CN113384590B - 栎樱酸在制备治疗胰腺癌的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种栎樱酸在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。本发明提供的天然药物栎樱酸，是一类可从龙胆科植物大叶秦艽的干燥根中提取到的天然成分，具有抗炎等作用。本发明以胰腺癌PANC‑1细胞为研究对象，通过栎樱酸作用胰腺癌PANC‑1细胞后，发现1‑10μM的栎樱酸可以显著抑制细胞的存活率，并可增加细胞Caspase‑3活性，促进细胞凋亡，当使用5μM的栎樱酸作用细胞后，通过对细胞的迁移率和侵袭率的分析，发现栎樱酸可以显著抑制细胞的迁移和侵袭能力，通过对体内动物实验研究，证实了栎樱酸在不影响动物体重的情况下，可以有效抑制异种移植瘤的形成。

Description

栎樱酸在制备治疗胰腺癌的药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种栎樱酸在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
背景技术
胰腺癌仍然是最致命的癌症类型之一，世界各地胰腺癌发病率和死亡率的趋势差异很大，发达国家的胰腺癌发病率和死亡率最高。到目前为止，胰腺癌的病因仍然不完全清楚，但可以确定的是吸烟、肥胖、基因、糖尿病、饮食不规范等均可增加胰腺癌患病的几率。
尽管其他常见癌症的发病率和死亡率一直在下降，但胰腺癌的发病率和死亡人数却在逐渐上升。随着技术的发展，胰腺癌的检测和治疗也取得了相应的进展，但仍只有约4％的患者能在确诊后存活5年。到目前为止，手术切除仍是胰腺癌患者的唯一治疗选择，但由于胰腺癌早期诊断技术缺乏，通常发现于晚期，只有不到20％的患者可以通过手术切除疾病。对于晚期患者，通常使用化学药物治疗。此外，由于胰腺癌患者先天或后天产生的耐药性，大多数化疗药物对胰腺癌的疗效较差。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种栎樱酸在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
栎樱酸是一种可从龙胆科植物大叶秦艽的干燥根中提取出来的天然成分。本发明通过栎樱酸对胰腺癌PANC-1细胞的存活率、凋亡率、迁移率、侵袭率以及异种移植瘤的抑制率等研究，探讨栎樱酸的抗癌作用，为胰腺癌的化疗研究提供新的理论基础。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种栎樱酸在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述治疗胰腺癌的药物剂型为胶囊剂、片剂、口服制剂、微囊制剂、注射剂、栓剂、喷雾剂或软膏剂。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述药物用于皮下注射、静脉注射、肌肉注射或经鼻给药。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述药物中栎樱酸浓度为0.5-10μM。优选的，所述的栎樱酸浓度为1-10μM。更为优选的，所述的栎樱酸浓度为0.5μM。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括栎樱酸。
作为本发明所述药物组合物的优选实施方式，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
作为本发明所述药物组合物的优选实施方式，所述药物组合物中栎樱酸浓度为0.5-10μM。
本发明的有益效果：
栎樱酸是一种天然药物，有研究证明栎樱酸在抗炎活性上具有良好作用，但其在抗肿瘤作用上未见报道，我们发现栎樱酸直接作用PANC-1细胞后，可以抑制细胞的生长，诱导细胞凋亡，与其抗炎作用无关。在胰腺癌的临床化疗中，标准的一线化疗药物吉西他滨因为患者的耐药性从而被极大的阻碍了治疗效果，因此开发新的具有抗胰腺癌潜能的药物是一项十分有必要的举措。
附图说明
图1为本发明实施例1中栎樱酸对胰腺癌PANC-1细胞的活性影响；
图2为本发明实施例2中栎樱酸对胰腺癌PANC-1细胞的凋亡影响，其中图2A表示药物作用后细胞凋亡率，图2B所示为药物作用后对细胞的Caspase-3活性影响；
图3为本发明实施例3中栎樱酸对胰腺癌PANC-1细胞的迁移率分析，其中图3A所示为显微镜下观察细胞划痕区域及药物作用后划痕愈合的效果图，图3B所示为5μM栎樱酸作用细胞后的迁移率影响；
图4为本发明实施例4中栎樱酸对胰腺癌PANC-1细胞的侵袭率分析，其中图4A、4B分别表示为对照组(无药物)、实验组(栎樱酸5μM)显微镜下细胞的侵袭能力，图4C所示为细胞侵袭率；
图5为本发明实施例5中栎樱酸对胰腺癌PANC-1细胞小鼠的异种移植瘤的抑制作用，其中图5A表示对照组(无药物)和实验组(栎樱酸5mg/kg)的平均肿瘤体积，图5B表示对照组和实验组小鼠体重。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
实施例1栎樱酸对胰腺癌细胞PANC-1的活性影响
将人胰腺癌细胞PANC-1以0.2×105个/ml的密度接种到35mm的培养皿中，每皿2ml，置于5％CO2、37℃培养箱中培养24h。设置对照组和实验组，栎樱酸用DMSO溶解，DMSO不超过0.2％。实验组栎樱酸的浓度分别为0.5μM、1μM、2μM、5μM、10μM。给药后，培养箱中继续作用72h，用台盼蓝拒染法检测细胞活性。细胞活性(％)＝(活细胞数/总细胞数)×100％。
