CN111317830A - 芒果苷对小鼠糖尿病药理作用的研究方法 - Google Patents

芒果苷对小鼠糖尿病药理作用的研究方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了芒果苷对小鼠糖尿病药理作用的研究方法，包括材料选取与实验方法、生化参数评价、组织学分析、测量活性氧、丙二醛和抗氧化酶的测定、肾组织炎症因子分析、免疫荧光染色、蛋白印迹和统计分析。本发明用三色染色法观察肾脏形态，用试剂盒测定血液生化指标，测定了炎性细胞因子、抗氧化酶、MDA和ROS水平，免疫组化检测纤维结合蛋白、胶原I和α‑SMA的表达，western blotting检测TGF‑β1、PTEN/PI3K/Akt通路的调节，研究发现芒果苷能明显改善糖尿病小鼠的肾功能紊乱，芒果苷治疗可以通过降低FN、Col I和α‑SMA的阳性表达来预防肾间质纤维化，同时，芒果苷增加了抗氧化酶，降低PI3K和Akt的磷酸化，抑制肾间质纤维化，为中医药治疗糖尿病的临床应用提供更多的理论依据。

Description

芒果苷对小鼠糖尿病药理作用的研究方法
技术领域
本发明涉及医药领域，具体来说，涉及芒果苷对小鼠糖尿病药理作用的研究方法。
背景技术
糖尿病是一种以慢性血糖升高为特征的代谢性疾病。高血糖症是由胰岛素的产生受损和胰岛素抵抗引起的。长期慢性高血糖会导致脂肪和蛋白质代谢紊乱，进而导致视网膜、肾脏和神经系统的一系列并发症。糖尿病肾病(DN)是糖尿病最严重的并发症。其特征是肾细胞丢失，被细胞外基质(ECM)替代，最终导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化。
氧化应激和慢性炎症在DN的发展中起着关键性的作用。高血糖增加了活性氧的生成，活性氧激活了信号转导，诱导了纤维粘连蛋白(FN)、α- 平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和胶原I等纤维化因子的增加。此外，ROS激活转化生长因子(TGF)－β1的表达，这有助于ECM的积累，这是肾纤维化的一个关键特征。科学证据还表明，炎症因子、肿瘤坏死因子-α(TNF- α)和白细胞介素-6(IL-6)与糖尿病肾病的发生密切相关。此外，磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路在糖尿病的增殖、细胞周期的进展和细胞活力中起着关键作用。10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)是PI3K信号的负调控因子，能抑制Akt的活化。链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的DN大鼠PI3K和Akt显著降低。因此，抗氧化应激和抗炎是防治DN肾纤维化的重要途径。寻找天然、有效、安全的药物治疗DN是必要和迫切的。
芒果苷(2-β-D-吡喃葡萄糖基-1,3,6,7-四羟基-9H-黄原-9-酮)是著名中药知母根茎的主要活性成分。具有抗氧化、抗菌、抗糖尿病、抗过敏、抗癌、免疫调节和免疫调节等有益的生物学活性。提示芒果苷对糖尿病及其并发症的防治有积极作用。虽然芒果苷对DN的治疗作用在以往的研究中也得到了证实，但有关芒果苷对DN肾间质纤维化作用机制的报道还很有限。
针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
发明内容
本发明的目的在于提供芒果苷对小鼠糖尿病药理作用的研究方法，以 STZ诱导的糖尿病小鼠为模型，研究芒果苷对糖尿病肾间质纤维化损伤的保护作用，探讨PTEN/PI3K/Akt信号通路在芒果苷抑制DN肾间质纤维化中的作用机制，为中医药治疗糖尿病的临床应用提供更多的理论依据。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：芒果苷对小鼠糖尿病药理作用的研究方法，包括材料选取与实验方法、生化参数评价、组织学分析、测量活性氧、丙二醛和抗氧化酶的测定、肾组织炎症因子分析、免疫荧光染色、蛋白印迹和统计分析,所述材料选取与实验方法具体如下：
材料选取：取70只7周龄且体重为21g±2g的C57BL/6雄性小鼠，将小鼠置于无特定病原体SPF条件下，室温恒定22-25℃，湿度45-55％，光暗循环 12小时，可随意获取清洁食品和水进行训化；
