CN1875104A - 来自内皮抑素n－末端的抗血管生成肽 - Google Patents

Abstract

在此提供一种含有内皮抑素N末端的抗血管生成肽，编码它的核酸、含有有效量所述肽及核酸的药物制剂以及所述药物在治疗或防止与不良血管生成相关的疾病或病症中的用途。

Description

来自内皮抑素N-末端的抗血管生成肽

权利声明：

本发明是在政府支持下由国立卫生研究所授予的R0 1CA064481拨款而进行的。政府在本发明中有相当的权利。

背景技术：

内皮抑素(endostatin)，相应于胶原蛋白18C末端的183氨基酸的蛋白水解裂解片段，因其不具毒副作用的抗肿瘤活性，已经成为许多实验室研究的主题。(O′Reilly et al.(1997)Cell，88：277-285.；Kisker et al.(2001)Cancer Res，61：7669-7674；Dhanabal et al.(1999)Cancer Res，59：189-197；Yoon et al.(1999)Cancer Res，59：6251-6256；Folkman and Kalluri，(2003)Cancer Medicine，6th edition，pp.161-194.Hamilton：B.C.DeckerInc.)。关于这个蛋白质已经被报告了许多抗血管生成活性，例如对内皮细胞增殖、迁移、以及形成血管的抑制作用。内皮抑素还抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的血管通透性(Takahashi et al.(2003)Faseb J，17：896-898)。然而，内皮抑素的作用机理仍然是未知的。内皮抑素通过结合α5β1整联蛋白来抑制病灶粘连激酶的磷酸化作用从而抑制内皮细胞迁移(Wickstromet al.(2002)Cancer Res，62：5580-5589)。还已经表明细胞表面磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)是低亲合力的内皮抑素受体(Karumanchi et al.(2001)MolCell，7：811-822)。内皮抑素已经涉及到一些信号传输途径，例如c-myc(Shichiri and Hirata(2001)Faseb J，15：1044-1053)、细胞周期蛋白(cyciin)-D1(Hanai et al.(2002)J Biol Chem，277：16464-16469)以及RhoA活性(Wickstrom et al.(2003)J Biol Chem，278：37895-37901)的下调作用，VEGF信号传输的阻断作用(Hajitou et al.(2002)Faseb J，16：1802-1804；Kimet al.(2002)J Biol Chem，277：27872-27879)，以及wnt信号传输途径的抑制作用(Hanai et al.(2002)J Cell Biol，158：529-539)。此外，内皮抑素还能够结合和灭活金属蛋白酶(Kim et al.(2000)Cancer Res，60：5410-5413；Nyberget al.(2003)J Biol Chem，278：22404-22411；Lee et al.(2002)FEBS Lett，519：147-152)，还能够调节抑制血管生成的一系列基因(Abdollahi et al.(2004)Mol Cell，13：649-663)。

鼠以及人的内皮抑素晶体结构都已经得到了阐明(Hohenester et al.(1998)Embo J，17：1656-1664；Ding et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA，95：10443-10448)，而且在结晶化所需要的高浓度下还显现为一种非共价相结合的二聚物形式(Ding et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA，95：10443-10448)。两二硫键的存在导致高度折叠的构造。每个内皮抑素单体通过分子N末端中的三个组氨酸(组氨酸1，3，和11)以及天冬氨酸76来结合一个锌原子。内皮抑素的肝素结合性质是由集聚在分子立体球状表面之上的非邻接精氨酸介导的(Sasaki et al.(1999)Embo J，18：6240-6248)。

内皮抑素低聚物(NC1以及二聚物)主要与基底膜中的层粘连蛋白结合(Javaherian et al.(2002)J Biol Chem，277：45211-45218)。这种结合对内皮抑素发挥的一些生物学功能来说可能是重要的。另一方面，内皮抑素的肝素结合性质也在它与细胞表面的相互作用中显示出来。很可能内皮抑素有许多由蛋白质不同区域介导的生物学功能。

发明内容：

本发明是基于内皮抑素N末端区域决定了它的抗血管生成活性这个令人吃惊的发现的基础上的。基于上述发现，本发明描述了含有SEQ ID No.2或4的至少约12个氨基酸的抗血管生成肽。示例性的抗血管生成肽选自由SEQ ID No.6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124-131组成的组。

还描述了一种药物组合物，其含有药学上可接受的载体以及有效量的含有SEQ ID No.2或4的至少约12个氨基酸的抗血管生成肽。某些药物由本文所述的抗血管生成蛋白和第二种肽组成。其它的药物组合物还额外包括有效量的锌。还描述了一种装置，例如其中含有在此所述肽的注射器和支架。

更进一步地公开了编码抗血管生成肽的核酸，其中含有SEQ ID No.2或4的至少约12个氨基酸，以及含有在适当载体中的所公开的核酸的药物组合物，所述载体用于表达有效量的抗血管生成肽以给予患者。优选的核酸含有SEQ ID No.1、3或5的至少约36、54或60个核苷酸。其它优选的核酸选自由SEQ ID No.1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121以及123所组成的组。

还提供了使用所述肽治疗或预防疾病或病症的方法，所述疾病或病征由血管生成作用(血管生成相关疾病)例如癌或者肿瘤生长引起。

所述抗血管生成肽的其它特征和有益效果将可以根据对下列详细说明和权利要求的理解而变得更为明显。

附图说明：

图1为显示用人内皮抑素肽治疗人胰腺癌(BxPC3)的图。

图2A-C图示内皮抑素的N末端结构域负责其抗肿瘤特性。图2A为显示用鼠Fc-内皮抑素和鼠肽P1，P2，P5，以及P6(分别为mP1，mP2，mP5以及mP6)治疗LLC的图表；图2B为LLC切片的图像，显示CD31染色；图2C为显示测定血管密度(^*p＜0.015比对磷酸缓冲液(对照))的图；而图2D为显示内皮抑素晶体结构的示意图。

图3A-E为显示内皮抑素的锌结合位点对抗肿瘤活性很重要的图。图3A为mP1和mP1-H1/3A的示意图；图3B为显示锌结合mP1和mP1-H1/3A的图；图3C为显示用mP1和mP1-H1/3A治疗LLC的图；图3D显示CD31染色的LLC肿瘤切片图像；而图3E为显示测定血管密度的图。

图4为显示用有或没有锌的mP1或者mP1-H每日两次治疗LLC时，在第4，7，10以及14天的老鼠肿瘤体积的图。

图5为显示内皮抑素肽对内皮细胞迁移的抑制作用的图。

图6A和B显示了内皮抑素肽对VEGF诱导的通透性的抑制作用。图6A图示用甲酰胺在室温保温5天，在620nm测定的自皮肤伊文思兰(Evan′sblue)染料的定量；而图6B图示了Miles试验的代表性图片(V是VEGF，P是PBS)。

图7图示给予mP1内皮抑素，mP1，mP1-15，mP1-20或者PBS的小鼠中的肿瘤体积作为治疗开始后天数的函数。

发明详述：

定义

如下所述，下列术语和短语应具有如下阐明的意思。除非已经定义，否则在此使用的所有技术和科学术语都具有如一个本领域普通技术人员的通常了解相同的意思。

除非上下文明确地规定，否则单数形式“一个，”“一种，”以及“所述”包括复数个形式。

术语“生物可用的”当涉及化合物时是本领域已经认定的，它涉及到化合物的某种形式，其允许给药的化合物或其量的一部分通过掺入而被所给药的患者或受试者吸收，或者换句话说对所给药的受试者或者患者是生理学上可用的。

在此使用的术语“组合物”意图包括一种产品，其含有具体量的规定的成分，同时任何产品都是直接或间接地从规定量的具体成分的组合而得到的。

“保守置换”意思是在有广泛相似的分子性质的氨基酸之间的变化。例如：脂烃基丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸之间的置换都可以被认为是保守的。有时甘氨酸和其中之一进行置换也可以认为是保守的。其他的保守置换还包括脂烃基天冬氨酸和谷氨酸之间；酰胺基天冬酰胺和谷氨酰胺之间；羟基丝氨酸和苏氨酸之间；芳香基苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸之间；碱性基团赖氨酸、精氨酸和组氨酸之间；以及含硫基团的甲硫氨酸和半胱氨酸之间的置换。有时甲硫氨酸和亮氨酸进行置换也可以认为是保守的。优选的保守置换基团是天冬氨酸-谷氨酸；天冬酰胺-谷氨酰胺；缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸；丙氨酸-缬氨酸；苯丙氨酸-酪氨酸；以及赖氨酸-精氨酸。

术语“胃肠外给药”以及“经胃肠外给药”是本领域已知的，它涉及到不同于肠道和局部给药的给药方式，通常通过注射，并且包括但不限于经静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包囊下、蛛网膜下、脊柱内、以及胸骨内注射和输注。

本发明目的方法治疗的“患者”、“受试者”或“宿主”既可以是人类也可以是非人类的动物。

术语“同一性百分比”是指两氨基酸序列或两核酸序列之间的序列同一性。同一性可以由以比较为目的比对每个序列中的位置来确定。当一个等效位置在所比较的序列中被相同的碱基或氨基酸占据时，那么该分子在那个位置就是同一的；当该等效位置被相同或类似的氨基酸残基(例如，空间排列和/或电荷性质类似)占据时，那么该分子在那个位置就可以被认为是同源的(相似的)。同源性、相似性、或同一性百分比的表述是指被比较序列的共享位置的相同或相似氨基酸数目的函数。可以使用各种各样的比对算法和/或程序，包括FASTA、BLAST、或ENTREZ。FASTA和BLAST作为GCG序列分析程序包(University of Wisconsin，Madison，Wis.)的一部分是可得的，而且能够在例如设置默认值状态下使用。ENTREZ可以通过国家生物技术情报中心、国立医学图书馆使用、国家卫生研究所、Bethesda、Md获得。在一个具体实施方式中，两序列的同一性百分比可通过缺口加权值为1的GCG程序确定，例如，每个氨基酸缺口都被加权就好像它是两序列之间的单个氨基酸或核苷酸的错配。其他的比对技术在Methods inEnzymology，vol.266：Computer Methods for Macromolecular SequenceAnalysis(1996)，ed.Doolittle，Academic Press，Inc.，a division of HarcourtBrace & Co.，San Diego，California，USA中有所描述。优选地，使用一种允许在序列中有缺口的比对程序来进行序列比对。h-Waterman就是一种在序列对比中允许有缺口的算法。见Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)。并且，GAP程序还可以使用Needleman和Wunsch比对方法进行序列比对。一种替代的检索策略用到了在MASPAR电脑上运行的MPSRCH软件。MPSRCH使用了一种Smith-Waterman算法在一个大规模并行计算机上对序列进行评分。这种方法改善了获得较远相关匹配的能力，而且尤其能够容忍细小的缺口和核苷酸序列错误。核酸编码的氨基酸序列既可以用于检索蛋白质数据库也可以用于检索DNA数据库。含各独立序列的数据库在Methods inEnzymology，ed.Doolittle，supra中有所描述。数据库包括Genbank，EMBL，以及DNA Database of Japan(DDBJ)。

术语“药学上可接受的载体”是本领域已经认定的，它是指一种药学上-可接受的材料、组合物或者媒介物，例如液体或固体填充物、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其参与携带或者运输任何目的的组合物或组分，将它从一个器官或者身体的一部分带到另一个器官或者身体的另一部分。每个载体必须都是“可接受的”其意义是指要适合目的组合物以及它的各组分而且不能对患者有害。一些可以充当药学上可接受的载体材料的例子包括：(1)糖类，例如乳糖、葡萄糖以及蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素，及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素以及醋酸纤维素；(4)黄芪胶粉末；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，例如可可脂以及栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油以及大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇以及聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯以及十二烷酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁以及氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)Ringer’s溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；以及(21)在医药制品组成中使用的其他无毒的相容物质。

术语“多核苷酸”、以及“核酸”可以交换地使用。它们是指一种任意长度的多聚体形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或者它的类似物。下列为多核苷酸的非限定性的例子：基因或基因片段的编码或非编码区域、由连接分析确定的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列中的分离DNA、任何序列中的分离RNA、核酸探针、以及引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸以及核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可能出现在多聚物装配之前或之后。核苷酸的序列有可能被非核苷酸成分中断。多核苷酸有可能在聚合作用之后更进一步地被修饰，例如结合标记组分。术语“重组”多核苷酸是指一种源于基因组、cDNA、半合成、或者合成的多核苷酸，其不存在于自然界而且还以一种非自然的方式与另一个多核苷酸连接。术语″寡聚核苷酸″是指具有少于约100个核苷酸的多核苷酸，例如少于约75、50、25、或者10个核苷酸。

术语“多肽”，“肽”以及“蛋白质”(如果为单链)在此是可以交换使用的，它是指一种氨基酸的多聚体。该多聚体可能是直线型或者分枝型的，它可以含有修饰的氨基酸，而且还可能被非氨基酸中断。该术语同时还包括了一种经修饰的氨基酸多聚体；所述修饰如，二硫键的形成、糖基化作用、脂化作用、乙酰化、磷酸化作用，或者任何其他的处理，例如结合标记组分。此处所使用的术语“氨基酸”既涉及天然的和/或非天然的氨基酸也涉及合成的氨基酸，包括甘氨酸及其两个D或L旋光异构体，和氨基酸类似物以及肽模拟物。

