CN106074564B - 熊果酸在制备抗包虫药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗包虫病的新型药物的发现研究，公开了熊果酸在制备抗包虫药物中的应用。本发明通过深入研究熊果酸对细粒棘球蚴的作用效果，探索其作为抗包虫药物新药的应用前景。经实验验证，熊果酸作用于体外培养的细粒棘球蚴生发层细胞，对细胞活性表现出显著的抑制效果；熊果酸对体外培养的细粒棘球蚴原头节内部结构亦有一定的损伤。熊果酸是一种高效的抗包虫新型药物，为治疗包虫病提供了一种新的途径和手段。

Description

熊果酸在制备抗包虫药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种化合物的医药用途，具体涉及熊果酸在制备抗包虫药物中的应用，属于生物医药领域。
背景技术
包虫病(Echinococcosis)，又称为棘球蚴病(Hydatid diseases)，是世界卫生组织公布的17种被忽视的热带病之一。患者误食入被虫卵污染的食物、水源或者接触感染的病犬等后，寄生虫可在其体内进一步发育，形成棘球蚴，其生长较为缓慢，主要产生占位性病变。若无有效治疗，患者会逐渐丧失劳动能力甚至死亡。据不完全统计，我国包虫病患者高达60～70万，受威胁人群约为达6600万以上。包虫病严重危害人民健康并给畜牧业带来了巨大的经济损失，国家卫生和计划生育委员会《2015年卫生计生工作要点》中提到要“继续实施艾滋病、结核病、疟疾、包虫病、麻风等重点传染病及地方病防治规划和行动计划”。
目前，手术治疗是包虫病治疗的首选方法，但鉴于包虫病的发病特点，病程长，发现时大多数以为晚期，药物治疗仍然是我国广大包虫病患者的主要治疗方法。现阶段临床治疗药物仅为阿苯达唑和甲苯达唑两种，且受到药物吸收差等因素的影响，治愈率仅为30％左右。现有药物难以满足目前包虫病治疗需求，亟待找到新的有效替代药物和药物靶点，加速包虫病药物研发，提高药物治疗效果，减轻患者疾病负担。
申请人长期研究发现，具有抗癌效果的熊果酸也具有抗包虫的效果，且该效果目前国内外尚未见报道。熊果酸(化学结构式(I))是一种存在于天然植物中的三萜类化合物，最早在果皮中发现，除此之外，各种香草和香料中亦有熊果酸成分。据报道，熊果酸具有多种药理作用，如镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗溃疡、降低血糖以及提高免疫力等。近年来研究发现，熊果酸在体外可通过抑制STAT3(信号转导及转录活化因子3，signal transducerstrallscription 3)活化等途径抑制多种肿瘤细胞的生长。
目前抗包虫药物的研究工作较为缓慢，熊果酸具有抗包虫效果的发现为治疗包虫病提供了新的思路，有望丰富包虫病的治疗手段。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供熊果酸的新用途，即在制药中的新应用。
本发明是通过深入研究熊果酸对细粒棘球蚴的作用效果，探索其作为抗包虫药物新药的应用前景。实验结果表明，熊果酸能够抑制细粒棘球蚴生发层细胞的生长，对原头节的内部结构亦有一定的损伤，是一种高效的抗包虫新型药物。
本发明的技术方案是：本发明提供熊果酸在制备抗包虫药物中的应用。
进一步地，所述熊果酸具有抑制细粒棘球蚴生发层细胞活性的功能。
进一步地，所述熊果酸具有抑制细粒棘球蚴原头节活性的功能。
进一步地，所述熊果酸抑制细粒棘球蚴生发层细胞活性的有效药物作用浓度为4μg/ml以上。
进一步地，所述熊果酸抑制细粒棘球蚴原头节活性的有效药物作用浓度为40μg/ml以上。
进一步地，所述抗包虫药物含有药学上有效量的熊果酸以及药学上可接受的载体。
进一步地，所述药物被制成任何一种药学上可接受的剂型。
进一步地，所述任何一种药学上可接受的剂型包括混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂等。
本发明评价熊果酸对体外培养的细粒棘球蚴生发层细胞和原头节的作用效果，步骤如下：
1)生发层细胞和原头节的体外培养
从继发感染的小鼠体内取出棘球蚴囊，分离生发层细胞。将上述生发层细胞和培养基加入培养瓶中，放置于5％CO2、相对湿度为95％的37℃温箱培养。
在流行区采集棘球蚴囊，分离和清洗囊中的原头节。将上述原头节和培养基加入培养瓶中，放置于5％CO2、相对湿度为95％的37℃温箱培养。
2)熊果酸的作用效果评价
将不同浓度的熊果酸溶液(4-40μg/ml)分别加入到培养的生发层细胞和原头节中，观察其药物作用效果。
实验结果表明，熊果酸浓度在8-40μg/ml的范围内，对细粒棘球蚴生发层细胞的活性的抑制率高达64.68±11.22％以上。熊果酸作用浓度为40μg/ml时，造成细粒棘球蚴原头节的死亡率为45.95±5.30％；该药物浓度作用下，细粒棘球蚴原头节的超微结构亦发生一定的改变。可见，熊果酸作用于体外培养的细粒棘球蚴生发层细胞，对细胞活性表现出显著的抑制效果；熊果酸对体外培养的细粒棘球蚴原头节内部结构亦有一定的损伤。熊果酸具有显著的抑制细粒棘球蚴生发层细胞和原头节活性的作用，具有较强的抗包虫效果，是一种高效的抗包虫新型药物，为治疗包虫病提供了一种新的途径和手段。
附图说明
图1是本发明实施例1中细粒棘球蚴生发层细胞经熊果酸作用后光镜观察结果示意图，其中，A代表正常细胞；B代表药物作用后细胞。
