TWI635867B

TWI635867B - 中草藥組合物製備抑制腫瘤細胞轉移之藥物之用途

Info

Publication number: TWI635867B
Application number: TW105132603A
Authority: TW
Inventors: 吳永昌; 佘玉萍; 楊顓丞; 戴昀皓
Original assignee: 中國醫藥大學
Priority date: 2016-10-07
Filing date: 2016-10-07
Publication date: 2018-09-21
Also published as: TW201813657A

Abstract

本發明為一種新穎組合之中草藥組合物，包括黃連萃取物和大黃萃取物。本發明另包含此中草藥組合物的製備方法，以極性溶劑萃取黃連和大黃，再將所得黃連萃取物和大黃萃取物乾燥後，混合可得到本發明之中草藥組合物。而本發明之中草藥組合物具有抑制腫瘤細胞轉移的作用，藉此本發明之中草藥組合物可用以製備抑制腫瘤細胞轉移之藥物。

Description

中草藥組合物製備抑制腫瘤細胞轉移之藥物之用途

本發明是有關於一種新穎的中草藥組合物、其製備方法及其用途，特別是一種可用於抑制腫瘤細胞轉移的中草藥組合物、其製備方法及其用於製備抑制腫瘤細胞轉移之藥物之用途。

癌症又名為惡性腫瘤，為細胞不正常增生，且這些增生的細胞可能侵犯身體的其他部分，為由控制細胞分裂增殖機制失常而引起的疾病。全世界罹患癌症的人口有不斷增加的趨勢，癌症係國人十大死因之一，且已連續二十七年為居十大死因之榜首。

癌症最可怕的地方在於病情進入轉移(metastasis)階段，癌細胞轉移是一個連續的過程，癌細胞從原發部位的腫瘤上剝落，侵入血管、淋巴管或經由其他途徑傳播到適當的位置生根繁殖，並在新的地方建立血管系來支持自己的生長，而能長大到會威脅生命的量，肺、骨骼和肝臟等為常見的轉移部位。

根據統計，癌症的死亡病例中，多數是因癌細胞轉移肺臟、肝臟、骨骼與腦部等重要器官而導致死亡，只有不到10%是由原發腫瘤引起。儘管化學治療等方法能夠延長癌細胞轉移病患的生命，然而由於醫學界對癌細胞轉移過程始終所知有限，因此少有藥物或療法能真正阻斷轉移過程，進而治癒疾病，這也是人人聞癌色變的一大原因。

因此，本發明之一態樣是在提供一種抑制腫瘤細胞轉移(metastasis)之中草藥組合物，包含黃連(Coptis chinensis)萃取物和大黃(Rheum rhabarbarum)萃取物，其中黃連萃取物和大黃萃取物之重量比例範圍為1：0.1至1：101。

依據前述之抑制腫瘤細胞轉移之中草藥組合物，其中腫瘤細胞可為乳癌細胞、肺癌細胞或膀胱癌細胞。

依據前述之抑制腫瘤細胞轉移之中草藥組合物，其中所述中草藥組合物之有效成分包含黃連鹼(Coptisine)和反式白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸(trans-Resveratrol 4'-O-β-D-glucuronide)。

依據前述之抑制腫瘤細胞轉移之中草藥組合物，其可為錠劑、丸劑、粒劑、粉末、膠囊或液劑。

本發明之另一態樣是在提供一種中草藥組合物之製備方法，包含以一極性溶劑分別萃取黃連和大黃，以得到黃連萃取物和大黃萃取物，所述極性溶劑可為水或乙醇。再乾燥黃連萃取物和大黃萃取物，以得黃連萃取物粉末和大黃萃取物粉末。最後混合黃連萃取物粉末和大黃萃取物粉末，以得到中藥組合物，其中黃連萃取物粉末和大黃萃取物粉末之重量比例範圍為1：0.1至1：101。

依據前述之中草藥組合物之製備方法，其中黃連和大黃為粉末或碎片。

依據前述之中草藥組合物之製備方法，其中黃連為味連(Coptis Chinensis Franch.)、雅連(Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao)、雲連(Coptis teeta Wall.)或台灣黃連(Coptis quinquefolia Miq.)。

