CN103330945A - 平阳霉素联合透明质酸钠在治疗淋巴管畸形药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了平阳霉素联合透明质酸钠在治疗淋巴管畸形药物中的应用，以及一种用于治疗淋巴管畸形的药物，特别是用于治疗微囊型淋巴管畸形的药物。本发明采用平阳霉素联合透明质酸钠，其在抑制人淋巴管畸形内皮细胞增殖和促进凋亡方面都强于单纯的平阳霉素。其中，所述透明质酸钠的分子量为600,000～1,500,000道尔顿，平阳霉素和透明质酸钠的浓度分别为100μg/mL和300μg/mL。

Description

平阳霉素联合透明质酸钠在治疗淋巴管畸形药物中的应用

技术领域

本发明涉及平阳霉素联合透明质酸钠在治疗淋巴管畸形药物中的应用。

背景技术

淋巴管畸形属于先天性脉管畸形，根据脉管疾病的临床特征和组织生物学特点，淋巴管瘤归类为淋巴管畸形，分为大囊型和微囊型。约50%淋巴管畸形患者在出生时即被发现，80%～90%的病变在两岁内发生，好发于舌、颈、颊、及唇部。其发病机制不明，有专家认为，淋巴管畸形可能与编码VEGF-C、VEGFR-3、FOX-C2及SOX-18的基因突变有关。淋巴管畸形虽是良性病损，但其自然消退率约为2%-12.5%，部分患者可因病变组织的创伤、感染而迅速增大，压迫呼吸道而引起呼吸困难、言语及进食障碍，严重情况下甚至危及生命。因此，临床应给予足够的重视并积极治疗。以往对淋巴管畸形的治疗以手术切除为主，由于淋巴管畸形的管壁菲薄，病变常与头颈部重要结构毗邻及具有局部浸润性，术中易发生血管神经的损伤，手术难以完整切除。文献报道术后并发症发生率11.58%～37.80%，且有11.67%～48.28%的复发率，这给临床治疗带来了很大困难。

目前，淋巴管畸形的治疗主要采用硬化剂注射治疗，其中平阳霉素(Pingyangmycin,PYM)局部注射硬化治疗淋巴管畸形取得较满意的疗效，临床使用具有见效快、活性强、疗程短，对免疫和造血功能基本无害等特点。其作用机制是抑制细胞DNA合成和切断DNA链，促使细胞变性、坏死。在淋巴管畸形治疗中，局部注射平阳霉素，通过破坏囊腔壁内皮细胞，减少淋巴液生成，腔内产生无菌性炎症，导致纤维结缔组织增生，使囊腔逐渐消失，从而达到治疗的效果。

虽然平阳霉素治疗淋巴管畸形临床应用广泛并取得了较好的效果，但也存在一些问题。①平霉素的副作用较小，但合并肾功能不全时会增加肺纤维化等风险。因此需控制剂量，及时检查肺部情况等。②由于微囊型淋巴管畸形具有多个囊腔，难以将腔内液体全部抽出，药物不能与瘤体内全部的囊壁充分接触，而导致效果不佳。平阳霉素对大囊型治愈率为84.38%，对微囊型治愈率只有38.88%。③由于药物剂量的限制，不能同时对婴幼儿颌面部大面积淋巴管畸形的所有病变区域给药，存在病变范围与用药剂量的矛盾。④对于头颈部面积较大的病变，淋巴循环丰富，回流较快，平阳霉素注射后很快被稀释，作用时间短，且很难直接与囊壁接触而发挥作用，故临床效果不理想，如果提高药物剂量或浓度，也会使相应的副作用增加。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供了平阳霉素联合透明质酸钠在治疗淋巴管畸形药物中的应用，以及一种用于治疗淋巴管畸形的药物，特别是用于治疗微囊型淋巴管畸形的药物。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

平阳霉素联合透明质酸钠在治疗淋巴管畸形药物中的应用，其中，所述透明质酸钠的分子量为600,000～1,500,000道尔顿。

所述的平阳霉素和透明质酸钠的浓度分别为100μg/mL和300μg/mL。

一种用于治疗淋巴管畸形的药物，它含有作为活性成分的平阳霉素和透明质酸钠，以及药物可接受的载体；其中，所述透明质酸钠的分子量为600,000～1,500,000道尔顿，平阳霉素和透明质酸钠的浓度分别为100μg/mL和300μg/mL。

本发明的有益效果：

透明质酸钠(Sodium hyaluronate,简称HA)，广泛存在于动物和人体的生理活性物质，在人皮肤、关节滑膜液、脐带、房水及眼玻璃体中均有分布，是一种可天然降解、可吸收的生物医学材料，由于其自身的高粘性、渗透性等特点而被用作药物缓释剂。平阳霉素治疗淋巴管畸形的疗效是被普遍认可的，但其缺点是：①不仅作用于淋巴管内皮细胞，起到治疗淋巴管畸形的目的，还对它所接触到的所有非淋巴管内皮细胞发挥作用，产生临床上所见到的毒副作用；②很容易随组织液或血液流走，因而作用时间较短暂；③平阳霉素可以产生非常严重的过敏反应，如果在数分钟内得不到成功的抢救，往往出现患者死亡；④即便不产生过敏，较大剂量的平阳霉素会对机体产生副作用，比如肺纤维化等。

