CN114617905A - 一种治疗2型糖尿病的合生元组合物及其应用 - Google Patents
一种治疗2型糖尿病的合生元组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种治疗2型糖尿病的合生元组合物及其应用。本发明首次将芒果苷和罗伊氏乳杆菌联合作为治疗2型糖尿病的联合药物，比单一的芒果苷或罗伊氏乳杆菌治疗具有更强的降糖活性，通过增加益生菌罗伊氏乳杆菌的增殖定值，拮抗有害菌定植，以及调节AI‑2水平改善肠道菌平衡，抑制宿主炎症反应，增强免疫功能，一定程度逆转T2D造成的肝脏及胰腺病变，进而改善糖代谢紊乱，整体效果与阳性药盐酸二甲双胍相当。本发明提供的合生元组合具有较高的临床安全性，在给药过程中未发现大鼠有不良反应发生，不存在盐酸二甲双胍带来的腹泻、胃痉挛等副作用，因此本合生元组合在药物安全性上具有巨大优势，可作为预防和治疗T2D的潜在新一代制剂。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种治疗2型糖尿病的合生元组合物及其应用。
背景技术
2型糖尿病(type Ⅱ diabetes，T2D)的流行率正在稳步上升，影响到全世界4.63亿人，占全球卫生支出的10%。T2D是一种由于胰岛B细胞功能受损或胰岛素抵抗而引起的血糖升高的代谢性疾病，患者特征为高血糖、相对缺乏胰岛素、胰岛素抵抗等，主要靠胰岛素及降糖药控制病情。但大多数口服降血糖药物具有不同程度的不良反应，常见降糖药物不良反应主要是低血糖反应、消化道反应以及代谢和营养障碍等。对降糖药物进行文献分析，胰岛素发生不良反应的概率约为28.00%，噻唑烷二酮类药物吡格列酮约为20.40%，磺酰脲类药物格列本脲约为18.18%、双胍类药物二甲双胍约为17.39%。
因此，开发一种高效低毒的抗糖尿病药物是极其必要的。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种治疗糖尿病的合生元组合物，本发明的第二目的是提供所述治疗糖尿病的合生元组合物的应用，本发明的第三目的是提供一种治疗2型糖尿病的药物。
本发明的第一目的是这样实现的，一种治疗2型糖尿病的合生元组合物，所述合生元组合物由益生元和益生菌组成，所述益生元为芒果苷，所述益生菌为罗伊氏乳杆菌。
本发明的第二目的是这样实现的，所述治疗2型糖尿病的合生元组合物的应用为在制备治疗糖尿病药物中的应用。
本发明的第三目的是这样实现的，一种治疗2型糖尿病的药物，是以所述合生元组合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或载体制备而成。
所述药物的剂型为胶囊剂、颗粒剂或口服液。
本发明的有益效果为：
1）本发明首次将芒果苷和罗伊氏乳杆菌联合作为治疗2型糖尿病的联合药物，比单一的芒果苷或罗伊氏乳杆菌治疗具有更强的降糖活性，通过增加益生菌罗伊氏乳杆菌的增殖定值，拮抗有害菌定植，以及调节AI-2水平改善肠道菌平衡，抑制宿主炎症反应，增强免疫功能，一定程度逆转T2D造成的肝脏及胰腺病变，进而改善糖代谢紊乱，整体效果与阳性药盐酸二甲双胍相当。
2）本发明提供的合生元组合具有较高的临床安全性，在给药过程中未发现大鼠有不良反应发生，不存在盐酸二甲双胍带来的腹泻、胃痉挛等副作用，因此本合生元组合在药物安全性上具有巨大优势，可作为预防和治疗T2D的潜在新一代制剂。
附图说明
图1为本发明各组大鼠的各生化指标图；其中，A为六周内各组大鼠的体重变化，B为六周内各组每只大鼠的平均摄食量变化，C为造模后各组大鼠的FBG，D为处死前各组大鼠的FBG，E为各组大鼠的OGTT曲线，F为各组大鼠的OGTT曲线线下面积，G为各组大鼠的FINS，H为各组大鼠的GC，I为各组大鼠的SCFAs，J为各组大鼠的LPS，K为各组大鼠的TNF-α，L为各组大鼠的IFN-γ，M为各组大鼠的ICAM-1，N为各组大鼠的IL-2，O为各组大鼠的IL-6，P为各组大鼠的罗伊氏乳杆菌绝对定量结果，Q为各组大鼠粪便的AI-2水平；
图2为本发明各组大鼠肝脏HE染色图；
图3 为本发明各组大鼠胰腺HE染色图；
图4为本发明各组大鼠菌群组成示意图；注：图A、B、C分别显示各组大鼠肠道微生物在门、属、种水平上的分布及相对丰度，D为各组大鼠肠道中Firmicutes /Bacteroidetes比例；
图5为本发明大鼠肠道微生物组间差异分析图；
