CN102631358A - 虎杖苷在制备糖尿病肾病治疗药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及虎杖苷在制备糖尿病肾病治疗药物中的应用。它从中药虎杖提取的有效成分虎杖苷。该药物的制备方法包括以下步骤：1)将虎杖药材粉碎成粗粉，2)虎杖粗粉加入10-20倍量、60-80％的乙醇中，回流提取2次，每次1-3小时，合并滤液，减压浓缩。3)应用大孔树脂吸附法进行虎杖苷的分离、纯化，冷冻干燥，得虎杖苷初产品，进行纯度测定。4)将虎杖苷初产品，加入适量辅料，制剂成口服剂型或注射剂型。虎杖苷将成为具有良好市场潜力的治疗糖尿病肾病的药物。
Description
[技术领域]
本发明涉及中药有效成分虎杖苷在制备糖尿病肾病治疗药物中的应用。
[背景技术]
糖尿病是全球范围内发病率增长最快的疾病之一，是继心血管疾病、肿瘤之后第三大高死亡率疾病。世界卫生组织估计，到2030年，全球糖尿病患者数可能超过3.6亿人，其中90％～95％为2型糖尿病。中国为世界第二大糖尿病国家，国际权威期刊《新英格兰医学杂志》2010年发布的“中国人口糖尿病流行状况”表明，中国年龄标准化的糖尿病发病率为9.7％(男10.6％，女8.8％)；糖尿病的发病率随年龄增长，20～39岁、40～59岁和超过60岁的人口，糖尿病发病率分别为3.2％、11.5％和20.4％。城市人口的发病率高于农村人口(11.4％vs.8.2％)。令人忧虑的是，糖尿病不再只是中老年人病，有向青少年扩大的趋势。随着胰岛素等药物的使用，糖尿病合并酮症酸中毒等糖尿病急性并发症的发病率大幅下降，而糖尿病合并慢性血管并发症等成为糖尿病的主要并发症，是糖尿病致残率、死亡率升高的主要原因。
糖尿病肾病(DN)又称糖尿病性肾小球硬化症，是糖尿病(DM)常见而难治的慢性微血管并发症，弥漫性的肾小球硬化是糖尿病的特异性肾损伤。临床表现为蛋白尿、水肿等，进一步发展可形成氮质血症，尿毒症，致残率与死亡率较高。随着糖尿病发病率的升高，糖尿病肾病已成为导致终末期肾衰竭的主要原因。目前多采取控制血糖、ACEI、钙拮抗剂、噻唑烷二酮类降糖药、降脂药等综合治疗，尚缺乏针对性的疗效满意的药物。因而，针对DN发病机制以及抗DN药物的研究，目前成为国内外医药领域的研究热点。
糖尿病肾病病变机制尚未完全清楚，目前认为是多因素综合作用的结果，如糖脂代谢紊乱、肾脏血流动力学改变、蛋白质非酶糖基化、氧化应激等因素刺激导致了致多元醇通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信号通路激活，导致了糖尿病状态下肾脏结构与功能的病理改变。近年来越来越多的研究发现，NF-κB的激活及其介导的炎症反应亦参与了DN的发生发展过程，有人甚至还认为DN是一种慢性炎症。糖尿病状态下，NF-κB激活后可进一步调节一些炎症介质(如细胞粘附分子，intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)或细胞因子(转化生长因子βtransfrom growth factor-beta，TGF-β)的过度表达，导致持续或放大的炎症反应，促进了肾脏纤维连接蛋白(FN)等细胞外基质的分泌增多，在糖尿病肾病的发生发展中起到了重要的作用。
因此，研发具有抑制肾脏炎症损伤、改善肾功能作用的治疗糖尿病肾病的疗效独特的药物，将极大地提高产品的市场竞争力，填补市场空白，产生良好的社会效益、获得可观的经济效益。
虎杖苷，(Polydatin，PD)是从寥科寥属-虎杖的干燥根茎中提取的第4种单体，故又名虎杖结晶4号；是白黎芦醇(Resveratrol，ReS)与葡萄糖结合的产物，它们均属于虎杖成分中的芪类化合物，即羟基二苯乙烯类化合物，化学名为3，4’，5-三羟基芪-3-β-D-葡萄糖苷，也可称为白黎芦醇苷(分子结构式见后)。