依據前述之中草藥組合物之製備方法，其中大黃為掌葉大黃(Rheum palmatum L.)、唐古特大黃(Rheum tanguticum Maxim.)或藥用大黃(Rheum officinale Baill.)。

本發明之又一態樣是在提供一種中草藥組合物之用途，其係用以製備抑制腫瘤細胞轉移之藥物，所述之中草藥組合物包含黃連萃取物和大黃萃取物，且黃連萃取物和大黃萃取物之重量比例範圍為1：0.1至1：101。

依據前述之中草藥組合物之用途，其中抑制腫瘤細胞轉移之藥物可為抑制腫瘤細胞遷移(migration)之藥物或抑制腫瘤細胞侵入(invasion)之藥物。

藉此，本發明所提供的中草藥組合物具有特定比例的黃連萃取物和大黃萃取物，且其中包含黃連鹼和反式白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸等有效成分，因本發明已確定產生抑制腫瘤轉移效果的黃連萃取物和大黃萃取物混合的特定比例及其有效成分，對日後進行中藥新藥臨床試驗品管該批藥品藥效能成為有力之憑據。而本發明之中草藥組合物能使黃連萃取物和大黃萃取物產生顯著的協同作用以抑制腫瘤細胞轉移，包含抑制腫瘤細胞的遷移和侵入，特別是抑制乳癌細胞的轉移，最佳地為雌激素受體陰性的乳腺癌細胞株。故本發明所揭露之中草藥組合物，可作為一種抑制腫瘤細胞轉移的藥物。

上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

100‧‧‧中草藥組合物之製備方法

110、120、130‧‧‧步驟

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖繪示本發明之中草藥組合物之製備方法之步驟流程圖；第2A圖為黃連萃取物之HPLC分析圖；第2B圖為大黃萃取物之HPLC分析圖；第3圖為黃連水萃取物之抑制移動測試之結果圖；第4圖為大黃水萃取物之抑制移動測試之結果圖；第5A圖至第5C圖為本發明之中草藥組合物之抑制乳癌細胞移動測試之結果圖；第6A圖至第6B圖為本發明之中草藥組合物之抑制乳癌細胞移動測試之結果圖；第7A圖至第7B圖為本發明之中草藥組合物之抑制膀胱癌細胞移動測試之結果圖；第8A圖至第8E圖為本發明之中草藥組合物之抑制肺癌細胞移動測試之結果圖；第9A圖至第9F圖為本發明之中草藥組合物之抑制侵入測試之結果圖；第10A圖至第10D圖為注射4T1-Luc乳腺癌細胞後第二周和第五周小鼠之血管超音波圖；第11A圖為注射4T1-Luc乳腺癌細胞後第五周小鼠體內冷光量之量化圖；以及第11B圖為注射4T1-Luc乳腺癌細胞後第六周小鼠肺部組織冷光量之量化圖。

本說明書揭露內容提出一種新穎的中草藥組合物、其製備方法及其用於抑制腫瘤細胞轉移的應用，並以體外試驗評估本發明之中草藥組合物抑制腫瘤細胞轉移的功效，並進一步驗證本發明之中草藥組合物可抑制腫瘤細胞的遷移和侵入。

茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。

<試驗例> 一、製備本發明之中草藥組合物

請參照第1圖，其係本發明之中草藥組合物之製備方法100之步驟流程圖。第1圖中，本發明之中草藥組合物之製備方法100包含步驟110、步驟120和步驟130。

步驟110，以一極性溶劑分別萃取黃連(Coptis chinensis)和大黃(Rheum rhabarbarum)，以得到黃連萃取物和大黃萃取物。更進一步說，先將黃連和大黃打碎研磨成粉末後，各取乾重500g，浸泡於極性溶劑中，超音波震盪10分鐘後，靜置10分鐘，再予以超音波震盪10分鐘後，可得黃連萃取物和大黃萃取物。其中極性溶劑可為水或50%重量比之乙醇。而適用於本發明之中草藥組成物之黃連和大黃可為任一品種之習知藥材，其中黃連較佳為味連(Coptis Chinensis Franch.)、雅連(Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao)、雲連(Coptis teeta Wall.)或台灣黃連(Coptis quinquefolia Miq.)，而大黃較佳為掌葉大黃(Rheum palmatum L.)、唐古特大黃(Rheum tanguticum Maxim.)或藥用大黃(Rheum officinale Baill.)。

