CN113143913A - 一种桉烷型倍半萜类化合物在制备抗胰腺癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桉烷型倍半萜类化合物的新的生物活性——抗胰腺癌活性。生物活性实验显示，该土木香倍半萜类化合物对人胰腺癌细胞具有良好的细胞毒活性，可有效抑制人胰腺癌细胞增殖，抑制人胰腺癌细胞的侵袭能力，而且具有良好的抗c‑Met激酶活性，可作为活性成分用于制备治疗胰腺癌的药物。土木香倍半萜类天然化合物的结构如下：

Description

一种桉烷型倍半萜类化合物在制备抗胰腺癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种桉烷型倍半萜类化合物的抗胰腺癌活性及在制备治疗胰腺癌药物中的应用，属于天然产物的生物医药用途领域。

背景技术

胰腺癌（PC）被称为“癌中之王”，具有很高的侵袭性和致命性，是目前已知预后最差的恶性肿瘤之一。近年来，我国胰腺癌的发病率呈上升趋势，其死亡率居恶性肿瘤的前10位，5年生存率只有10%。胰腺癌患者中大约有80%-85%的患者无法手术切除或者已经发生转移，即使可以局部手术切除的患者，预后仍然很差，通过手术得到控制的患者只有10%~15%。药物治疗是胰腺癌治疗的主要手段之一，目前临床推荐使用的FOLFIRINOX方案（奥沙利铂（Oxaliplatin）+亚叶酸钙（Folinic acid（Calcium））+ 伊利替康（Irinotecan）+ 氟尿嘧啶（Fluorouracil））或吉西他滨（Gemcitabine））+ 卡培他滨（Capecitabine）化疗组合是首选的晚期胰腺癌辅助化疗手段（图1）。但由于耐药性和缺乏药物特异性，药物总体有效率不到20%。为了延长胰腺癌患者的生存期，迫切需要开发寻找更加安全有效的胰腺癌化疗药物。基于此，本课题组对从土木香中提取的一类倍半萜类天然产物，进行抗胰腺癌活性研究，发现该类天然产物具有很好的抗胰腺癌细胞增殖活性。

虽然目前的胰腺癌化疗药物和化疗策略在改善患者的生存周期方面显示了一定的优势，但整体的预后不佳，迫切需要开发新的高效低毒的胰腺癌治疗药物。天然产物作为药物的重要来源，在新药的发现和开发中发挥着重要的作用。60%以上的抗肿瘤药物与天然产物密切相关。虽然小分子靶向药物在癌症治疗中占主导地位。但天然活性产物以其独特的作用模式和分子结构的多样性正在推动新型酪氨酸激酶抑制剂的开发。

土木香是（英文名：INULAE RADIX）《中国药典》收录的草药，药用来源为菊科植物土木香（Inula helenium L.）或藏木香（Inula racemosa Hook.f.）的干燥根。秋季采挖，除去泥沙，晒干即可得。有健脾和胃，调气解郁，止痛安胎之功效。用于胸胁、脘腹胀痛，呕吐泻痢，胸胁挫伤，岔气作痛，胎动不安。土木香精油有镇静、杀菌、退烧和驱虫的作用，可作为消炎药、抗微生物制剂。（Xu LW, Shi YP. Sesquiterpenoids from Inula racemosa. JAsian Nat Prod Res. 2011,13(6):570-574.）公开了从土木香中分离提取分离倍半萜类天然化合物A的方法：藏木香干燥，粉碎，用乙醇为提取溶剂，药材和乙醇质量比1:10，60℃加热回流提取3次，每次3小时，提取液过滤，合并后浓缩，干燥。将粗提物与水混合成悬浮液，然后依次用石油醚（60-90℃）、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相。将石油醚相和乙酸乙酯相合并（300 g），用石油醚-丙酮混合溶剂（v/v）（100:1，50:1，30:1，20:1，10:1，8:1，5:1，3:1，2:1，1:1，0:100，MeOH）梯度洗脱，得到8个组分（fr1 -8）。组分f2和组分f3（共150 g）用硅胶柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂（v/v，10:1）分离得到化合物3（30 g）、4（20 g）和5（10 g）。组分f4和组分f5（共5 g）用硅胶柱色谱分离，石油醚-丙酮混合溶剂（v/v）（100:1，50:1，30:1，20:1，10:1，8:1，5:1，3:1，2:1，1:1，0:100，MeOH）梯度洗脱，得到7个组分（fr4.1 -4.7）。组分f4.1（1 g）用硅胶柱色谱分离，石油醚-丙酮（v/v, 10:1）洗脱，得到化合物8 (10 mg)。组分f4.5（1 g）用硅胶柱色谱分离，石油醚-丙酮（v/v, 5:1）洗脱得到化合物2（30 mg）。组分f4.6（3 g）用硅胶柱色谱分离，用石油醚-丙酮（v/v,4:1）洗脱，得到化合物6（13 mg）和7（20 mg），用石油醚-丙酮（v/v, 3:1）洗脱，得到化合物1（5 mg）（Xu LW, Shi YP. Sesquiterpenoids from Inula racemosa. JAsian Nat Prod Res. 2011,13(6):570-574.）。该类倍半萜活性天然产物（化合物A）结构通式如下所示：