图6为本发明临床因子与肠道菌相关性分析图；注：X轴和Y轴分别为临床因子和物种，通过计算获得相关性R值和P值；R值在图中以不同颜色展示；* P ≤ 0.05，** P ≤0.01，*** P ≤ 0.001；
图7为本发明各组大鼠产SCFAs菌OTU丰度统计图；注：A、B、C、D分别为药物干预后大鼠肠道内产SCFAs 菌、产乙酸菌、产丙酸菌、产丁酸菌的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
一种治疗2型糖尿病的合生元组合物，所述合生元组合物由益生元和益生菌组成，所述益生元为芒果苷，所述益生菌为罗伊氏乳杆菌。
所述芒果苷的剂量为20-60mg /kg/日，罗伊氏乳杆菌的剂量为以菌数计为5×108-5×1010CFU/mL/日。
本发明的第二目的是这样实现的，所述治疗2型糖尿病的合生元组合物的应用为在制备治疗糖尿病药物中的应用。
本发明的第三目的是这样实现的，一种治疗2型糖尿病的药物，是以所述合生元组合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或载体制备而成。
所述药物为单一的复方制剂。
所述药物为芒果苷制剂与罗伊氏乳杆菌制剂两种单独的制剂的组合。
所述的两种单独的制剂同时施用。
所述的两种单独的制剂依次施用。
所述药物的剂型为胶囊剂、颗粒剂或口服液。
实施例1 糖尿病模型建立
本发明实施例采用低剂量STZ诱导2型糖尿病大鼠。
材料选取：取48只SPF级雄性成年健康Spraque-Dawley大鼠，体重160-180 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2019-0004。实验条件和方法经云南中医学院动物实验中心伦理委员会审查合格，动物伦理学审查文件编号为：R-062020J009。从健康大鼠肠道分离出一株乳杆菌，经16S rRNA测序鉴定罗伊氏乳杆菌；链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)(S8050，纯度≥98％)购自北京索莱宝科技有限公司；芒果苷(S26694，纯度≥95％)购自上海源叶生物科技有限公司；阳性药为盐酸二甲双胍片，购自中美上海施贵宝制药有限公司，批准文号：国药准字H20023370。
实验方法：将培养好的罗伊氏乳杆菌在4℃，5 000 r/min 条件下离心10 min，所得菌泥用PBS清洗2次，调整总活菌量在5×1010 CFU/mL，于菌泥中加入30 %的蔗糖保护剂后保藏于-80℃备用；灌胃前用3%蔗糖溶液将菌液稀释10倍使用。
大鼠适应性饲养7天后，随机分为正常对照组(CON，6只)及糖尿病模型组(42只)，模型组分为7组，每组6只，分别为糖尿病模型组(MOD)，罗伊氏组(Lre)，芒果苷低剂量组(MGFL)，芒果苷高剂量组(MGFH)，芒果苷低剂量+罗伊氏组(MGFLL)，芒果苷高剂量+罗伊氏组(MGFHL)，盐酸二甲双胍组(MET)。尾尖取血测血糖。糖尿病造模方法如下：大鼠禁食不禁水16 h后，腹腔注射STZ 40 mg·kg-1 (临用前溶于0.1 mol·L－1，pH值=4.2柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，置于冰上，避光)。正常对照组腹腔注射等体积的0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液。STZ注射7天后利用血糖仪测定空腹血糖，通过血糖检测来确认动物模型建立成功与否(取血糖＞11.1 mmol·L－1的作为造模成功大鼠)。每组处理方式见表1。实验动物的喂养条件相同，自由进食饮水，各组分笼饲养于25 ± 2℃，明暗各12 h的动物室内，药物干预时间共计6周。
表1. 各组大鼠处理方式
注：服用方式为灌胃给药，MGFLL、MGFHL组为依次灌胃芒果苷溶液、L. reuteri 1-12溶液。表中/代表无此处理方式，-表示每天灌胃1 mL 3%蔗糖溶液，√表示每日灌胃1 mLL. reuteri 1-12(5×109 CFU/mL)3%蔗糖溶液，*代表每日灌胃剂量20 mg /kg( bw) 芒果苷，**代表每日灌胃剂量60 mg /kg( bw) 芒果苷，#代表每日灌胃剂量90 mg /kg( bw) 盐酸二甲双胍。
实施例2 合生元组合物对低剂量STZ诱导的小鼠2型糖尿病的治疗作用
1、生化参数评价
