CN110051734B - 一种抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物领域，特别是一种抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物及其应用。本发明所述的药物组合物包括以下组分：枫蓼组合物和氟尿嘧啶(5‑FU)；所述的枫蓼组合物与氟尿嘧啶的重量比为9.375‑1406.25：0‑1；所述的枫蓼组合物由牛耳枫和辣蓼草组成。本发明所述的组合物将枫蓼组合物与5‑FU联用，可达到增效5‑FU对结直肠癌的治疗效果，这种组合治疗将成为一种更为有效的治疗结肠癌的方法。

Description

一种抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及药物领域，特别是一种抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物及其应用。
背景技术
癌症又称为恶性肿瘤，它是多种相关疾病的统称。当身体内细胞发生突变后，它会不断地分裂，不受身体控制，最后形成癌症。癌症已经成为严重危害人类健康的疾病之一。目前癌症的治疗方法主要有手术、化疗、放疗、免疫治疗、介入治疗、中药治疗等等。
氟尿嘧啶(5-FU)是常用的化疗药物之一，该药作用机理清楚，且价格低廉，但其化疗效率低下，对肿瘤的抑制率仅有20％-30％，且又容易引发肿瘤多药耐药，从而使5-FU的疗效更低，因此急需开发一种新型安全的药物以提高 5-FU对癌症的生长抑制作用。中药在中国的癌症治疗方面有着悠久的历史，且价格低廉，毒性低，因此越来越受到医生和患者的重视。
牛耳枫和辣蓼草是海南常见的药材，由这两味药材的提取物制成的中成药枫蓼肠胃康，可用于治疗成人及儿童急、慢性肠胃炎，食滞胃痛等症。经多年临床应用，证明其具有确切疗效，且无明显不良反应，安全性高。
发明内容
本发明提出一种抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物及其应用，采用中西药结合的方式，抗癌效果显著。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物，其特征在于，包括以下组分：枫蓼组合物和氟尿嘧啶；所述的枫蓼组合物与氟尿嘧啶的重量比为 9.375-1406.25：0-1；所述的枫蓼组合物由牛耳枫和辣蓼草组成。
进一步，所述的牛耳枫和辣蓼草重量比为，1-5：1。
上述抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分别取配方量的牛耳枫和辣蓼草，混合后加水煎煮，提取液干燥得提取物；
(2)取配方量的氟尿嘧啶和步骤(1)制得的提取物分别包装，即得。
上述抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物在制备抑制结肠癌细胞HT-29的药物上的应用。
进一步，所述的抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物中，枫蓼组合物与氟尿嘧啶的重量比为9.375-750：1；枫蓼组合物的给药浓度为9.375-750μg/ml，氟尿嘧啶的给药浓度为1μg/ml。
上述抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物在制备抗癌药物上的应用。
进一步，所述的抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物中枫蓼组合物与氟尿嘧啶的重量比为1125-1406.25：1。
进一步，所述的癌症为慢性结肠炎相关性结肠癌。
上述的抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物在制备预防结肠炎相关性结肠癌的药物上的应用。
进一步，所述的药物组合物中，氟尿嘧啶的重量为0。
本发明的有益效果：
