TWI533876B - 用以抗子宮肌瘤之中草藥組合物、及其萃取物之用途 - Google Patents

Description

用以抗子宮肌瘤之中草藥組合物、及其萃取物之用途

本發明係關於一種中草藥組合物，特別係一種用以抗子宮肌瘤之中草藥組合物，本發明另關於該中草藥組合物之萃取物用以製備抗子宮肌瘤藥物之用途。

子宮肌瘤(uterine fibroid)為源自於子宮肌層(myometrium)的良性腫瘤(leiomyoma)，好發於30~50歲之婦女，大多數之子宮肌瘤無明顯症狀，但是隨著子宮肌瘤之增長，除了可能造成嚴重痛經(heavy,painful periods)、不正常出血(abnormal gynecologic hemorrhage)，甚至可能會導致不孕現象(infertility)，此時可以藉由子宮肌瘤切除術(uterine myomectomy)加以清除。

習用藥物多用以改善子宮肌瘤之病症，例如利用非類固醇抗炎藥物(non-steroidal anti-inflammatory drug，簡稱NSAID)來治療子宮肌瘤導致之疼痛，或使用口服避孕藥(oral contraceptive pill，簡稱OCP)來減少出血現象；此外，另可以藉由促性腺激素釋放激素類似物(gonadotropin-releasing hormone analog，簡稱GnRH類似物)，降低體內動情素(estrogen)含量，以抑制子宮肌瘤的生長，長期服用該GnRH類似物卻可能導致骨質疏鬆症(osteoporosis)或停經(postmenopausal symptom)等症狀，而且於停止投藥後，子宮肌瘤仍可能會繼續生長，因此僅建議使 用於特定患者。

據此，仍有必要提供一種中草藥組合物，以對抗子宮肌瘤之病症。

本發明之主要目的係提供一種用以抗子宮肌瘤之中草藥組合物，係抑制子宮肌瘤生長者。

本發明之又一目的係提供一種中草藥萃取物用以製備抗子宮肌瘤藥物之用途，係藉由萃取自該中草藥組合物之活性成分，改善子宮肌瘤之病狀，以提升患者之生活品質者。

為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段及藉由該技術手段所能達到之功效包含有：一種用以抗子宮肌瘤之中草藥組合物，係包含：以重量百分比計為25~75%之牛樟芝、20.8~62.5%之黃耆，及4.2~12.5%之益母草。

本發明之中草藥組合物，其中，該中草藥組合物係包含以重量百分比計為75%之牛樟芝。

本發明之中草藥組合物，其中，該中草藥組合物係包含以重量百分比計為20.8%之黃耆。

本發明之中草藥組合物，其中，該中草藥組合物係包含以重量百分比計為4.2%之益母草。

本發明之中草藥組合物，其中，該中草藥組合物係包含以重量百分比計為75%之牛樟芝、20.8%之黃耆，及4.2%之益母草。

一種中草藥萃取物用以製備抗子宮肌瘤藥物之用途，其中，該中草藥萃取物係藉由一包含下列步驟之方法所製得：提供如申請專利範圍第1~5項任一項所述之中草藥組合物；及於50~80℃下，以95%酒精萃取該中草藥組合物8~12小時，以獲得該中草藥萃取物；及濃縮該中草 藥萃取物；其中，該中草藥組合物及該95%酒精之重量體積比為1：2，該牛樟芝係為子實體，該黃耆係為根部，該益母草係為地上部位。

本發明之中草藥萃取物用以製備抗子宮肌瘤藥物之用途，其中，該中草藥萃取物係投予一所需個體，以預防或改善該所需個體之子宮肌瘤病症，其中，該中草藥萃取物投予該所需個體之每天投予劑量為300毫克/公斤體重，且連續投予28天。

本發明之用以抗子宮肌瘤之中草藥組合物，係藉由牛樟芝、黃耆及益母草之組成配比，降低所需個體體內之動情素及黃體素含量，可以達到抑制子宮肌瘤生長之功效。

本發明之中草藥萃取物用以製備抗子宮肌瘤藥物之用途，係藉由萃取自牛樟芝、黃耆及益母之活性成分，有效抑制子宮肌瘤之生長，使患者得以免除子宮肌瘤增長導致之痛經、不正常出血等病症，進而達到提升患者生活品質之功效。

