CN111729070B - 多肽fl15在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于多肽药物领域，公开了多肽FL15在制备抗肿瘤药物中的应用，所述多肽FL15的氨基酸序列为：FLKRLFRKIRKLIRK。所述抗肿瘤药物为促肿瘤细胞凋亡药物。本发明所述多肽FL15对正常细胞的毒性小，安全性高；且对包括结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌在内的多种肿瘤细胞具备良好的抑制和杀伤效果。

Description

多肽FL15在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于多肽药物领域，特别涉及多肽FL15在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

抗癌肽(ACPs)是由10-60个氨基酸组成的一系列肽链，其两亲的结构通常由阳离子面和疏水面组成，这对于促进肽与靶细胞的相互作用是必需的。ACPs可抑制肿瘤细胞的增殖或迁移，或抑制肿瘤血栓的形成，同时不容易引起肿瘤细胞的耐药性，上述优点使得ACPs成为最有前途的抗癌候选药物。与一般抗癌药物相比，ACPs不仅具有更为高效的抗肿瘤活性，且对正常细胞的毒副作用较低，也不易产生耐药性。当然，并不是所有的ACPs都能作为抗癌药物进行研究，大多数的ACPs会存在以下缺点，例如半衰期短、易被蛋白酶水解、毒性较强，靶向性较差等，不能满足对理想抗癌肽的需求。

因此，还需要针对不同类型的肿瘤，继续研发新的抗肿瘤效果好，且对正常细胞毒性低的抗癌肽。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种多肽FL15在制备抗肿瘤药物中的应用，所述多肽FL15对正常细胞的毒性较小，但对结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌等肿瘤细胞具有良好的杀伤效果。

多肽FL15及其在药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用，所述多肽FL15的氨基酸序列为：FLKRLFRKIRKLIRK。所述多肽FL15(所述多肽FL15的命名属于本领域的常规命名方法，F和L是短肽前两个氨基酸的缩写，15是氨基酸数)含有15个氨基酸残基，分子量大小为2015.84，疏水性为-0.48，亲水性为0.67，净电荷为8。

所述多肽FL15为申请人自主研发和设计的多肽链，最初仅发现多肽FL15具有较好的抑菌性能。但通过对其进一步研究，多肽FL15对正常细胞的毒性轻微，并可对多种肿瘤细胞产生良好的杀伤效果，可作为药物活性成分以制备抗肿瘤药物，使得多肽FL15获得更具价值的应用。

本发明所述多肽FL15的肽链长度较短，可采用固相合成法进行合成，具有合成方便，迅速的特点。

优选的，所述多肽FL15在药学上可接受的盐包括乙酸盐或柠檬酸盐。为了提高多肽药物的稳定性或溶解性，因此可将多肽FL15制为乙酸盐或柠檬酸盐的形式。

优选的，所述抗肿瘤药物为促肿瘤细胞凋亡药物。实验表明，多肽FL15可通过促进肿瘤细胞的凋亡以实现抗肿瘤的作用。

优选的，所述肿瘤为结直肠癌、卵巢癌或乳腺癌中的至少一种。

更优选的，所述肿瘤为结直肠癌。

一种抗肿瘤药物，包括多肽FL15和/或其在药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。

优选的，所述药学上可接受的辅料为溶剂、润湿剂、乳化剂、增稠剂、赋形剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、润滑剂或稀释剂中的至少一种。

优选的，其剂型为片剂、注射剂、喷雾剂、冻干粉针剂、胶囊或包衣药丸。

更优选的，所述药物组合物为注射剂时，所述注射剂中多肽FL15的质量浓度为1-20mg/mL。由于所述多肽FL15属于多肽药物，易被降解和较难穿越肠黏膜，口服可能会降低其药效，因而将多肽FL15制备为注射剂的形式，更有助于药物成分的吸收利用。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)本发明所述多肽FL15对正常细胞的毒性小，安全性高。

(2)本发明所述多肽FL15对包括结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌在内的多种肿瘤细胞具备良好的抑制和杀伤效果，可用于制备相应的抗肿瘤药物。

附图说明

图1表示FL15对HCT-8细胞凋亡的影响；

图2表示FL15对HCT-8细胞线粒体膜电位的影响；

图3表示FL15对HCT-8细胞内ROS的影响。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

主要材料和仪器

多肽的合成：实验中所用多肽FL15由上海淘普生物科技有限公司合成，合成方法为固相合成法，纯度均在95％以上。

HCT-8(人结直肠腺癌细胞)、SKVO3(卵巢癌细胞)、MCF-7(乳腺癌细胞)和HK2(人肾小管上皮细胞)细胞株均从中科院上海细胞库中购买，所需实验材料为：RPMI-1640基础培养基；DMEM基础培养基；F12培养基；胎牛血清；氨苄青霉素和链霉菌素；DMSO；Annexin v-FITC双染试剂盒；低分子量蛋白Maker；胰蛋白酶；PBS；MTT；高效RIPA组织/细胞裂解液；阳性多肽药物LL37；PMSF；蛋白定量(BCA)测试试剂盒；活性氧检测试剂盒；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)；DEPC水；Trizol；丙三醇；氯仿。

