CN104703596A - 用于治疗子宫内膜异位的绿茶表没食子儿茶素-3-没食子酸酯的前药(pro-egcg) - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗子宫内膜异位和相关适应症的方法，所述方法包含投与Pro-EGCG，一种表没食子儿茶素-3-没食子酸酯[(-)-EGCG]的合成和衍生产物。Pro-EGCG在制造治疗子宫内膜异位和相关适应症的药剂中的用途。用于治疗子宫内膜异位和相关适应症的Pro-EGCG。

Description

用于治疗子宫内膜异位的绿茶表没食子儿茶素-3-没食子酸酯的前药(PRO-EGCG)
技术领域
本发明涉及Pro-EGCG(一种(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)的合成衍生物)在治疗子宫内膜异位和相关适应症的方法中的新颖应用，所述方法包含投与Pro-EGCG。
本发明还涉及Pro-EGCG在制造治疗子宫内膜异位和相关适应症的药剂中的用途以及用于治疗子宫内膜异位和相关适应症的Pro-EGCG。
背景技术
血管生成(从先存在的血管形成新血管的生理过程)在发育、生殖和修复中具有必不可少的作用。然而，病理性血管生成不仅在肿瘤形成中发生，而且在一系列可被共同归类为“血管生成相关疾病”的非赘生性疾病中发生(卡梅利特P(Carmeliet P)和杰恩RK(Jain RK)(2000)自然(Nature)407，249-257；西蒙斯M(Simons M)(2005)循环(Circulation)111，1556-1566)。
子宫内膜异位是一种慢性病症，其特征在于子宫内膜腺体和基质植入在子宫腔外部。尽管关于子宫内膜异位的发病机制有不同的假设，但被广泛接受的是子宫内膜异位是一种血管生成相关病症，且血管生成在子宫内膜异位病灶的生长和存活中起到必不可少的作用(泰勒RN(Taylor RN)等人纽约科学院年鉴(Ann N Y Acad Sci)2002；955：89-100)。
子宫内膜异位病灶需要形成新血管来传递对于子宫内膜异位的发展和进展必不可少的氧和养分供给(格罗特许斯PG(Groothuis PG)等人血管生成(Angiogenesis)2005；8：147-56)。密集的血管形成是子宫内膜异位的一种典型病理特征。可在腹腔镜检查期间在子宫内膜异位病灶周围观察到许多腹膜血管，且根据组织学检查，异位子宫内膜高度血管化(尼索勒M(Nisolle M)等人生育与不孕(Fertil Steril)1993；59：681-4)。
动物模型已通过展示邻近血管从周围血管发展到子宫内膜异位植入物中来证实血管生成发生在子宫内膜异位中(贝克尔CM(Becker CM)等人美国病理学杂志(Am JPathol)2008；172：534-44；许H(Xu H)等人人类生殖(Hum Reprod)2009；24：608-18)。抗血管生成疗法为治疗子宫内膜异位提供新的机会(赫尔ML(Hull ML)等人临床内分泌学与新陈代谢杂志(J Clin Endocrinol Metab)2003；88：2889-99)。
子宫内膜异位的当前治疗由各种激素疗法组成，所述激素疗法旨在中断子宫内膜异位病灶的刺激和出血的循环。然而，认为这一方法并不十分令人满意(莱斯VM(RiceVM).纽约科学院年鉴2002；955：343-52)。
用于治疗子宫内膜异位的抗血管生成与常规手术和激素疗法相比具有潜在的更低复发率和更少内分泌副作用的优势(许H(Xu H)，王CC(Wang CC).子宫内膜异位：症状、诊断和治疗(Endometriosis：Symptoms，Diagnosis and Treatments).米切尔LA(Mitchell LA)编诺瓦科学(Nova Science)，纽约(New York).第1章，第1-40页，2010)。常用血管生成抑制性化合物(如VEGF抗体、TNP-470、内皮抑制素和抗血管生成肽(anginex))已显著减小已建立的子宫内膜异位病灶中的微血管密度并显著抑制子宫内膜异位的生长和发展(奈普AW(Nap AW)等人临床内分泌学与新陈代谢杂志2004；89：1089-95；达布罗辛C(Dabrosin C)等人美国病理学杂志(Am J Pathol)2002；161：909-18；柳生T(Yagyu T)等人临床内分泌学与新陈代谢杂志2005；90：3017-21)。迄今为止，唯一已进行临床试验的是沙立度胺(thalidomide)(斯卡尔佩利尼F(Scarpellini F)等人生育与不孕2002；78：S87)。