实验方法：驯化1周后，将小鼠分为两组，对照组10只给予柠檬酸缓冲液，模型组60只给予多次低剂量50mg/kg的STZ，连续5天重复注射，STZ 溶于0.1mol/L，pH4.5冰枸橼酸缓冲液中，30min内注射完毕，72h后空腹血糖高于13.9mmol/L的小鼠为成功糖尿病模型小鼠。将纯度大于97％芒果苷悬浮于蒸馏水中，每日口服一次，将模型组60只糖尿病小鼠随机分为6组，每组10只，分别为模型组(Mod)，低剂量组(Mang-L)，芒果苷浓度为15mg/kg/d，中剂量组(Mang-M)芒果苷浓度为30mg/kg/d，高剂量组(Mang-H)芒果苷浓度为60mg/kg/d，PTEN抑制剂组(BpV)，即糖尿病小鼠注射PTEN抑制剂并给予生理盐水，PTEN抑制剂+芒果苷组(BpV+Mang-H)。
进一步的，所述生化参数评价具体如下：
处死前测定小鼠体重(BW)，实验4周后，用氯胺酮(30mg/kg)和硫代巴比妥(50mg/kg)麻醉小鼠，经尾静脉取肝素溶液试管血，分离血清，从膀胱收集尿液，测定尿蛋白、空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、血尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)，样品储存在-80℃下进行进一步分析。
进一步的，所述组织学分析为将小鼠肾组织浸泡在10％福尔马林中，石蜡包埋，取4μm厚的肾组织切片，脱水、保湿，然后用马松三色染料染色，用二甲苯清除，并用中性香脂固定，染色切片在光学显微镜下放大400倍进行检查。
进一步的，所述测量活性氧用生理盐水(1:9w/v)在4℃下将肾组织匀浆，匀浆在11000g下在室温下离心15min，用2，7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA) 试剂盒测定活性氧生成。
进一步的，所述丙二醛和抗氧化酶的测定为利用BCA蛋白检测试剂盒对肾组织进行匀浆和蛋白质浓度测定，丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的水平使用商业工具包测量。
进一步的，所述肾组织炎症因子分析使用商用ELISA试剂盒测量肾匀浆中白细胞介素-6、白细胞介素-1b和肿瘤坏死因子的浓度。
进一步的，所述免疫荧光染色方法如下：
免疫荧光法检测5组(mod组、Mang-H组、Mang-M组、BpV组、BpV+Mang-H 组)肾脏中纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(Col I)和α-平滑肌肌动蛋白(α -SMA)的表达水平及差异，石蜡包埋标本切片，用无血清蛋白封闭，通透性 30min，切片在4℃下用一级抗体FN，Col I，α-SMA(1:100稀释)孵育过夜，切片用TBS 3×10min洗涤，孵育种特异性二级抗体：山羊抗兔IgG H&L进行 1:1000稀释，室温1h，用TBS洗涤后，用含有4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)和1,4-二氮双环-2,2,2-辛烷(DABCO)的甘油安装培养基染色。用 Leica-DM-LB2显微镜观察标记组织，使用NIS Elements 4.13软件拍摄荧光图像(放大400倍)，在每个组织切片上，从5个具有代表性的高倍视野(400 倍放大)中计数荧光阳性细胞的数量。
进一步的，所述蛋白印迹用BCA蛋白检测试剂盒测定匀浆中的总蛋白浓度，并在电泳前进行平衡，上清液中40μg蛋白质经10％SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上，用5％脱脂奶粉室温封闭1h后，用TGF-β1抗体(1:500稀释)、 PTEN(1:400稀释)、PI3K p85(1:1000稀释)孵育，p-PI3K p85(Tyr458) /p55(Tyr199)(1:1000稀释)、Akt和p-Akt(Ser473)(1:1000稀释)在 4℃下过夜，用TBST洗涤后，用IgG-HRP(1:5000稀释)在室温下孵育1h，使用ECL试剂用增强化学发光法开发膜，并使用数字成像系统进行可视化，用 NIH-Image J软件进行密度分析，对印迹进行定量。
进一步的，所述统计分析步骤如下：
