织获得肿瘤的活组织检查样品，当肿瘤被全部去除时，在切除的肿瘤边缘留下残留组织。在干冰上或液氮中冷冻样品。在500uL RIPA缓冲液(50mM Tris pH 7.2，1％Triton X-100，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，500mM NaCl，10mM MgCl2，10mg/ml亮抑酶肽，10mg/ml抑肽酶，1mM PMSF)中匀浆大约5mm2的切除组织样品。4℃下通过两次10-分钟13,000g离心来使匀浆澄清，提供用于进一步分析的样品。然后将其与如实施例8所述制备的偶联在谷胱甘肽琼脂糖珠子(Sigma，Oakville，Canada)上的GST-RBD一起4℃保温50分钟。以western印迹测定存在于组织匀浆中的GTP-结合Rho和总Rho。
为了检测活组织检查样品中哪些细胞有活化的Rho，可以制备冷冻切片(cryostat sections)。4℃14,000rpm离心30分钟澄清RBD-GST的细菌溶菌液。通过将所述部分与含有RBD-GST的细菌溶菌液一起保温来检测活化的Rho。用4％PFA固定后，将大鼠脊索冷冻切片(约厚16μm)与细菌溶菌液一起4℃保温过夜。然后用TBS洗涤所述切片三次，室温在3％BSA中阻断1小时，与抗GST抗体(Cell signalling，New England Biolabs，Mississauga，Canada)和细胞类型特异性抗体一起保温。在脑肿瘤的例子中，可以使用神经细胞特异性抗体(NeuN)或星形细胞特异性抗体(GFAP)检测具有活化的Rho的细胞类型，以帮助诊断肿瘤。在TBS中洗涤这些切片，与FITC，TexasRed或罗丹明偶联的第二抗体(Jackson ImmunoResearch，Mississauga，Canada)一起在室温偶联保温2小时。
实施例10
检测金属蛋白酶(MMP)活性降低的一般方法
通过酶谱法检测金属蛋白酶活性，通过该方法在非还原性条件下将酶的蛋白水解活性分离于聚丙烯酰胺凝胶中。为检测金属蛋白酶活性，用明胶酶谱检测培养基中来自Caki-1结肠癌细胞生长的解明胶(glatinolytic)活性。Caki-1细胞与0.1，1.0或10μg/ml的BA-07或与作为对照的缓冲液一起保温24小时。用含7.5％聚丙烯酰胺的1mg/ml明胶对培养基等分试样(25μl)进行SDS/PAGE，在非还原性条件下分离多肽。为评估MMP活性，通过室温在2.5％(v/v)Triton X-100中保温30分钟去除SDS。重复该步骤，然后用ddH2O漂洗5次。接下来，37℃将凝胶在含50mM Tris-HCl，pH 7.6，0.2M NaCl，5mM CaCl2，和0.02％(v/v)Brij-35的缓冲液中保温20小时。凝胶用考马斯亮蓝R-250染色，脱色。明胶底物上的酶活性是可探测的，其在蓝色背景下为明显的条带。具有明胶酶活性的MMP酶的鉴定使用阳性对照来评估，例如在这些试验中为HT-1080。
实施例11
探测用BA-07处理后金属蛋白酶活性的降低
采用实施例10的方法，其中使用BA-07。观测金属蛋白酶活性的降低。
实施例12
无菌溶液中的融合蛋白制剂
将治疗上有效单位剂量量的本发明的融合蛋白如BA-07溶解于单位剂量体积的无菌溶液如无菌等渗PBS中，形成单位剂量量的溶液，在无菌条件下通过0.2微米过滤器过滤。在惰性气体(例如，氮气或氩气)中将滤液收集到无菌瓶子中。然后用无菌隔膜和螺丝盖密封瓶子，室温保存。可以将瓶子中含有融合蛋白如本发明的融合蛋白BA-07的单位剂量量的溶液施用于患者，施用通过注射如静脉内递送、灌输、或通过直接注射至哺乳动物的肿瘤部位例如病人的肿瘤、或通过注射至哺乳动物组织如病人组织中的肿瘤切除部位边缘来进行。
均包含单位剂量量的两个或多个瓶子可以以类似的的方式制备，单位剂量量可以通过在治疗学上有效的治疗时间注射到需要治疗的患者。按照这种方式，可以制备以单位剂量施用的序列到患者的组织或全身性地施用于患者。例如，单位剂量量的融合蛋白组合物可以每天一次施用于患者，或每两天一次施用于患者，或每周一次施用于患者。另外，可以将治疗有效量的单位剂量的包含融合蛋白的药物组合物于肿瘤切除前在一或多处全身性地施用于组织中有肿瘤的患者，和/或于肿瘤切除例如手术切除前在一或多处施用到患者经诊断确定的肿瘤边缘中，和/或于肿瘤切除前在一或多处直接施用到肿瘤组织中，和/或于肿瘤切除后在一或多处全身性施用，和/或于肿瘤切除后直接施用到肿瘤的残留边缘中。为了防止第一肿瘤存在下或去除第一肿瘤后第二肿瘤的生长，这样重复的单位剂量施用次数和每个单位剂量形式的融合蛋白量在患者与患者之间和肿瘤类型与肿瘤类型之间以及肿瘤大小之间可以不同。
实施例13
冻干制剂
溶解于可药用的等渗水介质中的含单位剂量量的本发明的组合物，在无菌条件下无菌过滤(例如，通过0.2微米过滤器)，所述组合物包含融合蛋白如BA-07，所述等渗水介质含可药用的缓冲盐和/或易溶于水的可药用的碳水化合物(优选可药用的非还原性糖或环式糊精)，滤液置于已灭菌的瓶子中，冷冻滤液，将冷冻水溶液在减压条件下于可药用的冷冻干燥机中无菌冻干，在瓶子中剩下含融合蛋白的干燥基质，在无菌惰性气体下将瓶子放回大气压力中，用无菌的塞子(例如与螺丝盖一起)密封瓶子。为了将融合蛋白基质重建为单位剂量形式的溶液，在密封的瓶子上标上其所含内容物及剂量，与第二个密封的无菌瓶子一起置于试剂盒中，第二个瓶子含有一定量的注射用无菌水用于转移到第一个含融合蛋白的瓶子。在另一实施方案中，可以将融合蛋白溶解于起始体积的水介质中，其中含有高渗水介质，无菌过滤溶液，将滤液装入瓶子，冻干成干燥的基质。此干燥基质可以在大于原始体积的无菌水中溶解或重建，所述更大的体积足以形成用于注射的等渗溶液。可选地，可以通过将高渗溶液灌输到含更大体积等渗水介质的滴水袋中用于施用，由此，所述的高渗溶液事实上被稀释了。任选地，将含有一定体积的、其用量适合于将基质重建为单位剂量形式的无菌水的瓶子与冻干蛋白一起分装成试剂盒。优选重建的组合物含有等渗溶液。可以用该制剂以类似于前述实施例中的方式将融合蛋白用于静脉内递送、和/或灌输、和/或直接注射到肿瘤中。
实施例14
多聚体中的制剂
通过混和到聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸(PLA)共聚物中来配制包含融合蛋白如BA-07的本发明的组合物。PGA/PLA共聚物可以在植入后2-6个月降解，这依赖于PGA相对于PLA的比例。在一种制剂中，使用PGA/PLA，以0.5-50％，优选1.0-3.0％的浓度将其溶解于非变性有机溶剂中。然后可以用降低水位的小刀(drawdown knife)或浇注在以多糖为基础的薄膜或泡沫表面上，或者通过喷雾或浸渍涂覆或其他可用的手段扩散多聚体溶液，然后通过去除溶剂干燥。可以制备合成的筛网例如包含可药用的可溶的和/或可降解的多聚体的筛网，用于整合融合蛋白如BA-07，其将在筛网降解时释放。筛网可以植入在肿瘤手术切除部位中，所述融合蛋白可以释放出来以防止任何残留肿瘤细胞的转移和生长。
实施例15
处理切除肿瘤边缘的一般方法
配制于可药用的乳膏中的包含融合蛋白如BA-07的本发明的组合物可用于处理皮肤切除部位。例子为恶性黑素瘤的治疗，其中这样的乳膏被置于围绕肿瘤切除部位的皮肤上。一个方面，含有融合蛋白的这样的乳膏制剂可以在肿瘤切除前施用于皮肤，用于在第一次活组织检查至作出肯定的组织学诊断前这一期间治疗肿瘤。当把乳膏应用于肿瘤部位时，可以防止肿瘤的扩散和转移。
实施例16
防止第二肿瘤在肿瘤边缘中生长
包含融合蛋白如BA-07的本发明的组合物，例如上述的水溶液或制备的手术粘胶如粘性纤维素或水明胶，可用于处理肿瘤手术切除区域。例子为结肠癌结肠切除(colonectomy)后对健康结肠的处理。在肿瘤切除前以其他方式包围肿瘤区域的健康结肠组织可以在去除肿瘤和相关的组织后，用手术胶如纤维素密封剂中的融合蛋白组合物如BA-07处理，将可用于防止在残留组织中形成额外的病灶。
实施例17
说明哺乳动物中的临床前功效的一般方法
将黑素瘤细胞系皮下植入第一组裸鼠(Charles River Laboratories)。在第一组小鼠中培养肿瘤，收获，单独移植到第二组小鼠中的每只小鼠体内(每只小鼠一个肿瘤)。每天将包含有效剂量的融合蛋白如BA-07的本发明药物组合物置于可药用的媒介中经注射施用于第二组小鼠中的每只小鼠，估计所述药物组合物的剂量范围在10-100ug/mL肿瘤体积。对照动物用媒介注射作为对照。测定肿瘤的生长，进行组织学分析以测定来自恶性角化细胞的标志物如γ免疫蛋白10(IP10)。包含融合蛋白的组合物防止或大幅抑制了第二组小鼠中肿瘤的生长。
实施例18
应用于植入的乳房装置(device)表面的包含融合蛋白的组合物在防止乳腺癌复发中的用途
将治疗有效量的包含融合蛋白的本发明的药物组合物涂覆在可药用的乳房植入物表面上。从患者乳腺组织切除肿瘤，可选地与如上所述的本发明的药物组合物联合施用。由肿瘤切除所形成的空间至少部分地被乳房植入物所填充，所述乳房植入物由包含融合蛋白的药物组合物所涂覆，缝合切开和/或植入造成的伤口。残留肿瘤边缘组织中的第二肿瘤的生长被大幅抑制或防止。
实施例19
制备融合蛋白的一般方法
代表性融合蛋白BA-14的DNA序列
融合蛋白BA-14的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)
ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aatgcttatt ccattaatca aaaggcttat   60
tcaaatactt accaggagtt tactaatatt gatcaagcaa aagcttgggg taatgctcag  120
tataaaaagt atggactaag caaatcagaa aaagaagcta tagtatcata tactaaaagc  180
gctagtgaaa taaatggaaa gctaagacaa aataagggag ttatcaatgg atttccttca  240
aatttaataa aacaagttga acttttagat aaatctttta ataaaatgaa gacccctgaa  300
aatattatgt tatttagagg cgacgaccct gcttatttag gaacagaatt tcaaaacact  360
cttcttaatt caaatggtac aattaataaa acggcttttg aaaaggctaa agctaagttt  420
ttaaataaag atagacttga atatggatat attagtactt cattaatgaa tgtctctcaa  480
tttgcaggaa gaccaattat tacacaattt aaagtagcaa aaggctcaaa ggcaggatat  540
attgacccta ttagtgcttt tcagggacaa cttgaaatgt tgcttcctag acatagtact  600
tatcatatag acgatatgag attgtcttct gatggtaaac aaataataat tacagcaaca  660
atgatgggca cagctatcaa tcctaaagaa ttcgtgatgg aatcccgcaa acgcgcaagg  720
cagacataca cccggtacca gactctagag ctagagaagg agtttcactt caatcgctac  780
ttgacccgtc ggcgaaggat cgagatcgcc cacgccctgt gcctcacgga gcgccagata  840
aagatttggt tccagaatcg gcgcatgaag tggaagaagg agaactga               888
融合蛋白BA-14的蛋白质序列(SEQ ID NO：4)：
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
 1               5                  10                  15
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                  105                  110
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 l75
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Glu Ser Arg Lys Arg Ala Arg
225                 230                 235                 240
Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe His
                245                 250                 255
Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile Glu Ile Ala His Ala
            260                 265                 270
Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
        275                 280                 285
Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn
    290                 295
为说明用于制备本发明的融合蛋白的方法，添加到C3多肽C端的触角足序列的例子是有用的。欲添加到C端的DNA序列可以是能够导致在包含C3多肽的肽的C端添加至少一个氨基酸的任何DNA序列。
首先，用标准方法制备pGEX2T-C3质粒DNA(N.Lamarche，McGillUniversity)。可以使用引物5’GAA TTC TTT AGG ATT GAT AGC TGT GCC 3’(SEQ ID NO：1)和5’GGT GGC GAC CAT CCT CCA AAA 3’(SEQ ID NO：2)通过聚合酶链式反应(PCR)用EcoRl位点置换DNA 3’末端的终止密码子。将PCR产物亚克隆到pSTBlue-1载体(Novagen，Madison，Wisconsin)中，然后用BamH I和Not I限制性位点克隆到pGEX-4T(Amersham Biosciences，Baie d’Urfe，Quebec)载体中。该载体可称为pGEX-4T/C3，其提供了制备本发明融合蛋白的一般方法。可通过PCR从含有触角足序列的pET-3a载体制备用于添加到pGEX-4T/C3中的C3 3’末端的触角足序列(Bloch-Gallego(1993)120：485-492；和Derossi(1994)269：10444-10450)，亚克隆到pSTBlue-1平端载体中，然后用限制性位点EcoR I和Sal I克隆到pGEX-4T/C3，制得pGEX-4T/BA-14。
BA-14的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)
ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aatgcttatt ccattaatca aaaggcttat   60
tcaaatactt accaggagtt tactaatatt gatcaagcaa aagcttgggg taatgctcag  120
tataaaaagt atggactaag caaatcagaa aaagaagcta tagtatcata tactaaaagc  180
gctagtgaaa taaatggaaa gctaagacaa aataagggag ttatcaatgg atttccttca  240
aatttaataa aacaagttga acttttagat aaatctttta ataaaatgaa gacccctgaa  300
aatattatgt tatttagagg cgacgaccct gcttatttag gaacagaatt tcaaaacact  360
cttcttaatt caaatggtac aattaataaa acggcttttg aaaaggctaa agctaagttt  420
ttaaataaag atagacttga atatggatat attagtactt cattaatgaa tgtctctcaa  480
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attgacccta ttagtgcttt tcagggacaa cttgaaatgt tgcttcctag acatagtact  600
tatcatatag acgatatgag attgtcttct gatggtaaac aaataataat tacagcaaca  660
atgatgggca cagctatcaa tcctaaagaa ttcgtgatgg aatcccgcaa acgcgcaagg  720
cagacataca cccggtacca gactctagag ctagagaagg agtttcactt caatcgctac  780
ttgacccgtc ggcgaaggat cgagatcgcc cacgccctgt gcctcacgga gcgccagata  840
aagatttggt tccagaatcg gcgcatgaag tggaagaagg agaactga               888
融合蛋白BA-14的蛋白质序列(SEQ ID NO：4)：
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
 1               5                  10                  15
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                 105                 110
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Glu Ser Arg Lys Arg Ala Arg
225                 230                 235                 240
Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe His
                245                 250                 255
Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile Glu Ile Ala His Ala
            260                 265                 270
Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
        275                 280                 285
Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn
    290                 295
本发明的融合蛋白可以从细菌细胞提取物制备，或者通过使用这样的重组技术来制备：在适合的表达媒介中，用具有源于触角足基因的转运序列用的、编码全部或部分融合蛋白DNA片段如编码BA-05的DNA片段转化、转染、或感染宿主细胞。
实施例20
融合蛋白BA-05的制备
将C3样融合蛋白的例子命名为pGEX-4T/BA-05(Seq ID NO：4)。
BA-05是此处给予通过将编码C3的cDNA连接到编码融合19聚肽的cDNA而制得的蛋白质的名称。
实施例19的方法可用于制备融合蛋白BA-05，其含有以下的氨基酸序列：
pGEX-4TBA-05蛋白质编码序列(SEQ ID NO：4)
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
 1               5                  10                  15
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                 105                 110
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Glu Ser Arg Lys Arg Ala Arg
225                 230                 235                 240
Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe His
                245                 250                 255
Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile Glu Ile Ala His Ala
            260                 265                 270
Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
        275                 280                 285
Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn
    290                 295
通过所述的方法将触角足基因DNA操作至pGEX4T/C3DNA中，产生pGEX4T/BA-14，由此制备C3样融合蛋白。选择具有移码突变的克隆，制备所述蛋白质并检测。尽管存在突变，但只要培养物检测为阳性，就对质粒DNA重新测序以确认该突变。此处新的克隆称为BA-05。为了确认C3APLT的序列，同时对来自两条链的编码序列测序。此处的实施例中给出了该克隆的序列(BA-05的核苷酸序列；SEQ ID NO：3，BA-05的氨基酸序列；SEQ ID NO：4)。
另一种用于制备BA-05的方法是制备pGEX-4T/BA-14，然后利用定点诱变技术，该技术中使用两个互补寡核苷酸引物如pGEX4T-BA14 DNA中删除了一个碱基对的(SEQ ID NO：58)5’CCTAAAGAAT TCGTGATGAATCCCGCAAAC GCGCA 3’和SEQ ID NO：59 5’TGCGCGTTTGCGGGATTCAT CACGAATTCT TTAGG 3’)。通过核苷酸存在下引物的延伸，使用QuikChange试剂盒(Statragene，LaJolla，CA)掺入所述的删除。以下的温度循环用于制备BA-05：95℃30秒1个循环，然后95℃30秒18个循环，55℃1分钟，以及68℃10.5分钟。然后如生产商所述用限制性酶DpnI处理所述DNA。然后将一部分反应物转化到大肠杆菌DH5alpha或XLl-Blue。在含有选择性抗生素的琼脂板上分离大肠杆菌的单个克隆，培养于LB培养基+氨苄青霉素中。用MidiPrep Kit(Qiagen)分离DNA。对5个克隆的DNA进行测序，确认序列变化。从所述DNA表达蛋白质并按照Lehmann等，1999中所述进行纯化。纯化的蛋白质可用作生物系统中的Rho拮抗剂。