第1圖：係第C0組大鼠之子宮切片H&E染色結果。

第2圖：係第C0組大鼠之子宮角切片H&E染色結果。

第3圖：係第C1組大鼠之子宮切片H&E染色結果。

第4圖：係第C1組大鼠之子宮角切片H&E染色結果。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明之中草藥組合物係包含牛樟芝(Antrodia cinnamomea)、黃耆(Astragalus onobrychis)及益母草(Leonurus japonicus)，藉由牛樟芝、黃耆及益母草之組成配比，該中草藥組合物係具 有抑制子宮肌瘤成長之活性。

詳而言之，該中草藥組合物係包含以重量百分比計為25~75%之牛樟芝、20.8~62.5%之黃耆，及4.2~12.5%之益母草，該中草藥組合物較佳更可以包含以重量百分比計為75%之牛樟芝、20.8%之黃耆，及4.2%之益母草，據此，該中草藥組合物即可以藉由多種活性成分之共同作用，抑制子宮肌瘤之生長，進而可以免除子宮肌瘤患者的痛經、不正常出血等病症。

其中，牛樟芝係選用皿培式牛樟芝子實體，其富含三萜類；黃耆係可以選擇豆科植物蒙古黃芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao)或膜莢黃芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.)的乾燥根，其係含有豐富的苷類、多醣體、黃酮類化合物、胺基酸及微量元素；益母草係可以選擇植物之乾燥地上部份，其含有益母草鹼、益母草定、水蘇鹼等多種生物鹼。並含苯甲酸、氯化鉀、月桂酸、亞麻酸、油酸、維生素A以及蘭香苷等黃酮類物質。

本發明之中草藥組合物係可以有效抑制子宮肌瘤之生長，因而係能夠作為一種輔助抑制子宮肌瘤之活性成分，較佳係可以將該中草藥組合物經萃取獲得之中草藥萃取物應用於製備預防或治療子宮肌瘤之藥物或保健食品，該中草藥萃取物與醫藥學上可以接受之載劑或賦形劑組合形成一醫藥組合物，其中，該中草藥萃取物係可以製備成任何方便食用之型式，如錠劑、膠囊、粉劑、粒劑或液劑等，或者將該中草藥萃取物與其他食品或飲料組合，以一適於食用之樣態供生物體以口服方式服用。

其中，該中草藥萃取物較佳係可以藉由一包含以下步驟之方法所製得：提供如上述之中草藥組合物；於50~80℃下，以95%酒精萃取該中草藥組合物8~12小時；及將萃取產物進行濃縮，以獲得該中草藥萃取物。

詳而言之，該中草藥組合物係能夠以重量體積比為1：2之比例與95%酒精混合，使該中草藥組合物所富含之多種活性成分可以溶出於該95%酒精。

於本實施例中，係取500克之中草藥組合物，以1公升之95%酒精進行萃取，於60℃定溫回流10小時，重複萃取3次，最後藉由真空過濾、減壓濃縮及冷凍乾燥，以獲得該中草藥萃取物。

又，該中草藥萃取物係可以供投予一所需個體，例如每天投予劑量為300毫克/公斤體重，且連續投予該所需個體28天，使各種活性成分得以於該所需個體體內作用，而可以抑制子宮肌瘤之生長。

為證實本發明中草藥組合物確實具有抗子宮肌瘤活性，遂進行以下試驗：

(A)中草藥萃取物之製備及活性成分含量檢測

本試驗中，各組中草藥組合物的組成比例係如第1表所示，該中草藥萃取物之製備方法係如上所述，各取500克之各組中草藥組合物，以1公升之95%酒精進行萃取後，經由過濾、濃縮及冷凍乾燥後，即可以獲得各組之中草藥萃取物。

分別秤取0.2克之各組中草藥萃取物至一螺旋試管中，加入5mL甲醇，以超音波震盪15分鐘，再以3000rpm離心10分鐘後，取5mL 上清液，置入一乾淨試管，再以100℃水浴加熱至乾燥。