步驟120，乾燥黃連萃取物和大黃萃取物，以得黃連萃取物粉末和大黃萃取物粉末。更進一步說，將步驟 110中所得之黃連萃取物和大黃萃取物以濾紙或濾膜過濾後，利用冷凍乾燥法或冷凍真空乾燥法乾燥黃連萃取物和大黃萃取物，以得到黃連萃取物粉末和大黃萃取物粉末，並將黃連萃取物粉末和大黃萃取物粉末妥善存放於-80℃冰箱備用。

步驟130，混合黃連萃取物粉末和大黃萃取物粉末，以得到中藥組合物，其中黃連萃取物粉末和大黃萃取物粉末之重量比例範圍為1：0.1至1：101。

將經步驟110所萃取出黃連萃取物和大黃萃取物，取上清液以0.45μm之濾膜過濾作為檢液，注入20μl至HPLC中定量分析，以分析其中所含之有效成分。其中經由步驟110所萃取出之黃連萃取物之主要有效成分為黃連鹼(coptisine)，經由步驟110所萃取出之大黃萃取物之主要有效成分為反式白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸(trans-resveratrol-4'-O-β-D-glucuronide)。

請參照第2A圖和表一，第2A圖為黃連萃取物之HPLC分析圖，表一為黃連生藥材及黃連萃取物中黃連鹼含量之百分比。

在第2A圖中，於滯留時間16.5分鐘(箭頭所指之處)可見黃連鹼被沖提出，而於表一可見，與黃連生藥材相較，經由步驟110所萃取出黃連萃取物，不論是利用50%重量比之乙醇或水進行萃取之黃連萃取物，皆能大幅提升其中黃連鹼的含量。

請參照第2B圖和表二，第2B圖為大黃萃取物之HPLC分析圖，表二為大黃生藥材及大黃萃取物中反式白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸含量之百分比。

在第2B圖中，於滯留時間22.6分鐘(箭頭所指之處)可見反式白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸被沖提出，於表二可見，與大黃生藥材相較，經由步驟110所萃取出大黃萃取物，不論是利用50%重量比之乙醇或水進行萃取之大黃萃取物，皆能大幅提升其中反式白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸的含量，而利用水進行萃取的大黃萃取物所含的反式白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸，又較利用50%重量比之乙醇進行萃取的大黃萃取物更多。

二、本發明之中草藥組合物抑制腫瘤細胞轉移 1.抑制移動(migration)分析

腫瘤細胞轉移時，若為高轉移細胞株，當細胞間受到破壞，加上細胞本身釋放大量的蛋白分解酵素促進細胞外基質降解，會增加腫瘤細胞的遷移情形，造成腫瘤細胞的轉移。

本試驗利用細胞刮傷試驗(Wound scratching assay)分析黃連萃取物、大黃萃取物和含有不同比例的黃連萃取物和大黃萃取物之中草藥組合物對於腫瘤細胞遷移的影響效應。