经动物实验证明，枫蓼组合物和氟尿嘧啶联合使用，对肿瘤的生长具有显著的抑制作用，明显高于氟尿嘧啶。本发明所述的抗癌药物组合物将具有增效作用且本身无毒副作用的中药成分与5-FU联用，在维持抗癌作用不变的前提下，减少5-FU的使用剂量从而降低该药的毒副作用。
同时，本发明所述的枫蓼组合物可以抑制炎性肠病向结肠癌的发展，减少结直肠组织的不典型增生以及肿瘤的形成，可用于预防结肠炎相关性结肠癌，为预防和治疗结肠炎相关性结肠癌的提供了新的思路和选择。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1FLZHW与5-FU联用对HT-29细胞增殖抑制作用的影响；
其中，上图为单独用不同梯度浓度的5-FU作用于结肠癌HT-29细胞24h后所得到的生长抑制曲线；下图为不同梯度浓度FLZHW以及与5-FU联合作用于结肠癌HT-29细胞24h后所得到的细胞活力特征；
图2FLZHW与5-FU联用对HT-29细胞凋亡的影响；
图3FLZHW与5-FU联用对HT-29细胞周期的影响；
图4各实验组小鼠肿瘤体积变化曲线；
图5为5-FU、FLZHW及联合给药组对裸鼠瘤重的影响。
与造模组对比，*P＜0.05具有显著性差异。与5-FU低剂量组对比，##P＜ 0.05具有显著性差异；与5-FU高+FLZHW对比，**P＜0.05具有显著性差异；
图6不同给药17天处理后，携带HT-29的裸鼠肿瘤拍照；
图7FLZHW联合5-FU对裸鼠皮下HT-29实体瘤生长情况的影响；
其中，上图为不同治疗组动物在给药第1天和给药第17天的活体生物发光成像结果。下图为生物发光成像数据的定量分析。与5-FU20mg/kg组比较， *p<0.05显示出显著差异，与5-FU25mg/kg组比较，**p<0.05显示出显著差异。
图8 HT-29结肠癌肿瘤组织HE染色观察结果；
图9 CACC小鼠模型建立过程；
图10 FLZHW预防性给药对结肠炎相关性结肠癌小鼠体重的影响；
图11 FLZHW预防性给药对结肠炎相关性结肠癌小鼠存活率的影响；
图12 CACC小鼠肿瘤解剖情况示意图；
图13各组肿瘤数目的计数(n＝3，与模型组比较，*P<0.0 5有显着性差异)
图14 FLZHW预防性给药对结肠炎相关性结肠癌小鼠结直肠长度的影响，与空白组相比，*P<0.05,与模型组相比，#P<0.05；
图15 FLZHW对CACC小鼠结肠组织病理变化的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1-8
一种抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物，其中5-FU和枫蓼组合物的重量分别如表1所示。
表1实施例1-9药物组成
序号 5-FU(g) 枫蓼组合物(g) 牛耳枫和辣蓼草的重量比
实施例1 1 9.375 1:1
实施例2 1 18.75 2:1
实施例3 1 37.5 3:1
实施例4 1 75 4:1
实施例5 1 150 5:1
实施例6 1 300 1.5:1
实施例7 1 600 3.5:1
实施例8 1 750 2.5:1
实施例9 1 1125 2:1
实施例10 1 1406.25 2:1
实施例9和实施例10分别对应5-FU 25mg/kg+FLZHW28.125g/kg和 5-FU20mg/kg+FLZHW28.125g/kg
实施例1-10所述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别取牛耳枫和辣蓼草，混合后加水煎煮二次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，提取液干燥，即得枫蓼提取物；
(2)取配方量的氟尿嘧啶和步骤(1)制得的提取物分别包装，即得。
上述的药物组合物可用于制备抑制结肠癌细胞HT-29和抗慢性结肠炎相关性结肠癌药物上的应用。
实施例11
一种抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物，包括：牛耳枫10g，辣蓼草10g。
其制备方法，包括以下步骤：
分别取牛耳枫和辣蓼草，混合后加水煎煮，提取液干燥，即得。