为了制备重组BA-05(SEQ ID NO：3)，将含有相应cDNA(pGEX-4T/BA-05)的质粒转化到细菌株系XL-1 blue感受态大肠杆菌中。将所述细菌培养于含50ug/ml(BMC-Roche)氨苄青霉素的L-肉汤(10g/L细菌胰蛋白胨(Bacto-Tryptone)，5g/L酵母提取物(Yeast Extract)，10g/L NaCl)中，置于摇动保温器中37℃300rpm 1个小时。加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(Gibco)至0.5mM的最终浓度以诱导重组蛋白的产生，所述培养物于37℃，250rpm再培养6小时。4℃在250ml离心瓶中7000rpm离心6分钟，得到细菌沉淀。将每个沉淀重悬于加有1mM PMSF的10ml缓冲液A(50mM Tris，pH 7.5，50mM NaCl，5mM MgCl.2，1mM DTT)中。收集所有重悬的颗粒并转移到置于冰上的100ml塑料杯中。将剩余的含PMSF的缓冲液A加到收集的样品中。用Branson Sonifier 450探针超声仪超声处理细菌样品6×20秒。超声处理期间将细菌和探针于冰上冷却1分钟。4℃，将超声处理样品置于Sorvall SS-34转子中16,000rpm离心12分钟以使上清澄清。将上清转移到新的SS-34试管中，4℃12,000rpm再次离心12分钟。将共计20ml的谷胱甘肽-琼脂糖珠子(Sigma)加到澄清的溶菌液中，置于旋转盘上2至3小时。用缓冲液B(缓冲液A，NaCl为150mM，无PSMF)洗涤珠子4次，然后用缓冲液C(缓冲液B+2.5mM CaCl2)洗涤2次。直至珠子成为稠浆时将最终的洗涤液倒掉。为了去除来自重组蛋白的谷胱甘肽S转移酶序列，加入20U的凝血酶(牛，无纤溶酶原(Plasminogen)，Calbiochem)，将珠子留在旋转仪上4℃过夜。珠子用凝血酶裂解后装载到空白的20ml柱子中。通过用PBS洗脱，共收集到大约20份的1ml样品。将每份0.5ul的样品在硝化纤维素上点样，用氨基黑(Amido Black)染色以测定蛋白峰。收集含融合蛋白的等分试样，加入100微升的对氨基苯甲醚(p-aminobenzamidine)琼脂糖珠子(Sigma)，使之4℃混合15分钟。此最后步骤去除了来自重组蛋白样品的凝血酶。离心重组蛋白以除去珠子，然后用centriprep-10浓缩剂(Amicon)浓缩。浓缩的重组蛋白用PD-10柱子(Pharmacia，含Sephadex G-25M)脱盐，收集10份0.5ml的样品。对这些样品进行斑点印迹试验(dot-blot)以测定蛋白峰，收集适当的等分试样，过滤除菌，-80℃保存。用蛋白质试验(DC assay，Biorad)来测定重组蛋白的浓度。以SDS-PAGE测定样品的纯度，用NG-108细胞进行生物活性生物试验。
该过程的产物可以包含一般实施例中所述的融合蛋白如BA-14，或者包含通过克隆方法制备的新的融合蛋白，这样的融合蛋白具有例如与BA-14分子或对照的C3蛋白如BA-05的分子量和Rho灭活生物试验中的活性不同的性质。这些新的融合蛋白可能包含C3序列，并且由于所使用的方法而在羧基端有变化。
实施例21
融合蛋白BA-07的制备
实施例1的方法可用于制备融合蛋白BA-07，其含有以下的氨基酸序列：
Met Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn Gln
 1               5                  10                  15
Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln Ala
            20                  25                  30
Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys Ser
        35                  40                  45
Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile Asn
    50                  55                  60
Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser Asn
65                  70                  75                  80
Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met Lys
                85                  90                  95
Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr Leu
            100                 105                 110
Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile Asn
        115                 120                 125
Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp Arg
    130                 135                 140
Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln Phe
145                 150                 155                 160
Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser Lys
                165                 170                 175
Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gln Leu Glu Met
            180                 185                 190
Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu Ser
        195                 200                 205
Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr Ala
    210                 215                 220
Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly Arg
225                 230                 235                 240
His Thr Pro Gly Thr Arg Leu
                245         (SEQ ID NO：57)
设计了两个PCR引物以将一个系列的重组构建体(BA-05)转移到pET-9a载体(Novagen，Madison，Wisconsin)中，当在适当的表达系统中表达时生产BA-07蛋白：上游引物：5′GGATCTGGTTCCGCGT CATATGTCTAGAGTCGACCTG 3′(Seq ID NO：38)下游引物：5′CGC GGATCCATTAGTTCTCCTTCTTCCACTTC 3′(SEQ IDNO：39)。Seq ID NO：395′末端的BamHI位点为 ggatccatta；TGA由TAAT所置换(atta，在SEQ ID NO：39中)。
用于使用Pfu聚合酶扩增所述产物的程序包括：95℃5′1个循环，然后94℃2′→56℃2′→70℃2′10个循环，然后94℃2′→70℃3′30个循环，4℃保温。可以使用QIAEXII试剂盒(Qiagen)纯化含有所需DNA条带的琼脂糖凝胶片段。按照生产商的使用说明(New England BioLabs，Beverly，MA)，用BamHI和NdeI消化插入序列和载体，用琼脂糖凝胶电泳和QIAEXII试剂盒(Qiagen)纯化，按照生产商的使用指导，与T4 DNA连接酶一起保温过夜。
用连接混合物转化大肠杆菌(DH5alpha，或优选，XL1-Blue)。可以通过小规模诱导和SDS-GAGE检查克隆，并使用抗C3抗体进行粗制溶菌液的免疫印迹来确定。纯化质粒DNA，并可评估纯度。可以进行DNA测序(例如，使用LiCor技术，该技术中对整条链的克隆全长进行测序)。
以此方式(pET3a-BA-07，SEQ ID NO：7)制备第一构建体，其与构建体pGEX/BA-05的理论DNA序列可接受地相匹配，由于克隆策略，在5`端稍有变化。
可以按照生产商的使用说明，通过使用BamHI和NdeI(New EnglandBioLabs，Beverly，MA)切割pET3a构建体，从pET3a-BA-07中将插入序列亚克隆到pET9a载体中，由此可以制备第二构建体pET9a-BA-07。可以用同样的酶切割pET9a质粒DNA。可以通过琼脂糖凝胶电泳纯化插入的DNA和载体DNA。可以用T4DNA连接酶(New England BioLabs，Beverly，MA)将插入序列连接到新的载体中。连接的DNA可以转化到DH5alpha细胞中，可以用QIAGEN mini和maxi试剂盒制备DNA。可以同时在两个方向通过插入序列的限制性消化和DNA测序以定性克隆(例如，BioS&T，Lachine，Quebec)。可以将构建体DNA转化到BL21(DE3)细胞和BL21(DE3)/pLysS细胞(Novagen，Madison，WI)或另一适合的表达系统中。
实施例22
用于测定细胞增殖的氚标记的胸苷吸收的一般方法
3H-胸苷掺入试验
检测细胞系的支原体，发现在研究开始前是阴性的。细胞系从美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD)获得。HEC-1B细胞系培养于添加有10％胎牛血清(FBS)和1％HEPES的Eagle极限必需培养基(EaglesMinimal Essential Medium，E-MEM)中。Caco-2细胞系培养于添加有20％FBS，1％HEPES，1mM丙酮酸钠和0.1mM非必需氨基酸的E-MEM中。SK-MEL-1细胞系培养于添加有10％FBS和1％HEPES的McCoy’s基本培养基中。体积为100μl的每种2X C3-07工作溶液、阳性和媒介对照在含有细胞(4×103/100μl)的96孔微板上一式三份铺板，得到200μl的终体积。将这些平板放置于37℃、湿度为100％以及5％CO2的保温器中。保温约54小时后，将含1.0μCi，体积为20μl的氚标记胸苷(3H-胸苷)(ICN，Montreal，Canada)加至每个孔中。3H-胸苷于添加有10％FBS的RPMI-1640中制备。如上述在相同条件下将培养物再保温18个小时。
保温结束时，用自动细胞收集器(Tomtec)收获细胞，用微孔板闪烁发光计数仪(TopCount NXT，Packard)测定3H-胸苷的每分钟掺入数(cpm)。将由BA-07融合蛋白处理的孔所得到的数值与媒介对照的数值相比较。以每分钟掺入数(cpm)为y轴，融合蛋白剂量为X轴，利用所得数据绘制曲线。
                       序列表
<110>比奥阿克松医疗技术股份有限公司
<120>治疗肿瘤扩散的肉毒梭菌C3外转移酶组合物和方法
<130>16627-2PCT
<150>US 10/902,879
<151>2004-08-02
<150>US 60/506,162
<151>2003-09-29
<160>59
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)cDNA中去除终止密码子的寡核苷酸。
<400>1
gaattcttta ggattgatag ctgtgcc                                   27
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)cDNA中去除终止密码子的寡核苷酸。
<400>2
ggtggcgacc atcctccaaa a                                                         21
<210>3
<211>888
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>C3APL的序列：包括ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)和触角足序列。
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(888)
<223>
<400>3
gga tcc tct aga gtc gac ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat          48
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
1               5                   10                  15
caa aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa                96
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
gca aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa               144
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
tca gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata               192
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
aat gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca               240
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
aat tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg               288
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
aag acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat               336
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                 105                 110
tta gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att               384
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
aat aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat               432
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
aga ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtc tct caa               480
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
ttt gca gga aga cca att att aca caa ttt aaa gta gca aaa ggc tca               528
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
aag gca gga tat att gac cct att agt gct ttt cag gga caa ctt gaa               576
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
atg ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg               624
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
tct tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca               672
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
gct atc aat cct aaa gaa ttc gtg atg gaa tcc cgc aaa cgc gca agg               720
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Glu Ser Arg Lys Arg Ala Arg
225                 230                 235                 240
cag aca tac acc cgg tac cag act cta gag cta gag aag gag ttt cac               768
Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe His
                245                 250                 255
ttc aat cgc tac ttg acc cgt cgg cga agg atc gag atc gcc cac gcc               816
Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile Glu Ile Ala His Ala
            260                 265                 270
ctg tgc ctc acg gag cgc cag ata aag att tgg ttc cag aat cgg cgc               864
Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
        275                 280                 285
atg aag tgg aag aag gag aac tga                                               888
Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn
    290                 295
<210>4
<211>295
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C3APLT的序列：包括ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)和触角足序列。
<400>4
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
1               5                   10                  15
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                 105                 110
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Glu Ser Arg Lys Arg Ala Arg
225                 230                 235                 240
Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe His
                245                 250                 255
Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile Glu Ile Ala His Ala
            260                 265                 270
Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
        275                 280                 285
Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn
    290                 295
<210>5
<211>774
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>C3APS的序列：包括ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)和触角足序列。
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(774)
<223>
<400>5
gga tcc tct aga gtc gac ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat                48
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
1               5                   10                  15
caa aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa                96
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
gca aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa                 144
