CN105998014A - 去氢骆驼蓬碱衍生物作为制备治疗囊型包虫病药物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及去氢骆驼蓬碱衍生物的应用技术领域，是一种去氢骆驼蓬碱衍生物作为制备治疗囊型包虫病药物的应用。本发明首次公开了去氢骆驼蓬碱衍生物作为制备治疗囊型包虫病药物的应用；体外药效学实验数据表明去氢骆驼蓬碱衍生物能够显著降低细粒棘球蚴的生存率；体内药效学实验数据表明去氢骆驼蓬碱衍生物与阿苯达唑治疗囊型包虫病的药效相当；体内外安全性评价实验数据表明去氢骆驼蓬碱衍生物的毒性小于具有抗囊型包虫活性的去氢骆驼蓬碱单体，从而为囊型包虫病的治疗提供了新途径。

Description

去氢骆驼蓬碱衍生物作为制备治疗囊型包虫病药物的应用
技术领域
本发明涉及去氢骆驼蓬碱衍生物的应用技术领域，是一种去氢骆驼蓬碱衍生物作为制备治疗囊型包虫病药物的应用。
背景技术
包虫病，又称棘球蚴病，是由棘球绦虫的蚴虫寄生在人体所致的一种严重的人畜共患寄生虫病，95％病例为细粒棘球蚴的蚴虫囊泡在人体所致的囊型包虫病。该病呈全球分布，我国西部的新疆、西藏、宁夏、青海、甘肃、内蒙古、四川等7个省(自治区)为高发区，每年造成经济损失逾30亿元，是西部农牧民“因病致贫、因病返贫”的主要原因之一，也是备受关注的严重公共卫生问题，2006年该病被列入国家免费救助计划。
目前包虫病的临床治疗仍以手术为主，而为预防术后复发或无法外科手术的病人多采用口服药物进行治疗。现治疗包虫病的首选药物为苯并咪唑类药物，其中阿苯达唑和甲苯咪唑是WHO推荐治疗棘球蚴病仅有的两种药物。但由于药物治疗存在吸收差、病灶区药物浓度低、长期服用易产生耐药性、个体差异大等缺陷而疗效欠佳，因此寻找新的候选药物和非手术治疗方法对防治包虫病具有重要的意义。
为了切实提高包虫病的治疗效果，抗包虫病药物的研发已成为主要的研究方向。目前主要是通过改良药物剂型和发现新型抗包虫药物两方面来实现。在药物新剂型方面，主要是将抗包虫病药物制成乳剂、脂质体、纳米载体制剂等剂型，目的是为了克服苯并咪唑类药物生物利用度低的问题；另一方面则是从中药中获取有抗包虫活性的单体，如骆驼蓬碱，川芎嗪、苦参碱，青蒿素等，从而达到治疗包虫病的目的。本研究方向为研发新型抗包虫药物。
通过国内外前期实验研究发现，隶属于蒺藜科(Zygoph yll aceae)骆驼蓬属植物的骆驼蓬(Peganun harmala L.)及其主要成分骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱(Harmine,HM)单体都具有抗包虫疗效。康金风等用骆驼蓬籽治疗小鼠腹腔细粒棘球蚴和泡球蚴，结果发现骆驼蓬籽对细粒棘球蚴和泡球蚴的生长均有一定的抑制作用；杨文光对23例包虫病人服用骆驼蓬籽口服液后的临床效果进行观察发现，患者口服含骆驼蓬籽的口服液2个月，病情均有不同程度好转，显示出一定的临床治疗效果；赵晋明等用骆驼蓬总碱治疗小鼠腹腔细粒棘球蚴，发现骆驼蓬总碱对包虫囊有抑制作用；李文科用化学方法对中药骆驼蓬生物碱进行提取并对获得的骆驼蓬总碱和去氢骆驼蓬碱单体进行临床研究，结果显示：骆驼蓬碱，去氢骆驼蓬碱均具有治疗包虫病的作用；李红玲等对去氢骆驼蓬碱抗细粒棘球蚴原头节作用进行研究，结果显示去氢骆驼蓬碱对体内外细粒棘球原头蚴均有较强的抑制作用。
去氢骆驼蓬碱是一种具有开发潜力的抗包虫病药物，但具有较大的毒性作用，能引起家畜严重中毒，中毒后表现为厌食、呕吐、腹泻症状，明显处于麻醉状态并伴有间歇性的兴奋，继而呼吸困难，瞳孔放大，在病症出现后可能出现死亡症状，这些综合病症表明骆驼蓬植物中有亚致死物。人过量服用或误服后也会产生神经感觉症状、幻觉等神经毒性症状。去氢骆驼蓬碱衍生物具有广泛的药理作用，除主要的抗肿瘤活性外，还具有抗菌、减肥、促进骨增长等的药理作用，但未发现任何有关去氢骆驼蓬碱衍生物治疗包虫病的报道。
发明内容
本发明提供了一种去氢骆驼蓬碱衍生物作为制备治疗囊型包虫病药物的应用，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决去氢骆驼蓬碱单体治疗囊型包虫病存在的毒性较大的问题；本发明首次公开了去氢骆驼蓬碱衍生物作为制备治疗囊型包虫病药物的应用；体外药效学实验数据表明去氢骆驼蓬碱衍生物能够显著降低细粒棘球蚴的生存率；体内药效学实验数据表明去氢骆驼蓬碱衍生物与阿苯达唑治疗囊型包虫病的药效相当；体内外安全性评价实验数据表明去氢骆驼蓬碱衍生物的毒性小于具有抗囊型包虫活性的去氢骆驼蓬碱单体，从而为囊型包虫病的治疗提供了新途径。
