CN111773217A

CN111773217A - 骆驼蓬碱在制备防治慢性肾脏病的药物中的应用

Info

Publication number: CN111773217A
Application number: CN202010564035.3A
Authority: CN
Inventors: 孙世仁; 杨振; 刘利敏; 宁晓暄; 魏蕾; 刘宝建
Original assignee: Air Force Medical University of PLA
Current assignee: Air Force Medical University of PLA
Priority date: 2020-06-18
Filing date: 2020-06-18
Publication date: 2020-10-16

Abstract

本发明公开了骆驼蓬碱在制备防治慢性肾脏病的药物中的应用。所述的骆驼蓬碱(Harmine)的结构如式(I)所示。本发明通过体内外实验发现，Harmine可减少缺氧引起的脂滴聚集，并且改善脂肪酸代谢障碍缓解肾间质纤维化进程。Harmine可降低肾小管上皮细胞脂肪酸代谢障碍和缓解肾间质纤维化，能应用于制备防治慢性肾脏病的药物。

Description

骆驼蓬碱在制备防治慢性肾脏病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及骆驼蓬碱在制备防治慢性肾脏病的药物中的应用。

背景技术

慢性肾脏病(Chronic kidney disease，CKD)以其高达10.8％的发病率已经成为威胁人类公共健康的主要疾病之一。肾小管间质纤维化是各种慢性肾脏病(chronickidney disease，CKD)进展至终末期肾脏病的共同病理表现。因此，深入研究肾小管间质纤维化的分子机制对于阻止或延缓慢性肾脏病具有重要意义。

慢性缺氧导致肾小管损伤是肾间质纤维化形成的主要原因及早期事件。持续不断的慢性缺氧可导致肾小管上皮细胞发生不可逆性损伤，发生坏死、凋亡、表型转化，启动肾脏的损伤修复应答，肾间质纤维化是一个失败的损伤修复过程，以肌成纤维细胞的增殖及细胞外基质(Extracelluar matrix，ECM)过度沉积为主要特征。我们课题组长期致力于慢性缺氧性肾损伤的研究，已证实转录因子Twist受HIF-1α直接转录激活，在缺氧导致的肾小管上皮细胞转分化(EMT)和肾脏纤维化中发挥着重要作用，采用Twist1的siRNA可以体外显著减低肾小管上皮细胞纤维化因子的表达。新近的(Nat Med.2015；21(1):37-46)研究报道发现：肾小管上皮细胞主要依赖于脂肪酸的氧化供能，阻止肾小管上皮细胞的脂肪酸氧化供能将导致细胞内脂滴聚集、大量细胞凋亡、表型转化，释放炎症因子、促纤维化因子导致肾间质纤维化。我们研究发现缺氧可以诱导肾小管上皮细胞脂肪酸代谢障碍，因此，急需寻找缓解脂代谢障碍逆转纤维化的有效药物。

骆驼蓬，又名苦苦菜(《陕西中草药》)，骆驼蒿、臭草、臭牡丹、沙蓬豆豆(《陕甘宁青中草药选》)，阿地热斯忙(维名)，乌姆希-乌布斯(蒙名)，臭古都、老哇瓜。该植物种子提取物Harmine的结构如下式(I)所示：

发明内容

本发明的目的是提供骆驼蓬碱或其药用盐在制备防治慢性肾脏病的药物中的应用，优选，是提供骆驼蓬碱或其药用盐在制备改善肾小管上皮细胞脂肪酸代谢障碍和减轻肾间质纤维化的药物中的应用。所述的骆驼蓬碱(Harmine)的结构式如下式(I)所示：

所述的骆驼蓬碱(Harmine)购买于Sigma-Aldrich(286044-1G)(美国)。

本发明还提供了一种防治慢性肾脏病的药物，其含有有效量的骆驼蓬碱或其药用盐为活性成分。

本发明采用40μmol/L Harmine处理缺氧诱导的肾小管上皮细胞系(HK-2)，结果表明，Harmine可以改善慢性缺氧诱导的脂肪酸代谢障碍。

进一步，采用Harmine处理HK-2，缺氧处理48h之后Western blot检测纤维化因子的表达和脂肪酸代谢调控分子的表达，结果显示采用Twist1siRNA和Harmine处理HK-2细胞之后，均可以显著降低纤维化因子α-SMA，胶原(Collagen I，Collagen IV)，Fibronectin的表达，并且对于缺氧条件诱导的HK-2中脂肪酸相关蛋白PGC-1α和PPARα以及脂肪酸氧化关键限速酶CPT1A和ACOX1的下降有显著的缓解作用。