尽管所述结果在子宫内膜异位患者中展示了有希望的疼痛减轻，但沙立度胺是一种潜在的致畸剂，其被禁止用于想要怀孕的女性。此外，抗血管生成剂还可使得限制生理性血管生成，如在排卵和月经中(尼贝里P(Nyberg P)等人癌症研究(Cancer Res)2005；65：3967-79)。这些药剂对在这一易受损的群体中生殖功能和后代的可能的不良作用必须得以解决(克劳伯N(Klauber N)等人AGM-1470.自然·医学(Nat Med)1997；3：443-6；贝克尔CM(Becker CM)等人生育与不孕2005；84增刊2：1144-55)。
茶中的某些化合物已被鉴别为具有各种生物学益处。具体来说，茶多酚是绿茶的主要化学成分(格雷安HN(Graham HN).预防医学(Preventive Med.)1992；21：334-50)。具体来说，在绿茶中发现的多酚由各种儿茶素衍生物组成，主要是儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素-3-没食子酸酯(ECG)、没食子儿茶素-3-没食子酸酯(GCG)和表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)，并且发现其具有强力的抗氧化、抗有丝分裂和抗血管生成特性(内格尔DG(Nagle DG)等人植物化学(Phytochemistry)2006；67：1849-55)。
具体来说，EGCG是最丰富的儿茶素并且在其它儿茶素当中具有最强力的生物学特性(李CH(Lea CH)等人化学工业(Chem Ind)1957；1073-4)。EGCG的抗血管生成活性已在体外和体内得到广泛证实(曹YH(Cao YH)等人自然(Nature)1999；398：381)。在我们的实验室中，我们证实了EGCG在小鼠中抑制血管生成信号传导路径并抑制新血管生成和实验性子宫内膜异位的生长(许H等人人类生殖2009；24：608-18；许H等人生育与不孕2011；96：1021-8)。
然而，EGCG在生理条件下尤其不稳定，且已知生物利用度较差(陈Z(Chen Z)等人农业与食物化学杂志(J Agric Food Chem)2001；49，477-82)，因为其(1)在肠和体液中的中性或略碱性条件中不稳定；(2)由于EGCG的高亲水性而吸收不佳；和(3)经由生物转化反应被修饰，包括甲基化、葡萄糖醛酸苷化和硫酸酯形成(朱QY(Zhu QY)等人农业与食物化学杂志1997；45：4624-8)。
发明内容
本发明的一个目的是提供治疗子宫内膜异位的更有效治疗方法，所述方法力图缓解一些与当前用于子宫内膜异位的治疗方法相关的问题或提供潜在替代方案。
在第一方面中，本申请案提供治疗子宫内膜异位或相关适应症的方法，其包含向有需要的个体投与有效量的具有下式的Pro-EGCG：
在一个优选实施例中，所述方法是治疗子宫内膜异位的方法，所述子宫内膜异位可为腹膜或骨盆子宫内膜异位。在另一优选实施例中，所述方法是治疗子宫腺肌症的方法。
所述方法可涉及将Pro-EGCG投与到个体的子宫腔或阴道中。
在第二方面中，本发明提供具有下式的Pro-EGCG：
其用于治疗有需要的个体的子宫内膜异位或相关适应症的方法。
在一个优选实施例中，所述Pro-EGCG用于治疗子宫内膜异位的方法，所述子宫内膜异位可为腹膜或骨盆子宫内膜异位。在另一优选实施例中，Pro-EGCG用于治疗子宫腺肌症的方法。
Pro-EGCG当用于治疗有需要的个体的子宫内膜异位或相关适应症的方法时可被投与到所述个体的子宫腔或阴道中。
在第三方面中，本发明提供有效量的具有下式的Pro-EGCG的用途：
其用于制造治疗有需要的个体的子宫内膜异位和相关适应症的药剂。
在一个优选实施例中，所述药剂用于治疗子宫内膜异位，所述子宫内膜异位可为腹膜或骨盆子宫内膜异位。在另一优选实施例中，所述药剂用于治疗子宫腺肌症。
所述药剂当用于治疗子宫内膜异位或相关适应症时适于投与到个体的子宫腔或阴道中。
附图说明
图1A展示在基线(第0周)、第3周和第4周时测量的来自植入物的发光信号。发光信号的强度表示为从发光强度0(蓝色，低信号，无生长)、15,000(绿色，中等信号，缓慢生长)扩展到25,000(红色，高信号，快速生长)的颜色标度。
图1B展示在干预期间在每一周记录的绝对发光强度的纵向变化。平均值±SEM，单因素ANOVA和利用邦弗朗尼事后检验(post hoc Bonferroni test)的多重比较，与盐水组相比*P＜0.05；与EGCG组相比
图2A在上方图展示根据剖腹手术在右腹部的腹壁中发展的子宫内膜植入物(箭头指示病灶的最大长度和垂直宽度以用于病灶大小计算)；且在下方图展示发展中的子宫内膜异位病灶的夹心结构，包括外表层和皮下层(s)，具有子宫内膜腺体(g)和子宫内膜包囊样结构(c)的中间子宫内膜异位病灶，以及内侧腹肌和腹膜(m)。比例尺：0.5mm。