术语“预防性的”或“治疗性的”治疗是本领域已经认定的，它是指将药物施用于宿主。如果是在不希望有的临床表现(例如，宿主动物的疾病或者其他不希望有的状态)出现之前给药，那么该治疗就是预防性的，也就是说，它保护宿主克服发展成不希望有的情况，反之如果是在不希望有的情况显现以后给药，该治疗就是治疗性的(也就是说，它是用来减少、改善或者维持现存的不希望有的情况或者由此产生的副作用)。

术语“合成的”是本领域已经认定的，它是指在体外的化学或酶促合成。

术语“全身性给药”、“系统地给药”、“系统地给药”以及“经外周给药”都是本领域已经认定的，它是指对受试者施用不会直接进入中枢神经系统之内的组合物、治疗剂或其它材料，使它得以进入患者的系统内并且因而参与到新陈代谢以及其它类似的过程中。

术语“治疗剂”是本领域已经认定的，它是指局部或系统地作用于受试者的具有生物、生理或药理学活性的化学组分。因此该术语的意思是指任何意图用于诊断、治愈、调理、治疗或预防疾病或是增强动物或人体内理想的身体或心理发育和/或状态的物质。

术语“治疗效果”是本领域已经认定的，它是指由药理学活性物质而引起的在动物，具体是哺乳动物，而且更具体是人类体内产生的局部或全身性的作用。术语“治疗有效量”是指所述物质的量，其以在适于任何治疗的合理效益/风险比所产生的一些理想的局部或全身性作用。所述物质治疗有效量的改变取决于被治疗的受试者以及疾病的状况、受试者的体重和年龄、疾病的严重度、给药的方式等，其可由本领域普通技术人员容易地确定。例如，所述组合物以能够产生一种适于所述治疗的合理效益/风险比来进行给药。

术语“治疗”是本领域已经认定的，它是指治愈以及改善至少一种症状或疾病，或者防止症状或者疾病的恶化。

术语“载体”是指核酸，其能够转运与其相连的另一核酸。游离体(episome)是符合本发明的一种载体，其为一种能够在染色体外复制的核酸。其它载体还包括那些能够自主复制和表达到它们所连接的核酸的载体。能够引导与其可操作连接的基因表达的载体在此叫做“表达载体”。一般说来，在DNA重组技术中有用的表达载体经常是“质粒”的形式，它是指环状双链DNA分子，其载体形式没有结合染色体。由于质粒是最常用的载体形式，所以在目前的规格标准中，“质粒”和“载体”是能够交换使用的。然而，本发明还意图包括了提供同样功能的其它形式的表达载体，其将随后为本领域所知。

示例性组合物：

肽

在此提供了抑制血管生成进而抑制肿瘤生长和/或形成的肽。人和鼠的这种肽的氨基酸序列分别为HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIR(SEQID NO：2)和HTHQDFQPVLHLVALNTPLSGGMRGIR(mP1；SEQ ID NO：4)。SEQ ID NO：2由下列核酸序列编码：cacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgc(SEQ ID NO：1)。SEQ ID NO：4由下列核酸序列编码：catactcatcaggactttcagccagtgctccacctggtggcactgaacacccccctgtctggaggcatgcgtggtatccgt(SEQ ID NO：3)。

与SEQ ID NO：1稍有不同的肽也显示出保持着抗血管生成活性。一种这样的肽为HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRG(hP1；SEQ ID NO：6)，其由以下核酸序列编码：catactcatcaggactttcagccagtgctccacctggtggcactgaacacccccctgtctggaggcatgcgtggt(SEQ ID NO：5)。SEQ ID NO：6并不包含SEQ ID NO：2中C末端最后的两个氨基酸残基。更多的抗血管生成肽有可能在SEQ ID No：2或4的N或C末端缺失一个或多个氨基酸。作为示例的抗血管生成肽如下所述：

SHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：8)；

HRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：10)；

RDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：12)；

DFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：14)；

FQPVLHLVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：16)；

SPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：18)；

PVLHLVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：20)；

VLHLVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：22)；

LHLVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：24)；

HLVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：26)；

LVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：28)；

VALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：30)；

ALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：32)；

LNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：34)；

NSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：36)；

HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGI(SEQ ID NO：38)；

HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMR(SEQ ID NO：40)；

HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGM(SEQ ID NO：42)；

HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGG(SEQ ID NO：44)；

HSHRDFQPVLHLVALNSPLSG(SEQ ID NO：46)；

HSHRDFQPVLHLVALNSPLS(SEQ ID NO：48)；

HSHRDFQPVLHLVALNSPL(SEQ ID NO：50)；

HSHRDFQPVLHLVALNSP(SEQ ID NO：52)；

HSHRDFQPVLHLVALNS(SEQ ID NO：54)；

HSHRDFQPVLHLVALN(SEQ ID NO：56)；

HSHRDFQPVLHLVAL(SEQ ID NO：58)；

HSHRDFQPVLHLVA(SEQ ID NO：60)；

HSHRDFQPVLHLV(SEQ ID NO：62)；

HSHRDFQPVLHL(SEQ ID NO：64)；

THQDFQPVLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：66)；

HQDFQPVLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：68)；

QDFQPVLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：70)；

DFQPVLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：72)；

FQPVLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：74)；

QPVLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：76)；

PVLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：78)；

VLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：80)；

LHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：82)；

HLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：84)；

LVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：86)；

VALNTPLSGGMRGIR(SEQID NO：88)；

ALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：90)；

LNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：92)；

NTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：94)；

HTHQDFQPVLHLVALNTPLSGGMRGI(SEQ ID NO：96)；

HTHQDFQPVLHLVALNTPLSGGMRG(SEQ ID NO：98)；

HTHQDFQPVLHLVALNTPLSGGMR(SEQ ID NO：100)；

HTHQDFQPVLHLVALNTPLSGGM(SEQ ID NO：102)；

HTHQDFQPVLHLVALNTPLSGG(SEQ ID NO：104)；

HTHQDFQPVLHLVALNTPLSG(SEQ ID NO：106)；

HTHQDFQPVLHLVALNTPLS(mP1-20；SEQ ID NO：108)；

HTHQDFQPVLHLVALNTPL(SEQ ID NO：110)；

HTHQDFQPVLHLVALNTP(SEQ ID NO：112)；

HTHQDFQPVLHLVALNT(SEQ ID NO：114)；

HTHQDFQPVLHLVALN(SEQ ID NO：116)；

HTHQDFQPVLHLVAL(mP1-15；SEQ ID NO：118)；

HTHQDFQPVLHLVA(SEQ ID NO：120)；

HTHQDFQPVLHLV(SEQ ID NO：122)；

HTHQDFQPVLHL(SEQ ID NO：124)；

HSHRDFVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：125)；

HSHRDFQPVLHLLSGGMRGIR(SEQ ID NO：126)；

QPVLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：127)；

HTHQDFVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：128)；以及

HTHQDFQPVLHLLSGGMRGIR(SEQ ID NO：129)。

其它抗血管生成肽是基于下列共有序列的：

HXaaHXaaDFQPVLHLVALNXaaPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：130)或

HXaaHXaaDFQPVLHLVALNXaaPLSG(SEQ ID NO：131)，其中Xaa为任意氨基酸。

其它具有抗血管生成活性的肽可能含有、由或者基本上由如上所述的任何氨基酸序列组成。而其它肽还可以含有、由或者基本上由与N末端内皮抑素肽具有至少约70％、80％、90％、95％、98％或者99％同一性或同源性的氨基酸序列组成。例如，预期与自然存在的内皮抑素蛋白有大约1、2、3、4、5或更多个不同氨基酸的肽保持抗血管生成活性。与如上所述序列相似的肽可能含有取代例如保守性替换、缺失或添加。那些差异最好是存在于在不同种间保守性不明显的区域。此类区域可以通过各种动物物种间内皮抑素蛋白氨基酸序列的比对来确定。例如，对SEQ ID NO：2、4、或6的2、4、和17位氨基酸以及在如SEQ ID NO：8、10、12、30、32、或34中的突出显示(黑体)的氨基酸的取代就不会对抗血管生成活性造成负面的影响，这是因为这些氨基酸在人类和老鼠序列之间是不同的。这些氨基酸可以被如在另一个物种中发现的那些氨基酸所取代。由于和原鸡(Gallusgallus)物种中不同，第9位的氨基酸也可以被取代。可在这些或者其它位置被取代、插入或缺失的其它氨基酸可以通过诱变研究与生物学分析来确定。

在此还包括融合与异源肽的内皮抑素肽，例如可以用来检出、纯化、稳定、或增溶内皮抑素肽的异源肽。

肽可以连接于免疫球蛋白(Ig)恒定区重链或轻链区域或其部分。例如，肽可能连接于重链CH1、CH2和/或CH3区域。如果恒定区来自于轻链，它可能来自于κ或入轻链。如果恒定区来自于重链，它可能来自于下列抗体种类的任何一种中的一种抗体：IgG、IgA、IgE、IgD、以及IgM。IgG可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。恒定区可以是Fc片段。恒定区可能是来自于哺乳动物的抗体，例如，人类抗体。可溶性受体-IgG融合蛋白是常用的免疫试剂而且它们的构建方法也是本领域公知的(见例如，美国专利No.5,225,538、5,726,044、5,707,632、5750,375、5,925，351、6,406,697以及Bergers et al.Science 1999 284：808-12)。优选的免疫球蛋白是人类IgG具体是IgG1的重链恒定区部分，其中两重链间的二聚体形成就发生在绞链区。已经认定那些作为融合多肽一部分的Fc区的CH2和CH3区域能够增加含有Fc区多肽以及含有所述多肽的寡聚物或二聚物的体内循环半衰期。

包括绞链区以及CH2和CH3区域的人类IgG1Fc部分具有如下核苷酸序列：5’gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctcctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cggacc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aactgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tacaac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aaggag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaagcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cea tcc cgg gat gag ctgacc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtggag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gactcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag gggaac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctctcc ctg tct ccg ggt aaa tga 3’(SEQ ID NO：132)，其编码的肽具有如下氨基酸序列：Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro GluLeu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu MetIle Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp ProGlu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr LysPro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val LeuHis Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala LeuPro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln ValTyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr CysLeu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly GlnPro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe PheLeu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe SerCys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser LeuSer Pro Gly Lys(SEQ ID NO：133)。

恒定的Ig区域还可以含有用来减少或消除一种或多种效应物功能的一个或多个突变，所述效应物功能例如，Fc受体的结合以及补体激活作用(见see，e.g.，S.Morrison，Annu.Rev.Immunol.，10，pp.239-65(1992)；Duncan andWinter(1988)Nature 332：738-740；和Xu et al.(1994)J Biol.Chem.269：3469-3474)。举例来说，对应人类IgGI Leu 235和Pro 331的氨基酸分别变突变为Glu和Ser。在美国专利No.6,656,728中进一步地描述了上述构建体。

恒定的Ig区域可以与肽的N末端或C末端相连。

所述肽还可以与具有凝血酶裂解位点的连接序列相连，例如在肽和免疫球蛋白区域之间。编码上述位点的示例性核苷酸序列具有下列核苷酸序列：5′tct aga ggt ggt cta gtg ccg cgc ggc agc ggt tcc ccc ggg ttg cag 3′(SEQ IDNO：134)，其编码的肽具有如下氨基酸序列：Ser Arg Gly Gly Leu VAl Pro ArgGly Ser Gly Ser Pro Gly Leu Gln(SEQ ID NO：135)。

所述肽还可以融合于信号序列。例如，当制备重组体时，编码所述肽的核酸可能在它的5′末端连接信号序列，从而使所述肽能够从细胞中分泌。

所述肽可以用作为基本纯的制剂，例如，在所述制剂的肽中至少有约90％是所需的肽。还可以使用组合物，其含有至少约50％、60％、70％、或80％的所需的肽。

所述肽可以是变性或非变性的而且由此还可以是聚集或非聚集的。所述肽可以按照本领域公知的方法来变性。

所述肽可以与锌结合。因而，所述肽可能处于含有Zn²⁺的组合物中，例如，在足量的情况下大部分所述肽都与一个或多个Zn²⁺分子结合。将Zn²⁺结合于肽可以由下列试验来证明。将锌和肽溶液混合，选择性地共同保温，然后透析除去未结合在所述肽上的锌。接着可以通过进行原子吸收来检测在所述肽溶液中的锌。

而此处包含的其它肽是含有被修饰的氨基酸的那些肽。示例的肽是衍生化的肽，其通过糖基化作用、聚乙二醇化、磷酸化作用或者任何类似过程，修饰，并保留了其所来源的肽的至少一种生物学功能。

所述肽还可能含有一个或多个非天然存在的氨基酸。例如，非常见氨基酸或者化学氨基酸类似物可以取代或添加到肽内。非常见氨基酸总体上包括但不限于，常见氨基酸的D型异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸(citrulline)、同型瓜氨酸、磺基丙氨酸(cysteic acid)、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计物(designer)的氨基酸例如β-甲基氨基酸、C alpha-甲基氨基酸、Nalpha-甲基氨基酸、以及氨基酸类似物。此外，所述氨基酸可以是D型(右旋)或L型(左旋)的。

在其它具体实施方式中，提供了所述肽的分支类型，例如，通过由具有能够形成与一个或多个氨基酸的肽键的自由侧链的氨基酸或者氨基酸类似物取代所述序列内一个或多个氨基酸而形成(而因此能够形成一种“分枝类型”)。也涉及环状的肽。