本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种去氢骆驼蓬碱衍生物作为制备治疗囊型包虫病药物的应用，去氢骆驼蓬碱衍生物的结构通式为：
其中，R1是选自氢、C1-4烷基、取代或非取代的五元芳基或六元芳基、取代或非取代的含有1个至4个选自N或O或S的杂原子的五元杂芳基或六元杂芳基中的一种，R9是选自氢、C1－6烷基、羟基-C1-6烷基、芳基-C1－6烷基中的一种。
下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：
上述取代或非取代的五元芳基或六元芳基上的取代基选自羟基、氨基、羧基、卤素、硝基、C1－6烷基和C1－6烷氧基中的一种。
上述去氢骆驼蓬碱衍生物为1-(4-甲氧基)苯基-9-丁基-β-咔啉，其结构式为：
上述去氢骆驼蓬碱衍生物为1-(2-氯)苯基-9-丁基-β-咔啉，其结构式为：
本发明首次公开了去氢骆驼蓬碱衍生物作为制备治疗囊型包虫病药物的应用；体外药效学实验数据表明去氢骆驼蓬碱衍生物能够显著降低细粒棘球蚴的生存率；体内药效学实验数据表明去氢骆驼蓬碱衍生物与阿苯达唑治疗囊型包虫病的药效相当；体内外安全性评价实验数据表明去氢骆驼蓬碱衍生物的毒性小于具有抗囊型包虫活性的去氢骆驼蓬碱单体，从而为囊型包虫病的治疗提供了新途径。
附图说明
附图1为阴性组细粒棘球蚴的伊红染色图。
附图2为细粒棘球蚴经去氢骆驼蓬碱衍生物1体外干预的伊红染色图。
附图3为细粒棘球蚴经去氢骆驼蓬碱衍生物2体外干预的伊红染色图。
附图4为空白组对细粒棘球蚴感染干预的肝脏病理图(HE，200×)。
附图5为模型组对细粒棘球蚴感染干预的肝脏病理图(HE，200×)。
附图6为阿苯达唑组对细粒棘球蚴感染干预的肝脏病理图(HE，200×)。
附图7为去氢骆驼蓬碱高剂量组对细粒棘球蚴感染干预的肝脏病理图(HE，200×)。
附图8为去氢骆驼蓬碱衍生物1高剂量组对细粒棘球蚴感染干预肝脏病理图(HE，200×)。
附图9为去氢骆驼蓬碱衍生物2高剂量组对细粒棘球蚴感染干预肝脏病理图(HE，200×)。
附图10为模型组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡病理图(HE，200×)。
附图11为阿苯达唑组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡病理图(HE，200×)。
附图12为去氢骆驼蓬碱高剂量组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡病理图(HE，200×)。
附图13为去氢骆驼蓬碱衍生物1高剂量组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡病理图(HE，200×)。
附图14为去氢骆驼蓬碱衍生物2高剂量组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡病理图(HE，200×)。
附图15为模型组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡透射电镜图(10000×，5000×)。
附图16为阿苯达唑组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡透射电镜图(10000×，5000×)。
附图17为去氢骆驼蓬碱高剂量组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡透射电镜图(10000×，5000×)。
附图18为去氢骆驼蓬碱衍生物1高剂量组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡透射电镜图(10000×，5000×)。
附图19为去氢骆驼蓬碱衍生物2高剂量组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡透射电镜图(10000×，5000×)。
附图20为空白组健康小鼠的心脏HE染色病理图(200×)。
附图21为去氢骆驼蓬碱高剂量组健康小鼠的心脏HE染色病理图(200×)。
附图22为去氢骆驼蓬碱衍生物1高剂量组健康小鼠的心脏HE染色病理图(200×)。
附图23为去氢骆驼蓬碱衍生物2高剂量组健康小鼠的心脏HE染色病理图(200×)。
