CN115737817A

CN115737817A - 络氨酸激酶抑制剂在制备治疗棘球蚴病药物中的应用

Info

Publication number: CN115737817A
Application number: CN202211421846.3A
Authority: CN
Inventors: 刘丛珊; 尹建海; 张皓冰; 薛剑
Original assignee: National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2022-11-14
Filing date: 2022-11-14
Publication date: 2023-03-07

Abstract

本发明涉及治疗棘球蚴病(包虫病)的新型药物的发现研究，公开了一系列络氨酸激酶抑制剂在制备治疗棘球蚴病药物中的应用。本发明通过深入研究络氨酸激酶抑制剂对棘球蚴的作用效果，探索其作为治疗棘球蚴病药物新药的应用前景。经实验验证，络氨酸激酶抑制剂对体外培养的棘球蚴原头节和囊表现出显著的杀灭和抑制效果，并且对感染棘球蚴的实验动物也有一定治疗效果。络氨酸激酶抑制剂可用于棘球蚴病的治疗，为治疗棘球蚴病提供了一种新的选择。

Description

络氨酸激酶抑制剂在制备治疗棘球蚴病药物中的应用

技术领域

本发明涉及一类药物的医药用途，具体涉及络氨酸激酶抑制剂在制备治疗棘球蚴病药物中的应用，属于生物医药领域。

背景技术

棘球蚴病，俗称包虫病，是全球分布的重要人畜共患疾病之一，也是我国重点防控的重大寄生虫病。该病患者通过误食被虫卵污染的食物、水源等致病，寄生虫可在患者体内产生占位性病变，使患者丧失劳动能力，严重者可导致死亡。因此，棘球蚴病不仅严重危害人民群众生命健康，还制约了畜牧业地区的经济发展。

目前，棘球蚴病治疗的首选方法是手术治疗，但是由于早期诊断技术的限制，许多患者发病时已经是晚期，因此长期甚至终身服用临床药物-苯并咪唑类药物(阿苯达唑和甲苯达唑)是目前最主要的治疗手段。除此之外，对于接受手术的患者，为了巩固手术治疗效果并且防止复发，药物治疗也是重要的治疗手段。但是，该类药物受到吸收差或者代谢产物无活性等因素的影响，其治愈率仅为30％左右，难以满足目前棘球蚴病治疗需求。因此亟待找到新的有效替代药物，尤其是药物靶点明确的药物，以提高药物治疗效果并减轻患者疾病负担。

络氨酸激酶抑制剂，如阿法替尼、双马来酸阿法替尼等在临床上主要用于癌症治疗，其中阿法替尼可用于特定的转移性非小细胞肺癌，选择性不可逆的结合并抑制癌细胞的表皮生长因子受体，从而抑制肿瘤生长和血管生成。双马来酸阿法替尼是阿法替尼的二马来酸盐形式，是通过将阿法替尼与两个摩尔当量的马来酸组合获得的马来酸盐，用于转移性非小细胞肺癌患者的一线治疗，其作用机制同上述阿法替尼。另一络氨酸激酶抑制剂，培利替尼，正在被开发为抗癌药物，其亦可通过与表皮生长因子受体不可逆结合，而抑制受体磷酸化和信号转导，并导致过度表达这些受体的肿瘤细胞凋亡和抑制增殖。上述络氨酸激酶抑制剂在抗棘球蚴效果国内外目前尚未见报道。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明的目的是提供络氨酸激酶抑制剂在棘球蚴病上的应用，丰富棘球蚴病的治疗手段。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

络氨酸激酶抑制剂在制备治疗棘球蚴病药物中的应用。

在一些实施方案中，所述络氨酸激酶抑制剂包括但不限于阿法替尼、双马来酸阿法替尼和培利替尼中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述络氨酸激酶抑制剂可抑制棘球蚴生长。

在一些实施方案中，所述络氨酸激酶抑制剂有抑制棘球蚴原头节活性的功能，抑制棘球蚴囊活性的功能和/或抑制感染棘球蚴小鼠体内棘球蚴囊生长的功能。

在一些实施方案中，所述络氨酸激酶抑制剂抑制棘球蚴生长的有效药物作用浓度为1.5725μM以上。

在一些实施方案中，所述络氨酸激酶抑制剂抑制棘球蚴生发层细胞活性的有效药物作用浓度为1.5725μM以上。

在一些实施方案中，所述络氨酸激酶抑制剂抑制棘球蚴囊活性的有效药物作用浓度为3.125μM以上。

在一些实施方案中，所述络氨酸激酶抑制剂抑制感染棘球蚴小鼠体内棘球蚴囊生长的有效口服剂量为25mg/kg以上。

在一些实施方案中，所述治疗棘球蚴病药物含有药学上有效量的络氨酸激酶抑制剂以及药学上可接受的载体，所述治疗棘球蚴病药物有效剂量时的血药浓度范围为0.100-3.125μM。