实验方法：实验期间，每天记录一次大鼠摄食量，每周记录一次大鼠体重。造模后和处死前对各组大鼠进行空腹血糖(FBG)测定。在试验结束前两天，进行葡萄糖耐量实验(OGTT)，各组均禁食12 h，全部按照 2g/kg ( bw) 给予葡萄糖溶液(500 mg/mL)，尾静脉取血，依次测定给予葡萄糖溶液后0 min、 30 min、 60 min、90min、 120 min的血糖变化。实验结束后，大鼠用戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，收集血清。采用ELISA 试剂盒检测血清胰岛素(FINS)、胰高血糖素(GC)、短链脂肪酸(SCFAs)、脂多糖(LPS)、细胞间粘附因子(ICAM-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素6(IL-6)含量。
检测结果：
从图1A可知，六周内，糖尿病大鼠体重均显著低于CON组体重，且MOD组体重一直处于低水平状态。结果显示，实验各组大鼠体重起初无明显差别，CON组大鼠体重持续增高，至第四周趋于稳定，而其他组大鼠体重几乎无增长，第六周时MOD、Lre、MGFL组大鼠体重较低，MGFH、MGFLL、MGFHL、MET组大鼠体重略有上升。
图1 B显示六周内，糖尿病大鼠摄食量在第三~五周内均高于CON组，在第六周各组大鼠的摄食量趋于同一水平。CON组的平均摄食量几乎无改变，保持在32 g/只/天左右。
图1C显示，T2D造模后，CON组与MOD组的FBG存在显著差异，糖尿病组趋于同一水平，无显著差异。
图1D显示，CON、 MGFH、 MGFLL、 MGFHL、 MET组的FBG水平均显著低于MOD组。说明即便芒果苷即便处于浓度较低的状态下，合生元组合也能够达到降低FBG的作用。而合生元组合与盐酸二甲双胍降糖效果相似，作用明显。
由图1 E可知，给予葡萄糖溶液后，各组大鼠的血糖浓度急剧上升，在0.5~1h达到峰值。在1h~2h之间，随着时间的延长血糖值随之下降，基本接近初始水平。整个过程中，MOD大鼠的血糖值在每个时间点均高于CON组，其胰岛敏感性大大降低。Lre、MGFL组OGTT曲线高于MOD组，MGFH、MGFLL、MGFHL、MET组OGTT曲线低于MOD组。
图1F显示，计算OGTT线下面积，与MOD组相比，Lre组无显著差异(P > 0.05)，MGFL组显著增高(P < 0.001)，CON(P < 0.0001)、MGFH(P < 0.0001)、MGFLL(P < 0.0001)、MGFHL(P < 0.01)、MET(P < 0.0001)组显著降低。相比于罗伊氏乳杆菌及芒果苷单用，合生元组合能够稳定的逆转T2D造成的糖耐量异常，阳性药盐酸二甲双胍糖耐量增高作用与合生元组近乎持平。
图1G显示，与CON组相比，在高脂高糖饮食诱导下，MOD组大鼠的FIN水平显著低于CON组(P < 0.05)。与MOD组相比，CON(P < 0.05)、Lre(P < 0.05)、MGFL(P < 0.05)、MGFH(P< 0.05)、MGFLL(P < 0.01)、MGFHL(P < 0.01)、MET(P < 0.05)组的FIN水平显著增高，提示芒果苷、罗伊氏乳杆菌能够改善STZ造成的胰岛破坏，并且合生元组合效果略强于其他给药组，提升FIN产生释放。
图1H显示，CON组的GC水平显著低于MOD组，其他各给药组与MOD组无显著差异，处于同一水平。
图1I显示，Lre组与MOD组的SCFAs无显著差异，其他各给药组SCFAs水平均显著高于MOD组。其中，合生元组合中的MGFLL升高SCFAs作用略低于MET及芒果苷单用组，强于罗伊氏乳杆菌单用。
图1J显示，与MOD组相比，CON(P < 0.0001)、Lre(P < 0.01)、MGFL(P < 0.0001)、MGFH(P < 0.0001)、MGFLL(P < 0.0001)、MGFHL(P < 0.0001)、MET(P < 0.0001)组的LPS水平显著降低。其中，罗伊氏乳杆菌单用抑制作用较弱，其他组处于同一水平。
图1K显示，与MOD组相比，CON(P < 0.05)、Lre(P < 0.01)、MGFL(P < 0.01)、MGFLL(P < 0.0001)、MGFHL(P < 0.01)、MET(P < 0.01)组的TNF-α水平显著降低。合生元组合中的MGFLL抑制作用最强。
图1L显示，与MOD组相比，CON(P < 0.01)、MGFH(P < 0.001)、MGFLL(P < 0.0001)、MGFHL(P < 0.01)、MET(P < 0.0001)组的IFN-γ水平显著降低。合生元组合中的MGFLL抑制作用最强，与阳性药MET抑制作用处于同一水平。
