CN109985030A - 醌式查尔酮化合物在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种醌式查尔酮衍生化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述醌式查尔酮衍生化合物是2‑[1‑羟基‑3‑(4‑甲氧甲氧基苯基)‑亚‑2‑丙烯基]‑5‑甲氧甲氧基‑6,6‑二异戊烯基环己‑4‑烯‑1,3‑二酮，还提供了该化合物在肿瘤疾病治疗中作为联合用药的应用，该化合物本身具有较强的抗肿瘤能力，与干扰素等抗肿瘤药物联用时，不但可以将分化的肿瘤细胞杀灭，还可以将进入休眠的肿瘤干细胞杀灭，具有彻底清除肿瘤细胞的效果。

Description

醌式查尔酮化合物在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种醌式查尔酮化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，同时涉 及该化合物在肿瘤疾病治疗中作为联合用药的应用，以及一种抗肿瘤药物制 剂组合。
背景技术
恶性肿瘤是一种由细胞异常增殖所导致的疾病，肿瘤干细胞对肿瘤的存 活、增殖、转移及复发均有重要作用。从本质上讲，肿瘤干细胞通过自我更 新和无限增殖维持肿瘤细胞群的生命力，其运动和迁徙能力赋予了肿瘤细胞 远端侵袭转移的能力。近年来研究报道显示，临床治疗过程中肿瘤干细胞可 以长时间处于休眠状态并上调多种耐药分子表达而对杀伤肿瘤细胞的外界理 化因素不敏感。肿瘤休眠(tumor dormancy)是一种偶然发现的临床状态，包 括细胞休眠、肿瘤血管休眠和免疫状态休眠，是恶性肿瘤细胞的生物学特征 之一，是导致临床肿瘤反复发作和远端侵袭转移的重要原因之一。传统的手 术、放疗和化疗手段在取得一定治疗效果的同时，伴随有较严重临床副作用， 且存在诱导肿瘤休眠的风险，寻找有效、毒副作用小的治疗方法提高患者生 存质量已成为医学研究的重中之重。
体外采用杀伤性T细胞对癌细胞进行杀伤，理论上讲杀伤性T细胞数目 越多，杀伤效果越显著，然而本案发明人在以黑色素瘤B16-OVA细胞为例的 研究中发现，杀伤性T细胞对癌细胞的杀伤随浓度增加而增强，然而达到一 定比例后即使增加T细胞数目也不能彻底清除B16-OVA细胞。这一现象提 示着，癌细胞在临床治疗过程中存在着一群无法被特异性T细胞杀伤的休眠 细胞，而这些休眠癌细胞在肿瘤患者体内埋下了隐患，目前的临床治疗中由 于无法彻底清除休眠状态的癌细胞，而使得临床患者存在肿瘤复发或转移而 导致死亡的风险。
虽然不断有抗肿瘤药物研究结果出现，寻找更有效的药物和手段的工作 并没有停止，寻找清除休眠肿瘤细胞的方法，真正有效清除肿瘤，达到彻底 治疗临床肿瘤患者体内癌细胞的目的，是业内人士努力寻求，也是全社会期 盼的目标。
发明内容
本发明提供了一种醌式查尔酮化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，该化 合物表现出良好的抗肿瘤活性，不仅能够杀伤肿瘤，更能够辅助抗肿瘤药物 的使用，达到杀灭休眠肿瘤细胞的效果。
本发明还提供了该醌式查尔酮衍生化合物作为活性分成的药物与干扰素 或其它抗肿瘤药物联合用药在抗肿瘤治疗中的应用，以及提供一种活性成分 包括该化合物的药物与干扰素或其它抗肿瘤药的抗肿瘤制剂组合。
本发明的一个方面，提供了一类醌式查尔酮化合物，该化合物为2-[1-羟 基-3-(4-甲氧甲氧基苯基)-亚-2-丙烯基]-5-甲氧甲氧基-6,6-二异戊烯基环己-4- 烯-1,3-二酮，结构式如下：
本案发明人在前期大量探索的基础上发现，使用具有上述醌式查尔酮化 合物机构的小分子抑制剂，作为单药使用，表现出了比较显著的抗肿瘤效果， 而与临床抗肿瘤药联用，更可打破肿瘤细胞的休眠状态，相比单用抗肿瘤药 物表现出更优的抑制和杀灭癌细胞的效果，这对于彻底清除患者体内的肿瘤 细胞，治愈肿瘤疾病有着重要意义。
所以，本发明尤其提供了上述醌式查尔酮化合物在制备治疗肿瘤疾病的 药物中的应用。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物组合物，其包含有上述醌式查尔酮化合 物(HB-48)作为活性成分和药学上可接受的载体。
根据本案发明人的研究结果，上述醌式查尔酮化合物是一种小分子抑 制剂(本发明中以“HB-48”代表)作为单药或联用药，可适用的肿瘤疾 病包括临床诊断的实体瘤和白血病，例如乳腺癌、恶性黑色素瘤、肺癌、肝 癌、胰腺癌、脑瘤和白血病等。
根据本发明的方案，包含所述HB-48活性成分的治疗肿瘤疾病药物或药 物组合物可以为单位制剂，更利于临床治疗中的使用。根据肿瘤类型和患者 的病情，所述单位制剂的药物中可以包含1-5毫克作为活性成分的所述醌式 查尔酮化合物。该药物组合物的剂型可以是注射剂型或口服剂型等。
根据本发明的方案，包含所述HB-48成分的药物可以用于单药治疗，也 可以与目前的临床抗肿瘤药物联用，一个实施方案中，所述治疗肿瘤疾病药 物也可以为包括干扰素与所述HB-48化合物的制剂组合。
同样的考虑，制剂组合形式的所述治疗肿瘤疾病药物也可以为单位制剂。 可以是包含肿瘤治疗有效量的干扰素和1-5毫克作为活性成分的所述HB-48 化合物。在一个实施方案中，所述制剂组合形式的单位制剂的药物可以包含 1×107～4×107U的干扰素，或根据肿瘤类型和患者病程确定剂量。
本发明的再一方面，提供了一种抗肿瘤药物的制剂组合，其中的治疗活 性成分包括干扰素和所述的HB-48化合物。
发明人的研究发现，小分子抑制剂HB-48对于肿瘤细胞的杀灭作用和以 及联合干扰素类抗肿瘤药物进一步提升对恶性肿瘤疾病治疗效果的协同功效 方面具有意想不到的效果。
发明人的研究证明，采用本发明提供的醌式查尔酮化合物(HB-48)作 为活性成分制备的药物，可以作为单药用于肿瘤疾病治疗，达到至少能部分 杀灭肿瘤功效，可以与干扰素类临床抗肿瘤药物联用，有效杀伤休眠状态肿 瘤细胞，从而为彻底清除患者体内恶性癌细胞提供可能。
另一方面，本发明提供的醌式查尔酮衍生化合物(HB-48)作为活性成 分制备的药物，用于抗肿瘤治疗中，也可以与其它的临床抗肿瘤药物联用， 例如，与抗肿瘤疫苗联用，或者，与化疗药物联合使用等，都能够有效杀灭 休眠肿瘤细胞，从而为彻底清除患者体内恶性癌细胞提供可能。
本发明提供的HB-48是一种醌式查尔酮的结构化合物，其A环和B环上 分别联有甲氧甲氧基-OCH2OCH3(本发明表示为-OMOM)，可以按照相关 的公开内容自行合成制备，例如，可以参照中国专利申请CN210410220017.8 中公开的方法。也可以商购得到。
根据本发明的实施方案，适用于联合给药的干扰素类药物IFN可以是目 前临床使用的干扰素β和γ，即，IFN-β、IFN-γ。
为了研究和证明小分子抑制剂HB-48对休眠状态肿瘤细胞的杀伤和抑 制，发明人采用3D胶对肿瘤细胞进行培养来获得肿瘤干细胞，相较于传统 分离肿瘤干细胞的方法，3D胶培养技术获得的干细胞具有增殖能力强、耐药 性高、成瘤能力强、远端侵袭转移能力高等特征。并且，发明人使用来自人 或鼠肿瘤细胞实验和荷瘤小鼠模型的给药研究显示，小分子抑制剂HB-48不 仅具有抑制和杀灭肿瘤的效果，更能显著地降低CD8+T细胞PD-1的表达， 对于抑制Kyn介导的PD-1表达上调，增强特异性CD8+T细胞对相应肿瘤细 胞的杀伤，更具有意想不到的效果，有理由预期，HB-48联合目前临床抗肿 瘤药IFN的抗肿瘤药物制剂组合不但可以将分化的肿瘤细胞杀灭，还可以将 进入休眠的肿瘤干细胞杀灭。