R₁=H，R₂=H，R₃=H，R₄= C= C，R₅=H，R₆= H，R₉= H，R₁₀= CH₃。

但是上述文献并没有对该倍半萜活性天然产物（化合物A）的生物活性进行研究。

发明内容

本发明的目的是对土木香提取物中分离的桉烷型倍半萜类天然化合物A的抗胰腺癌活性进行研究，以期用于制备治疗抗胰腺癌的药物。

实验1：化合物A抑制胰腺癌细胞增殖活性

CCK-8实验：取对数生长期细胞，接种于96孔板（每孔1×10⁴个细胞），待细胞贴壁后，分别加入浓度范围为1-100 µM梯度的化合物，培养72 h，然后每孔加入10 µL CCK-8溶液继续培养4小时，振荡10 min，酶标仪450 nm测定吸光度值，根据吸光值计算细胞存活率和抑制率得到化合物的IC₅₀值。

实验结果：采用CCk-8法检测化合物A对胰腺癌细胞系的增殖抑制作用，化合物A的浓度为 0.2 µM、1 µM、5 µM、25 µM、125 µM，作用胰腺癌细胞的时间为72 h。结果如图1所示，以化合物A为代表的土木香提取天然产物对胰腺癌细胞系都有增殖抑制作用，包括PANC-1细胞、SW1990细胞、BxPC-3细胞、Capan-2细胞、CFPAC-1细胞、AsPC-1细胞，其中，对PANC-1 细胞抑制效果最为显著，IC₅₀达到 0.97 μM。

实验2：化合物A抑制胰腺癌细胞侵袭

transwell侵袭实验：取对数生长的细胞重悬于含有不同浓度的待测化合物的培养液中，调整细胞密度至1×10⁵个/mL，取细胞悬液100-200 µL加入transwell小室，常规培养48小时后，取出小室，PBS洗3次，用棉签小心擦去微孔膜内层的细胞，95%酒精固定5 min，结晶紫溶液染色，倒置显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞，计算细胞侵袭率。

实验结果：癌症的浸润性是决定它的恶性程度因素之一，是肿瘤治疗效果不佳的重要原因和最大障碍。肿瘤细胞侵袭级别发展到一定阶段就会发生转移，也就是说，肿瘤转移是侵袭的的更高阶段。为了证实以化合物A为代表的倍半萜类化合物对胰腺癌细胞侵袭的抑制，我们通过Transwell实验，研究以化合物A为代表的倍半萜类化合物对PANC-1细胞的侵袭的影响。结果如图3所示。用1 µM和5 µM化合物A处理PANC-1细胞24 h后，发现穿透基质胶的细胞数量明显减少，且呈浓度依懒性。表明化合物A能够抑制PANC-1细胞的侵袭。

实验3：激酶抑制活性实验

采用HTRF法检测目标化合物对激酶的抑制活性。除待测化合物外，另设3个对照组：阳性对照组、空白对照组和Cryptate对照组。将酶缓冲液 HEPES、MgCl₂、DTT、MnCl₂、NaN₃和ddH₂O 配制成激酶缓冲液。用该激酶缓冲液分别稀释TK-Substrate-biotin、ATP和相应的激酶。稀释后将TK-Substrate-biotin、ATP按体积比1:1混合，混合液按5 μL/孔加入至EP管中。按2 μL/孔加入待测化合物的稀释溶液，空白对照孔用2 μL激酶缓冲液补齐，混匀。最后加入3 μL/孔激酶稀释液，无酶孔用3 μL激酶缓冲液补齐，混匀。TK-Substrate-biotin、ATP 和激酶的终浓度分别为1 μmol/L、3 μmol/L与0.1 mg/L。实验设置3个复孔。将反应液转移至384孔板中，37°C 孵育30 min，加入终止液，充分混匀以终止反应。室温放置60 min后，将384孔板放于离心机中2000 rpm离心2 min，选取314 nm作为激发波长，检测665 nm、615 nm波长处荧光，计算激酶的抑制率，采用Spss 13.0软件计算半数抑制浓度(IC₅₀)值。