图1M显示，与MOD组相比，CON(P < 0.01)、Lre(P < 0.05)、MGFLL(P < 0.05)、MGFHL(P < 0.05)、MET(P < 0.01)组的ICAM-1水平显著降低。其中合生元组合的抑制作用强于单独使用，阳性药MET作用最佳。
图1 N显示，与MOD组相比，CON(P < 0.05)、Lre(P < 0.001)、MGFL(P < 0.01)、MGFLL(P < 0.0001)组的IL-2水平显著降低。其中合生元组合中的MGFLL抑制效果最佳，强于单独使用及阳性药MET。
图1 O显示，与MOD组相比，CON(P < 0.01)组的IL-6水平显著降低，其他组与MOD组无显著差异。
由图1P可知，与MOD组相比，CON(P < 0.01), Lre(P < 0.0001), MGFL(P <0.0001), MGFH(P < 0.0001), MGFLL(P < 0.0001), MGFHL(P < 0.0001), MET(P <0.0001)组罗伊氏乳杆菌数量显著增高。其中合生元组合对罗伊氏乳杆菌的增殖作用最为显著，强于其单独使用及阳性药MET。
由图1 Q可知，与MOD组相比，Lre、MGFL组AI-2水平无显著差异，CON、 MGFH、MGFLL、 MGFHL、 MET组AI-2水平显著高于MOD组(P < 0.0001)。其中，合生元组合大鼠粪便的AI-2含量比单独使用高，与阳性药MET处于同一水平。
结果分析：
由1C-E可知，本发明合生元组合物芒果苷联合罗伊氏乳杆菌能够有效降低糖尿病大鼠的FBG，显著降低OGTT线下面积，强于其单独使用并且和阳性药MET效果相近，这一结果证实芒果苷联合罗伊氏乳杆菌能够提高糖尿病大鼠的糖耐量。
SCFAs由微生物组中的有益细菌产生，由图1I可知，芒果苷联合罗伊氏乳杆菌的合生元组合能够有效提高血清中的SCFAs含量，对促进宿主健康具有重要作用。
T2D大鼠肝门静脉血中LPS含量显著升高，使得LPS进入血液循环，诱导促炎因子产生，引起慢性低度炎症状态。与MOD组相比，给药组均能够显著降低LPS水平，并且降低一系列促炎因子TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-6及粘附分子ICAM-1水平。相较于其它组，合生元组合在抑制促炎因子产生方面具有突出优势。
罗伊氏乳杆菌在肠黏膜中具有很强的黏附能力，可拮抗有害菌定植，改善肠道菌群分布，促进肠道上皮组织的再生和修复，对保护维持肠道健康具有重要作用。图1P结果显示，合生元能够极大促进罗伊氏乳杆菌的增殖定植，这可能与群体感应信号分子AI-2的调节有关(图1Q)。
综合分析发现，比起芒果苷及罗伊氏乳杆菌单独干预，合生元组合能够更好的能够较大程度改善STZ所造成的胰岛及肝脏损伤，能够较好的改善STZ造成的胰岛素缺乏，对高血糖具有显著的控制作用，显著提高罗伊氏乳杆菌在肠道中的增殖定植，并且对T2D代谢紊乱所造成的SCFAs缺损及炎症反应有着良好的缓解作用，整体效果与阳性药MET相近。
2、组织病理学分析
实验方法：将大鼠肝脏、胰腺组织浸泡在4%多聚甲醛溶液，石蜡包埋，然后用苏木精-伊红染色。分别拍摄肝脏和胰腺的显微照片，染色切片在光学显微镜下放大400倍进行病理学分析。
结果分析：
从图2可知，CON组大鼠肝组织结构完整，肝索清晰，细胞排列规则，未出现脂肪变性、空泡变性等表现，MOD组肝组织中细胞排列紊乱，呈现弥漫性的脂肪变性，表现为明显的脂滴积聚增多，有大小不一的空泡，肝索排列紊乱。而给药组脂肪变性及肝索紊乱有所改善。相比于MOD组，各给药组有所改善，其中，合生元组合中的空泡变性较少，肝索排列较为规则，效果强于单独使用。从图3可知，COD组大鼠胰腺内胰岛数目及体积大致正常，形态规则，胰岛团为圆形或卵圆形，边界清晰，胰岛团内细胞数量较多，胞质丰富；MOD组胰腺体积明显缩小，且胰岛内细胞数量明显减少，形状不规则，毛细血管结构不清楚，部分胰岛组织结构甚至完全萎缩、崩解，与胰腺外分泌部交错，难以区分。相比于MOD组，各给药组有所改善，其中，合生元组合中胰岛细胞数量较多，胰岛细胞坏死减轻，胰岛轻度萎缩，形状较规则，排列较整齐，边界较清楚，胞浆较丰富，改善效果强于单独使用，与阳性药MET效果较为接近。说明合生元组合在一定程度上改善糖尿病大鼠肝脏及胰腺的器官病变。
3、肠道微生态分析
