CN113207799A

CN113207799A - 一种二型糖尿病小鼠快速心衰模型的构建方法

Info

Publication number: CN113207799A
Application number: CN202110296508.0A
Authority: CN
Inventors: 蔡卫斌; 吴燕笛; 黄统生; 李兴会
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2021-03-19
Filing date: 2021-03-19
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2041-03-19
Also published as: CN113207799B

Abstract

本发明提供了一种二型糖尿病小鼠快速心衰模型的构建方法，涉及到AGN193109在构建二型糖尿病小鼠快速心衰模型方面的应用，具体是高脂饮食联合链脲佐菌素诱导得到二型糖尿病小鼠模型，再给药小分子化合物AGN 193109。本发明在不添加对二型糖尿病小鼠心肌会产生毒副作用的药物的情况下，将小鼠的心衰时间缩短了一半，达到了在小鼠血糖稳定快速上升，且产生更严重的高血糖、高血脂及胰岛素抵抗的同时，15周就出现心肌结构功能受损的目的。本发明的模型构建方法具有成模快、成模率高、病理改变一致程度高等优点，构建出的模型能很好地作为人二型糖尿病心肌病复制和研究的工具，对二型糖尿病心肌病相关研究具有相当的必要性。

Description

一种二型糖尿病小鼠快速心衰模型的构建方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体地，涉及一种二型糖尿病小鼠快速心衰模型的构建方法。

背景技术

心血管疾病严重危害了人类的生命与健康，导致了沉重的社会经济负担，已是全球性重大公共卫生问题。糖尿病作为心血管疾病的主要危险因素之一，因其患病人数众多，且死亡率高而格外引人关注，据国际糖尿病联合会(International DiabetesFederation，IDF)统计，全球糖尿病患者数已达4.63亿，而中国是全球糖尿病最高发的国家。随着胰岛素的临床应用和新型治疗手段的出现，二型糖尿病病人寿命延长，但原本隐匿或晚发的二型糖尿病心肌损伤却“从幕后走到台前”，成为了糖尿病患者死亡的主要原因，现有约50％～80％的糖尿病患者死于心血管疾病。二型糖尿病心肌病是美国心脏科医生Shirley Rubler等于1972年首次提出的，是一种独立于高血压和冠状动脉疾病的原发型心肌损伤。二型糖尿病患者即使在无心肌缺血及高血压时，心脏也会发生以心肌细胞肥大、间质纤维化、PAS阳性物质浸润、冠状小动脉基底膜增厚、心肌内微血管病变等为特征的明显病理改变，这些病理改变会使患者出现左心室舒张和/或收缩功能障碍，最终导致心力衰竭、心源性休克，甚至猝死。然而时至今日，研究者们对于二型糖尿病心肌病发生发展的机制了解得仍不充分，临床上也缺乏对二型糖尿病心肌病的有效防治策略和治疗措施。

应用疾病动物模型模拟人类疾病，寻找潜在的分子机制和治疗靶点，为人类疾病的研究提供了极大的便利，但现有的二型糖尿病相关的动物模型，面临着造模时间长、动物死亡率高、成模率低、病理改变程度个体差异大等问题。如现有多以基因修饰的方法建立的二型糖尿病小鼠模型，选用瘦素敲除的ob/ob小鼠、瘦素受体敲除的db/db小鼠或引入了黄色肥胖基因的KK-Ay小鼠等，在应用上均存在着成本高，且难免受到相关基因限制的缺点；又如Li Xinghui et al.Distinct cardiac energy metabolism and oxidative stressadaptations between obese and non-obese type 2diabetes mellitus.[J].Theranostics,2020,10(6):2675-2695，公开了一种高脂饮食联合链脲佐菌素(STZ)诱导的二型糖尿病小鼠，虽因其模型的致病方式与人二型糖尿病患病机理相似(即高脂饮食和轻微胰岛β细胞受损，导致胰岛素抵抗和高血糖)，且造模成本低廉，成为了研究人二型糖尿病的良好动物模型，但若将其作为二型糖尿病心肌病的动物模型，会存在血糖不够稳定，以及成模36周后才能出现心肌功能障碍等的缺陷。上述这些问题极大地增加了推进二型糖尿病心肌病相关研究的难度和成本，也限制着二型糖尿病心肌病相关研究的进展。

因此，在现有二型糖尿病小鼠模型的基础上，结合二型糖尿病心肌病发病的分子机制予以改进，构建出二型糖尿病小鼠快速心衰模型，是加速二型糖尿病心肌病相关研究进展的良策。

发明内容

本发明要解决的是现有二型糖尿病小鼠心衰模型存在的不足和缺陷，旨在提供一种二型糖尿病小鼠快速心衰模型的构建方法，涉及到AGN 193109在构建二型糖尿病小鼠快速心衰模型方面的应用，具体是高脂饮食联合链脲佐菌素诱导得到二型糖尿病小鼠模型，再给药小分子化合物AGN 193109。