实验结果：采用HTRF法检测目标化合物对激酶的抑制活性，结果发现，以化合物A为代表的倍半萜类天然产物，对包括c-kit、Flt-3、flt-4、VEGFR2、c-Met激酶都有抑制活性，其中对c-Met激酶的抑制活性最显著，IC₅₀为50.10 nM。如表1所示：

。

实验4：化合物A抑制胰腺癌裸鼠移植瘤

手术中切取肿瘤边缘生长比较旺盛、无溃疡坏死的肿瘤组织，迅速装入含有组织保存液的离心管中，离心管装入冰包低温运输至实验室。在实验室生物安全柜内用0.4%的台盼蓝染液检测肿瘤组织活性，剔除没有活性的组织。然后将组织放入0.2%的碘伏溶液中浸泡30秒钟消毒，再用含有3%双抗的PBS溶液冲洗组织。将冲洗干净的肿瘤组织放入新的培养皿中，一边用7号针头戳组织，一边用少量PBS溶液冲洗，把组织戳成片状后，再用两把镊子拧、挤压组织，并在PBS溶液中漂洗，然后收集液体，通过300目过滤网过滤。将过滤后的微组织块悬液收集进15 mL离心管，1000转/分钟离心5分钟，弃去离心管内大部分的液体，留取少量培养基悬浮微组织块备用。在SPF级动物房，选择成年雄性裸鼠，麻醉后将小鼠俯卧位固定于手术板上，0.5%碘伏消毒局部皮肤后，用眼科剪在背颈部做一个约5 mm长的切口，然后用眼科剪提起切口边缘皮肤，用100 µL微量注射器吸取20-50 µL混匀的微小组织块混悬液或者细胞悬液多点注射进切口内，然后缝合切口，0.5%碘伏棉签消毒缝合部位，接种完毕。待瘤体长到150 mm³左右后将裸鼠随机分成4组(control组、30 mg/kg组、60 mg/kg组、90 mg/kg组)，每组8只，灌胃给药，每3天1次，连续治疗7-8次，每次记录瘤体大小，按公式 V=1/2 a×b²（V代表瘤体积，a为长径，b为短径）计算肿瘤体积，绘制生长曲线。

实验结果：以化合物A为代表的倍半萜类天然产物在体外对PANC-1细胞增殖抑制作用明显，为了验证其效果，在体内评价化合物A对PANC-1裸鼠肿瘤模型的抑制效果，如图3所示，化合物A给药剂量分别为25 mg/kg，50 mg/kg。和Vehical组比较，25 mg/kg剂量组抑制PANC-1肿瘤增殖效果并不明显，但是，在给药剂量为50 mg/kg 时，化合物A都能够明显抑制PANC-1移植瘤模型的增长。说明化合物A具有抑制PANC-1增殖的潜能。

试验还表明，化合物A前药及药用盐对肿瘤细胞，特别是人胰腺癌细胞具有良好的细胞毒活性，可有效抑制人胰腺癌细胞增殖，抑制人胰腺癌细胞的侵袭能力，而且具有良好的抗c-Met激酶活性，特别适合c-Met激酶过度活化所致的胰腺癌的治疗。

综上所述，本发明通过CCK-8法、Transwell实验、体外激酶抑制活性实验、裸鼠移植瘤模型实验发现以化合物A为代表的倍半萜类活性天然产物具有抗胰腺癌活性，可作为活性成分，用于制备治疗胰腺癌的药物。

附图说明

图1为化合物A对胰腺癌细胞增殖抑制作用。

图2为以化合物A为代表的倍半萜类天然产物抑制胰腺癌细胞的侵袭。

图3为以化合物A为代表的倍半萜类天然产物抑制胰腺癌PANC-1细胞移植瘤模型。

具体实施方式

即以化合物A为药物活性组分，以药学或生理学可接受的辅料及常规药物制剂的制备工艺制成内服制剂（包括散剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊、粉剂、丸剂、片剂、口服液）或注射剂。

Claims (5)

1.一种桉烷型倍半萜类化合物在制备治疗胰腺癌药物中的应用。

2.如权利要求1所述桉烷型倍半萜类化合物在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于：所述土木香倍半萜类化合物的结构式如下：

R₁=H，R₂=H，R₃=H，R₄= C= C，R₅=H，R₆= H，R₉= H，R₁₀= CH₃。

3.如权利要求1所述桉烷型倍半萜类化合物在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于：土木香倍半萜类化合物包括其前药及药用盐。

4.如权利要求1或2所述桉烷型倍半萜类化合物在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于：以桉烷型倍半萜类化合物为活性组分，以药学或生理学可接受的辅料及常规药物制剂的制备工艺制成内服制剂或注射剂。

5.如权利要求4所述桉烷型倍半萜类化合物在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于：内服制剂为散剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊、粉剂、丸剂、片剂、口服液。

Images