CN103599111B - 用于治疗胰腺癌的组合药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于治疗胰腺癌的组合药物制剂，该组合药物制剂是将醉茄素A和奥沙利铂使用，治疗胰腺癌。本发明中醉茄素A与奥沙利铂均可通过ROS介导的氧化应激损伤来杀伤肿瘤细胞，组合用药后可将两种不同来源的ROS联合并发挥协同效应，其杀伤胰腺癌细胞的效果显著强于单一用药。组合药物在不对正常细胞产生明显毒性效应的浓度下，对胰腺癌细胞的生长抑制作用较胰腺癌临床一线用药吉西他滨更为显著，表明该组合药物能够更好地应用在胰腺癌的治疗以及制备抗胰腺癌的药物中。

Description

用于治疗胰腺癌的组合药物

技术领域

本发明涉及治疗胰腺癌领域，具体地指一种用于治疗胰腺癌的组合药物。

背景技术

胰腺癌是一种恶性程度高，预后极差的消化道肿瘤。近年来，其发病率在全球范围内逐年升高，在美国，胰腺癌发病率位居恶性肿瘤第十位，死亡率为第四位；在中国，随着国民经济和国人生活水平的不断提高，胰腺癌在恶性肿瘤中的发病率已由第20位上升到第8位，死亡率居恶性肿瘤第6位。因此，胰腺癌已经成为严重威胁人类健康的疾病之一。

由于胰腺的特殊解剖部位，使胰腺癌的早期症状隐匿，多数患者只表现出一些如恶心呕吐、食欲下降等消化道症状，极易被误诊；而只有在晚期肿瘤压迫胰腺周围神经，引起剧烈腹疼时才发现病情，此时已失去最佳治疗时机；又由于胰腺癌本身的生物学特点，其恶性程度高，进展快，转移早，且目前尚缺乏有效的系统治疗手段，使得胰腺癌预后较差。胰腺癌在初次确诊后，1年内死亡率达80%，3年内为95%，转移患者的中位生存期为3～6个月，局部晚期为6～10个月，故其也被成为“癌症之王”。

目前，胰腺癌的治疗以手术为主，根治性手术切除是现阶段唯一可以治愈胰腺癌的方法。然而由于大多数患者就诊时已属中晚期，失去了手术切除的机会，故非手术治疗（如化疗）在胰腺癌的综合治疗中有着十分重要的地位。但现有的临床化疗方案对胰腺癌的治疗效果并未达到令人满意的程度，以吉西他滨（Gemcitabine）为代表的一线化疗药物的治疗应答率不足30%，仅能延长患者4～6个月的中位生存期。

因此，面对目前胰腺癌的治疗现状，以及人群中日益增加的发病率，迫切需要开发出一种更有效的新型抗肿瘤剂来治疗胰腺癌。但是用醉茄素A（Withaferin A）与奥沙利铂组合使用是否显示抗肿瘤效果尚无任何报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供了一种用于治疗胰腺癌的组合药物制剂，将醉茄素A（Withaferin A）与奥沙利铂组合使用时，可通过阻滞Ras/Raf/MAPK、PI3K/AKT/mTOR信号通路来实现对胰腺癌细胞的生长抑制作用，同时该组合药物还可引起细胞内活性氧（ROS）水平显著上升，并通过氧化应激损伤诱导胰腺癌细胞的凋亡。上述效应均较单一使用醉茄素A或奥沙利铂时显著增强

为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于治疗胰腺癌的组合药物制剂，由有效量的奥沙利铂、醉茄素A和药学上可接受的辅料组成。