使用C57小鼠构建经典的肾间质纤维化模型---小鼠单侧输尿管梗阻(Unilateralureteral obstruction,UUO)模型，采用H&E和Masson染色检测Harmine处理对肾脏病理改变和纤维化程度的改变，结果显示，Harmine可以显著缓解肾脏病理学改变和纤维化的程度。

综上所述，本发明通过体内外实验发现，Harmine可减少缺氧引起的脂滴聚集，并且改善脂肪酸代谢障碍缓解肾间质纤维化进程。Harmine可降低肾小管上皮细胞脂肪酸代谢障碍和缓解肾间质纤维化，能应用于制备防治慢性肾脏病的药物。

附图说明

图1是采用Harmine处理缺氧诱导的肾小管上皮细胞系(HK-2)的脂肪酸代谢障碍的结果。图中，A.HK-2细胞分为三组，常氧组(Normoxia)，缺氧组(Hypoxia-Parental)，缺氧加入40μmol/L Harmine组(Hypoxia-Harmine)，培养48h后，采用ORO染色分别检测三组细胞内的脂滴聚集；B.高内涵细胞分析系统(HCS Studio Cell Analysis Software)分析检测每组细胞脂滴的数目；C，D采用Image J软件分析三组细胞内的脂滴的相对相对面积、直径大小；E.分析每组HK-2相等数目细胞内脂滴聚集和水解的百分比变化。与常氧培养组相比，*P＜0.05，与只做缺氧处理48h组相比，^#P＜0.05。

图2是采用Western blot检测HK-2细胞转染Twist1siRNA处理组(siTwist1)、HK-2细胞转染对照质粒pSilencer处理组(pSilencer)、HK-2细胞加入40μmol/L Harmine处理组(Harmine)、空白对照组(Parental)这四组缺氧处理48h之后HK-2的纤维化因子的表达(Twist1、α-SMA、Collagen I，Collagen IV和Fibronectin)和脂肪酸代谢调控分子的表达(PGC-1α和PPARα)。右侧柱状图代表相对于β-actin的灰度分析值，与只做缺氧处理的空白对照组相比，*P＜0.05，与转染了对照质粒后并做缺氧处理48h组相比，^#P＜0.05。

图3是采用H&E和Masson染色检测Harmine处理对UUO模型小鼠肾脏病理改变和纤维化程度的改变。图中，A.采用H&E和Masson检测假手术组(Sham)，UUO造模腹腔注射PBS组和UUO每天腹腔注射20mg/kg Harmien组小鼠造模14天小鼠肾脏病理改变和纤维化程度；B.结合H&E染色的结果，评估各组TDI，结合Masson染色结果对各组的TFI进行评估，与Sham组相比，*P＜0.05。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：Harmine改善慢性缺氧诱导的脂肪酸代谢障碍的研究

采用Harmine处理缺氧诱导的HK-2，并采用油红O检测细胞内的脂滴，分析Harmine缓解慢性缺氧诱导的脂肪酸代谢障碍的作用，具体步骤为：

1、HK-2细胞常规培养基组成为：DMEM/F-12培养基中加入10wt％FCS、胰岛素(5mg/mL)、转铁蛋白(5mg/mL)、硒(5ng/mL)、氢化可的松(36ng/mL)和三碘甲状腺素(4pg/mL)。

在HK-2细胞常规培养基中培养HK-2细胞，在培养基中加入40μmol/L Harmine进行处理，并以培养基中不添加Harmine作为对照，将添加了Harmine处理的HK-2细胞进行缺氧培养(1％O₂，5％CO₂，37℃)，将没有添加Harmine处理的HK-2细胞分别做常氧培养(21％O₂，5％CO₂，37℃)和缺氧培养(1％O₂，5％CO₂，37℃)。

结果显示：与只做缺氧处理的HK-2组(即没有加入Harmine处理的缺氧组Hypoxia-Parental)相比，加入Harmine并进行缺氧处理组(Hypoxia-Harmine)的HK-2细胞内脂滴的聚集减少，水解增加，脂滴的数目减少，相对大小变小(^#p＜0.05)。与常氧组(即没有加入Harmine处理的常氧组Normoxia)相比没有显著差异(p＞0.05)，结果见图1。

