CN115991739A - 一种抗肿瘤的多肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤的多肽及其制备方法和应用。所述多肽的氨基酸序列通式如下：FX₁PVLX₂LVALNX₃；其中：X₁、X₂和X₃分别为任意的L型或D型的天然氨基酸。本发明的多肽具有良好的肿瘤抑制活性，可通过抑制血管形成细胞例如人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)增殖，抑制肿瘤细胞迁移。本发明的多肽体内代谢具有可预测性，容易合成，具有高选择性和高活性，安全性高，可高通量标准化生产，较单克隆抗体的生产成本更低，更易生产，具有良好的临床应用潜力。

Description

一种抗肿瘤的多肽及其制备方法和应用

本申请要求申请日为2021/12/20的中国专利申请CN202111567350.2的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗肿瘤的多肽及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤的生长过程可分为两个时期：血管前期和血管期。血管前期因缺少血液的供应，肿瘤处于休眠状态，直径1-2mm，并不发病；血管期因获得充足的血液供应，肿瘤体积快速增大，产生浸润、转移，并诱导新生血管生成。肿瘤血管形成(angiogenesis)是指肿瘤细胞诱导的微血管生长以及肿瘤中血液循环建立的过程。肿瘤新生血管形成过程中受血管形成的促进因子和抑制因子调节。血管形成抑制因子通过抑制肿瘤组织血管形成，断绝血液供应，间接的抑制肿瘤细胞的增长。用血管形成抑制因子治疗肿瘤具有抗瘤谱广、没有毒副作用、不产生耐药性等优点。血管形成抑制因子不能直接杀伤肿瘤细胞，停药后肿瘤会复发，因此血管形成抑制因子主要是作为化疗药物的辅助药物，配合化疗药物使用，用以减少化疗药物剂量，降低化疗药物的毒性。

恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病，寻找新型高效、低毒的抗肿瘤药物抑制是国内外医药研发的热点。小分子多肽具有分子量小、低毒性、高活性、易于穿透肿瘤细胞等特点，且能以多种方式给药、易于多途径吸收、不易产生耐药性。蛋白质类大分子药物分子量大、结构复杂，不易穿透细胞，且具有免疫原性，而小分子多肽结构易于改造，人工合成成本较低，由于其具有相对分子质量(Mr)小、活性高、毒性低的特点，在肿瘤的临床治疗上有重要的价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术缺少具有抗肿瘤活性的小分子多肽药物的不足，提供一种抗肿瘤的多肽及其制备方法和应用。所述抗肿瘤多肽具有良好的肿瘤抑制活性，例如可抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)增殖和肿瘤细胞迁移。具有良好的临床应用潜力。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：

本发明的第一方面提供一种多肽，所述多肽的氨基酸序列通式如SEQ IDNO:1所示：

FX₁PVLX₂LVALNX₃(SEQ ID NO:1)；

其中：X₁、X₂和X₃分别为任意的L型或D型的天然氨基酸。本发明一些实施方案中，X₃为S或T。

本发明一些实施方案中，X₁为N、D、Q或E；优选Q。

本发明一些实施方案中，X₂为H、K或R；优选H。

本发明一些具体实施方案中，X₁为Q，X₂为H，X₃为S。例如，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明的第二方面提供一种制备如第一方面所述的多肽的方法，所述方法选自自然提取、酶水解法、发酵法、基因工程表达和化学合成。

本发明的第三方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如第一方面所述的多肽。

本发明一些实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

本发明中，所述药学上可接受的载体可以为药学上可接受的药物辅料。所述药物辅料可为本领域常规，较佳地包括药学上可接受的赋形剂、填充剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、泡腾剂、表面活性剂、吸收促进剂、润滑剂、吸附载体、缓释微球、埋植剂、原位微球、脂质体、微乳、原位水凝胶、纳米粒、蛋白酶抑制剂、生物黏附剂等。

本发明的第四方面提供一种如第一方面所述的多肽或者如第三方面所述的药物组合物在制备治疗和/或预防疾病的药物中的应用。

本发明一些实施方案中，所述疾病为肿瘤。

本发明中，所述肿瘤可为本领域常规，较佳地为肺癌、肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌或者神经胶质瘤。所述肺癌例如为非小细胞肺癌或小细胞肺癌；所述肠癌例如为结肠癌或直肠癌；所述胰腺癌例如为胰腺导管腺癌或胰腺腺泡细胞癌；所述乳腺癌例如为非浸润性乳腺癌、早期浸润性乳腺癌；所述肝癌例如为原发性肝癌或继发性肝癌；所述神经胶质瘤例如为星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、松果体瘤或脉络丛乳头状瘤。