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
tca gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata                 192
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
aat gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca                 240
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
aat tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg                 288
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
aag acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat                 336
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                 105                 110
tta gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att                 384
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
aat aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat                 432
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
aga ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtc tct caa                 480
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
ttt gca gga aga cca att att aca caa ttt aaa gta gca aaa ggc tca                 528
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
aag gca gga tat att gac cct att agt gct ttt cag gga caa ctt gaa                 576
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
atg ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg                 624
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
tct tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca                 672
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
gct atc aat cct aaa gaa ttc cgc cag atc aag att tgg ttc cag aat                 720
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn
225                 230                 235                 240
cgt cgc atg aag tgg aag aag gtc gac tcg agc ggc cgc atc gtg act                 768
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Val Asp Ser Ser Gly Arg Ile Val Thr
                245                 250                 255
gac tga                                                                         774
Asp
<210>6
<211>257
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C3APS的序列：包括ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)和触角足序列。
<400>6
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
1               5                   10                  15
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                 105                 110
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
l45                 150                 155                 l60
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn
225                 230                 235                 240
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Val Asp Ser Ser Gly Arg Ile Val Thr
                245                 250                 255
Asp
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增触角足序列的寡核苷酸
<400>7
gaatcccgca aacgcgcaag gcag                                                24
<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增触角足序列的寡核苷酸
<400>8
tcagttctcc ttcttccact tcatgcg                                             27
<210>9
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆来自触角足基因的序列的寡核苷酸
<400>9
aattccgcca gatcaagatt tggttccaga atcgtcgcat gaagtggaag aagg               54
<210>10
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆来自触角足基因的序列的寡核苷酸
<400>    10
ggcggtctag ttctaaacca agctcttagc agcgtagttc accttcttcc agct            54
<210>11
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增相应于HIv-1 Tat的氨基酸27-72的序列的寡核苷酸
<400>11
gaatccaagc atccaggaag tcagcc                                           26
<210>12
<21l>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增相应于HIV-1 Ta七的氨基酸27-72的序列的寡核苷酸
<400>12
accagccacc accttctgat a                                                         21
<210>13
<211>876
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>C3-TL的序列：包括ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)和HIV-1 Tat序列。
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(876)
<223>
<400>13
gga tcc tct aga gtc gac ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat                 48
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
1               5                   10                  15
caa aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa                 96
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
gca aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa                 144
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
tca gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata                 192
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
aat gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca                 240
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
aat tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg                 288
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
aag acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat                 336
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                 105                 110
tta gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att                 384
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
aat aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat                 432
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
aga ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtc tct caa                 480
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
ttt gca gga aga cca att att aca caa ttt aaa gta gca aaa ggc tca                 528
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
aag gca gga tat att gac cct att agt gct ttt cag gga caa ctt gaa                 576
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
atg ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg                 624
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
tct tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca                 672
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
gct atc aat cct aaa gaa ttc aag cat cca gga agt cag cct aaa act                 720
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Lys His Pro Gly Ser Gln Pro Lys Thr
225                 230                 235                 240
gct tgt acc aat tgc tat tgt aaa aag tgt tgc ttt cat tgc caa gtt                 768
Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe His Cys Gln Val
                245                 250                 255
tgt ttc ata aca aaa gcc tta ggc atc tcc tat ggc agg aag cgg aga                 816
Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Arg Arg
            260                 265                 270
cag cga cga aga gct cat cag aac agt cag act cat caa gct tct cta                 864
Gln Arg Arg Arg Ala His Gln Asn Ser Gln Thr His Gln Ala Ser Leu
        275                 280                 285
tca aag cag taa                                                       876
Ser Lys Gln
    290
<210>14
<211>291
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C3-TL的序列：包括ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)和HIV-1 Tat序列。
<400>14
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
1               5                   10                  15
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                 105                 110
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
210                 215                 220
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Lys His Pro Gly Ser Gln Pro Lys Thr
225                 230                 235                 240
Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe His Cys Gln Val
                245                 250                 255
Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Arg Arg
            260                 265                 270
Gln Arg Arg Arg Ala His Gln Asn Ser Gln Thr His Gln Ala Ser Leu
        275                 280                 285
Ser Lys Gln
    290
<210>15
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆来自HIV-1 Tat的序列的寡核苷酸
<400>15
aattctatgg tcgtaaaaaa cgtcgtcaac gtcgtcgtg                                       39
<210>16
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆来自HIV-1 Tat的序列的寡核苷酸
<400>16
gataccagca ttttttgcag cagttgcagc agcacagct                                       39
<210>17
<211>756
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>C3-TS的序列：包括ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)和HIV-1 Tat序列。
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(756)
<223>
<400>17
gga tcc tct aga gtc gac ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat                  48
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
1               5                   10                  15
caa aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa                  96
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
gca aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa                 144
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
tca gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata                 192
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
aat gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca                 240
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
aat tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg                 288
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
aag acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat                 336
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                 105                 110
tta gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att                 384
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
aat aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat                 432
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
aga ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtc tct caa                 480
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
ttt gca gga aga cca att att aca caa ttt aaa gta gca aaa ggc tca                 528
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
aag gca gga tat att gac cct att agt gct ttt cag gga caa ctt gaa                 576
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
atg ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg                 624