透明质酸钠分为高分子量和低分子量两种，只有前者才能用于药物载体。本发明所用的分子量为600,000～1,500,000道尔顿，是目前唯一的临床上可以应用的高分子量药物。

可以用于平阳霉素药物的载体具有众多的选择，除了透明质酸钠之外，尚有医用胶原、纳米颗粒、医用蛋白胶等等。由于淋巴管内皮细胞膜上有透明质酸的受体，本发明采用透明质酸的盐，即透明质酸钠作为载体，保证了平阳霉素特异性作用于淋巴管内皮细胞，而几乎不对其它细胞发生毒副作用。在以上科学分析和筛选的基础上，我们特异性地选择了透明质酸钠作为平阳霉素的载体，并且将透明质酸钠与平阳霉素通过实验科学配比，使平阳霉素能够定向、特异性地与淋巴管内皮细胞发挥作用（即靶向药物治疗），从而解决了平阳霉素的前述所有缺点。

另外，本申请筛选出了平阳霉素和透明质酸钠的最优浓度配比，即两者的浓度分别为100μg/mL和300μg/mL。在其他浓度下，平阳霉素和透明质酸钠的配合也起到抑制淋巴管内皮细胞生长的作用，但效果次于该浓度配比。

附图说明

图1是从组织块中爬出的HLMECs(×200)；

图2是原代HLMECs(×200)；

图3是淋巴管畸形组织，LYVE1阳性表达(×100)；

图4是淋巴管畸形组织，PROX1阳性表达(×100)；

图5是HLMECs中LYVE1呈阳性表达(×400)；

图6是HLMECs中PROX1呈阳性表达(×400)；

图7是不同浓度的PYM作用不同时间后细胞的吸光度值；

图8是不同浓度的HA作用不同时间后细胞的吸光度值；

图9是药物作用后HLMECs生长曲线；

图10是TUNEL检测细胞凋亡图片，10a）Control组，细胞活力旺盛，几乎没有凋亡细胞；10b）HA组，极少数细胞出现凋亡显现；10c）PYM组，部分细胞出现凋亡；10d）PYM+HA组，凋亡细胞更明显；

图11是细胞凋亡统计图，四组细胞同等视野下核棕染的细胞/全部细胞的比率。Control组与HA组相比无统计学差异，PYM+HA组与PYM组相比有统计学差异。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：

本发明所涉及的一种用于治疗淋巴管畸形的药物的制备：

取平阳霉素8mg，透明质酸钠20mg，加入制备注射剂的药物可接受的载体，配制得到6mL注射剂。由于淋巴管瘤中的液体不可能完全抽出来而被置换成该浓度的药物，打到肿瘤内的平阳霉素和透明质酸钠的实际浓度约为100μg/mL和300μg/mL。

透明质酸钠为市购的玻璃酸钠注射液，山东博士伦福瑞达制药有限公司，批准文号：国药准字H10960136。

下面通过药效学实验来进一步说明其药物活性。

试验例

1.材料

1.1标本来源收集山东大学齐鲁医院手术切除的1例2个月未进行任何治疗的淋巴管畸形组织。患儿监护人对本申请的研究内容知情同意。

1.2主要试剂内皮细胞培养基(Endothelial cell medium,ECM)，Sciencell公司；LYVE1兔抗人多克隆抗体，Abcam公司；PROX1兔抗人多克隆抗体，Abcam公司；MTT试剂盒，Sigma公司；TUNEL试剂盒，Sigma公司。

2.方法

2.1组织块法培养HLMECs在超净台中，将淋巴管畸形组织洗净，修剪成2cm³大小的组织块，加入质量浓度0.25%的胰蛋白酶，37℃水浴箱中消化15min，再加入等体积含质量浓度10%胎牛血清的ECM培养液中止消化；将消化后的组织块修剪成1mm³碎块，接种于事先用质量浓度1%明胶包被的六孔板内，孵箱内倒置20min。然后六孔板每孔加入1mL ECM，使培养液缓慢浸润组织块，放入孵箱内培养；接种后1周后去除组织块，更换培养液后继续培养；每3天更换1次培养液；细胞汇合成片铺满板底时按1:3比例传代培养。于倒置相差显微镜下观察HLMECs的形态特征和生长情况。

2.2HLMECs的鉴定用淋巴管内皮细胞标记物LYVE1和PROX1经过免疫化学染色法联合检测HLMECs和淋巴管畸形组织。免疫细胞化学法取培养第3代的细胞，按试剂盒说明书进行操作。

2.3确定最适药物浓度实验将HLMECs以1×10⁴/mL细胞密度接种于96孔板，每孔100μL，细胞生长至铺满孔底80%时，实验组加入不同浓度的PYM（1、10、100、1000μg/mL）和HA（50、100、300、500μg/mL），每个浓度设五个复孔，并设不加药对照组，继续培养不同时间（12、24、48h）后，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，继续孵育4h，移去培养液，加入150μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，在酶标仪上于490nm波长测吸光度值（OD value），实验重复3次，确定合适的PYM和HA作用于HLMECs的浓度。