附图24为空白组健康小鼠的肝脏HE染色病理图(200×)。
附图25为去氢骆驼蓬碱高剂量组健康小鼠的肝脏HE染色病理图(200×)。
附图26为去氢骆驼蓬碱衍生物1高剂量组健康小鼠的肝脏HE染色病理图(200×)。
附图27为去氢骆驼蓬碱衍生物2高剂量组健康小鼠的肝脏HE染色病理图(200×)。
附图28为空白组健康小鼠的脾脏HE染色病理图(200×)。
附图29为去氢骆驼蓬碱高剂量组健康小鼠的脾脏HE染色病理图(200×)。
附图30为去氢骆驼蓬碱衍生物1高剂量组健康小鼠的脾脏HE染色病理图(200×)。
附图31为去氢骆驼蓬碱衍生物2高剂量组健康小鼠的脾脏HE染色病理图(200×)。
附图32为空白组健康小鼠的肺脏HE染色病理图(200×)。
附图33为去氢骆驼蓬碱高剂量组健康小鼠的肺脏HE染色病理图(200×)。
附图34为去氢骆驼蓬碱衍生物1高剂量组健康小鼠的肺脏HE染色病理图(200×)。
附图35为去氢骆驼蓬碱衍生物2高剂量组健康小鼠的肺脏HE染色病理图(200×)。
附图36为空白组健康小鼠的肾脏HE染色病理图(200×)。
附图37为去氢骆驼蓬碱高剂量组健康小鼠的肾脏HE染色病理图(200×)。
附图38为去氢骆驼蓬碱衍生物1高剂量组健康小鼠的肾脏HE染色病理图(200×)。
附图39为去氢骆驼蓬碱衍生物2高剂量组健康小鼠的肾脏HE染色病理图(200×)。
附图40为空白组健康小鼠的脑HE染色病理图(200×)。
附图41为去氢骆驼蓬碱高剂量组健康小鼠的脑HE染色病理图(200×)。
附图42为去氢骆驼蓬碱衍生物1高剂量组健康小鼠的脑HE染色病理图(200×)。
附图43为去氢骆驼蓬碱衍生物2高剂量组健康小鼠的脑HE染色病理图(200×)。
附图15至附图19中，左图的放大倍数为10000倍，右图的放大倍数为5000倍。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：去氢骆驼蓬碱衍生物的结构通式为：
其中，R1是选自氢、C1-4烷基、取代或非取代的五元芳基或六元芳基、取代或非取代的含有1个至4个选自N或O或S的杂原子的五元杂芳基或六元杂芳基中的一种，R9是选自氢、C1－6烷基、羟基-C1-6烷基、芳基-C1－6烷基中的一种。
实施例2：作为上述实施例的优化，取代或非取代的五元芳基或六元芳基上的取代基选自羟基、氨基、羧基、卤素、硝基、C1－6烷基和C1－6烷氧基中的一种。
实施例3：作为上述实施例的优化，去氢骆驼蓬碱衍生物为1-(4-甲氧基)苯基-9-丁基-β-咔啉，其结构式为：
实施例4：作为上述实施例的优化，去氢骆驼蓬碱衍生物为1-(2-氯)苯基-9-丁基-β-咔啉，其结构式为：
下面为根据本发明上述实施例所述的去氢骆驼蓬碱衍生物作为制备治疗囊型包虫病药物的应用的具体药理实验：
在实验中，衍生物1为1-(4-甲氧基)苯基-9-丁基-β-咔啉，衍生物2为1-(2-氯)苯基-9-丁基-β-咔啉。
一、去氢骆驼蓬碱衍生物体外抗包虫活性筛选
1.实验分组
本次实验共分14组，分别为衍生物1干预组1、衍生物1干预组2、衍生物1干预组3、衍生物1干预组4、衍生物1干预组5、衍生物1干预组6、衍生物2干预组1、衍生物2干预组2、衍生物2干预组3、衍生物2干预组4、衍生物2干预组5、衍生物2干预组6、阴性组和DMSO组；每组3个副孔；试验周期共设置2天。
2.母液配置
分别称取衍生物1和衍生物2各2mg溶于400μL DMSO中得到5mg/mL的母液①；将母液①用DMSO稀释2倍后得到2.5mg/mL的母液②；将母液②用DMSO稀释2倍后得到1.25mg/mL的母液③；将母液③用DMSO稀释2倍后得到0.625mg/mL的母液④；将母液④用DMSO稀释2倍后得到0.3125mg/mL的母液⑤；将母液⑤用DMSO稀释2倍后得到0.15625mg/mL的母液⑥。
3.细粒棘球蚴的制备
将从新疆乌鲁木齐屠宰场新鲜采集自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏，用75％酒精进行表面消毒，用一次性注射器轻插入肝脏包囊内抽取囊液，移入50mL离心管中，静置使原头蚴自然沉淀。在无菌条件下，用含1％(体积百分比)双抗的无菌PBS清洗原头蚴3次，然后加入1％(质量百分比)胃蛋白酶(pH2.0)，37℃消化30min，再用无菌PBS清洗10次，加入RPMI1640培养基，培养备用。
4.体外加药干预