試驗使用的細胞為人類乳腺細胞MDA-MB-231細胞株、人類膀胱癌細胞TCCSUP細胞株和小鼠肺臟上皮細胞TC-1細胞株，其中MDA-MB-231細胞株為雌性激素受體陰性(ERα(-))的乳腺癌細胞株，TC-1細胞株為C57BL/6小鼠肺臟上皮細胞的初級培養細胞，經由含有HPV-16 E6和E7之質體不朽化(immortalized)後，再轉染攜帶有ras致癌基因的質體所形成的腫瘤細胞株。細胞皆購自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center；BCRC)。MDA-MB-231細胞株培養於含10%胎牛血清(Fetal bovine serum；FBS)的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培養液中。培養箱維持5% CO₂、37℃恆溫。細胞培養至一定數量時，利用0.05mM的胰蛋白(trypsin)和2.5mM的EDTA將細胞在培養皿中打散，轉植到新的培養皿中，於實驗前24小時更換培養液，並以細胞計數器(hemocytometer)計算細胞數目。TCCSUP細胞株培養於含10% FBS的DMEM培養液中，另加入100units/mL的青黴素(penicillin)和100μg/mL的鏈黴素(streptomycin)，在5% CO₂、37℃恆溫的培養箱中培養。細胞培養至一定數量時，利用0.05mM的胰蛋白(trypsin)和2.5mM的EDTA將細胞在培養皿中打散，轉植到新的培養皿中，於實驗前24小時更換培養液，並以細胞計數器(hemocytometer)計算細胞數目。TC-1細胞株培養於含10% FBS的RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute 1640)培養液中，另加入100units/mL的青黴素(penicillin)、100μg/mL的鏈黴素(streptomycin)、2mM的麩胺酸(L-glutamin)、2mM的非必要胺基酸(non-essential amino acid)、1mM的丙酮酸鈉(sodium pyruvate)，在5% CO₂、37℃恆溫的培養箱中培養。此外在培養過程中，細胞仍須持續加入藥物Neomycin(G418；400g/mL)，以維持TC-1細胞可表現E6、E7和ras的特性。培養至一定數量時，利用0.05mM的胰蛋白和2.5mM的EDTA將細胞在培養皿中打散，轉植到新的培養皿中，於實驗前24小時更換培養液，並以細胞計數器(hemocytometer)計算細胞數目。

1-1.本發明之中草藥組合物抑制乳癌細胞轉移之效果

觀察細胞遷移的方法係利用ibidi Culture-Insert(ibidi)製造出大小一致的細胞間隙(500±50μm)，再觀察MDA-MB-231細胞株以黃連水萃取物、大黃水萃取物和含有不同比例的黃連水萃取物和大黃水萃取物之中草藥組合物處理後24小時的遷移情況。以及 MDA-MB-231細胞株以黃連乙醇萃取物、大黃乙醇萃取物和含有黃連乙醇萃取物和大黃乙醇萃取物之中草藥組合物處理後12小時的遷移情況。

觀察含有黃連水萃取物和大黃水萃取物之中草藥組合物對於MDA-MB-231細胞株遷移情況影響的詳細試驗步驟如下，將MDA-MB-231細胞株濃度調整為5×10⁵cells/mL，取70μl分別加入insert兩邊，待細胞貼穩後(24小時)，移除insert並拍照當作實驗前面積。再加入黃連水萃取物、大黃水萃取物和含有不同比例的黃連水萃取物和大黃水萃取物之中草藥組合物，培養24小時後拍照當作實驗後面積，而於試驗中另包含未加入任何萃取物的組別作為控制組。計算兩者面積，再帶入下面公式I便可換算MDA-MB-231細胞株之閉合率。

另再將各組所計算出之閉合率，利用CompuSyn軟體計算黃連水萃取物和大黃水萃取物的協同作用指數(combination index,CI)，以找出黃連水萃取物和大黃水萃取物最佳混合比例。

請參照第3圖，第3圖為黃連水萃取物之抑制移動測試之結果圖。結果顯示，黃連水萃取物具有抑制MDA-MB-231細胞株移動的效果，且隨著黃連水萃取物的濃度增加，其抑制MDA-MB-231細胞株移動越好。

請參照第4圖，第4圖為大黃水萃取物之抑制移動測試之結果圖。結果顯示，大黃水萃取物亦具有抑制MDA-MB-231細胞株移動的效果，隨著大黃水萃取物的濃度增加，其抑制MDA-MB-231細胞株移動越好。且由第3圖和第4圖可知，黃連水萃取物抑制MDA-MB-231細胞株移動較大黃水萃取物的效果更佳。