因此，本发明的第一目的是提供AGN 193109在构建二型糖尿病小鼠快速心衰模型方面的应用。

本发明的第二目的是提供一种二型糖尿病小鼠快速心衰模型的构建方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了AGN 193109在构建二型糖尿病小鼠快速心衰模型方面的应用。

此外，本发明还提供了一种二型糖尿病小鼠快速心衰模型的构建方法，具体是高脂饮食联合链脲佐菌素诱导得到二型糖尿病小鼠模型，再给药小分子化合物AGN 193109。

优选地，所述AGN 193109的配制方法为先用DMSO促溶，再用无毒副作用的有机溶剂稀释。

最优选地，所述有机溶剂为玉米油。

优选地，所述小鼠为4周龄C57BL/6小鼠。

优选地，所述给药方式为灌胃，直至所述小鼠的左心室射血分数出现下降，即得所述二型糖尿病小鼠快速心衰模型。

更优选地，所述下降为下降至射血分数小于60％。

更优选地，所述灌胃为每天以1.15μMol/kg_体重的用量灌胃一次。

进一步优选地，所述灌胃为每天早上九点灌胃。

进一步优选地，所述二型糖尿病小鼠模型给药小分子化合物AGN 193109期间，维持高脂饮食。

优选地，所述高脂饮食选用的饲料营养素能量配比为20％蛋白、20％碳水化合物和60％脂肪。

比如，作为一种可选择的方案，所述高脂饮食选用的饲料为代号D12492，含60％卡路里的超高脂饲料。

具体地，作为一种可选择的方案，所述二型糖尿病小鼠快速心衰模型的构建方法为：选用4周龄的C57BL/6小鼠，以高脂饲料喂养，自由摄食饮水至12周龄后，对其腹腔注射剂量为35mg/kg_体重的链脲佐菌素，连续注射7天，注射期间夜间禁食，全天饮用浓度为10％的蔗糖水，注射结束2周后测定小鼠空腹血糖，血糖≥11.1mM的小鼠即为成功诱导出的二型糖尿病小鼠；再每天一次，采用用量为1.15μMol/kg_体重的AGN 193109进行灌胃，期间继续高脂饮食，直至所述小鼠的左心室射血分数下降至小于60％，即得所述二型糖尿病小鼠快速心衰模型。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种二型糖尿病小鼠快速心衰模型的构建方法，涉及到AGN 193109在构建二型糖尿病小鼠快速心衰模型方面的应用，具体是高脂饮食联合链脲佐菌素诱导得到二型糖尿病小鼠模型，再给药小分子化合物AGN 193109。本发明在不添加对二型糖尿病小鼠心肌会产生毒副作用的药物的情况下，将小鼠的心衰时间缩短了一半，达到了在小鼠血糖稳定快速上升，且产生更严重的高血糖、高血脂及胰岛素抵抗的同时，15周就出现心肌细胞肥大、间质纤维化、左心室收缩功能障碍的病理性改变的目的。本发明的模型构建方法具有成模快、成模率高、病理改变一致程度高等优点，构建出的模型能很好地作为人二型糖尿病心肌病复制和研究的工具，对二型糖尿病心肌病相关研究具有相当的必要性。

附图说明

图1A是体重变化图；图1B是血糖变化图。

图2A是胰岛素耐量实验血糖改变程度图；图2B是胰岛素耐量实验血糖改变程度曲线下面积图。

图3A是心脏超声示意图；图3B是左心室射血分数统计图；图3C是左心室缩短分数统计图。

图4A是甘油三酯测定结果；图4B是总胆固醇测定结果；图4C是低密度脂蛋白测定结果；图4D是高密度脂蛋白测定结果。

图5A是心肌HE染色图；图5B是细胞面积统计分析结果。

图6A是心肌Masson染色图；图6B是胶原沉积面积统计分析结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1一种二型糖尿病小鼠快速心衰模型的构建方法

一、实验材料

1.4周龄的雄性C57BL/6小鼠：市购；

2.高脂饲料：代号D12492，含60％卡路里的超高脂饲料，该饲料的营养素能量配比为：20％蛋白，20％碳水化合物，60％脂肪；

3.链脲佐菌素：纯度为HPLC≥98％的链脲佐菌素，临用前以0.1M的柠檬酸缓冲液溶解，调PH至4.0～4.5，现用现配；

4.AGN 193109：纯度为HPLC≥98％的AGN 193109，少量DMSO促溶后，再用玉米油稀释至575nMol/L。

二、实验分组

选择75只4周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为三组，分别为野生组、STZ组和STZ+AGN组。

野生组以普通小鼠饲料喂养，自由饮水摄食。

STZ组和STZ+AGN组小鼠，以高脂饲料喂养，自由饮水摄食至12周龄后，对其腹腔注射剂量为35mg/kg_体重的链脲佐菌素(STZ)，连续注射7天，注射期间夜间禁食，全天饮用浓度为10％的蔗糖水，注射结束2周后测定小鼠空腹血糖，血糖≥11.1mM的小鼠即为成功诱导出的二型糖尿病小鼠，再将STZ组和STZ+AGN组的小鼠混合，重新随机分配成两组，再按照以下方式处理：