如前所述，本发明提供的抗肿瘤单药和抗肿瘤药物制剂组合中，小分子 抑制剂HB-48单药以及干扰素(IFN)均可以为单位制剂。所述单位制剂是 指满足一次给药所需有效成分的制剂，如一单位(针)针剂，也可以是一片 (粒)或丸等作为单次用药即可满足剂量的制剂。给予患者一次施用所需的 药物的量可以方便地通过计算患者的体重和该患者一次用药所需单位体重剂 量的乘积得到。在制备药物的过程中，一般认为成人体重为50-70kg，最初 可以通过实验动物与人的单位体重剂量之间的等效剂量换算关系来确定用药量。例如，可以根据FDA、SFDA等药品管理机构提出的指导意见，也可参 考(黄继汉等，“药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算”，《中 国临床药理学与治疗学》,2004Sep；9(9):1069-1072)来确定。在本发明的 实施方式中，可以使用按照人和小鼠的体表面积折算系数0.0026来换算人和 小鼠的剂量。具体确定方式属于本领域人员能力范畴。
在本发明的实施方案中，针对体重为20g的小鼠，HB-48以5mg/kg小鼠 体重的剂量施用，IFN-β则是以5×104-1×105U的量施用。例如，将HB-48用 水或药物溶剂配制为溶液，按照设计剂量给小鼠灌服或实施瘤内注射，而 IFN-β一般是瘤内注射给药。
更进一步的，根据针对小鼠的实验结果，转换为针对正常体重范围的人 (例如50-70kg体重)给药设计，HB-48单位制剂药物中包含1-5mg活性成 分，IFN单位制剂中包含1×107～4×107U的IFN。配成制剂组合时，HB-48和 干扰素的含量也分别满足上述剂量。
本发明提供的抗肿瘤药物和药物制剂组合的给药方式为：对有治疗需要 的患肿瘤个体(可以是人或哺乳动物)施用包含所述HB-48的药物或所述抗 肿瘤药物制剂组合，例如，单药治疗时口服(灌胃)、注射(静脉注射、腹 腔内或瘤内注射)HB-48药物；联合用药时，静脉、腹腔内或者瘤内注射IFN， 联合口服(灌胃)或注射(腹腔内或瘤内注射)HB-48药物。
本发明提供的含有HB-48和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物，作为活 性成份的HB-48的含量可以为例如0.1-95％重量。
本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的 时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或 辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。
本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径 可为体内给药或局部给药，例如肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、 口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等；可为注射给药，包括静脉注射、肌肉注射、 皮下注射、皮内注射和穴位注射等；还可以是液体剂型、固体剂型，如液体 剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型；其他剂型 例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗 粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。
本发明药物组合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、 靶向制剂及各种微粒给药系统。
例如为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载 体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳 糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、 硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、 糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、 紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、 海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨 糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂， 例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、 十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、 硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
例如为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载 体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可 可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、单硬脂酸甘油脂、高岭土、滑石粉等； 粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等； 崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、 乙基纤维素等。
例如为了将单位给药剂型制成胶囊，将有效成分本发明化合物与上述的 各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可 将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可 装入硬胶囊中或制成注射剂应用。
例如，将本发明化合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳 剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效 学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散 剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬 脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂、肪酸酯等。另外，为了制备 等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外， 还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。