还包括一种在合成期间或之后进行了差异修饰的衍生化的肽，例如，修饰通过苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、聚乙二醇化、通过公知的保护/封端基团的衍生作用、蛋白水解裂解、结合抗体分子或其它细胞配体，等等。在具体的实施方式中，所述肽在N末端乙酰化和/或在C末端酰胺化。

还提供了内皮抑素肽的衍生物，例如化学修饰的肽和肽模拟物。肽模拟物是基于或来源于肽和蛋白质的化合物。肽模拟物可以通过利用非天然氨基酸、构象限制、电子等排置换诸如此类的方式对已知肽进行结构修饰而获得。目的肽模拟物构成了在肽和非肽合成结构之间的结构空间的连续统一体(continum)；所以，肽模拟物可能在划定药效基团以及促进肽翻译为具有亲本肽活性的非肽化合物中是有益的。

此外，还提供了目的肽的模拟物(mimetopes)。该肽模拟物具有以下性质：不可水解(例如，升高的稳定性以抵抗蛋白酶水解或其它降解相应的肽的生理情况)、升高的特异性和/或刺激细胞分化的效应。作为例证，肽模拟物使用例如，苯二氮(benzodiazepines)(例如，见Freidinger等Peptides：Chemistry and  Biology，GR.Marshall ed.，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988)，取代的gama乳胺环(lactam)(Garvey等Peptides：Chemistry and  Biology，GR.Marshall ed.，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988，p123)，C-7模拟物(Huffman等Peptides：Chemistry andBiologyy，GR.Marshall ed.，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988，p.105)，酮-亚甲基伪肽(keto-methylene pseudopeptide)(Ewenson等(1986)JMed Chem 29：295；以及Ewenson等Peptides：Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium)Pierce Chemical Co.Rockland，IL，1985)，β-转角二肽核心(Nagai等(1985)Tetrahedron Lett26：647；以及Sato等(1986)J Chem Soc Perkin Trans 1：1231)，β-氨基醇(Gordon等(1985)Biochem Biophys Res Commun126：419；以及Dann等(1986)Biochem Biophys Res Commun 134：71)，二氨基酮(diaminoketone)(Natarajan等(1984)Biochem Biophys Res Commun124：141)，以及亚甲基氨基修饰的(Roark等Peptides：Chemistry and Biology，G.R.Marshall ed.，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988，p 134)来产生。通常还可以见Session III：Analytic and synthetic methods，in in Peptides：Chemistry and Biology，G.R.Marshall ed.，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988)。

除了各种能够进行肽模拟物形成的侧链取代之外，说明书中还明确涉及了肽二级结构的构象限制模拟物的使用。许多肽的酰胺键的代用物已经开发出来。酰胺键的开发代用物常常包括下列基团(i)反式烯烃(transolefin)，(ii)氟代烯烃(fluoroalkene)，(iii)亚甲基氨基(methyleneamino)，(iv)磷酰胺(phosphonamide)，以及(v)磺酰胺(sulfonamide)。

代用物的例子有：

另外，还可以应用基于对肽主链更多的实质上修饰的肽模拟物。属于这中类型的肽模拟物包括(i)逆倒转类似物(retro-inverso analogues)，(ii)N-烷基甘氨酸类似物(所谓的类肽(opeptoid))。

类似物的例子有：

        逆倒转类似物                                                N-烷基甘氨酸类似物

此外，在新的肽模拟物开发过程中还运用了组合化学(combinatorialchemistry)的方法。例如，所谓“肽变型(morphing)”策略的一个具体实施方式的焦点在于随机生成包含大范围肽键取代的肽模拟物的文库。

在一个示范性的具体实施方式中，肽模拟物可以衍生为肽的逆倒转类似物。所述逆倒转类似物可以按照本领域公知的方法制备，例如Sisto等的美国专利4,522,752中所描述的方法。逆倒转类似物还能够如WO 00/01720中的描述制备。将理解可以产生例如包括一些正常肽键合的混合肽。作为一般的指导，对于蛋白水解作用最为敏感的位点通常被改变，较不敏感的酰胺键对于模拟物转变(mimetic switching)而言是可选的。其最终产品或中间产物可以由HPLC进行纯化。

所述肽可以包含至少一个D型立体异构体氨基酸或者每个氨基酸都是D型立体异构体。其他肽可以包含至少一个反转的氨基酸。所述的反转的氨基酸也可能是D型立体异构体。所述肽的每个氨基酸都可能是反转的和/或每个氨基酸都可能是D型立体异构体。

在另一个说明性的具体实施方式中，肽模拟物可以衍生为肽的逆镜像类似物(retio-enantio analog)。如WO 00/01720中所述，此类逆镜像类似物可以用市售的D型氨基酸(或其类似物)以及标准固相或液相肽合成方法进行合成。其最终产品可以由HPLC进行纯化，产生纯的逆镜像类似物。

在又一个说明性的具体实施方式中，目的肽被制成了反式-烯烃衍生物。反式-烯烃类似物可以按照Y.K.Shue et al.(1987)Tetrahedron Letters 28：3225以及WO 00/01720中描述的方法进行合成。它还可能更进一步将通过上述的方法合成的伪二肽，连接于其他伪二肽，从而产生具有一些烯烃功能而非酰胺功能的肽模拟物。

还有另一类包括膦酸酯(phosphonate)衍生物的肽模拟物衍生物。上述膦酸酯衍生物的合成可以采用已知的合成方案。见，例如，Loots等Peptides：Chemistry and Biology，(Escom Science Publishers，Leiden，1988，p.118)；Petrillo等Peptides：Structure and Function(Proceedings of the 9th AmericanPeptide Symposium，Pierce Chemical Co.Rockland，IL，1985)。

许多其他的肽模拟物结构是本领域已知的，而且可以很容易的适用于本发明的目的肽模拟物。举例说明，肽模拟物可以包括1-氮杂二环(azabicyclo)[4.3.0]壬烷(nonane)替代物(见Kim et al.(1997)J.Org.Chem.62：2847)，或者N-酰基哌嗪酸(piperazine acid)(见Xi等(1998)J.Am.Chem.Soc.120：80)，或2-取代的哌嗪组分作为限制的氨基酸模拟(见Williams et al.(1996)J.Med.Chem.39：1345-1348)。在又一个具体实施方式中，一些氨基酸残基可以用芳基以及二芳基部分取代，例如，单环或二环的芳香(aromatic)或杂环(heteroaromatic)核，或者二芳香核(biaromatic)、芳香-杂环(aromatic-heteroaromatic)核、或二杂环(biheteroaromatic)核。

目的肽模拟物可以通过例如组合合成技术联合高通量筛选的来进行优化。

此外，其他模拟物(mimetope)的例子还包括但不限于，基于蛋白质的化合物、基于碳水化合物的化合物、基于脂质的化合物、基于核酸的化合物、天然有机化合物、合成衍生的有机化合物、抗独特型抗体和/或催化抗体、或其片段。模拟物(mimetope)可以通过例如筛选天然以及合成化合物的库中能够抑制血管生成和/或肿瘤生长的化合物进行来获得。模拟物(mimetope)还可以从例如天然以及合成化合物的库，具体是化学或组合物文库(即，那些在序列或大小方面不同但具有同样的结构区块的化合物的文库)中获得。模拟物(mimetope)还可以通过例如合理的药物设计来获得。在合理的药物设计步骤中，本发明化合物的三维空间结构可以通过例如核磁共振(NMR)或X-射线晶体衍射(crystallography)来进行分析。进而可以利用其三维结构通过例如电脑模型来预知潜在模拟物的结构。预知的模拟物结构可以进而通过例如化学合成、重组DNA技术、或通过从天然来源(例如，植物、动物、细菌以及真菌)中分离模拟物来产生。

“肽，其变体及衍生物”或“肽及其类似物”包含于“肽治疗剂”，而且意图包括在此所述的任何肽或其修饰型例如肽模拟物。优选的肽治疗剂具有抗血管生成活性。例如，它们可以减少或抑制血管生成至少约50％、2倍、5倍、10倍、30倍或100倍，如由例如在此描述的试验分析中确定的那样。

检测候选肽的抗血管生成及肿瘤生长或形成抑制的分析试验是本领域已知的，而本发明在此将更进一步地描述一个示范的例子。

核酸

还公开了编码抗血管生成肽的核酸。优选的核酸如下：

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核酸包括载体，例如用于产生肽的表达载体，举例来说如，病毒载体。在此还提供了一种含有编码所述肽的核酸的细胞以及用于产生所述肽的方法，包括培养所述细胞。上述方法可以用来制备重组肽或用来在细胞中表达肽，例如，在目的细胞中。

可以通过众所周知的技术诸如传染、转导、转染、转位(transrection)、电穿孔以及转化将适当的载体引入宿主细胞。所述载体可能是例如，噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可为有复制能力的或复制缺陷的。在后者的情况下，病毒繁殖通常会仅仅发生在互补型(complementing)宿主细胞中。

所述载体可能含用于在宿主中增殖的选择性标记。一般来说，将质粒载体引入一个沉淀物例如磷酸钙沉淀物中，或是引入具有带电脂质的复合物中。如果所述载体是病毒，那么它可能先在体外利用适当的包装细胞系进行包装然后再转导到宿主细胞中。

优选的载体含有对于目的多核苷酸的顺式作用控制区域。适当的反式作用因子可以由宿主提供、由互补型载体提供或是由引入到宿主时所述载体本身提供。

在某些实施方式中，提供特异性表达的载体，它们可以是可诱导的和/或细胞类型特异性的。在所述载体之中尤其优选的是那些可通过便于操作的、环境因素例如温度以及营养添加剂可诱导的载体。

在本发明中有益的表达载体包括染色体-、游离体-以及病毒-衍生的载体，例如，来源于细菌质粒、噬菌体、酵母游离体、酵母染色体元件、病毒如杆状病毒(baculo virus)、乳多泡病毒(papova virus)、痘苗病毒(vacciniavirus)、腺病毒、禽痘病毒(fowlpox virus)、伪狂犬病病毒(pseudorabjes virus)和逆转录病毒的载体，以及来源于上述的组合的载体，诸如粘粒和噬粒。DNA嵌入物应有效地连接适当的启动子，如噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、trp和tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTRs启动子等。其它适当的启动子也将是本领域技术人员公知的。表达构建体还将进一步含有转录开始、终止位点以及在经转录的区中的、用于翻译的核糖体结合位点。通过构建体表达的成熟转录物的编码部分将优选地包括在开始处的翻译起始位点以及适当地设置在待翻译多肽末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。

应指出的是，表达载体将优选包括至少一个选择性标记。所述标记包括用于真核细胞培养基的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性基因，以及用于培养大肠杆菌及其他细菌中的四环素、卡那霉素、或氨苄青霉素抗性基因。适宜的宿主的代表性例子包括但不限于，细菌细胞，例如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞，例如酵母细胞；昆虫细胞例如果蝇(Drosophila)S2和Sf9细胞；动物细胞例如CHO、COS和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞。适当的培养基和上述宿主细胞的培养条件是本领域公知的。

其中应用于细菌的载体优选包括Qiagen公司市售的pQE70、pQE60和pQE9、pQE10；Stratagene公司市售的pBS载体、Phagescript载体、Blueseript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；Novagen公司市售的pET系列载体；以及Pharmacia公司市售的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。其中优选的真核载体为Stratagene公司市售的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及Pharmacia公司市售的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其他适当的载体对本领域技术人员来说也将是显而易见的。

其中适用于本发明的已知细菌启动子包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子，T3、T5和T7启动子，gpt启动子，入PR和PL启动子，trp启动子以及xyI/tet嵌合启动子。适当的真核启动子包括CMV即刻早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒LTRs例如劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、以及金属硫因(metallothionein)启动子，例如鼠金属硫因-I启动子。

将构建体引入宿主细胞可以通过磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐介导的转染、阳离子脂类介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他的方法而完成。所述方法在许多标准实验手册(例如，Davis等，Basic Methods In MolecularBiology(1986))中均有描述。

由高等真核生物转录编码本发明多肽的DNA是通过在载体中插入增强子序列来提高的。增强子是DNA的顺式作用元件，通常由大约10到300个核苷酸组成，用来提高所给宿主细胞类型中启动子的转录活性。增强子的例子包括SV40增强子，它是位于复制起点晚期侧(late side)的100到270个核苷酸，巨细胞病毒早期启动子增强子，在复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子，以及腺病毒增强子。

还可以制备本发明多肽的重组可溶性形式，举例来说，通过删除至少一部分跨膜结构域，从而使所述蛋白质不能将其自身定位到细胞膜。同样在本发明范畴内的还有编码拼接变体的核酸或代表从可选择的转录启动位点的转录物合成的核酸，诸如那些其转录起始于内含子中的位点的那些核酸。上述同系物可以使用本领域公知的标准方法通过杂交或PCR进行克隆。

所述多核苷酸序列还可能编码前导序列，例如，天然的前导顺序或者异源的前导顺序。可选，核苷酸可以被改造从而删除天然的前导顺序并在它的位置插入异源的前导序列。术语“前导序列”在此可以与术语“信号肽”互换地使用。例如，理想的DNA序列可能融合在与和帮助多肽从宿主细胞中表达和分泌的DNA序列相同的阅读框中，例如，起分泌序列作用的用于控制多肽从细胞中转运的前导序列。具有前导序列的蛋白质是前原蛋白质，并可具有可由宿主细胞切割的前导序列，从而形式所述蛋白质的成熟形式。

