CN109331026A - 替加环素在制备抗多发性骨髓瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了替加环素在抗血液恶性肿瘤，特别是多发性骨髓瘤的应用。经体外及体内试验显示，替加环素抗多发性骨髓瘤机制不同于已知的化疗药物马法兰、阿霉素及蛋白酶体抑制剂硼替佐米等，其具有抑制细胞活力、阻滞细胞周期及诱导细胞自噬的作用。

Description

替加环素在制备抗多发性骨髓瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于药物应用技术领域，涉及新型的广谱静脉注射用抗生素替加环素(Tigecycline)新的药物用途，具体涉及替加环素在制备抗多发性骨髓瘤药中的用途，以及在制备抗其他血液恶性疾病药物中的应用。

背景技术

众所周知，多发性骨髓瘤是血液系统疾病中最常见的三大恶性肿瘤之一。研究显示，多发性骨髓瘤是以产生M蛋白的单克隆浆细胞的恶性增生为特点。骨髓中克隆性增生的浆细胞浸润骨骼和软组织，引起骨骼破坏、贫血、肾功能损害等表现。其发病情况：多发性骨髓瘤约占肿瘤发病中的1％-2％，占血液系统恶性肿瘤的10％。我国发病率约1/10万，发病年龄在50-70岁，男：女＝3：1。近20年来，由于新的治疗方案不断出现，以及造血干细胞技术的不断成熟，多发性骨髓瘤患者的生存得到较大改善。目前治疗的方式主要包括联合化疗、蛋白酶体抑制剂硼替佐米治疗和造血干细胞移植等，患者的生存质量和生存期有较大改善，但由于治疗相关的毒副作用及并发症等限制，目前多发性骨髓瘤的中位生存期仍只有27个月，开发新的治疗药物及策略仍势在必行。

替加环素属于新一类抗生素，其结构式如式(Ⅰ)，

替加环素是已知甘氨酰环素类抗生素的一个新类，主要通过与细菌30S核糖体结合，阻止转移RNA的进入，使得氨基酸无法结合成肽链，最终起到阻断细菌蛋白质合成，限制细菌生长的作用。

已有文献报道其通过抑制线粒体蛋白质合成发挥抗急性髓系白血病作用，作为抗急性髓系白血病药物已进入I期临床试验，并且未在患者身上发现显著的不良反应。

迄今为止，尚未见有关替加环素具有抗多发性骨髓瘤作用的用途报道。

发明内容

本发明的目的是提供替加环素的新的药物用途，具体涉及替加环素在抗多发性骨髓瘤中的应用。

本发明中，所述的替加环素具有式(Ⅰ)的结构，

本发明对所述的替加环素进行了体外及体内试验，结果表明，替加环素具有显著地抗多发性骨髓瘤的作用；在体外实验中，替加环素使人多发性骨髓瘤细胞株RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞活性降低，并且通过降低周期蛋白CDK2、CyclinD1、p21等表达水平，阻滞细胞周期；通过体内实验我们进一步证实了替加环素的抗多发性骨髓瘤的用途。

本发明的实验结果显示：

(1)替加环素抑制人多发性骨髓瘤细胞株RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞活性研究结果表明，替加环素呈浓度和时间依赖性的抑制RPMI-8226、NCI-H929和U266的细胞活力，其IC50分别为10μM、10μM和20μM(如图1所示)。

(2)替加环素阻滞人多发性骨髓瘤细胞株RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞周期研究结果表明，替加环素通过降低细胞内周期蛋白CDK2、CyclinD1、p21的表达水平使RPMI-8226、NCI-H929和U266的细胞阻滞在G₀/G₁期，从而抑制细胞生长。

(3)替加环素提高人多发性骨髓瘤细胞株RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞自噬水平，研究结果表明，替加环素通过促进自噬标志蛋白LC3-I转化成LC3-II，降解其底物SQSTM1/p62蛋白，从而提高RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞自噬水平，体外与自噬抑制剂Baf-A1联合处理可协同降低细胞活性，说明自噬在替加环素抗多发性骨髓瘤中起到保护作用。

(4)替加环素体内抗多发性骨髓瘤作用。5×10⁶个RPMI-8226细胞皮下注射NOD/SCID小鼠腋窝建立多发性骨髓瘤小鼠皮下成瘤模型，替加环素75mg/kg，每天两次，连续两周，腹腔注射给药，与对照组相比，可明显抑制NOD/SCID小鼠皮下肿瘤的生长，证实替加环素在体内也同样发挥抑制多发性骨髓瘤细胞生长的作用，联合应用自噬抑制剂氯喹更显著地抑制RPMI-8226细胞体内生长，具有协同作用，进一步证实自噬在替加环素抗多发性骨髓瘤中起到保护细胞的作用。