本发明还提供了一种治疗或预防肿瘤的方法，包括给予患有肿瘤的个体 或具有肿瘤发生趋势的个体(可以是人或哺乳动物)施用所述抗肿瘤药物或 抗肿瘤药物制剂组合的过程。例如，单药治疗时，给予口服或注射(静脉注 射、腹腔内或瘤内注射)HB-48药物；联合用药时，给予注射IFN(静脉、 腹腔或瘤内注射)，联合口服(灌胃)或注射(静脉注射、腹腔或瘤内注射) 给药HB-48。
根据本发明的方案，所述醌式查尔酮化合物药物和干扰素的治疗给药剂 量均可以根据需要控制，推荐的，可以制备不同剂量的单位制剂，方便对不 同阶段的肿瘤患者的给药。
采用HB-48联合干扰素给药时，给药顺序没有特别要求和限制，例如， 可以同时给药、或二种药顺序施用，二种药之间一般不建议太大的给药间隔， 例如，可以是30分钟到60分钟内完成给药，也可以1-12小时内，或者1-2 天内完成给药，也可以根据医嘱将每种药的按照各自的给药程序或周期施用。
干扰素(例如IFN-β或者IFN-γ)是一种由成纤维细胞分泌产生的细胞 因子，具有抗病毒、调节固有免疫反应及抗肿瘤特性，是一种常见的抗肿瘤 生物因子。在本申请人研究中发现，干扰素在临床治疗的应用中虽然具有比 较好的抗肿瘤效果，但仍有一定量治疗后的患者会出现肿瘤复发乃至转移的 情况，原因在于单独使用IFN-β或者IFN-γ只能杀死部分处于分化状态的肿 瘤细胞，未被杀死的肿瘤细胞具有干细胞特性，并进入休眠状态，正是这些 休眠肿瘤细胞的存在，使得临床肿瘤患者在一段时间(若干年)后又会面临 肿瘤复发或转移的风险。本申请人经过大量实验研究发现，所述醌式查尔酮 化合物作为活性成分的药物不仅自身能杀死肿瘤细胞，与IFN-β或者IFN-γ 联合给药，在杀死已分化的肿瘤细胞的同时，更能够实现对休眠肿瘤细胞杀 伤的目的，而且在显著增效的同时也实现降低单药的使用剂量。
本发明提供的抗肿瘤药物制剂组合，还可以为活性成分是上述醌式查尔 酮衍生化合物和临床抗肿瘤药物的联合，例如临床上使用的抗肿瘤疫苗、各 类化疗药物，患病个体的治疗中联合给予本发明的醌式查尔酮衍生化合物为 活性成分的药物，该药物的剂型、给药剂量及给药途径和方式，均参照前述。
综上，本发明的方案至少具有以下效果：
1、本申请利用所述醌式查尔酮化合物(HB-48)制备的抗肿瘤药物制剂 单独使用可以部分杀伤肿瘤细胞，而与干扰素β或者γ联合使用，或与其它 临床抗肿瘤药物联用，不但可以杀灭分化的肿瘤细胞，而且可以杀伤进入休 眠的肿瘤细胞，具有彻底清除肿瘤细胞的效果。
2、本发明的抗肿瘤药物制剂组合不仅可以通过增强全身免疫反应，实 现杀灭肿瘤的效果，也可以不通过调节全身免疫反应而对肿瘤产生直接杀伤 作用，因此具有安全性高、无毒副作用的优点。
附图说明
图1显示了HB-48诱导3D培养下的实体瘤和白血病细胞凋亡。
图中A-F分别显示了DMF、HB-48诱导3D培养A375、A549、HepG2、MCF-7、PANC-1及HL-60细胞凋亡的效果。
图2显示HB-48单用对3D培养下的实体瘤和白血病细胞克隆大小的影 响；图中，
A显示采用不同浓度HB-48处理3D培养条件下的人恶性黑色素瘤细胞 A375的克隆大小；
B显示采用不同浓度HB-48处理3D培养条件下的鼠黑色素瘤细胞B16 克隆大小；
C显示采用不同浓度HB-48处理3D培养条件下的人恶性黑色素瘤细胞 MP-1的克隆大小；
D采用不同浓度HB-48处理3D培养条件下的人乳腺癌细胞MCF-7的克 隆大小；
E显示采用不同浓度HB-48处理3D培养条件下的人白血病细胞HL-60 克隆的大小；
F显示采用不同浓度HB-48处理3D培养条件下的人白血病细胞K562克 隆的大小；
G显示采用不同浓度HB-48处理3D培养条件下的人白血病细胞ALL-1 的克隆大小。
图3显示HB-48单用对显示在3D培养下的实体瘤和白血病细胞克隆数 目的影响。图中：
A显示了采用不同浓度HB-48处理在3D培养条件下的人恶性黑色素瘤 细胞A375克隆数目；
B显示了不同浓度HB-48处理3D培养条件下的鼠黑色素瘤细胞B16克 隆数目；
C显示了不同浓度HB-48处理3D培养条件下人黑色素瘤细胞MP-1克隆 数目；
D显示了采用不同浓度HB-48处理在3D培养条件下的人乳腺癌细胞 MCF-7克隆数目；
E显示了不同浓度HB-48处理3D培养条件下的人白血病细胞HL-60克 隆数目；
F显示了不同浓度HB-48处理3D培养条件下的人白血病细胞K562克隆 数目；
G显示了采用不同浓度HB-48处理在3D培养条件下的人白血病细胞 ALL-1克隆数目。
图4显示HB-48对实体瘤和白血病体内生长的抑制。
图中A-F分别显示了采用DMF、HB-48对A375、A549、HepG2、MCF-7、 PANC-1及HL-60荷瘤小鼠的治疗效果。
图5显示HB-48和IFNβ联用对在3D培养条件下的实体瘤和白血病细 胞克隆大小的影响。图中：
A显示采用HB-48与IFNβ联用处理3D培养条件下的人恶性黑色素瘤细 胞A375克隆大小，并采用DMF与IFNβ联用作为阳性对照；
B显示采用HB-48与IFNβ联用处理3D培养条件下的鼠黑色素瘤细胞 B16克隆大小，并采用DMF与IFNβ联用作为阳性对照；
C显示采用HB-48与IFNβ联用处理3D培养条件下，人恶性黑色素瘤细 胞MP-1克隆大小，并采用DMF与IFNβ联用作为阳性对照；
D显示采用不同浓度HB-48与IFNβ联用处理3D培养条件下的人乳腺癌 细胞MCF-7克隆大小，并采用DMF与IFNβ联用作为阳性对照；
E显示采用不同浓度HB-48与IFNβ联用处理3D培养条件下，人白血病 细胞HL-60克隆大小；
F显示采用不同浓度HB-48与IFNβ联用处理3D培养条件下，人白血病 细胞K562克隆大小；
G显示采用不同浓度HB-48和IFNβ联用处理3D培养条件下，人白血病 细胞ALL-1克隆大小。
图6为HB-48与IFNβ联用对在3D培养条件下的实体瘤和白血病细胞 克隆数目的影响。图中：
A显示采用HB-48与IFNβ联用处理3D培养条件下的人恶性黑色素瘤细 胞A375克隆数目，并采用DMF与IFNβ联用作为阳性对照；
B显示采用HB-48与IFNβ联用处理3D培养条件下的鼠黑色素瘤细胞 B16克隆数目，并采用DMF与IFNβ联用作为阳性对照；
C显示采用HB-48和IFNβ联用处理3D培养条件下的人恶性黑色素瘤细 胞MP-1克隆数目，并采用DMF与IFNβ联用作为阳性对照；
D显示采用HB-48与IFNβ联用处理3D培养条件下的人乳腺癌细胞 MCF-7克隆数目，并采用DMF与IFNβ联用作为阳性对照；
E显示采用HB-48与IFNβ联用处理3D培养条件下的人白血病细胞 HL-60克隆数目，并采用DMF与IFNβ联用作为阳性对照；