数据用平均值±标准差(SEM)表示，采用单因素方差分析(ANOVA)评估各组间的差异，然后采用SPSS 21.0统计软件包进行Tukey检验。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明用三色染色法观察肾脏形态，用试剂盒测定血液生化指标，测定了炎性细胞因子、抗氧化酶、MDA和ROS水平，免疫组化检测纤维结合蛋白、胶原I和α-SMA的表达，western blotting检测TGF-β1、 PTEN/PI3K/Akt通路的调节，研究发现芒果苷能明显改善糖尿病小鼠的肾功能紊乱，芒果苷治疗可以通过降低FN、Col I和α-SMA的阳性表达来预防肾间质纤维化，同时，芒果苷增加了抗氧化酶，降低PI3K和Akt的磷酸化，抑制肾间质纤维化，为中医药治疗糖尿病的临床应用提供更多的理论依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为芒果苷对糖尿病小鼠空腹血糖和体重的影响。
图2为芒果苷对糖尿病小鼠肾功能及脂质代谢生化指标的影响。
图3为芒果苷对STZ糖尿病小鼠肾损伤的组织病理学影响。
图4为芒果苷对STZ糖尿病小鼠肾脏炎症的影响。
图5为芒果苷对STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏抗氧化活性的影响。
图6为免疫荧光分析芒果苷对糖尿病小鼠纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原 (Col I)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响。
图7为芒果苷对TGF-β1和PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对发明做出进一步的描述：
请参阅图1-7，根据本发明实施例的芒果苷对小鼠糖尿病药理作用的研究方法,包括材料选取与实验方法、生化参数评价、组织学分析、测量活性氧、丙二醛和抗氧化酶的测定、肾组织炎症因子分析、免疫荧光染色、蛋白印迹和统计分析,所述材料选取与实验方法具体如下：
材料选取：取70只7周龄且体重为21g±2g的C57BL/6雄性小鼠，将小鼠置于无特定病原体SPF条件下，室温恒定22-25℃，湿度45-55％，光暗循环 12小时，可随意获取清洁食品和水进行训化；
实验方法：驯化1周后，将小鼠分为两组，对照组10只给予柠檬酸缓冲液，模型组60只给予多次低剂量50mg/kg的STZ，连续5天重复注射，STZ 溶于0.1mol/L，pH4.5冰枸橼酸缓冲液中，30min内注射完毕，72h后空腹血糖高于13.9mmol/L的小鼠为成功糖尿病模型小鼠。将纯度大于97％芒果苷悬浮于蒸馏水中，每日口服一次，将模型组60只糖尿病小鼠随机分为6组，每组10只，分别为模型组(Mod)，低剂量组(Mang-L)，芒果苷浓度为15mg/kg/d，中剂量组(Mang-M)芒果苷浓度为30mg/kg/d，高剂量组(Mang-H)芒果苷浓度为60mg/kg/d，PTEN抑制剂组(BpV)，即糖尿病小鼠注射PTEN抑制剂并给予生理盐水，PTEN抑制剂+芒果苷组(BpV+Mang-H)。
具体的，所述生化参数评价具体如下：
处死前测定小鼠体重(BW)，实验4周后，用氯胺酮(30mg/kg)和硫代巴比妥(50mg/kg)麻醉小鼠，经尾静脉取肝素溶液试管血，分离血清，从膀胱收集尿液，测定尿蛋白、空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、血尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)，样品储存在-80℃下进行进一步分析。
具体的，所述组织学分析为将小鼠肾组织浸泡在10％福尔马林中，石蜡包埋，取4μm厚的肾组织切片，脱水、保湿，然后用马松三色染料染色，用二甲苯清除，并用中性香脂固定，染色切片在光学显微镜下放大400倍进行检查。
具体的，所述测量活性氧用生理盐水(1:9w/v)在4℃下将肾组织匀浆，匀浆在11000g下在室温下离心15min，用2，7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA) 试剂盒测定活性氧生成。
具体的，所述丙二醛和抗氧化酶的测定为利用BCA蛋白检测试剂盒对肾组织进行匀浆和蛋白质浓度测定，丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的水平使用商业工具包测量。
具体的，所述肾组织炎症因子分析使用商用ELISA试剂盒测量肾匀浆中白细胞介素-6、白细胞介素-1b和肿瘤坏死因子的浓度。
具体的，所述免疫荧光染色方法如下：