实验方法：每组抽取3个盲肠样本进行DNA抽提，PCR的扩增16S rRNA的V3-V4区(引物为338F:ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT)，之后构建文库并用MiSeq上机测序。另外，采用绝对定量方法测定各组大鼠粪便中罗伊氏乳杆菌的数量。
上述统计分析步骤如下：数据用平均值±标准差(SD)表示，采用 SPSS 16.0 统计软件分析处理数据，所有数据进行单因素方差分析(ANOVA)统计，检验结果均取 *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，**** P< 0.0001 作为统计学意义差异判断标准。
检测结果：
测序结果显示，微生物在门水平上主要归为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、 放线菌门(Actinobacteriota)、变形菌门(Proteobacteria)。如图所示，各组大鼠肠道微生物各菌门占比不同。与CON组大鼠相比，MOD组厚壁菌门占比增加，而拟杆菌门占比明显减少，且厚壁菌门/拟杆菌门比例明显升高。与MOD组相比，CON, Lre, MGFL,MGFH, MGFLL, MGFHL, MET组的厚壁菌门占比偏低，拟杆菌门比例处于较高水平(图4 A)，并且MGFH(P < 0.05), MGFHL(P < 0.01), MET(P < 0.05)组厚壁菌门/拟杆菌门比例显著低于MOD组(图4 D)。
肠道微生物在属水平上主要归为乳杆菌属(Lactobacillus)、norank_f__ Muribaculaceae、普氏菌属(Prevotella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、unclassified_ f__Lachnospiraceae、Lachnospiraceae_NK4A136_group、罗氏菌属(Roseburia)、norank_ f__norank_o__Clostridia_UCG-014、布劳特氏菌属(Blautia)、Allobaculum、 Ruminococcus、Phascolarctobacterium、Alloprevotella、Bacteroides、 Lachnoclostridium、Helicobacter。由图4 B可知，与CON组相比，MOD组中的乳杆菌属、普氏菌属、Alloprevotella比例明显较低，双歧杆菌属、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Roseburia、Allobaculum、Ruminococcus比例明显较高。与MOD组相比，药物干预后，各组中的乳杆菌属、普氏菌属、Phascolarctobacterium、Lachnoclostridium比例有所增加，Lachnospiraceae_NK4A136_group、Ruminococcus、Helicobacter比例降低。
肠道微生物在种水平上主要归为uncultured_bacterium_g__norank_f__ Muribaculaceae、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus_acidophilus)、uncultured_bacterium_g__ Prevotella、假长双歧杆菌(Bifidobacterium_pseudolongum)、unclassified_f__ Lachnospiraceae、unclassified_g__norank_f__Muribaculaceae、鼠乳杆菌(Lactobacillus_murinus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus_reuteri)、uncultured_ bacterium_g__Lachnospiraceae_NK4A136_group、Roseburia_sp._499、uncultured_ bacterium_g__UCG-005、unclassified_g__norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014、约氏乳杆菌(Lactobacillus_johnsonii)、unclassified_g__Phascolarctobacterium、肠乳杆菌(Lactobacillus_intestinalis)、Helicobacter_apodemus。