F显示采用HB-48与IFNβ联用处理3D培养条件下的人白血病细胞K562 克隆数目，并采用DMF与IFNβ联用作为阳性对照；
G显示采用HB-48与IFNβ联用处理3D培养条件下的人白血病细胞 ALL-1克隆数目，并采用DMF与IFNβ联用作为阳性对照进行评估。
图7显示了IFNβ与HB-48联用分别对在平板和3D培养条件下的实体 瘤和白血病细胞凋亡的影响。图中：
A显示采用IFNβ与HB-48联用分别处理平板和3D培养条件下的鼠恶性 黑色素瘤细胞B16，检测其细胞凋亡百分比；
B显示采用IFNβ与HB-48联用分别处理平板和3D培养条件下的人恶性 黑色素瘤细胞A375，检测其细胞凋亡百分比；
C显示采用IFNβ与HB-48联用分别处理平板和3D培养条件下的人恶性 黑色素瘤细胞MP-1，检测其细胞凋亡百分比；
D显示采用IFNβ与HB-48联用分别处理平板和3D培养条件下的人乳腺 癌细胞MCF-7，检测其细胞凋亡百分比；
E显示采用IFNβ与HB-48联用分别处理平板和3D培养条件下的人白血 病K562细胞，检测其细胞凋亡百分比；
F显示采用IFNβ与HB-48联用分别处理平板和3D培养条件下的人白血 病HL-60细胞，检测其细胞凋亡百分比；
G显示采用IFNβ与HB-48联用分别处理平板和3D培养条件下的人白血 病ALL-1细胞，检测其细胞凋亡百分比。
图8为HB-48与IFNβ联用对实体瘤荷瘤小鼠生长的影响。图中：
A显示联合IFN-β与DMF/HB-48对抑制小鼠黑色素瘤B16(C57BL/C小 鼠)生长的影响；
B显示联合IFN-β与DMF/HB-48延长荷瘤小鼠生存期的影响；
C显示联合IFN-β与DMF/HB-48对抑制小鼠黑色素瘤B16(NOD-SCID 小鼠模型)生长的影响；
D显示联合IFN-β与DMF/HB-48对延长NOD-SCID小鼠生存期的影响；
E显示联合IFN-β与HB-48对抑制人黑色素瘤A375(NOD-SCID小鼠模 型)生长的影响；
F显示联合IFN-β与HB-48减少人黑色素瘤A375瘤重的效果；
G显示联合IFN-β与DMF/HB-48抑制人乳腺癌细胞MCF-7(NOD-SCID 小鼠模型)生长的影响；
H显示联合IFN-β与DMF/HB-48延长NOD-SCID小鼠生存期的影响。
图9显示HB-48对体外培养的小鼠CD8+T细胞PD-1表达的影响。
图中：A为小分子抑制剂HB-48和DMF对体外培养激活的小鼠 CD8+T细胞PD-1表达的影响(纵标“count”表示数量)；B为小分子 抑制剂HB-48或DMF对特异性OT-1CD8+T细胞PD-1表达的影响。
图10为HB-48联合特异性CD8+T细胞过继对荷瘤小鼠肿瘤生长的 影响。
图11为HB-48对人外周血CD8+T细胞PD-1表达的影响。图中：
A显示HB-48和DMF对未激活的人外周血CD8+T细胞PD-1表达的 影响(纵标“count”表示数量，横标“Patients”表示病人样本)；
B显示在Kyn存在的情况下，HB-48和DMF对激活的人外周血CD8+ T细胞PD-1表达的影响(纵标“count”表示数量，横标“Patients”表 示病人样本)；
C显示在Kyn存在的情况下，HB-48和DMF对激活的人外周血CD8+ T细胞Kyn转运子PAT4表达的影响。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步阐述本发明方案和实施效果，但不能认为是 对本发明可实施范围的限定。
下述实验及实施例中使用的肿瘤细胞、药物及实验动物：
OVA-B16肿瘤细胞系、B16小鼠黑色素瘤细胞系(也称B16肿瘤细胞系)、 MCF-7人乳腺癌细胞系，A375人黑色素瘤细胞系、K562人白血病细胞系、 A549人肺腺癌细胞系、HepG2人肝癌细胞系、PANC-1人胰腺癌细胞系、HL-60 人白血病细胞系均可从美国ATCC中心或北京协和医学院基础研究院细胞中 心购买。
MP-1人黑色素瘤细胞是申请人从收集的临床恶性黑色素瘤患者切除组 织在无菌条件下进行处理培养而培养的可稳定传代的细胞。
ALL-1人白血病细胞是申请人从收集的临床白血病患者骨髓血在无菌条 件下在3D培养条件下获得的细胞。
荧光素酶标记的HL-60细胞为HL-60细胞转染荧光素酶报告基因质粒后 筛选出的稳定表达该荧光素酶基因的单克隆细胞。
实验动物：健康雌性C57BL/C小鼠、雌性NOD-SCID小鼠、OT-1(转 基因)小鼠，4-6周龄，购自中国医学科学院协和医学院实验动物中心，且该 动物实验获得中国医学科学院动物伦理委员会批准；
DMF(二甲基甲酰胺的简称)，购自美国SIGMA公司，根据实验设计 要求配制成相应浓度或剂量的溶液剂；
人源或鼠源IFN-β，细胞因子购自PeproTech公司，根据实验设计要求配 制成相应浓度或剂量的溶液剂；
HB-48，来自于中国医学科学院药物所合成产物，或者参照中国专利申 请CN210410220017.8实施例4公开的方法自行合成制备，并根据实验设计要 求配制成相应浓度或剂量的溶液剂。
3D纤维蛋白软凝胶(3D胶)、RPMI-1640培养基、PBS均可商购获得。
以下实施例得到数据的统计学结果在对应附图中均有相应显示，图中标 记“*”、“**”和“***”分别代表该结果相比于对照组结果的统计学差异 P<0.05、P<0.01和P<0.001。
第一部分：小分子抑制剂HB-48单用对实体瘤和白血病的作用检测
实施例1：本发明的HB-48单药使用可有效诱导3D培养条件下的实体 瘤和白血病细胞凋亡。
1、实验步骤
采用3D胶技术培养A375、A549、HepG2、MCF-7、PANC-1和HL-60 细胞，细胞数约10000左右/孔，2天后观察细胞状态，良好的情况下，每种 培养细胞均分别依以下组别进行加药：
对照组(control)：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如RPMI-1640培 养基)；
实验组：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如RPMI-1640培养基)中加 入10μmol/ml HB-48，等量的DMF作为阳性对照。
加药时先将药物与培养基均匀混合再加入到各组实验细胞中，加药开始 记为第0天，96小时(第4天)对3D胶中的细胞进行凋亡检测。
2、实验结果
各组别的统计结果见图1，结果显示，所有实验组(包括阳性对照DMF) 的药物均可均不同程度诱导实体瘤及白血病细胞凋亡，与对照组相比具有显 著差异，其中，HB-48诱导实体瘤及白血病细胞凋亡的效果更加突出，且显 著优于阳性对照DMF。
实施例2：HB-48作为单药使用可以有效抑制3D培养条件下的实体瘤和 白血病细胞克隆生长。
1、实验步骤
采用3D胶技术培养A375、B16、MP-1、MCF-7、HL-60、K562和ALL-1 细胞，细胞数控制在3000左右/孔，2天后观察细胞状态，良好的情况下，每 种培养细胞均分别依以下组别进行加药：
对照组1(Medium)：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如RPMI-1640 培养基)；