取细粒棘球蚴培养液分别加入96孔培养板上，每孔加198μL，然后分别加入2μL衍生物1母液①成为衍生物1干预组1(50μg/mL)、2μL衍生物1母液②成为衍生物1干预组2(25μg/mL)、2μL衍生物1母液③成为衍生物1干预组3(12.5μg/mL)、2μL衍生物1母液④成为衍生物1干预组4(6.25μg/mL)、2μL衍生物1母液⑤成为衍生物1干预组5(3.125μg/mL)、2μL衍生物1母液⑥成为衍生物1干预组6(1.5625μg/mL)，分别加入2μL衍生物2母液①成为衍生物2干预组1(50μg/mL)、2μL衍生物2母液②成为衍生物2干预组2(25μg/mL)、2μL衍生物2母液③成为衍生物2干预组3(12.5μg/mL)、2μL衍生物2母液④成为衍生物2干预组4(6.25μg/mL)、2μL衍生物2母液⑤成为衍生物2干预组5(3.125μg/mL)、2μL衍生物2母液⑥成为衍生物2干预组6(1.5625μg/mL)，在198μL的细粒棘球蚴培养液中加入2μL的DMSO混匀后得DMSO组(DMSO)，取200μL的细粒棘球蚴培养液得阴性组(NC)。14组进行培养，每个实验3个副孔。培养48h后，将细粒棘球蚴全部取出，伊红染色，涂片后置显微镜下拍照，见图1、图2和图3，根据死亡率获得体外半数致死浓度LC50值。衍生物1和衍生物2及去氢骆驼蓬碱的体外干预的LC50结果见表1。
通过表1可以看出，在体外药物干预条件下，衍生物1和衍生物2在2天内的半数致死浓度均小于去氢骆驼蓬碱，说明衍生物1和衍生物2对细粒棘球蚴的毒性比去氢骆驼蓬碱对细粒棘球蚴的毒性要高，提示衍生物1和衍生物2为高效抗包虫药物分子。
二、去氢骆驼蓬碱衍生物的体内抗包虫药效学实验
1.去氢骆驼蓬碱衍生物的小鼠急性毒性实验
为了摸索2种去氢骆驼蓬碱衍生物治疗囊型包虫病小鼠动物模型的药物剂量，设计小鼠急性毒性实验。
取健康昆明白小鼠，禁食6h至8h，依据急性毒性实验上下法的设定摸索剂量，观察小鼠腹腔注射2种去氢骆驼蓬碱衍生物后在14天内的死亡情况，计算各去氢骆驼蓬碱衍生物的半数致死量(LD50)及95％的可信限。各去氢骆驼蓬碱衍生物的半数致死量(LD50)及95％的可信限结果如表2所示。
2.去氢骆驼蓬碱衍生物的小鼠药效学实验
2.1细粒棘球蚴囊泡的制备
制备细粒棘球蚴(方法同体外细粒棘球蚴的制备)，取活力大于95％的细粒棘球蚴于培养液中培养，培养2个月至3个月后形成直径为2mm至3mm的细粒棘球蚴囊泡。培养条件为37℃、5％CO2的培养箱，根据培养液的颜色，每隔5天至7天更换培养液1次。
2.2囊型包虫病小鼠动物模型的建立
无菌条件下挑选2mm至3mm大小均一的细粒棘球蚴囊泡，腹腔注射接种于6周至8周龄、体重为20g至25g的昆明白小鼠体内，于感染3个月至4个月左右进行B超检测，直径超过0.5cm的细粒棘球蚴囊泡的昆明白小鼠为造模成功。
2.3实验分组
将造模成功的包虫小鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性药物1组(去氢骆驼蓬高剂量组、去氢骆驼蓬中剂量组、去氢骆驼蓬低剂量组)、阳性药物2组(ABZ组即阿苯达唑组，阿苯达唑(治疗囊性包虫病的临床首选))、药物干预组(衍生物1高剂量组、衍生物1中剂量组、衍生物1低剂量组、衍生物2高剂量组、衍生物2中剂量组、衍生物2低剂量组)，共12组，每组12只。
2.4药物干预
依据急性毒性的数据，以半数致死量(LD50)的1/5至1/10作为给药剂量的高剂量，以半数致死量(LD50)的1/10至1/20作为给药剂量的中剂量，以半数致死量(LD50)的1/20至1/40作为给药剂量的低剂量。
空白对照组和模型组注射灭菌生理盐水；阳性药物1组给药去氢骆驼蓬碱，分别给药剂量为9.88mg/kg、4.94mg/kg和2.47mg/kg；阳性药物2组给药阿苯达唑，给药剂量为50mg/kg；衍生物1高剂量组给药剂量为50.53mg/kg，衍生物1中剂量组给药剂量为25.27mg/kg，衍生物1低剂量组给药剂量为12.63mg/kg；衍生物2高剂量组给药剂量为75.91mg/kg，衍生物2中剂量组给药剂量为37.96mg/kg，衍生物2低剂量组给药剂量为18.98mg/kg；给药剂量为10mL/kg，每组12只，腹腔注射，每天1次，给药2周。
2.5药物配制方法：(同一组动物根据体重按同浓度不同药量给予)
阳性药物1组(去氢骆驼蓬高剂量组)：精密称取去氢骆驼蓬碱29.64mg，加入灭菌生理盐水30mL，充分振摇溶解，即为9.88mg/kg(0.988mg/mL)剂量。
阳性药物1组(去氢骆驼蓬中剂量组)：精密称取去氢骆驼蓬碱14.82mg，加入灭菌生理盐水30mL，充分振摇溶解，即为4.94mg/kg(0.494mg/mL)剂量。
