CN115708840A - 神香草提取物在制备抗肺癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了神香草提取物在制备抗肺癌药物中的应用，属于生物医药技术领域，本发明提供的神香草提取物可显著抑制人肺癌细胞A549和NCI‑H1975的增殖、迁移和侵袭，影响细胞形态及细胞上清液中炎症因子TNF‑α、IL‑6的释放，且具有剂量依赖性，同时有效抑制对其侵袭相关的基质金属酶MMP‑2、MMP‑9的分泌。本发明通过小鼠Lewis肺癌原位模型病理切片观察，神香草提取物可减少Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞数量，显著提高小鼠血清中IL‑2、IFN‑γ浓度水平，有效提升脾脏中淋巴细胞增殖能力和NK细胞数量发挥调节Lewis肺癌小鼠的免疫功能。同时，与顺铂联用可降低顺铂对肺癌小鼠的免疫抑制作用。

Description

神香草提取物在制备抗肺癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及神香草提取物在抗肺癌药物中的应用。

背景技术

原发性支气管肺癌(Primary bronchogenic caicinoma)，简称肺癌(Lungcancer)，根据病理类型又分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，是起源于支气管粘膜或腺体的恶性肿瘤。肺癌的发病率常年位于我国恶性肿瘤发病率首位，在我国男性和女性恶性肿瘤中肺癌发病率分别位居第1位和第2位，已成为严重威胁人类健康的恶性疾病之一。目前临床上对肺癌的主要治疗方法有化疗、介入、手术、基因、免疫治疗和药物治疗等。尽管近年来肺癌治疗手段有较快发展，然而总体预后并无明显改善，5年总生存率仅为16％～18％，且化疗的毒副作用严重影响患者的生活质量。

在我国，中医药与多学科相结合的治疗模式是医药领域的一大特色，也是目前科研人员治疗肺癌密切关注的研究热点。中药治疗肿瘤具有独特的优势，如改善机体的内环境，调节肿瘤微环境，从而起到免疫调节、抑制肿瘤发展的双重作用。中药单独使用可诱导肿瘤细胞凋亡、自噬，抑制其转移，作为辅助用药可调节患者的免疫功能，增强化疗敏感性，缓解放化疗所导致的不良反应及降低耐药性从而可提高患者的生存质量，延长患者的生存时间。

神香草为唇形科植物硬尖神香草Hyssopus cuspidatus Boriss的干燥地上部分，维吾尔名为“祖发奇尼”，是维吾尔族民间习用药材，性质干热，有很强的香味，具有镇咳、袪痰、平喘、消除吾腐乃提(炎症)的作用。神香草药用全草，全株主要含挥发油，具有痉挛停生物碱样作用，可使支气管痉挛解除，神香草的叶、花均可入药，也表现出镇咳祛痰的功用。在维吾尔医和民间用于治疗气管炎已有几百年的历史，其疗效确切、显著。神香草主要含挥发油、黄酮、萜类、酚类、有机酸及其脂类等化学成分，具有化痰止咳、清热利湿、杀菌之功效。发明人课题组研究发现神香草提取物具有较好的体内外抗炎、抗哮喘作用，结果表明，神香草提取物能够抑制RAW264.7细胞相关炎性因子的产生，抑制NF-κB信号通路和MAPK信号通路的激活，发挥抗炎作用；并有效抑制支气管哮喘小鼠炎症因子的释放，对Th1、Th2、Th17细胞的免疫应答具有一定的调节作用，同时对支气管平滑肌具有舒张作用。但是，现有技术中没有关于神香草提取物在治疗肺癌药物中的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供神香草提取物在制备抗肺癌药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种神香草提取物在制备抗肺癌药物中的应用。

优选地，所述抗肺癌药物的作用原理为抑制人肺癌细胞A549和NCI-H1975的增殖、迁移和侵袭，影响细胞形态，抑制炎症因子TNF-α、IL-6的释放，抑制基质金属酶MMP-2、MMP-9的分泌。

优选地，所述抗肺癌药物的作用原理还包括：提高血液中IL-2和IFN-γ的浓度，提高脾脏淋巴细胞的增值刺激指数和NK细胞的数量。

优选地，所述神香草提取物的有效浓度为3～300μg/mL。

优选地，所述抗肺癌药物包括神香草提取物和辅料。

优选地，所述抗肺癌药物的剂型为药学上可接受的剂型。

优选地，所述药学上可接受的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、糖浆、悬混剂、散剂、口服液或注射液。