进一步地，药物制剂由1份醉茄素A、1～50份奥沙利铂和6～8份辅料组成。

再进一步地，药物制剂由1份醉茄素A、1～30份奥沙利铂和6～8份辅料组成。

再进一步地，所述辅料为维生素C、山梨醇、甘露醇、木糖醇、果糖、氨基酸、葡甲胺、糊精、硬脂酸镁和蔗糖中任意一种或两种。

再进一步地，所述药物制剂为注射制剂或口服制剂。

再进一步地，所述口服制剂为片剂、胶囊剂或颗粒剂。

再进一步地，所述注射制剂由1份醉茄素A、10份奥沙利铂、6份果糖和2份维生素C组成。

再进一步地，所述片剂由1份醉茄素A、8份奥沙利铂和6份维生素C组成。

再进一步地，所述片剂由1份醉茄素A、30份奥沙利铂、1份糊精和6份果糖组成。

再进一步地，所述注射制剂为冻干粉针剂。

本发明的理论基础：

醉茄素A是茄科植物醉茄的主要活性成分。化学名称为(4β,5β,6β,22R)-5,6-环氧-4,22,27-三羟基-1-氧代-麦角甾-2,24-二烯-26-乌苏酸δ-内酯，英文名为Withaferin A，分子式C₂₈H₃₈O₆，分子量470.58，白色棱柱结晶(丙酮-石油醚)，熔点252～253°，沸点680.69℃，易溶于甲醇、二甲基亚砜(DMSO)，见光缓慢分解，密度1.28g/cm³，其结构式如下：

现代药理和临床研究证明，醉茄素A具有调节免疫、缓解焦虑及保护心血管等作用。同时还发现其对多种人类肿瘤细胞具有生长抑制作用，但对正常组织和细胞却没有明显的损伤作用，副作用小，具有良好的应用前景。关于产生这种差异的机制尚未完全明确，部分原因可能与醉茄素A通过氧化应激损伤机制来杀伤细胞，而正常细胞较肿瘤细胞更能耐受氧化应激损伤。

奥沙利铂（Oxaliplatin）属于新的铂类抗癌药，其在结、直肠癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌中的适用已被许可或开发。另外，通过将奥沙利铂与各种药剂组合来对抗各种癌症的组合疗法已被许可或开发。其中包括：通过与5-氟尿嘧啶组合使用来治疗转移性结、直肠癌或转移性乳腺癌、通过与吉西他滨组合使用来治疗局部晚期胰腺癌、通过与培美曲塞组合使用来治疗进展期非小细胞肺癌、通过与多西紫杉醇组合使用来治疗复发性卵巢癌等

本发明的有益效果在于：

醉茄素A与奥沙利铂均可通过ROS介导的氧化应激损伤来杀伤肿瘤细胞，但二者产生ROS的来源和机制不同，组合用药后可将两种不同来源的ROS联合并发挥协同效应，其杀伤胰腺癌细胞的效果显著强于单一用药。而正常细胞一般较肿瘤细胞更能耐受ROS介导的应激损伤，因此，在相同剂量的药物浓度下，组合用药对人体正常细胞的毒性作用较肿瘤细胞小；此外，原癌基因K-ras和Akt分别调控的Ras/Raf/MAPK和PI3K/Akt/mTOR信号通路，被认为是维持胰腺癌恶性生物学行为的重要分子通路。本发明通过免疫印迹检测发现，单用醉茄素A或奥沙利铂均只能部分抑制Ras/Raf/MAPK和PI3K/Akt/mTOR信号通路活性，而组合用药可显著抑制上述通路活性，进而抑制胰腺癌细胞的生长。同时，上述组合药物在不对正常细胞产生明显毒性效应的浓度下，对胰腺癌细胞的生长抑制作用较胰腺癌临床一线用药吉西他滨更为显著，表明该组合药物能够更好地应用在胰腺癌的治疗以及制备抗胰腺癌的药物中。

附图说明

图1为不同药物处理方式对人胰腺癌细胞和人正常细胞存活率影响的图；其中，纵坐标表示细胞存活率，单位为%；横坐标表示药物浓度，单位为μg/mL。

图2、图3、图4及图5为通过Compusyn软件计算醉茄素A和奥沙利铂联合用药对人胰腺癌细胞和人正常细胞的药物联合指数CI的图。

图6为不同药物浓度的吉西他滨对人胰腺癌细胞以及人正常细胞存活率影响的图；其中，纵坐标表示细胞存活率，单位为%；横坐标表示药物浓度，单位为μg/mL。

图7为不同药物处理方式对人胰腺癌细胞集落形成率影响的图。

图8为不同药物处理方式对人胰腺癌细胞形态学影响的图。

图9为不同药物处理方式对人胰腺癌细胞凋亡率影响的图。

图10为不同药物处理方式对人胰腺癌细胞内活性氧水平影响的图。

图11为不同药物处理方式对人胰腺癌细胞蛋白表达影响的图。

图12为不同药物处理方式对人胰腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤成瘤能力影响的图。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1醉茄素A联合奥沙利铂的体外细胞毒性检测实验