免疫荧光法检测5组(mod组、Mang-H组、Mang-M组、BpV组、BpV+Mang-H 组)肾脏中纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(Col I)和α-平滑肌肌动蛋白(α -SMA)的表达水平及差异，石蜡包埋标本切片，用无血清蛋白封闭，通透性 30min，切片在4℃下用一级抗体FN，Col I，α-SMA(1:100稀释)孵育过夜，切片用TBS 3×10min洗涤，孵育种特异性二级抗体：山羊抗兔IgG H&L进行1:1000稀释，室温1h，用TBS洗涤后，用含有4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI) 和1,4-二氮双环-2,2,2-辛烷(DABCO)的甘油安装培养基染色。用 Leica-DM-LB2显微镜观察标记组织，使用NIS Elements 4.13软件拍摄荧光图像(放大400倍)，在每个组织切片上，从5个具有代表性的高倍视野(400 倍放大)中计数荧光阳性细胞的数量。
具体的，所述蛋白印迹用BCA蛋白检测试剂盒测定匀浆中的总蛋白浓度，并在电泳前进行平衡，上清液中40μg蛋白质经10％SDS-PAGE分离后转移到 PVDF膜上，用5％脱脂奶粉室温封闭1h后，用TGF-β1抗体(1:500稀释)、 PTEN(1:400稀释)、PI3K p85(1:1000稀释)孵育，p-PI3K p85(Tyr458) /p55(Tyr199)(1:1000稀释)、Akt和p-Akt(Ser473)(1:1000稀释)在 4℃下过夜，用TBST洗涤后，用IgG-HRP(1:5000稀释)在室温下孵育1h，使用ECL试剂用增强化学发光法开发膜，并使用数字成像系统进行可视化，用 NIH-Image J软件进行密度分析，对印迹进行定量。
具体的，所述统计分析步骤如下：
数据用平均值±标准差(SEM)表示，采用单因素方差分析(ANOVA)评估各组间的差异，然后采用SPSS 21.0统计软件包进行Tukey检验。
实验数据分析：
图1为芒果苷对糖尿病小鼠空腹血糖和体重的影响，(A)为第1、2、3 和4周的空腹血糖；(B)为第4周的空腹血糖；(C)为体重，数据表示为平均值±标准差，N＝10，*<0.05与对照组，#<0.05与Mod组。如图1A和B所示，与正常小鼠相比，STZ诱导的糖尿病小鼠FBG显著升高(P＜0.05)。在第1、2、3和4周，用芒果苷(15、30和60mg/kg/d)治疗导致模型小鼠的FBG浓度依赖性降低(P＜0.05)，但未完全降低至正常小鼠水平(图1A和B)。与正常小鼠相比，模型小鼠体重明显下降。芒果苷治疗后，体重与模型小鼠相比呈剂量依赖性增加(P<0.05，图1C)。提示芒果苷对STZ诱导的糖尿病小鼠具有一定的降糖作用。
图2为芒果苷对糖尿病小鼠肾功能及脂质代谢生化指标的影响，图2中(A) 血尿素氮(BUN)水平；(B)血清肌酐(SCr)水平；(C)尿蛋白水平；(D) 肾重比(KW/BW)；(E)甘油三酯(TG)水平；(F)总胆固醇(TC)水平。数据用平均值±标准差表示，N＝10，*P<0.05与对照组比较，#P<0.05与Mod 组比较。图2显示了与肾功能不全相关的特异性标记物，如BUN、SCr和尿蛋白，以及肾重比(KW/BW)。模型小鼠BUN、SCr和尿蛋白显著升高(p<0.05，图2A-C)。然而，芒果苷处理有效地降低了这些生化指标的升高。此外，与模型小鼠相比，芒果苷还降低了糖尿病小鼠的KW/BW(P<0.05，图2D)。此外，用芒果苷治疗可显著降低模型小鼠的TG和TC水平(P<0.05，图2E-F)。提示芒果苷对STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏损伤和脂质代谢紊乱具有保护作用。
图3为芒果苷对STZ糖尿病小鼠肾损伤的组织病理学影响，采用Masson 三色染色法观察芒果苷对糖尿病小鼠肾纤维化的影响。胶原纤维呈蓝色，肌纤维胞浆呈红色。对照组和实验组肾小球的这些变化如图3所示。未治疗组(Con 组)肾脏胶原纤维有少量沉积，而单纯STZ组(Mod组)肾小球间充质胶原纤维明显增多。芒果苷(Mang-L、Mang-M和Mang-H)能有效缓解间充质胶原纤维的这些变化。尤其是大剂量处理的小鼠，可见胶原纤维与对照组比较接近。这些结果进一步表明芒果苷对DN具有肾脏保护作用。
图4为芒果苷对STZ糖尿病小鼠肾脏炎症的影响，其中(A)肿瘤坏死因子(TNF-α)水平；(B)白细胞介素-1b(IL-1b)水平；(C)白细胞介素-6 (IL-6)水平。数据表示为平均值±标准差，N＝10，*<0.05与对照组，#<0.05 与Mod组。模型组肿瘤坏死因子-α水平升高，而芒果苷则呈剂量依赖性降低肾脏肿瘤坏死因子-α水平(P<0.05，图4A)。此外，与模型组相比，芒果苷治疗还降低了IL-1β和IL-6的剂量依赖性水平，糖尿病小鼠的IL-1β和IL-6 水平显著高于正常小鼠(P<0.05，图4B-C)。提示芒果苷对糖尿病肾损伤的保护作用部分是由于其抗炎作用。