图2B展示不同组中的病灶大小和重量的柱状图以及代表性病灶图片。平均值±SEM，学生T检验(Student′s T test)，与盐水组相比*P＜0.05；与EGCG组相比
图3A在上方图展示用FITC-葡聚糖灌注且利用Cellvizio捕获的子宫内膜异位植入物中的微血管(白色)；在中间图展示围绕病灶和在病灶内的微血管架构用microfil造影剂灌注且利用μCT捕获(黄色点)；且在下方图展示利用针对内皮细胞的特异性抗小鼠抗体CD31(红色)、针对平滑肌的αSMA(绿色)和针对细胞核的DAPI(蓝色)测定的子宫内膜异位病灶中的微血管。新微血管是CD31阳性且αSMA阴性染色的(封闭箭头)，g：子宫内膜腺体；c：子宫内膜包囊样结构；m：腹肌。展示不同组中的代表性图像。比例尺：10μm。
图3B展示不同组中的病灶微血管参数的柱状图。平均值±SEM，学生T检验，与盐水组相比*P＜0.05；与EGCG组相比
图4A在上方图展示用-1碘化物标记且经捕获的子宫内膜异位植入物中的凋亡细胞(白色)；且在下方图展示通过TUNEL染色测定的子宫内膜异位病灶中的凋亡细胞(深褐色染色)，s：皮肤和皮下层，g：子宫内膜腺体；c：子宫内膜包囊样结构。展示不同组中的代表性图像。比例尺：50μm。
图4B为不同组中通过Cellvizio成像和TUNEL染色得到的病灶凋亡细胞的柱状图。平均值±SEM，学生T检验，与盐水组相比*P＜0.05；与EGCG组相比
图5A-5C展示在上方图展示在干预期间血浆中的以下变化：(A)对应的EGCG和pro-EGCG浓度(pmol/ml)、(B)氧自由基吸收能力(ORAC，mM水溶性维生素E当量(Trolox-equiv)/ml)和(C)血管内皮生长因子(VEGF，pg/ml)浓度。平均值±SEM，单因素ANOVA和利用邦弗朗尼事后检验的多重比较，与盐水组相比*P＜0.05；与EGCG组相比且在下方图展示在干预之后病灶中的最终EGCG和pro-EGCG浓度(pmol/mg)、ORAC(mM水溶性维生素E当量/mg)和VEGF浓度(pg/mg)。平均值±SEM，学生T检验，与盐水组相比*P＜0.05；与EGCG组相比
图6A-6B展示在卵巢(上方图)和子宫(下方图)中通过H&E染色测定的卵巢滤泡和子宫内膜腺体以及通过抗小鼠CD34免疫染色测定的卵巢和子宫内膜基质中的微血管。展示不同组中的代表性图像。比例尺：0.5mm。
具体实施方式
如本文所用的“Pro-EGCG”是指通过乙酰化EGCG而获得的EGCG的合成衍生物，其可充当EGCG的前药(pro-EGCG)。其也可被称作(-)-EGCG八乙酸酯。
Pro-EGCG如由以下化学式定义：
Pro-EGCG是通过乙酰化反应性羟基而形成的经保护的EGCG类似物，其会防止产生更多的用于二聚化和代谢的反应性酚盐阴离子和自由基(陈Z(Chen Z)等人农业与食物化学杂志2001；49，477-82)。另外，pro-EGCG在生物学上保持非活性，直到其在细胞中通过酯酶去乙酰化且转化成其母体EGCG化合物(兰姆WH(Lam WH)等人生物有机化学与医药化学(Bioorg Med Chem.)2004；12：5587-93)。此外，还展示出在CF-1小鼠中胃内投与pro-EGCG与投与等摩尔剂量的EGCG相比产生更好的生物利用度(兰伯特JD(Lambert JD)等人药物代谢与处置(Drug Metab Dispos)2006；34，2111-6)。
如本文中所用，“子宫内膜异位和相关适应症”是指子宫内膜异位或子宫腺肌症以及由子宫内膜异位直接或间接引起或与子宫内膜异位直接或间接相关的任何医学病症和病况。在例示性应用中，子宫内膜异位的类型是腹膜或骨盆子宫内膜异位。
如本文中所用，“治疗”是指预防、缓解或改善子宫内膜异位或与子宫内膜异位相关的病症或病况的任何临床表现和结果。
抗血管生成是绿茶多酚的最充分表征的生物学特性之一。使用多种肿瘤血管生成模型的实验研究已展示，绿茶提取物和尤其EGCG具有强力抗血管生成作用(法希纳G(Fassina G)等人临床癌症研究(Clin Cancer Res)2004；10：4865-73；廖J(Liao J)等人营养与癌症(Nutr Cancer)2004；48：44-53)。
潜在机制仍未完全理解，不过EGCG对癌症中以及子宫内膜异位中的VEGF表达和受体活性的抑制性作用已经广泛地研究(许H等人生育与不孕2011；96：1021-8；莱米S(Lamy S)等人癌症研究(Cancer Res)2002；62：381-5；儿岛-汤浅A(Kojima-YuasaA)等人生命科学(Life Sci)2003；73：1299-313；近藤T(Kondo T)等人癌症通讯(CancerLett)2002；180：139-44；荣格YD(Jung YD)等人英国癌症杂志(Br J Cancer)2001；84；844-50；萨提普尔MR(Sartippour MR)等人营养学杂志(J Nutr)2002；132：2307-11)。