1、材料

实验药物配置：

本实施例中醉茄素A购自美国Santa Cruz公司，用DMSO配制成浓度为2mg/mL的浓缩液，置于-20℃冰箱中保存，实验时根据需要用培养液将其稀释成不同浓度的工作液；

奥沙利铂可通过公知的方法制备，例如，可以按照美国专利第5338874号（US5338874）及美国专利第5420319号（US5420319）中记载的方法制备。另外，奥沙利铂还可以通过从Sanofi Aventis公司购买Eloxatin（注册商标）来获得。

本实施例中奥沙利铂购自Sanofi Aventis公司。

其他试剂：高糖DMEM、RPMI-1640、胎牛血清（Fatal BovineSerum，FBS）均购于美国Gibco公司；细胞培养瓶、培养板均购自于美国Corning公司；CCK-8（cell counting kit-8）检测试剂盒购自日本Dojindo公司；

2、细胞及细胞培养

人胰腺癌细胞株Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2购自美国模式培养集存库(ATCC)；正常人肝细胞L02和正常人肺成纤维细胞HLF1购自中科院上海细胞库。HLF1细胞培养条件：RPMI-1640，10%胎牛血清，37℃，5%CO₂；Panc-1、MiaPaCa-2、Capan-2和L02细胞培养条件：高糖DMEM，10%胎牛血清，37℃，5.0%CO₂。

3、实验步骤

取对数生长期的人胰腺癌细胞、正常人肝细胞L02和正常人肺成纤维细胞HLF1，调整细胞密度为2.0×10⁴个/mL接种于96孔培养板中，每孔100μL，置于培养箱中培养，待细胞完全贴壁后吸去培养液，分别加入200μL含有不同浓度梯度醉茄素A、奥沙利铂以及醉茄素A+奥沙利铂联合使用的培养液，同时设立空白对照组及含有同等稀释度的DMSO作为阴性对照组，每组设5个复孔。药物作用24小时后，每孔加入10μL CCK-8，继续培养4h，于酶标仪波长450nm处读取吸光度（D）值。按公式计算细胞存活率和抑制率。细胞存活率%（Cell viability%）＝（药物处理组平均D值/细胞对照孔平均D值）×100%。细胞抑制率%（inhibitory rate%）＝（1-药物处理组平均D值/细胞对照孔平均D值）×100%。细胞的半数抑制浓度（half inhibitionconcentration，IC50）按中效方程计算，药物联合指数（CombinationIndex，CI）采用Compusyn软件计算。

4、实验结果

图1中A-J显示不同药物处理方式对细胞存活率的影响。由图1中A-F可知，醉茄素A和奥沙利铂对胰腺癌细胞Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2均具有一定的生长抑制作用，且有浓度依赖性。作用24小时后，奥沙利铂对Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2细胞的IC50分别为33.93、22.70和16.10μg/mL，而当奥沙利铂联合0.5μg/mL的醉茄素A后，其对三种胰腺癌细胞的IC50显著减少，分别为5.62、2.34和3.04μg/mL；同样，醉茄素A作用24小时后对Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2细胞的IC50分别为8.13、1.53和1.69μg/mL，而当醉茄素A联合5μg/mL的奥沙利铂后，其对三种胰腺癌细胞的IC50分别为0.40、0.22和0.25μg/mL，均显著低于单用醉茄素A。