图2是本发明实施例2中细粒棘球蚴原头节经熊果酸作用后电镜观察结果示意图，其中，A代表正常原头节；B代表药物作用后原头节。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1熊果酸对体外培养的细粒棘球蚴生发层细胞的作用效果评价
1)细粒棘球蚴生发层细胞的制备
继发棘球蚴小鼠模型的建立：在流行区采集棘球蚴囊，取出并用HBSS
(Hanks Balanced Salt Solution-，Hanks平衡盐溶液，一般用于配制细胞培养过程中的培养基或者清洗细胞)清洗其中的原头节。接种时将原头节稀释至4000只/ml备用。用1ml注射器吸取原头节悬液0.5ml，用75％酒精擦涂小鼠皮肤，将原头节注入小鼠腹腔内。该模型建立8-10月后可用于后续实验。
生发层细胞的分离：剖检上述小鼠，取出其体内的棘球蚴囊，用生理盐水清洗囊3-5次后将其剪碎后加入0.25％胰酶，37℃消化10-30分钟，离心后沉淀即为生发层细胞团。
2)细粒棘球蚴生发层细胞的培养
将制备的细胞用培养基调节密度为5×104个/ml，铺板后置于5％CO2、相对湿度为95％的37℃温箱培养，每2-3天换液一次。
3)熊果酸的药效评价方法
将培养的生发层细胞调整密度为5×104个/ml加入96孔培养板中，每孔加入200μl培养基，分别加入待测熊果酸不同浓度的溶液(用DMSO进行稀释)，使终浓度为4、8、10、20、40μg/ml。给药后72小时，用CCK-8试剂盒(购自于日本Dojondo公司)测定细胞活性。
计算该待测药物对生发层细胞活性的抑制率：细胞活性抑制率＝[(对照度吸光度值-调零孔吸光度值)-(药物组吸光度值-调零孔吸光度值)]/(对照度吸光度值-调零孔吸光度值)×100％。
4)熊果酸对细粒棘球蚴生发层细胞的作用效果
经药物作用72小时后，熊果酸浓度为8-40μg/ml时，对细粒棘球蚴可达64.68±11.22％％以上的抑制效果，当药物浓度降低为4μg/ml以下时，则无效(详见表1)。在显微镜下观察发现，正常生发层细胞结构清晰，有一定的透明度，贴壁生长，呈现圆形或者三角形；而药物作用后的生发层细胞颜色加深，细胞之间的连系减少，细胞有聚成团的趋势(见图1)。
表1不同浓度熊果酸对细粒棘球蚴生发层细胞的抑制作用
实施例2熊果酸对体外培养的细粒棘球蚴原头节的作用效果评价
1)细粒棘球蚴原头节的制备
棘球蚴原头节的采集：在流行区采集棘球蚴囊，吸取含有原头节的囊液，将此囊液倾至容量为50ml的圆底离心管中，自然沉淀10min后，去上清液，随后用生理盐水将含原头节的沉淀物洗涤5-8次。在倒置显微镜下计数，并观察原头节存活状况。
2)细粒棘球蚴原头节的体外培养
培养器皿可用25cm2培养瓶，将上述处理后的原头节和培养基加入培养瓶中，然后置于5％CO2、相对湿度为95％的37℃温箱培养，每4-5天换液一次。3)熊果酸的药效评价方法
将培养的原头节加入96孔培养板中，每孔加入200μl培养基，分别加入待测熊果酸不同浓度的溶液(用DMSO进行稀释)，使终浓度为4、8、10、20、40μg/ml。给药后72小时，用美兰染液对原头节进行染色，死亡的原头节会被染成深蓝色，计数进行原头节活性计算。
原头节活性＝活的原头节数目/原头节总数×100％。
4)电镜观察
将药物作用后的原头节用PBS清洗2-3次，加入2.5％的戊二醛4℃固定2小时以上。经过一系列的清洗、固定、包埋、切片和染色等步骤处理后，上机对样本进行观察。
5)熊果酸对细粒棘球蚴原头节的作用效果
经药物作用72小时后，仅在40μg/ml浓度造成原头节的死亡率为45.95±5.30％，其余浓度未对原头节的活性有明显的作用效果(详见表2)。扫描电镜发现，对照组正常原头节表皮合胞体结构致密，内部各种细胞和囊泡排列整齐；同对照组正常原头节相比，药物作用后的原头节表面较为粗糙，合胞体结构发生轻微肿胀，内部各种细胞和结构出现空泡(见图2)。
表2不同浓度熊果酸对细粒棘球蚴原头节活性的影响

Claims (7)

1.熊果酸在制备抑制细粒棘球蚴生发层细胞活性的药物中的应用。
2.熊果酸在制备抑制细粒棘球蚴原头节活性的药物中的应用。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述熊果酸抑制细粒棘球蚴生发层细胞活性的有效药物作用浓度为4μg/ml以上。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述熊果酸抑制细粒棘球蚴原头节活性的有效药物作用浓度为40μg/ml以上。
5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述抗包虫药物含有药学上有效量的熊果酸以及药学上可接受的载体。
6.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物被制成任何一种药学上可接受的剂型。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述任何一种药学上可接受的剂型选自混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂。
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