为了将所述翻译的多肽分泌到内质网细胞腔、浆膜外周间隙或者胞外环境中，可将适宜的分泌信号掺入所表达的多肽，例如，氨基酸序列KDEL。所述信号可能是多肽内源的或者它们也可能是异源的信号。

所述多肽还可以以经修饰的形式进行表达，诸如融合蛋白质，它不但可以包括分泌信号，而且还可以包括其他的异源功能性区域。例如，其他的氨基酸具体是带电的氨基酸的区域，可能被加到所述多肽的N末端或C末端用来改善在纯化或后续处理以及贮藏期间其在宿主细胞中的稳定性和持久性。也可将肽部分加入多肽用来促进纯化。上述区域可能在多肽最终制备好之前被除去。将肽部分添加于多肽用来促进分泌或排出、改善稳定性和促进纯化及其他作用是本领域常规和熟知的技术。上述融合蛋白的一个例子可以包含用于使蛋白质增溶的来自免疫球蛋白的异源区域。

示例性的方法

抗血管生成肽或编码抗血管生成肽的核酸载体可以对需要它的受试者给药来预防或降低血管生成和/或细胞增殖，例如，肿瘤生长，或与其相关的任何疾病或异常。受试者可以是人类或动物，例如哺乳动物。

不受控制的血管生成存在于许多疾病、肿瘤转移和内皮细胞异常生长状态中，而且在此类情况下可以见到它维持着病理性的破坏。不受控制的血管生成引起的种种病理状态可以归类为血管生成依赖或血管生成相关的疾病。旨在控制血管生成的治疗方法可以导致此类疾病的康复或缓和。因此，无论关系到正常状况或疾病，血管生成都与任何新的组织生长有关。于是相应的，无论关系到正常状况或疾病，在此描述的治疗剂都可用于抑制与任何新的组织生长有关的血管生成。

治疗剂可能与组织相接触来预防血管生成和/或细胞增殖，例如，肿瘤生长，或相关的任何疾病或病症。由血管生成介导的疾病和过程包括血管瘤(hemangioma)、实体肿瘤(solidtumors)、白血病、转移(metastasis)、毛细血管扩张牛皮癣硬皮病(telangiectasia psoriasis scleroderma)、脓性肉芽肿(pyogenic granuloma)、心肌血管生成、动脉粥样斑新血管化(plaqueneovascularization)、冠状动脉侧支形成(coronary collaterals)、大脑侧支形成(cerebral collaterals)、动静脉畸形(arteriovenous malformation)、缺血性四肢血管生成(ischemic limbangiogenesis)、角膜疾病(corneal disease)、虹膜潮红(rubeosis)、新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)、糖尿病性视网膜病、晶状体后纤维组织形成(retrolental fibroplasia)、关节炎、糖尿病性新血管化、黄斑变性(macular degeneration)、伤口愈合、胃溃疡、骨折、瘢痕瘤(keloid)、类天疱疮(phemphigoid)、沙眼(trachoma)、血管发生、造血作用、排卵、月经(menstruation)、以及胎盘形成(placentation)。在此所述的治疗剂还可以用于治疗或抑制癌症的生长或者降低肿瘤质量。

血管生成在实体肿瘤形成和转移瘤中是较为显著的。已经发现与一些实体肿瘤例如横纹肌肉瘤、成视网膜细胞瘤、尤文(Ewing)肉瘤、成神经细胞瘤和骨肉瘤相关的血管生成因子。如果没有血液供给来提供营养以及带走细胞的废物，肿瘤是无法扩张的。血管生成对于肿瘤包括实体肿瘤以及良性瘤例如听神经瘤(acousticneuroma)、纤维神经瘤(neurofibroma)、沙眼和脓性肉芽肿都很重要。防止血管生成可以阻止这些肿瘤生长和由于肿瘤存在而导致的动物的组织损害。

血管生成对瘤转移的两个阶段都十分重要。血管生成刺激作用十分重要的第一阶段是在肿瘤的血管化阶段，它能够让肿瘤细胞进入血流而通过循环遍及全身。在肿瘤细胞离开了最初的位点之后，然后就安置在次级的转移瘤位点，血管生成必须存在于新的肿瘤能够生长和扩张之前。所以，防止血管生成可以预防肿瘤转移以及可能防止最初位点的赘生物生长。

值得注意的是血管生成与生血(blood-born)肿瘤例如白血病、骨髓的任何多样的急性或慢性赘生物疾病有关，其中存在着白血球的无限制增殖，还通常伴随着贫血、凝血障碍、以及淋巴结、肝和脾的肿大。可以相信血管生成对引起白血病-样肿瘤的骨髓中的异常状态起一定的作用。

在此描述的组合物可以用来治疗动脉粥样硬化。相应地，含有在此描述的所述肽的组合物可以用来预防或消退动脉粥样硬化生长或动脉粥样斑形成。

一般来说，在此描述的组合物可以被用来治疗炎症性的病症，例如免疫性和非免疫性的炎症、慢性关节风湿病、伴随着不合宜或不合时机的脉管侵入的牛皮癣病症、例如糖尿病性视网膜病、新生血管性青光眼、再狭窄(restenosis)、动脉粥样硬化斑中的毛细管增殖以及骨质疏松症。还可以治疗的癌症相关的病症包括实体肿瘤、实体肿瘤转移瘤、血管纤维瘤、晶状体后纤维组织形成、血管瘤、以及卡波奇(Kaposi)肉瘤。

血管生成介导疾病的一个例子是眼新生血管疾病。这种疾病的特点在于新生血管侵入到眼睛例如视网膜或角膜结构中。它是最常见的导致失明的原因而且还涉及到近二十种眼疾。在年龄相关的黄斑变性中，伴随的视觉问题起因于脉络膜毛细管的向内生长穿过布鲁赫(Bruch’s)膜中的缺陷以及视网膜色素上皮细胞之下纤维脉管组织的增生。血管生成损害还与糖尿病性视网膜病、幼年视网膜病(retinopathy of prematurity)、角膜移植物排斥、新生血管性青光眼和晶状体后纤维组织形成有关。

可以认为，在此描述的可被治疗的、与角膜新血管化相关的疾病包括但不限于，糖尿病性视网膜病、幼年视网膜病、角膜移植物排斥、新生血管性青光眼和晶状体后纤维组织形成、流行性角膜结膜炎(epidemickeratoconjunctivitis)、维生素A缺乏症、隐形眼镜过度磨损(contact lensoverwear)、特异反应性的角膜炎(atopic keratitis)、上边缘角膜炎(superiorlimbic keratitis)、翼状胬肉角膜炎sicca(pterygium keratitis sicca)、干燥(sjogrens)、红斑痤疮(acenrosacea)、phylectenulosis、梅毒(syphilis)、分枝杆菌感染、脂质变性(lipid degeneration)、化学灼伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯性疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、卡波奇肉瘤、Mooren溃疡、Terrien氏边缘变性(Terrien’s marginal degeneration)、边缘角膜溶解(marginal keratolysis)、外伤、类风湿性关节炎、系统性狼疮(systemic lupus)、多发性动脉炎(polyarteritis)、韦格纳(Wegener’s)结节病、巩膜炎(Scieritis)、Steven′s Johnson病、以及类天疱疮(periphigoid)放射状角膜切开术。

可以认为，在此描述的与视网膜/脉络膜的新血管化相关的疾病包括但不限于，糖尿病性视网膜病、黄斑变性、镰刀形红细胞贫血病、类肉瘤(sarcoid)、梅毒、弹性假黄瘤(pseudoxanthoma elasticum)、Pagets病、静脉闭塞、动脉闭塞、颈动脉梗阻性疾病、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎、分枝杆菌感染、莱姆氏病、系统性红斑狼疮、幼年视网膜病、Eales病、白塞病、导致视网膜炎或脉络膜炎的感染、推定的眼睛组织胞浆菌病(presumed ocularhistoplasmosis)、Bests病、近视、眼凹(opticpits)、Stargarts病、睫状体平坦部炎(pars planitis)、慢性视网膜剥离、高粘稠度综合征(hyperviscositysyndrome)、弓形体病(toxoplasmosis)、外伤以及激光后并发症(post-lasarcomplication)。其它疾病包括但不限于，与虹膜潮红(rubeosis)(角部(angle)的新血管形成化)相关的疾病以及由纤维脉管组织或纤维组织的异常增生所引起的疾病，包括不论是否与糖尿病相关的所有形式的增生性玻璃体视网膜病变。

另一个被认为涉及血管生成的疾病是类风湿性关节炎。在关节滑液内层的血管经历了血管生成。除形成新的血管网络以外，内皮细胞释放因子以及氧反应性物质导致关节面血管翳的生长和软骨的破坏。涉及血管生成的因子可以积极地促进和帮助维持类风湿性关节炎的长期发炎状态。

血管生成相关的因子还可以在骨关节炎中具有一定作用。由血管生成相关因子对软骨细胞的活化作用加剧了关节破坏。在后期阶段，血管生成因子将促进新骨的形成。预防骨组织破坏的治疗剂的引入能够中断该疾病的发展并且减轻患者由关节炎带来的痛苦。

慢性炎症也可能涉及到病理性血管生成。所述疾病状态如溃疡性结肠炎和克隆氏病显示了新血管向内生长到发炎组织中的组织学变化。一种发现于南美洲的细菌感染——巴尔通氏体病(Bartonellosis)能够导致一种以血管内皮细胞增生为特征的慢性阶段。另一与血管生成相关的病理性作用发现于动脉粥样硬化症。形成于血管内腔中的动脉粥样斑显示了血管生成刺激活性。

小儿最常见的血管生成疾病之一是血管瘤。大多数情况下，肿瘤是良性的且无需干预即可退化。在更严重的病例中，肿瘤发展为大的多孔和渗透性的形式并且引起临床并发症。血管瘤的全身性形式，多发性血管瘤(hemangiomatoses)，具有很高的死亡率。治疗耐受性血管瘤目前还没有可以用于治疗的治疗剂。

血管生成还是造成遗传病例如Osler-Weber-Rendu病或遗传出血性毛细管扩张中的损害的原因。这是一种以许多的小型血管瘤、血管或淋巴管肿瘤为特征的遗传性疾病。血管瘤发现于皮肤和粘膜中，时常伴有鼻衄(鼻出血)或胃肠道出血以及有时带有肺或肝的动静脉瘘。

另一个能够按照本发明治疗的疾病是获得性免疫缺损综合症。

所述治疗性的肽还可以用于减少正常、血管化细胞组织的过度增生，所述组织例如脂肪组织、良性息肉、肥大的心脏组织、肥大的肾脏组织、肥大的前列腺组织、含有淀粉状蛋白沉淀的组织、以及子宫纤维瘤。所述治疗剂可以以减少对组织的血管供应，或缩小血管化的组织的大小或减弱其生长的有效量进行给药，所述组织例如脂肪组织、息肉(例如，肠或鼻息肉)、以及肌肉(包括心肌)组织。所以，可以治疗的患者包括患有息肉、以及增大的前列腺、心脏或肾脏肥大或者肥胖或超重的患者。所述肽治疗剂可以以导致可调节待治疗的血管化的组织的大小和/或生长的血液水平的量和持续时期给药。

所述能够降低体重的治疗既适用于正常的超重个体，也适用于有遗传性缺陷的个体。所述方法还可以用于大多数涉及由于激素或代谢缺陷症或药物副作用引起的重量增加的情况中。除了能够促进体脂损失同时维持纤瘦体质以及在慢性给药的过程中能够持续重量减轻之外，所述治疗的其它有益效果还包括对糖尿病相关肥胖的血糖水平的正常化。

另外，作为由按照所述方法可以治疗的血管生成相关疾病引起的任何疾病或继发状况的发展也是可以治疗的。例如，任何由超重或肥胖引起的状况是可以如上所述进行治疗或预防的。常见的疾病包括高脂血症(hyperlipidemia)、脂质生成障碍(dyslipogenesis)、高胆固醇血症(hypercholesterolemia)、葡萄糖耐量障碍(impaired glucose tolerance)、高血糖水平(high blood glucose sugar level)、X综合症(syndrome X)、高血压(hypertension)、动脉粥样硬化症和脂肪代谢障碍(atherosclerosis and lipodystrophy)、高血压(hypertension)、高血液胆固醇(highblood cholesterol)、血脂紊乱(dyslipidemia)、2型糖尿病(type 2diabetes)、胰岛素抵抗(insulin resistance)、葡萄糖不耐(glucose intolerance)、高胰岛素血症(hyperinsulinemia)、冠心病(coronary heart disease)、心绞痛(angina pectoris)、充血性心力衰竭(congestive heart failure)、中风(stroke)、胆结石(gallstones)、胆囊炎以及胆石症(cholescystitis and cholelithiasis)、痛风(gout)、骨关节炎(osteoarthritis)、梗阻性睡眠呼吸暂停和呼吸作用问题(obstructive sleep apneaand respiratory problems)、一些类型的癌症(some types of cancer)(例如子宫内膜(such as endometrial)、胸部(breast)、前列腺(prostate)、以及结肠(and colon))、妊娠并发症(complications of pregnancy)、不良的雌性生殖健康状态(poor femalereproductive health)(例如月经不调(menstrual irregularities)、不育(infertility)、排卵不规则(irregular ovulation))、膀胱控制问题(bladder control problems)(例如压迫性尿失禁(stress incontinence))；尿酸肾石病(uric acid nephrolithiasis)；以及心理学的病症(and psychological disorders)(例如忧郁症(such as depression)、进食紊乱(eating disorders)、身体映象扭曲(distorted body image)，以及自卑(andlow self esteem))。