实施例2：Western blot检测Harmine对纤维化因子的表达和脂肪酸代谢调控分子的表达

采用Western blot检测HK-2细胞转染Twist1siRNA处理组(siTwist1)、HK-2细胞转染对照质粒pSilencer处理组(pSilencer)、HK-2细胞加入40μmol/L Harmine处理组(Harmine)、HK-2细胞不添加Harmine处理的空白对照组(Parental)这四组缺氧处理48h之后HK-2的纤维化因子的表达(Twist1、α-SMA、Collagen I，Collagen IV和Fibronectin)和脂肪酸代谢调控分子的表达(PGC-1α和PPARα)。具体步骤为：

1、PEI(polyethylenimine)辅助的HK-2转染Twist1siRNA质粒或pSilencer质粒

1)PEI的配置：323mg PEI加入90mL ddH₂O中，滴入HCl促进溶解；

2)充分溶解后，加入ddH₂O将体积调至100mL。此浓缩液储存在-20℃保存；

3)将细胞接种于培养板6孔板中，密度长到50％-70％；

4)配制转染溶液Mix1和Mix2

Mix1：4.5μL PEI+20.5μL NaCl

Mix2：1μg质粒+所需的NaCl补充至总体积为25μL

5)将Mix1加入Mix2中，涡旋振荡50s，静置20min；

6)吸出6孔板中的培养基，加入1mL无血清的培养基；

7)20min后将步骤5)的混合物缓慢加入6孔板中，轻轻摇匀，37℃恒温箱中孵育6-8h；

8)在此过程中，应观察细胞的状态。若细胞死亡较多，且状态很差，需要及时换成10％血清的培养基培养；

9)孵箱孵育48h，取出6孔板，倒置荧光显微镜观察细胞中的荧光强度确定质粒转染效率；

10)收集细胞用于下一步实验。

2、HK-2细胞的总蛋白提取

按照下述步骤，分别提取转染Twist1siRNA的HK-2细胞、转染pSilencer的HK-2细胞、加入40μmol/L Harmine处理的HK-2细胞、不添加Harmine处理的HK-2细胞进行缺氧培养(1％O₂，5％CO₂，37℃)48h的总蛋白，具体步骤为：

1)裂解液(RIPA)与PMSF(蛋白酶抑制剂)在使用前以1:100的比例配制；

2)用细胞刮将贴壁生长的细胞刮下，预冷的PBS 1mL混匀成细胞悬液；

3)4℃的离心机1000g离心5min，弃去上清；

4)5×10⁷个细胞加入200μL RIPA与PMSF配制的蛋白裂解液，超声波细胞破碎仪裂解3-5次，冰上继续裂解10min；

5)细胞裂解液于4℃的离心机1000g离心5min；

6)上清取出约30μL定量用；

7)余下的加入1/4体积的上样缓冲液(Loading buffer)，100℃金属浴5min，蛋白变性，-80℃，保存待用。

3、蛋白质印迹法(Western Blot)

1)按照碧云天生物技术有限公司的SDS-PAGE凝胶配制说明书，配制浓缩胶和分离胶；

2)组装好电泳装置，电泳槽中加入适量的1×电泳液，配置好的凝胶放入电泳槽中，拔去梳子，在凝胶上缘所形成的泳道中分别加入蛋白蛋白Maker和蛋白样品；

3)接通电源，浓缩胶恒压80V，分离胶110V进行电泳，注意电泳仪的正负极匹配；

4)待溴酚蓝的蓝色指示线接近凝胶下缘时，停止电泳；

5)根据目的蛋白所在的位置裁剪凝胶，根据凝胶大小裁剪PVDF和滤纸，PVDF膜预先在甲醇中浸泡1min；

6)将滤纸、PVDF膜、凝胶和滤纸按照从下至上的顺序叠放在转膜仪上，恒压25V，30min进行转膜；

7)转膜结束，取出PVDF膜，在1×丽春红溶液中查看目的蛋白位置，裁取多余的膜；

8)PVDF膜放入1×TBST清洗3次，每次5min；

9)5％脱脂牛奶的TBST封闭膜1h；

10)封闭结束将PVDF膜放入稀释好的一抗溶液中，4℃孵育过夜；

11)次日取出膜，用1×TBST清洗3次，每次5min；

12)加入稀释好的HRP标记的二抗溶液(1:1000稀释)，室温孵育1h；

13)取出膜，用1×TBST清洗3次，每次5min；

14)将膜置入Bio Rad显影仪的检测区，滴加现配好的ECL化学发光液进行显影，并采集蛋白显影图片，利用Image J分析对蛋白条带的灰度值进行分析。

4、统计学分析

每个实验至少重复三遍。使用SPSS 19.0统计软件处理数据。两组之间的比较使用t检验进行，多组数据用单因素方差分析。以均数±标准差(x±s)表示具体数据。p＜0.05认为是差异有统计学意义。