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
tct tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca                 672
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
gct atc aat cct aaa gaa ttc tat ggt gct aaa aaa cgt cgt caa cgt                 720
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Tyr Gly Ala Lys Lys Arg Arg Gln Arg
225                 230                 235                 240
cgt cgt gtc gac tcg agc ggc ccg cat cgt gac tga                                 756
Arg Arg Val Asp Ser Ser Gly Pro His Arg Asp
                245                 250
<210>18
<211>251
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C3-TS的序列：包括ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)和HIV-1 Tat序列。
<400>18
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
1               5                   10                  15
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                 105                 110
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Tyr Gly Ala Lys Lys Arg Arg Gln Arg
225                 230                 235                 240
Arg Arg Val Asp Ser Ser Gly Pro His Arg Asp
                245                 250
<210>19
<211>1413
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包括GST序列、ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)序列和任意的碱性氨基酸序列。
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1413)
<223>
<400>19
atg tcc cct ata cta ggt tat tgg aaa att aag ggc ctt gtg caa ccc                  48
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1               5                   10                  15
act cga ctt ctt ttg gaa tat ctt gaa gaa aaa tat gaa gag cat ttg                  96
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
            20                  25                  30
tat gag cgc gat gaa ggt gat aaa tgg cga aac aaa aag ttt gaa ttg                 144
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
        35                  40                  45
ggt ttg gag ttt ccc aat ctt cct tat tat att gat ggt gat gtt aaa                 192
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60
tta aca cag tct atg gcc atc ata cgt tat ata gct gac aag cac aac                 240
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65                  70                  75                  80
atg ttg ggt ggt tgt cca aaa gag cgt gca gag att tca atg ctt gaa                 288
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
                85                  90                  95
gga gcg gtt ttg gat att aga tac ggt gtt tcg aga att gca tat agt                 336
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
            100                 105                 110
aaa gac ttt gaa act ctc aaa gtt gat ttt ctt agc aag cta cct gaa                 384
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
        115                 120                 125
atg ctg aaa atg ttc gaa gat cgt tta tgt cat aaa aca tat tta aat                 432
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
    130                 135                 140
ggt gat cat gta acc cat cct gac ttc atg ttg tat gac gct ctt gat                 480
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145                 150                 155                 160
gtt gtt tta tac atg gac cca atg tgc ctg gat gcg ttc cca aaa tta                 528
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
                165                 170                 175
gtt tgt ttt aaa aaa cgt att gaa gct atc cca caa att gat aag tac                 576
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
            180                 185                 190
ttg aaa tcc agc aag tat ata gca tgg cct ttg cag ggc tgg caa gcc                 624
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
        195                 200                 205
acg ttt ggt ggt ggc gac cat cct cca aaa tcg gat ctg gtt ccg cgt                 672
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg
    210                 215                 220
gga tcc tct aga gtc gac ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat                 720
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
225                 230                 235                 240
caa aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa                 768
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
                245                 250                 255
gca aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa                 816
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
            260                 265                 270
tca gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata                 864
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
        275                 280                 285
aat gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca                 912
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
    290                 295                 300
aat tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg                 960
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
305                 310                 315                 320
aag acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat                1008
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
                325                 330                 335
tta gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att                1056
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
            340                 345                 350
aat aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat                1104
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
        355                 360                 365
aga ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtt tct caa                1152
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
        370                 375                 380
ttt gca gga aga cca att att aca aaa ttt aaa gta gca aaa ggc tca                1200
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
385                 390                 395                 400
aag gca gga tat att gac cct att agt gct ttt cag gga caa ctt gaa                1248
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
                405                 410                 415
atg ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg                1296
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
            420                 425                 430
tct tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca                1344
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
        435                 440                 445
gct atc aat cct aaa gaa ttc aga agg aaa caa aga aga aaa aga aga                1392
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Arg Arg Lys Gln Arg Arg Lys Arg Arg
    450                 455                 460
ctg cag gcg gcc gca tcg tga                                                    1413
Leu Gln Ala Ala Ala Ser
465                 470
<210>20
<211>470
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>包括GST序列、ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)序列和任意的碱性氨基酸序列。
<400>20
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1               5                   10                  15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
            20                  25                  30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
        35                  40                  45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65                  70                  75                  80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
                85                  90                  95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
            100                 105                 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
        115                 120                 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
    130                 135                 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145                 150                 155                 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
                165                 170                 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
            180                 185                 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
        195                 200                 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg
    210                 215                 220
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
225                 230                 235                 240
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
                245                 250                 255
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
            260                 265                 270
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
        275                 280                 285
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
    290                 295                 300
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
305                 310                 315                 320
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
                325                 330                 335
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
            340                 345                 350
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
        355                 360                 365
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
    370                 375                 380
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
385                 390                 395                 400
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
                405                 410                 415
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp MetArg Leu
            420                 425                 430
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
        435                 440                 445
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Arg Arg Lys Gln Arg Arg Lys Arg Arg
    450                 455                 460
Leu Gln Ala Ala Ala Ser