血管生成也涉及正常的生理学过程例如生殖(reproduction)以及伤口愈合。血管生成是排卵中的重要阶段并且对受精后囊胚(blastula)的着床也十分重要。血管生成的阻止可用于引起闭经、阻断排卵或防止囊胚的着床。

在伤口愈合中，过度的修补或纤维组织形成是外科操作的有害副作用并且可能引起或加剧血管生成。粘连是一种外科手术的常见并发症，它会导致例如小肠梗阻的问题。所以在这类以及其它情况下，利用在此所述的治疗性的肽防止伤口愈合可能是合乎需要的。

所述肽可以以药物组合物提供以及向需要的它的患者给药。所述肽还可以在体外与组织或细胞接触。

治疗方法一般来说含有向患者，例如，需要的它的患者，施予治疗有效量的治疗剂，例如，在此所述的肽或其变体或衍生物或其编码核酸。患者可以是哺乳动物，例如人类、非人类灵长类、犬、猫、马、猪、绵羊、牛、羊、小鼠以及大鼠。在此所述方法具体能被用于兽医学用途。所述方法可以首先包含诊断带有将给药所述肽有益的疾病或病症例如恶性或良性的肿瘤生长的患者。所述方法还可以包含确定在给药之后的某一时间的治疗效果。例如，测定从治疗开始后约一周、一月或两个月的肿瘤生长大小。测定还可以含有组织样品例如肿瘤的获得以及血管生成水平的确定。

所述治疗剂可以以“生长抑制量”即，对于抑制或缩小细胞或组织增生具有治疗有效性的量给药。所述治疗剂还可以以“抗血管生成量”即，对于抑制或缩小血管生成具有治疗有效性的量给药。所述治疗剂可以施用于，优选是人类，既可以单独给药，也可以联合药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，按照标准药学常规形成药物组合物给药。治疗剂可以直接向希望抑制血管生成或肿瘤生长的组织中给药。所述治疗剂也可以口服或胃肠外给药，包括经静脉内、肌内、腹膜内、皮下、经直肠以及局部地给药。一种或多种治疗剂可以直接注射到要治疗患者的肿瘤之内。

可以将锌与所述肽或其变体或衍生物共同给药。例如可以将治疗有效剂量的治疗剂组合物(见下文)和治疗有效剂量的Zn²⁺(见下文)一起给药。所述肽或其变体或衍生物可以在给药之前或在给药的同时与锌溶液混合，从而使锌与所述肽相互作用。可选，所述肽或其变体或衍生物在将锌给药之前或之后独立地给药，条件是两者都在至少有一段的时期共同存在于循环当中。例如，在肽给药之前或之后约几分钟到几小时可以进行锌溶液的给药。然而在其它一些实施方式中，却没有向施予所述肽的患者进行锌的给药。但是当患者血液循环中具有锌时，施予的肽依然可以结合锌。

所述治疗剂的毒性和治疗效力可以由在细胞培养或实验动物中的标准药学方法确定，例如用于确定LD50(对于50％的群体致命的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗性效果之间的剂量比就是治疗指数，它可以用LD50/ED50的比率来表示。优选显示出较大治疗指数的药剂。同时为了例如使对于正常细胞的潜在损害变成最小，使用显示毒副作用的试剂时，可以设计将所述试剂靶向受影响组织的位点的递送系统，从而降低副作用。

从细胞培养试验和动物研究中获得的数据可被用于制定适用于人类使用的剂量范围。所述治疗剂的剂量优选地落在包括ED50而几乎没有或没有毒性的循环浓度范围中。所述剂量在此范围中的变化取决于采用的剂型和使用的给药途径。对于任何治疗剂的应用，治疗有效剂量可以从细胞培养试验中进行最初估计。动物模型中的剂量可以达到这样的循环血浆浓度，其包括细胞培养中测定的IC50(即，达到对症状最大抑制作用的一半的试验治疗剂浓度)。上述信息可以更为精确地确定用于人类的剂量。

所述治疗剂的剂量将取决于疾病状况或治疗情况及其他临床因素，例如人或动物的体重和病情以及化合物的给药途径。对于治疗人类或动物，可以施予大约0.5毫克/千克到500毫克/千克范围内的治疗剂。更优选的范围是大约1毫克/千克到100毫克/千克或从约2毫克/千克到50毫克/千克，最优选的范围是从2毫克/千克到10毫克/千克。取决于所述治疗剂在各个具体的动物或人类体内的半衰期，所述治疗剂可以在每天若干次到每周一次的范围之间给药。可以理解，此申请的方法是既适用于人类也可以作为兽医学用途的。本发明的方法涵盖了单独给药也包括了多次给药，既可以同时给药也可以持续的时段之内进行。

当所述肽或其变体或衍生物和锌一起给药时，包括在含有所述肽或其变体或衍生物的治疗剂组合物中的锌的浓度在从约0.1到约100毫克/千克/天；约1到约10毫克/千克/天；或约2-5毫克/千克/天。锌可以以Zn²⁺或其盐类的形式给药。锌的量的改变取决于患者循环(例如，血液)中锌的量以及患者的肽给药量。锌的必需的量可以通过例如取接受单独的具体量的肽或连同接受了锌的患者血样来确定，然后确定例如如上所述的复合了锌的肽的量。

含有治疗剂药物组合物可以是适合于口服用途的形式，例如，药片、锭剂、菱形锭剂、水状或油状的悬浮液、可分散性粉剂或颗粒剂、乳剂、硬质或软质胶囊、或糖浆或酏剂。设计为口服用途组合物可以按照本领域公知的任何生产药物组合物的方法制备，而且为了提供药学上精致可口的制剂，所述组合物还可以含有选自由甜味剂、调味剂、着色剂以及防腐剂构成的组中的一种或多种附加剂。药片还可以含有活性成分(即，治疗剂)与适于药片生产的无毒的药学上可接受的赋形剂的混合物。这些赋形剂可以是例如，惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化以及崩解剂，如，微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、玉米淀粉、或藻酸；粘合剂，如淀粉、白明胶、聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯胶，以及润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。所述药片可以是不加涂覆的或它们也可以是由公知技术包衣，用来掩盖药物不良味或延迟崩解以及为了有助于胃肠道吸收，从而提供一种更久期限的持续作用。例如，可以使用水溶性的味道遮蔽材料如羟丙基甲基纤维素或羟丙基纤维素，或者时间延迟材料如乙基纤维素、乙酸-丁酸纤维素。

口服用途的剂型还可以以硬胶囊的形式存在，其中的活性成分混合了惰性固相稀释剂，例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土，或以软胶胶囊的形式存在，其中的活性成分混合了水溶性的载体，如，聚乙二醇或油介质，例如花生油、液体石蜡、或者橄榄油。

含有活性材料的水悬浮液可以混合适于水悬浮液生产的赋形剂。所述赋形剂是助悬剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散或湿润剂可以是天然存在的磷脂酰(phosphatide)，例如卵磷脂，或脂肪酸与烯基氧化物的缩合产物，例如聚氧化乙烯硬脂酸盐，或长链脂族醇环氧乙烷的缩合产物，例如heptadecaethylene-oxycetanol，或来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯(partialester)与环氧乙烷的缩合产物如聚氧化乙烯山梨糖醇一油酸，或来源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚乙烯单油酸山梨醇酐酯。所述水中悬浮体还可以含有一种或多种防腐剂，例如乙基，或正丙基对羟基苯酸盐，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，以及一种或多种甜味剂，如蔗糖、糖精或阿斯巴甜。

油状悬浮液的配制可以通过将活性成分悬浮在植物油中，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，或者悬浮在矿物油中如液体石蜡中进行。所述油状悬浮液可以含有稠化剂，例如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。还可以加入如上所述的甜味剂以及调味剂以提供可口的口服制剂。这类组合物可以通过加入抗氧化剂如丁化羟基苯甲醚(butylated hydroxyanisol)或α-生育酚(tocopherol)来进行保存。

适于通过加入水调制成水悬浮液的可分散性粉剂和颗粒剂提供了活性成分与分散或润湿剂、助悬剂以及一种或多种防腐剂的混合物。适当的分散或润湿剂以及助悬剂已经通过如上所述举例说明。还可以存在其他的赋形剂，例如甜味剂、调味品以及着色剂。这类组合物可以通过加入抗氧化剂如抗坏血酸来进行保存。

药物组合物还可以是水包油乳化剂的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或者矿物油，例如液体石蜡或者上述的混合物。适当的乳化剂可以是天然存在的磷脂酰，例如黄豆卵磷脂，以及来源于脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如单油酸山梨醇酐酯，以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧化乙烯单油酸山梨醇酐酯(polyoxyethylene sorbitanmonooleate)。所述乳剂还可以含有甜味剂、调味剂、防腐剂和抗氧化剂。

糖浆和酏剂的配制可以利用甜味剂，例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或者蔗糖。所述剂型可以同时含有镇痛剂、防腐剂、调味品和着色剂以及抗氧化剂。

药物组合物还可以是无菌注射水溶液的形式。对于可接受的媒介物(vehicle)和溶剂，可以采用水、林格(Ringer)氏溶液和等渗氯化钠溶液。

无菌注射制剂还可以是将活性成分溶于油相的无菌注射水包油微乳剂。例如，活性成分可以先溶于豆油和卵磷脂的混合物。然后将油溶液引入水和甘油的混合物中然后加工成微乳化的形式。

注射溶液或者微乳剂可以通过局部的药团(bolus)注射引入患者的血流当中。可选，为了便于给药，溶液或微乳剂可以按维持本化合物的恒定循环浓度的方法给药。为了维持所述的恒定浓度，可以使用连续的静脉注射递送装置。所述装置的一个例子是Deltec CADD-PLUSTM 5400型静脉注射泵。举例来说，它可以产生在约100到500纳克/毫升、或约200到400纳克/毫升或约250-300纳克/毫升范围内的治疗性肽的血液水平。

所述药物组合物还可以是经肌肉内和皮下给药的无菌注射水状或油状悬浮液的形式。这种悬浮液可以按照本领域公知技术使用如上所述的适当的分散剂或润湿剂以及助悬剂来进行配制。所述无菌注射制剂还可以是无毒的、位于胃肠外可接受稀释剂或溶剂例如1，3-丁烷-二醇中的无菌注射溶液或悬浮液。另外，无菌的非挥发性油也通常作为溶剂或悬浮介质。为了这个目的，任何刺激性少的非挥发性油包括合成的一或二脂酸甘油酯都可以采用。此外，脂肪酸如油酸在所述注射制剂中也可应用。

在某些实施方式中，优选以局部治疗的方法给药，如通过局部注射给药。例如，直接注射治疗剂到希望抑制血管生成的、显示过度增生的组织中。在一个实施方式中，治疗剂被局部地施予肿瘤床(bed)中。

在一个实施方式中，将治疗性肽掺入局部制剂之中。例如，广泛适用于局部药物给药，并且含有本领域公知的任意所述材料的局部载体。所述局部载体可以进行选择以提供期望形式的组合物，例如，作为软膏、洗液、乳油、微乳剂、凝胶、油、溶液等等，而且既可以由天然存在的材料组成也可以由合成来源的材料组成。优选选出的载体应对局部制剂的活性剂或其他的成分均无不利的作用。在此可以使用作为适当局部载体的例子包括水、酒精及其他无毒有机溶剂、甘油、矿物油、硅酮、矿脂(petroleum jelly)、羊毛脂、脂肪酸、植物油、对羟苯甲酸、石蜡等等。剂型可以是无色、无味的软膏、洗液、乳油、微乳剂以及凝胶剂。

可以将本领域技术人员公知的各种添加剂包括在制剂如局部制剂之内。添加剂的例子包括但不限于，增溶剂、皮肤透过增强剂、不透明剂、防腐剂(例如，抗氧化剂)、胶凝(gelling)剂、缓冲剂、表面活性剂(尤其是非电离和两性表面活性剂)、乳化剂、软化剂、增稠剂、稳定剂、湿润剂、着色剂、芬芳剂等等。具体优选包含增溶剂和/或皮肤透过增强剂，伴有乳化剂、软化剂和防腐剂。最适宜的局部制剂含有大约：2wt％到60wt％，优选2wt％到50wt％的增溶剂和/或皮肤透过增强剂；2wt％到50wt％，优选2wt％到20wt％的乳化剂；2wt％到20wt％的软化剂；以及0.01wt％到0.2wt％的防腐剂，活性剂以及载体(例如，水)构成为所述制剂的其余部分。

制剂中还可以包括其它活性剂，例如，其它消炎剂、止痛剂、抗微生物剂、抗真菌剂、抗生素、维生素、抗氧化剂、以及防晒剂，它通常发现于遮光剂成分中，其包括但不限于氨基苯甲酸盐、二苯甲酮(具体是二苯甲酮-3)、樟脑(camphor)衍生物、肉桂酸盐(cinnamates)(如，辛基甲氧基肉桂酸盐(octyl methoxycinnamate))、二苯甲酰甲烷(如，丁基甲氧基二苯甲酰甲烷(butyl methoxydibenzoyl methane))、对氨基苯甲酸(PABA)及其衍生物、以及水杨酸盐(例如，辛基水杨酸盐)。