本发明一些具体实施方案中，所述肿瘤为肝癌。

本发明的第五方面提供一种套装药盒，所述套装药盒包括药盒A和药盒B；

其中，所述药盒A包括如第一方面所述的多肽或者如第三方面所述的药物组合物；所述药盒B包括其他治疗剂。

本发明一些实施方案中，所述药盒A与药盒B的施用时间不分先后或者先施用所述药盒A。

本发明一些实施方案中，所述施用的途径包括口服给药、吸入式给药、鼻腔给药、眼部给药、经皮给药和注射给药。

本发明一些具体实施方案中，所述注射给药包括静脉滴注给药、腹腔注射给药、皮下注射给药或肌肉注射给药。

本发明中，所述多肽、药物组合物或套装药盒的剂型为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。

本发明中，所述治疗和/或预防较佳地是指存在可能的疾病因素例如肿瘤因素时，使用后防止或降低肿瘤的产生，或者存在病灶时，减轻肿瘤的程度，或者治愈肿瘤使之正常化，或者减缓或延迟肿瘤的进程，或者减轻肿瘤引起的症状。

本发明的第六方面提供一种分离的核酸，所述核酸编码如第一方面所述的多肽。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的多肽具有良好的肿瘤抑制活性，可通过抑制血管形成细胞例如人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)增殖，抑制肿瘤细胞迁移。管内皮细胞增殖是血管生成的重要步骤，因而能抑制内皮细胞增殖的物质就有可能抑制血管生成，表明本发明多肽可能通过抑制肿瘤组织血管形成，断绝血液供应，间接的抑制肿瘤并抑制肿瘤迁移。作为小分子多肽，本发明的多肽克服了大多数单克隆抗体由于分子量大而不能穿透肿瘤的缺点，避免了产生免疫原性的风险，以及避免了当单克隆抗体被人源化后聚集在肝脏和肾脏等排泄器官的情况发生。本发明的多肽体内代谢具有可预测性，容易合成，具有高选择性和高活性，安全性高，可高通量标准化生产，较单克隆抗体的生产成本更低，更易生产，具有良好的临床应用潜力。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例中使用的试剂材料如表1所示：

表1试剂材料

实施例中使用的受试物(多肽TB1001和TB1002)由珠海市藤栢医药有限公司合成，纯度≥95％，以冻干粉形式在-85～-70℃避光保存。

实施例中使用的对照品1(TB01)由珠海市藤栢医药有限公司合成，其氨基酸序列为RGDRGDMHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGM(SEQ ID NO:2)。

实施例1中的完全培养基为人脐静脉内皮细胞完全培养基，实施例2、实施例3中的完全培养基为89％基础培养基+10％ FBS+1％青-链霉素，其中％为质量体积百分比。

实施例中使用的仪器设备如表2所示：

表2仪器设备

实施例中受试物溶液的配制如下：

精确称取1mg样品，加入0.480mL纯水及20μL 10％醋酸溶液配制为A溶液，取A溶液0.3mL，加入0.1mL纯水，轻柔摇晃使药物混匀，避免产生泡沫(如产生泡沫，需静置至消泡)。用亲水性除菌过滤器(0.22μm PES滤膜)将样品溶液进行无菌过滤，配制成浓度为1.5mg/mL的工作液，再用实施例1的完全培养基进行稀释使用。

实施例中受试物的氨基酸序列为：FQPVLHLVALNS-NH₂(SEQ ID NO:3)。

实施例中对照品溶液的配制如下：

1、TB01配制：

将1mL纯水或5％(m/v)葡萄糖注射液注入2mg注射用HYD-PEP06药瓶中，轻柔摇晃使药物重新溶解，避免产生泡沫(如产生泡沫，需静置至消泡)，溶解后成澄清无色2mg/mL的A溶液，取A溶液0.3mL加入0.1mL纯水或5％(m/v)葡萄糖注射液，配制成浓度为1500μg/mL的工作液，再用实施例1的完全培养基进行稀释50倍后使用。

2、恩度配制：

取120μL恩度原液(5mg/mL)，加入80μL完全培养基稀释后混匀，配制成终浓度为3mg/mL的工作液，再用实施例1的完全培养基进行稀释100倍后使用。

3、舒尼替尼配制：

取1.5mg舒尼替尼粉末，加入0.5mL的纯水溶解并混匀，用亲水性除菌过滤器(0.22μm PES滤膜)将样品溶液进行无菌过滤，配制成终浓度为3000μg/mL的储存液，再用实施例1的完全培养基进行稀释100倍后使用。