465                 470
<210>21
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C3Basicl的任意碱性氨基酸序列
<400>21
Lys Arg Arg Arg Arg Arg Pro Lys Lys Arg Arg Arg Ala Lys Arg Arg
1               5                   10                  15
<210>22
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆C3Basicl中的任意碱性氨基酸序列的寡核苷酸
<400>22
aagagaaggc gaagaagacc taagaagaga cgaagggcga agaggaga                          48
<210>23
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆C3Basicl中的任意碱性氨基酸序列的寡核苷酸
<400>23
ttctcttccg cttcttctgg attcttctct gcttcccgct tctcctct                             48
<210>24
<211>792
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>C3Basicl的序列：包括ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)序列和编码任意碱性氨基酸序列的序列以及组氨酸标记。
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(792)
<223>
<400>24
gga tcc tct aga gtc gac ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat                  48
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asr Ala Tyr Ser Ile Asn
1               5                   10                   15
caa aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa                  96
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
gca aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa                 144
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
tca gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata                 192
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
aat gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca                 240
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
 65                 70                  75                  80
aat tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg                 288
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
aag acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat                 336
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                 105                 110
tta gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att                 384
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
aat aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat                 432
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
aga ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtt tct caa                 480
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
ttt gca gga aga cca att att aca aaa ttt aaa gta gca aaa ggc tca                 528
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
aag gca gga tat att gac cct att agt gct ttt cag gga caa ctt gaa                 576
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
atg ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg                 624
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
tct tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca                 672
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
gct atc aat cct aaa gaa ttc aag aga agg cga aga aga cct aag aag                 720
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Lys Arg Arg Arg Arg Arg Pro Lys Lys
225                 230                 235                 240
aga cga agg gcg aag agg aga cac cac cac cac cac cac gtc gac tcg                 768
Arg Arg Arg Ala Lys Arg Arg His His His His His His Val Asp Ser
245                 250                 255
agc ggc cgc atc gtg act gac tga                                                 792
Ser Gly Arg Ile Val Thr Asp
260
<210>25
<211>263
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C3Basicl的序列：包括ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)序列和编码任意碱性氨基酸序列的序列以及组氨酸标记。
<400>25
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Ash Ala Tyr Ser Ile Asn
1               5                   10                  15
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                 105                 110
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Lys Arg Arg Arg Arg Arg Pro Lys Lys
225                 230                 235                 240
Arg Arg Arg Ala Lys Arg Arg His His His His His His Val Asp Ser
                 245                 250                 255
Ser Gly Arg Ile Val Thr Asp
            260
<210>26
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C3Basic2的任意碱性氨基酸序列
<400>26
Lys Arg Arg Arg Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1               5                   10
<210>27
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆C3Basic2中的任意碱性氨基酸序列的寡核苷酸
<400>27
aagcgtcgac gtagaaagaa acgtagacag cgtagacgt                                    39
<210>28
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆C3Basic2中的任意碱性氨基酸序列的寡核苷酸
<400>28
ttcgcagctg catctttctt tgcatctgtc gcatctgca                                    39
<210>29
<211>783
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>C3Basic2的序列：包括来自ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)的序列和编码任意碱性氨基酸序列的序列以及组氨酸标记。
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(783)
<223>
<400>29
gga tcc tct aga gtc gac ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat                  48
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
1               5                   10                  15
caa aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa                  96
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
gca aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa                 144
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
tca gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata                 192
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
aat gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca                 240
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
aat tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg                 288
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
aag acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat                 336
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                 105                 110
tta gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att                 384
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
aat aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat                 432
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
aga ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtt tct caa                 480
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
ttt gca gga aga cca att att aca aaa ttt aaa gta gca aaa ggc tca                 528
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
aag gca gga tat att gac cct att agt gct ttt cag gga caa ctt gaa                 576
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
atg ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg                 624
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
tct tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca                 672
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
gct atc aat cct aaa gaa ttc aag cgt cga cgt aga aag aaa cgt aga                 720
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Lys Arg Arg Arg Arg Lys Lys Arg Arg
225                 230                 235                 240
cag cgt aga cgt cac cac cac cac cac cac gtc gac tcg agc ggc cgc                 768
Gln Arg Arg Arg His His His His His His Val Asp Ser Ser Gly Arg
                245                 250                 255
atc gtg act gac tga                                                             783
Ile Val Thr Asp
            260
<210>30
<211>260
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C3Basic2的序列：包括来自ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)的序列和编码任意碱性氨基酸序列的序列以及组氨酸标记。
<400>30
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
1               5                   10                  15
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
               85                  90                  95
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                 105                 110
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Lys Arg Arg Arg Arg Lys Lys Arg Arg
225                 230                 235                 240
Gln Arg Arg Arg His His His His His His Val Asp Ser Ser Gly Arg
                245                 250                 255
Ile Val Thr Asp
            260
<210>31
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C3Basic3的反向HIV-1 Tat氨基酸序列
<400>31
Arg Arg Lys Gln Arg Arg Lys Arg Arg
1               5
<210>32
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆C3Basic3中的反向HIV Tat序列的寡核苷酸
<400>32
agaaggaaac aaagaagaaa aagaaga                                                              27
<210>33
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆C3Basic3中的反向HIV Tat序列的寡核苷酸
<400>33
tcttcctttg tttcttcttt ttcttct                                                    27
<210>34
<211>771
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>C3Basic3的序列：包括来自ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)的序列和编码反向HIV Tat序列的序列以及组氨酸标记。
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(771)
<223>
<400>34
gga tcc tct aga gtc gac ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat                  48
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
1               5                   10                  15
caa aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa                  96
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
gca aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa                 144
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
tca gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata                 192
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
aat gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca                 240
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
aat tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg                 288
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
aag acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat                 336
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp ProAla Tyr
            100                 105                 110
tta gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att                 384
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
aat aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat                 432