实施例12
一种抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物，包括：牛耳枫50g，辣蓼草10g。
其制备方法，包括以下步骤：
分别取牛耳枫和辣蓼草，混合后加水煎煮，提取液干燥，即得。
实施例13
一种抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物，包括：牛耳枫20g，辣蓼草10g。
其制备方法，包括以下步骤：
分别取牛耳枫和辣蓼草，混合后加水煎煮，提取液干燥，即得。
实施例11-13所述的药物组合物可用于制备预防结肠炎相关性结肠癌的药物。
本申请所述的药物组合物疗效考察
1.材料与方法
1.1细胞
人结肠癌细胞系HT-29细胞由中国科学院细胞库提供；HT-29-Luc细胞株由上海奥陆生物科技有限公司提供。
1.2实验动物
Balb/c裸小鼠84只，Balb/c小鼠45只，雄性，5周龄(18-22g),给药分组前体重范围为18～22g，购于湖南莱克景达实验动物有限公司。
2.实验方法
2.1.1小鼠结肠癌HT29细胞培养
人结肠癌HT29细胞常规培养于含10％胎牛血清的1640培养基中，培养在 37℃5％CO2的培养箱中。
2.1.2 MTT法测定细胞的活力
选取处于对数生长期的HT-29细胞，分为枫蓼组合物(FLZHW)+5-FU给药组，药物配比按照实施例1-8，稀释至5-FU浓度1μg/ml后给药。同时设置阴性对照组及5-FU阳性对照组。给药24h后，于终止培养前4h加入20μL MTT (5mg/ml)4h后弃去培养液，每孔加入150μLDMSO，然后在酶标仪上测量 570nm波长条件下各孔的吸收度(A)。计算各实验组的生长抑制率:生长抑制率(％)＝(对照组A－处理组A)/对照组A×100％。
2.1.3流式细胞术(FCM)检测枫蓼组合物联合5-FU给药对HT-29结肠癌细胞凋亡及细胞周期变化的影响：
选取处于对数生长期的HT-29细胞，分为枫蓼组合物(FLZHW)+5-FU给药组，药物配比按照实施例5-7，稀释至5-FU浓度1μg/ml后给药，同时设置空白对照组和5-FU阳性对照组，进行以下检测：
细胞凋亡检测：以上方法给药处理细胞24h后，用胰蛋白酶处理并收集细胞，离心收集细胞，加入Annexin V/FITC和PI，室温避光孵育10min。用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，计算细胞各期凋亡率。
细胞周期检测：以上方法给药处理细胞24h后，收集细胞制成单细胞悬液，离心去除上清，涡旋同时逐滴加入70％的冰乙醇固定过夜，4℃保存；PBS洗去固定液，加入RNaseA及PI染色，4℃避光孵育30min，流式检测细胞仪检测细胞周期分布变化。
2.2枫蓼组合物联合5-FU对人结肠癌细胞HT-29荷瘤动物模型生长抑制作用
2.2.1人结肠癌细胞HT-29-Luc荷瘤动物模型的建立
取SPF级健康的雄性裸小鼠数84只(5周龄)，用1ml注射器在每只裸鼠右侧颈背部皮下注射HT-29-Luc细胞，悬液0.2ml(细胞浓度约为1×107个 /ml)，注射后用医用棉签轻压片刻，以防止漏液。将小鼠重新放回笼中观察，以腹腔注射生物发光检测底物D-荧光素钾盐，IVIS小动物活体成像系统检测到接种细胞作为造模成功标准。
2.2.2动物分组
实验第0天，接种动物。第4天，将动物按完全随机表进行分组，共7组 (每组均12只)，分为空白组(尾静脉注射生理盐水，灌胃无菌水)、造模组(尾静脉注射生理盐水，灌胃无菌水)、5-FU高剂量组(尾静脉注射25mg/kg 5-FU，灌胃无菌水)、5-FU低剂量组(尾静脉5-FU20mg/kg，灌胃无菌水)、FLZHW组 (灌胃FLZHW28.125g/kg，尾静脉生理盐水)联合给药高剂量组 (5-FU25mg/kg+FLZHW28.125g/kg)、联合给药低剂量组(5-FU20mg/kg +28.125g/kgFLZHW)，组合物中牛耳枫和辣蓼草的重量比为2:1。
2.2.3各组小鼠给药方法