图5为芒果苷对STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏抗氧化活性的影响，其中(a) 超氧化物歧化酶(SOD)水平；(b)过氧化氢酶(CAT)水平；(c)谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平；(d)丙二醛(MDA)水平；(E)活性氧(ROS)。数据表示为平均值±标准差，N＝10，*<0.05vs对照组，#<0.05vsMod组，如图 5所示，模型小鼠的抗氧化酶活性(SOD、CAT和GSH-Px)显著降低，MDA和 ROS水平显著升高(＜0.05)。而芒果苷则以剂量依赖的方式增加SOD、CAT 和GSH-Px的活性(<0.05，图5A-C)。以剂量依赖的方式给药芒果苷后，发现丙二醛和活性氧水平降低(图5D-E，小于0.05)。提示芒果苷对糖尿病肾损伤的保护作用是其抗氧化应激作用的结果。
图6为免疫荧光分析芒果苷对糖尿病小鼠纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原 (Col I)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响，其中(A)纤维连接蛋白(FN)免疫荧光；(B)Ⅰ型胶原(Col I)免疫荧光；(C)α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光；(D)定量结果。*<0.05与对照组比较，<0.05 与Mod组比较，<0.05与Mang-H组比较，<0.05与BpV组比较，ns无显著性差异。为了进一步研究芒果苷对糖尿病小鼠肾纤维化的保护作用，在图6中观察了肾皮质中纤维连接蛋白(FN)、胶原I(coli)和α-SMA等ECM相关因子的表达水平和差异。与正常组相比，糖尿病小鼠肾脏FN、Col I和α-SMA的表达明显增加(P<0.05)。而高剂量芒果苷能有效逆转FN、Col I和α-SMA 的升高(P<0.05)。另外，应用PTEN抑制剂(BpV)后，FN、Col I和α-SMA 的表达明显高于模型小鼠(P<0.05)。而芒果苷对BpV治疗的糖尿病小鼠FN、 Col I和α-SMA水平也有显著降低(P<0.05)，但未超过未加PTEN抑制剂的芒果苷治疗组。提示芒果苷对肾间质纤维化的保护作用与其抑制ECM因子的产生和积累有关。
图7为芒果苷对TGF-β1和PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响，其中(A) Western blot带；(B)TGF-β1蛋白表达；(C)p-PI3K p85(Tyr458)/p55 (Tyr199)和PI3K p85蛋白表达；(D)p-Akt(Ser473)和Akt蛋白表达； (E)PTEN蛋白表达。数据用平均值±标准差表示，N＝4，*<0.05与对照组比较，#<0.05与Mod组比较，$<0.05与Mang-H组比较，<0.05与BpV组比较，N S无显著性差异。为了更明确，我们评估了调节ECM的相关信号通路。图7A-B 显示芒果苷对上游TGF-β1信号的抑制作用。与正常组相比，糖尿病小鼠肾脏 TGF-β1的表达明显增加(P<0.05)。而高剂量芒果苷能有效逆转TGF-β1的升高(P<0.05)，与FN、Col I和α-SMA的表达一致。在BpV的干预下，TGF- β1的表达明显高于模型小鼠(P<0.05)。但与BpV组相比，芒果苷能显著降低BpV组糖尿病小鼠TGF-β1的表达(P<0.05)。提示芒果苷对肾间质纤维化的保护机制部分与抑制TGF-β1介导的ECM升高有关。
芒果苷对PTEN/PI3K/Akt信号通路的抑制作用如图7A、C、D、E所示，模型组p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表达均显著高于正常组(p<0.05)，而 PTEN表达则显著降低(p<0.05)。在BpV干预下，p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt 的表达较模型小鼠进一步升高(p<0.05)。但与BpV组相比，芒果苷能显著降低糖尿病小鼠p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的表达，同时增加PTEN蛋白的表达 (p<0.05)。提示芒果苷通过调节PTEN/PI3K/Akt信号通路增强肾间质纤维化的抵抗力，不仅可以作为无创性的生物标志物，而且是肾纤维化的病理介质和治疗靶点。