由图1中G-J可知，奥沙利铂作用24小时后对L02和HLF1细胞的IC50分别为57.04和117.10μg/mL，当奥沙利铂联合0.5μg/mL的醉茄素A后，其对L02和HLF1细胞的IC50分别为16.40和26.77μg/mL；醉茄素A作用24小时后对L02和HK2细胞的IC50分别为17.91和19.16μg/mL，而当醉茄素A联合5μg/mL的奥沙利铂后，其对L02和HLF1细胞的IC50分别为2.16和3.79μg/mL。

图1中K-M显示，当醉茄素A与奥沙利铂药物浓度比固定为1：10联合作用24小时后，奥沙利铂对Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2细胞的IC50分别为4.70、5.05和4.75μg/mL，醉茄素A对Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2细胞的IC50分别为0.47、0.51和0.47μg/mL，均显著低于单独用药组。

图2A-E、图3、图4A-C及图5为通过Compusyn软件分别计算Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2的药物联合指数CI，CI＜1提示奥沙利铂与醉茄素A联合应用可产生协同效应。

实施例2吉西他滨的体外细胞毒性检测实验

1、材料

实验药物：吉西他滨购自美国Sigma公司，用DMSO配制成浓度为50mg/mL的浓缩液，置于-20℃冰箱中保存，实验时根据需要用培养液将其稀释成不同浓度的工作液；

其他试剂：高糖DMEM、RPMI-1640、胎牛血清（Fatal BovineSerum，FBS）均购于美国Gibco公司；细胞培养瓶、培养板均购自于美国Corning公司；CCK-8（cell counting kit-8）检测试剂盒购自日本Dojindo公司；

2、细胞及细胞培养

人胰腺癌细胞株Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2购自美国模式培养集存库(ATCC)；正常人肝细胞L02和正常人肺成纤维细胞HLF1购自中科院上海细胞库。HLF1细胞培养条件：RPMI-1640，10%胎牛血清，37℃，5%CO₂；Panc-1、MiaPaCa-2、Capan-2和L02细胞培养条件：高糖DMEM，10%胎牛血清，37℃，5.0%CO₂。

3、实验步骤

取对数生长期的人胰腺癌细胞、正常人肝细胞L02和正常人肺成纤维细胞HLF1，调整细胞密度为2.0×10⁴个/mL接种于96孔培养板中，每孔100μL，置于培养箱中培养，待细胞完全贴壁后吸去培养液，分别加入200μL含有不同浓度梯度（0.5、1、5、10、50μg/mL）吉西他滨的培养液，同时设立空白对照组及含有同等稀释度的DMSO作为阴性对照组，每组设5个复孔。药物作用24小时后，每孔加入10μL CCK-8，继续培养4h，于酶标仪波长450nm处读取吸光度（D）值。按公式计算细胞存活率和抑制率。细胞存活率%（Cell viability%）＝（药物处理组平均D值/细胞对照孔平均D值）×100%。

4、实验结果

图6显示不同浓度吉西他滨对细胞存活率的影响。由图6可知，在50.0μg/mL的高浓度吉西他滨作用时，其对胰腺癌细胞株的抑制率仅在15～45%之间，同时对正常人肝细胞L02和正常人肺成纤维细胞HLF1的抑制率分别达到25.8±3.0%和41.8±5.9%。结合图1结果，当使用0.5μg/mL醉茄素A联合1.0μg/mL奥沙利铂对胰腺癌细胞株的抑制率就可达到20%以上，随着奥沙利铂浓度从5.0μg/mL增加到50.0μg/mL，组合药物对胰腺癌细胞的抑制率介于45～95%之间，效果明显高于吉西他滨；同时，当使用0.5μg/mL醉茄素A联合1.0μ-5.0μg/mL奥沙利铂时，对正常人肝细胞L02和正常人肺成纤维细胞HLF1仅有轻微抑制作用，而只有当奥沙利铂在50.0μg/mL高浓度时，才对两种细胞有较明显的抑制作用。因此从上述实验可以看出，在较低浓度范围内，醉茄素A与奥沙利铂联合用药对胰腺癌细胞的生长抑制作用较吉西他滨效果更为显著，且对正常细胞的毒性作用更小。