附图说明

图1：显示了替加环素显著抑制RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞活性，并具有浓度和时间依赖性。RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞接种于96孔板中，8×10³个/孔，使用PBS、10μM、20μM、40μM的浓度分别处理这3种细胞，分别培养24、48、72小时后用CCK-8法检测各组细胞活性，数据用平均值±标准误表示。分别与DMSO比较和PBS对照组相比，^*P<0.05，^**P<0.01。

图2：显示了替加环素长期作用也显著抑制RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞活性。RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞接种于6孔板甲基纤维素半固体培养基中，1×10⁴个/孔，分别用PBS、20μM替加环素处理3种细胞，培养7天后，通过显微镜观察集落数量，并进行细胞计数。与PBS对照组相比，^*P<0.05，^**P<0.01。

图3：显示了替加环素作用RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞，使其阻滞在G₀/G₁期。分别用PBS、10μM、20μM、40μM浓度替加环素处理RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞，培养48小时后，PI单染流式检测细胞周期变化情况，结果显示替加环素导致这3种细胞G₀/G₁期比例相比对照组增高，S期细胞比例相比对照组降低，说明替加环素对RPMI-8226、NCI-H929和U266有G₀/G₁期周期阻滞作用(图3A)。采用Westernblot检测周期蛋白CyclinD1、CDK2、p21水平，发现随着替加环素作用下CyclinD1、CDK2、p21蛋白表达水平降低(图3B)。与PBS对照组相比，^*P<0.05，^**P<0.01。

图4：显示了替加环素处理提高RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞自噬水平。分别用PBS、10μM、20μM、40μM的浓度处理RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞48小时后，采用Westernblot检测自噬蛋白SQSTM1/p62和LC3-II表达水平，发现随着替加环素浓度增加SQSTM1/p62蛋白表达水平降低，而LC3-II蛋白表达水平升高(图4A)，自噬抑制剂Baf-A1作用能抑制替加环素诱导的自噬(图4B)，进一步促进替加环素处理导致的细胞活性降低(图4C)。^*P<0.05。

图5：体内实验证明替加环素体内给药具有显著的抗多发性骨髓瘤作用。使用RPMI-8226细胞皮下注射NOD/SCID小鼠成功建立皮下成瘤模型后，待皮下肿瘤生长达300mm³后，随机分为对照组、替加环素组、氯喹组和替加环素+氯喹组后，进行以下处理，对照组：生理盐水，200μl，每天两次，腹腔注射，连续两周；替加环素组：替加环素75mg/kg，每天两次，腹腔注射，连续给药两周；氯喹组：氯喹50mg/kg，每天一次，腹腔注射，连续给药两周；替加环素+氯喹组：替加环素75mg/kg，每天两次联合氯喹50mg/kg，每天一次，腹腔注射，连续给药两周。观察各组小鼠体重变化(图5A)，皮下肿瘤生长的体积曲线(图5B)，评估替加环素在体内抗多发性骨髓瘤的作用，^*P<0.05，^**P<0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，本发明中体外实验所使用的替加环素来自Selleck公司，动物实验中所使用的替加环素来自浙江海正药业股份有限公司，百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1替加环素抑制RPMI-8226、NCI-H929和U266的细胞活性

本实施例中，CCK-8试验：分别取适量RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞，用含8％FBS的RPMI 1640液稀释至8×10⁴个/ml，混匀，每组取400μl于EP管，根据不同处理组情况，加入0、10μM、20μM、40μM替加环素，取96孔板，按100μl/孔×3副孔，将EP管中细胞与试剂充分混匀后，铺入96孔板，即每孔8×10³个细胞，并设立只有培养液无细胞的调零组；根据实验分组不同，分别在培养箱中处理24小时、48小时、72小时，每孔加入10μl CCK-8试剂，每隔半小时观察各孔颜色变化情况，将96孔板置入分光光度计，测量各孔450nm波长处的光密度值(OD值)，尽量保证空白组光密度值处于0.8-1之间，求出每组光密度平均值，减去调零组平均值，得出实际值，其他各组与空白组比值为其细胞活性百分比；每组实验至少重复3次，运用SPSS 20.0统计结果。结果显示替加环素呈时间浓度依赖性的抑制RPMI-8226、NCI-H929和U266的细胞活性。