优选地，，所述神香草提取物包括以下质量百分含量的有效成分：总黄酮含量为30～70％，总多酚含量为10～30％，迷迭香酸含量为0.05～5％。

有益技术效果：

本发明提供了神香草提取物在制备抗肺癌药物中的应用。本发明提供的神香草提取物对可显著抑制人肺癌细胞A549和NCI-H1975的增殖、迁移和侵袭，影响细胞形态及细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-6的释放，且具有剂量依赖性，同时有效抑制对其侵袭相关的基质金属酶MMP-2、MMP-9的分泌。本发明通过小鼠Lewis肺癌原位模型病理切片观察，神香草提取物可减少Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞数量，显著提高小鼠血清中IL-2、IFN-γ的浓度水平，有效提升脾脏中淋巴细胞增殖能力和NK细胞的数量发挥调节Lewis肺癌小鼠的免疫功能。同时，与顺铂联用可降低顺铂对肺癌小鼠的免疫抑制作用。

附图说明

图1：神香草提取物对人肺癌细胞A549细胞增殖的影响；其中，A：神香草提取物3μg/mL组，B：神香草提取物10μg/mL组，C：神香草提取物30μg/mL组，D：神香草提取物100μg/mL组，E：神香草提取物300μg/mL组，F：顺铂组；

图2：神香草提取物对人肺癌细胞NCI-H1975细胞增殖的影响；其中，A：神香草提取物3μg/mL组，B：神香草提取物10μg/mL组，C：神香草提取物30μg/mL组，D：神香草提取物100μg/mL组，E：神香草提取物300μg/mL组，F：顺铂组；

图3光学显微镜下不同浓度神香草提取物作用后A549细胞形态的变化；其中A：空白对照组，B：阳性对照组(顺铂30μg/mL)，C：神香草提取物3μg/mL组，D：神香草提取物10μg/mL组；E：神香草提取物30μg/mL组，F：神香草提取物100μg/mL组，G：神香草提取物300μg/mL组；

图4光学显微镜下不同浓度神香草提取物作用后NCI-H1975细胞细胞形态的变化；其中A：空白对照组，B：阳性对照组(顺铂30μg/mL)，C：神香草提取物3μg/mL组，D：神香草提取物10μg/mL组；E：神香草提取物30μg/mL组，F：神香草提取物100μg/mL组，G：神香草提取物300μg/mL组；

图5：荧光显微镜下不同浓度神香草提取物作用后A549细胞形态的变化(×10)；其中A：空白对照组，B：阳性对照组(顺铂30μg/mL)，C：神香草提取物3μg/mL组，D：神香草提取物10μg/mL组；E：神香草提取物30μg/mL组，F：神香草提取物100μg/mL组，G：神香草提取物300μg/mL组；

图6：荧光显微镜下不同浓度神香草提取物作用后NCI-H1975细胞形态的变化(×10)；其中A：空白对照组，B：阳性对照组(顺铂30μg/mL)，C：神香草提取物3μg/mL组，D：神香草提取物10μg/mL组；E：神香草提取物30μg/mL组，F：神香草提取物100μg/mL组，G：神香草提取物300μg/mL组；

图7：神香草提取物对人肺癌细胞A549细胞迁移的影响；其中A：空白对照组，B：阳性对照组(顺铂30μg/mL)，C：神香草提取物3μg/mL组，D：神香草提取物10μg/mL组；E：神香草提取物30μg/mL组，F：神香草提取物100μg/mL组，G：神香草提取物300μg/mL组；

图8：神香草提取物对人肺癌细胞NCI-H1975细胞迁移的影响；其中A：空白对照组，B：阳性对照组(顺铂30μg/mL)，C：神香草提取物3μg/mL组，D：神香草提取物10μg/mL组；E：神香草提取物30μg/mL组，F：神香草提取物100μg/mL组，G：神香草提取物300μg/mL组；

图9：神香草提取物对A549细胞细胞凋亡的影响；其中A：空白对照组，B：阳性对照组(顺铂30μg/mL)，神香草提取物3μg/mL组，D：神香草提取物10μg/mL组，E：神香草提取物30μg/mL组，F：神香草提取物100μg/mL组，G：神香草提取物300μg/mL组；

图10：神香草提取物对NCI-H1975细胞细胞凋亡的影响；其中A：空白对照组，B：阳性对照组(顺铂30μg/mL)，神香草提取物3μg/mL组，D：神香草提取物10μg/mL组，E：神香草提取物30μg/mL组，F：神香草提取物100μg/mL组，G：神香草提取物300μg/mL组；

图11：神香草提取物对A549细胞侵袭能力的影响；其中*P<0.05，与空白组比较，n＝3，A：空白组，B：神香草提取物30μg/mL组，C：神香草提取物100μg/mL组，D：神香草提取物300μg/mL组，E：顺铂组；

图12：神香草提取物对NCI-H1975细胞侵袭能力的影响；其中*P<0.05，与空白组比较，n＝3，A：空白组，B：神香草提取物30μg/mL组，C：神香草提取物100μg/mL组，D：神香草提取物300μg/mL组，E：顺铂组；