实验组2(HB-48)：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如RPMI-1640 培养基)中加入不同浓度的(1μmol/ml、5μmol/ml、10μmol/ml、20μmol/ml、 50μmol/ml)HB-48；
加药时先将药物与培养基均匀混合再加入到各组实验细胞中，加药开始 记为第0天，48小时(第2天)和96小时(第4天)分别对3D胶中的细胞 克隆大小进行拍照，采用ImageJ软件对克隆大小进行分析，以第2天对照组 克隆大小为对照计算不同组中细胞克隆大小相对值，并进行统计分析。
2、实验结果
各组别的统计结果显示于图2。
结合图2中可以看出，HB-48单药可以有效抑制实体瘤和白血病细胞克 隆大小，且呈浓度依赖性。
实施例3：HB-48单用可以有效减少在3D培养条件下的实体瘤和白血病 细胞克隆数目。
1.实验步骤：
采用3D胶技术培养A375、B16、MP-1、MCF-7、HL-60、K562和ALL-1 细胞，细胞数控制在3000左右/孔，2天后观察细胞状态，良好的情况下，将 每种培养细胞都分为对照组和实验组，依以下组别进行加药：
对照组1(Medium)：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如RPMI-1640 培养基)；
实验组2(HB-48)：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如RPMI-1640 培养基)中加入不同浓度的(1μmol/ml、5μmol/ml、10μmol/ml、20μmol/ml、 50μmol/ml)HB-48；
加药时先将药物与培养基均匀混合再加入到各组实验细胞中，加药开始 记为第0天，48小时(第2天)和96小时(第4天)分别在显微镜下统计 细胞克隆数目，并进行统计分析。
2、实验结果
各组别实验的细胞克隆数目统计结果显示于图3。
可以看出，HB-48单药可以有效减少实体瘤和白血病细胞克隆数目，且 呈浓度依赖性。
实施例4：HB-48对实体瘤和白血病体内生长的抑制。
1.实验方法
(1)A375荷瘤小鼠的构建：NON-SCID小鼠皮下接种1×105个A375 细胞，待瘤体成长至5mm x 5mm时，将荷瘤小鼠等数量随机分成3组，每组 7只，给予荷瘤小鼠以下不同治疗方式：
对照组(control)：灌胃给与PBS；
阳性对照组：灌胃给予DMF(10mg/kg体重)，每两天1次。
实验组：灌胃给予HB-48，10mg/kg体重，每两天给药一次；
第21天将小鼠处死后，剥离皮下肿瘤，称取并统计各组瘤重。
(2)A549荷瘤小鼠的构建：NON-SCID小鼠皮下接种1×105个A549 细胞，待瘤体成长至5mm x 5mm时，将荷瘤小鼠等数量随机分成3组，每组 7只，给予荷瘤小鼠以下不同治疗方式：
对照组(control)：灌胃给与PBS；
阳性对照组：灌胃给与DMF(10mg/kg体重)，每两天1次。
实验组：灌胃给予HB-48，10mg/kg体重，每两天给药一次；
第28天将鼠处死后，剥离皮下肿瘤，称取并统计各组瘤重。
(3)HepG2荷瘤小鼠的构建：NON-SCID小鼠皮下接种2×106个HepG2 细胞，待瘤体成长至5mm x 5mm时，将荷瘤小鼠等数量随机分成3组，每组 7只，给予荷瘤小鼠以下不同治疗方式：
对照组(control)：灌胃给与PBS；
阳性对照组：灌胃给与DMF(10mg/kg体重)，每两天1次。
实验组：灌胃给予HB-48，10mg/kg体重，每两天给药一次；
第42天将鼠处死后，剥离皮下肿瘤，称取并统计各组瘤重。
(4)MCF-7荷瘤小鼠的构建：NON-SCID小鼠皮下接种2×106个MCF-7 细胞，待瘤体成长至5mm x 5mm时，将荷瘤小鼠等数量随机分成3组，每组 7只，给予荷瘤小鼠以下不同治疗方式：
对照组(control)：灌胃给与PBS；
阳性对照组：灌胃给与DMF(10mg/kg体重)，每两天1次。
实验组：灌胃给予HB-48，10mg/kg体重，每两天给药一次；
第56天将鼠处死后，剥离皮下肿瘤，称取并统计各组瘤重。
(5)PANC-1荷瘤小鼠的构建：NON-SCID小鼠皮下接种5×106个 PANC-1细胞，待瘤体成长至3mm x 3mm时，将荷瘤小鼠等数量随机分成3 组，每组7只，给予荷瘤小鼠以下不同治疗方式：
对照组(control)：灌胃给与PBS；
阳性对照组：灌胃给与DMF(10mg/kg体重)，每两天1次。
实验组：灌胃给予HB-48，10mg/kg体重，每两天给药一次；
第56天将鼠处死后，剥离皮下肿瘤，称取并统计各组瘤重。
(6)HL-60白血病小鼠模型的构建：NON-SCID小鼠尾静脉注射1×106个荧光素酶标记的HL-60细胞，7天后，将小鼠等数量随机分成3组，每组7 只，给与小鼠以下不同治疗方式：
对照组(control)：灌胃给予PBS；
阳性对照组：灌胃给与DMF(10mg/kg体重)，每两天1次。
实验组：灌胃给予HB-48，10mg/kg体重，每两天给药一次；
第42天，将小鼠麻醉后利用小动物活体成像系统检测并统计白血病细胞 体内分布情况。
2.实验结果
各组肿瘤生长情况的统计结果显示于图4。
可以看出，同对照组相比，HB-48单药和DMF单药均可不同程度延缓 A375、A549、HepG2、MCF-7、PANC-1及HL-60的生长，但相比DMF，
HB-48效果更加显著，统计结果均具有显著性差异。
可以证明，本发明的HB-48对实体瘤及白血病细胞体内生长具有显著的 抑制作用。
第二部分：小分子抑制剂HB-48和IFNβ对实体瘤和白血病的作用检测
实施例5：HB-48和IFNβ联用可以有效抑制3D培养条件下的实体瘤和 白血病细胞克隆生长。
1、实验步骤
采用3D胶技术培养A375、B16、MP-1、MCF-7、HL-60、K562和ALL-1 细胞，细胞数控制在3000左右/孔，2天后观察细胞状态，良好的情况下，将 每种培养细胞都分成对照组和实验组，并依以下组别进行加药：
对照组1(control)：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如RPMI-1640 培养基)；
对照组2(IFNβ)：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如RPMI-1640 培养基)中加入6ng/ml鼠源或10ng/ml人源IFNβ；
对照组3(IFNβ+DMF)：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如RPMI-1640 培养基)中加入6ng/ml鼠源或10ng/mg人源IFNβ和20μmol/ml DMF；
实验组4(HB-48)：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如RPMI-1640 培养基)中加入10μmol/ml HB-48；
实验组5(IFNβ+HB-48)：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如RPMI-1640培养基)中加入6ng/ml鼠源或10ng/ml人源IFNβ和10μmol/ml HB-48；