结果综合分析：
STZ通常用于建立动物糖尿病模型，其病理学特征之一是诱发糖尿病肾改变。因此，我们选择持续低剂量STZ诱导的糖尿病小鼠作为模型，研究芒果苷对肾脏损伤的影响。升高的葡萄糖水平成功地引起了与DN患者相似的肾脏损害，其特征是高血糖、高脂血症、氧化应激和肾损伤。本研究通过组织形态学和生化分析，证实STZ诱导的糖尿病小鼠出现肾损伤，芒果苷对其有明显的改善作用。结果表明，芒果苷能降低糖尿病小鼠FBG水平，提高KW/BW比值。先前的研究也显示芒果苷降低了血糖水平，恢复了肾重比。SCr、BUN等生化指标是DN的重要指标，在糖尿病患者中逐渐升高，进而加速DN的发展。在本研究中，芒果苷显著降低STZ诱导的糖尿病小鼠的SCr、BUN和尿蛋白，这意味着芒果苷可以部分缓解DN的进展。这些进一步证实了芒果苷对糖尿病的有益作用，主要集中在血糖控制和肾脏保护上。芒果苷改善肾纤维化的作用也可能与提高FBG水平有关，这也是其作用不容忽视的原因之一。然而，在本研究中，芒果苷虽然能降低FBG，但并没有降低到正常对照水平。由此推测芒果苷对肾纤维化的改善并不是完全由血糖的抑制作用决定的。
脂代谢异常常发生在DN的发病机制中。作为主要的脂质代谢因子，糖尿病患者的TC和TG通常升高。在本研究中，芒果苷治疗STZ诱导的糖尿病小鼠后，其TC和TG水平显著降低，说明芒果苷可以通过调节异常脂质代谢和血脂紊乱而对糖尿病小鼠有益。这些结果与timosaponin B-II抑制四氧嘧啶所致小鼠血脂升高的相关研究一致。同样，据报道，非球面葡萄球菌的黄酮类物质可以降低2型糖尿病大鼠的血糖和总胆固醇。抗糖尿病药物二甲双胍通过改善胰岛素敏感性改善脂质代谢，改善脂质过氧化。因此，芒果苷可能通过类似的机制调节DN引起的脂质代谢紊乱。
在糖尿病肾病的发展过程中，肾脏肥大、结节性硬化、肾小球基底膜增厚、无系膜基质增生是糖尿病肾病的重要病理特征。在本研究中，STZ诱导的糖尿病小鼠表现出明显的肾纤维化，并伴有芒果苷的减轻作用。结果表明，芒果苷能明显改善小鼠肾脏损伤，抑制DN的发生。这与报道一致。相关研究还表明， TB-II治疗改善了结节硬化的抑制作用，减轻了肾小球损伤。研究表明芒果苷对肾纤维化有良好的预防和治疗作用。进一步揭示了其潜在机制。
先前的研究表明，靶向氧化应激和炎症可以改善DN的治疗选择。有人提出一种假设，即高血糖诱导的ROS过度产生可能导致DN的各种致病途径。各种研究表明，芒果苷能有效地保护肾脏，其有效的内源性抗氧化系统调节和强烈的自由基(ROS)清除活性的糖尿病。在本研究中，芒果苷处理后SOD、CAT 和GSH-Px活性升高，MDA和ROS含量降低。这些结果表明芒果甙通过增加抗氧化酶和降低脂质过氧化作用起到一定的作用。与报道一致。
慢性炎症在DN的进展中起重要作用。炎性细胞因子如TNF-α和IL-6通过氧化应激、PKC通路和慢性未解决炎症而激活。先前的研究表明，与无肾病的高血糖患者相比，DN患者的TNF-α和IL-6水平显著升高。因此，联合抗炎药可作为糖尿病患者肾功能不全治疗的补充策略。芒果苷还具有调节葡萄糖代谢、改善胰岛素抵抗、降低胆固醇合成、抑制肿瘤坏死因子-α表达的降血糖作用。在本研究中，STZ显著提高了糖尿病小鼠的TNF-α、IL-1b和IL-6水平。而芒果苷的干预使炎症细胞因子呈浓度依赖性下降。因此，除了抗氧化应激，芒果苷介导的抗炎作用是保护DN发生的另一重要机制，芒果苷对糖尿病肾损害的显著作用与芒果苷抗炎、抗氧化作用有关，可能是肾功能减退的重要原因。糖尿病大鼠的损伤。
α-SMA蛋白、I型胶原和IV在糖尿病小鼠纤维化肾脏中的表达增加。纤维连接蛋白是细胞外基质和基膜中主要的非胶原糖蛋白之一，在细胞粘附、细胞极性调节、分化和生长中起着重要作用。以往的研究表明，芒果苷通过抑制肾小球ECM的扩张和积聚，降低肾小球基底膜厚度和系膜细胞增殖，改善了糖尿病动物的肾纤维化。免疫荧光法检测CoI、FN和α-SMA的变化。结果显示，模型组大鼠肾纤维化以CoI、FN和α-SMA的表达显著升高为特征。而芒果苷能显著逆转糖尿病小鼠CoI、FN和α-SMA蛋白表达的升高，提示芒果苷对DN 小鼠肾纤维化有显著的治疗作用。类似的研究还显示，慢性芒果苷治疗通过降低CoIV和α-SMA水平显示出良好的肾纤维化疗效。并进一步探讨芒果苷对糖尿病小鼠肾纤维化的作用机制。