續選用Purospher STAR(Merck)RP-18e(5μm)250mm×4mm管柱進行分析，以47：53之體積比混合乙腈(Acetonitrile，簡稱ACN)及0.085%之磷酸溶液作為流動相，流速為1mL/min，偵測波長為254nm之吸光值，並分析各組總三萜占總面積之百分比，紀錄於第2表。

又，另以半乳糖作為標準品，利用其濃度及吸光值製成標準曲線。續配置各組中草藥萃取溶液，取1mL之各組中草藥萃取物加入1mL之5%酚類溶液，再加入5mL濃硫酸，於靜置10分鐘後，震盪使其均勻混合，並利用分光光度計量測各組於490nm之吸光值，藉由標準曲線計算其濃度，其結果紀錄於第2表。

根據上述試驗結果，各組中草藥萃取物均富含總三萜及多醣體，其中又以第A3組之含量最高。

(B)對子宮肉瘤細胞之存活影響

本試驗係選用人類子宮肉瘤細胞(MES-SA cells)，購自食品工業發展研究所(BCRC 60333)，該子宮肉瘤細胞係培養於含有1.5mM _L-麩氨酸(_L-Glutamine)及10%胎牛血清(FBS)之90% McCoy's 5a培養液中，並置於溫度為37℃、二氧化碳濃度為5%及溼度為95%之培養箱中，每隔兩天更換一次新鮮培養液

該子宮肉瘤細胞於繼代培養時，係先將培養液及細胞以1000 rpm離心5分鐘，去除上清液後，再加入新的培養液，並且使10公分培養皿中維持細胞數為約1×10⁵至1×10⁶cells/mL。

本試驗進行時，係可以取出已經長8~9分滿之上述子宮肉瘤細胞的10公分培養皿，去除已變色之培養液，以8mL之PBS緩衝溶液沖洗細胞一次，加入胰蛋白酶/乙二胺乙酸(Trypsin/EDTA)反應1~3分鐘後，輕搖培養皿使細胞自壁上脫落，加入已回溫的培養液，輕輕將細胞沖散，再將含細胞之培養液分別置入離心管內，以1500rpm離心10分鐘，除去上清液後，再加入含血清之培養液，使細胞分散均勻，並取出20μL之細胞，加入20μL 0.04%之錐蟲藍(Trypan Blue)進行染色，放入細胞計數器，並於顯微鏡下計數活細胞數，細胞存活率必須不小於85%才可以進行後續試驗。

以含血清之培養液將上述子宮肉瘤細胞之濃度調整為1x10⁵cell/mL，並且各取100μL之該子宮肉瘤細胞接種於96孔盤，使每個槽孔含有1x10⁴細胞，並於溫度為37℃、二氧化碳濃度為5%之培養箱進行隔夜培養。

經過24小時培養後，分別加入100μL如第3表所示之中草藥萃取物(濃度為2mg/mL，溶於DMSO中)，混合均勻後，於溫度為37℃，二氧化碳濃度為5%之培養箱續隔夜培養24小時。

* 存活率之換算公式：「各組之吸光值」/「未經任何藥物處理之控制組吸光值」×100%。

24小時後，移除培養液，以磷酸緩衝液沖洗後，再加入100μL含有CCK-8之新鮮培養液，置於溫度為37℃，二氧化碳濃度為5%之培養箱反應2小時後，震搖5分鐘後，偵測每個槽孔於450nm波長下之吸光值，並依未經任何藥物處理之控制組的吸光值結果計算存活率，紀錄於第3表。

請參照第3表所示，依據上述試驗結果，該中草藥萃取物確實具有抑制子宮肉瘤細胞生長之能力，且係以第A3組中草藥萃取物具有最佳效力，是以續利用該第A3組中草藥萃取物進行後續試驗。

(C)對子宮肉瘤大鼠之影響

本試驗係選用購自財團法人國家實驗研究院國家實驗動物中心之Wistar雌性大鼠，該些大鼠皆在8週週齡以上，體重介於180~190克之間。該些大鼠係飼養於大仁科技大學動物中心，維持室溫為20~22℃之動物室，光照時間與黑暗時間各為12小時，該些大鼠可以自由進食及飲水。