实验组6(IFNβ+HB-48)：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如 RPMI-1640培养基)中加入6ng/ml鼠源或10ng/ml人源IFNβ和不同浓度 的(1μmol/ml，3μmol/ml、5μmol/ml、6μmol/ml、10μmol/ml、20μmol/ml) HB-48；
加药时先将药物与培养基均匀混合再加入到各组实验细胞中，加药开始 记为第0天，在培养第2天(48小时)和第4天(96小时)拍照，采用Image J软件对克隆大小进行分析，以第2天对照组克隆大小为对照计算不同时间点 不同组中克隆大小相对值，并进行统计分析。
注：实验中使用“鼠用IFNβ”或“人用IFNβ”根据所培育肿瘤细胞 的属性确定，以下实施例均相同。
2、实验结果
各组别实验的相对克隆大小分析结果、IFNβ+HB-48实验组中不同浓度 HB-48对细胞克隆大小的影响结果统计显示于图5中，A-D为三个对照组和 实验组4、5的结果统计，E-G是实验组6的结果统计。
从图5可以看出，小分子抑制剂DMF和HB-48与IFNβ联用均表现出 较好的抑制肿瘤作用，但实验组IFNβ与HB-48联用(IFNβ+HB-48)更可 以有效抑制实体瘤和白血病细胞克隆大小，且相对HB-48呈浓度依赖性，统 计结果具有显著性差异。
实施例6：HB-48和IFNβ联用可以有效抑制在3D培养条件下的实体瘤 和白血病细胞克隆数目。
1、实验步骤
采用3D胶技术培养A375、B16、MP-1、MCF-7、HL-60、K562和ALL-1 细胞，细胞数控制在3000左右/孔，2天后观察细胞状态，良好的情况下，将 每种培养细胞都分成对照组和实验组，并依以下组别进行加药：
对照组1(Control)：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如RPMI-1640 培养基)；
对照组2(IFNβ)：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如RPMI-1640 培养基)中加入6ng/ml鼠源或10ng/ml人源IFNβ；
对照组3(IFNβ+DMF)：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如RPMI-1640 培养基)中加入6ng/ml鼠源或10ng/ml人源IFNβ和20μmol/mlDMF；
实验组4(HB-48)：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如RPMI-1640 培养基)中加入10μmol/mlHB-48；
实验组5(IFNβ+HB-48)：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如 RPMI-1640培养基)中加入6ng/ml鼠源或10ng/ml人源IFNβ和10μmol/ml HB-48；
加药时需先将药物与培养基均匀混合再加入到各组实验细胞中，加药开 始记为第0天，第4天在显微镜下统计细胞克隆数目。
2、实验结果
各组别实验的细胞克隆数目统计结果示于图6。图6显示了对应的统计 结果，针对每种肿瘤细胞的统计图中，从左至右的柱形图依次代表：Control 组、IFNβ组、IFNβ+DMF组、HB-48组和IFNβ+HB-48组。
从图6可以看出，实验组IFNβ与HB-48联用可以有效减少实体瘤和白 血病细胞克隆数目，且效果显著优于IFNβ与DMF联用，具有显著性差异。
实施例7：IFN-β与HB-48联用显著诱导3D培养条件下的实体瘤细胞 和白血病细胞凋亡，然而对平板培养细胞却无明显作用。
1、实验步骤
将实体瘤细胞A375、B16，和白血病细胞MP-1、MCF-7、HL-60、K562 和ALL-1细胞分别进行3D胶培养(24孔板，细胞密度为8000/孔)和平板 培养(6孔板细胞密度为3万/孔)，第二天观察细胞状态，细胞存活状态良 好的情况下，平板和3D培养细胞分别按以下分组进行加药处理：
对照组1(PBS)：普通培养基和药物溶剂；
对照组2(IFNβ)：普通培养基加入6ng鼠用或10ng人用IFNβ；
实验组3(HB-48)：普通培养基加入10μM的HB-48；
实验组4(IFNβ+DMF)：普通培养基加入6ng/ml鼠用或10ng/ml人用 IFNβ和20μmol/ml的DMF；
实验组5(IFNβ+HB-48)：普通培养基加入6ng/ml鼠用或10ng/ml人 用IFNβ和10μmol/ml的HB-48；
加药时需先将药物与培养基均匀混合再加入到各组实验细胞中，培养48 小时，采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。
2.实验结果：
将各组平板(Flask)培养和3D胶培养条件下的细胞凋亡率结果以对照 方式显示于图7中A-G。
可以看到，平板培养条件下，IFNβ单用或与HB-48联用均对实体瘤细 胞和白血病细胞无显著杀伤作用；3D胶培养条件下，IFNβ和HB-48单用对 实体瘤细胞杀伤效果有一定提升，但显著性不突出；但IFNβ与小分子抑制 剂联用相比使用单药可显著提高对实体瘤细胞的杀伤能力，而IFNβ与HB-48 联用时对实体肿瘤的杀伤效果更是显著高于IFNβ单用、HB-48单用和IFN β与DMF联用。
实施例8：联合应用IFN-β和HB-48能抑制实体瘤荷瘤小鼠肿瘤生长， 延长荷瘤小鼠生存期。
1、联合应用IFN-β和HB-48对C57BL/C小鼠肿瘤的治疗实验
1)实验步骤
构建荷瘤小鼠：B16黑色素瘤细胞接种于4-6周龄C57BL/C小鼠(接种 量为1×105个细胞)，将35只小鼠随机分为5组，小鼠体重为20g左右，7 天左右即可观察到肿瘤生成；待瘤体成长至5mm x 5mm时，依组别给予荷瘤 小鼠以下不同治疗方式：
对照组1(PBS)：仅瘤内注射PBS；
实验组2(IFN-β)：IFN-β单独处理荷瘤小鼠，每只小鼠瘤内注射1×105U 的IFN-β，每两天注射一次，共注射10天；
实验组3(HB-48)：HB-48单独处理荷瘤小鼠，HB-48用量为每两天按 照5mg/kg小鼠体重给药，方式为瘤内注射，共注射10天；
实验组4(IFN-β+HB-48)：小鼠分别给予IFN-β和HB-48，IFN-β给 药方式为：瘤内给药1×105U的IFN-β，每两天瘤内注射一次，共注射10天； HB-48给药方式为：每两天瘤内注射给药一次(药量为5mg/kg小鼠体重)， 共给药10天；IFN-β和HB-48的给药顺序没有限制，每次可同时给药或依序 连续给药；
实验组5(IFN-β+DMF)：小鼠分别给予IFN-β和DMF(即联合应用 IFN-β和DMF)，IFN-β给药方式为：瘤内给药1×105U的IFN-β，每两天瘤 内注射一次，共注射10天；DMF给药方式为：每两天瘤内注射给药一次(药 量为5mg/kg小鼠体重)，共给药10天；IFN-β和DMF的给药顺序没有限制， 每次可同时给药或依序连续给药，DMF的给药量也与HB-48相同。
给药实验开始每日测量瘤体大小变化并记录小鼠死亡日期。