实施例3集落形成实验检测药物对细胞生长的抑制率

1、材料

实验药物：醉茄素A购自美国Santa Cruz公司，用DMSO配制成浓度为2mg/mL的浓缩液，置于-20℃冰箱中保存；奥沙利铂购自Sanofi Aventis公司。

其他试剂：高糖DMEM、胎牛血清（Fatal Bovine Serum，FBS）均购于美国Gibco公司；细胞培养瓶、培养皿均购自于美国Corning公司；4%多聚甲醛和结晶紫均购自北京鼎国昌盛生物技术公司。

2、细胞及细胞培养

人胰腺癌细胞株Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2购自美国模式培养集存库(ATCC)。细胞培养条件：高糖DMEM，10%胎牛血清，37℃，5.0%CO₂。

3、实验步骤

取对数生长期的人胰腺癌Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2细胞接种于6cm培养皿中，每个小皿接种约1000个细胞，置于培养箱中培养，待细胞完全贴壁后吸去培养液，分别加入3mL含有1μg/mL醉茄素A、10μg/mL奥沙利铂以及1μg/mL醉茄素A+10μg/mL奥沙利铂的培养液，同时设立含有同等稀释度的DMSO作为阴性对照组。作用24小时后更换新鲜的培养液，继续培养10天，随后用4%多聚甲醛溶液固定，结晶紫染色并计数集落个数（以大于50个细胞为一个集落单位）。集落抑制率=(1-药物处理组集落形成率/阴性对照组集落形成率)×100%

4、实验结果

图7结果显示，相比于阴性对照组，10μg/mL奥沙利铂对三种胰腺癌细胞Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2的集落抑制率分别为26.47±4.24%、32.12±3.54%和31.95±1.41%，1μg/mL醉茄素A对三种细胞集落抑制率分别为28.86±1.62%、41.26±2.12%和34.94±3.54%，而10μg/mL奥沙利铂与1μg/mL醉茄素A联合使用对三种细胞集落抑制率分别为72.76±4.95%、77.85±2.83%和83.63±1.41%（图7A-C）。提示醉茄素A与奥沙利铂联合用药对胰腺癌细胞的增殖抑制作用显著强于单一用药。

实施例4醉茄素A联合奥沙利铂对胰腺癌细胞形态学影响

1、材料

实验药物：醉茄素A购自美国Santa Cruz公司，用DMSO配制成浓度为2mg/mL的浓缩液，置于-20℃冰箱中保存；奥沙利铂购自Sanofi Aventis公司。

其他试剂：高糖DMEM、胎牛血清（Fatal Bovine Serum，FBS）均购于美国Gibco公司；细胞培养瓶、培养板均购自于美国Corning公司。

2、细胞及细胞培养

人胰腺癌细胞株Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2购自美国模式培养集存库(ATCC)。细胞培养条件：高糖DMEM，10%胎牛血清，37℃，5.0%CO₂。

3、实验步骤

取对数生长期的人胰腺癌Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2细胞，调整细胞密度为2.0×10⁵个/mL接种于12孔培养板中，每孔2ml，置于培养箱中培养，待细胞完全贴壁后吸去培养液，分别加入2ml含有1μg/mL醉茄素A、10μg/mL奥沙利铂以及1μg/mL醉茄素A+10μg/mL奥沙利铂的培养液，同时设立含有同等稀释度的DMSO作为阴性对照组。作用24小时后将各组细胞置于倒置普通显微镜下观察并拍照。

4、实验结果

图8结果显示，醉茄素A与奥沙利铂的组合用药可引胰腺癌Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2细胞大部分出现体积变小、皱缩变圆、细胞间的连接消失等凋亡形态学改变，这种效应较醉茄素A或奥沙利铂单独用药组显著增强（图8A-C）。

实施例5醉茄素A联合奥沙利铂对胰腺癌细胞凋亡率的影响

1、材料

实验药物：醉茄素A购自美国Santa Cruz公司，用DMSO配制成浓度为2mg/mL的浓缩液，置于-20℃冰箱中保存；奥沙利铂购自Sanofi Aventis公司。