实施例1

一种多肽FL15，其氨基酸序列为：FLKRLFRKIRKLIRK，可应用于制备抗肿瘤药物。

实施例2：MTT法检测FL15对肿瘤细胞和正常细胞增殖的影响

细胞复苏：将HCT-8、SKVO3、MCF-7和HK2细胞株冻存管于液氮罐中取出，并放置于37℃水浴锅摇晃至融解。将融化后的细胞株于无菌超净台中分别吸出至15mL规格的无菌离心管中，1000r/min离心5min，去上清；在HCT-8和MCF中分别加入5mL新鲜的RPMI-1640完全培养基；在HK2中加入DMEM/F12(1:1)完全培养基。最后分别转移至规格为25cm²的无菌培养瓶，于5％CO₂、37℃条件下培养。

细胞传代：用显微镜观察细胞，细胞形态正常，且生长密度达到90％左右时进行细胞传代。首先把含细胞的培养瓶取出放入超净台中，吸出原培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞2次，吸净PBS后加入600μL胰酶，使其能完全覆盖培养瓶瓶底，拧紧瓶盖后置于37℃培养箱中进行消化。消化完毕后用新鲜的完全培养基沿瓶壁吹下细胞，接着把细胞悬液吸至15mL无菌离心管中以1000r/min条件离心5min，去除上清，加入新鲜完全培养基重悬细胞并以1:3的比例进行细胞传代。

细胞冻存：按上述细胞传代的过程离心去除上清后，加入冻存液(基础培养基:胎牛血清:DMSO＝5:4:1)重悬细胞，并将其悬液分别加入到1.5mL的细胞冻存管中(每管细胞悬液中大约为1×10⁶个细胞)，做好标记后进行梯度降温法冻存。

本实验中，以不同浓度的FL15分别处理正常细胞HK2和3种不同的肿瘤细胞24h，并以多肽LL37(LL37是hCAP-18蛋白中含有37个氨基酸的C端，除具有抗菌作用外，还具有良好的抗肿瘤效应，但缺点是对正常细胞的毒性较大)作为阳性药物组，检测和探究FL15对3种肿瘤细胞和正常细胞HK2生长增殖的影响，实验结果如表1和表2所示：

表1：FL15对4种细胞的IC50值(单位：μM)

注:与HK2相比，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05

表2：FL15对3种肿瘤细胞的治疗指数

如表1所示，阳性药物LL37对这3种肿瘤细胞的抑制效果很好，但对HK2的毒副作用也很明显；而FL15对3种肿瘤细胞具有很好的抑制效果，与阳性药物LL37对肿瘤细胞的抑制效果相近或更好；但与阳性药物LL37相比，FL15对正常细胞的毒性明显更小，安全性更好。如表2所示，FL15对表中3种肿瘤细胞的治疗指数较高，且均大于5。结合表1和表2，可表明FL15对肿瘤细胞(结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌)的生长抑制效果好，对正常细胞的毒性小，因而具有用于制备抗肿瘤药物的突出潜力。

实施例3：FL15对HCT-8细胞凋亡的影响

以实施例2中FL15对肿瘤细胞治疗指数最高的HCT-8为例，探究多肽FL15对HCT-8细胞凋亡的影响。

收集对数生长期的HCT-8细胞，分别配置细胞悬液按每孔5×10⁵个细胞加入到6孔板中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。

弃去原培养基，分别加入以新鲜基础培养基配置的FL15药物溶液，浓度分别为0μM(Control组，即空白对照组)、1μM、2μM、4μM，于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养24h。

药物作用24h后，收集孔中培养基于离心管中，然后每孔加入200μL无EDTA的胰蛋白酶消化贴壁细胞，用新鲜培养基轻柔吹打细胞并将其转移至无菌离心管中，1000r/min离心5min，收集沉淀。然后再用冷的PBS对沉淀洗涤两次，1000r/min离心5min，弃上清。然后加入1mL 1×的Binding Buffer重悬细胞，300g离心10min，弃上清。再用1mL 1×的BindingBuffer重悬细胞，使细胞密度达到1×10⁶个/mL。加入5μL Annexin V-FITC，室温和避光条件下，轻轻地混匀10min。再加入5μL PI，室温和避光条件下，孵育5min。通过流式细胞仪进行检测。