在本发明中以下详述的实例中，pro-EGCG与天然EGCG相比展示出对小鼠中实验性子宫内膜异位模型的更强和更好的抗血管生成作用。
由于pro-EGCG与EGCG相比具有更高的血浆和组织抗氧化和抗血管生成能力，故pro-EGCG在子宫内膜异位模型中的生物活性增加可能归因于其更好的体内生物利用度。
尽管在本研究中未研究pro-EGCG的抗血管生成机制，但可预期对VEGF表达和受体活性的类似抑制性作用。EGCG和pro-EGCG还是强力抗氧化剂。如维生素E般，EGCG和pro-EGCG显著提高其在血浆和病灶中的总抗氧化能力，但维生素E对子宫内膜异位血管生成和生长并无作用，表明pro-EGCG对实验性子宫内膜异位的抗血管生成作用与其抗氧化特性无关。
Pro-EGCG展示出在癌细胞中抑制蛋白酶体和诱导细胞死亡(兰姆WH(Lam WH)等人生物有机化学与医药化学2004；12：5587-93)。Pro-EGCG与EGCG相比在抑制人类前列腺、乳房、白血病和猴病毒40转化的细胞中的增殖和转化活性和凋亡诱导方面展示出远为更高的效力(库恩D(Kuhn D)等人生物科学前沿(Front Biosci)2005；10：1010-23)。在实验性子宫内膜异位中，pro-EGCG与EGCG相比在发展中的子宫内膜异位病灶中诱导更多的细胞死亡。
在以下详述的实例中，pro-EGCG还展示出与EGCG相比在抑制小鼠中的实验性子宫内膜异位的发展和生长方面的更大功效。
已展示从第一周起生物发光与病灶大小密切相关(贝克尔CM(Becker CM)等人美国病理学杂志(Am J Pathol)168：2074-2084)。生物发光在2周的pro-EGCG治疗之后显著减小被视为pro-EGCG在抑制小鼠中的子宫内膜异位的发展和生长方面的功效的证据。尽管EGCG也从2周起显著抑制病灶生长，但pro-EGCG的抑制性作用与EGCG的抑制性作用相比在整个治疗中出乎意料地更强力。与小鼠中的前列腺癌接种模型(李SC等人营养与癌症2008；60：483-91)形成对比，在我们的研究中在2周的pro-EGCG治疗之后观察到子宫内膜异位生长的显著抑制，而在李的研究中早在第1周治疗中就观察到肿瘤生长的抑制。延迟的功效可能归因于与李的研究中使用的1mm3的单片相比在这项研究中使用了较大组织(5片，每片2mm3)。
令人遗憾的是，由于技术限制，我们并未直接监测在不同时间点下的微血管；因此，我们无法排除抑制是否与病灶中的血管减少相关。
如背景部分中所指出，当前用于子宫内膜异位的治疗由各种激素疗法组成，所述激素疗法旨在中断子宫内膜异位病灶的刺激和出血的循环。然而，认为这一方法并不十分令人满意(莱斯VM.纽约科学院年鉴2002；955：343-52)。
尽管结果在子宫内膜异位患者中展示了有希望的疼痛减轻，但在使用沙立度胺(一种潜在致畸剂)的情况下也存在重大问题。此外，抗血管生成剂还可用来限制生理性血管生成，如在排卵和月经中(尼贝里P等人癌症研究2005；65：3967-79)。必须在这一易受损的群体中解决这些药剂对生殖功能和后代的可能的不良作用(克劳伯N等人AGM-1470.自然·医学1997；3：443-6；贝克尔CM等人生育与不孕2005；84增刊2：1144-55)。
在以下详述的实例中，展示出卵巢滤泡和子宫的子宫内膜腺体未受到EGCG或pro-EGCG治疗影响，表明这些天然抗血管生成剂可能不改变正常排卵和月经。
Pro-EGCG可易于以相对较低的成本制造，且可能已经具有与EGCG的毒性概况类似的毒性概况(曹YH(Cao YH)等人营养生物化学杂志(J Nutr Biochem)2002；13：380-90)。
医药调配物
本发明的Pro-EGCG可单独投与，或更优选地与可由所属领域的技术人员恰当选择的常规载剂和赋形剂一起调配。本发明的调配物包含Pro-EGCG以及一或多种医药学上可接受的载剂和任选地其它治疗性成分。
调配物中含有有效量的Pro-EGCG以实现既定目的。更具体地说，治疗有效量意指Pro-EGCG有效预防、缓解或改善子宫内膜异位或与子宫内膜异位相关的病症或病况的临床表现和结果的量。
本发明的调配物可呈现为胶囊、扁胶剂或片剂，其各自含有预定量的活性成分；粉末或颗粒；水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或水包油液体乳液或油包水液体乳液，且可根据此项技术已知的任何方法制备。
含有活性成分的医药调配物可以适于既定投与方法的任何形式提供，所述既定投与方法包括(但不限于)经肠投与、肠胃外投与(包括腹膜投与、静脉内投与)和局部投与。在一个优选实施例中，调配物被投与到需要治疗的女性受试者的子宫腔或阴道。