其他试剂：高糖DMEM、胎牛血清（Fatal Bovine Serum，FBS）均购于美国Gibco公司；细胞培养瓶、培养皿均购自于美国Corning公司；AnnexinV/FITC凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

2、细胞及细胞培养

人胰腺癌细胞株Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2购自美国模式培养集存库(ATCC)。细胞培养条件：高糖DMEM，10%胎牛血清，37℃，5.0%CO₂。

3、实验步骤

取对数生长期的人胰腺癌Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2细胞，接种于12孔板，每孔2×10⁵个细胞，置于细胞培养箱中培养过夜。待细胞完全贴壁后吸去培养液，分别加入2mL含有1μg/mL醉茄素A、10μg/mL奥沙利铂以及1μg/mL醉茄素A+10μg/mL奥沙利铂的培养液，同时设立含有同等稀释度的DMSO作为阴性对照组，继续培养24小时，消化收集细胞，PBS洗涤细胞2次（2000rpm，室温离心5min，r＝8cm），每管收集约1×10⁵个细胞；加入500μL的Binding Buffer重悬细胞后，再分别加入5μL Annexin V-FITC和5μL Propidiumiodide染料混匀，室温避光反应15min，于1h内上流式仪检测细胞凋亡情况。采用CellQuest软件分析实验结果。正常的活细胞不被AnnexinV–FITC和PI染色；早期凋亡的细胞仅被AnnexinV–FITC染色；坏死细胞和晚期凋亡的细胞可以被AnnexinV–FITC和PI同时染色。我们视AnnexinV–FITC阳性细胞为凋亡细胞。

4、实验结果

图9中A-C结果显示，胰腺癌Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2细胞未加药的空白对照组凋亡率分别为4.82±1.35%、12.21±2.56%和9.73±1.54%；10μg/mL奥沙利铂作用24小时后三种细胞凋亡率分别为22.37±3.67%、26.98±2.54%和20.53±2.27%；1μg/mL醉茄素A作用24小时后三种细胞凋亡率分别为24.89±2.44%、42.03±6.07%和38.74±4.29%；而10μg/mL奥沙利铂与1μg/mL醉茄素A联合作用24小时后三种细胞凋亡率分别为76.10±5.38%、83.32±6.37%和84.03±8.06%。可见与之前凋亡形态学结果相一致，醉茄素A与奥沙利铂联合用药对胰腺癌细胞的促凋亡作用显著强于单一用药。

实施例6醉茄素A联合奥沙利铂对胰腺癌细胞活性氧(ROS)水平的影响

1、材料

实验药物：醉茄素A购自美国Santa Cruz公司，用DMSO配制成浓度为2mg/mL的浓缩液，置于-20℃冰箱中保存；奥沙利铂购自Sanofi Aventis公司。

其他试剂：高糖DMEM、胎牛血清（Fatal Bovine Serum，FBS）均购于美国Gibco公司；细胞培养瓶、培养板均购自于美国Corning公司；活性氧（ROS）检测试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所。

2、细胞及细胞培养

人胰腺癌细胞株Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2购自美国模式培养集存库(ATCC)。细胞培养条件：高糖DMEM，10%胎牛血清，37℃，5.0%CO₂。

3、实验步骤

取对数生长期的人胰腺癌Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2细胞，接种于12孔板，每孔2×10⁵个细胞，置于细胞培养箱中培养过夜。待细胞完全贴壁后吸去培养液，分别加入2ml含有1μg/mL醉茄素A、10μg/mL奥沙利铂以及1μg/mL醉茄素A+10μg/mL奥沙利铂的培养液，同时设立含有同等稀释度的DMSO作为阴性对照组，继续培养12小时。去除细胞培养液，加入浓度为10μmol/L的荧光探针DCFH-DA，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，消化收集细胞后上流式仪检测。