局部制剂还可以被用作预防性，例如，化学预防性组合物。当被用于化学预防性的方法时，敏感皮肤在具体个体显现任何状况之前进行处理进行治疗。

治疗剂还可能以经直肠施予所述药物的栓剂形式给药。这种组合物可以通过将药物和适当的无刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在常温为固体但是在直肠温度是液态的，从而在直肠中融化来释放药物。这样的材料包括可可脂、甘油明胶、氢化植物油、各种分子量的聚乙二醇混合物以及聚乙二醇的脂肪酸酯。

对于局部用途，可以使用含有所述治疗剂的乳油、软膏、胶状物、溶液或悬浮液等等。对本申请来说，局部施用应该包括漱口药以及含漱剂(gargle)。

治疗剂可以以通过局部使用适当的鼻内媒介物和输送装置的方式进行鼻内给药，或通过透皮方法使用本领域普通技术人员熟知的透皮贴片形式给药。对于以透皮输送系统形式的给药，给药剂量在给药方案的自始至终将毫无疑问的是持续而非间断的。

所述治疗性肽可以以维持循环中恒定浓度的剂量安排进行给药。它们也可以以治疗被周期性中断例如每日一次药团注射的剂量安排进行给药。

可以单独施予治疗性肽或其变体或衍生物。可选，还可以共同施予两种或更多不同的肽。例如，只施用治疗性肽或者还可以共同施予其它血管生成抑制剂，例如美国专利No.5,290,807所述的TNP-470、美国专利No.5,639,725所述的血管抑素(Angiostatin)，内皮抑素以及Thalidomide。其它血管生成抑制剂在Genetic Engineering News，Oct.1，1998和美国专利No.6,306,819中都有所描述。

在其它实施方式中，治疗剂与所选其它众所周知的对被治疗状况特别有用的治疗剂共同给药。例如，本治疗剂联合已知的抗肿瘤和细胞毒素试剂就是十分有用的。类似地，本治疗剂联合在治疗和预防良性或恶性肿瘤中有效的试剂也是十分有益的。所述治疗性试剂可以加入化学疗法、放射疗法或者与联合免疫疗法或疫苗疗法联用。

能够与在此所述治疗剂共同给药的药物包括选自长春花生物碱、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、蒽环霉素(anthracycline)、放线菌素D、普卡霉素(plicamycin)、嘌呤霉素、短杆菌肽D、红豆杉醇(taxd)、秋水仙碱、细胞分裂抑素(cytochalasin)B、吐根碱(emetine)、美登素、或安吖啶(amsacrine)的抗肿瘤药。

能被用于化疗剂(抗肿瘤药试剂)的化合物种类包括：烷化剂，抗代谢物、天然产物和它们的衍生物、激素和类固醇(包括合成的类似物)，以及合成物质。这些种类的化合物的例子给出如下。烷化剂(包括氮芥类、氮丙啶衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)：尿嘧啶氮芥、氮芥、环磷酰胺(癌得星CytoxanTM)、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、双溴丙基哌嗪、三乙烯三聚氰胺、三乙烯硫代磷胺、白消安、亚硝脲氮芥、环己亚硝脲、链脲霉素、氮烯唑胺，以及替莫唑胺(temozolomide)。抗代谢物(mnetabolite)(包括叶酸对抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂)：氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、5-氟脱氧尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、氟达拉滨磷酸酯、戊糖苷，以及吉西他汀(Gemcitabine)。天然产物和它们的衍生物(包括长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴激活素和表鬼臼毒素)：长春花碱、长春新碱、去乙酰长春酰胺、争光霉素、放线菌素、道诺红菌素、阿霉素、表柔比星、黄胆素、太平洋紫杉醇(Paclitaxel)(太平洋紫杉醇是市售的红豆杉醇而且在下文小标题为“微管作用试剂”的分段中会有更详细地所述)、光神霉素、脱氧柯福霉素、丝裂霉素-C、左旋天冬醯胺、干扰素(具体是干扰素-α)、依托泊甙(etoposide)，以及替尼泊甙(Teniposide)。激素和类固醇(包括合成的类似物)在内：17.α.-乙炔雌二醇、己烯雌酚、睾丸激素、强的松、氟烃甲基睾丸素、甲雄烷醇酮丙酸盐、睾内酯、甲地孕酮、三苯氧胺、甲基强的松龙、甲基睾甾酮、氢化泼尼松、氟羟脱氢皮醇、氯三芳乙烯、羟孕酮、氨基苯乙哌啶酮、雌氮芥、6α-甲-17-羟孕酮醋酸酯、柳菩林、拂劼璐锭、托瑞米芬、诺雷德。合成物质(包括无机复合体例如铂配位络合物)：顺氯氨铂、卡铂(Carboplatin)、羟基脲、安吖啶、甲基苄肼、米托坦、米托蒽醌、左旋四咪唑，以及六甲三聚氰胺。

大部分这类化疗剂的安全而有效的给药方法是本领域技术人员公知的。而且，它们的给药方法在标准文献中也有所描述。例如，许多化疗剂的给药方法在“Physicians′Desk Reference”(PDR)，e.g.，2004 edition(ThomsonPDR，Montvale，N.J.07645-1742，USA)之中描述。

如果配方作为固定的剂量，所述联用产品使用在所述剂量范围内的所述组合以及批准剂量范围内的其他药学活化剂。当多重组合配方不恰当时，本发明的组合还可以与已知的药学上可接受的试剂序贯使用。

放射疗法也可以用于与在此所述的治疗剂进行组合用来治疗癌症，其包括从外部施加的波束或通过植入微小的放射源释放X射线或γ射线。

当给人类患者施予治疗剂时，每日的剂量将通常取决于医师根据年龄、体重、和个体患者的反应以及患者症状的严重程度的不同所规定的剂量。

在此所述的治疗性肽或其类似物可以是同位素标记的或者具有其他用于检测和显现内皮抑制素结合部位的分子或蛋白质，检测和显现内皮抑制素结合部位的现有技术包括但不限于，正电子发射断层扫描(positionemission tomography)、自动射线照相术(autoradiography)、流式细胞术、辐射感受器结合试验(radioreceptor binding assay)、以及免疫组织化学。标记的肽或其类似物可以用来探测和定量在体液中的内皮抑制素特异性抗体的存在。

本领域技术人员将可以理解编码内皮抑制素肽的核酸可以被用于替代在此所述的大多数具体实施方式中的肽。例如，可以通过向组织中引入在此所述的编码肽的核酸来抑制血管生成。核酸可以连接或包含转录控制元件，例如启动子或增强子。核酸可以更进一步地包含于载体例如表达载体中。示范性的表达载体包括病毒载体，例如腺病毒以及腺伴随病毒(AAV)载体。当使用一种非病毒载体时，许多方法都能用于促使核酸进入细胞，例如脂质体。

示范性的试剂盒

在此还提供了一种试剂盒，例如，治疗剂试剂盒。试剂盒可以包括在此所述的治疗性的肽以及选择性地含有所述治疗性的肽的给药装置。试剂盒还可以包括冻干形式的治疗性的肽以及用来溶解所述治疗性肽的溶液或缓冲液。试剂盒还可以包含使用说明书。

除非另有陈述，本发明的实施将使用本领域技术人员熟知的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学的常见方法。上述的技术在文献中均已得到充分的解释。见，例如，Molecular Cloning A Laboratory Manua1，2nd Ed.，ed.by Sambrook，Fritsch andManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes Iand II(D.N.Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis等美国专利No：4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames& S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods InEnzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，Cold Spring HarborLaboratory)；Methods In EnzymologY，Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating theMouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

具体实施方式：

在本发明作了一般性描述的基础上，现在为了更容易地理解，将通过参考下列实施例来说明，所述实施例仅仅是为了说明本发明的某些方面和具体实施方式，并不是为了限定本发明。

实施例1：产生抗肿瘤活性的27氨基酸内皮抑制素肽的鉴定

合成了来源于小鼠内皮抑制素和人内皮抑制素两者的24-27氨基酸的重叠肽(表1)。

表1.重叠的小鼠和人内皮抑制素肽

名字       序列

小鼠肽

mP1：HTHQDFQPVLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：4)；

mP2：MRGIRGADFQAFQQARAVGLSGTFR(SEQ ID NO：136)；

mP3：TFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRGSV(SEQ ID NO：137)；

mP4：GSVPIVNLKDEVLSPSWDSLFSGSQ(SEQ ID NO：138)；

mP5：GSQGQVQPGARIFSFDGRDVLRHPA(SEQ ID NO：139)；

mP6：HPAWPQKSVWHGSDPSGRRLMESY(SEQ ID NO：140)；

mP7：ETWRTETTGATGQASSLLSGRLLEQ(SEQ ID NO：141)；

mP8：KAASAHNSYIVLAIENSFMTSFSKKK(SEQ ID NO：142)。

人肽

hP1  1  HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRG 25(SEQ ID NO：6)

hP2  23 MRGIRGADFQ AFQQARAVGLAGTFR 47(SEQ ID NO：143)

hP3  45 TFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAV 69(SEQ ID NO：144)

hP4  67 AAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSE 91(SEQ ID NO：145)

hP5  89 GSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRttPT 113(SEQ ID NO：146)

hP6  111 HPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESY 134(SEQ ID NO：147)

hP7  136 ETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQ 160(SEQ ID NO：148)

hP8  158 LGQSAAS AHHAYIVL AIENSFMTASK

183(SEQ ID NO：149)

所述肽是内皮抑制素全长的大约1/7-1/8的长度。三个半胱氨酸，33，165，173被丙氨酸取代(表1中的下划线部分)，而且半胱氨酸135被缺失用来防止二硫键的形成。两个额外的赖氨酸被添加在hP8的C末端用来提高它的可溶性(双下划线)。除hP2为高浓度(＞2.5mg/ml)时之外，大多数肽都是水溶性的。并且所有的肽都是大约70％纯的。然而，当使用纯度超过95％的所述肽时，也并没有观察到在肿瘤抑制存在差异。

使用植入SCID小鼠背部皮下的人类胰腺肿瘤细胞BxPC-3细胞进行了这些肽抗肿瘤活性的最初测试。由于自小鼠循环中的高清除率，对于全身治疗，将人类内皮抑制素肽P1-P8以7毫克/千克/天、每天两次的量进行皮下(s.c.)给药。全长的Fc-内皮抑制素hFcES，仅以20毫克/千克/天、每天一次的量进行皮下给药。PBS则用于作为一组对照。每三天测量肿瘤并且在第28天时进行最终测量，结果显示在图1中(标明了每个条的T/C而且每一组的样本量n为3)。

内皮抑制素N末端hP1肽抑制BxPC-339％(p＝0.077)，而全长的内皮抑制素为44％(p＝0.0057)(图1)。其他两个肽，hP2和hP5，也显示了一些较小的抗肿瘤活性，其中hP2抑制BxPC-319％(p＝0.48)，而hP5为29％(p＝0.15)。其他的肽没有产生效果(图1)。与全长的内皮抑制素相比，大部分抗肿瘤活性都是与N末端hP1肽有关的。虽然由于每一组中的小鼠样本量很少(n＝3)，hP1、hP2和hP5的肿瘤抑制并不是呈现统计显著性，但是这些肽抑制肿瘤的趋势促进在鼠LLC模型中进一步研究所述肽抑制肿瘤的作用。而且，所述肽和全长的内皮抑制素并不是等摩尔浓度的。然而，这些数据显示出内皮抑制素的抗肿瘤性质可能位于它的N末端区域中。

内皮抑制素N末端27个氨基酸的肽导致了它的抗肿瘤性质

使用鼠LLC肿瘤模型(O′Reilly et al.(1994)Cell，79：315-328)进一步表征这些肽的特性，因为这类肿瘤比BxPC-3细胞生长得更快，从而允许更短的治疗周期。合成了内皮抑制素肽的鼠类似物。在人肽和鼠肽之间仅有的差异就是鼠P1肽包含27个氨基酸而人P1是25个氨基酸。在上述的实验中我们仅测试那些显示抗肿瘤活性的肽(见图1)。

不同于对BxPC-3的处理，LLC肿瘤是用等摩尔浓度的鼠内皮抑制素和鼠肽(mP1、mP2、mP5、和mP6)进行处理的。mP6被用作一种常用的对照肽，因为它没有抗肿瘤活性(参见图1)。对照小鼠用PBS进行处理。在这些实验中，LLC细胞被植入到C5781/6J小鼠背部皮下，然后进行全身治疗。肽(mP1、mP2、mP5、和mP6)以2.8/毫克/千克/天、每天两次的剂量注射(皮下)，而内皮抑制素和磷酸缓冲液以20/毫克/千克/天、每天一次的剂量给药。内皮抑制素N末端的mP1肽抑制LLC 44％(p＜0.035)这与全长的内皮抑制素的作用相当(53％，p＜0.01)(图2A；图中还给出了T/C的值)。使用与mP1肽浓度的相同mP2、mP5和mP6检测到无或不明显的活性(图2A)。因此，这一结果说明27个氨基酸的mP1肽包含了所有内皮抑制素相关的所有抗肿瘤活性。