相对与白藜芦醇，虎杖苷抗酶催氧化作用更强，水溶性也更好。与白藜芦醇被动渗透进入细胞不同，虎杖苷通过葡萄糖载体主动转运到细胞内。这些性质都使虎杖苷比白藜芦醇具有更好的生物利用度。研究表明虎杖苷具有抑制血小板聚集与血栓形成、降血脂、抗脂质过氧化、抗动脉粥样硬化、抗休克等作用；虎杖苷可以明显减轻炎症导致的细胞间粘附，减少粘附分子的表达。虎杖苷的上述药理活性既往侧重于对心脑血管等组织器官的影响研究。
虎杖苷具有良好的抗炎症损伤的效应，但这种效应对于糖尿病状态下肾组织/细胞炎症信号通路激活所引起的肾损伤的保护作用尚未见相关研究报道。
[发明内容]
本发明的目的在于提供中药虎杖的有效成分虎杖苷在制备抑制肾脏炎症损伤、改善肾功能、治疗糖尿病肾病的药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供在中药虎杖中提取虎杖苷的方法，该发明目的是这样实现的：
1)将虎杖药材粉碎成粗粉；
2)虎杖粗粉加入10-20倍量、60-80％的乙醇中，回流提取2次，每次1-3小时，合并滤液，减压浓缩；
3)应用大孔树脂吸附法进行虎杖苷的分离、纯化，冷冻干燥，得虎杖苷初产品，进行纯度测定。
将虎杖苷初产品，加入适量辅料，制成相关剂型，包括口服剂型与注射剂型，口服剂型包括颗粒剂(冲服剂)、片剂(素片、包衣片、分散片、速崩片、泡腾片等)、胶囊剂(硬胶囊、软胶囊)、口服液体剂。
[附图说明]
图1PAS染色观察肾小球内的结构改变(A)、(B)以及肾组织中FN的变化(C)；
图2免疫组化检测P65表达情况(A)以及虎杖苷对STZ诱导的糖尿病肾损伤大鼠IκB-α(B)、ICAM-1(C)、TGF-β1(D)蛋白表达的影响。与正常组相比*P＜0.05；与模型组相比#P＜0.05；
图3虎杖苷预干预抑制高糖刺激的大鼠肾小球系膜细胞FN的蛋白表达。与正常组相比*P＜0.05；与模型组相比#P＜0.05；
图4虎杖苷预干预对高糖刺激的大鼠肾小球系膜细胞NF-κB激活的影响。
与正常组相比*P＜0.05；与模型组相比#P＜0.05；
图5虎杖苷预干预抑制高糖刺激的大鼠肾小球系膜细胞胞浆IκB-α蛋白的降解。与正常组相比*P＜0.05；与模型组相比#P＜0.05；
图6虎杖苷对高糖诱导的肾小球系膜细胞ICAM-1蛋白表达的影响。
与正常组相比*P＜0.05；与模型组相比#P＜0.05；
图7虎杖苷对高糖诱导的肾小球系膜细胞TCF-β蛋白表达的影响。
与正常组相比*P＜0.05；与模型组相比#P＜0.05。
[具体实施方式]
实施例1：其特征在于它主要由从中药虎杖中提取的有效成分虎杖苷。
1)将虎杖药材粉碎成粗粉，
2)虎杖粗粉加入10-20倍量、60-80％的乙醇中，回流提取2次，每次1-3小时，合并滤液，减压浓缩。
3)应用大孔树脂吸附法对滤液进行虎杖苷的分离、纯化，冷冻干燥，得虎杖苷初产品，进行纯度测定。
4)将虎杖苷初产品，加入适量辅料，制成相关剂型。
例如：口服剂型可加工成颗粒剂(冲服剂)、片剂(素片、包衣片、分散片、速崩片、泡腾片等)、胶囊剂(硬胶囊、软胶囊)，注射剂。
实施例2：
按10倍量的80％乙醇将虎杖粗粉回流提取2次，3h/次，分次过滤，合并滤液。减压浓缩。其余步骤同实施例1，制得本发明药物。
实施例3：
按15倍量的60％乙醇将虎杖粗粉回流提取2次，1.5h/次，分次过滤，合并滤液。减压浓缩。其余步骤同实施例1，制得本发明药物。
实施例4：
按20倍量的75％乙醇将虎杖粗粉回流提取2次，1h/次，分次过滤，合并滤液。减压浓缩。其余步骤同实施例1，制得本发明药物。
实施例5：
按15倍量的80％乙醇将虎杖粗粉回流提取2次，2h/次，分次过滤，合并滤液。减压浓缩。其余步骤同实施例1，制得本发明药物。
实施例6：