在一些实施方案中，所述治疗棘球蚴病药物可制成任何一种药学上可接受的剂型；所述任何一种药学上可接受的剂型包括但不限于混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂中的一种或多种。

申请人长期研究发现，络氨酸激酶抑制剂阿法替尼(Afatinib，N-[4-[(3- 氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)、培利替尼(Pelitinib，(2E)-N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3- 氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)和双马来酸阿法替尼 (Afatinib dimaleate，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3S)-四氢-3-呋喃基] 氧基]-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺；丁-2-烯二酸)具有抗棘球蚴的效果。

目前抗棘球蚴药物的研究工作较为缓慢，络氨酸激酶抑制剂具有抗棘球蚴效果的发现为治疗棘球蚴病提供了新的思路，有望丰富棘球蚴病的治疗手段。

本发明的有益效果如下：

1.所述络氨酸激酶抑制剂可杀灭多房棘球蚴原头节。实验表明络氨酸激酶抑制剂培利替尼在低至6.25μM的浓度作用于细粒/多房棘球蚴原头节，能发挥100％的杀灭效果，除此之外，减低浓度至1.5725μM仍然能抑制30％多房棘球蚴原头节活性；阿法替尼及双马来酸阿法替尼在低至12.5μM的浓度作用于细粒/多房棘球蚴原头节，能发挥100％的杀灭效果(详见表1)。

2.所述络氨酸激酶抑制剂可抑制细粒棘球蚴囊。实验表明经3.125μM络氨酸激酶抑制剂阿法替尼作用168小时后，对细粒棘球蚴可达接近100％的抑制效果(详见表2)。在显微镜下观察发现，正常细粒棘球蚴囊结构清晰，内囊与外囊紧密贴合；而药物作用后的内囊从外囊脱落(见图2C-D)。

3.所述络氨酸激酶抑制剂可抑制感染多房棘球蚴小鼠体内多房棘球蚴囊的生长。实验表明用25mg/kg和50mg/kg两种剂量口服治疗感染细粒棘球蚴6个月的小鼠，络氨酸激酶可抑制多房棘球蚴囊的生长，囊重抑制率为20.9-48.55％，并且延长感染实验动物的生存率。

综上，本发明的络氨酸激酶抑制剂具有显著的抑制棘球蚴生原头节和囊活性的作用，具有较强的抗棘球蚴效果，还能抑制感染棘球蚴小鼠体内棘球蚴囊的生长，是一种有效的抗棘球蚴新型药物，为治疗棘球蚴病提供了一种新的选择。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是阿法替尼(化学式(I))、培利替尼(化学式(II))和双马来酸阿法替尼(化学式(III))的化学式。

图2是本发明实施例2的多房棘球蚴原头节和实施例3细粒棘球蚴囊经络氨酸激酶抑制剂作用后光镜观察结果图，其中，A代表正常多房棘球蚴原头节；B代表药物作用后多房棘球蚴原头节；C代表正常细粒棘球蚴囊；D代表药物作用后的细粒棘球蚴囊。

图3是本发明实施例4的经络氨酸激酶抑制剂口服治疗后的多房棘球蚴囊的结构观察结果图，其中，A代表正常多房棘球蚴囊HE染色观察结果；B代表药物作用后的多房棘球蚴囊HE染色观察结果；C代表正常多房棘球蚴囊的扫描电镜结果；D代表药物作用后的多房棘球蚴囊扫描电镜结果。

具体实施方式

为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

实施例1:评价络氨酸激酶抑制剂对体外培养的棘球蚴原头节和囊，以及感染棘球蚴实验小鼠的体内作用效果的步骤

1)原头节和囊的体外培养

采集棘球蚴病流行区的细粒棘球蚴囊，分离和清洗囊中的细粒棘球蚴原头节。在中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心)实验室保种的多房棘球蚴感染小鼠体内分离棘球蚴囊组织，分离多房棘球蚴原头节。将上述原头节和培养基加入培养瓶中，放置于5％ CO²、相对湿度为95％的37℃温箱培养。

分别从继发感染多房或者细粒棘球蚴的小鼠体内取出棘球蚴囊组织，分离棘球蚴囊。将上述棘球蚴囊和培养基加入培养瓶中，放置于5％ CO²、相对湿度为95％的37℃温箱培养。