所属领域的技术人员可基于个别接受者的需求来确定和调节具体剂量和投与时间间隔以提供所需的Pro-EGCG血浆含量。
所属领域的技术人员在考虑以下并不打算具限制性的实例后将清楚本发明的其它目的、优点和新颖特点。
实例
概述
将同源子宫内膜皮下移植到小鼠中，以接受盐水、维生素E、EGCG或pro-EGCG处理持续4周。在干预期间通过无创体内成像监测子宫内膜植入物的生长。子宫内膜异位病灶的血管生成通过体内成像和Microfil微断层摄影来测定。在血浆和病灶中测量所述处理的生物利用度、抗氧化和抗血管生成能力。收集植入物与邻近外部皮下和内侧腹肌层以用于组织学、微血管和细胞凋亡检查。
材料和方法
化学品
如先前所述通过用乙酸酐和吡啶处理(-)-EGCG过夜来从(-)-EGCG合成Pro-EGCG(兰姆WH等人生物有机化学与医药化学2004；12：5587-93)。HPLC级EGCG、维生素E和溶剂是购自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))。用于体内成像的D-荧光素(马萨诸塞州的卡立泊生命科学公司(Caliper LifeSciences，MA))、FITC-葡聚糖MW150,000(宾夕法尼亚州的波利塞斯公司(PolySciencesInc.，PA))、-1碘化物(加利福尼亚州的英杰公司(Invitrogen，CA))和MicrofilMV-120蓝(马萨诸塞州的流体技术公司(Flow Tech，MA))是购自其相应的制造商。
动物
转基因荧光素酶表达小鼠(CMV-Luc)是获自赛诺金(Xenogen，加利福尼亚州的赛诺金公司(Xenogen Cor.，CA))，且免疫功能不全小鼠(NOD-SCID)是获自杰克逊实验室(Jackson Laboratory，缅因州巴尔港(Bar Harbor，ME))。所有动物均在大学医院的具有个别通风过滤器笼具的独立屏障设施中在无疾病条件中圈养。监测环境温度，且调节明和暗周期。小鼠在手术和实验之前任意供给经辐照的实验室食物和无菌水适应至少一周。所有动物研究均由动物实验伦理委员会(07/010/MIS)批准且根据机构指导原则进行。
实验性子宫内膜异位
基于我们的先前研究，通过皮下移植人类或小鼠组织来形成实验性子宫内膜异位的免疫缺陷小鼠模型以评估绿茶儿茶素的抗血管生成作用和机制(许H等人人类生殖2009；24：608-18；许H等人生育与不孕2011；96：1021-8)。在小鼠中皮下或腹膜内接种子宫内膜组织有效地引起两个位置的子宫内膜异位病灶形成(奈普AW等人临床内分泌学与新陈代谢杂志2004；89：1089-95)，但皮下植入允许更准确地定量病灶大小和数目且也允许易于接近以便体内成像。
在这一研究中，获取来自八周大的雌性CMV-LUC小鼠(n＝15)的子宫内膜组织以便移植到不发光的NOD-SCID小鼠(n＝32)中。在增殖动情期获得小鼠子宫内膜，且用无菌真皮活检打孔器(纽约州的米尔泰克斯公司(Miltex，NY))获得直径为2mm的活检体。立即在经预温热的无酚红DMEM/F-12培养基(西格玛公司(西格玛))中洗涤活检体以移除残余血液和粘液，且将样品在移植之前维持在无血清的DMEM/F-12培养基中(布鲁纳-特兰KL(Bruner-Tran KL)等人临床内分泌学与新陈代谢杂志2009；94：2489-94)。随机分配经培养的子宫内膜活检体以便移植。
将每治疗组五个小鼠子宫内膜活检体沿着脐部正下方的腹部植入到小鼠腹壁中形成的单一皮下凹穴中。所有手术程序均在使用异氟醚(伊利诺斯州的巴克斯特公司(Baxter，IL))的全身麻醉下进行，且监测小鼠直到其完全恢复。
在移植之后立即随机分配小鼠以接受媒剂(n＝8；假对照)、维生素E(n＝8；抗氧化剂对照，20mg/kg)、EGCG(n＝8；抗血管生成对照，50mg/kg，约等于1.5mg/30g)或pro-EGCG(n＝8；50mg/kg)。
将杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco′s phosphate-buffered saline)(PBS，西格玛公司)用作溶剂以溶解药物。选择这些剂量是因为已在小鼠中报导了其显著的抗血管生成和抗氧化作用(桑S(Sang S)等人化学毒理学研究(Chem Res Toxicol)2005；18，1762-9；比利亚扬德雷BM(Villayandre BM)等人脑研究(Brain Research)2004；1028，148-55)。所述处理经由腹膜内注射每天投与一次持续连续4周时间。
在干预结束时，子宫内膜异位病灶的大小根据游标卡尺测定为最长长度和垂直宽度且计算为0.52×宽度2×长度(mm3)。从腹壁移出子宫内膜植入物以及皮下和肌肉层以便进行详细的组织学检查和特异性染色分析。