图13：神香草提取物对人肺癌细胞A549细胞上清液中炎症因子TNF-α和IL-6浓度的影响，其中A：空白对照组，B：阳性对照组(顺铂30μg/mL)，神香草提取物3μg/mL组，D：神香草提取物10μg/mL组，E：神香草提取物30μg/mL组，F：神香草提取物100μg/mL组，G：神香草提取物300μg/mL组；

图14：神香草提取物对人肺癌细胞NCI-H1975细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-6浓度的影响，其中A：空白对照组，B：阳性对照组(顺铂30μg/mL)，神香草提取物3μg/mL组，D：神香草提取物10μg/mL组，E：神香草提取物30μg/mL组，F：神香草提取物100μg/mL组，G：神香草提取物300μg/mL组；

图15：造模小鼠肺部病理切片；

图16：小鼠肿瘤组织病理切片；其中A为模型组，B为神香草提取物高剂量组，C为神香草提取物中剂量组，D为神香草提取物低剂量组，E为顺铂组，F为联合组；

图17：神香草提取物对脾脏中NK细胞比例的影响；其中，A为正常组，B为模型组，C为高剂量组，D为中剂量组，E为低剂量组，F为顺铂组，G为联合组。

具体实施方式

本发明提供了一种神香草提取物在制备抗肺癌药物中的应用。

在本发明中，所述抗肺癌药物的作用原理为抑制人肺癌细胞A549和NCI-H1975的增殖、迁移和侵袭，影响细胞形态，抑制炎症因子TNF-α、IL-6的释放，抑制基质金属酶MMP-2、MMP-9的分泌。

在本发明中，所述抗肺癌药物的作用原理还包括：提高血液中IL-2和IFN-γ的浓度，提高脾脏淋巴细胞的增值刺激指数和脾脏细胞中NK细胞的数量。

在本发明中，所述神香草提取物的有效浓度优选为3～300μg/mL，更优选为30～300μg/mL，最优选为100～300μg/mL。

在本发明中，所述抗肺癌药物包括神香草提取物和辅料。

在本发明中，所述抗肺癌药物的剂型为药学上可接受的剂型；所述药学上可接受的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、糖浆、悬混剂、散剂、口服液或注射液。在本发明中，所述神香草提取物包括以下质量百分含量的有效成分：总黄酮含量为30～70％，总多酚含量为10～30％，迷迭香酸含量为0.05～5％。

在本发明中，所述神香草提取物的制备方法包括以下步骤：

1)取干燥、粉碎，过10目筛的神香草地上部分，置圆底烧瓶中，加入重量15倍的体积浓度为50～80％乙醇水溶液进行提取，水浴加热温度50～70℃，回流提取1～3次，时间为1～3小时/次，提取后的滤液经减压浓缩至相对密度为1.0～1.5，备用；

2)将步骤1)中得到的提取液，经真空干燥箱干燥，真空度-0.08MPa，温度50～70℃，得到提取物，备用；

3)将步骤2)得到的提取物与聚酰胺树脂为或尼龙-66树脂按重量比1:6进行吸附，树脂柱径高比为1:2，上样液提取物浓度为20％，上样流速为1BV/h，吸附后先用水洗脱聚酰胺树脂7BV，洗脱流速1BV/h，再将水洗脱液弃去后，用体积比浓度为50％的乙醇水溶液洗脱7BV，流速为1BV/h，收集浓度为20～60％梯度的乙醇洗脱液，经旋转蒸发仪浓缩，再经真空干燥箱干燥，其真空度-0.08MPa，温度40～70℃，经摇式高速万能粉粹机粉碎至粉末，即得神香草提取物。

具体到本发明的实施例中，所得神香草提取物总黄酮含量为60.75％，总多酚含量为14.57％，迷迭香酸含量为0.184％。

在本发明中，所述神香草提取物的作用为：

1)神香草提取物随着浓度的升高对人肺癌细胞A549、NCI-H1975增殖的抑制作用逐渐增加且对细胞形态的影响逐渐明显。

2)神香草提取物可抑制A549细胞和NCI-H1975细胞的增殖和迁移，影响其细胞形态及细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-6的释放，促进凋亡，同时神香草提取物可抑制两种肺癌细胞的侵袭作用并抑制MMP-2及MMP-9的表达。

3)随着造模后天数的增加小鼠精神逐渐萎靡，呼吸逐渐困难，体重下降，服用神香草提取物后可影响肺癌小鼠的脾脏指数和体重指标，神香草提取物组、顺铂组及联合神香草提取物组脾脏指数下降，同时神香草提取物组体重略微升高。提示神香草提取物可调节小鼠免疫功能。