阳性药物1组(去氢骆驼蓬低剂量组)：精密称取去氢骆驼蓬碱7.41mg，加入灭菌生理盐水30mL，充分振摇溶解，即为2.47/kg(0.247mg/mL)剂量。
阳性药物2组：精密称取150mg阿苯达唑，置于已灭菌的研钵中，用吐温-80致使药物完全润湿，在研钵中进行研磨，然后慢慢加入0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液30mL并混匀，即为50mg/kg(5mg/mL)剂量。
衍生物1高剂量组：精密称取151.59mg衍生物1，置于已灭菌的研钵中，用吐温-80致使药物完全润湿，在研钵中进行研磨，然后慢慢加入0.5％CMC-Na溶液30mL并混匀，即为50.53mg/kg(5.053mg/mL)剂量。
衍生物1中剂量组：精密称取75.80mg衍生物1，置于已灭菌的研钵中，用吐温-80致使药物完全润湿，在研钵中进行研磨，然后慢慢加入0.5％CMC-Na溶液30mL并混匀，即为25.27mg/kg(2.527mg/mL)剂量。
衍生物1低剂量组：精密称取37.90mg衍生物1，置于已灭菌的研钵中，用吐温-80致使药物完全润湿，在研钵中进行研磨，然后慢慢加入0.5％CMC-Na溶液30mL并混匀，即为12.63mg/kg(1.263mg/mL)剂量。
衍生物2高剂量组：精密称取227.73mg衍生物2，置于已灭菌的研钵中，用吐温-80致使药物完全润湿，在研钵中进行研磨，然后慢慢加入0.5％CMC-Na溶液30mL并混匀，即为75.91mg/kg(7.591mg/mL)剂量。
衍生物2中剂量组：精密称取113.88mg衍生物2，置于已灭菌的研钵中，用吐温-80致使药物完全润湿，在研钵中进行研磨，然后慢慢加入0.5％CMC-Na溶液30mL并混匀，即为37.96mg/kg(3.796mg/mL)剂量。
衍生物2低剂量组：精密称取56.94mg衍生物2，置于已灭菌的研钵中，用吐温-80致使药物完全润湿，在研钵中进行研磨，然后慢慢加入0.5％CMC-Na溶液30mL并混匀，即为18.98mg/kg(1.898mg/mL)剂量。
空白对照组：生理盐水。
模型组：生理盐水。
2.6去氢骆驼蓬碱衍生物囊湿重及抑囊率结果
给药结束后处死小鼠，收集每只小鼠的细粒棘球蚴囊泡，称重，统计囊湿重并计算抑囊率。抑囊率＝(模型组细粒棘球蚴囊湿重-用药组细粒棘球蚴囊湿重)/模型组细粒棘球蚴囊湿重×100％。各实验组的囊湿重及抑囊率结果见表3。在表3中，*与模型组相比较，P<0.05。
对给药干预的小鼠进行剖检，剖检小鼠后大体观察发现，模型组小鼠体内的囊泡数目较多、直径较大，囊泡呈透明状且囊液清亮；给药组小鼠体内的囊泡大多呈半透明状或质地比较硬的钙化结节且囊液呈乳黄色；与模型组相比较，各给药组平均囊湿重均显著下降，差异均具有统计学意义(P<0.05)；与阳性药各剂量组相比，衍生物1和衍生物2各剂量组的囊湿重无明显差别，差异均无统计学意义(P>0.05)。囊湿重结果显示：衍生物1和衍生物2均具有较好的体内抗包虫效果，并呈现一定的量效关系，以衍生物1高剂量组对体内细粒棘球蚴的抑制作用最强，其抑囊率达71.56％。
2.7组织病理学
取出囊泡、肝脏，置于生理盐水中清洗后用滤纸吸干，然后进行切割整理，取适量组织置于4％多聚甲醛中固定，包埋、切片、HE染色，进行病理组织学检查。组织病理结果如下：
2.7.1肝脏组织病理结果
通过肝脏组织病理学观察，空白对照组小鼠肝小叶内有少许点片状坏死，血管周围少许炎细胞浸润，无水肿、脂肪变性(如附图4所示)；模型组肝脏不典型增生，肝板消失，血管周围有明显炎细胞浸润(如附图5所示)；阿苯达唑组肝小叶内有少许点片状坏死，血管周围有少许炎细胞浸润(如附图6所示)；去氢骆驼蓬碱高剂量组肝小叶点状坏死明显减少，肝小叶内与汇管区有轻度炎细胞(淋巴细胞)浸润(如附图7所示)；衍生物1高剂量组和衍生物2高剂量组肝小叶内有点片状坏死，汇管区小胆管炎细胞浸润不明显(如附图8至9所示)。
2.7.2囊泡组织病理结果
囊泡组织病理结果显示：模型组细粒棘球蚴囊泡生发层结构及轮廓清晰，内壁平整，无坏死灶及钙化灶，无异物肉芽肿，外层可见角质层细胞较多，具有吸收营养物质及保护生发层作用(如附图10所示)；阿苯达唑组生发层结构被破坏及轮廓不清晰，外层角质层细胞减少，无钙化(如附图11所示)；去氢骆驼蓬碱高剂量组生发层结构及轮廓均被破坏，内壁不平整，且中、高剂量组均有少许钙化(如附图12所示)；衍生物1高剂量组和衍生物2高剂量组生发层结构被破坏、细胞脱落，内壁不平整，且有较多钙化灶(如附图13至14所示)。