5-FU尾静脉隔天给药，FLZHW按14.0625g/kg/次灌胃给药，一天给药两次，实验各组给药体积均为10ml/kg，连续给药17天。
2.2.4 IVIS小动物活体成像系统检测肿瘤细胞在小鼠体内的生长情况。
裸鼠在给药前、给药1、4、8、12和17d后，用IVIS Kinetics小动物活体成像系统拍照检测，定量分析活的肿瘤细胞数量，即经生物发光标记的肿瘤细胞HT-29-Luc在单位角度单位面积下每秒种内所产生的光子数(p·s·cm·sr)。
2.2.5观察小鼠体重变化
小鼠体重：每3天称量一次小鼠体重，记录于体重表格中。
2.2.6实验动物的处理
末次给药24小时后，称量小鼠重量，采用摘眼球放血方法收集小鼠血液，收集血液标本后处死小鼠，立即剥取皮下移植瘤。用电子天平称重，取部分组织放入装有4％多聚甲醛的离心管中固定；将血液3000r/min，离心15min收集血清，并和剩余组织一起发放于-80℃超低温冰箱中,冷冻保存,以备检测。
2.2.7实验指标检测
实验结束后，逐只小鼠剖取肿瘤，称量，记录瘤重，并检查肿瘤有无坏死感染等情况。
计算肿瘤抑制率＝(对照组平均瘤重—实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％
计算肿瘤体积(mm3)＝(肿瘤长径×肿瘤短径2)/2
2.3.1结肠炎相关结肠癌小鼠模型的建立及给药
Balb/c雄性小鼠(n＝45)，体重在18-22g左右，随机按体重分为3组，每组15只，分别为空白对照组，造模组，枫蓼组合物(FLZHW)组，小鼠预适应一周后，除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其余各组均腹腔注射12.5mg/kg 氧化偶氮甲烷(AOM)，一周后饮用含2.5％DSS的饮用水，连续饮用7天，随后给予正常饮用水，连续饮用14天，上述21天作为一个循环，共反复三个循环，建立小鼠结肠炎相关性结肠癌模型，造模方法如图1所示。以腹腔注射AOM作为第0天，从造模第1天开始至造模结束对枫蓼组合物(FLZHW)组小鼠进行给药，连续给药72天，枫蓼组合物给药剂量为18.75g/kg，每只小鼠灌胃给予浓度为1.875g/ml的枫蓼组合物，正常对照组以及模型对照组小鼠给予等量双蒸水。观察小鼠的一般生活状态、腹泻和血便情况，并称量体重。
2.3.2实验动物的处理
于第73天，采用摘眼球放血方法收集小鼠血液，收集血液标本后处死小鼠，暴露小鼠腹腔，剖取结直肠并测量长度；沿肠系膜方向将结直肠纵向剪开，生理盐水清洗粪便，肉眼观察结直肠内膜肿瘤形成情况，并记录肿瘤数量，之后固定于4％多聚甲醛溶液中；将血液3000r/min，离心15min收集血清，并和剩余组织一起发放于-80℃超低温冰箱中,冷冻保存,以备检测。
2.3.3实验指标检测
采用Graph Pad Prism 5对各组CACC小鼠的存活率进行统计，采用Image J 软件，对小鼠结肠部位的肿瘤数量，小鼠结肠肿瘤的直径进行测量，并对肿瘤的大小、数量等指标进行统计分析。
2.4常规HE染色
取固定的组织进行脱水、透明、浸蜡，包埋，再将组织石蜡标本切片依次浸入二甲苯I、二甲苯Ⅱ中进行脱蜡。采用梯度酒精方式进行水化处理。使用苏木素进行染色处理，处理时间为1-3min。用双蒸水进行清洗操作，再使用盐酸酒精分化，返蓝。显微镜检查细胞时胞核清晰后，再使用伊红进行染色处理1min，采用梯度酒精方式进行脱水，最后使用中性树胶进行封片处理。
3.统计分析
以均数±标准误表示实验数据，利用统计分析软件Graph Pad Prism 5、SPSS17.0对实验数据进行统计分析，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)对实验数据进行相应统计分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2.结果
4.1 FLZHW与5-FU联用对体外抗肿瘤的影响
4.1.1 FLZHW与5-FU联用对HT-29细胞的生长抑制的MTT检测结果