4、实验结果

图10中A-C结果显示，胰腺癌Panc-1、MiaPaCa-2和Capan-2细胞未加药的空白对照组ROS平均荧光强度（MFI）值分别为11.92±1.99、58.11±0.50和4.06±0.07；10μg/mL奥沙利铂作用12小时后三种细胞ROS平均荧光强度（MFI）值分别为19.58±4.85、67.37±2.43和16.46±1.31；1μg/mL醉茄素A作用12小时后三种细胞ROS平均荧光强度（MFI）值分别为28.31±5.18、86.46±2.29和25.24±0.95；而10μg/mL奥沙利铂与1μg/mL醉茄素A联合作用12小时后三种细胞ROS平均荧光强度（MFI）值分别为47.20±6.41、138.30±6.27和65.56±4.09。提示相较于醉茄素A或奥沙利铂单药作用而言，联合用药可显著提高胰腺癌细胞内ROS水平。

实施例7醉茄素A联合奥沙利铂对胰腺癌细胞相关蛋白的影响

1、材料

实验药物：醉茄素A购自美国Santa Cruz公司，用DMSO配制成浓度为2mg/mL的浓缩液，置于-20℃冰箱中保存；奥沙利铂购自Sanofi Aventis公司。

Western blot主要试剂：蛋白分子量Marker购于Fermentas公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜购于美国Millipore公司；牛血清蛋白（BSA）购于北京鼎国昌盛生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂购于德国Roche公司；化学发光剂（ECL）购自美国Pierce公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗体购自武汉博士德生物工程有限公司司，所有一抗均购自于美国Cell Signaling公司。

其他试剂：高糖DMEM、胎牛血清（Fatal Bovine Serum，FBS）均购于美国Gibco公司；细胞培养瓶、培养皿均购自于美国Corning公司。

2、细胞及细胞培养

人胰腺癌细胞株Panc-1和MiaPaCa-2购自美国模式培养集存库(ATCC)。细胞培养条件：高糖DMEM，10%胎牛血清，37℃，5.0%CO₂。

3、实验步骤

取对数生长期的人胰腺癌Panc-1和MiaPaCa-2细胞接种于6cm培养皿中，每个小皿接种约1×10⁶个细胞，置于培养箱中培养，待细胞完全贴壁后吸去培养液，分别加入3ml含有1μg/mL醉茄素A、10μg/mL奥沙利铂以及1μg/mL醉茄素A+10μg/mL奥沙利铂的培养液，同时设立含有同等稀释度的DMSO作为阴性对照组。继续培养24和48小时后，胰酶消化、收集细胞，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂，冰上孵育30min，4℃12000×g，离心20min。取上清用BCA法测定蛋白浓度；以50ug蛋白/泳道上样，10%-12%的SDS-PAGE电泳分离，电泳结束后将PAGE胶上蛋白电转移至PVDF膜上；于5%的脱脂奶粉中室温振荡封闭2h；分别加入一抗（稀释比例均为1︰500）于杂交袋中4℃孵育过夜；次日用TBST洗膜15min/次×3次，室温孵育二抗(1∶3000)1h；TBST洗膜10min/次×3次；之后采用增强化学发光（ECL）法进行显色、曝光。采集图像后用图像分析软件Quantity One进行灰度分析。

4、实验结果

图11A结果显示，单用10μg/mL奥沙利铂或1μg/mL醉茄素A分别作用胰腺癌Panc-1和MiaPaCa-2细胞24小时和48小时，可引起细胞凋亡蛋白Caspase-3、PARP1的前体减少而活性剪切体(cleavedcaspase-3、cleaved PARP1)增多，提示细胞出现部分凋亡；而当两种药物联合作用后，可显著增加凋亡蛋白Caspase-3、PARP1的活性剪切体，同时前体进一步减少，提示细胞凋亡较单一用药组显著增加，这也与AnnexinV凋亡检测结果相一致。

图11B结果显示，醉茄素A与奥沙利铂组合用药相比于单一用药，可显著抑制胰腺癌Panc-1和MiaPaCa-2细胞Ras/Raf/MAPK和PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白c-Raf、ERK1/2、PDK1、AKT和mTOR的磷酸化活性形式。而Ras/Raf/MAPK和PI3K/Akt/mTOR信号通路被认为是维持胰腺癌恶性增殖和分化的关键通路之一，因此，联合用药可通过靶向干预关键蛋白位点来达到抑制胰腺癌细胞生长和增殖的目的。