体内成像
使用各种体内成像系统监测实验性子宫内膜异位的发展和血管生成。在干预期间，如先前所述，每周通过使用无创IVIS 200活动物成像系统(赛诺金公司)测量皮下荧光素酶阳性植入物的生物发光来监测子宫内膜异位病灶(每组n＝8)的生长(桑S等人 人类基因治疗学(Hum Gene Ther.)2011；22：439-49)。在成像前10分钟，将总共150mg/kg荧光素腹膜内注射到小鼠尾静脉中。一式三份地在面元大小4下捕获来自每个动物的图像，且将生物发光信号强度平均化以便比较。
在干预结束时，如先前所述，通过使用LAB LSU-488系统与ProFlexMicroprobe S1500(巴黎的冒纳凯亚技术公司(Mauna Kea Technologies，Paris)测量荧光染料在植入物中发展的新微血管中的流动来监测子宫内膜异位病灶(每组n＝8)的功能性血管生成(许H等人生育与不孕2011；96：1021-8)。将总共10mg/ml FITC-葡聚糖静脉内注射到每个小鼠中，随后成像。总血管长度(μm)和面积(μm2)和功能性毛细管长度(μm-1)和表面密度使用LAB血管检测软件测量，且从一式两份的病灶的4个垂直区域平均化。同时，通过Cellvizio-LAB 488与ProFlex MiniO/100微探针使用LAB I/C查看器软件(冒纳凯亚技术公司)来捕获病灶中的凋亡细胞。将总共10μl的含10μM-1碘化物的DSMO直接注射到病灶区域中。
对凋亡细胞的总数计数且如上文所述从一式两份的病灶的4个垂直区域平均化。IVIS和Cellvizio成像程序均在使用异氟醚(伊利诺斯州的巴克斯特公司)的全身麻醉下进行，且观察小鼠直到其完全恢复。
在活动物成像之后，如先前所述，通过使用VivaCT 40μCT系统(瑞士的斯堪科医学公司(Scanco Medical，Switzerland))检测植入物中发展的新微血管中的Microfil来进一步检查子宫内膜异位病灶(每组n＝4)的结构性血管生成(孙MH(Sun MH)等人骨科研究杂志(J Orthop Res.)2012；30：137-43)。小鼠通过颈椎脱位处死且立即用4％多聚甲醛和Microfil MV-120蓝灌注。构建三维微血管架构，且使用内置软件测定绝对和相对的Microfil填充的微血管体积。
组织学和免疫染色
制备石蜡切片(每组n＝4)以便如先前所述进行标准苏木精和伊红(hematoxylin andeosin，H&E)染色、血管生成免疫染色和TUNEL染色(许H等人人类生殖2009；24：608-18)。使用MACH 3HRP聚合物试剂盒(康科德的生物照护医学公司(BiocareMedical，Concord))通过免疫过氧化酶方法进行原位血管生成的免疫组织化学染色，且使用甲基绿或甲基蓝溶液进行复染。
针对小鼠CD31和α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)的抗体(马萨诸塞州的艾宾公司(Abeam Inc.，MA))用于双重荧光染色子宫内膜异位病灶中发展的微血管，且针对CD34的抗体(艾宾公司)用于染色卵巢和子宫中的微血管。无初级抗体的样品充当阴性对照。分别计数病灶中阳性染色的新和旧的微血管的总数。平均微血管数目和大小由来自治疗组内的每个动物的5个分离的切片计算，且分别呈现为每病灶数目和每病灶μm2。
针对原位凋亡细胞的TUNEL标记使用ApopTag过氧化酶原位细胞凋亡检测试剂盒(加利福尼亚州的蒂梅丘拉(Temecula，CA))根据制造商的说明书进行。计数TUNEL阳性染色的细胞的总数目。平均凋亡细胞数目由来自治疗组内的每个动物的5个分离的切片计算且如上呈现为每病灶数目。对于所有检查，五个最佳切片展示出外表层和皮下层的全部组织学特点；首先由两名有经验的病理学家评估并选择中间子宫内膜异位病灶和内侧腹肌和腹膜以便进行详细检查。由不知道实验组和结果的两名检查员评估每一切片。
分析测量
EGCG和pro-EGCG在动物中的药物动力学通过测量干预期间血浆中以及干预结束时病灶中对应的EGCG和pro-EGCG浓度(EGCG组中的EGCG，pro-EGCG组中的pro-EGCG)来进行研究。EGCG和pro-EGCG通过如先前所述的分析方法定量(兰姆WH等人生物有机化学与医药化学2004；12：5587-93；朱KO(Chu KO)等人色谱B杂志(J Chromat B)2004；810：187-95；朱KO等人分析化学(Anal Chim Acta)2004；510：69-76)。样品的抗氧化和抗血管生成能力也通过如先前所述使用修改的藻红素荧光衰减分析测量氧自由基吸收能力(ORAC)来进行研究(王CC(Wang CC)等人临床化学(Clin Chem)2004；50：952-4)，并且血管内皮生长因子(VEGF)浓度使用商业ELISA试剂盒(德克萨斯州的优尔生生命科学公司(Uscn Life Science Inc.，TX))根据制造商的手册测量。每周一次从尾静脉收集血液样品(每组n＝8)，并且通过即刻离心制备血浆。从腹壁移出无皮下和肌肉层的植入物(每组n＝4)，并且将子宫内膜异位病灶冷冻。所有样品在分析之前均保持在-80℃中。