按10倍量的75％乙醇将虎杖粗粉回流提取2次，1.5h/次，分次过滤，合并滤液。减压浓缩。其余步骤同实施例1，制得本发明药物。
实施例7：
按20倍量的60％乙醇将虎杖粗粉回流提取2次，2h/次，分次过滤，合并滤液。减压浓缩。其余步骤同实施例1，制得本发明药物。
虎杖苷抑制糖尿病状态下肾组织/细胞NF-κB炎症信号通路的激活、
改善肾功能的研究
实验目的
虎杖苷，(Polydatin，PD)是从寥科寥属-虎杖的干燥根茎中提取的第4种单体，故又名虎杖结晶4号；是白黎芦醇(Resveratrol，ReS)与葡萄糖结合的产物，它们均属于虎杖成分中的芪类化合物，即羟基二苯乙烯类化合物，化学名为3，4’，5-三羟基芪-3-β-D-葡萄糖苷，也可称为白黎芦醇苷(分子结构式见后)。相对于白藜芦醇，虎杖苷抗酶催氧化作用更强，水溶性也更好。与白藜芦醇被动渗透进入细胞不同，虎杖苷通过葡萄糖载体主动转运到细胞内。这些性质都使虎杖苷比白藜芦醇具有更好的生物利用度。研究表明：PD具有抑制血小板聚集与血栓形成、降血脂、抗脂质过氧化、抗动脉粥样硬化、抗休克等作用；虎杖苷可以明显减轻炎症导致的细胞间粘附，减少粘附分子的表达。虎杖苷的上述药理活性既往侧重于对心脑血管等组织器官的影响研究。
虎杖苷具有良好的抗炎症损伤的效应，然这种效应对于糖尿病状态下肾组织/细胞炎症信号通路激活所引起的肾损伤的保护作用尚未见相关研究报道。有鉴于此，本研究采用链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病肾病大鼠模型；观察虎杖苷对肾功能及肾组织NF-κB炎症信号通路的影响；同时应用高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞、观察虎杖苷对引起糖尿病肾病、肾小球硬化的主要效应指标纤维连接蛋白(FN)及NF-κB炎症信号通路的影响。
材料与方法
1、动物实验方法
正常雄性SD大鼠预喂养3天后，选取30只大鼠禁食8小时后，单次腹腔注射链脲霉素(streptozocin，使用枸援酸缓冲液新鲜配制)mg/kg。72小时后禁食3-5小时测血糖，血糖值＞16.7mmol/L为糖尿病模型大鼠，选取模型动物16只，随机分为模型组、虎杖苷组，每组各8只。选同批次8只正常大鼠作为正常对照组。共观察12周，实验期间大鼠自由进食、饮水。不使用胰岛素等降糖药物。糖尿病模型复制成功后次日，虎杖苷组大鼠灌胃0.5％醋酸纤维素钠溶液制成的虎杖苷混悬液0.15g/kg。模型组和正常对照组给予等体积的0.5％醋酸纤维素钠溶液。观察12周后收集标本，实验结束前一天用代谢笼准确收集24h尿液，进行24h尿蛋白检测；大鼠空腹8小时后，摘眼球取血2ml，离心后留取血清，作生化肾功能检查；大鼠用脱臼法处死后取出肾脏，迅速用预冷生理盐水冲洗，除去被膜，游离肾脏，用滤纸吸干血迹后称双肾重并记录，观察肾脏大小、色泽、质地，使用刀片将左肾沿正中矢状面纵向剖开，将左肾一半放于包埋盒中做好标记再一起放入于4％甲醛液中固定后进行PAS染色处理以及免疫组化检测；左肾另一半及右肾分离肾皮质，将所得的全部肾皮质迅速装入冻存管放入液氮中速冻，后转移到-80℃保存，供western blot检测。
2、动物实验生理生化指标和肾脏病理组织变化
2.1各组大鼠肾脏肥大指数、肾功能的检测及肾组织病理学观察
每周定期称重并记录各组大鼠体重观察其变化。实验结束时以体重/肾重比值来反映肾脏肥大指数。肾功能指标包括血糖(FBG)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)、24h尿蛋白(UP24h)。血糖用葡萄糖氧化酶法检测，尿素氮、血肌酐分别用酶法、速率法使用BeckmanCX-5全自动生化分析仪进行检测，单位分别为mmol/L，μmol/L；24h尿蛋白用磺基水杨酸-硫酸钠比浊法检测，按试剂盒说明操作，单位为g/L。将10％福尔马林液固定的肾组织，进行脱水、包埋、常规石蜡制片，切片厚度约3-4μm，PAS染色，用OLYMPUS CH-2型光学显微镜进行组织学观察。封片一两天后可进行光镜下观察肾脏病理组织学变化，重点观察肾小球的病理改变。