结果显示：采用Twist1siRNA和Harmine处理HK-2细胞之后，均可以显著降低纤维化因子α-SMA，胶原(Collagen I，Collagen IV)，Fibronectin的表达，并且对于缺氧条件诱导的HK-2中脂肪酸相关蛋白PGC-1α和PPARα以及脂肪酸氧化关键限速酶CPT1A和ACOX1的下降有显著的缓解作用，结果见图2。

实施例3：采用H&E和Masson检测Harmine对单侧输尿管梗阻模型小鼠的肾脏病理改变和纤维化程度的改变

1、构建小鼠单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction，UUO)模型

C57BL/6J雄性小鼠共24只，体重20g左右，随机分为假手术组、UUO造模腹腔注射PBS组、UUO造模腹腔注射20mg/kg Harmien组，每组8只，造模过程：1％戊巴比妥钠80mg/kg麻醉小鼠，开腹，左侧输尿管上下结扎，中间离断，缝合。造模后每天腹腔注射PBS或20mg/kgHarmien，造模后第14牺牲小鼠取肾脏，取部分肾脏组织制备石蜡切片，剩余部分保存于-80℃备用；H&E和Masson染色检测肾脏病理改变和纤维化程度的改变。并对组织切片进行模型肾小管间质损伤指数(Tubulointerstitial damage index,TDI)评分，肾小管间质纤维化指数(Tubulointerstitialfibrosis index,TFI)评分。

2、H&E染色：

1)0.8％的伊红溶液的配制：称取0.8g伊红溶解于少量蒸馏水中，再滴加冰醋酸搅拌至糊状，滤纸过滤，将滤渣烘干后，用100mL 95％的乙醇溶解。

2)苏木素染液的配制：6g苏木精溶解于100mL无水乙醇中，150g硫酸铝钾溶解于2000mL蒸馏水中，与苏木精的酒精溶液混合，再加入900mL甘油，最后加入120mL冰醋酸。

3)1％盐酸酒精分化液的配制：1mL浓盐酸加入99mL70％的乙醇即可。

4)组织石蜡切片二甲苯脱蜡。

5)梯度酒精(无水乙醇，90％乙醇，80％乙醇，70乙醇，)，蒸馏水，各5min复水。

6)苏木精溶液染色5min。

7)流水洗去苏木精溶液，约1-3s。

8)1％盐酸乙醇溶液孵育3s。

9)流动的水缓慢冲洗20s。

10)蒸馏水过洗2s。

11)0.8％伊红溶液染色3min。

12)蒸馏水洗2s。

13)梯度酒精(70％乙醇，80％乙醇，90％乙醇，无水乙醇)脱水。

14)二甲苯透明。

15)中性树胶封片。

3、Masson染色：

1)肾组织切片用梯度酒精复水至水。

2)苏木素染色5min。

3)酸性乙醇分化液分化，水洗。

4)用Masson蓝化液返蓝，水洗。

5)丽春红品红染色液染色5min。

6)磷钼酸溶液孵育2min。

7)用配好的弱酸工作液洗1min。

8)苯胺蓝染色2min。

9)弱酸工作液洗1min。

10)95％乙醇脱水1min。

11)二甲苯透明5min。

12)中性树胶封片。

H&E结果显示，造模14天小鼠肾脏有明显病理学改变，肾小球有硬化，系膜区有显著增生，肾小管有扩张，上皮细胞有脱落坏死现象。Masson染色可见造模组的肾小管间质中有明显的蓝色胶原纤维沉积；与注射PBS组比较，Harmine可以显著缓解病理学改变和纤维化的程度，结果见图3。

综上所述，本发明通过体内外实验发现，骆驼蓬碱可减少缺氧引起的脂滴聚集，并且改善脂肪酸代谢障碍缓解肾间质纤维化进程，可用于制备防治慢性肾脏病的药物，具有良好的应用前景。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.骆驼蓬碱或其药用盐在制备防治慢性肾脏病的药物中的应用，所述的骆驼蓬碱的结构式如下式(I)所示：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是在制备改善肾小管上皮细胞脂肪酸代谢障碍和减轻肾间质纤维化的药物中的应用。

3.一种防治慢性肾脏病的药物，其特征在于，含有有效量的骆驼蓬碱或其药用盐为活性成分。