4)神香草提取物可提高小鼠血清中IL-2及IFN-γ的水平。

5)神香草提取物可提高小鼠脾脏淋巴细胞增殖刺激指数，降低顺铂对脾脏淋巴细胞的抑制作用。

6)神香草提取物可提高脾脏中NK细胞的数量，降低顺铂对脾脏中NK细胞的抑制作用。

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

1.方法：

1.1.神香草提取物对人肺癌A549、NCI-H1975增殖的影响

将对数生长期的A549、NCI-H1975细胞常规消化收集后，调整细胞浓度为3.5×10⁴个/mL、4×10⁴个/mL，接种于96孔板中，每孔接种100μL细胞悬液，置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育过夜。设置组别：空白组，给药组(3、10、30、100、300μg/mL)，阳性药组(30μg/mL顺铂)及空白对照组，在药物干预24h后，吸出培养基弃去，再加入10％MTS溶液，置于37℃、5％CO₂培养箱中，1-4h后在490nm处测各孔的吸光度值。

抑制率％＝[1-(OD_药物组-OD_对照组)/(OD_空白组-OD_对照组)]×100％

1.2神香草提取物对人肺癌细胞A549、NCI-H1975细胞形态及生长状态的影响

1.2.1光学显微镜观察人肺癌细胞A549、NCI-H1975形态学及生长状态的影响

取密度为5×10⁵个/mLA549细胞和NCI-H1975细胞接种于6孔板中，1mL/孔，放置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养。实验设置空白对照组，阳性对照组(30μg/mL顺铂干粉剂)，药物组(3μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、100μg/mL、300μg/mL)。分别培养24h和48h，于倒置光学显微镜下观察细胞形态变化并拍照。

1.2.2荧光显微镜观察人肺癌细胞A549和NCI-H1975形态学及生长状态的影响

取密度为5×10⁵个/mL A549细胞和NCI-H1975细胞接种于6孔板中，1mL/孔，于孵箱中孵育。细胞孔加入不同处理因素，作用24h、48h后弃掉培养液，用PBS润洗3次，1mL/孔。加入4％多聚甲醛，在细胞培养箱中固定15min，PBS润3次，1mL/孔。加入Hoechst 33342染料(PBS按1:100稀释)，室温孵育5min，避光，PBS清洗3次，1mL/孔。1mL/孔PBS封片，避光。于倒置荧光显微镜下观察细胞核形态变化并拍照。

1.3神香草提取物对人肺癌细胞A549和NCI-H1975迁移的影响

marker笔预先在空6孔板背面均匀画横竖线，线与线间隔大约0.5～1cm，每孔至少穿过5条线。每孔加密度约5×10⁵个/mL细胞，过夜。枪头垂直，在细胞板孔中画线，尽量不要倾斜，PBS润3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，放入孵箱培养。按0h，6h，12h，24h取样，拍照。

Image J软件计算各组修复面积百分比。

计算公式：划痕愈合距离＝划痕前宽度-划痕后宽度

抑制率＝(1-加药组划痕距离/对照组划痕距离)×100％

1.4神香草提取物对人肺癌细胞A549和NCI-H1975凋亡的影响

贴壁细胞需用0.25％的胰酶消化，在标记前用1×PBS或1×binding buffer洗涤，清除EDTA。

细胞收集：用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，2000rpm离心5-10min，收集细胞。细胞洗涤：用预冷1×PBS(4℃)重悬细胞一次，2000rpm离心5-10min，弃上清。加入300μL的1×Binding Buffer悬浮细胞。Annexin V-FITC标记：加入5μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15min。PI标记：上机前5min再加入5μL的PI染色。上机检测前，补加200μL的1×Binding Buffer。1h内用流式细胞仪检测，分析细胞凋亡率。

1.5神香草提取物对人肺癌细胞A549和NCI-H1975侵袭的影响

将A549或NCI-H1975细胞提前饥饿24h，常规消化收集细胞，DMEM培养基重悬细胞，调整细胞悬液浓度至4×10⁵个/mL，在每个小室中接种100μL细胞悬液，在下室加入含10％FBS的培养基600μL，清除上下室之间的气泡。接种细胞2h后(细胞贴壁后)，置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育。给药18h后，吸出小室及下室中的培养基，将小室取出放入装有PBS缓冲液的烧杯中清洗。上下室中分别加入4％多聚甲醛固定细胞，20min后吸出，并将小室置于PBS缓冲液中清洗。在上下室中分别加入0.1％结晶紫溶液染色，20min后吸出结晶紫溶液，并将小室置于PBS缓冲液中清洗。洗去多余染液后用棉签小心擦去小室内侧细胞，于倒置显微镜下观察，每组小室取上下左右及中间5视野，拍照并计数各个视野下的细胞个数，实验重复3次。

1.6神香草提取物对人肺癌细胞A549和NCI-H1975上清液TNF-α、IL-6的影响

将人肺癌细胞A549和NCI-H1975以5×10⁴个/孔的密度接种在96孔板，分组、加药，孵育24h后，收集细胞上清，按照ELISA试剂盒说明书的方法检测TNF-α，IL-6的含量。