2.4MTT检测药物作用后HLMECs的增殖将HLMECs以1×10⁴/mL细胞密度接种于96孔板，每孔100μL，细胞生长至铺满孔底80%时，实验分四组：PYM组、HA组、PYM联合HA组（PYM+HA组）和不加药对照组（Control组）。每组五个复孔。培养不同时间（0、12、24、48h）后，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，继续孵育4h，移去培养液，加入150μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，在酶标仪上于490nm波长测吸光度值（OD value）。

2.5TUNEL法检测药物作用后HLMECs的凋亡将HLMECs以1×10⁴/mL细胞密度接种于48孔板，每孔200μL，细胞生长至铺满孔底80%时，实验组分四组：PYM组、HA组、PYM+HA组和不加药对照组（Control组）。每组五个复孔。继续培养24小时后，按照TUNEL试剂盒说明书进行操作。

2.6统计学分析。采用SPSS15.0软件，采用t检验和q检验，比较各组间的差异是否有统计学意义，P=0.05为检测水准。

3结果

3.1HLMECs的培养组织块接种72h后有细胞长出，呈多角形，胞核呈圆形卵圆形，居中，核质比较大，见图1；去除组织块后继续培养，细胞呈长梭形，胞浆均匀，核质比减小，见图2。

3.2HLMECs的鉴定淋巴管畸形组织及培养的HLMECs中，淋巴管内皮特异性标志物LYVE1和PROX1均呈阳性表达，见图3、4、5、6，证明淋巴管畸形内皮细胞表面存在LYVE1受体，及我们培养的细胞为HLMECs。

3.3最适药物浓度实验不同浓度的PYM作用不同时间后HLMECs的增殖效果，见图7，在PYM浓度为100μg/mL和500μg/mL时，随时间延长均表现出明显的细胞抑制现象，所以本实验选取100μg/mL的PYM为最适浓度。不同浓度的HA作用不同时间后HLMECs的增殖效果，见图8，HA在浓度为300μg/mL和500μg/mL，且时间为48h时，表现出对HLMECs有轻微的抑制作用，在本实验其余不同浓度和时间分组内，对HLMECs未见明显的抑制作用，所以本实验选取HA的最适浓度为300μg/mL。

3.4联合用药物后MTT法测HLMECs的增殖情况在PYM浓度为100μg/mL，HA浓度为300μg/mL的条件下。药物作用后HLMECs生长曲线，见图9，PYM组和PYM+HA组作用后细胞生长明显抑制，且随时间延长细胞抑制率增加，在24h和48h时，PYM+HA组与PYM组相比，有统计学差异，由此可知，PYM和HA联合作用时，对HLMECs生长的抑制作用比单纯的PYM效果更明显。

3.5TUNEL检测各组的细胞凋亡情况药物作用后，正常细胞核呈蓝色，凋亡细胞核被染成棕色，见图10。计算四组细胞同等视野下核棕染的细胞/全部细胞的比率，进行统计学分析，Control组与HA组无统计学差异，证明HA对HLMECs没有明显的凋亡作用；PYM+HA组与PYM组有统计学差异，显示PYM联合HA比单纯的PYM更能促进HLMECs的凋亡，见图11。

透明质酸钠是广泛存在于动物和人体的生理活性物质，其具有良好的生物相容性，生物可吸收性和很强的黏稠性，在制剂中能抑制药物的扩散、对流和沉降，并且有很强的黏膜黏附作用，使制剂黏附在作用部位，缓慢释放药物发挥作用。

通过前述的实验研究表明，淋巴管畸形内皮细胞表面表达LYVE1受体，高浓度透明质酸钠抑制HLMECs增殖，并且平阳霉素联合透明质酸钠对体外培养的HLMECs，在抑制其增殖和促进凋亡方面都强于单纯的平阳霉素，这是因为透明质酸钠包被平阳霉素，增加了平阳霉素与细胞的接触浓度，并且通过细胞膜表面LYVE1受体，携载平阳霉素更好的通过胞膜，从而抑制细胞增殖和促进其凋亡。

本发明的平阳霉素联合透明质酸钠在治疗淋巴管畸形（特别是微囊型）药物中的应用效果良好。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (3)

1.平阳霉素联合透明质酸钠在治疗淋巴管畸形药物中的应用，其特征在于，其中，所述透明质酸钠的分子量为600,000～1,500,000道尔顿。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的平阳霉素和透明质酸钠的浓度分别为100μg/mL和300μg/mL。

3.一种用于治疗淋巴管畸形的药物，其特征在于，它含有作为活性成分的平阳霉素和透明质酸钠，以及药物可接受的载体；其中，所述透明质酸钠的分子量为600,000～1,500,000道尔顿，平阳霉素和透明质酸钠的浓度分别为100μg/mL和300μg/mL。

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