正位子宫内膜和卵巢
还检查了EGCG和pro-EGCG对每一动物的子宫内膜和卵巢的生殖作用。在4周干预之后，移出子宫角和卵巢(每组n＝8)，且将其固定以便如上文所述进行组织学检查和血管生成免疫染色。评估子宫内膜和卵巢基质中的子宫内膜腺体、卵巢滤泡和血管形成。
统计
根据标准方法和如我们的先前研究中所述计算动物的样品大小(许H等人人类生殖2009；24：608-18)。在EGCG处理之后小鼠中实验性子宫内膜异位病灶的大小减小的预期差值是10mm2，且预期标准偏差是3.5mm2，故每治疗组需要至少8只小鼠以用于0.01的I型错误与99％的功效。结果表示为平均值±SEM。干预期间的组间纵向比较使用ANOVA继而使用邦弗朗尼校正的个别组事后比较进行。干预后的组间的最终比较使用学生参数无关的t检验进行。统计分析用PASW统计第18版(伊利诺斯州的SPSS公司(SPSS Inc.，IL))进行。P值＜0.05被认为是显著。
结果
Pro-EGCG抑制小鼠中实验性子宫内膜异位的生长
用无创体内成像监测子宫内膜异位病灶以测定pro-EGCG对小鼠中实验性子宫内膜异位的生长和发展的治疗作用。发光子宫内膜异位病灶的生长在干预期间在每一周中加以监测，且利用来自植入物的增加的生物发光信号指示(图1A)。
在对照盐水组中，病灶生物发光在前2周略微增加；接着其在第3周快速增加且在第4周维持在高水平下(图1B)。
在EGCG处理的情况下，病灶生物发光维持在基线水平周围，且强度在干预的第2周、第3周和第4周显著低于盐水组的强度。
在pro-EGCG处理的情况下，病灶生物发光进一步减小到基线水平以下，且强度在干预的第2周、第3周和第4周显著低于盐水组和EGCG组两者的强度。
在维生素E组中，病灶生物发光强度在第3周显著低于盐水组的病灶生物发光强度，但其在干预的第4周返回到正常生长，如在盐水组中般。
Pro-EGCG限制小鼠中实验性子宫内膜异位的发展
在终结手术时，植入的子宫内膜异位病灶被鉴别为位于宿主腹肌与皮下层之间(图2A)。病灶是光滑且界限分明的。根据显微镜检查，病灶位于内侧腹肌和腹膜层与外部皮下和皮肤层之间。
与对照组相比，EGCG和pro-EGCG两组中的病灶大小和重量显著减小(图2B)。来自pro-EGCG处理的小鼠的病灶与来自EGCG处理的小鼠的病灶相比显著较小且较轻。在EGCG和pro-EGCG处理之后的子宫内膜异位病灶发展不佳。
子宫内膜组织在EGCG组中较小且松散地附着于邻近组织，但在pro-EGCG组中退化且几乎从腹膜肌肉层分离。相比之下，使用维生素E的全身性处理未显著减小病灶的大小或重量，且形成较大包囊样子宫内膜腺体结构。
Pro-EGCG抑制小鼠中实验性子宫内膜异位的血管生成
通过Cellvizio和μCT的体内血管生成成像以及利用CD31和αSMA染色的原位血管生成免疫组织化学分析展示出在EGCG和pro-EGCG处理的小鼠中病灶新血管生成发展不佳(图3A)。在与盐水组相比时，EGCG和pro-EGCG两者而非维生素E显著抑制病灶中的总血管长度和面积、功能性毛细管长度、密度和面积、血管体积和密度以及CD31阳性且αSMA阴性染色的新微血管数目和CD31阳性且αSMA阳性染色的旧微血管数目两者(图3B)。pro-EGCG组中的所有微血管参数均显著低于EGCG组中的微血管参数。
Pro-EGCG增强小鼠中实验性子宫内膜异位的细胞凋亡
通过Cellvizio进行的体内细胞凋亡成像和通过TUNEL染色进行的原位dUTP缺口末端标记展示出EGCG和pro-EGCG处理的小鼠中的病灶细胞凋亡增加(图4A)。与盐水组相比，EGCG和pro-EGCG两者而非维生素E显著增加病灶中的总凋亡细胞数目(图4B)。pro-EGCG组中的凋亡细胞数目也显著高于EGCG组中的凋亡细胞数目。
Pro-EGCG的高生物利用度、抗氧化和抗血管生成能力
测量(i)干预期间血浆中和(ii)干预后子宫内膜异位病灶中的EGCG和pro-EGCG浓度和ORAC和VEGF浓度，从而比较所述处理在小鼠中的药物动力学以及抗氧化和抗血管生成能力。
所述处理在血浆和子宫内膜异位病灶中在pro-EGCG情况下的生物利用度显著高于在EGCG情况下的生物利用度(图5A)。与盐水组相比，在维生素E、EGCG和pro-EGCG组中，血浆和子宫内膜异位病灶中的ORAC显著增加(图5B)。