2.2各组大鼠肾组织免疫组化分析
用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质混合液法(SP法)检测P65蛋白在肾小球细胞的核内表达。阳性部位呈棕黄色。应用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文分析系统，检测每个肾小球视野内阳性胞核细胞数与所有肾小球细胞数之比，以每组均值进行比较。每个标本切片取10个完整的肾小球视野进行P65的核内阳性表达观察，取均值代表每个标本肾小球细胞核内P65的相对含量。
2.3westernblot检测各组大鼠肾组织IκB-α、FN、ICAM-1、TGF-β1的蛋白表达
IκB-α的降解可以反映NF-κB的P65核转位情况，ICAM-1、TGF-β1等为NF-κB信号通路的下游炎症因子，FN为反映肾脏纤维化变化的效应指标。每组取肾组织皮质20mg，加300ul的蛋白裂解液并加入蛋白酶抑制(PI)，冰上进行匀浆，裂解后静止在冰浴上30分钟，用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，收集细胞裂解液至1.5ml EP管中，BCA蛋白定量法测定各组蛋白质含量，转膜、封闭。抗兔IκB-α一抗(1∶1000)，ICAM-1、TGF-β及FN一抗为抗鼠ICAM-1(1∶1000)、抗鼠TGF-β(1∶1000)、抗鼠FN(1∶1000)，用5％脱脂奶进行稀释，二抗为辣根过氧化物酶标记的抗鼠二抗轻轻混匀，将膜平放至一个小盒子内，把稀释好的抗体溶液加到盒中并盖好盖子，放置4℃层析柜的摇床上孵育过夜。次日TBS-T洗膜洗三次，每次5分钟，辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗(稀释度1∶2000)室温孵育1h，TBS-T洗膜后加入化学发光试剂，GE ImageQuant LAS4000mini曝光。美国UVP公司GDS8000系统摄取图象，LABWORK4.0凝胶蛋白分析软件对条带进行灰度分析。
3、大鼠肾小球系膜细胞培养与传代
本课题组自行分离、培养、鉴定的SD大鼠肾小球系膜细胞(GMC)，常规培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件为37℃，饱和湿度，5％CO2。每2-3天用含0.25％的胰酶消化传代，实验用细胞在第6代到12代之间。
4、实验分组
消化重悬的系膜细胞稀释成相应的密度接种至培养瓶或培养皿中常规培养，细胞生长近融合时，用含5.6mM gluose的普通无血清DMEM培养基培养24h同步化后，根据不同的刺激条件与用药共分为6组：1)正常对照组(NG)，2)细胞模型组(HG30mM glucose)，3)虎杖苷低剂量组(10μM Polydatin+HG，PL)，4)虎杖苷中剂量组(20μM Polydatin+HG，PM)，5)虎杖苷高剂量组(40μMPolydatin+HG，PH)，6)NF-κB抑制剂组(100μM PDTC+HG，PDTC)。
5、给药、刺激方法与指标检测