通过采用MTT测定，图1为单独用不同梯度浓度的5-FU作用于结肠癌 HT-29细胞24h后所得到的生长抑制曲线以及5-FU与不同梯度浓度FLZHW联合以及单独用不同梯度浓度的FLZHW作用于HT-29细胞24h后所得到的细胞活力特征。结果显示，在测定范围内，FLZHW对HT-29细胞的细胞活力无明显抑制作用，而5-FU与FLZHW联用(即本申请实施例1-8)可明显增强5-Fu对 HT-29细胞增殖的抑制作用(P<0.05)，与5-FU单用对比，*P<0.05显示出显著差异(图1)。
4.1.2 FLZHW与5-FU联用对HT-29细胞凋亡的影响
从流式细胞检测结果的二维点图中可见，早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞分别位于右下象限的(LR)和右上象限(UR)，见图2。每组样品计数10000个细胞，统计早期与晚期凋亡细胞数，按下式计算细胞凋亡率。凋亡率＝(早期与晚期凋亡细胞数之和/10000)×100％。结果显示，阴性对照组、5-FU组、FLZHW 低+5-FU组、FLZHW中+5-FU组、FLZHW高+5-FU组的凋亡率分别为3.1％、 5.3％、17.3％、18.0％和24.8％(见图2)。结果显示，FLZHW具有增效5-FU对 HT-29细胞的凋亡作用,且具有一定的剂量依赖性。
4.1.3 FLZHW与5-FU联用对HT-29细胞周期影响的流式检测结果
结果显示，与对照组相比5-FU单用及与不同浓度的FLZHW联用均可引起 HT-29细胞在S期阻滞(P＜0.05)；FLZHW低剂量与5-FU联用组与5-FU 单用组相比，处于S期细胞的比例由14.6％增加到17.3％。FLZHW中剂量与 5-FU联用组与5-FU单用组相比，处于S期细胞比例由14.6％增加到38.0％。 FLZHW高剂量与5-FU联用组与5-FU单用组相比，处于S期细胞比例由 14.6％增加到41.1％。提示FLZHW与5-FU联用可使更多的HT-29细胞阻滞于 S期，两药联用抑制HT-29细胞增殖的效果显著优于5-FU单用的效果(见图3)。
4.2 FLZHW联合5-FU对HT-29结肠癌皮下移植瘤裸鼠模型生长抑制作用
对于HT-29皮下移植瘤，连续给药17天，各组肿瘤体积均有不同程度的增长(图4)。实验结束时，颈椎脱臼处死裸鼠，分离出肿瘤称取瘤重，并根据瘤重计算出瘤重抑制率。模型对照组瘤重为(0.63±0.09)g，FLZHW组瘤重为(0.65 ±012)g，抑瘤率为0，5-FU低剂量组瘤重为(0.55±0.12)g，抑瘤率为11.67％； 5-FU低剂量+FLZHW组瘤重为(0.46±0.05)g，抑瘤率为27.4％；5-FU高剂量组瘤重为(0.43±0.06)g，抑瘤率为31.58％，5-FU高剂量+FLZHW组瘤重为 (0.34±0.07)g，抑瘤率为48.6％，除FLZHW组外，不同治疗组与模型对照组相比，瘤重均有显著性差异(P＜0.05)，5-FU与FLZHW联合给药组与5-FU单独给药组相比，瘤重均具有显著差异(均为P＜0.05)(图5)。
4.3活体生物发光成像技术观察FLZHW联合5-FU对皮下肿瘤生长的影响
图7显示了不同治疗组动物在给药第1天和给药第17天的活体生物发光成像结果以及第1天至第17天的活体生物发光成像数据的定量分析。在指定时间点的平均肿瘤大小由成像信号强度(photons/second/cm2/ser)表示。
生物发光成像显示，除FLZHW外，不同治疗组肿瘤生长均明显低于模型组(p<0.05)。与5-FU20mg/kg组相比，5-FU20mg/kg+FLZHW组肿瘤体积明显缩小(P<0.05)。与5-FU25mg/kg组相比，5-FU25mg/kg+FLZHW组肿瘤体积明显缩小(P<0.05)。5-FU25mg/kg组与5-FU20mg/kg组肿瘤大小无显着性差异。提示 FLZHW能增强5-FU的抗肿瘤作用。
4.4 FLZHW联合5-FU对荷瘤小鼠肿瘤组织HE染色结果的影响
图8是各组肿瘤HE染色结果，从图中可以看出模型组肿瘤细胞形态多样，细胞轮廓清晰，胞膜完整；核呈圆形或卵圆形、大小各异，核仁明显，可见核分裂像，部分细胞可见多个核仁，存在少量肿瘤细胞凋亡；5-FU低剂量组和5-FU低+FLZHW组：两剂量组肿瘤细胞均存在部分的肿瘤细胞核固缩、凋亡； 5-FU高剂量组与5-FU高+FLZHW组的肿瘤细胞凋亡数量相对较多；FLZHW组与造模组相似，也存在少量的细胞凋亡。