与CON组相比，MOD组中的Lactobacillus_acidophilus、Bifidobacterium_pseudolongum、uncultured_ bacterium_g__Lachnospiraceae_NK4A136_group、Roseburia_sp._499占比明显升高，而unclassified_g__norank_f__Muribaculaceae、鼠乳杆菌(Lactobacillus_murinus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus_reuteri)、肠乳杆菌(Lactobacillus_intestinalis)明显减少。给与药物干预后，与MOD组相比，各给药组的Lactobacillus_acidophilus丰度增高, Lre、MGFL、MGFLL、MET组中的Bifidobacterium_pseudolongum比例有所增加，MGFLL、MGFHL、MET组中的Lactobacillus_murinus比例有所增加，Lre、MGFLL、MET组中的Lactobacillus_ reuteri比例有所增加，MGFLL组中的Lactobacillus_johnsonii比例有所增加。
组间显著性差异检验根据得到的群落丰度数据，运用统计学方法对不同组微生物群落之间的物种进行假设检验，评估物种丰度差异的显著性水平，获得组间显著性差异物种。图5 A显示，Ruminococcus、Phascolarctobacterium、norank_f__Eubacterium_ coprostanoligenes_group、Fusicatenibacter、NK4A214_group、Collinsella、 Romboutsia、Desulfovibrio等菌属在各组中的占比存在显著差异。与CON组相比，Lactobacillus_murinus、Lactobacillus_reuteri、Lactobacillus_intestinalis、Lactobacillus_johnsonii等益生菌在MOD组中占比减小。与MOD组相比，各给药组能够降低Ruminococcus、Desulfovibrio等菌属比例，增加Phascolarctobacterium比例；MGFL组中的Fusicatenibacter比例大大增加；MET组中的Collinsella、Fusicatenibacter比例增加，MET组中的Romboutsia减少。图5 B显示，unclassified_g__norank_f__Muribaculaceae、Lactobacillus_reuteri、Lactobacillus_johnsonii、unclassified_g__ Phascolarctobacterium、unclassified_g__Ruminococcus、uncultured_organism_g__ Fusicatenibacter、Collinsella_aerofaciens、Romboutsia_ilealis等菌种在各组间的占比存在显著差异。相比于芒果苷及罗伊氏乳杆菌的单独使用而言，合生元组合尤其是MGFLL的益生菌Lactobacillus_acidophilus、Bifidobacterium_pseudolongum、Lactobacillus_ johnsonii、Lactobacillus_reuteri等的丰度显著增加。
LEfSe是一种用于发现高维生物标识和揭示基因组特征的分析工具，包括基因，代谢和分类，用于区别两个或两个以上生物条件(或者是类群)。可以进行两个或多个分组的比较，能够在组与组之间寻找具有统计学差异的生物标识。图5C显示在不同组之间，各分类水平上都存在一定的显著差异。各组中LDA > 3的分类单元共有56种，其中，在CON、MOD、Lre、MGFL、MGFH、MGFLL、MET组中起到重要作用的微生物类群分别有15、15、3、5、4、10、4种。MGFHL组中没有发现标志性的生物类群。分析结果显示，罗伊氏乳杆菌在维持CON组的健康肠道微生态中起到关键作用，是标志微生物之一。