虎杖苷低中高剂量组给予不同剂量(10μM、20μM、40μM)的虎杖苷预干预30min，NF-κB抑制剂组给予100μM PDTC预干预30min，之后，除正常对照组外，各组给予终浓度为30mM的glucose刺激30min后，收集细胞，提取胞浆蛋白、胞核蛋白，用于NF-κB激活的western检测；或用4％多聚甲醛固定贴壁细胞后，做免疫荧光染色，用于NF-κB P65核转位的激光共聚焦观察；虎杖苷低、中、高剂量组给予不同剂量(10μM、20μM、40μM)的虎杖苷预干预12h，NF-κB抑制剂组给予100μM PDTC预干预30min，除正常对照组外，各组给予终浓度为30mM的glucose刺激24h后，收集细胞，提取总蛋白，用于FN、ICAM-1、TCF-β的western检测；另取虎杖苷40μM预干预30min，NF-κB抑制剂组给予100μM PDTC预干预30min，除正常对照组外，各组给予终浓度为30mM的glucose刺激2h后，收集细胞，提取核蛋白，用于NF-κB P65核转位后与基因结合情况的EMSA检测。
5.1肾小球系膜细胞FN蛋白表达
各组取等量待测总蛋白质样本，与5X上样缓冲液混合煮沸5min后上样进行SDS-PAGE电泳，湿转膜至PVDF膜上，膜经5％的脱脂牛奶或BSA室温封闭1h，分别加入特异性的一抗，特异性一抗分别为：FN(1∶1000)、α-tublin(1∶10000)]，于4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，加入相应的二抗(兔二抗，鼠二抗或羊二抗，1∶10000)，室温孵育1h，TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，暗室中ECL发光液覆盖膜，X光胶片曝光，显影，定影。用LabWork4.0凝胶蛋白分析软件对条带进行分析。
5.2肾小球系膜细胞NF-kB的激活
P65/P50二聚体形式是NF-κB的主要胞内存在形式，细胞在静息状态下，NF-κB主要与其抑制蛋白IκB-α结合以三聚体的形式存在于胞浆中，不具有调节基因转录的能力。当细胞受到胞外刺激时，IκB-α可迅速发生磷酸化降解，从而与p65/p50二聚体解离，暴露NF-κB的核定位序列(NLS)，使得NF-κB P65/P50二聚体转位入核而被激活。
因此以P65在肾小球系膜细胞胞浆、胞核内表达及IκB-α蛋白在胞浆中表达量来反映NF-κB的激活程度。
Western blot检测肾小球系膜细胞胞浆/胞核P65及IκB-α蛋白表达
各组取等量待测胞浆或胞核蛋白质样本，Western blot方法分别检测细胞胞浆/胞核P65及IκB-α蛋白表达。检测方法同前。分别加入特异性的一抗，IκB-α[(1∶1000)、P65(1∶1000)、Histone H1(1∶1000)]用LabWork 4.0凝胶蛋白分析软件对条带进行分析，蛋白水平用目的蛋白胞核P65/Histone H1、(IκB-α，胞浆P65)/α-tubulin(内参)表示。
5.3ICAM-1、TCF-β检测
各组取等量待测肾小球系膜细胞总蛋白样本，Western blot方法分别检测ICAM-1、TCF-β、FN蛋白表达。检测方法同前。特异性一抗分别为：ICAM-1(1∶1000)、TCF-β(1∶1000)、FN(1∶1000)。
6、统计分析
实验数据用SPSS11.5统计软件分析，多组比较用方差分析(单因素方差分析、LSD法)，组间比较、组内比较用t检验，结果用均数±标准差
表示。
结果
1、各组大鼠体重、肾重、肾重/体重比(肥大指数)变化
从表1可以看出，实验12周结束时，糖尿病模型组与正常对照组相比，体重明显下降，肾重、肾重/体重(肥大指数)均明显升高(P＜0.05)。虎杖苷组与模型组相比能明显改善肾脏肥大指数(P＜0.05)。
表1虎杖苷对STZ诱导的糖尿病肾损伤大鼠体重、肾重、肾重/体重比(肥大指数)的影响(
n＝8)
与正常组相比*P＜0.05；与模型组相比#P＜0.05
2、各组大鼠肾功能变化