血浆和子宫内膜异位病灶中的ORAC在pro-EGCG组中与在EGCG和维生素E组相比显著较高，但EGCG组与维生素E组没有显著不同。
与盐水组相比，在EGCG和pro-EGCG组中，血浆和子宫内膜异位病灶中的VEGF浓度显著减小，而维生素E组与盐水组没有显著不同(图5C)。pro-EGCG组中的血浆和子宫内膜异位病灶中的VEGF浓度显著低于EGCG组中的VEGF浓度。
Pro-EGCG保持正常卵巢滤泡和子宫内膜腺体
所有动物在子宫内膜移植之后均是健康且有活动力的。在干预期间未观察到应激迹象、对麻醉、手术或植入的不耐受或对盐水、维生素E、EGCG和pro-EGCG投与的任何毒性反应。在实验期内在组内和组间未观察到体重的显著变化。在腹部植入部位无可观察的肿胀、炎症或脱发。
卵巢滤泡和子宫内膜腺体通过H&E染色测定，且卵巢和子宫内膜基质中的微血管通过卵巢中抗小鼠CD34免疫染色来测定。组织学检查揭示对卵巢滤泡(图6A)和子宫内膜腺体(图6B)无明显的生殖作用。此外，卵巢和子宫的血管形成在任一治疗组中均未受影响。
结论
Pro-EGCG与EGCG相比以更大的功效、更好的生物利用度以及更大的抗氧化和抗血管生成能力显著抑制小鼠中实验性子宫内膜异位的发展、生长和血管生成。预期Pro-EGCG是用于子宫内膜异位的强力抗血管生成剂。
本发明提供一种用于治疗子宫内膜异位和相关适应症的改进的方法，其包含投与Pro-EGCG，Pro-EGCG是一种表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(-)-EGCG的合成衍生物，其与增加的稳定性和改进的生物利用度相关。
重要的是，Pro-EGCG在治疗子宫内膜异位和相关适应症的改进的方法中的使用并不影响受治疗的女性受试者如在排卵和月经中的生理性血管生成，且所述方法没有对生殖功能的副作用，和目前可利用的其它方法形成对比。
另外，Pro-EGCG当用于治疗子宫内膜异位和相关适应症的改进的方法时涉及使用易于制造的化合物，所述化合物可以相对较低成本制造。

Claims (18)

1.一种治疗子宫内膜异位或相关适应症的方法，其包含向有需要的个体投与有效量的具有下式的Pro-EGCG：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是治疗子宫内膜异位的方法。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述子宫内膜异位是腹膜或骨盆子宫内膜异位。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是治疗子宫腺肌症的方法。
5.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述Pro-EGCG被投与到所述个体的子宫腔中。
6.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述Pro-EGCG被投与到所述个体的阴道中。
7.一种Pro-EGCG，其具有下式：
其用于治疗有需要的个体的子宫内膜异位或相关适应症的方法。
8.根据权利要求7所述的Pro-EGCG，其用于治疗子宫内膜异位的方法。
9.根据权利要求8所述的Pro-EGCG，其用于治疗子宫内膜异位的方法，其中所述子宫内膜异位是腹膜或骨盆子宫内膜异位。
10.根据权利要求7所述的Pro-EGCG，其用于治疗子宫腺肌症的方法。
11.根据权利要求7到10中任一权利要求所述的Pro-EGCG，其用于治疗有需要的个体的子宫内膜异位或相关适应症的方法，其中所述Pro-EGCG被投与到所述个体的子宫腔中。
12.根据权利要求7到10中任一权利要求所述的Pro-EGCG，其用于治疗有需要的个体的子宫内膜异位或相关适应症的方法，其中所述Pro-EGCG被投与到所述个体的阴道中。
13.一种有效量的Pro-EGCG的用途，所述Pro-EGCG具有下式：
其用于制造治疗有需要的个体的子宫内膜异位和相关适应症的药剂。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述药剂用于治疗子宫内膜异位。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述子宫内膜异位是腹膜或骨盆子宫内膜异位。
16.根据权利要求13所述的用途，其中所述药剂用于治疗子宫腺肌症。
17.根据权利要求13到16中任一权利要求所述的用途，其中所述药剂适于投与到所述个体的子宫腔中。
18.根据权利要求13到16中任一权利要求所述的用途，其中所述药剂适于投与到所述个体的阴道中。
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