1.7神香草提取物对Lewis肺癌小鼠的免疫调节作用

1.7.1动物分组及给药

C57BL/6小鼠雄性小鼠84只，将小鼠随机分为7组，每组12只，分别为：①正常组(正常饲养)；②模型组(0.5％CMC-Na溶液0.1mL/10g灌胃)；③阳性药组(1.5mg/kg顺铂腹腔注射，隔天给药)；④神香草提取物高剂量组(神香草提取物120mg溶于6mL0.5％CMC-Na溶液，10mg/10g灌胃)；⑤神香草提取物中剂量组(神香草提取物60mg溶于6mL0.5％CMC-Na溶液，5mg/10g灌胃)；⑥神香草提取物低剂量组(神香草提取物30mg溶于6mL0.5％CMC-Na溶液，2.5mg/10g灌胃)；⑦联合组(1.5mg/kg顺铂腹腔注射，隔天给药，神香草提取物10mg/10g灌胃)。造模第2日开始给药，每日给药一次，连续给药21天。

1.7.2lewis肺癌小鼠模型建立

将LLC-luc细胞用0.125％胰酶消化至细胞收缩变圆、细胞间隙变大时，加入含10％FBS的DMEM培养基终止消化，1000r/min，离心5min，弃去上清，加入PBS缓冲液重悬细胞。取出少量细胞混悬液，按1:1的比例加入4％台盼蓝染液，计数活细胞。将细胞浓度调整至2.2×10⁶个/mL，再与等体积matrigel matrix混匀，将混合好的细胞悬液置于冰上保持低温，备用。

将小鼠左胸前部的毛发刮净，完全暴露出胸前皮肤。碘伏消毒小鼠皮肤，在左腋前线下1cm处剪开0.5cm的皮肤，并可观察到暗红色心脏旁的粉红色的肺实质性组织，将注射器针头垂直刺入肺组织，进针深度3-5mm，将细胞悬液缓慢推射入肺内。在伤口处滴洒几滴庆大霉素注射液，4-0的可吸收缝合线缝合伤口1-2针。3天内观察小鼠伤口，在愈合较差的伤口处涂抹红霉素软膏，防止伤口感染。

1.7.3脾脏指数

小鼠末次给药结束后24h，记录小鼠体重，颈椎脱臼法处死小鼠，取出脾脏，剔除周围多余的脂肪及结缔组织后，记录脾脏重量，计算脾脏指数。

脾脏指数＝脾脏质量(mg)/体质量(g)。

1.7.4血清中IFN-γ、IL-2含量测定

小鼠末次给药24h后，眼球摘除取血，在室温下静置4h后，3000r/min离心15min，吸取上层血清。用于细胞因子的检测。采用双抗体夹心法，按照试剂盒说明书步骤检测各组IFN-γ、IL-2的含量，以分析神香草提取物对lewis肺癌小鼠血清中细胞因子水平的影响。

1.7.5脾脏淋巴细胞刺激指数

开腹取脾脏组织，剪碎、研磨，200目筛过滤，制备单细胞悬液，在细胞悬液中加入3倍体积红细胞裂解液，冰上放置15min，期间颠倒混匀两次。4℃，450×g离心10min,离心后下方的细胞团为白色。弃去上清液，再加入两倍体积红细胞裂解液重悬细胞，4℃，450×g离心10min。弃去上清液，加入含10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，台盼蓝染色，计数活细胞。将细胞浓度调整为5×10⁶个/ml，取100μL细胞悬液加入96孔板中，加入终浓度5μg/ml的ConA，常规培养48h后，MTS检测细胞增值率。

淋巴细胞刺激指数(SI)＝(实验组OD值-空白对照孔OD值)/(对照孔OD值-空白对照孔OD值)。

1.7.6流式细胞术检测小鼠NK细胞

将脾脏置于筛网上，用无菌的注射器针芯轻柔挤压研磨脾脏，PBS缓冲液冲洗，使其滤过。加入3倍体积的红细胞裂解液，冰上放置15min，期间颠倒混匀两次。4℃，450×g离心10min。弃去上清液，再加入两倍体积的红细胞裂解液，重悬细胞，4℃，450×g离心10min。弃去上清液，加入PBS缓冲液重悬细胞，台盼蓝染色，细胞计数，调整细胞浓度为1×10⁷个/mL。准备NK细胞特异性流式抗体PE anti-mouse NK1.1以及FITC anti-mouse CD3。上机流式分析，准备IgG的Isotype对照。在DAPI阴性下圈出来CD3阴型，NK1.1阳性的细胞群，即为所需要的NK细胞，加上偏转电压，收集NK细胞。

2实验结果

2.1神香草提取物对人肺癌细胞A549、NCI-H1975增殖的影响

2.1.1神香草提取物对人肺癌细胞A549细胞增殖的影响

结果如图1所示，神香草提取物干预24h后，对A549细胞的抑制率随着神香草提取物的浓度的升高而逐渐增加。与空白组相比，当神香草提取物的浓度大于30μg/mL时，细胞数量急剧减少，提示神香草提取物对A549细胞呈现显著的细胞毒性和生长抑制作用。