2)建立细粒/多房棘球蚴继发感染实验动物模型

用75％酒精擦涂小鼠皮肤，将分离的细粒/多房棘球蚴原头节用注射器注入小鼠腹腔内，6个月后模型可用于体内药效评价。

3)络氨酸激酶抑制剂氨酸激酶抑制剂的体内外作用效果评价

将不同浓度的络氨酸激酶抑制剂溶液(0.7863 -100μM)分别加入到多房或者细粒棘球蚴原头节和棘球蚴囊中，观察药物作用效果。

将络氨酸激酶抑制剂口服给药感染细粒/多房棘球蚴的实验小鼠，连续给药一个月后，进行剖检，将其腹腔内的囊全部取出，称重并记录囊重。

实施例2:络氨酸激酶抑制剂对体外培养的多房棘球蚴原头节的作用效果评价

1)多房棘球蚴原头节的制备

收集适量中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 实验室保种的多房棘球蚴囊组织，匀浆过滤后吸取含有原头节沉淀倾至容量为50 ml的圆底离心管中，自然沉淀10分钟后，去上清液，随后用生理盐水将含原头节的沉淀物洗涤5-8次。在倒置显微镜下计数，并观察原头节存活状况。

2)多房棘球蚴原头节的体外培养

培养器皿可用25cm²培养瓶，将上述处理后的多房棘球蚴原头节和培养基加入培养瓶中，然后置于5％ CO²、相对湿度为95％的37℃温箱培养，每3天换液一次。

3)络氨酸激酶抑制剂的体外药效评价方法

将培养的多房棘球蚴原头节加入96孔培养板中，每孔加入200μl培养基，分别加入待测络氨酸激酶抑制剂(阿法替尼，targetmol/T2303；培利替尼，targetmol/T2327；双马来酸阿法替尼,targetmol/T1773，实施例2-4所用络氨酸激酶抑制剂来源相同)不同浓度的溶液(用DMSO进行稀释)，使终浓度为0.7863、 1.5725、3.125、6.25、12.5、25、50、100μM。给药后72小时和144小时，用美兰染液对多房棘球蚴原头节进行染色，死亡的多房棘球蚴原头节会被染成深蓝色，对其进行计数并计算多房棘球蚴原头节死亡率。

原头节死亡率＝死亡原头节数目/原头节总数×100％。

4)络氨酸激酶抑制剂对多房棘球蚴原头节的作用效果

经浓度为12.5μM以上的络氨酸激酶抑制剂作用72小时，以及浓度为6.25μM 以上的培利替尼作用168小时后，多房棘球蚴原头节的死亡率为100％，并呈现明显的剂量-效果关系(详见表1)。在显微镜下观察发现，正常多房棘球蚴原头节多为内陷形态，内部结构和边缘整齐清晰；经药物作用后死亡的多房棘球蚴原头节全部外翻，整体形态和结构发生强烈改变，已经没有明显的内部结构和边缘(见图 2A-B)。

表1不同浓度络氨酸激酶抑制剂作用下的多房棘球蚴原头节死亡率(体外)

实施例3:络氨酸激酶抑制剂对体外培养的细粒棘球蚴囊的作用效果评价

(1)细粒棘球蚴囊的制备

继发细粒棘球蚴小鼠模型的建立：在流行区采集细粒棘球蚴囊，取出并用生理盐水清洗其中的细粒棘球蚴原头节。接种时将细粒棘球蚴原头节稀释至4000只/ml 备用。用1ml注射器吸取细粒棘球蚴原头节悬液0.5ml，用75％酒精擦涂小鼠皮肤，将细粒棘球蚴原头节注入小鼠腹腔内。该模型建立8-10月后可用于后续实验。

细粒棘球蚴囊的分离和培养：剖检上述小鼠，取出其体内的细粒棘球蚴囊，用PBS清洗后置于5％ CO₂、相对湿度为95％的37℃温箱培养，每3天换液一次。

(2)络氨酸激酶抑制剂对体外培养的细粒棘球蚴囊活性评价方法

将上述细粒棘球蚴囊放入24孔板中，每孔加入2ml培养基，分别加入3.125 μM的待测络氨酸激酶抑制剂(用DMSO进行稀释)。给药144小时后，观察囊的形态改变，计算药物对囊活性抑制率。

棘球蚴囊活性抑制率＝形态改变的棘球蚴囊数目/总棘球蚴囊数目×100％。

(3)络氨酸激酶抑制剂对细粒棘球蚴囊的作用效果

经3.125μM络氨酸激酶抑制剂阿法替尼作用168小时后，对细粒棘球蚴囊可达接近100％的抑制效果(详见表2)。在显微镜下观察发现，正常细粒棘球蚴囊结构清晰，内囊与外囊紧密贴合；而药物作用后的内囊从外囊脱落(见图2C-D)。

表2 3.125μM络氨酸激酶抑制剂对细粒棘球蚴囊抑制作用(体外)