实施例8醉茄素A联合奥沙利铂对胰腺癌细胞皮下移植瘤成瘤能力的影响

1、材料

实验药物：醉茄素A购自美国Santa Cruz公司，用DMSO配制成浓度为2mg/mL的浓缩液，置于-20℃冰箱中保存；奥沙利铂购自Sanofi Aventis公司。

动物及其他试剂：雌性BALB/C裸鼠（6-8W）购自北京华阜康公司。高糖DMEM、胎牛血清（Fatal Bovine Serum，FBS）均购于美国Gibco公司。

2、细胞及细胞培养

人胰腺癌细胞株Panc-1和MiaPaCa-2购自美国模式培养集存库(ATCC)。细胞培养条件：高糖DMEM，10%胎牛血清，37℃，5.0%CO₂。

3、实验步骤

取对数生长期的细胞，经胰酶消化后，调整细胞浓度至2×10⁷个/mL，取0.2mL接种于裸鼠右前肢背部皮下。当瘤子体积达到100mm³后，将裸鼠随机分成4组，每组5只。空白对照组给予含等量DMSO的生理盐水腹腔注射，醉茄素A组给予2mg/kg，1次/2天，腹腔注射；奥沙利铂组给予20mg/kg，2次/周，腹腔注射；联合组给予醉茄素A+奥沙利铂治疗方案。于最后一次给药结束后第二天处死裸鼠并取出瘤子称重。给药期间每3天测量肿瘤长、短径，根据公式：体积(V)=长径×短径×短径×0.5计算肿瘤大小。比肿瘤体积=给药后肿瘤体积/给药前肿瘤体积。

4、实验结果

图12中A-D结果显示，醉茄素A与奥沙利铂组合用药可显著抑制胰腺癌Panc-1和MiaPaCa-2细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，效果较单一给药显著增强。

实施例9注射制剂制备

取1份醉茄素A、10份奥沙利铂、6份果糖和2份维生素C，按常规方法制备成注射制剂。

实施例10片剂制备

取1份醉茄素A、8份奥沙利铂和6份维生素C，按常规方法制备成片剂。

实施例11片剂制备

取1份醉茄素A、30份奥沙利铂、1份糊精和6份果糖，按常规方法制备成片剂。

实施例12胶囊剂制备

取1份醉茄素A、1份奥沙利铂、2份维生素C和6份果糖，按常规方法制备成胶囊剂。

实施例13颗粒剂制备

取1份醉茄素A、50份奥沙利铂、1份氨基酸和4份蔗糖，按常规方法制备成胶囊剂。

Claims (9)

1.一种用于治疗胰腺癌的组合药物制剂，其特征在于：所述药物制剂由1份醉茄素A、1～50份奥沙利铂和6～8份辅料组成。

2.根据权利要求1所述的组合药物制剂，其特征在于：药物制剂由1份醉茄素A、1～30份奥沙利铂和6～8份辅料组成。

3.根据权利要求1或2所述的组合药物制剂，其特征在于：所述辅料为维生素C、山梨醇、甘露醇、木糖醇、果糖、氨基酸、葡甲胺、糊精、硬脂酸镁和蔗糖中任意一种或两种。

4.根据权利要求1或2所述的组合药物制剂，其特征在于：所述药物制剂为注射制剂或口服制剂。

5.根据权利要求4所述的组合药物制剂，其特征在于：所述口服制剂为片剂、胶囊剂或颗粒剂。

6.根据权利要求4所述的组合药物制剂，其特征在于：所述注射制剂由1份醉茄素A、10份奥沙利铂、6份果糖和2份维生素C组成。

7.根据权利要求5所述的组合药物制剂，其特征在于：所述片剂由1份醉茄素A、8份奥沙利铂和6份维生素C组成。

8.根据权利要求5所述的组合药物制剂，其特征在于：所述片剂由1份醉茄素A、30份奥沙利铂、1份糊精和6份果糖组成。

9.根据权利按要求4所述的组合药物制剂，其特征在于：所述注射制剂为冻干粉针剂。