从表2看出，实验12周结束时，糖尿病模型组较正常对照组血糖、BUN、Cr、UP24均明显升高(P＜0.05)，提示糖尿病大鼠肾功能损伤的形成。虎杖苷组与模型组相比能一定程度的降低血糖，明显降低血尿素氮、血肌酐、24h尿蛋白(P＜0.05)。表1与表2结果提示虎杖苷能有效改善糖尿病肾病大鼠的肾功能。
表2虎杖苷对STZ诱导的糖尿病肾损伤大鼠肾功能的影响(
n＝8)
与正常组相比*P＜0.05；与模型组相比#P＜0.05
3、各组大鼠肾组织病理变化
各组大鼠每张切片选5-10个视野重点观察肾小球病理变化，结果图1A-B：正常组：肾小球外层上皮细胞与肾小球囊有明显分界，结构未见明显异常。模型组：肾小球体积增大与系膜基质增生明显，系膜区基底膜区深染扩大，且肾小球内上皮细胞与肾小球囊粘连明显。虎杖苷组：肾小球体积增大较模型组明显改善，肾小球系膜区基质减少，上皮细胞与肾小球囊粘连减轻。与正常组大鼠比较，模型组大鼠出现明显的肾小球内细胞数增多，平均肾小球体积增加，系膜区基质增生明显，且肾小球内上皮细胞与外肾小球囊粘连，虎杖苷治疗12周后，肾脏形态学损伤明显改善，包括肾小球内细胞数明显减少、肾小球基底膜增厚及系膜细胞增生明显减轻，同时也粘连减轻。表明虎杖苷能够阻止或延缓糖尿病大鼠肾脏的病理损害。糖尿病模型组肾组织FN表达与正常对照组相比明显升高(图1.C)(P＜0.05)。与模型组相比，虎杖苷能够明显抑制肾组织FN表达升高(P＜0.05)。
4、各组大鼠肾组织肾小球细胞NF-κB(P65)的核内表达
经免疫组化染色，肾小球胞核阳性染色为棕黄色。结果显示：模型组与正常组比其肾小球细胞核内NF-κB(P65)的阳性表达量明显高于正常组；虎杖苷组的NF-κB(P65)的阳性表达量明显降低(P均＜0.05)。见图2A)从图2B可以看出，糖尿病模型组肾组织IκB-α蛋白表达与正常对照组相比明显降低(P＜0.05)，与模型组相比，虎杖苷能够明显抑制肾组织IκB-α蛋白降解(P＜0.05)。提示糖尿病肾病大鼠NF-κB激活，虎杖苷可抑制NF-κB的激活。同免疫组化结果一致。从图2C可以看出，糖尿病模型组肾组织ICAM-1蛋白表达与正常对照组相比明显升高(P＜0.05)。与模型组相比，虎杖苷能够明显抑制肾组织ICAM-1蛋白表达升高(P＜0.05)。从图2D可以看出，糖尿病模型组肾组织TGF-β1蛋白表达与正常对照组相比明显升高(P＜0.05)。与模型组相比，虎杖苷能够明显抑制肾组织TGF-β1蛋白表达升高(P＜0.05)。
5、肾小球系膜细胞FN的蛋白表达
Western blot的结果(图.3)显示：30mM高糖可显著诱导肾小球系膜FN的蛋白表达上调，与正常组相比，p＜0.05；虎杖苷各剂量组、NF-κB特异性抑制剂组与模型组相比，对30mM高糖诱导的GMC的FN表达增加有一定抑制作用，以虎杖苷中、高剂量组、NF-κB特异性抑制剂组作用明显，p均＜0.05(A)。而甘露醇对照对FN表达无影响(B)，提示虎杖苷具有抑制30mM高糖诱导的GMC的FN蛋白表达的作用。而正常对照组(normal group，Fig.3.C-a)细胞只有少量的荧光染色；经30mM高糖刺激30min后、模型组(model group，Fig.3.C-b)细胞密布FN的荧光染色；虎杖苷组(Polydatin group，Fig.3.C-c)细胞少量荧光染色；NF-κB特异性抑制剂组(PDTC group，Fig.3.C-d)，细胞极少见FN的荧光染色。
6、肾小球系膜细胞NF-κB P65的胞浆和胞核蛋白表达
我们用Western blot的方法分别检测了GMC胞浆和胞核中NF-κB P65的蛋白表达。由Western blot的结果(见图4)可知，正常状态下，NF-κB P65蛋白主要表达在细胞浆中；30mM高糖刺激30min可明显诱导GMC胞核中NF-κB P65的蛋白表达增加、胞浆NF-κB P65蛋白减少，与正常组相比p＜0.05图.4A；虎杖苷各剂量组、NF-κB特异性抑制剂组与模型组相比，胞核中NF-κB P65的蛋白表达减少、胞浆中NF-kB P65蛋白表达增加，以虎杖苷中、高剂量组、NF-κB特异性抑制剂组作用显著，p均＜0.05图.4B。提示虎杖苷有抑制胞浆中NF-κBP65向胞核转位的作用，呈一定的量效依赖关系。而甘露醇对NF-κB P65核转位无影响。(图4C)