如图1所示为经不同浓度的FL15处理后的HCT-8细胞的凋亡情况，即随着FL15药物浓度的增加，早期凋亡细胞的数目也逐渐增加，平均凋亡率分别为25.71％、37.15％和43.96％。与空白对照组(Control组)相比，FL15引起了HCT-8细胞明显的凋亡现象(P＜0.01)，且该现象呈现明显的浓度依赖性，表明FL15对HCT-8细胞可以通过凋亡作用促使其受到抑制。

实施例4：FL15对HCT-8细胞线粒体膜电位的影响

配置细胞悬液和加药处理同实施例3，给药浓度仍为0μM(Control组，即空白对照组)、1μM、2μM、4μM。

药物处理24h后，吸净培养液于离心管中，PBS洗涤2次，每孔用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，用新鲜培养基吹打混匀后转移至离心管中，1000r/min离心5min，弃上清。

继续加入0.5mL新鲜培养基重悬细胞，再分别加入0.5mL JC-1染色工作液，颠倒数次混匀，细胞培养箱中37℃孵育20min。

在孵育期间，按照每1mL JC-1染色缓冲液(5×)加入4mL蒸馏水的比例，配置适量的JC-1染色缓冲液(1×)，并放置冰浴。

37℃孵育结束后，600g和4℃离心3min，收集沉淀，弃上清。

再用JC-1染色缓冲液(1×)洗涤两次：加入1mL JC-1染色缓冲液(1×)重悬细胞。600g，4℃离心3min，收集沉淀，弃上清。再次加入1mL JC-1染色缓冲液(1×)重悬细胞。600g，4℃离心3min，收集沉淀，弃上清。再用1mL JC-1染色缓冲液(1×)重悬细胞后，使用流式细胞仪进行检测。

图2所示为FL15对HCT-8细胞线粒体膜电位的影响，在检测浓度范围内(0-4μM)，经FL15处理后的HCT-8细胞的线粒体膜电位随着FL15浓度的增加，FL1通道收集到的荧光信号逐渐增加，FL2通道的荧光信号逐渐降低。与空白对照组(Control组)相比，随着浓度增加，HCT-8细胞线粒体膜电位出现明显降低的趋势(P＜0.01)，表明FL15对HCT-8细胞可通过降低线粒体膜电位导致细胞发生凋亡。

实施例5：FL15对HCT-8细胞内ROS(活性氧)的影响

配置细胞悬液和加药处理步骤与实施例3相同。经药物处理24h后，吸净培养液于离心管中，PBS洗涤2次，每孔用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，用新鲜培养基吹打混匀后转移至离心管中，1000r/min离心5min，弃上清。按照1:1000的比例用无血清培养基稀释DCFH-DA，使终浓度为10μM。

收集HCT-8细胞之后，加入1mL稀释好的DCFH-DA重悬，细胞培养箱中37℃孵育20min。孵育完成后用无血清的培养基洗涤离心3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。适量PBS重悬后上流式细胞仪检测。

图3所示为FL15对HCT-8细胞内ROS的影响，在检测浓度范围内(0-4μM)，FL15对HCT-8细胞内的ROS含量而先增加后降低，在1μM时达到峰值，平均荧光强度为4753.677±62.405，经与空白对照组(Control组)比较，ROS含量明显的增加(P＜0.01)，在浓度达到4μM时，HCT-8细胞内的ROS含量大幅度降低(P＜0.01)。初步认为，FL15在较低浓度时，可通过增加HCT-8细胞内的ROS含量来促使凋亡发生；但随着浓度继续上升，HCT-8细胞的死亡不与ROS的含量直接相关。

实施例6

一种抗肿瘤药物，其剂型为片剂，按质量份数计，包括以下原料：多肽FL15的乙酸盐10份，玉米淀粉55份，硬脂酸镁7份，水5份。其中玉米淀粉为填充剂，硬脂酸镁为润滑剂，水为润湿剂。

实施例7

一种抗肿瘤药物，其剂型为注射剂，包括质量浓度为10mg/mL的多肽FL15以及作为溶剂的0.9％氯化钠溶液。

Claims (4)

1.多肽FL15及其在药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述多肽FL15的氨基酸序列为：FLKRLFRKIRKLIRK。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多肽FL15在药学上可接受的盐包括乙酸盐或柠檬酸盐。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为促肿瘤细胞凋亡药物。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为结直肠癌、卵巢癌或乳腺癌中的至少一种。

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