2)实验结果
各组小鼠的瘤体变化统计结果和小鼠生存情况见图8中A、B。
可以看到，同对照组相比，虽然实验组的治疗在抑制黑色素瘤生长具有 较明显的优势，但IFN-β联用DMF和IFN-β联用HB-48则表现出可更显著 抑制黑色素瘤肿瘤生长(见图A)，和更显著延长C57BL/C小鼠生存期(见 图B)，均具有统计学意义P<0.001；而对比这二组联和用药实验组情况，在 抑制肿瘤生长和延长荷瘤小鼠生存期方面，IFN-β联用HB-48尤其表现出更 突出的优势，结果也均具有统计学意义P<0.001。
2、联合应用IFN-β和HB-48对NOD-SCID小鼠肿瘤的治疗实验
1)实验步骤
构建荷瘤NOD-SCID小鼠：为证实本发明使用的HB-48抑制剂对肿瘤的 抑制作用是否与免疫系统有关，采用6周龄NOD-SCID小鼠35只，每只小 鼠皮下接种2×105B16小鼠黑色素瘤细胞，10天左右即可观察到肿瘤形成； 当肿瘤成长至5mm x 5mm左右时，将小鼠随机分为5组，以下述不同方式进 行治疗：
对照组1(PBS)：仅瘤内注射PBS；
实验组2(IFN-β)：IFN-β单独处理荷瘤小鼠，每只小鼠瘤内注射1×105U 的IFN-β，每两天注射一次，共注射10天；
实验组3(HB-48)：HB-48单独处理荷瘤小鼠，给每只小鼠瘤内注射， HB-48用量为5mg/kg小鼠体重，每两天注射一次，共注射10天；
实验组4(IFN-β+HB-48)：每只小鼠分别给予IFN-β和HB-48(即联 合应用IFN-β和HB-48)，IFN-β给药方式为：瘤内给药1×105U的IFN-β， 每两天瘤内注射一次，共注射10天；HB-48给药方式为：每两天瘤内注射给 药HB-48(药量为5mg/kg小鼠体重)，共给药10天，IFN-β和HB-48的给 药顺序没有限制，每次可同时给药或依序连续给药；
实验组5(IFN-β+DMF)：每只小鼠分别给予IFN-β和DMF(即联合 应用IFN-β和DMF)，给药方式同实验组4，DMF的给药量也与HB-48相同。
给药实验开始每日测量瘤体大小变化并记录小鼠死亡日期。
2)实验结果
各组小鼠的瘤体变化统计结果和小鼠生存情况见下图8中C、D。
可以看到，给药期间，同对照组相比，虽然实验组的治疗在抑制黑色素 瘤生长具有较明显的优势，但联合应用IFN-β+HB-48抑制剂和IFN-β+DMF 实验组则表现出可更显著抑制黑色素肿瘤生长，相较其它对照组和实验组的 结果优势具有显著差异，而HB-48联用IFN-β效果更显著优于DMF联用IFN- β组(见图C)，均具有统计学意义P<0.001；生存周期数据显示，联合用药 实验组IFN-β+HB-48和IFN-β+DMF可显著延长NOD-SCID荷瘤小鼠生存期，具有显著性差异，而HB-48联用IFN-β效果更显著优于DMF联用IFN- β组(图D)，结果也均具有统计学意义P<0.001。
此外，我们还将人黑色素瘤细胞A375(5×105)和人乳腺癌细胞MCF-7 (1×106)注射到NOD-SCID小鼠皮下构建成荷瘤小鼠，10天后，观察到肿 瘤形成，并进行实验，荷瘤小鼠的分组以及各组给药实验均参照前实验1和 实验2的说明。
肿瘤抑制效果和荷瘤小鼠生存期统计结果示于图8中E-H：
对实验结果的分析可以得出相同的结论，即，各实验组相比较，IFN-β 和HB-48抑制剂联合用药可显著抑制肿瘤生长，显著延长NOD-SCID荷瘤小 鼠的生存期(见图8的E-H)，结果均具有统计学意义P<0.001。
以上各组结果综合分析可以说明HB-48抑制剂的抗肿瘤也可以不通过调 节全身免疫反应而对肿瘤产生直接杀伤作用。
第三部分：小分子抑制剂HB-48对CD8+T细胞PD-1表达的影响
实施例9：HB-48能降低小鼠CD8+T细胞PD-1的表达，增强T细胞的 杀伤功能。
1、检测HB-48对激活的小鼠CD8+T细胞PD-1表达的影响
1)实验步骤
磁珠分选获得小鼠脾脏CD8+T细胞，种于U型底96孔板(10万/孔)， 同时加入抗CD3/CD28磁珠激活T细胞，培养基为RPMI-1640加10ng/mL小 鼠IL-2和50nMβ巯基乙醇。激活的T细胞按以下分组加药：
对照组1(PBS)：普通培养基中加PBS；
实验组2(Kyn)：普通培养基中加入Kyn 200μmol/ml；
实验组3(Kyn/DMF)：普通培养基中同时加入Kyn 200μmol/ml和DMF 10 μmol/ml；
实验组4(Kyn/HB-48)：普通培养基中同时加入Kyn 200μmol/ml和HB-48 10μmol/ml；
加药后培养48小时，采用流式细胞术检测每组T细胞的PD-1表达水平。
2)实验结果
各组检测T细胞PD-1表达水平结果统计见下图9中A。
结合图A可以看出，HB-48比DMF能更有效地抑制Kyn(犬尿氨酸， kynurenine)介导的CD8+T细胞PD-1上调，且结果具有显著性差异，说明 HB-48比DMF能更有效地抑制小分子受体。
2、检测HB-48对特异性CD8+T细胞功能的影响
1)实验步骤
磁珠分选获得OT-1小鼠脾脏CD8+T细胞，种于U型底96孔板(10万/ 孔)，按以下分组加药处理：
对照组1(PBS)：普通培养基中加PBS；
实验组2(DMF)：普通培养基中加入DMF 10μmol/ml；
实验组3(HB-48)：普通培养基中加入HB-48 10μmol/ml；
各组加药实施预处理OT-1CD8+T细胞24小时后，将3D胶术培养的 OVA-B16与分别各组预处理的OT-1CD8+T细胞以1比10的比例共培养，4 小时后流式检测OVA-B16细胞的凋亡情况。
2)实验结果
各组流式检测的细胞凋亡结果统计示于图9中B。
结合图B可以看出，与HB-48预处理T细胞共培养的OVA-B16肿瘤细 胞凋亡比例明显增加，说明HB-48能显著抑制T细胞小分子受体，下调PD-1 表达，即，增强CD8+T细胞的杀伤功能。
实施例10：HB-48联合特异性CD8+T细胞过继治疗小鼠实体肿瘤的效 果显著。
1、实验步骤
构建荷瘤小鼠：OVA-B16黑色素瘤细胞接种于4-6周C57BL/6小鼠(接 种量为1×105个细胞)，将35只小鼠随机分为7组，小鼠体重为20g左右， 7天左右即可观察到肿瘤生成；待瘤体成长至5mm x 5mm时，依组别给予荷 瘤小鼠以下不同治疗方式：
对照组1(PBS)：仅瘤内注射PBS；
实验组2(CD8+T)：OT-1小鼠CD8+T细胞尾静脉过继荷瘤小鼠，5 天一次，共3次，每次过继4x 106CD8+T细胞；
实验组3(DMF)：DMF单药瘤内注射荷瘤小鼠，每两天一次，共10 次，每次用量为5mg/kg荷瘤小鼠体重；
实验组4(HB-48)：HB-48单药瘤内注射荷瘤小鼠，每两天一次，共10 次，每次用量为5mg/kg荷瘤小鼠体重；
实验组5(CD8+T+DMF)：OT-1小鼠CD8+T细胞静脉过继联合DMF 瘤内注射，方法和剂量同实验组2和3，过继和给药操作各自遵循设定的给 药周期；
实验组6(CD8+T+HB-48)：OT-1小鼠CD8+T细胞静脉过继联合HB-48 瘤内注射，方法和剂量同实验组2和4，过继和给药操作各自遵循设定的给 药周期；
给药实验开始每日测量瘤体尺寸，计算肿瘤体积变化。
2、实验结果
各组实验小鼠的瘤体变化统计结果见图10。