分別經胃管將RO水(第C0組)或第A3組中草藥萃取物(第C1組)投予大鼠(投予劑量為每天每公斤大鼠投予300毫克之中草藥萃取物)，同時藉由腹腔注射投予動情素(劑量為200微克/次)，每日紀錄各組大鼠之體重、攝食量及飲水量，於4週後，自腹腔動脈採血，量測血液中之動情素及黃體素(progesterone)含量，並取出子宮，進行組織切片及H&E染色(hematoxylin-eosin)，其結果分別如第4表及第1~4圖所示。

請參照第4表，本試驗各組之大鼠於28天後之體重、攝食量、飲水量並無顯著差異，而投予該中草藥萃取物之第C1組大鼠血液中之動情素及黃體素含量則有明顯下降(對動情素之抑制率達47.5±4.8%，而對對黃體素之抑制率為33.1±5.1%)，顯示該中草藥萃取物確實具有降低體內動情素及黃體素含量之能力。

續參照第1及2圖，分別為第C0組大鼠之子宮、子宮角之組織切片染色結果，子宮平滑肌細胞係呈現肥大狀態(hypertrophy)，具有嗜伊紅性細胞質，細胞邊界較不清楚、排列交錯、紊亂，且無法觀察到細胞有絲分裂現象，顯示已成功誘導使第C0組大鼠形成子宮肌瘤；又，請參照第3及4圖，第C1組大鼠之組織染色切片結果顯示，口服該中草藥萃取物可以成功抑制子宮平滑肌增生及肥大情形，顯示該中草藥萃取物確實具有改善子宮平滑肌增生、肥大現象之活性。

綜合上述，本發明之用以抗子宮肌瘤之中草藥組合物，係藉由牛樟芝、黃耆及益母草之組成配比，降低所需各體體內之動情素及黃體素含量，可以達到抑制子宮肌瘤生長之功效。

再者，本發明之中草藥萃取物用以製備抗子宮肌瘤藥物之用途，係藉由萃取自牛樟芝、黃耆及益母之活性成分，有效抑制子宮肌瘤之生長，使患者得以免除子宮肌瘤增長導致之痛經、不正常出血等病症，進而達到提升患者生活品質之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (7)

1. 一種用以抗子宮肌瘤之中草藥組合物，係包含：以重量百分比計為25~75%之牛樟芝、20.8~62.5%之黃耆，及4.2~12.5%之益母草。
2. 如申請專利範圍第1項所述之中草藥組合物，其中，該中草藥組合物係包含以重量百分比計為75%之牛樟芝。
3. 如申請專利範圍第1項所述之中草藥組合物，其中，該中草藥組合物係包含以重量百分比計為20.8%之黃耆。
4. 如申請專利範圍第1項所述之中草藥組合物，其中，該中草藥組合物係包含以重量百分比計為4.2%之益母草。
5. 如申請專利範圍第1項所述之中草藥組合物，其中，該中草藥組合物係包含以重量百分比計為75%之牛樟芝、20.8%之黃耆，及4.2%之益母草。
6. 一種中草藥萃取物用以製備抗子宮肌瘤藥物之用途，其中，該中草藥萃取物係藉由一包含下列步驟之方法所製得：提供如申請專利範圍第1~5項任一項所述之中草藥組合物；於50~80℃下，以95%酒精萃取該中草藥組合物8~12小時；及將萃取產物進行濃縮，以獲得該中草藥萃取物；其中，該中草藥組合物及該95%酒精之重量體積比為1：2，該牛樟芝係為子實體，該黃耆係為根部，該益母草係為地上部位。
7. 如申請專利範圍第6項所述之中草藥萃取物用以製備抗子宮肌瘤藥物之用途，該中草藥萃取物係投予一所需個體，以預防或改善該所需個體之子宮肌瘤病症，其中，該中草藥萃取物投予該所需個體之每天投予劑量為300毫克/公斤體重，且連續投予28天。