7、胞浆IκB-α的蛋白表达
IκB-α为NF-κB的抑制性蛋白。正常状态下，NF-κB与其抑制蛋白IκB-α结合以非活性形式存在于细胞质中，在胞外刺激下，胞浆中IκB-α蛋白的降解可促进NF-κB P65的核转位，因此胞浆中IκB-α的蛋白表达量是佐证NF-κB P65核转位的重要指标。Western blot的结果(图5)显示：30mM高糖刺激30min即可引起GMC胞浆IκB-α蛋白的降解，与正常组相比，p＜0.05；虎杖苷各剂量组、NF-κB特异性抑制剂组与模型组相比，对高糖诱导的GMC胞浆IκB-α的蛋白降解具有一定的抑制作用，尤以虎杖苷高剂量组、NF-κB特异性抑制剂组作用显著，p均＜0.05。实验结果与胞浆/胞核NF-κB P65的蛋白表达结果相吻合，提示虎杖苷通过抑制IκB-a的降解、减少NF-κB P65的转位入核，从而抑制NF-kB的激活。
8、ICAM-1的蛋白表达
正常状态下，GMC表达少量的ICAM-1蛋白，30mM高糖干预24h即可显著诱导肾小球系膜ICAM-1的蛋白表达上调。Western blot的结果(图6)显示：与正常组相比，p＜0.05；虎杖苷各剂量组、NF-κB特异性抑制剂组与模型组相比，对30mM高糖诱导的GMC的ICAM-1表达增加有一定抑制作用，以虎杖苷高剂量组、NF-κB特异性抑制剂组作用明显，p均＜0.05。提示虎杖苷具有抑制30mM高糖诱导的GMC的炎症粘附分子ICAM-1蛋白表达的作用。
9、TCF-β1的蛋白表达
正常状态下，采用30mM高糖干预GMC 24h即可显著诱导GMC TCF-β的蛋白表达上调。Western blot的结果(Fig.7)显示：与正常组相比，p＜0.05；虎杖苷各剂量组、NF-κB特异性抑制剂组与模型组相比，有抑制30mM高糖诱导的GMC TCF-β蛋白表达增加的作用，以虎杖苷中、高剂量组、NF-κB特异性抑制剂组作用明显，p均＜0.05。提示虎杖苷具有抑制30mM高糖诱导的GMC TCF-β蛋白表达的作用。
实验结论：
1、体内动物实验结果表明：虎杖苷能显著改善实验性糖尿病肾病大鼠的肾功能，改善肾组织的病理改变；明显抑制肾脏NF-κB炎症信号通路的激活及炎症因子的表达。
2、体外细胞实验结果表明：虎杖苷能明显抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞纤维化成分-FN的表达；抑制肾小球系膜细胞NF-κB炎症信号通路的激活及炎症因子的表达。
综上：体内、外实验证实虎杖苷对糖尿病状态下肾组织/细胞具有满意的抗炎症损伤、改肾功能的效应，是治疗糖尿病肾病有潜力的药物。
Claims (4)
1.虎杖苷在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述用途，其特征在于将虎杖苷加工成口服剂型药物中的应用，包括：颗粒剂、片剂、胶囊剂和口服液体剂。
3.根据权利要求1所述用途，其特征在于将虎杖苷加工成注射剂型药物中的应用。
4.虎杖苷的提取方法，它包括以下步骤：
1)将虎杖药材粉碎成粗粉；
2)虎杖粗粉加入10-20倍量、60-80％的乙醇中，回流提取2次，每次1-3小时，合并滤液，减压浓缩；
3)应用吸附法进行虎杖苷的分离、纯化，冷冻干燥，得虎杖苷初产品，进行纯度测定。
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