4、贝伐珠单抗配制：

取120μL贝伐珠单抗原液，加入0.880mL完全培养基稀释后混匀(不使用糖溶液配制或与糖溶液混合)，配制成终浓度为3mg/mL的工作液，再用实施例1的完全培养基进行稀释100倍后使用。

5、西仑吉肽配制：

取1.5mg西仑吉肽粉末，加入0.5mL的超纯水溶解，再加入4.5mL完全培养基稀释后混匀，用亲水性除菌过滤器(0.22μm PES滤膜)将样品溶液进行无菌过滤，配制成终浓度为300μg/mL的工作液，再用实施例1的完全培养基进行稀释10倍后使用。

实施例中所有试剂均现配现用。

实施例1多肽对HUVEC细胞增殖抑制作用的筛选试验

1、HUVEC细胞的复苏与培养传代：

取1支HUVEC冻存细胞，37℃水浴轻柔且快速复苏，管内冻存液融化至只剩一个约2mm直径的冰晶时，即停止水浴。继续晃动冻存管，至冰晶融化。250×g，离心4min，离心后去除上清。加入2mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。将细胞接种到1个T25培养瓶中。加入足量完全培养基，1个T25培养瓶中完全培养基的总量不少于5mL。摇匀细胞，放入37℃、5％CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中(注意：接种2h内不可移动、观察细胞。这会严重影响细胞贴壁，造成状态不佳、细胞聚团、贴壁不均匀等情况)。复苏次日，观察细胞状态，并更换新鲜的完全培养基或传代。之后，每2天更换一次完全培养基，直到细胞生长至90％汇合，即需传代(通常人脐静脉内皮细胞传代比例为1:3，72h内生长至可传代汇合度)。

2、实验方法

(1)取对数生长期HUVEC细胞，弃掉完全培养基，用PBS洗两遍；使用0.05％Trypsin-0.53mM EDTA消化细胞；

(2)300×g，25℃低速离心5min，使用完全培养基重悬细胞；

(3)使细胞终浓度为5×10⁴cells/mL，每孔加入100μL细胞悬液，每组设置3个平行孔；

(4)于5％CO₂、37℃条件下培养6h，待细胞贴壁后，每孔加入不同受试物和对照品各100μL/孔；

(5)在5％CO₂、37℃条件下继续培养48h后，使用CellTiter-Glo化学发光细胞活性检测试剂盒处理细胞；

(6)准备含无细胞的完全培养基的对照孔，以测定本底发光。

(7)向100μL含有细胞的完全培养基中加入100μL CellTiter-

2.0Reagent；

(8)在定轨振荡器上将内容物混合2分钟以诱导细胞裂解；

(9)将培养板在室温孵育10min，以稳定发光信号；

(10)在酶标仪上检测荧光值，记录数据，计算细胞的增殖抑制率(IR)。增殖抑制率(％)＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。

3、实验结果

在同一浓度(例如30μg/mL)下，本多肽对HUVEC细胞增殖具有显著抑制作用，抑制率为90.85±2.05％，显著优于贝伐珠单抗的3.05±14.51％，(P<0.01)，优于西仑吉肽87.08±0.92％，表明本多肽具有显著的HUVEC细胞增殖抑制作用。

实施例2多肽对肿瘤细胞划痕修复作用的筛选试验

1、细胞复苏、培养

取1支冻存细胞，37℃水浴轻柔且快速复苏，1000rpm，25℃低速离心5min，弃上清后，用适量完全培养基(89％基础培养基+10％ FBS+1％青-链霉素)将细胞重悬后，接种于25T培养瓶中，于37℃、5％ CO₂细胞培养箱培养。待细胞生长融合度达到80％～90％左右时，用0.25％ Trypsin-0.53mM EDTA消化细胞，按比例进行细胞传代培养，于37℃、5％ CO₂细胞培养箱中培养。

2、细胞铺板、划痕

(1)第一天(D1)，取指数生长期的肿瘤细胞，采用0.25％胰蛋白酶进行消化，1000rpm(室温)离心5min，细胞计数；

(2)用完全培养基调整细胞浓度为1×10⁶cells/mL。

(3)取6孔板用marker笔在板背后，用直尺比着均匀地划横线，大约每隔1cm一道，横穿过孔。将制备好的肿瘤细胞以2mL/孔的容量接种于6孔板，孵育过夜，使细胞贴壁，培养至细胞融合度达到80～90％。

(4)第二天(D2)，弃去上清，用20μL微量移液头在孔板内垂直划痕，尽量垂直于背后的横线划痕，用PBS洗细胞1～2次，依次将含相应药物浓度的无血清培养基溶液2mL/孔加入到铺有细胞的6孔板，每组设3个复孔，继续培养24h。