组织病理学结果中，2种去氢骆驼蓬碱衍生物对肝脏和囊泡组织中的炎细胞浸润情况均有不同程度的改善，显示一定的抗包虫药效。
2.8囊泡透射电镜
透射电镜下观察囊泡超微结构结果显示：模型组细粒棘球蚴囊泡生发层结构清晰，微毛整齐且数量较多，皮层细胞核大而圆，核仁清晰，核膜边界有少许异染色质，角质层结构均匀，板层结构清晰(如附图15所示)；阿苯达唑组生发层厚度尚可，微毛减少，皮层细胞核边界不清，核仁消失，角质层纹理被破坏，板层结构模糊不清(如附图16所示)；去氢骆驼蓬碱高剂量组生发层变薄，微毛稀少且排列不整齐，皮层细胞数目甚少并发生细胞解离，细胞结构完全破坏，核仁消失，角质层疏松，板层结构消失，且着随剂量的增加，囊泡结构破坏越严重(如附图17所示)；衍生物1和衍生物2高剂量组均能起到破坏包虫细胞核，导致细胞裂解、核仁消失的作用(如附图18至19所示)。
透射电镜下观察囊泡超微结构结果表明衍生物1和衍生物2具有较好的抗包虫药效。
三、2种去氢骆驼蓬碱衍生物体内外安全性评价
1.体外安全性评价
1.1体外PC-12神经细胞毒性实验
选取对数期生长的PC-12细胞于96孔板中，加入干预药物。实验设置正常对照组、去氢骆驼蓬碱组、衍生物1组和衍生物2组。除正常对照组外，每一组设置6个梯度浓度(浓度梯度见表4)，每个浓度设5个复孔。加入不同组的干预药物后继续培养PC-12细胞24h，每孔加入5mg/mL MTT 20μL，37℃孵育4h至5h，终止培养。吸弃孔内培养液，每孔加150μL DMSO(二甲基亚砜)，低速振荡10min后放入酶标仪中于490nm处测定吸光度，检测PC-12细胞的抑制率，抑制率(％)＝(正常对照组OD值-实验组值平均OD值)/正常对照组OD值×100％。根据抑制率计算去氢骆驼蓬碱及其衍生物1和衍生物2的半数抑制浓度IC50值，结果见表4。
表4结果显示，IC50值由大到小排列，衍生物1>衍生物2>去氢骆驼蓬碱，说明：相对去氢骆驼蓬，碱衍生物1和衍生物2对体外神经细胞的毒性较低。
1.2体外NCTC1469肝细胞毒性实验
选取对数期生长的NCTC1469肝细胞于96孔板中，加入干预药物。实验设置正常对照组、去氢骆驼蓬碱组、衍生物1组和衍生物2组。除正常对照组外，每一组设置6个梯度浓度(浓度梯度见表5)，每个浓度设5个复孔。加入不同组的干预药物后继续培养NCTC1469肝细胞24h，每孔加入5mg/mL MTT 20μL，37℃孵育4h至5h，终止培养。吸弃孔内培养液，每孔加150μL DMSO，低速振荡10min后放入酶标仪中于490nm测定吸光度，检测NCTC1469肝细胞抑制率，抑制率(％)＝(正常对照组OD值-实验组值平均OD值)/正常对照组OD值×100％。根据抑制率计算去氢骆驼蓬碱及其衍生物1和衍生物2的半数抑制浓度IC50值，结果见表5。
表5结果显示，IC50值由大到小排列，衍生物2>衍生物1>去氢骆驼蓬碱；说明：相对去氢骆驼蓬碱，衍生物1和衍生物2对体外肝细胞的毒性较低。
体外神经细胞及肝细胞MTT试验结果表明，不同浓度的去氢骆驼蓬碱及其2种衍生物作用24h后，随着药物浓度的增加，细胞抑制率也逐渐增加，对神经细胞及肝细胞生长抑制影响呈剂量依赖性，并且相对去氢骆驼蓬碱，衍生物1和衍生物2对体外神经细胞和肝细胞的毒性均较低。
2体内安全性评价
2.1血清学指标检测
选择15g左右的健康成年小鼠200只，随机分为阳性对照组(去氢骆驼蓬碱(HM)高、中、低剂量组)、衍生物1高、中、低剂量组、衍生物2高、中、低剂量组及空白对照组(等量生理盐水)，每组20只。腹腔注射量为0.2mL/10g至0.4mL/10g，每日给药1次，每周称重1次，连续给药30d。给药结束后对每组小鼠随机眼球采血，用全自动生化分析仪测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、胆固醇(CHO)、肌酐(Cr)、总蛋白(Tp)的含量，结果如表6和表7所示。表6和表7中，#与空白组相比较，P<0.05。
从表6和表7中的结果可以看出，去氢骆驼蓬碱高剂量组与空白对照组相比，小鼠谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的活性均出现明显增高，具有统计学意义(P<0.05)，其他指标无显著性差异(p>0.05)；去氢骆驼蓬碱低、中剂量组与空白对照组相比，各指标均无显著性差异(p>0.05)；衍生物1和衍生物2各剂量组与空白对照组相比，各指标也均无显著性差异(p>0.05)。