請再參照第5A圖至第5C圖，第5A圖至第5C圖為本發明之中草藥組合物之抑制乳癌細胞移動測試之結果圖，第5A圖為固定黃連水萃取物使用的濃度為75μg/mL，再進一步調整大黃水萃取物與其之混合比例。第5B圖之黃連水萃取物的濃度為150μg/mL，大黃水萃取物的濃度為113μg/mL。第5C圖為固定大黃水萃取物使用的濃度為75μg/mL，再進一步調整黃連水萃取物與其之混合比例。由第5A圖至第5C圖的結果顯示，雖單獨加入黃連水萃取物或大黃水萃取物，其皆有抑制MDA-MB-231細胞株移動的效果，但同時加入相同濃度的黃連水萃取物和大黃水萃取物(即本發明之中草藥組合物)，其抑制MDA-MB-231細胞株移動的效果顯著優於單獨加入黃連水萃取物或大黃水萃取物之組別。

另請參照表三，為將第5A圖至第5C圖中不同比例黃連水萃取物和大黃水萃取物之中草藥組合物於乳癌細胞抑制移動分析中所計算出之協同作用指數，其中當協同作用指數小於1，表示黃連水萃取物和大黃水萃取物之間具有協同作用，而當協同作用指數小於0.5，表示黃連水萃取物和大黃水萃取物之間的協同作用具有顯著的效果。由表三的結果顯示，重量比例範圍為1：0.75至1：48的黃連水萃取物和大黃水萃取物經互相混合後，其抑制腫瘤細胞轉移的效果大於黃連水萃取物和大黃水萃取物單獨起到的作用。

觀察含有黃連乙醇萃取物和大黃乙醇萃取物之中草藥組合物對於MDA-MB-231細胞株遷移情況影響的詳細試驗步驟如下，將MDA-MB-231細胞株濃度調整為5×10⁵cells/mL，取70μl分別加入insert兩邊，待細胞貼穩後(24小時)，移除insert並拍照當作實驗前面積。再加入45μg/mL的黃連乙醇萃取物、400μg/mL的大黃乙醇萃取物和含有45μg/mL的黃連乙醇萃取物和400μg/mL的大黃乙醇萃取物之中草藥組合物，培養12小時後拍照當作實驗後面積，而於試驗中另包含未加入任何萃取物的組別作為控制組。計算兩者面積，再帶入公式I的公式便可換算MDA-MB-231細胞株之閉合率。

請參照第6A圖至第6B圖，第6A圖為本發明之中草藥組合物之抑制乳癌細胞移動測試之顯微照片圖，第6B圖為第6A圖的量化圖。結果顯示，雖單獨加入黃連乙醇萃取物或大黃乙醇萃取物，其皆有抑制MDA-MB-231細胞株移動的效果，但同時加入相同濃度的黃連乙醇萃取物和大黃乙醇萃取物(即本發明之中草藥組合物)，其抑制MDA-MB-231細胞株移動的效果顯著優於單獨加入黃連乙醇萃取物或大黃乙醇萃取物之組別。

1-2.本發明之中草藥組合物抑制膀胱癌細胞轉移之效果

觀察細胞遷移的方法係利用ibidi Culture-Insert(ibidi)製造出大小一致的細胞間隙(500±50μm)，再觀察TCCSUP細胞株以黃連水萃取物、大黃水萃取物和含有黃連水萃取物和大黃水萃取物之中草藥組合物處理後24小時的遷移情況。

觀察含有黃連水萃取物和大黃水萃取物之中草藥組合物對於TCCSUP細胞株遷移情況影響的詳細試驗步驟如下，將TCCSUP細胞株濃度調整為5×10⁵cells/mL，取70μl分別加入insert兩邊，待細胞貼穩後(24小時)，移除insert並拍照當作實驗前面積。再加入47μg/mL的黃連乙醇萃取物、220μg/mL的大黃乙醇萃取物和含有47μg/mL的黃連乙醇萃取物和220μg/mL的大黃乙醇萃取物之中草藥組合物，培養24小時後拍照當作實驗後面積，而於試驗中另包含未加入任何萃取物的組別作為控制組。計算兩者面積，再帶入公式I的公式便可換算TCCSUP細胞株之閉合率。