实施例2克隆形成实验

取装有1ml甲基纤维素半固体培养基的EP管若干，4℃解冻后，置于涡旋振荡器上震荡1分钟，静置5分钟。将细胞密度调整至1×10⁵个/ml，取100μl，加入已加有1ml甲基纤维素半固体培养基的EP管中，根据不同分组及药物浓度，分别加入PBS、20μM替加环素，置于涡旋振荡器上震荡1分钟，静置5分钟；用1ml针筒将处理好的甲基纤维素半固体培养基吸出注入小皿，注意将小皿底面完全覆盖，盖上皿盖；一个大皿中放置3个小皿(2个甲基纤维素+1个含无菌水小皿，无盖，保持湿度)，盖上皿盖；显微镜下观察是否细胞单个分布，置于培养箱中，静置7天；用带相机显微镜在200倍及40倍视野下，拍摄各实验组细胞图像；任意取10个40倍镜视野，计数集落个数，根据培养皿底面积是视野面积的66倍，可按比例估算整皿集落数；用PBS缓冲液将甲基纤维素从培养皿洗脱，计数细胞总数。

结果显示替加环素处理组细胞集落数和细胞数均明显少于对照组，说明替加环素长期作用可显著抑制RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞活性。

实施例3替加环素阻滞RPMI-8226、NCI-H929和U266的细胞周期。

本实施例中，收集细胞悬液，计数细胞总数为2×10⁵～1×10⁶，500g×5分钟离心沉淀细胞，去上清，用PBS缓冲液洗1次，加入1mL的DNA solution和10μL的RNase A，将EP管中细胞液转移至流式管中，管壁外侧用记号笔标明分组；涡旋混匀5～10秒，室温孵育30分钟，200目筛网过滤后，上流式细胞仪测定结果，实验结果用ModFit软件分析。

结果显示替加环素使RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞G₀/G₁期比例相比对照组增高，S期细胞比例相比对照组降低，具有周期阻滞作用。

实施例4替加环素的体内抗多发性骨髓瘤作用。

本实施例中，选用NOD/SCID小鼠构建动物模型，造模前1天，腹腔注射环磷酰胺200mg/kg抑制小鼠免疫功能，收集RPMI-8226细胞，以无血清1640培养基洗涤3次，将细胞密度调整为2.5×10⁷个/ml，每只小鼠进行腋窝皮下注射200μl，注射前注意回抽确认无血后注入。每天观察小鼠皮下成瘤情况，用游标卡尺测量肿瘤大小，肿瘤体积＝长×宽²×0.5236，待皮下肿瘤达300mm³时，随机分组为对照组、替加环素组、氯喹组和替加环素+氯喹组(每组5只)：

对照组：生理盐水，200μl，每天两次，腹腔注射，连续两周；

替加环素组：替加环素75mg/kg，每天两次，腹腔注射，连续给药两周；氯喹组：氯喹50mg/kg，每天一次，腹腔注射，连续给药两周；

替加环素+氯喹组：替加环素75mg/kg，每天两次，联合氯喹50mg/kg，每天一次，腹腔注射，连续给药两周。

隔天游标测量肿瘤大小并记录小鼠体重，绘制肿瘤生长曲线和小鼠体重曲线，给药结束后处死小鼠，分离出小鼠皮下肿瘤，并称重。

结果显示替加环素组小鼠皮下肿瘤明显小于对照组，替加环素+氯喹组小鼠皮下肿瘤略小于替加环素组，但无统计学差异，替加环素组小鼠和替加环素+氯喹组小鼠在药物治疗9天后较对照组均出现体重减轻，但不影响小鼠生存情况，说明替加环素具有体内抗多发性骨髓瘤作用。

Claims (5)

1.式(I)结构的替加环素在制备抗多发性骨髓瘤药物中的应用：

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的替加环素通过诱导人多发性骨髓瘤细胞周期阻滞在G₀/G₁期而抑制细胞生长，同时通过诱导细胞自噬水平而起到保护细胞的作用。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的替加环素为注射用药，剂量为25～150mg/kg。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述替加环素联合其它抗肿瘤药物在制备抗多发性骨髓瘤药物中的应用。

5.权利要求1所述的的替加环素在制备抗血液恶性疾病药物中的应用。