实验结果如图1所示，不同栎樱酸处理的PANC-1细胞，其存活率随药物浓度的增加呈剂量依赖性降低。与对照组相比，0.5μM的栎樱酸作用细胞后，对细胞活性影响不明显，而当1μM(*p<0.05)、2μM(***p<0.001)、5μM(***p<0.001)、10μM(***p<0.001)栎樱酸作用PANC-1细胞时，差异具有统计学意义，细胞活性显著降低。
实施例2栎樱酸对胰腺癌细胞PANC-1的凋亡分析
将人胰腺癌细胞PANC-1以0.2×105个/ml的密度接种到35mm的培养皿中，每皿2ml，置于5％CO2、37℃培养箱中培养24h。设置对照组和实验组，实验组栎樱酸的浓度分别为0.5μM、1μM、2μM、5μM、10μM。给药后，培养箱中继续作用72h，碘化丙啶染色法和Caspase-3活性检测细胞凋亡。
实验结果如图2所示，不同栎樱酸处理的PANC-1细胞，其细胞凋亡与Caspase-3活性随药物浓度的增加呈剂量依赖性增加。Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。当栎樱酸为1μM(*p<0.05)、2μM(***p<0.001)、5μM(***p<0.001)、10μM(***p<0.001)时，碘化丙啶染色法显示此时栎樱酸的浓度可显著促进细胞凋亡，其凋亡作用是通过增加Caspase-3活性实现的。
碘化丙啶染色法测得的细胞凋亡的计算公式为：凋亡率＝(凋亡细胞数/总细胞数)×100％。
实施例3栎樱酸抑制PANC-1细胞的迁移研究
栎樱酸对PANC-1细胞的迁移作用由细胞划痕实验进行探讨。在该实验中，以细胞密度1×106个/孔接种到6孔板上，当细胞密度长到95％以上时，取出培养基，用200μl无菌枪头枪尖划痕细胞表面，用PBS洗涤两次去除漂浮细胞。设置对照组(无药物)和实验组(5μM)，培养基中血清含量为1％，培养箱培养24h。
结果如图3所示，5μM栎樱酸作用24h后，PANC-1细胞的迁移能力明显受到抑制。图3A显示了在迁移实验中，对照组和5μM栎樱酸组处理的细胞在0h和24h划痕区域的显微图。迁移率可用Image J软件计算细胞移动的距离，根据在特定时间内细胞移动的距离可以判断药物对细胞迁移能力的影响，计算公式为：细胞迁移率(100％)＝(给药组0h距离-给药组24h距离)/(对照组0h距离-对照组24h距离)×100％。24h后，对照组细胞大部分划痕区域实现了“划痕愈合”，而栎樱酸处理的细胞划痕区域只“愈合”了一小部分。图3B显示了对照细胞和栎樱酸处理后PANC-1细胞的迁移率。与对照细胞相比，栎樱酸处理的细胞迁移率显著降低(***p<0.001)。这些结果表明，栎樱酸可以显著降低胰腺癌PANC-1细胞的迁移能力。
实施例4栎樱酸抑制PANC-1细胞的侵袭研究
用transwell法检测栎樱酸对胰腺癌细胞侵袭的影响。transwell(孔径8μm)涂有制造商所述的Matrigel基质。将PANC-1细胞以4×105个/孔的密度接种于顶部室无血清DMEM培养基(200μL)中，用栎樱酸处理。下腔填充800μL DMEM，并添加20％胎牛血清。37℃孵育24小时后，用甲醇固定细胞，0.1％结晶紫染色。染色结束后，用PBS清洗小室三次，通风橱晾干。晾干后，将小室放在载玻片上，显微镜拍照，image J计算计数穿过膜的细胞数，随机计数每层膜上的细胞数量，测定细胞的侵袭力。计算公式为：细胞侵袭率(％)＝(实验组穿过膜的细胞数)/(对照组穿过膜的细胞数)×100％。
图4A、B分别为对照组和栎樱酸处理组侵袭细胞的显微图。如图4C所示，经栎樱酸处理的细胞的细胞侵袭率明显低于对照细胞。本发明表明，栎樱酸对PANC-1细胞的侵袭具有明显的抑制作用(***p<0.001)。
实施例5栎樱酸对PANC-1异种移植瘤的抑制作用
在体内的研究中，将雌性重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠(6-7周龄)安置在无菌滤嘴微隔离笼中，并提供无菌食物和饮水。PANC-1细胞重悬于Matrigel：DMEM培养基＝1:1的混合液中，以2×104个/0.1ml每鼠，皮下注射于小鼠右侧腹侧。注射后，检查小鼠的肿瘤形成情况。当肿瘤达到100mm3时，将小鼠随机分为两组(8只/组)。小鼠每隔一天注射无药物的溶剂对照(第一组)或栎樱酸5mg/kg(第二组)，连续3周。每周记录一次肿瘤大小和体重。计算肿瘤体积的公式为：体积≈(长度×宽度2)/2。
动物实验结果如图5所示，栎樱酸对PANC-1肿瘤的生长有抑制作用(如图5A所示)。实验结束时，对照组肿瘤起始体积百分比为266.1±39.3，栎樱酸治疗组为174.9±24.9。采用t检验进行统计分析，结果显示，对照组与治疗组肿瘤体积差异有统计学意义(***p<0.001)。在这项动物研究中，药物治疗组的体重与对照组相比没有明显下降，实验结束时，对照组体重为21.2±2.0，栎樱酸处理组为20.0±2.3。t检验结果显示，对照组与栎樱酸处理组的体重无显著性差异(p>0.05)。这些结果表明，栎樱酸在不影响动物的体重下，能有效抑制PANC-1肿瘤的生长。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.栎樱酸在制备治疗胰腺癌的药物中的应用，其特征在于，所述药物中栎樱酸浓度为0.5-10μM；所述栎樱酸作为唯一活性成分。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗胰腺癌的药物剂型为口服制剂或注射剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述口服制剂为胶囊剂、片剂或微囊制剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物用于皮下注射、静脉注射、肌肉注射或经鼻给药。
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