請參照第7A圖至第7B圖，第7A圖為本發明之中草藥組合物之抑制膀胱癌細胞移動測試之顯微照片圖，第7B圖為第7A圖的量化圖。結果顯示，單獨加入220μg/mL的大黃水萃取物，TCCSUP細胞株的閉合率與控制組相當，顯示單獨加入大黃水萃取物不具有抑制TCCSUP細胞株移動的效果。而單獨加入47μg/mL的黃連水萃取物可以降低TCCSUP細胞株的閉合率，顯示黃連水萃取物具有抑制TCCSUP細胞株移動的效果，但同時加入相同濃度的黃連水萃取物和大黃水萃取物(即本發明之中草藥組合物)，其大幅降低TCCSUP細胞株的閉合率，顯示本發明之中草藥組合物抑制TCCSUP細胞株移動的效果顯著優於單獨加入黃連水萃取物或大黃水萃取物之組別。

1-3.本發明之中草藥組合物抑制肺癌細胞轉移之效果

觀察肺癌細胞遷移的方法係利用拍照錄影的方式記錄細胞移動的軌跡長度。先將4×10⁴的TC-1細胞株種於6公分培養皿中，待TC-1細胞株貼穩後，分別加入黃連鹼與反式白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸和含有黃連鹼與反式白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸的組合物，其中黃連鹼的最終濃度為5μM，反式白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸的最終濃度為15μM，於試驗中另包含僅加入溶劑的組別作為控制組。再將培養皿置於顯微鏡下培養、觀察並錄影6小時又40分鐘後，計算細胞移動的軌跡長度，錄影條件為每20分鐘拍照1次，共拍照20次。

請參照第8A圖至第8E圖，第8A圖為控制組之 TC-1細胞株之移動軌跡圖，第8B圖為加入黃連鹼組別之TC-1細胞株之移動軌跡圖，第8C圖為加入反式白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸組別之TC-1細胞株之移動軌跡圖，第8D圖為加入本發明之中藥組合物之有效成份組別(黃連鹼和反式白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸)之TC-1細胞株之移動軌跡圖，第8E圖為第8A圖至第8D圖的統計量化圖。結果顯示，單獨加入反式白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸的組別，TC-1細胞株移動的累積距離與控制組相當，顯示單獨加入反式白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸不具有抑制TC-1細胞株移動的效果。而單獨加入黃連鹼雖可以降低TC-1細胞株移動的累積距離，但同時加入相同濃度的黃連鹼和反式白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸(即本發明之中草藥組合物之有效成分)，其降低TC-1細胞株移動的累積距離的幅度具有顯著的差異，顯示本發明之中草藥組合物抑制TC-1細胞株移動的效果顯著優於單獨加入黃連鹼或反式白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸之組別。

2.抑制侵入(invasion)分析

當惡性腫瘤準備進行轉移的時候，腫瘤細胞藉由破壞細胞外基質(extracellular matrix,ECM)進而侵入組織的基膜(basement membrane)，稱為侵入(invasion)，是藉由金屬蛋白質酶群MMPs的參與，促進腫瘤細胞侵入的能力。

本試驗利用細胞移行試驗(Transwell invasion assay)分析含有不同比例的黃連萃取物和大黃萃取物之中草藥組合物對於腫瘤細胞移行的影響效應。細胞移行試驗係利用Matrigel為細胞外基質的成分，可以模擬細胞間環境，當BD Matrigel^TM Invasion Chamber中的細胞受到Matrigel matrix中的生長因子刺激，則細胞會分泌一些基質分解酵素，將Matrigel分解，會吸引細胞的移行，若細胞移行能力強，可以在濾膜上觀察到細胞。

細胞移行試驗的步驟如下，取MDA-MB-231細胞株濃度調整為2.5×10⁵回溶於無血清之培養液，取100μL分別加入轉移盤(transwell)，並在轉移盤外部加入含有10%FBS和中草藥組合物之培養基，其中所述中草藥組合物含有不同比例的黃連水萃取物和大黃水萃取物。而於試驗中另包含未加入任何萃取物的組別作為控制組。培養後個別拍照計算細胞，並帶入下面公式II計算細胞移行率。