2.1.2神香草提取物对人肺癌细胞NCI-H1975细胞增殖的影响

结果如图2所示，药物干预24h后，NCI-H1975细胞的抑制率随着神香草提取物的浓度的升高而逐渐增加，当神香草提取物的浓度大于30μg/mL时，细胞的抑制率明显增加，提示神香草提取物对NCI-H1975细胞呈现显著的细胞毒性和生长抑制作用。

2.2神香草提取物对人肺癌细胞A549、NCI-H1975细胞形态及生长状态的影响

2.2.1光学显微镜下观察神香草提取物对人肺癌细胞A549细胞形态及生长状态的影响

由图3可知，药物组作用48h作用后，空白对照组A549细胞形态清晰，呈长梭形，贴壁生长，生长旺盛；阳性药物组A549细胞形态明显不规则，细胞体积缩小变圆增多；神香草提取物组浓度为3μg/mL～10μg/mL的少数A549细胞体积开始缩小变圆，神香草提取物组浓度为30μg/mL～300μg/mL的A549细胞缩小变圆，并随药物浓度的增加而加剧，且形态不规则情况增多。

2.2.2光学显微镜下观察神香草提取物对人肺癌细胞NCI-H1975细胞形态及生长状态的影响

如图4所示，药物作用NCI-H1975细胞48h后，空白对照组形态规则，轮廓清晰，贴壁生长，生长旺盛；阳性药物组NCI-H1975细胞形态发生明显变化，体积缩小变圆的细胞增多，细胞碎裂呈小块状；神香草提取物组浓度为3μg/mL～10μg/mL的少数NCI-H1975细胞变圆，细胞形态不规则，有缩小变圆的趋势，神香草提取物浓度为30μg/mL～300μg/mL的NCI-H1975细胞变圆数量明显增加，部分细胞碎裂。

2.2.3荧光显微镜下观察神香草提取物对人肺癌细胞A549细胞形态及生长状态的影响

由图5可知，不同处理因素作用于A549细胞24h，Hoechst33342染色后荧光显微镜下观察发现，空白对照组的细胞，细胞核形态规则，大小均匀，状态较好，蓝色荧光较弱；与空白对照组比较，阳性药物组的细胞形状不规则，细胞核固缩、碎裂，碎裂的细胞核蓝色荧光较强，浓度为3μg/mL、10μg/mL、30μg/mL的神香草提取物作用24h后，少数细胞核形态变得不规则，有核碎裂，浓度为100μg/mL、300μg/mL的神香草提取物作用24h后，细胞核生长依次变得缓慢，形状不规则，核碎裂现象明显。

2.2.4荧光显微镜下观察神香草提取物对NCI-H1975细胞形态及生长状态的影响

由图6所示，不同处理因素作用于NCI-H1975细胞24h，Hoechst33342染色后荧光显微镜下观察发现，对照组的细胞，细胞核形态正常，大小均匀，形态规则，细胞核蓝色荧光较弱；与对照组细胞核比较，阳性药物组的细胞，细胞核体积变小，形态不规则，有核碎裂情况；与对照组细胞核比较，浓度为3μg/mL、10μg/mL、30μg/mL的神香草提取物作用24h后，少数细胞核碎裂，碎裂的细胞核蓝色荧光较弱，100μg/mL、300μg/mL的神香草提取物组细胞核形态不规则，核固缩、碎裂情况明显，碎裂的细胞核荧光轻度较强。

2.3神香草提取物对人肺癌细胞A549、NCI-H1975迁移的影响

2.3.1神香草提取物对人肺癌细胞A549细胞迁移的影响

由图7所示，在不同处理条件下，空白对照组在划痕后随着时间的增加细胞迁移速度变快，迁移细胞的数量增加；与空白对照组相比，阳性药物组细胞迁移速度和迁移细胞数量均下降，划痕区域的愈合明显受到抑制、细胞迁移减慢。神香草提取物组(3μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、100μg/mL、300μg/mL)分别处理24h、48h、72h后均能显著抑制A549细胞迁移，差异有统计意义(P<0.05-0.001)，并且具有浓度依赖性。结果表明：神香草提取物对人肺癌细胞A549迁移起剂量依赖性抑制作用。

2.3.2神香草提取物对人肺癌细胞NCI-H1975细胞迁移的影响

由图8所示，在不同处理条件下，观察24h、48h、72h后NCI-H975细胞的迁徙情况，空白对照组随着时间的增加细胞迁移速度变快，迁移细胞的数量增加；与空白对照组相比，阳性药物组细胞迁移速度和迁移细胞数量均下降，划痕区域的愈合明显受到抑制、细胞迁移减慢。神香草提取物组(3μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、100μg/mL、300μg/mL)分别处理24h、48h、72h后，NCI-H1975细胞划痕区域的愈合受到明显抑制，差异具有统计意义(P<0.05-0.001)。结果表明：神香草提取物对人肺癌细胞NCI-H1975的迁移具有抑制作用。