实施例4:络氨酸激酶抑制剂对感染多房棘球蚴小鼠的体内治疗效果评价

(1)继发多房棘球蚴小鼠模型的建立

收集实验室保种的多房棘球蚴囊组织，匀浆过滤后收集原头节。接种时将原头节稀释至4000只/ml备用。用1ml注射器吸取原头节悬液0.5ml，用75％酒精擦涂小鼠皮肤，将原头节注入小鼠腹腔内。该模型建立6个月后可用于后续实验。

(2)络氨酸激酶抑制剂的体内治疗方案及观察指标

制备络氨酸激酶抑制剂混悬液。将35只接种细粒棘球蚴6个月以上的昆明小鼠分为7组(每组5只小鼠)，其中1组为阴性对照组(未感染组)，其余6组为治疗组，分别是50mg/kg培利替尼组(按每1kg小鼠灌注50mg培利替尼的标准进行灌注)，25mg/kg培利替尼组(按每1kg小鼠灌注25mg培利替尼的标准进行灌注)，50mg/kg阿法替尼组(按每1kg小鼠灌注50mg阿法替尼的标准进行灌注)，25mg/kg阿法替尼组(按每1kg小鼠灌注25mg阿法替尼的标准进行灌注)，以及50mg/kg双马来酸阿法替尼组(按每1kg小鼠灌注50mg双马来酸阿法替尼的标准进行灌注)，25mg/kg双马来酸阿法替尼组(按每1kg小鼠灌注25mg 双马来酸阿法替尼的标准进行灌注)。各组实验鼠连续灌胃给药28天，停药14 天后剖检，将其体内的囊全部取出称重记录并计算囊重抑制率。

囊重抑制率＝(阴性对照组平均囊重-各治疗组平均囊重)/阴性对照组平均囊重×100％。

(3)经络氨酸激酶抑制剂作用后感染多房棘球蚴小鼠体内的棘球蚴囊的超微结构变化

HE组织染色观察：经口服络氨酸激酶抑制剂治疗后，取出感染多房棘球蚴小鼠体内的棘球蚴囊，经10％多聚甲醛固定后经梯度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡后进行石蜡包埋并连续4μm切片。切片经苏木素和以后染色后封片观察。

扫描电镜观察：上述样本经4％戊二醛固定后漂洗3次，后经梯度酒精脱水，干燥后进行到点处理，在扫描电子显微镜下观察。

(4)络氨酸激酶抑制剂对感染多房棘球蚴小鼠的体内治疗效果

培利替尼、阿法替尼和双马来酸阿法替尼25mg/kg和50mg/kg的给药剂量都可减少实验鼠体内多房棘球蚴囊的重量(除了50mg/kg阿法替尼药物毒性大，停止治疗)，囊重抑制率分别从20.90％到48.55％(表3)。感染多房棘球蚴小鼠给药后体内多房棘球蚴囊HE组织染色和扫描电镜结果都显示寄生虫组织的显著性改变(图3)。阴性对照组的内囊中的细胞结构完整，角质层和生发层清晰可见，尤其是内囊中的细胞结构完整(图3A、3C)。经过络氨酸激酶抑制剂治疗后，实验鼠体内的多房棘球蚴囊中的生发层发生强烈改变，其中的结构模糊，无明显细胞形态(图3B、3D)。

表3口服络氨酸激酶抑制剂抑制感染多房棘球蚴小鼠体棘球蚴囊生长(体内)

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.络氨酸激酶抑制剂在制备治疗棘球蚴病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述络氨酸激酶抑制剂包括但不限于阿法替尼、双马来酸阿法替尼和培利替尼中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述络氨酸激酶抑制剂可抑制棘球蚴生长。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述络氨酸激酶抑制剂有抑制棘球蚴原头节活性的功能，抑制棘球蚴囊活性的功能和/或抑制感染棘球蚴小鼠体内棘球蚴囊生长的功能。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述络氨酸激酶抑制剂抑制棘球蚴生长的有效药物作用浓度为1.5725μM以上。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述络氨酸激酶抑制剂抑制棘球蚴生发层细胞活性的有效药物作用浓度为1.5725μM以上。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述络氨酸激酶抑制剂抑制棘球蚴囊活性的有效药物作用浓度为3.125μM以上。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述络氨酸激酶抑制剂抑制感染棘球蚴小鼠体内棘球蚴囊生长的有效口服剂量为25mg/kg以上。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗棘球蚴病药物含有药学上有效量的络氨酸激酶抑制剂以及药学上可接受的载体，所述治疗棘球蚴病药物有效剂量时的血药浓度范围为0.100-3.125μM。

10.根据权利要求1至9任一项所述的应用，其特征在于，所述治疗棘球蚴病药物可制成任何一种药学上可接受的剂型；所述任何一种药学上可接受的剂型包括但不限于混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂中的一种或多种。