TGF-β在肾小球硬化和间质纤维化中起关键作用，它通过刺激ECM合成和减少胶原酶的产生而促进组织纤维化。多种研究表明，TGF-β在糖尿病肾病发病机制中起重要作用，其与氧化应激和炎症反应有关。结果表明，芒果苷干预可下调TGF-β1蛋白表达，提示芒果苷可能抑制TGF-β1信号激活。TGF-β1 能促进ECM的沉积，从而启动和促进肾纤维化的发展，提示芒果苷可能通过干预TGF-β1相关通路的激活而降低CoI、FN和α-SMA，从而减轻STZ所致DN肾间质纤维化。这些结果与之前的研究一致。类似地，阿育吠陀降糖药Salacia oblonga(SO)根(主要成分是芒果苷)治疗逆转了Zucker糖尿病脂肪(ZDF) 大鼠肾脏TGF-β1表达的增加。
磷酸肌醇3-激酶(PI3Ks)-Akt信号在调节细胞生长、代谢、增殖、葡萄糖稳态和囊泡运输方面发挥着重要作用。PI3K/Akt介导的NF-KB信号转导可能是DN治疗的机制之一。在糖尿病肾病早期，糖尿病小鼠肾皮质PI3K/Akt 信号通路的状态被激活且更高。值得注意的是，除了刺激TGF-β1的分泌外，还有证据表明IL-1β可以激活PI3K/Akt信号，从而增强肾纤维化。先前的研究表明PI3K/Akt是芒果苷暴露后细胞存活的可能调节因子。因此，鉴于潜在的DN相关通路，进一步探讨了芒果苷抑制肾间质纤维化的PI3K/Akt信号通路机制。在本研究中，STZ显著增加磷酸化PI3K和Akt的表达。与先前报告的结论一致。此外，芒果苷可显著降低纤维化肾脏磷酸化PI3K和Akt的表达。类似的报道还显示，TB-II，一种非球面葡萄的主要成分，通过降低p-PI3K 和p-Akt显著提高了细胞的活力。提示PI3K/Akt信号可能参与STZ诱导的肾纤维化，并受芒果苷干预。
此外，还观察了糖尿病小鼠肾脏损伤后PTEN的变化情况。抑癌基因PTEN 最初被认为是PI3K信号的负性调节因子，它可以抑制Akt的激活[46]。目前的研究表明，肾脏形态学和分子指标显示模型小鼠肾纤维化与PTEN蛋白下调有关，而芒果苷治疗有效地逆转了这种变化。此外，由于PTEN在DN中的重要作用，PTEN抑制剂BpV的应用通过增加CoI、FN、α-SMA和TGF-β1，以及升高PI3K/AKT信号通路，加重了小鼠肾间质纤维化的发展。此外，芒果苷在BpV出现时对肾间质纤维化有明显的缓解作用，但不大于无BpV时。PTEN的丢失或损伤导致抗糖尿病作用，提示PTEN可能是抗Ⅱ型糖尿病药物的重要靶点。在本研究中，当使用PTEN抑制剂时，TGF-β1、p-PI3K和p-AKT蛋白表达较高。但PTEN的表达变化不大，无显著性差异，说明芒果苷通过增强PTEN的活性而发挥抗纤维化作用。阻断芒果苷活化作用的PTEN抑制剂。提示芒果苷可阻止STZ诱导的DN病理进程，PTEN的上调可能是其重要原因之一。许多动物研究和进一步的临床数据表明，PI3K活性降低可能在胰岛素敏感性和II型糖尿病中发挥作用。因此，芒果苷减轻DN的机制之一可能是通过抑制PI3K/Akt 信号通路提高胰岛素敏感性。这些结果表明PI3K/Akt信号通路在肾间质纤维化中起重要作用，抑制PI3K/Akt信号通路并激活PTEN依赖性活性的替代途径可能是一种潜在的肾损伤保护方法。
结论
研究表明，芒果苷作为一种有效的抗纤维化药物，通过调节 PTEN/PI3K/Akt途径，通过降低TGF-β1诱导的CoI、FN和α-SMA升高，抑制 DN肾间质纤维化。我们的发现为芒果苷在肾间质纤维化中的分子机制提供了新的见解，并为慢性纤维化肾病提供了新的治疗途径。芒果苷可作为预防和治疗DN的潜在佐剂。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限定本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.芒果苷对小鼠糖尿病药理作用的研究方法，其特征在于，包括材料选取与实验方法、生化参数评价、组织学分析、测量活性氧、丙二醛和抗氧化酶的测定、肾组织炎症因子分析、免疫荧光染色、蛋白印迹和统计分析,所述材料选取与实验方法具体如下：
材料选取：取70只7周龄且体重为21g±2g的C57BL/6雄性小鼠，将小鼠置于无特定病原体SPF条件下，室温恒定22-25℃，湿度45-55％，光暗循环12小时，可随意获取清洁食品和水进行训化；
实验方法：驯化1周后，将小鼠分为两组，对照组(Con)10只给予柠檬酸缓冲液，模型组60只给予多次低剂量50mg/kg的STZ，连续5天重复注射，STZ溶于0.1mol/L，pH4.5冰枸橼酸缓冲液中，30min内注射完毕，72h后空腹血糖高于13.9mmol/L的小鼠为成功糖尿病模型小鼠。将纯度大于97％芒果苷悬浮于蒸馏水中，每日口服一次，将模型组60只糖尿病小鼠随机分为6组，每组10只，分别为模型组(Mod)，低剂量组(Mang-L)，芒果苷浓度为15mg/kg/d，中剂量组(Mang-M)芒果苷浓度为30mg/kg/d，高剂量组(Mang-H)芒果苷浓度为60mg/kg/d，PTEN抑制剂组(BpV)，即糖尿病小鼠注射PTEN抑制剂并给予生理盐水，PTEN抑制剂+芒果苷组(BpV+Mang-H)。