2.4神香草提取物对人肺癌细胞A549、NCI-H1975凋亡的影响

2.4.1神香草提取物对人肺癌细胞A549细胞凋亡的影响

图9结果显示：与空白对照组相比，阳性对照组和神香草提取物各剂量组均能不同程度导致人肺癌细胞A549凋亡数量增加。其中，神香草提取物浓度为100μg/mL和300μg/mL剂量组对A549细胞早期凋亡具有促进作用，且结果有统计学差异(p<0.05-0.01)；对A549细胞晚期凋亡，神香草提取物各剂量组均有促进凋亡作用，且结果都具有统计学差异(p<0.05-0.001)。2.4.2神香草提取物对人肺癌细胞NCI-H1975细胞凋亡的影响

图10结果显示，与空白对照组相比，阳性对照组和神香草提取物各剂量组均能不同程度导致人肺癌细胞NCI-H1975凋亡数量增加。其中，神香草提取物300μg/mL对NCI-H1975细胞早期凋亡有促进作用，结果具有统计学差异(p<0.01)；而对NCI-H1975晚期凋亡，神香草提取物各剂量组均有促进作用，且结果有统计学差异(p<0.05-0.001:)。

2.5神香草提取物对人肺癌细胞A549、NCI-H1975细胞侵袭的影响

2.5.1神香草提取物对人肺癌细胞A549细胞侵袭的影响

采用Transwell小室法检测神香草提取物对A549细胞侵袭能力影响，结果如图11所示，加药干预18h后，空白组穿过小室的细胞数为(136.67±29.29)个，神香草提取物：低剂量组穿过的细胞数为(113.29±30.42)个，神香草提取物中剂量组穿过的细胞数为(91.23±13.71)个，神香草提取物高剂量组穿过的细胞数为(51.06±10.59)个，顺铂组穿过的细胞数为(66.94±4.70)个。与空白组相比，各浓度组穿过小室的细胞数均少于空白组，神香草提取物高剂量组及顺铂组穿过的细胞数明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.5.2神香草提取物对人肺癌细胞NCI-H1975细胞侵袭的影响

采用Transwell小室法检测神香草提取物对NCI-H1975细胞侵袭能力的影响，结果如图12所示，加药干预18h后，空白组穿过小室的细胞数为(116.92±14.29)个，神香草提取物低剂量组穿过的细胞数为(107.80±17.73)个，神香草提取物中剂量组穿过的细胞数为(89.88±15.53)个，神香草提取物高剂量组穿过的细胞数为(69.94±18.01)个，顺铂组穿过的细胞数为(65.53±13.85)个。与空白组相比，各浓度组穿过的细胞数均少于空白组，神香草提取物300μg/mL组及顺铂组穿过的细胞数明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.6神香草提取物对人肺癌细胞A549和NCI-H1975上清液中炎症因子TNF-α、IL-6的影响

2.6.1神香草提取物对人肺癌细胞A549细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-6的影响

由图13实验结果显示，给予1μg/mL LPS刺激24h后，与模型组相比，阳性对照组TNF-α分泌量明显降低；神香草提取物各剂量组对LPS诱导的A549细胞上清液中TNF-α分泌量具有抑制作用，差异具有统计学意义(P<0.01-0.001)。

给予1μg/mL LPS刺激24h后，与模型组组相比，阳性对照组IL-6分泌量明显降低(P<0.001)；神香草提取物各剂量组对LPS诱导的A549细胞上清液中IL-6分泌量具有明显抑制作用，差异具有统计学意义(P<0.001)。

2.6.2神香草提取物对人肺癌细胞NCI-H1975细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-6的影响

由图14实验结果显示，给予1μg/mL LPS刺激24h后，与模型组相比，阳性对照组TNF-α和IL-6分泌量均明显降低(P<0.001)；神香草提取物各剂量组对LPS诱导的NCI-H975细胞上清液中TNF-α和IL-6分泌量均具有抑制作用，差异具有统计学意义(P<0.01-0.001)。

2.7神香草提取物对Lewis肺癌小鼠的免疫调节作用

2.7.1 lewis肺癌小鼠肺部病理学观察

如图15所示，在小鼠肺部病理切片中，可观察到区别于正常肺组织的致密的肿瘤组织病灶。

2.7.2肿瘤组织病理切片

除正常组外，6组实验组小鼠肿瘤组织HE染色结果如图16所示，模型组小鼠肿瘤组织细胞轮廓清晰，分布密集，细胞生长旺盛，且核大深染。各给药组小鼠肿瘤组织细胞密度均下降，坏死区域均增多，神香草提取物高剂量组最为明显。顺铂组中有大片细胞细胞核固缩，细胞崩解坏死。