相关性heatmap图(图6)通过相关性数值可视化展示样本中不同的物种与临床变量之间的关系，采用Pearson分析评估微生物分类与临床变量之间的相关性。在属水平上(图6A)，norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group、Christensenellaceae_R-7_ group、NK4A214_group、Christensenellaceae_R-7_group、Lachnospiraceae_NK4A136_ group与SCFAs成负相关，Phascolarctobacterium、Lachnoclostridium与SCFAs成正相关。Prevotella与FINS成正相关。Dubosiella、norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_ group、Christensenellaceae_R-7_group、NK4A214_group与GC成正相关。CAG-352、 Frisingicoccus与FBG成正相关，Alloprevotella与FBG成负相关。norank_f__ Eubacterium_coprostanoligenes_group、norank_f__Lachnospiraceae与LPS成正相关，Blautia、Phascolarctobacterium、Lachnoclostridium与LPS成负相关。norank_f__ Eubacterium_coprostanoligenes_group、Lachnospiraceae_NK4A136_group、norank_f__ Lachnospiraceae与IFN-γ成正相关，Lactobacillus、Phascolarctobacterium与IFN-γ成负相关。unclassified_f__Lachnospiraceae与TNF-α成正相关，Lactobacillus、Blautia与TNF-α成负相关。
在种水平上，结果显示(图6B)，unclassified_g__Phascolarctobacterium、 unclassified_g__Lachnoclostridium、Lactobacillus_acidophilus与SCFAs成正相关，unclassified_g__Allobaculum、uncultured_bacterium_g__Lachnospiraceae_NK4A136_ group、unclassified_g__Lachnospiraceae_NK4A136_group与SCFAs成负相关。uncultured_bacterium_g__Prevotella与FINS成正相关。uncultured_organism_g__ norank_f__Muribaculaceae、uncultured_bacterium_g__CAG-352与FBG成正相关，Lactobacillus_reuteri、unclassified_g__norank_f__Muribaculaceae、uncultured_ bacterium_g__Alloprevotella与FBG成负相关。unclassified_f__Lachnospiraceae与TNF-α成正相关，Lactobacillus_reuteri、Lactobacillus_johnsonii与TNF-α成负相关。uncultured_bacterium_g__Lachnospiraceae_NK4A136_group、unclassified_g__ Lachnospiraceae_NK4A136_group与IFN-γ成正相关，unclassified_g__ Phascolarctobacterium、unclassified_g__norank_f__Muribaculaceae与IFN-γ成负相关。unclassified_g__Lachnospiraceae_NK4A136_group与LPS成正相关，unclassified_ g__Phascolarctobacterium、unclassified_g__Lachnoclostridium与LPS成负相关。
参照文献对产SCFAs菌丰度进行分析(图7)，在本发明中注释到的产乙酸菌主要有拟杆菌属、双歧杆菌属、嗜酸乳杆菌、普氏菌属、瘤胃球菌属、梭菌属、梭状芽胞杆菌，产丙酸菌主要有拟杆菌属、普氏菌属、梭状芽胞杆菌、考拉杆菌属、罗氏菌属、粪球菌属，产丁酸菌主要有嗜酸乳杆菌、瘤胃球菌属、梭状芽胞杆菌、粪球菌属、罗氏菌属、Anaerostipes、优杆菌属。与CON组相比，MOD组中产乙酸菌、产丁酸菌丰度有所升高，而产丙酸菌丰度没有显现出差异。与MOD组相比，各给药组的产SCFAs菌丰度均有所提高，尤其是合生元组合中的MGFHL组及MET组的丰度提升最为明显，优于其单独使用。