2.根据权利要求1所述的芒果苷对小鼠糖尿病药理作用的研究方法，其特征在于，所述生化参数评价具体如下：
处死前测定小鼠体重(BW)，实验4周后，用氯胺酮(30mg/kg)和硫代巴比妥(50mg/kg)麻醉小鼠，经尾静脉取肝素溶液试管血，分离血清，从膀胱收集尿液，测定尿蛋白、空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、血尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)，样品储存在-80℃下进行进一步分析。
3.根据权利要求1所述的芒果苷对小鼠糖尿病药理作用的研究方法，其特征在于，所述组织学分析为将小鼠肾组织浸泡在10％福尔马林中，石蜡包埋，取4μm厚的肾组织切片，脱水、保湿，然后用马松三色染料染色，用二甲苯清除，并用中性香脂固定，染色切片在光学显微镜下放大400倍进行检查。
4.根据权利要求1所述的芒果苷对小鼠糖尿病药理作用的研究方法，其特征在于，所述测量活性氧用生理盐水(1:9w/v)在4℃下将肾组织匀浆，匀浆在11000g下在室温下离心15min，用2，7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)试剂盒测定活性氧生成。
5.根据权利要求1所述的芒果苷对小鼠糖尿病药理作用的研究方法，其特征在于，所述丙二醛和抗氧化酶的测定为利用BCA蛋白检测试剂盒对肾组织进行匀浆和蛋白质浓度测定，丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的水平使用商业工具包测量。
6.根据权利要求1所述的芒果苷对小鼠糖尿病药理作用的研究方法，其特征在于，所述肾组织炎症因子分析使用商用ELISA试剂盒测量肾匀浆中白细胞介素-6、白细胞介素-1b和肿瘤坏死因子的浓度。
7.根据权利要求1所述的芒果苷对小鼠糖尿病药理作用的研究方法，其特征在于，所述免疫荧光染色方法如下：
免疫荧光法检测5组(mod组、Mang-H组、Mang-M组、BpV组、BpV+Mang-H组)肾脏中纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(Col I)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平及差异，石蜡包埋标本切片，用无血清蛋白封闭，通透性30min，切片在4℃下用一级抗体FN，Col I，α-SMA(1:100稀释)孵育过夜，切片用TBS 3×10min洗涤，孵育种特异性二级抗体，山羊抗兔IgG H&L进行1:1000稀释，室温1h，用TBS洗涤后，用含有4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)和1,4-二氮双环-2,2,2-辛烷(DABCO)的甘油安装培养基染色。用Leica-DM-LB2显微镜观察标记组织，使用NIS Elements4.13软件拍摄荧光图像(放大400倍)，在每个组织切片上，从5个具有代表性的高倍视野(400倍放大)中计数荧光阳性细胞的数量。
8.根据权利要求1所述的芒果苷对小鼠糖尿病药理作用的研究方法，其特征在于，所述蛋白印迹用BCA蛋白检测试剂盒测定匀浆中的总蛋白浓度，并在电泳前进行平衡，上清液中40μg蛋白质经10％SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上，用5％脱脂奶粉室温封闭1h后，用TGF-β1抗体(1:500稀释)、PTEN(1:400稀释)、PI3K p85(1:1000稀释)孵育，p-PI3K p85(Tyr458)/p55(Tyr199)(1:1000稀释)、Akt和p-Akt(Ser473)(1:1000稀释)在4℃下过夜，用TBST洗涤后，用IgG-HRP(1:5000稀释)在室温下孵育1h，使用ECL试剂用增强化学发光法开发膜，并使用数字成像系统进行可视化，用NIH-Image J软件进行密度分析，对印迹进行定量。
9.根据权利要求1所述的芒果苷对小鼠糖尿病药理作用的研究方法，其特征在于，所述统计分析步骤如下：
数据用平均值±标准差(SEM)表示，采用单因素方差分析(ANOVA)评估各组间的差异，然后采用SPSS 21.0统计软件包进行Tukey检验。
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