2.2病理组织学指标检测
给药结束后24h对小鼠进行剖检，每组取小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑等脏器，用10％的甲醛溶液浸泡固定，一定时间后冲洗、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，进行病理组织学检查。
小鼠重要内脏器官的病理组织学变化描述如下：
心脏：如附图20至附图23所示，空白对照组、衍生物1高剂量组和衍生物2高剂量组的小鼠心外膜和心内膜结构正常，间质血管大多扩张充血，但未见有炎细胞浸润及异常渗出物，肌层细胞走向大多交错有序，肌浆红染，横纹和纵纹清晰，未发现有明确的肌溶灶或凝固性坏死灶，心肌纤维未见增生肥大、萎缩、断裂，以及颗粒变性、脂肪变性或心肌纤维化，心肌纤维间质等病变，血管均未见明显水肿及炎性细胞浸润改变，但去氢骆驼蓬碱高剂量组部分小鼠心肌细胞轻度萎缩。
肝脏：如附图24至附图27所示，去氢骆驼蓬碱高剂量组、衍生物1高剂量组和衍生物2的高剂量组，其小鼠肝组织与空白对照组比较，都有不同程度的损伤，其中去氢骆驼蓬碱高剂量组小鼠损伤最为严重，有肝细胞水肿，肝细胞片状坏死，汇管区炎细胞侵润纤维组织增生，脂肪变性；衍生物1高剂量小鼠有肝细胞水肿和脂肪变性，肝板部分消失，小叶结构絮乱；衍生物2高剂量组的小鼠肝组织轻微损伤，部分有肝细胞水肿和脂肪变性。
脾脏：如附图28至附图31所示，空白对照组、去氢骆驼蓬碱高剂量组、衍生物1高剂量组和衍生物2高剂量组的小鼠脾被膜无纤维组织增生及炎细胞浸润，脾小梁结构正常，脾小体结节状散在分布，各组均未见明显的中央动脉增厚、变性，红髓区淋巴细胞索网状分布，淋巴窦内以大小淋巴细胞为主，无粒细胞浸润，血窦隙及小血管大多扩张，轻度淤血，考虑与动物解剖时应激反应相关，与药物的毒性缺少关联。
肺脏：如附图32至附图35所示，空白对照组、衍生物1高剂量组和衍生物2高剂量组的小鼠肺泡大多充气，支气管粘膜上皮完整，层次大多清晰，未见出血、炎细胞侵润等变化，但有轻度肺气肿及充血，考虑与动物解剖时应激反应相关，与药物的毒性缺少关联。而去氢骆驼蓬碱高剂量组小鼠可见肺泡间隔增宽，部分可见单核细胞侵润。
肾脏：如附图36至附图39所示，空白对照组、衍生物1高剂量组和衍生物2高剂量组的小鼠肾被膜未见异常，肾小球均匀分布，其毛细血管内皮细胞及间质细胞未见增生、纤维化及硬化，未见肾小球囊腔内纤维蛋白、红细胞及炎细胞渗出，肾小球毛细血管球襻未见细胞增生与纤维化，而去氢骆驼蓬碱高剂量组部分小鼠有肾小管上皮细胞水肿，其他各给药组均未见与药物毒性相关的其他病变。
脑：如附图40至附图43所示，去氢骆驼蓬碱高剂量组小鼠有神经元细胞水肿，其余各给药组与空白组无明显差异，小鼠脑组织、软脑膜及蛛网膜下腔未见有出血及炎细胞浸润，脑实质各层结构清晰，锥体细胞和各种神经核细胞未见肿胀，无空泡变性及脂褐素积聚，细胞突起大多可见，神经细胞未见坏死及噬神经细胞现象。
病理组织学检查各组主要脏器形态学结果显示，衍生物1和衍生物2高剂量组均有个别动物的肝出现区域性肝细胞轻度水肿和脂肪变性，由于分布欠规律，认为可能与样本处理因素有关，与药品的毒性作用缺少必然联系。此外，镜下观察发现去氢骆驼蓬碱高剂量组的小鼠脾脏淤血，认为可能是动物解剖时诱发的应激反应，与药物的毒性缺少关联外，其余组织器官(心、肝、肺、肾、脑)均有器质性病变。
综合体内及体外安全试验结果，说明：相对于去氢骆驼蓬碱，衍生物1和衍生物2的安全性较高，即去氢骆驼蓬碱衍生物的安全性比去氢骆驼蓬碱的安全性要高。
综上所述，本发明首次公开了去氢骆驼蓬碱衍生物作为制备治疗囊型包虫病药物的应用；体外药效学实验数据表明去氢骆驼蓬碱衍生物能够显著降低细粒棘球蚴的生存率；体内药效学实验数据表明去氢骆驼蓬碱衍生物与阿苯达唑治疗囊型包虫病的药效相当；体内外安全性评价实验数据表明去氢骆驼蓬碱衍生物的毒性小于具有抗囊型包虫活性的去氢骆驼蓬碱单体，从而为囊型包虫病的治疗提供了新途径。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
表1 LC50测定结果(n＝3)
药物 LC50(mg/kg)
去氢骆驼蓬碱 48.28±17.76
衍生物1 14.34±5.70
衍生物2 12.62±2.88
表2 LD50测定结果及95％可信限(n＝10)
药物 衍生物1 衍生物2
LD50(mg/kg) 252.66 759.12
95％可信限(mg/kg) 220.6至289.7 657.9至948.6
表3囊湿重及抑囊率