结果分析：
肠道菌群与糖尿病的发生和发展有着密切的关系，菌群多样性及结构变化直接影响着机体的糖代谢。本试验中，MOD组大鼠肠道多样性及丰度未有下降趋势，但是厚壁菌门/拟杆菌门比例明显增高。给予本发明合生元组合物芒果苷及罗伊氏乳杆菌干预后，能够有效降低厚壁菌门/拟杆菌门的比例。研究表明，T2D的肠道微生态变化通常表现为益生菌的减少(如产SCFAs细菌和参与胆汁酸代谢的细菌)，条件致病菌增加。本实验中，通过药物干预后，乳杆菌属、普氏菌属、考拉杆菌属Phascolarctobacterium、Lachnoclostridium丰度增加，而毛螺菌属Lachnospiraceae_NK4A136_group、瘤胃球菌属Ruminococcus、螺杆菌属Helicobacter丰度降低，作为益生菌的嗜酸乳杆菌、假长双歧杆菌、鼠乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、约氏乳杆菌等丰度有所提升，尤其是在MGFLL及MET组表现最为明显。这表明本发明提供的合生元组合物对提升益生菌丰度及维持肠道健康具有更强的作用效果。Pearson分析结果显示嗜酸乳杆菌与SCFAs成正相关，罗伊氏乳杆菌与FBG及TNF-α成负相关，并且罗伊氏乳杆菌在CON组中被标注为微生物标志物，在健康大鼠肠道中具有重要作用，表明罗伊氏乳杆菌对于T2D可能具有直接调节作用。
AI-2是细菌之间的交流语言，对于监控细菌的运动、粘附能力和生长、毒力因子的产生、生物发光、菌落形态、对抗生素的敏感性等都具有重要作用，肠道中的AI-2含量可能对肠道微生态的菌群密度监测有着重要作用。研究发现增加AI-2能够在门水平调节抗生素造成的肠道菌群紊乱，肠道AI-2水平可能是一个简易、快捷、廉价、无创监测肠道菌群多样性改变的指标。
本发明中，合生元组(MGFLL、MGFHL)能够增加益生菌在肠道中的占比，促进罗伊氏乳杆菌在糖尿病大鼠肠道中的增殖定植，提高肠道AI-2水平。从而可知，整体而言，罗伊氏乳杆菌联合芒果苷的合生元组合能够在一定程度上调节T2D造成的肠道菌群紊乱，促进肠道益生菌尤其是罗伊氏乳杆菌的增殖定植，增加产SCFAs菌的丰度，调节AI-2水平进而改善肠道菌群组成。
综上所述，芒果苷联合罗伊氏乳杆菌可通过调节菌群微生物发挥改善作用，增加胰岛素含量，在血糖调节中发挥重要作用。合生元组合治疗T2D的机制为增加益生菌罗伊氏乳杆菌的增殖定值，拮抗有害菌定植，通过调节AI-2水平改善肠道菌平衡，抑制宿主炎症反应，增强免疫功能，一定程度逆转T2D造成的肝脏及胰腺病变，进而改善糖代谢紊乱，整体效果与阳性药盐酸二甲双胍相当。另外，本发明提供的合生元组合具有较高的临床安全性，在给药过程中未发现大鼠有不良反应发生，不存在盐酸二甲双胍带来的腹泻、胃痉挛等副作用，因此本合生元组合在药物安全性上具有巨大优势，可作为预防和治疗T2D的潜在新一代制剂。
Claims (9)
1.一种治疗2型糖尿病的合生元组合物，其特征在于，所述合生元组合物由益生元和益生菌组成，所述益生元为芒果苷，所述益生菌为罗伊氏乳杆菌。
2.根据权利要求1所述治疗2型糖尿病的合生元组合物，其特征在于，所述芒果苷的剂量为20-60mg /kg/日，罗伊氏乳杆菌的剂量为以菌数计为5×108 -5×1010CFU/mL/日。
3.权利要求1所述治疗2型糖尿病的合生元组合物在制备治疗糖尿病药物中的应用。
4.一种治疗2型糖尿病的药物，其特征在于，所述药物以权利要求1所述所述合生元组合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或载体制备而成。
5.根据权利要求4所述的治疗2型糖尿病的药物，其特征在于，所述药物为单一的复方制剂。
6.根据权利要求4所述的治疗2型糖尿病的药物，其特征在于，所述药物为芒果苷制剂与罗伊氏乳杆菌制剂两种单独的制剂的组合。
7.根据权利要求6所述的治疗2型糖尿病的药物，其特征在于，所述的两种单独的制剂同时施用。
8.根据权利要求6所述的治疗2型糖尿病的药物，其特征在于，所述的两种单独的制剂依次施用。
9.权利要求4所述药物的剂型为胶囊剂、颗粒剂或口服液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220614 |