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
aga ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtt tct caa                 480
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
ttt gca gga aga cca att att aca aaa ttt aaa gta gca aaa ggc tca                 528
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
aag gca gga tat att gac cct att agt gct ttt cag gga caa ctt gaa                 576
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
atg ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg                 624
Met Leu Leu ProArg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
tct tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca                 672
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
gct atc aat cct aaa gaa ttc aga agg aaa caa aga aga aaa aga aga                 720
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Arg Arg Lys Gln Arg Arg Lys Arg Arg
225                 230                 235                 240
cac cac cac cac cac cac gtc gac tcg agc ggc cgc atc gtg act gac                 768
His His His His His His Val Asp Ser Ser Gly Arg Ile Val Thr Asp
                245                 250                 255
tga                                                                              771
<210>35
<211>256
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C3Basic3的序列：包括来自ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)的序列和编码反向HIV Tat序列的序列以及组氨酸标记。
<400>35
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
1               5                   10                  15
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                 105                 110
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Arg Arg Lys Gln Arg Arg Lys Arg Arg
225                 230                 235                 240
His His His His His His Val Asp Ser Ser Gly Arg Ile Val Thr Asp
                245                 250                 255
<210>36
<211>887
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>C3APLT的序列：包括来自ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)的序列和编码富含脯氨酸区域的序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(747)
<223>
<400>36
gga tcc tct aga gtc gac ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat                  48
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
1               5                   10                  15
caa aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa                  96
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
gca aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa                 144
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
tca gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata                 192
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
aat gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca                 240
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
aat tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg                 288
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
aag acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat                 336
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                 105                 110
tta gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att                 384
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
aat aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat                 432
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
aga ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtt tct caa                 480
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
ttt gca gga aga cca att att aca aaa ttt aaa gta gca aaa ggc tca                 528
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
aag gca gga tat att gac cct att agt gct ttt gca gga caa ctt gaa                 576
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
atg ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg                 624
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
tct tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca                 672
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
gct atc aat cct aaa gaa ttc gtg atg aat ccc gca aac gcg caa ggc                   720
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly
225                 230                 235                 240
aga cat aca ccc ggt acc aga ctc tag agctagagaa ggagtttcac                         767
Arg His Thr Pro Gly Thr Arg Leu
                245
ttcaatcgct acttgacccg tcggcgaagg atcgagatcg cccacgccct gtgcctcacg                 827
gagcgccaga taaagatttg gttccagaat cggcgcatga agtggaagaa ggagaactga                 887
<210>37
<211>248
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C3APLT的序列：包括来自ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)的序列和编码富含脯氨酸区域的序列
<400>37
Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn
1               5                   10                  15
Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln
            20                  25                  30
Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys
        35                  40                  45
Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile
    50                  55                  60
Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser
65                  70                  75                  80
Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met
                85                  90                  95
Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr
            100                 105                 110
Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile
        115                 120                 125
Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp
    130                 135                 140
Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln
145                 150                 155                 160
Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser
                165                 170                 175
Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gln Leu Glu
            180                 185                 190
Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu
        195                 200                 205
Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr
    210                 215                 220
Ala Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly
225                 230                 235                 240
Arg His Thr Pro Gly Thr Arg Leu
                245
<210>38
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆pET载体中的C3APLT的寡核苷酸
<400>38
ggatctggtt ccgcgtcata tgtctagagt cgacctg                                        37
<210>39
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于克隆pET载体中的C3APLT的寡核苷酸
<400>39
cgcggatcca ttagttctcc ttcttccact tc                                              32
<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于C3APLT测序的寡核苷酸
<400>40
aaattaatac gactcactat aggg                                                   24
<210>41
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于C3APLT测序的寡核苷酸
<400>41
gctagttatt gctcagcgg                                                         19
<210>42
<211>888
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pET载体中C3APLT的序列：包括来自ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)的序列和编码富含脯氨酸区域的序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(744)
<223>
<400>42
atg tct aga gtc gca ctg cag gca tgc aat gct tat tcc att aat caa                  48
Met Ser Arg Val Ala Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn Gln
1               5                   10                  15
aag gct tat tca aat act tac cag gag ttt act aat att gat caa gca                  96
Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln Ala
            20                  25                  30
aaa gct tgg ggt aat gct cag tat aaa aag tat gga cta agc aaa tca                 144
Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys Ser
        35                  40                  45
gaa aaa gaa gct ata gta tca tat act aaa agc gct agt gaa ata aat                 192
Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile Asn
    50                  55                  60
gga aag cta aga caa aat aag gga gtt atc aat gga ttt cct tca aat                 240
Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser Asn
65                  70                  75                  80
tta ata aaa caa gtt gaa ctt tta gat aaa tct ttt aat aaa atg aag                 288
Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met Lys
                85                  90                  95
acc cct gaa aat att atg tta ttt aga ggc gac gac cct gct tat tta                 336
Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr Leu
            100                 105                 110
gga aca gaa ttt caa aac act ctt ctt aat tca aat ggt aca att aat                 384
Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile Asn
        115                 120                 125
aaa acg gct ttt gaa aag gct aaa gct aag ttt tta aat aaa gat aga                 432
Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp Arg
    130                 135                 140
ctt gaa tat gga tat att agt act tca tta atg aat gtt tct caa ttt                 480
Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln Phe
145                 150                 155                 160
gca gga aga cca att att aca aaa ttt aaa gta gca aaa ggc tca aag                 528
Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser Lys
                165                 170                 175
gca gga tat att gac cct att agt gct ttt gca gga caa ctt gaa atg                 576
Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gln Leu Glu Met
            180                 185                 190
ttg ctt cct aga cat agt act tat cat ata gac gat atg aga ttg tct                 624
Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu Ser
        195                 200                 205
tct gat ggt aaa caa ata ata att aca gca aca atg atg ggc aca gct                 672
Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr Ala
    210                 215                 220
atc aat cct aaa gaa ttc gtg atg aat ccc gca aac gcg caa ggc aga                 720
Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly Arg
225                 230                235                   240
cat aca ccc ggt acc aga ctc tag agctagagaa ggagtttcac ttcaatcgct                774
His Thr Pro Gly Thr Arg Leu
                245
acttgacccg tcggcgaagg atcgagatcg cccacgccct gtgcctcacg gagcgccaga               834
taaagatttg gttccagaat cggcgcatga agtggaagaa ggaggactaa ctga                     888
<210>43
<211>247
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>pET载体中C3APLT的序列：包括来自ADP-核糖转移酶C3(肉毒梭菌)的序列和编码富含脯氨酸区域的序列
<400>43
Met Ser Arg Val Ala Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn Gln
1               5                   10                  15
Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln Ala
            20                  25                  30
Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys Ser
        35                  40                  45
Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile Asn
    50                  55                  60
Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser Asn
65                  70                  75                  80
Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met Lys
                85                  90                  95
Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr Leu
            100                 105                 110
Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile Asn
        115                 120                 125
Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp Arg
    130                 135                 140
Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln Phe
145                 150                 155                 160
Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser Lys
                165                 170                 175
Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gln Leu Glu Met
            180                 185                 190
Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu Ser
        195                 200                 205
Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr Ala
    210                 215                 220
Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly Arg
225                 230                 235                 240
His Thr Pro Gly Thr Arg Leu
                245
<210>44
<211>64
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>来自C3APL的触角足的氨基酸序列
<400>44
Val Met Glu Ser Arg Lys Arg Ala Arg Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe His Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg
            20                  25                  30
Arg Arg Arg Ile Glu Ile Ala His Ala Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln
        35                  40                  45
Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn
    50                  55                  60
<210>45
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>来自C3APS的触角足的氨基酸序列
<400>45
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1               5                   10                  15
Val Asp Ser
<210>46
<211>60
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>来自C3-TL的HIV-1 Tat的氨基酸序列
<400>46
Lys His Pro Gly Ser Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys
1               5                   10                  15
Lys Lys Cys Cys Phe His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu
            20                  25                  30
Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala His Gln
        35                  40                  45
Asn Ser Gln Thr His Gln Ala Ser Leu Ser Lys Gln
    50                  55                  60
<210>47
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>来自C3-TS的HIV-1 Tat的氨基酸序列
<400>47
Tyr Gly Ala Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Val Asp Ser Ser Gly
1               5                   10                  15
Pro His Arg Asp
            20
<210>48
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C3APLT的富含脯氨酸区域的氨基酸序列
<400>48
Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly Arg His Thr Pro Gly Thr Arg
1               5                   10                  15
Leu
<210>49
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>融合于C3蛋白以产生C3 Tat-short的氨基酸序列
<400>49
Tyr Gly Arg Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
 1               5                  10
<210>50
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>融合于C3蛋白以产生C3Basic3的Tat氨基酸的反向序列
<400>50
Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg
 1               5
<210>51
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>富含脯氨酸的转运肽
<400>51
Ala Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro
 1               5                  10
<210>52
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>精子fertilinealpha肽(Sperm fertiline alpha peptide)
<400>52
His Pro Ile Gln Ile Ala Ala Phe Leu Ala Arg Ile Pro Pro Ile Ser
 1               5                  10                  15
Ser Ile Gly Thr Cys Ile Leu Lys
            20
<210>53
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>来自C3Basic3的氨基酸序列
<400>53
Arg Arg Lys Gln Arg Arg Lys Arg Arg
 1               5
<210>54
<211>744
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>C3-07Q189A的序列
<400>54
atgtctagag tcgacctgca ggcatgcaat gcttattcca ttaatcaaaa ggcttattca     60
aatacttacc aggagtttac taatattgat caagcaaaag cttggggtaa tgctcagtat    120
aaaaagtatg gactaagcaa atcagaaaaa gaagctatag tatcatatac taaaagcgct    180
agtgaaataa atggaaagct aagacaaaat aagggagtta tcaatggatt tccttcaaat    240
ttaataaaac aagttgaact tttagataaa tcttttaata aaatgaagac ccctgaaaat    300
attatgttat ttagaggcga cgaccctgct tatttaggaa cagaatttca aaacactctt    360
cttaattcaa atggtacaat taataaaacg gcttttgaaa aggctaaagc taagttttta    420
aataaagata gacttgaata tggatatatt agtacttcat taatgaatgt ttctcaattt    480
gcaggaagac caattattac aaaatttaaa gtagcaaaag gctcaaaggc aggatatatt    540
gaccctatta gtgcttttgc aggagcactt gaaatgttgc ttcctagaca tagtacttat    600
catatagacg atatgagatt gtcttctgat ggtaaacaaa taataattac agcaacaatg    660
atgggcacag ctatcaatcc taaagaattc gtgatgaatc ccgcaaacgc gcaaggcaga  720
catacacccg gtaccagact ctag                                         744
<210>55
<211>247
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C3-07Q189A的氨基酸序列
<400>55
Met Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn Gln
1               5                   10                  15
Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln Ala
            20                  25                  30
Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys Ser
        35                  40                  45
Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile Asn
    50                  55                  60
Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser Asn
65                  70                  75                  80
Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met Lys
                85                  90                  95
Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr Leu
            100                 105                 110
Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile Asn
        115                 120                 125
Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp Arg
    130                 135                 140
Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln Phe
145                 150                 155                 160
Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Gln Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser Lys
                165                 170                 175
Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Gln Gly Ala Leu Glu Met
            180                 185                 190
Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu Ser
        195                 200                 205
Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr Ala
    210                 215                 220
Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly Arg
225                 230                 235                 240
His Thr Pro Gly Thr Arg Leu
                245
<210>56
<211>783
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>BA-05的序列
<400>56
ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aatgcttatt ccattaatca aaaggcttat     60
tcaaatactt accaggagtt tactaatatt gatcaagcaa aagcttgggg taatgctcag    120
tataaaaagt atggactaag caaatcagaa aaagaagcta tagtatcata tactaaaagc    180
gctagtgaaa taaatggaaa gctaagacaa aataagggag ttatcaatgg atttccttca    240
aatttaataa aacaagttga acttttagat aaatctttta ataaaatgaa gacccctgaa    300
aatattatgt tatttagagg cgacgaccct gcttatttag gaacagaatt tcaaaacact    360
cttcttaatt caaatggtac aattaataaa acggcttttg aaaaggctaa agctaagttt    420
ttaaataaag atagacttga atatggatat attagtactt cattaatgaa tgtttctcaa    480
tttgcaggaa gaccaattat tacaaaattt aaagtagcaa aaggctcaaa ggcaggatat    540
attgacccta ttagtgcttt tgcaggacaa cttgaaatgt tgcttcctag acatagtact    600
tatcatatag acgatatgag attgtcttct gatggtaaac aaataataat tacagcaaca    660
atgatgggca cagctatcaa tcctaaagaa ttcgtgatga atcccgcaaa cgcgcaaggc    720
agacatacac ccggtaccag actctagagc tagagaagga gtttcacttc aatcgctact    780
tga                                                                  783
<210>57
<211>247
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>pET9a-BA-07的氨基酸序列
<400>57
Met Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Asn Ala Tyr Ser Ile Asn Gln
 1               5                  10                  15
Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Ile Asp Gln Ala
            20                  25                  30
Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser Lys Ser
        35                  40                  45
Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys Ser Ala Ser Glu Ile Asn
    50                  55                  60
Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile Asn Gly Phe Pro Ser Asn
65                  70                  75                  80
Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys Ser Phe Asn Lys Met Lys
                85                  90                  95
Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly Asp Asp Pro Ala Tyr Leu
            100                 105                 110
Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn Ser Asn Gly Thr Ile Asn
        115                 120                 125
Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys Phe Leu Asn Lys Asp Arg
    130                 135                 140
Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Asn Val Ser Gln Phe
145                 150                 155                 160
Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys Val Ala Lys Gly Ser Lys
                165                 170                 175
Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gln Leu Glu Met
            180                 185                 190
Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile Asp Asp Met Arg Leu Ser
        195                 200                 205
Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala Thr Met Met Gly Thr Ala
    210                 215                 220
Ile Asn Pro Lys Glu Phe Val Met Asn Pro Ala Asn Ala Gln Gly Arg
225                 230                 235                 240
His Thr Pro Gly Thr Arg Leu
                245
<210>58
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>58
cctaaagaat tcgtgatgaa tcccgcaaac gcgca                             35
<210>59
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>59
tgcgcgtttg cgggattcat cacgaattct ttagg                             35

Claims (85)

1.防止或抑制哺乳动物中癌症的转移性肿瘤细胞不受控制的增殖和扩散或迁移的方法，包括对哺乳动物施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物。
2.防止或抑制残留于切除边缘中的转移性肿瘤细胞在靠近哺乳动物中癌症的肿瘤切除部位的宿主组织切除边缘内不受控制的增殖和扩散或迁移的方法，包括施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物，所述施用直接施用于切除边缘的表面上或者施用于切除边缘的表面下，或者施用至靠近仍残留在哺乳动物体内的切除边缘的组织中，所述施用在切除或去除肿瘤之前或之后、或之前和之后的时间间隔中进行。
3.防止来自哺乳动物宿主组织中恶性细胞的肿瘤的生长的方法，包括为所述哺乳动物施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物，其中所述融合蛋白同时防止或抑制以下情况中的至少两种：恶性细胞迁移、恶性细胞增殖、靠近恶性细胞的血管发生或管状结构形成或毛细血管网生长，和从恶性细胞分泌活性金属蛋白酶。
4.防止包含癌症残留肿瘤细胞的第二肿瘤在靠近哺乳动物中癌症的第一肿瘤切除或去除部位的宿主组织的切除边缘内生长的方法，该方法包括施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物，所述施用直接施用在切除边缘的表面上或切除边缘的表面下，或者施用至靠近仍残留在哺乳动物体内的切除边缘的组织中，所述施用在切除或去除第一肿瘤之前或之后、或之前和之后的时间间隔中进行，其中所述融合蛋白同时防止或抑制以下情况中的至少两种：残留肿瘤细胞迁移、残留肿瘤细胞增殖、靠近残留肿瘤细胞的血管发生或管状结构形成或毛细血管网生长，和从残留肿瘤细胞分泌活性金属蛋白酶。
5.权利要求1的方法，其中所述融合蛋白偶联物是BA-05。
6.权利要求1的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、脑癌、结肠癌、皮肤癌、肾脏癌和肝癌所组成的组。
7.权利要求1的方法，其中所述癌症为选自以下肿瘤组成的组的脑肿瘤：神经胶质瘤、神经元瘤、松果体瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、淋巴瘤、畸形瘤、和位于脑中的衍生自肺、乳腺、黑素瘤、肾和胃肠道肿瘤的转移性肿瘤。
8.权利要求1的方法，其中所述癌症为选自以下肿瘤组成的组的脑肿瘤：间变型星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、毛发细胞型星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、粘液性乳头状室管膜瘤、亚室管膜瘤、脉络膜丛乳头状瘤、神经母细胞瘤、神经节神经母细胞瘤、神经节瘤，以及髓母细胞瘤、松果体母细胞瘤和松果体细胞瘤、脑膜瘤、脑膜血管外皮细胞瘤、脑膜肉瘤、雪旺氏瘤(神经鞘瘤)和神经纤维瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发和继发亚型霍奇金淋巴瘤、原发和继发亚型非霍奇金淋巴瘤、颅咽管瘤、上皮样囊肿、皮样囊肿和胶体囊肿。
9.权利要求1的方法，其中所述治疗有效量为约0.001微克每cc至约50微克每cc组织。
10.权利要求1的方法，其中所述治疗有效量为每立方厘米(cc)组织约0.0001微克融合蛋白至每立方厘米组织约100微克融合蛋白。
11.权利要求1的方法，其中所述治疗有效量为每毫升约1微克至每毫升约10微克至每毫升约50微克。
12.权利要求1的方法，其中所述施用为通过注射、局部应用、或通过植入施用。
13.权利要求1的方法，其中所述施用选自经关节内、经眼内、经鼻内、经神经内、经皮内、经骨内、经舌下、口服、局部、经膀胱内、经鞘内、经静脉内、经腹膜内、经颅内、经肌肉内、经皮下、经吸入、经雾化吸入、直接应用于肿瘤内、直接应用于疾病部位、直接应用于肿瘤切除后残留的边缘上或边缘内、经肠、经肠和胃镜检方法一起、以及ECRP施用所组成的组。
14.权利要求1的方法，其中所述多肽性细胞膜转运部分包含含有约5至约50个氨基酸的肽。
15.权利要求1的方法，其中所述肉毒梭菌C3外转移酶单位包含融合蛋白BA-05的序列所示的氨基酸序列。
16.权利要求1的方法，其中所述功能类似物包含这样的蛋白，其显示的活性为野生型肉毒梭菌C3外转移酶活性的50％至500％。
17.权利要求1的方法，其中所述药物组合物包含可药用的载体。
18.权利要求1的方法，其中所述药物组合物包含选自以下物质组成的组的可药用载体：乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、PVA、部分水解的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、乙烯-醋酸乙烯酯-乙烯醇共聚物、交联的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、交联的部分水解的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、交联的乙烯-醋酸乙烯酯-乙烯醇共聚物、聚-D，L-乳酸、聚-L-乳酸、聚乙醇酸、PGA、乳酸与乙醇酸共聚物、聚己内酯、聚戊内酯、聚酸酐、聚己内酯与聚乙二醇的共聚物、聚乳酸与聚乙二醇的共聚物、聚乙二醇；及其组合物和混合物。
19.权利要求1的方法，其中所述药物组合物包含含有水明胶、水性蛋白、多聚体载体、交联剂及其组合的可药用的载体。
20.权利要求1的方法，其中所述药物组合物包含含有基质的可药用的载体。
21.权利要求1的方法，其中所述药物组合物包含可药用的载体，所述可药用的载体包含水，可药用的缓冲盐，可药用的缓冲溶液，可药用的抗氧化剂，抗坏血酸，一种或多种低分子量的可药用的多肽，包含约2至约10个氨基酸残基的肽，一种或多种可药用的蛋白，一种或多种可药用的氨基酸，人体必需的氨基酸，一种或多种可药用的碳水化合物，一种或多种可药用的碳水化合物衍生物质，非还原性糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、海藻糖、甘露醇、麦芽糊精、糊精、环式糊精，可药用的螯合剂，EDTA、DTPA、二价金属离子的螯合剂、三价金属离子的螯合剂、谷胱甘肽，可药用的非特异性血清白蛋白，及其组合。
22.权利要求1的方法，其中所述药物组合物是无菌的。
23.权利要求1的方法，其中所述药物组合物是可灭菌的。
24.权利要求1的方法，其中所述药物组合物是已灭菌的。
25.权利要求1的方法，其中所述药物组合物以单位剂量形式或以单位剂量的整倍数形式存在于小瓶中。
26.权利要求1的方法，其中所述药物组合物是干燥的。
27.权利要求1的方法，其中所述药物组合物包含脱水的基质。
28.权利要求1的方法，其中所述药物组合物包含可药用的载体。
29.权利要求1的方法，其中所述药物组合物包含冻干的基质中的融合蛋白。
30.包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物的药物组合物的用途，用于防止或抑制哺乳动物中癌症的转移性肿瘤细胞不受控制的增殖和扩散或迁移。
31.包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物的药物组合物的用途，用于防止或抑制残留于切除边缘中的转移性肿瘤细胞在靠近哺乳动物中癌症的肿瘤切除部位的宿主组织切除边缘内的不受控制的增殖和扩散或迁移。
32.包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物的药物组合物的用途，用于防止来自哺乳动物宿主组织中恶性细胞的肿瘤的生长，其中所述融合蛋白同时防止或抑制以下情况中的至少两种：恶性细胞迁移、恶性细胞增殖、靠近恶性细胞的血管发生或管状结构形成或毛细血管网生长，和从恶性细胞分泌活性金属蛋白酶。
33.包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物的药物组合物的用途，用于防止包含癌症残留肿瘤细胞的第二肿瘤在哺乳动物中癌症的第一肿瘤切除或去除部位附近的宿主组织切除边缘内的生长，其中所述融合蛋白同时防止或抑制以下情况中的至少两种：残留肿瘤细胞迁移、残留肿瘤细胞增殖、靠近残留肿瘤细胞的血管发生或管状结构形成或毛细血管网生长，和从残留肿瘤细胞分泌活性金属蛋白酶。
34.权利要求30-33中任一项的用途，其中所述融合蛋白偶联物是BA-05。
35.权利要求30、31或33的用途，其中所述癌症选自乳腺癌、脑癌、结肠癌、皮肤癌、肾癌和肝癌所组成的组。
36.权利要求35的用途，其中所述癌症为选自以下肿瘤组成的组的脑肿瘤：神经胶质瘤、神经元瘤、松果体瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、淋巴瘤、畸形瘤、和位于脑中的衍生自肺、乳腺、黑素瘤、肾和胃肠道肿瘤的转移性肿瘤。
37.权利要求35的用途，其中所述癌症为选自以下肿瘤组成的组的脑肿瘤：间变型星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、毛发细胞型星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、粘液性乳头状室管膜瘤、亚室管膜瘤、脉络膜丛乳头状瘤、神经母细胞瘤、神经节神经母细胞瘤、神经节瘤，以及髓母细胞瘤、松果体母细胞瘤和松果体细胞瘤、脑膜瘤、脑膜血管外皮细胞瘤、脑膜肉瘤、雪旺氏瘤(神经鞘瘤)和神经纤维瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发和继发亚型霍奇金淋巴瘤、原发和继发亚型非霍奇金淋巴瘤、颅咽管瘤、上皮样囊肿、皮样囊肿和胶体囊肿。
38.权利要求30至37中任一项的用途，其中所述药物组合物配制为约0.001微克每cc至约50微克每cc组织的剂量形式。
39.权利要求30至37中任一项的用途，其中所述药物组合物配制为每立方厘米(cc)组织约0.0001微克融合蛋白至每立方厘米组织约100微克融合蛋白的剂量形式。
40.权利要求30至37中任一项的用途，其中所述药物组合物配制为每毫升约1微克至每毫升约10微克至每毫升约50微克的剂量形式。
41.权利要求30至40中任一项的用途，其中所述药物组合物配制成用于经注射、局部应用、或植入施用的剂型。
42.权利要求1、权利要求30至40中任一项的用途，其中所述药物组合物配制成用于通过选自以下方式的组的方式所施用的剂型：经关节内、经眼内、经鼻内、经神经内、经皮内、经骨内、经舌下、口服、局部、经膀胱内、经鞘内、经静脉内、经腹膜内、经颅内、经肌肉内、经皮下、经吸入、经雾化吸入、直接应用于肿瘤内、直接应用于疾病部位、直接应用于肿瘤切除后残留的边缘上或边缘内、经肠、经肠和胃镜检方法一起、以及ECRP。
43.权利要求30至42中任一项的用途，其中所述多肽性细胞膜转运部分包含含有约5至约50个氨基酸的肽。
44.权利要求30至43中任一项的用途，其中所述肉毒梭菌C3外转移酶单位包含融合蛋白BA-05的序列所示的氨基酸序列。
45.权利要求30至44中任一项的用途，其中所述功能类似物包含这样的蛋白，其显示的活性为野生型肉毒梭菌C3外转移酶活性的50％至500％。
46.权利要求30至45中任一项的用途，其中所述药物组合物进一步包含可药用的载体。
47.权利要求46的用途，其中所述可药用的载体选自以下物质组成的组：乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、PVA、部分水解的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、乙烯-醋酸乙烯酯-乙烯醇共聚物、交联的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、交联的部分水解的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、交联的乙烯-醋酸乙烯酯-乙烯醇共聚物、聚-D，L-乳酸、聚-L-乳酸、聚乙醇酸、PGA、乳酸与乙醇酸共聚物、聚己内酯、聚戊内酯、聚酸酐、聚己内酯与聚乙二醇的共聚物、聚乳酸与聚乙二醇的共聚物、聚乙二醇；及其组合物和混合物。
48.权利要求46的用途，其中可药用的载体包含水明胶、水性蛋白、多聚体载体、交联剂及其组合。
49.权利要求46的用途，其中所述可药用的载体包含基质。
50.权利要求46的用途，其中所述可药用的载体包含选自以下物质组成的组中的至少一种载体：水，可药用的缓冲盐，可药用的缓冲溶液，可药用的抗氧化剂，抗坏血酸，低分子量的可药用的多肽，包含约2至约10个氨基酸残基的肽，可药用的蛋白，可药用的氨基酸，人体必需的氨基酸，可药用的碳水化合物，可药用的碳水化合物衍生物质，非还原性糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、海藻糖、甘露醇、麦芽糊精、糊精、环式糊精，可药用的螯合剂，EDTA、DTPA、二价金属离子的螯合剂、三价金属离子的螯合剂、谷胱甘肽，可药用的非特异性血清白蛋白。
51.权利要求30至50中任一项的用途，其中所述药物组合物是无菌的。
52.权利要求30至50中任一项的用途，其中所述药物组合物是可灭菌的。
53.权利要求30至50中任一项的用途，其中所述药物组合物是已灭菌的。
54.权利要求30至53中任一项的用途，其中所述药物组合物以单位剂量形式或以单位剂量的整倍数形式存在于小瓶中。
55.权利要求30至54中任一项的用途，其中所述药物组合物是干燥的。
56.权利要求30至54中任一项的用途，其中所述药物组合物包含脱水的基质。
57.权利要求30至54中任一项的用途，其中所述药物组合物包含冻干的基质中的融合蛋白。
58.包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物的药物组合物在制备药剂中的用途，所述药剂用于防止或抑制哺乳动物中癌症的转移性肿瘤细胞不受控制的增殖和扩散或迁移。
59.包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物的药物组合物在生产药剂中的用途，所述药剂用于防止或抑制残留于切除边缘中的转移性肿瘤细胞在靠近哺乳动物中癌症的肿瘤切除部位的宿主组织切除边缘内不受控制的增殖和扩散或迁移。
60.包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物的药物组合物在制备药剂中的用途，所述药剂用于防止来自哺乳动物宿主组织中恶性细胞的肿瘤的生长，其中所述融合蛋白同时防止或抑制以下情况中的至少两种：恶性细胞迁移、恶性细胞增殖、靠近恶性细胞的血管发生或管状结构形成或毛细血管网生长，和从恶性细胞分泌活性金属蛋白酶。
61.包含含有多肽性细胞膜转运部分和肉毒梭菌C3外转移酶单位或其功能类似物的可透过细胞的融合蛋白偶联物的药物组合物在制备药剂中的用途，所述药剂用于防止包含癌症残留肿瘤细胞的第二肿瘤在哺乳动物中癌症的第一肿瘤切除或去除部位附近的宿主组织切除边缘内的生长，其中所述融合蛋白同时防止或抑制以下情况中的至少两种：残留肿瘤细胞迁移、残留肿瘤细胞增殖、靠近残留肿瘤细胞的血管发生或管状结构形成或毛细血管网生长，和从残留肿瘤细胞分泌活性金属蛋白酶。
62.权利要求58至61中任一项的用途，其中所述融合蛋白偶联物是BA-05。
63.权利要求58、59或61中任一项的用途，其中所述癌症选自乳腺癌、脑癌、结肠癌、皮肤癌、肾癌和肝癌所组成的组。
64.权利要求63的用途，其中所述癌症为选自以下肿瘤组成的组的脑肿瘤：神经胶质瘤、神经元瘤、松果体瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、淋巴瘤、畸形瘤、和位于脑中的衍生自肺、乳腺、黑素瘤、肾和胃肠道肿瘤的转移性肿瘤。
65.权利要求63的用途，其中所述癌症选自以下肿瘤组成的组的脑肿瘤：间变型星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、毛发细胞型星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、粘液性乳头状室管膜瘤、亚室管膜瘤、脉络膜丛乳头状瘤、神经母细胞瘤、神经节神经母细胞瘤、神经节瘤，以及髓母细胞瘤、松果体母细胞瘤和松果体细胞瘤、脑膜瘤、脑膜血管外皮细胞瘤、脑膜肉瘤、雪旺氏瘤(神经鞘瘤)和神经纤维瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发和继发亚型霍奇金淋巴瘤、原发和继发亚型非霍奇金淋巴瘤、颅咽管瘤、上皮样囊肿、皮样囊肿和胶体囊肿。
66.权利要求58至65中任一项的用途，其中所述药物组合物配制为约0.001微克每cc组织至约50微克每cc组织的剂量形式。
67.权利要求58至65中任一项的用途，其中所述药物组合物配制为每立方厘米(cc)组织约0.0001微克融合蛋白至每立方厘米组织约100微克融合蛋白的剂量形式。
68.权利要求58至65中任一项的用途，其中所述药物组合物配制为每毫升约1微克至每毫升约10微克至每毫升约50微克的剂量形式。
69.权利要求58至68中任一项的用途，其中所述药物组合物配制成用于经注射、局部应用、或植入使用的剂型。
70.权利要求1、权利要求58至68中任一项的用途，其中所述药物组合物配制成用于通过选自以下方式的组的方式所施用的剂型：经关节内、经眼内、经鼻内、经神经内、经皮内、经骨内、经舌下、口服、局部、经膀胱内、经鞘内、经静脉内、经腹膜内、经颅内、经肌肉内、经皮下、经吸入、经雾化吸入、直接应用于肿瘤内、直接应用于疾病部位、直接应用于肿瘤切除后残留的边缘上或边缘内、经肠、经肠和胃镜检方法一起、以及ECRP。
71.权利要求58至70中任一项的用途，其中所述多肽性细胞膜转运部分包含含有约5至约50个氨基酸的肽。
72.权利要求58至71中任一项的用途，其中所述肉毒梭菌C3外转移酶单位包含融合蛋白BA-05的序列所示的氨基酸序列。
73.权利要求58至72中任一项的用途，其中所述功能类似物包含这样的蛋白，其显示的活性为野生型肉毒梭菌C3外转移酶活性的50％至500％。
74.权利要求58至73中任一项的用途，其中所述药物组合物进一步包含可药用的载体。
75.权利要求74的用途，其中所述可药用的载体选自以下物质组成的组：乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、PVA、部分水解的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、乙烯-醋酸乙烯酯-乙烯醇共聚物、交联的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、交联的部分水解的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、交联的乙烯-醋酸乙烯酯-乙烯醇共聚物、聚-D，L-乳酸、聚-L-乳酸、聚乙醇酸、PGA、乳酸与乙醇酸共聚物、聚己内酯、聚戊内酯、聚酸酐、聚己内酯与聚乙二醇的共聚物、聚乳酸与聚乙二醇的共聚物、聚乙二醇；及其组合物和混合物。
76.权利要求74的用途，其中所述可药用的载体包含水明胶、水性蛋白、多聚体载体、交联剂及其组合。
77.权利要求74的用途，其中所述可药用的载体包含基质。
78.权利要求74的用途，其中所述可药用的载体包含选自以下物质所组成的组中的至少一种载体：水，可药用的缓冲盐，可药用的缓冲溶液，可药用的抗氧化剂，抗坏血酸，低分子量的可药用的多肽，包含约2至约10个氨基酸残基的肽，可药用的蛋白，可药用的氨基酸，人体必需的氨基酸，可药用的碳水化合物，可药用的碳水化合物衍生物质，非还原性糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、海藻糖、甘露醇、麦芽糊精、糊精、环式糊精，可药用的螯合剂，EDTA、DTPA、二价金属离子的螯合剂、三价金属离子的螯合剂、谷胱甘肽，可药用的非特异性血清白蛋白。
79.权利要求58至78中任一项的用途，其中所述药物组合物是无菌的。
80.权利要求58至78中任一项的用途，其中所述药物组合物是可灭菌的。
81.权利要求58至78中任一项的用途，其中所述药物组合物是已灭菌的。
82.权利要求58至81中任一项的用途，其中所述药物组合物以单位剂量形式或以单位剂量的整倍数形式存在于小瓶中。
83.权利要求58至82中任一项的用途，其中所述药物组合物是干燥的。
84.权利要求58至82中任一项的用途，其中所述药物组合物包含脱水的基质。
85.权利要求58至82中任一项的用途，其中所述药物组合物包含冻干的基质中的融合蛋白。
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