4.5 FLZHW对结肠炎相关结肠癌预防作用的药理学影响
4.5.1 FLZHW对结肠炎相关结肠癌小鼠一般状况及存活率的影响
在结肠炎相关性结肠癌建模过程(CACC)中，模型组小鼠在DSS饮用期间精神不振，活动减少，皮毛粗糙无光泽，出现腹泻、血便情况；撤去DSS后，腹泻情况逐渐恢复，便血逐渐消失；如图9所示，从建模第3个周期开始，模型组小鼠体重下降明显，腹泻、血便情况日渐严重，而FLZHW组小鼠体重逐渐开始有所恢复，一般活动状况明显优于模型组。根据Kaplan-Meier生存曲线 (图11)，FLZHW治疗也能提高小鼠的存活率。结果表明，FLZHW可以明显改善小鼠在炎性肠病向结肠癌转变过程中的一般活动状况及存活率低的情况。
4.5.2 FLZHW对AOM/DSS诱导的CACC小鼠肿瘤发生数目和大小的影响
剖取小鼠结、直肠组织发现(图12、13)，正常对照组小鼠的结直肠黏膜完整且光滑；模型组小鼠肠腔有大量粘性分泌物，从肛门处肠黏膜增厚，形成大量肿瘤，且瘤体积较大，分布密集，面积较大；与模型组比较，FLZHW组小鼠诱发的肿瘤数目明显减少(P<0.05)，瘤体积较小，肿瘤较分散，分布面积小。当肿瘤按直径大小为<2和≥2mm分组时，FLZHW组≥2mm肿瘤数量组明显低于CACC组(P<0.0 5)。结果表明，FLZHW可以明显抑制小鼠在炎性肠病向结肠癌转变过程中的肿瘤形成。
4.5.3 FLZHW对AOM/DSS诱导的CACC小鼠结直肠长度的影响
剖取小鼠结肠组织进行测量比较，结果如图14所示，与正常对照组相比，模型组小鼠结直肠长度明显缩短，而枫蓼组合物预防性给药组小鼠结直肠长度明显长于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明，FLZHW预防性给药对CACC小鼠结直肠长度的缩短有显著的改善作用。
4.5.4 FLZHW对CACC小鼠结肠组织病理变化的影响
显微镜下观察小鼠结肠组织HE切片，如图15所示，正常对照组小鼠的结肠组织结构规则，腺体排列整齐；模型组小鼠结肠黏膜局灶性非典型性增生，突入肠腔，呈菜花状，基底膜完整，核体积变大，深染，少量核异型分裂，有部分炎性细胞浸润；FLZHW组小鼠部分增生的黏膜上皮细胞核固缩、凋亡，腺腔扩大，内含较多脱落坏死物质。
5.讨论
目前临床上结肠癌的化疗方案中，5-FU是最常用的药物之一，该药作用机理清楚，且价格低廉，但其化疗效率低下，对结肠癌的抑制率仅有20％-30％，且又容易引发肿瘤多药耐药，从而使5-FU的疗效更低，因此急需开发一种新型安全的药物以提高5-FU对癌症的生长抑制作用。中药在中国的癌症治疗方面有着悠久的历史，且价格低廉，毒性低，因此越来越受到医生和患者的重视。
本申请通过应用基于全自动酶标仪的MTT方法、基于FITC-Annexin V/PI 荧光双染以及PI单染的流式细胞检测技术，从细胞生长、细胞凋亡和细胞周期等三个方面对FLZHW联合5-FU作用于结肠癌HT-29细胞的效应进行了研究。MTT检测结果显示，实施例1-8中，FLZHW与5-FU联用组对HT-29细胞的生长抑制率显著高于5-FU单用组(P＜0.05)，提示FLZHW具有增效 5-FU对HT-29细胞的抑制作用。此外，实施例5-7中，FLZHW与5-FU联用给药组HT-29细胞的凋亡率显著高于5-FU单用组的。细胞周期的流式检测结果表明，FLZHW与5-FU联用组与5-FU单用组相比，可使更多的HT-29细胞阻滞在细胞增殖周期的DNA合成期(S期)，影响细胞DNA的复制，导致HT-29 细胞分裂增殖受阻。因此，在细胞水平上看，FLZHW联合5-FU对结肠癌细胞 HT-29细胞抑制作用的机理可能表现在两个方面，一是联合用药通过S期阻滞干扰细胞周期的运行，进而抑制癌细胞的增殖；二是诱导癌细胞生凋亡。