为了确定mP1处理之后对血管生成的影响，还分析了经过等摩尔浓度的mP1、mP2和内皮抑制素处理的LLC肿瘤的血管密度(CD31)。图2B显示了经过PBS(对照)、Fc-内皮抑制素(20/毫克/千克/天)、mP1(2.8/毫克/千克/天)以及mP2(2.8/毫克/千克/天)处理后的小鼠LLC切片的CD31染色。在所有情况下，所述肽以每天两次皮下进行给药，然后将从第13天开始，对LLC肿瘤切片进行福尔马林-固定与石蜡-包埋，然后用CD31(PECAM)染色。图2C显示了血管密度的测定，Y轴表示为％CD31/高倍视野(hpf)。经mP1和内皮抑制素处理的LLC血管密度显著地降低(大约65％，p＜0.015)，而mP2和PBS没有效果。mP5和mP6的处理显示了与mp2处理相似的结果。这些结果说明mP1可以以与全长内皮抑制素相似的方式通过降低血管密度来抑制LLC肿瘤生长。

在内皮抑制素位置1和3的组氨酸对于锌结合是重要的

内皮抑制素的晶体结构显示出高度折叠的分子(图2D)。但是，N末端区域是类似无规卷曲的结构，这符合我们关于对应这个区域的合成肽可模拟天然分子的分析(图2D)。

由于内皮抑制素N末端区域导致它的抗肿瘤活性，于是我们想进一步研究mP1肽。锌原子与每个内皮抑制素分子都有关(Ding et al.(1998)ProcNatl Acad Sci USA，95：10443-10448)。基于我们的晶体结构分析，处于位置1、3和11的三个组氨酸加上处于位置76的丁氨二酸为锌原子构成了四个配位物(coordinate)(Ding et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA，95：10443-10448)。mP1包含了如上所述的三个组氨酸。这产生了所述肽能够通过由一个水分子占领第四个配位物而结合锌的可能性(图3A，左图)。过去已经显示了组氨酸1和3的突变破坏内皮抑制素与锌的结合(Boehm et al.(1998)Biochem Biophys Res Commun，252：190-194)。因此，合成了将mP1肽位置1和3的组氨酸突变为丙氨酸的突变体。这种突变肽叫做mP1-H1/3A(也可以叫做mP1-H)，并具有下列氨基酸序列：ATAQDFQPVIHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO：150)。mP1和mP1-H1/3A的序列在图3A中也表明。

为了确定mP1和mP1-H1/3A的锌结合力，进行了燃烧原子吸收实验(flame atomic absorption)。将两种肽溶于20mM，pH为8.0的Tris溶液，其浓度为0.5mg/ml，混合过量的氯化锌(1mM)，然后在透析溶液中用上述缓冲液进行72小时的透析，其间换液三次(截留分子量(MWCO)＝1000kDa；所述肽的分子量认为是3000kDa)。最终确定终锌浓度的原子吸收读数(μg/ml)，mP1和mP1-H1/3A分别为9.63和1.05。这些数据显示锌的比率对于每分子mP1-H1/3A为0.1而对于每分子mP1为0.9(图3B)。因此，在位置1和3的组氨酸突变为丙氨酸消除了锌的结合(图3A，右图)。

内皮抑制素的锌结合区域对它的抗肿瘤活性是重要的

利用LLC肿瘤模型检测mP1和mP1-H1/3A，确定锌结合对于内皮抑制素的抗肿瘤性质是否同样重要。肽以2.8/毫克/千克/天、每天两次的剂量进行给药(皮下)。肽mP1对LLC的抑制为42％(p＝0.031)，而mP1-H1/3A则没有效果(图3C)。在经过mP1和mP1-H1/3A处理之后分析LLC肿瘤的血管密度(CD31)，确定血管生成是否存在差异。在mP1处理之后血管密度出现了相当大的降低(降低67％，p＜0.01)，而mP1-H1/3A的结果与PBS的结果类似(图3D和3E)。这些数据说明锌的结合对于内皮抑制素的抗肿瘤性质是重要的。统计分析中应用了不成对的Student t检验。

其他处理包括皮下注射mP1-H肽和1mM的Zn²⁺；皮下单独注射mP1肽或同时还注射1mM的Zn²⁺；或者皮下注射PBS(图4)。图3和4显现的结果表明给药其中组氨酸1和3转换为丙氨酸的mP1-H1/3A基本上没有影响肿瘤体积，因为其肿瘤质量与注射PBS(阴性对照)获得的结果相似。

因此，这些结果表明处于内皮抑制素肽N末端位置1和3的组氨酸不能被丙氨酸取代，而且它们与另一个氨基酸的置换也可能会降低或消除所述肽的抗肿瘤作用。这个结果进一步表明含有所述肽的组合物中包括锌也许是有益的，除非循环中已经有锌存在。

内皮抑制素的N末端片段保留它抑制内皮细胞迁移的能力

检测了内皮抑制素肽的抗内皮细胞迁移活性。使用若干种剂量的内皮抑制素肽确定对人微脉管内皮细胞(HMVECs)的VEGF诱导迁移的抑制(图5)。使用人肽是由于所述细胞是人源的，HMVEC的迁移反应使用经修饰的Boyden小室进行分析。使用VEGF(5ng/ml)作为趋化剂，细胞由人内皮抑制素(Entremed；EM-ES)、人Fc-内皮抑制素(nFcES)、人P1(hP1)、人P2(hP2)、人P6(hP6)以及人P1-H1/3A(hP1-H1/3A)攻击。利用Scion图像软件(NationalInstitutes of Health)可以从捕捉的图像中测量每一层膜的迁移总数，而且统计分析中还应用了不成对的Student t检验。人重组内皮抑制素(Entremed)在500和200ng/ml(30％)而不是100ng/ml抑制内皮细胞迁移，而人Fc-内皮抑制素产生同样的抑制是在500和100ng/ml(25-30％)的浓度之间(图5)。有趣的是，观察到在100ng/ml的Fc-内皮抑制素和200ng/ml的内皮抑制素(Entremed)对内皮细胞迁移的抑制稍好于更高浓度的情况，这说明了内皮抑制素反应的U形分布。hP1最好的抑制作用是在100、62.5和25ng/ml时。在这些浓度之间没有观察到明显的差别。在升高或降低的浓度中则观察到降低的或无抑制作用。在hP1为500ng/ml时观察不到抑制作用。因此，与全长的内皮抑制素相似，hP1对内皮细胞迁移的抑制作用也存在U形反应。内皮抑制素hP2肽即使在较高的浓度也根本没有效果。然而，hP6却在比hP1更高的浓度抑制内皮细胞迁移，在浓度低于100ng/ml时观察不到抑制作用。

还检测了hP1-H1/3A，确定锌结合对于抗内皮细胞迁移活性是否重要。这些突变体肽在200和100ng/ml浓度时确实显示了一些微小的抑制作用。但是，这些抑制作用在统计上是不显著的。因此，肽hP1可以在与全长内皮抑制素或人内皮抑制素(EntreMed)(200ng/ml)等摩尔浓度(25ng/ml)的情况下抑制VEGF诱导的内皮细胞迁移，而hP6仅在100和200ng/ml的剂量出现抑制。有趣的是，hP1在抑制内皮细胞迁移方面比全长的内皮抑制素更有效。这种结果说明内皮抑制素N末端的P1肽保持了抑制VEGF诱导的内皮细胞迁移的能力，而锌结合部位是这种活性的关键。

内皮抑制素肽的抗渗透性活性

也利用Miles试验(Miles and Miles(1952)J Physiol，118：228-257)检测了内皮抑素肽抑制VEGF诱导的渗透性的能力。以前利用Miles试验已经显示了内皮抑制素可抑制VEGF诱导的渗透性。在进行Miles试验5天以前对免疫损伤的SCID小鼠进行处理。具体地说，对SCID小鼠皮下注射(s.c.；每天两次)100毫克/千克/天剂量的人内皮抑制素(EntreMed；EM-ES)；20毫克/千克/天剂量的鼠Fc-内皮抑制素；2.8毫克/千克/天或14毫克/千克/天剂量的鼠内皮抑制素肽mP1和mP1-H1/3A；或者PBS(样本数为3)，持续5天。在高剂量(14毫克/千克/天)时，mP1和mP1-H1/3A对VEGF诱导的渗透性的抑制作用与人内皮抑制素(EntreMed)和鼠Fc-内皮抑制素相当(图6)。然而，当使用等摩尔浓度(2.8毫克/千克/天)时也获得了相似的结果(图6)。由于甚至在等摩尔浓度时mP1-H1/3A也显示了与mP1相同的抑制作用，这说明抗肿瘤活性和抗渗透性活性是分开的。

来源于mP1的更小的肽也显示出抑制肿瘤生长的作用。利用LLC肿瘤模型测定了两种肽，mP1-15(SEQ ID NO：118)和mP1-20(SEQ ID NO：108)的抗肿瘤活性。以2.8毫克/千克/天的剂量在第4、7、10和14天用所述肽每天两次进行皮下给药。PBS作为对照。图7显示了mP1-15和mP1-20均有抑制肿瘤体积的作用(标明了T/C而且每一组的样本量n为5)。

因此，我们显示相当于内皮抑制素的N末端的合成肽，决定着它的抗肿瘤、抗迁移以及抗渗透性活性。锌的结合是所述抗肿瘤和抗迁移活性需要的，因为在所述肽中氨基酸位置1和3上两个组氨酸的置换会完全地阻断它的性质。然而，对于抗渗透性性质来说锌的结合是不需要的。

内皮抑制素抑制肿瘤形成对于结合锌的需要已经引起争论，从不同的组中报告了冲突的结果(Boehm et al.(1998)Biochem Biophys Res Commun，252：190-194；Yamaguchi et al.(1999)Embo J，18：4414-4423；Sim et al.(1999)Angiogenesis，3：41-51)。然而，最早的报告显示由丙氨酸对组氨酸1和3的取代阻断了内皮抑制素在LLC中的抑制效果(Boehm et al.(1998)BiochemBiophys Res Commun，252：190-194)，两个在后的出版物则挑战了这一发现(Yamaguchi et al.(1999)Embo J，18：4414-4423；Sim et al.(1999)Angiogenesis，3：41-51)。在其中一个上述报告中，通过在C末端和N末端都删除5个氨基酸而制备成内皮抑制素突变体(Yamaguchi et al.(1999)Embo J，18：4414-4423)。这种构建体得到了与全长的内皮抑制素相似的抗肿瘤活性。然而，在使用肾Rc-9癌肿瘤模型中，当肿瘤大小为300立方毫米时开始进行内皮抑制素给药，这样持续仅4天后，肿瘤大小达到了500立方毫米。注射部位是在肿瘤的周围，注射剂量为10微克/千克/天。与此相反，在我们的实验中，当LLC肿瘤到达约100立方毫米大小的开始进行治疗处理，一直持续到肿瘤成为约6000-7000立方毫米。而且，我们进行全身治疗处理而不是注射到肿瘤的外周组织中。

另一个涉及内皮抑制素抗肿瘤活性与结合锌的关联性的出版物，证明从人内皮抑制素N末端除去4个氨基酸的“HSHR”并未影响它的抗肿瘤活性(Sim et al.(1999)Angiogenesis，3：41-51)。锌结合的测定显示这种突变体结合2原子的锌每分子内皮抑制素，而其野生型结合10原子的锌每个内皮抑制素分子。然而，在我们的内皮抑制素晶体结构研究中，我们已经证明那些用于结晶研究的内皮抑制素含有1原子锌/内皮抑制素分子而除去N末端4个氨基酸的“HSHR”会缺乏锌的结合(Ding et al.(1998)Proc Natl Acad SciUSA，95：10443-10448)。

内皮抑制素是通过蛋白水解裂解胶原18生成的(O′Reilly et al.(1997)Cell，88：277-285；Wen et al.(1999)Cancer Res，59：6052-6056；Felbor et al.(2000)Embo J，19：1187-1194)。内皮抑制素N末端的第一个氨基酸是组氨酸。组氨酸存在对于锌结合内皮抑制素是重要的。因此，引导我们可以推断出胶原18到内皮抑制素的加工过程中可能是受到高度调节的。

一些组显示出来源于内皮抑素的肽具有抗血管生成作用(Wickstrom etal.(2004)J Biol Chem，279：20178-20185；Cattaneo et al.(2003)Exp Cell Res，283：230-236；Chillemi et al.(2003)J Med Chem，46：4165-4172；Morbidelli etal.(2003)Clin Cancer Res，9：5358-5369；Cho et al.(2004)Oncol Rep，11：191-195)。含有氨基酸6-49的N末端肽(缺少锌结合型组氨酸)能够抑制内皮细胞的增生和迁移(Cattaneo et al.(2003)Exp Cell Res，283：230-236；Chillemi et al.(2003)J Med Chem，46：4165-4172)。使用这种肽进行的Matrigel试验得到在体内具有血管生成抑制作用的结果。但是，并无抗癌的数据。在另一个研究中，保留了Cys135-Cys165二硫键的C末端肽(氨基酸135-184)显示其具有抗肿瘤活性(Morbidelli et al.(2003)Clin Cancer Res，9：5358-5369)。然而，所述肽是在肿瘤周围给药而不是全身给药的。Cho等显示了包括锌结合位点的N末端并不需要内皮抑素的C末端就具有抗肿瘤活性(Cho et al.(2004)Oncol Rep，11：191-195)。然而，这种肽和全长的内皮抑素并不是在等摩尔浓度下进行试验的。我们的结果与这些组的不同之处在于P1肽可以在与全长内皮抑素等摩尔浓度的条件下抑制肿瘤的形成、迁移和渗透性。此外，较高浓度(14毫克/千克/天)的mP2以及2.8毫克/千克/天的mP1，可以抑制LLC肿瘤的形成。然而，14毫克/千克/天的mP1对LLC肿瘤形成的抑制作用小于2.8毫克/千克/天的情况。因此，内皮抑素的抗肿瘤活性作为所述蛋白质浓度的函数似乎是U形曲线。在使用胰腺BxPC-3和ASPC-1肿瘤模型对全长的内皮抑素进行实验时观察到了类似的结果。所以，最适宜内皮抑素浓度的确定可能是重要因素。内皮抑素的体外试验也显示出类似的二相性特性曲线，例如在迁移试验中观察到的那样(参见图5)。