另再將各組所計算出之細胞移行率，利用CalcuSyn軟體計算黃連萃取物和大黃萃取物的協同作用指數(combination index,CI)，以找出黃連萃取物和大黃萃取物最佳混合比例。

請再參照第9A圖至第9F圖和表四，第9A圖至第9F圖為本發明之中草藥組合物之抑制侵入之結果圖，第9A圖為固定黃連水萃取物使用的濃度為9μg/mL，再進一步調整大黃水萃取物與其之混合比例。第9B圖為固定黃連水萃取物使用的濃度為38μg/mL，再進一步調整大黃水萃取物與其之混合比例。第9C圖之黃連水萃取物的濃度為19μg/mL，大黃水萃取物的濃度為57μg/mL。第9D圖為固定黃連水萃取物使用的濃度為75μg/mL，再進一步調整大黃水萃取物與其之混合比例。第9E圖為固定黃連水萃取物使用的濃度為150μg/mL，再進一步調整大黃水萃取物與其之混合比例。第9F圖為固定黃連水萃取物使用的濃度為300μg/mL，再進一步調整大黃水萃取物與其之混合比例。由第9A圖至第9F圖的結果顯示，雖單獨加入黃連水萃取物或大黃水萃取物，其皆有抑制MDA-MB-231細胞株侵入的效果，但同時加入相同濃度的黃連水萃取物和大黃水萃取物(即本發明之中草藥組合物)，其抑制MDA-MB-231細胞株侵入的效果顯著優於單獨加入黃連水萃取物或大黃水萃取物之組別。

另請參照表四，為將第9A圖至第9F圖中不同比例黃連水萃取物和大黃水萃取物之中草藥組合物於抑制侵入分析中所計算出之協同作用指數，其中當協同作用指數小於1，表示黃連水萃取物和大黃水萃取物之間具有協同作用，而當協同作用指數小於0.5，表示黃連水萃取物和大黃水萃取物之間的協同作用具有顯著的效果。由表四的結果顯示，重量比例範圍為1：0.1至1：101的黃連水萃取物和大黃水萃取物經互相混合後，其抑制腫瘤細胞侵入的效果大於黃連水萃取物和大黃水萃取物單獨起到的作用。

三、本發明之中草藥組合物抑制小鼠腫瘤細胞轉移

由前述試驗例可知本發明之中草藥組合物可於體外抑制腫瘤細胞轉移，於本試驗例將進一步探討本發明之中草藥組合物是否亦可抑制小鼠體內腫瘤細胞轉移。

試驗上將1×10⁵的4T1-Luc乳腺癌細胞打入BALB/c品系雌性小鼠右側第四對乳房組織中，並使腫瘤生長。4T1-Luc乳腺癌細胞帶有穩定表達生物性冷光酵素的luciferase基因，其係由中國醫藥大學附設醫院分子醫學中心所提供。乳癌的生長及轉移受到雌性激素濃度的影響，於4T1腫瘤小鼠模式中，雌激素增加會使腫瘤轉移至肺臟。待腫瘤生長兩周後，腹腔注射luciferase至小鼠體內，並以血管內超音波(intravascular ultrasound,IVIUS)觀察腫瘤生長情況，並將小鼠分為4組。第1組小鼠以管餵無菌水作為控制組，控制組共有6隻小鼠。第2組小鼠係以靜脈注射每5天給予一次6.5mg/kg的紫杉醇(Taxol)作為正對照組，正對照組共有7隻小鼠。第3組小鼠以管餵每天給予一次本發明之實施例一，第3組共有7隻小鼠。第4組小鼠以管餵每天給予一次本發明之實施例二，第4組共有7隻小鼠。其中實施例一為150μg之黃連萃取物和900μg之大黃萃取物，實施例二為300μg之黃連萃取物和900μg之大黃萃取物。所有組別的小鼠每周皆以血管內超音波觀察並拍照一次，並在第五周量化小鼠體內冷光量，以及在第六周犧牲取肺組織量化其轉移的冷光量。