可以看出，单纯CD8+T细胞过继或HB-48单药对于荷瘤小鼠的实体肿 瘤都有一定的治疗效果，但是CD8+T细胞过继联合小分子抑制剂治疗效果相 对较好，更突出的是CD8+T细胞过继联合HB-48疗效显著优于CD8+T细胞 过继联合DMF。
可以说明HB-48比DMF能更有效地抑制CD8+T细胞小分子受体，下调 其PD-1抑制性受体表达，增强CD8+T细胞体内杀伤功能。
实施例11：HB-48能降低人外周血CD8+T细胞PD-1的表达。
1、HB-48对乳腺癌病人外周血CD8+T细胞PD-1表达的影响
1)实验步骤
使用Ficoll分离乳腺癌患者外周全血获得单个核细胞，磁珠分选出 CD8+T细胞，种于U型底96孔板(10万/孔)，培养基为RPMI-1640加10ng/mL 人IL-2。按以下分组加药：
对照组1(PBS)：普通培养基加PBS；
实验组2(DMF)：普通培养基中加入DMF 10μmol/ml；
实验组3(HB-48)：普通培养基中加入HB-48 10μmol/ml；
加药后培养48小时，采用流式细胞术检测每组T细胞的PD-1表达水平。
2)实验结果
各组T细胞的PD-1表达水平检测结果见图11中A：
结合图A可以看出，HB-48比DMF能更有效地下调乳腺癌患者外周血 CD8+T细胞PD-1表达。
2、HB-48对激活的乳腺癌病人外周血CD8+T细胞PD-1表达的影响
1)实验步骤
使用Ficoll分离乳腺癌病人外周全血获得单个核细胞，磁珠分选CD8+T 细胞，种于U型底96孔板(10万/孔)，同时加入抗CD3/CD28磁珠激活T 细胞，培养基为RPMI-1640加10ng/ml人IL-2。
按以下分组加药：
对照组1(PBS)：普通培养基和PBS；
实验组2(Kyn)：普通培养基中加入Kyn 200μmol/ml；
实验组3(Kyn+DMF)：普通培养基中同时加入Kyn 200μmol/ml和DMF 10μmol/ml；
实验组4(Kyn+HB‐48)：普通培养基中同时加入Kyn 200μmol/ml和HB-48 10μmol/ml；
培养48小时，采用流式细胞术检测每组T细胞的PD-1表达水平。
2)实验结果
各组T细胞的PD-1表达水平检测结果见图11中B：
图B可以看出，Kyn能上调其PD-1的表达，而HB-48比DMF能更有效 地抑制Kyn介导的乳腺癌患者外周血CD8+T细胞PD-1上调，说明HB-48 比DMF能更有效地抑制人的CD8+T细胞小分子受体。
3、HB-48对激活人外周血CD8+T细胞Kyn转运子PAT4表达的影响
1)实验步骤
使用Ficoll分离乳腺癌病人外周全血获得单个核细胞，磁珠分选CD8+T 细胞，种于U型底96孔板(10万/孔)，同时加入抗CD3/CD28磁珠激活T 细胞，培养基为RPMI-1640加10ng/mL人IL-2。按以下分组加药：
对照组1(PBS)：培养基和PBS；
实验组2(Kyn)：培养基中加入Kyn 200μmol/ml；
实验组3(Kyn+DMF)：培养基中同时加入Kyn 200μmol/ml和DMF 10 μmol/ml；
实验组4(Kyn+HB-48)：培养基中同时加入Kyn 200μmol/ml和HB-48 10μmol/ml；
培养48小时，提取每组T细胞RNA，荧光定量PCR检测PAT4表达。
2)实验结果
各组RNA的PAT4表达水平检测结果见图11中C。
图C可以看出，Kyn能上调其转运子PAT4的表达，而HB-48比DMF 能更有效地下调乳腺癌病人外周血CD8+T细胞PAT4的表达。说明HB-48 能抑制CD8+T细胞对Kyn的摄取，进而减少其PAT4的表达。
以上仅是申请人大量研究中的部分实验结果，但已经可以说明：
本发明所用小分子抑制剂HB-48单独使用可有效抑制实体瘤和白血病的 恶性生长；
当联合使用小分子抑制剂HB-48和IFNβ时，可在大幅降低单药使用剂 量的前提下取得更优治疗效果，这提示着小分子抑制剂HB-48协同IFNβ不 仅可以降低有效治疗使用剂量，而且显著增强疗效。临床使用可以达到增强 杀伤效果，延缓瘤体生长；
小分子抑制剂HB-48与DMF相比较，能更显著地降低CD8+T细胞PD-1 的表达，更加抑制Kyn介导的PD-1上调，增强特异性CD8+T细胞对相应肿 瘤细胞的杀伤。

Claims (18)

1.一种醌式查尔酮化合物在制备治疗肿瘤疾病药物中的应用，所述醌式查尔酮化合物具有如下结构：
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述肿瘤疾病包括乳腺癌、恶性黑色素瘤、肺癌、肝癌、胰腺癌、脑瘤或白血病。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述治疗肿瘤疾病药物包括注射剂型和口服剂型。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其中，所述治疗肿瘤疾病药物为单位制剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述单位制剂的药物中包含作为活性成分的所述醌式查尔酮化合物1-5毫克。
6.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其中，所述治疗肿瘤疾病药物为包括治疗有效量的干扰素与所述醌式查尔酮化合物的制剂组合。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述治疗肿瘤疾病药物为单位制剂。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述单位制剂的药物中包含肿瘤治疗有效量的干扰素和1-5毫克作为活性成分的所述醌式查尔酮化合物。
9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述单位制剂的药物中包含1×107～4×107U的干扰素。
10.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其中，所述治疗肿瘤疾病药物为包括临床抗肿瘤药物与所述醌式查尔酮化合物的制剂组合。
11.根据权利要求10所述的应用，其中，所述临床抗肿瘤药物包括抗肿瘤疫苗或化疗药物。
12.一种抗肿瘤药物的制剂组合，其中的治疗活性成分包括干扰素和权利要求1中记载的醌式查尔酮化合物。
13.根据权利要求12所述的制剂组合，其中，所述制剂组合为单位制剂。
14.根据权利要求13所述的制剂组合，其中，所述单位制剂中包含肿瘤治疗有效量的干扰素和1-5毫克作为活性成分的所述醌式查尔酮化合物。
15.根据权利要求14所述的制剂组合，其中，所述单位制剂中包含1×107～4×107U的干扰素。
16.根据权利要求12-15所述的制剂组合，所述干扰素选自干扰素β或干扰素γ。
17.一种抗肿瘤药物的制剂组合，其中的治疗活性成分包括权利要求1中记载的醌式查尔酮化合物和临床抗肿瘤药物。
18.根据权利要求17所述的制剂组合，其中，所述临床抗肿瘤药物包括抗肿瘤疫苗或化疗药物。
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