在体内研究中，通过测定肿瘤体积生长曲线、肿瘤抑制率、瘤重、HE染色观察病理变化。此外，还采用了IVIS小动物活体成像系统检测肿瘤细胞在小鼠体内的生长情况，其作用原理为Luc标记的癌细胞是将Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，当外源(腹腔注射)给予其底物荧光素 (luciferin)，即可在几分钟内产生发光。这种酶在ATP及氧气的存在条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。从而在人结肠癌裸鼠动物模型实验中验证了FLZHW增效5-FU对肿瘤的抑制作用，FLZHW(28.125mg/kg)分别与5-FU(20mg/kg、25mg/kg)的联合治疗与单用5-FU相比，具有显著增强对肿瘤生长的抑制作用。
此外，在体内研究中，通过致癌剂AOM诱导突变损伤，再加以DSS持续性炎症刺激，建立结肠炎相关性结肠癌模型，证实了FLZHW可以抑制炎性肠病向结肠癌的发展，减少结直肠组织的非典型增生以及肿瘤的形成。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物，其特征在于，包括以下组分：枫蓼组合物和氟尿嘧啶；所述的枫蓼组合物与氟尿嘧啶的重量比为9.375-1406.25： 1；所述的枫蓼组合物由牛耳枫和辣蓼草组成。
2.如权利要求1所述的一种抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物，其特征在于：所述的牛耳枫和辣蓼草重量比为1-5：1。
3.一种如权利要求1或2所述的抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）分别取配方量的牛耳枫和辣蓼草，混合后加水煎煮，提取液干燥得提取物；
（2）取配方量的氟尿嘧啶和步骤（1）制得的提取物分别包装，即得。
4.如权利要求1或2所述的抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物在制备抑制结肠癌细胞HT-29的药物上的应用。
5.如权利要求4所述的抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物的应用，其特征在于：所述的抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物中，枫蓼组合物与氟尿嘧啶的重量比为9.375-750：1；枫蓼组合物的给药浓度为9.375-750μg/ml，氟尿嘧啶的给药浓度为1μg/ml。
6.如权利要求1或2所述的抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物在制备抗结肠癌药物上的应用。
7.如权利要求6所述的抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物的应用，其特征在于：所述的抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物中枫蓼组合物与氟尿嘧啶的重量比为1125-1406.25：1。
8.如权利要求7所述的抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物的应用，其特征在于：所述的结肠癌为结肠炎相关性结肠癌。
9.如权利要求1或2所述的抗结肠炎相关性结肠癌的药物组合物在制备预防结肠炎相关性结肠癌的药物上的应用。
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Herbal formula Huang Qin Ge Gen Tang enhances 5-fluorouracil antitumor activity through modulation of the E2F1/TS pathway;Haizhou Liu, et al;《cell communication and signaling》;20181231(第16期);第1-12页 *

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