组别 剂量(mg/kg) 囊湿重(g) 抑囊率(％)
模型组 -- 5.38±4.32 --
阿苯达唑组 50.00 1.38±1.11＊ 74.35
去氢骆驼蓬高剂量组 9.88 1.58±1.37＊ 70.63
去氢骆驼蓬中剂量组 4.94 1.89±1.11＊ 64.87
去氢骆驼蓬低剂量组 2.47 1.59±1.13＊ 70.45
衍生物1高剂量组 50.53 1.53±0.79* 71.56
衍生物1中剂量组 25.27 2.40±1.65＊ 55.39
衍生物1低剂量组 12.63 2.48±2.17＊ 53.90
衍生物2高剂量组 75.91 1.78±1.74* 66.91
衍生物2中剂量组 37.96 2.69±1.95＊ 50.00
衍生物2低剂量组 18.98 2.72±2.30* 49.44
表4药物干预体外PC-12神经细胞抑制率
表5药物干预体外NCTC1469肝细胞的抑制率
表6去氢骆驼蓬碱及衍生物1和衍生物2的血清学指标检测结果
组别 ALT(U/L) AST(U/L) ALP(U/L)
空白 42.17±5.37 136.80±21.71 78.37±12.61
HM低剂量组 44.73±6.18 161.50±17.52 72.05±12.37
HM中剂量组 42.00±7.27 161.50±21.69 60.72±12.77
HM高剂量组 63.32±3.21# 211.30±43.94# 126.60±28.97#
1低剂量组 40.55±5.47 147.80±36.17 68.27±12.39
1中剂量组 43.57±6.19 146.70±21.38 60.20±11.27
1高剂量组 40.48±7.46 141.10±27.02 75.75±16.08
2低剂量组 42.90±5.90 138.50±23.93 76.28±11.85
2中剂量组 40.00±6.92 151.40±23.31 64.33±12.17
2高剂量组 39.35±4.02 152.40±15.53 75.67±17.74
表7去氢骆驼蓬碱及衍生物1种衍生物2的血清学指标检测结果
组别 BUN(mmol/L) TP(g/L) Cr(μmol/L) TC(mmol/L)
空白 5.80±0.81 78.35±11.69 29.33±6.71 2.85±0.87
HM低剂量组 5.53±0.68 73.48±17.37 31.53±6.45 3.06±0.75
HM中剂量组 5.53±0.41 63.12±7.86 31.72±6.11 2.66±0.39
HM高剂量组 6.13±0.84 64.72±0.92 30.30±8.04 2.43±0.53
1低剂量组 5.37±2.58 69.72±10.00 33.93±6.94 2.42±0.28
1中剂量组 5.13±0.33 68.88±6.96 31.78±8.99 251±0.44
1高剂量组 5.45±0.44 71.23±7.60 32.75±5.17 2.09±0.17
2低剂量组 5.32±0.21 66.20±4.95 31.52±8.83 2.43±0.39
2中剂量组 5.25±0.40 64.48±8.04 24.08±8.39 2.70±0.31
2高剂量组 5.08±0.42 66.07±4.76 33.03±7.35 2.27±0.24

Claims (4)

1.一种去氢骆驼蓬碱衍生物作为制备治疗囊型包虫病药物的应用，其特征在于去氢骆驼蓬碱衍生物的结构通式为：
其中，R1是选自氢、C1-4烷基、取代或非取代的五元芳基或六元芳基、取代或非取代的含有1个至4个选自N或O或S的杂原子的五元杂芳基或六元杂芳基中的一种，R9是选自氢、C1－6烷基、羟基-C1-6烷基、芳基-C1－6烷基中的一种。
2.根据权利要求1所述的去氢骆驼蓬碱衍生物作为制备治疗囊型包虫病药物的应用，其特征在于取代或非取代的五元芳基或六元芳基上的取代基选自羟基、氨基、羧基、卤素、硝基、C1－6烷基和C1－6烷氧基中的一种。
3.根据权利要求2所述的去氢骆驼蓬碱衍生物作为制备治疗囊型包虫病药物的应用，其特征在于去氢骆驼蓬碱衍生物为1-(4-甲氧基)苯基-9-丁基-β-咔啉，其结构式为：
4.根据权利要求2所述的去氢骆驼蓬碱衍生物作为制备治疗囊型包虫病药物的应用，其特征在于去氢骆驼蓬碱衍生物为1-(2-氯)苯基-9-丁基-β-咔啉，其结构式为：
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