請參照第10A圖至第11B圖，第10A圖至第10D圖為注射4T1-Luc乳腺癌細胞後第二周和第五周小鼠之血管超音波圖，其中第10A圖為控制組小鼠和負對照組小鼠之血管超音波圖，負對照組為未注射4T1-Luc乳腺癌細胞的小鼠。第10B圖為正對照組小鼠之血管超音波圖。第10C圖為給予實施例一之小鼠之血管超音波圖。第10D圖為給予實施例二之小鼠之血管超音波圖。第11A圖為注射4T1-Luc乳腺癌細胞後第五周小鼠體內冷光量之量化圖，第11B圖為注射4T1-Luc乳腺癌細胞後第六周小鼠肺部組織冷光量之量化圖。

由第10A圖至第11A圖可見，注射4T1-Luc乳腺癌細胞至小鼠體內，會使腫瘤漸漸於小鼠體內生長。與控制組相比，給予紫杉醇的正對照組雖可以抑制腫瘤的生長，但正對照組有1隻小鼠在第五周已死亡。與控制組相比，給予本發明之中草藥組合物的組別，不論是給予實施例一或實施例二皆具有顯著地抑制腫瘤生長的效果。此外，給予實施例一和實施例二的組別，其抑制腫瘤生長的效果亦顯著地優於正對照組。另由第11B圖的結果顯示，本發明之中草藥組合物與控制組及正對照組相比，其具有優異的抑制腫瘤轉移的效果。

綜上所述，本發明所提供的中草藥組合物具有特定比例的黃連萃取物和大黃萃取物，且其中包含黃連鹼和反式白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸等有效成分，其能使黃連萃取物和大黃萃取物產生顯著的協同作用抑制體外和體內的腫瘤細胞轉移，包含抑制腫瘤細胞的遷移和侵入，特別是抑制乳癌細胞、膀胱癌細胞和肺癌細胞的轉移，而乳癌細胞最佳地為雌激素受體陰性的乳腺癌細胞株。故本發明所揭露之中草藥組合物，可作為一種抑制腫瘤細胞轉移的藥物，且可依需要可加入其他藥學上可接受之載體，例如乳化劑、分散劑、溶劑、增稠劑、澱粉、潤滑劑等。如果需要，可適當添加甜味劑、風味劑或色素。本發明之中草藥組合物之形式可為錠劑、丸劑、粒劑、粉末、膠囊、液劑，較佳為錠劑、丸劑、粒劑、膠囊或液劑，最佳為錠劑或液劑。中草藥組合物為液劑時，包括液態賦形劑以配製成液劑。

然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

Claims

一種中草藥組合物之用途，其係用以製備抑制腫瘤細胞轉移(metastasis)之藥物，其中該中草藥組合物係由一黃連(Coptis chinensis)萃取物和一大黃(Rheum rhabarbarum)萃取物所組成，該黃連萃取物和該大黃萃取物之重量比例範圍為1：0.1至1：101，且該黃連萃取物為一黃連水萃取物或一黃連乙醇萃取物，該大黃萃取物為一大黃水萃取物或一大黃乙醇萃取物。
如申請專利範圍第1項所述之中草藥組合物之用途，其中該腫瘤細胞為乳癌細胞、肺癌細胞或膀胱癌細胞。
如申請專利範圍第1項所述之中草藥組合物之用途，其中該中草藥組合物之有效成分包含黃連鹼(coptisine)和反式白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸(trans-resveratrol-4'-O-β-D-glucuronide)。
如申請專利範圍第1項所述之中草藥組合物之用途，其中該抑制腫瘤細胞轉移之藥物為抑制腫瘤細胞遷移(migration)之藥物。
如申請專利範圍第1項所述之中草藥組合物之用途，其中該抑制腫瘤細胞轉移之藥物為抑制腫瘤細胞侵入(invasion)之藥物。