2.7.3神香草提取物对脾脏指数及体重的影响

结果如表1所示，与正常组相比，模型组、神香草提取物中剂量组与低剂量组的脾脏指数显著升高(^ΔP<0.05)，顺铂组的脾脏指数显著降低，神香草提取物高剂量组的脾脏指数与正常组接近。与模型组相比，神香草提取物高剂量组、顺铂组、神香草提取物与顺铂联合组的脾脏指数显著降低(^*P<0.05)，神香草提取物其余各组的脾脏指数与模型组无显著差异。模型组，神香草提取物各剂量组的脾脏指数高于与顺铂组，差异具有显著性。与正常组相比，模型组、神香草提取物各剂量组、顺铂组及神香草提取物与顺铂联合组小鼠的体重均显著低于正常组(P<0.05)。与模型组比较，神香草提取物各剂量组体重略微升高(P>0.05)。提示神香草提取物可调节小鼠免疫功能。

表1神香草提取物对小鼠脾脏指数及体重的影响(

n＝5)

注：ΔΔΔP<0.0001,ΔΔP<0.001,与正常组相比；***P<0.0001,**P<0.001,与模型组相比；###P<0.0001与顺铂组相比。

2.7.4神香草提取物对小鼠血清中IL-2、IFN-γ含量的影响

如表2所示，与正常组相比，模型组小鼠血清中IL-2的浓度明显降低；与模型组相比，神香草提取物各剂量组小鼠血清中的IL-2浓度均高于模型组，且神香草提取物高剂量组IL-2的浓度显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与顺铂组相比，神香草提取物与顺铂联合组的IL-2浓度升高，但差异不明显(P>0.05)。与正常组相比，模型组INF-γ的浓度显著下降(P<0.05)；与模型组相比，神香草提取物各剂量组小鼠血清中INF-γ的浓度均高于模型组，神香草提取物高剂量组INF-γ浓度显著升高(P<0.05)。与顺铂组相比，神香草提取物与顺铂联合组INF-γ的浓度升高不明显，差异无统计学意义。结果表明神香草提取物高剂量组可提高小鼠外周血中IL-2及IFN-γ的含量。

表2神香草提取物对各组小鼠血清中IL-2、IFN-γ浓度的影响

注：ΔΔΔP<0.0001,ΔΔP<0.001,与正常组相比；***P<0.0001,**P<0.001,与模型组相比；###P<0.0001与顺铂组相比。

2.7.5神香草提取物对脾脏淋巴细胞增殖的影响

结果如表3所示，与正常组相比，模型组、神香草提取物低剂量组、顺铂组的脾脏淋巴细胞增殖刺激指数降低；与模型组相比，神香草提取物高剂量组与联合组的脾脏淋巴增殖刺激指数显著升高(P<0.05)；与顺铂组相比，联合组的脾脏淋巴增殖刺激指数显著升高(P<0.0001)，差异具有统计学意义。提示神香草提取物高剂量组可在体外刺激脾脏淋巴细胞增殖，与顺铂联合使用时可减轻顺铂对脾脏淋巴细胞的抑制作用。

表3神香草提取物对各组小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响(

n＝5)

注：^ΔΔP<0.001,与正常组相比；^*P<0.05,与模型组相比；^###P<0.001,与顺铂组相比。

2.7.6神香草提取物对NK细胞数量的影响

结果如图17所示，与正常组比较，模型组，神香草提取物中剂量组，低剂量组及顺铂组NK细胞的比例显著降低；与模型组比较，神香草提取物高剂量组及联合组NK细胞的比例显著升高(P<0.0001)；与顺铂组比较，神香草提取物高剂量组及联合组NK细胞的比例显著升高(P<0.0001)，提示高剂量的神香草提取物可促进NK细胞增殖，与顺铂联合使用可减轻顺铂对免疫系统的抑制作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.神香草提取物在制备抗肺癌药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肺癌药物的作用原理包括：抑制人肺癌细胞A549和NCI-H1975的增殖、迁移和侵袭，影响细胞形态，抑制炎症因子TNF-α、IL-6的释放，抑制基质金属酶MMP-2、MMP-9的分泌。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述抗肺癌药物的作用原理还包括：提高血液中IL-2和IFN-γ的浓度，提高脾脏淋巴细胞的增值刺激指数和NK细胞的数量。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述神香草提取物的有效浓度为3～300μg/mL。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肺癌药物包括神香草提取物和辅料。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肺癌药物的剂型为药学上可接受的剂型。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、糖浆、悬混剂、散剂、口服液或注射液。

8.根据权利要求1～7任意一项所述的应用，其特征在于，所述神香草提取物包括以下质量百分含量的有效成分：总黄酮含量为30～70％，总多酚含量为10～30％，迷迭香酸含量为0.05～5％。

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