(5)于继续培养后0、6、12、24h镜下观察细胞愈合情况，沿十字交叉处上下随机取样，每孔取三个点，拍照。使用Image J软件处理划痕愈合面积。计算公式如下：

愈合面积％＝(1-Ti划痕面积/T0划痕面积)×100，Ti为检测时间点划痕面积，T0为初始划痕面。

3、实验结果

在同一浓度(例如30μg/mL)下，本多肽显著抑制对HCCLM3肿瘤细胞划痕修复的作用(P<0.05)，24h愈合率为6.91±13.21％，显著优于贝伐珠单抗的22.27±6.59％、恩度的20.01±13.65％及TB01(PEP06)的16.74±8.04％，P<0.05，表明本多肽对细胞划痕修复有一定抑制作用。

实施例3多肽对肿瘤细胞HCCLM-3细胞的体外迁移Transwell试验

1、细胞复苏、培养

取1支冻存细胞，37℃水浴轻柔且快速复苏，1000rpm，25℃低速离心5min，弃上清后，用适量完全培养基(89％基础培养基+10％ FBS+1％青-链霉素)将细胞重悬后，接种于25T培养瓶中，于37℃、5％ CO₂细胞培养箱培养。待细胞生长融合度达到80％～90％左右时，用0.25％ Trypsin-0.53mM EDTA消化细胞，按比例进行细胞传代培养，于37℃、5％ CO₂细胞培养箱中培养。

2、细胞体外迁移试验(Transwell小室法)

肿瘤细胞接种于Transwell小室的上室，将供试品加入下室，共培养24h，然后测定迁移细胞数。

试验步骤：

(1)将盖玻片放于6孔板孔中，在各孔下室中分别加入2mL对应受试物工作液；

(2)取对数生长期细胞，弃掉培养基，用PBS洗两遍；使用0.25％Trypsin-0.53mMEDTA消化细胞；

(3)1000rpm，25℃低速离心5min，使用完全培养基重悬细胞；

(4)采用台盼蓝法进行细胞计数，取20μL细胞悬液，加入等体积台盼蓝充分混合，取20μL加入细胞计数板中，在细胞计数仪上计数；

(5)使细胞终浓度为5×10⁵cells/mL，向6孔板中加入1mL细胞悬液；

(6)于5％ CO₂、37℃条件下共培养48h，然后吸弃上清，加入PBS洗2次；

(7)加入1mL 4％多聚甲醛在4℃固定细胞20min，吸弃上清，使用PBS洗2次；

(8)加入0.1％结晶紫染色，室温孵育30min，吸弃结晶紫溶液；

(9)使用PBS洗2次，用棉球吸去表面细胞，显微镜下观察计数迁移细胞数量，评估受试物对肿瘤细胞体外迁移的影响。

3、实验结果

在同一浓度(例如30μg/mL)下，本多肽可以显著抑制HCCLM3细胞Transwell小室迁移的细胞数量(P<0.05)，提示其具有抑制HCCLM3细胞转移的作用；细胞迁移数量为2.33±1.37个，显著优于PEP06的7.83±2.14个，(P<0.01)；显著优于西仑吉肽5.72±5.50个、优于贝伐珠单抗4.67±1.63个及恩度的5.50±3.78个(P<0.05)，表明本多肽能够显著抑制HCCLM-3细胞的小室迁移。

Claims (10)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列通式如SEQ ID NO:

1所示：

FX₁PVLX₂LVALNX₃(SEQ ID NO:1)；

其中：X₁、X₂和X₃分别为任意的L型或D型的天然氨基酸。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，X₃为S或T。

3.如权利要求1或2所述的多肽，其特征在于，X₁为N、D、Q或E；和/或，X₂为H、K或R。

4.如权利要求3所述的多肽，其特征在于，X₁为Q；和/或，X₂为H；和/或，X₃为S。

5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，X₁为Q，X₂为H，X₃为S；例如，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

6.一种制备如权利要求1～5任一项所述的多肽的方法，其特征在于，所述方法选自自然提取、酶水解法、发酵法、基因工程表达和化学合成。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1～5任一项所述的多肽；

较佳地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

8.如权利要求1～5任一项所述的多肽或者如权利要求7所述的药物组合物在制备治疗和/或预防疾病的药物中的应用；

较佳地，所述疾病为肿瘤；

更佳地，所述肿瘤为肝癌。

9.一种套装药盒，所述套装药盒包括药盒A和药盒B；

其中，所述药盒A包括如权利要求1～5任一项所述的多肽或者如权利要求7所述的药物组合物；所述药盒B包括其他治疗剂；

较佳地，所述药盒A与药盒B的施用时间不分先后或者先施用所述药盒A。

10.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1～5任一项所述的多肽。