全长的内皮抑素并不是它的抗肿瘤活性所需的事实解释了最初内皮抑素活性的不一致性。内皮抑素具有两个二硫键。大肠杆菌制剂中的内皮抑素聚集体是由于PBS透析后的随机的分子间二硫化物所引起的。然而，在还原条件下，内皮抑素显示为单个的蛋白质分子，在非还原条件下，同一样品中的大部分蛋白都不会进入聚丙烯酰胺凝胶。非特异性的聚集体存在的程度很可能是一些制剂缺乏活性的原因。在一段时间以后内皮抑素很可能从动物体内的聚集体中释放出来，从而产生变性蛋白或部分片段，其由于它们的N末端肽而能够显示抗肿瘤性质。推测起来，一些制剂产生了更大的聚集体，使得释放效率降低而得到在小鼠体内并不会引起抗血管生成反应的产品。

什么是内皮抑素抗肿瘤活性的基础呢？已经提出了很多机理。其中一个更详细的研究是内皮抑素与整联蛋白α5β1的结合(Wickstrom et al.(2002)Cancer Res，62：5580-5589)。基于这些作者的发现，一些细胞表面蛋白的装配以及包括α5β1的成分负责内皮抑素和这种整联蛋白的互相作用(Wickstrom et al.(2003)J Biol Chem，278：37895-37901)。然而，不存在抗肿瘤数据来证实上述机理。近年来，相同的作者显示了来源于含有精氨酸的内皮抑素的11氨基酸肽，还显示出与肝素的结合负责内皮抑素的抗血管生成活性(Wickstrom et al.(2004)J Biol Chem，279：20178-20185)。我们推测研究者们观察到的那些现象反映了内皮抑素与肝素结合特征相关的一些性质，而不是它的抗肿瘤活性。以前，我们报道了内皮抑素与肝素的结合的破坏(通过在突变蛋白质表面上两个不连续的精氨酸实现)阻遏了细胞运动性(Kuo et al.(2001)J Cell Biol，152：1233-1246)。此外，我们的内皮抑素hP3肽(参见表1)，其含有作者报告过的肽，并不能抑制肿瘤生长。

材料和方法：

细胞培养物和化学试剂

人BxPC-3胰腺癌和Lewis肺癌(LLC)细胞的生长和保存如以前描述(Kisker et al.(2001)Cancer Res，61：7669-7674；O′Reilly et al.(1994)Cell，79：315-328)。为了BxPC-3肿瘤细胞的注射，细胞生长在900-cm2的滚轴(roller)瓶中。人微脉管内皮细胞(HMVEC-d；Clonetics，Walkersville，MD)培养在微脉管内皮细胞生长培养基中(EGM-2MV；Clonetics)，并且保存在5％CO₂、37℃的加湿恒温箱中。重组体人内皮抑素是EntreMed公司(Rockville，MD)的慷慨的赠品而重组体人和鼠的Fc-内皮抑素是如同以前的描述制备而成的(Bergers et al.(1999)Science，284：808-812)。人和鼠的内皮抑素肽是由SynPep公司合成的(Dublin，CA)。所述肽再悬浮于PBS或50mM Tris、150mM NaCl，pH为7.5中。PECAM、纯化的大鼠抗小鼠CD31是从BDPharmingen(San Diego，CA)获得的，人重组体VEGF是从NIH(Bethesda，MD)获得。

动物研究

所有的动物实验操作都是遵照波士顿儿童医院(Boston Children′sHospital)的指南进行的，而且草案都是经过动物保护和使用制度委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准的。使用了雄性(24-27克)具有免疫能力的C57B1/6J小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)和免疫受损的SCID小鼠(Massachusetts General Hospital，Boston，MA)。小鼠年龄为7-9周大小。它们是驯化的，五个一组关在有栅栏保护装置的笼中，并且用不限量的动物食物以及水进行喂养。在进行所有外科手术操作之前都通过吸入异氟烷(Baxter，Deerfield，IL)对动物进行麻醉并且观察直到完全恢复。通过一种致死量的CO₂窒息对动物进行安乐死。

肿瘤模型

BxPC-3和LLC细胞生长在如上所述的细胞培养物中。细胞浓度调节在50×10⁶细胞/毫升。在注射肿瘤细胞之前，小鼠进行了剃毛并且背部的皮肤用乙醇进行清洗。将5×10⁶肿瘤细胞在0.1毫升RPMI-1640(对于BxPC-3)或DMEM(对于LLC)中的悬浮液经皮下(s.c.)注射到小鼠背部邻近中线的部位。将BxPC-3细胞植入SCID小鼠而LLC植入C57B1/6J小鼠。

具有Lewis肺癌(600-800立方毫米肿瘤)的动物进行安乐死，并且覆盖肿瘤的皮肤用聚维酮碘(Betadine)和乙醇清洗。肿瘤组织在无菌状态下切除。肿瘤细胞在0.9％生理盐水中的悬浮液通过使有活力的肿瘤组织通过滤网和一系列依次变小的、直径22-到30-规格的皮下注射针头来制备。调节最终浓度到1×10⁷细胞/毫升，然后将悬浮液置于冰上。肿瘤细胞的注射操作如上所述。

称量小鼠重量并且每3-5天用一个刻度卡尺测量肿瘤的两处直径。体积用公式a²×b×0.52来确定(其中a是最短的直径而b是最长的直径)。数据表示为治疗的肿瘤相对于对照的体积(T/C)。在各个实验完成以后，对小鼠实施CO₂窒息的安乐死。肿瘤在10％缓冲福尔马林(Fisher Scientific，FairLawn，NJ)中固定然后进行石蜡包埋。

为了治疗携带肿瘤小鼠，允许肿瘤体积生长到大约100立方毫米，而且小鼠是随机化的。通过皮下单次药团注射的方式进行治疗。所述肽每天两次(每12小时)进行给药。所述肽的剂量相对于所述肽的纯度(大约70％)进行校正。例如，给小鼠注射4毫克/千克/天的所述肽经过校正之后实际上是注射了2.8毫克/千克/天。统计分析用到了不成对的Studentt-测验。

免疫组织化学

将肿瘤在4℃的10％缓冲福尔马林中固定过夜。第二天，将肿瘤在PBS中洗涤三次然后进行石蜡包埋。用40μg/ml的蛋白酶K(Roche DiagnosticsCorp.)在0.2M Tris-HCl缓冲液(pH7.6)中，于37℃对切片(5μm)进行可渗透化处理25分钟然后用PBS洗涤。PECAM(1∶250)在4℃过夜保温。染色通过使用酪胺(tyramide)信号放大直接和间接试剂盒(NEN Life ScienceProducts Inc.，Boston，MA)增强。使用NIKON TE300显微镜在400x放大下对切片进行照像。血管密度(三处平均)由IPLab软件来确定。统计分析用到了不成对的Studentt-测验。

细胞迁移试验

使用改良的Boyden小室测定HMVEC-d细胞的运动性反应。在迁移试验之前将细胞以0.5×10⁶细胞每烧瓶的浓度平铺在T75-cm²烧瓶中，生长48小时(～70％融合的)。为便于细胞粘着，37℃在transwell(8mm气孔；Costar)的上层膜用纤粘连蛋白涂布1小时。涂布后的膜用PBS冲洗然后风干立即使用。用胰蛋白酶处理脱离的细胞，用胰酶化的中和溶液(Clonetics)处理，然后在含有0.1％BSA的无血清内皮基本培养基(EBM；Clonetics)中以终浓度1×10⁶细胞/毫升重悬浮。然后用0.2毫升含有注明浓度的内皮抑素或肽的EBM/BSA处理细胞(200,000，在0.2毫升中)。细胞在37℃不定期振荡培养20分钟。在transwell的上方小室中加入细胞(50,000在100μl中)。在下方小室中加入EBM或添加了VEGF(5ng/ml)的EBM，然后在含有5％CO₂的加湿恒温箱中让细胞向底部小室迁移4小时。用PBS润洗transwell过滤物一次然后利用Diff-Quik染色试剂盒(Baxter)按照厂商的规程进行固定和染色。用棉拭将非迁移的细胞从上方小室中去除。将染色的滤纸从小室中剪出并使用Permount(Fisher)覆于载玻片上。利用显微镜计数迁移细胞的数目(利用40x物镜从每个膜的三个视野获得)，而且还可以利用SPOT软件由CCD摄像机捕获影象。每片薄膜的总迁移数由Scion Image软件(NationalInstitutes of Health)捕获的影象来定量。所有的实验均一式三份进行。统计分析用到了不成对的Studentt-测验。

Miles血管通透性试验(Miles试验)

在进行Miles试验(25)之前，对SCID小鼠皮下(s.c.)注射人内皮抑素(EntreMed；100毫克/千克/天)、鼠Fc-内皮抑素(20毫克/千克/天)、肽(14毫克/千克/天或2.8毫克/千克/天)以及盐(200μl)(n＝12)，持续5天。简要地，Evan氏蓝染料(100μl的1％PBS溶液)经静脉注射(i.v.)到小鼠体内。经过10分钟后，皮内注射50μl的人重组体VEGF(1ng/μl)或者PBS到预前剃好毛的背部皮内。20分钟之后对动物进行安乐死，然后去掉包括由染料渗漏引起的蓝斑的皮肤区域。用甲酰胺在室温保温5天提取出Evan氏蓝染料，然后用分光光度计在620纳米测定提取的染料的吸光率。统计分析用到了不成对的Studentt-测验。

统计方法

表示为平均数的数据+标准偏差。利用Student t检验评价统计显著性。P＜0.05就认为是统计上显著的。

参考文献的并入

所有引用过的参考文献中的内容(包括本申请一直引用的参考文献书目、GenBank登录号、公布的专利、公开的专利申请)在此都明确地并入以供参考。

等同方案

本领域技术人员仅仅利用常规实验就可以认定或能够探知本发明描述的具体实施方式的许多等同方案。所述等同方案旨在包含在权利要求中。

Claims (20)

1.抗血管生成肽，它包含SEQ ID No.2或4的约12个氨基酸或由SEQ IDNo.2或4的约12个氨基酸组成。

2.权利要求1所述的抗血管生成肽，它包含SEQ ID No.2或4的约15个氨基酸或由SEQ ID No.2或4的约15个氨基酸组成。

3.权利要求2所述的抗血管生成肽，它包含SEQ ID No.2或4的约18个氨基酸或由SEQ ID No.2或4的约18个氨基酸组成。

4.权利要求1所述的抗血管生成肽，其为选自下组的序列：SEQ ID No.6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，125，126，127，128，129，130或131。

5.权利要求1所述的抗血管生成肽，它是SEQ ID No.2或4。

6.药物组合物，它含有药学上可接受的载体和有效量的权利要求1所述的抗血管生成肽。

7.权利要求6所述的药物组合物，它还另外含有第二种肽。

8.权利要求6所述的药物组合物，它还另外含有有效量的锌。

9.权利要求6所述的药物组合物，  其中所述抗血管生成肽是SEQ IDNo.2或4。

10.核酸，它编码权利要求1所述的抗血管生成肽。

11.核酸，它包含SEQ ID No.1、3或5的约36个核苷酸或由SEQ ID No.1、3或5的约36个核苷酸组成。

12.核酸，它包含SEQ ID No.1、3或5的约60个核苷酸或由SEQ ID No.1、3或5的约60个核苷酸组成。

13.权利要求10所述的核酸，其为选自下组的序列：SEQ ID No.1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121或123。

14.载体，它含有权利要求10所述的核酸。

15.药物组合物，它含有权利要求14所述的载体和药学上可接受的载体。

16.治疗或预防受试者中的血管生成相关疾病的方法，包括给药受试者权利要求5所述的药物组合物。

17.治疗或预防受试者中的血管生成相关疾病的方法，包括给药受试者权利要求8所述的药物组合物。

18.治疗或预防受试者中的血管生成相关疾病的方法，包括给药受试者权利要求9所述的药物组合物。

19.治疗或预防受试者中的血管生成相关疾病的方法，包括给药受试者权利要求15所述的药物组合物。

20.如权利要求16所述的方法，其中所述的血管生成相关疾病是选自下组的疾病：动脉粥样硬化，血管瘤，实体肿瘤，白血病，转移，毛细血管扩张牛皮癣硬皮病，脓性肉芽肿，心肌血管生成，动脉粥样斑新血管化，冠状动脉侧支形成，大脑侧支形成，动静脉畸形、缺血性四肢血管生成，角膜疾病，虹膜潮红，新生血管性青光眼，糖尿病性视网膜病，晶状体后纤维组织形成，关节炎，糖尿病性新血管化，黄斑变性，伤口愈合，胃溃疡，骨折，瘢痕瘤，类天疱疮(phemphigoid)，沙眼，血管发生和造血作用。

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