(1)STZ组小鼠每天一次，采用用量为1.15μMol/kg_体重的玉米油进行灌胃，期间继续高脂饮食。

(2)STZ+AGN组小鼠每天一次，采用用量为1.15μMol/kg_体重的AGN 193109进行灌胃，期间继续高脂饮食，直至STZ+AGN组小鼠的左心室射血分数下降至小于60％时，历时15周，结束三组小鼠模型的构建。

实施例2体重、空腹血糖及胰岛素耐量的检测

一、检测方法

每组随机选取5只小鼠用来检测体重、空腹血糖和胰岛素耐量，检测前禁食不禁水12小时。先对小鼠称重(图1A)，再用强生稳豪型血糖仪测量血糖值(图1B)，最后腹腔注射1IU/kg_体重剂量的胰岛素，检测并记录小鼠注射胰岛素后第15、30、60、90及120分钟时的血糖值(图2A和图2B)。

二、结果分析

由图1A可知，STZ组和STZ+AGN组的小鼠体重变化没有差异，且全程与野生组小鼠维持一致；

由图1B可知，与野生组小鼠相比，STZ组和STZ+AGN组的小鼠血糖明显升高，且STZ+AGN组小鼠血糖升高得更快且更稳定。(***，p<0.001，与野生组比较；#，p<0.05，与STZ组比较；##，p<0.01，与STZ组比较)；

由图2A和图2B可知，与野生组小鼠相比，STZ组和STZ+AGN组的小鼠均存在胰岛素耐量受损，且STZ+AGN组小鼠的胰岛素耐量受损程度高于STZ组小鼠。(***，p<0.001，与野生组比较；###，p<0.001，与STZ组比较)。

实施例3心功能的检测

心功能障碍是二型糖尿病心肌病的主要特征，在二型糖尿病心肌病的早期，以舒张性功能障碍为主，在后期以收缩性功能障碍为主。以射血分数下降为特征的左心室收缩功能受损，是判断小鼠发生二型糖尿病心肌病的标准。

一、检测方法

每组随机选取5只小鼠用来检测心功能，所用设备为Vevo 3100小动物超声仪。小鼠异氟烷吸入麻醉，在麻醉状态下用脱毛膏对小鼠胸部脱毛，仰卧位置于恒温加热板上，持续性吸入异氟烷。小鼠四肢与心电图电极相连，用于检测心率并记录心电图，30MHz探头于小鼠左胸骨部位探测(图3A)。短轴，行M型超声测量左心室射血分数(图3B)和左心室缩短分数(图3C)，以评价心脏收缩功能。

二、结果分析

结果显示，与野生组和STZ组小鼠比较，STZ+AGN组的小鼠在成模15周时，就出现了左心室射血分数和左心室缩短分数的显著降低，表明其心功能严重受损，发生了心力衰竭。

实施例4血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的检测

一、检测方法

每组随机选取5只小鼠用来检测小鼠血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白，到达实验终点后，提前12小时禁食不禁水。戊巴比妥麻醉后，以眼科镊行摘眼球取全血，所得全血室温静置半小时，2500转4℃离心15分钟，吸取上清，-80℃保存或进行后续检测。血清的甘油三酯(图4A)、总胆固醇(图4B)、低密度脂蛋白(图4C)和高密度脂蛋白(图4D)均使用南京建成相应试剂盒检测。

二、结果分析

结果显示，与野生组小鼠相比较，STZ组小鼠的血脂异常体现在：血清中的总胆固醇和低密度脂蛋白水平显著升高，但甘油三酯和高密度脂蛋白水平没有发生明显改变；STZ+AGN组小鼠的血脂异常体现在：血清甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白水平显著升高，但高密度脂蛋白水平没有发生明显改变。另外，STZ+AGN组小鼠的总胆固醇和低密度脂蛋白水平也显著高于STZ组小鼠。(**，p<0.01，与野生组比较；#，p<0.05，与STZ组比较；##，p<0.01，与STZ组比较)

实施例5病理的检测

心肌细胞肥大是二型糖尿病心肌病的主要病理特征，被认为是心肌细胞在长期高负荷状况下的一种代偿反应。心肌细胞肥大是导致心力衰竭的独立危险因素。

心肌纤维化是以心脏间质成纤维细胞过度增殖、胶原过度沉积及异常分布为特征的心脏间质重构，是二型糖尿病心肌病的主要病理特征。

一、检测方法

(1)制备心脏石蜡切片：

每组随机选取10只小鼠用来进行病理检测。小鼠达到实验终点后，提前12小时禁食不禁水。戊巴比妥麻醉后，以眼科剪开胸，剪开右心耳，用注射器从小鼠左心室灌注无菌PBS至血液流尽，剪下心脏，用PBS漂洗至无血渍，4％多聚甲醛固定过夜。次日，PBS洗3次，每次30分钟；25％乙醇、50％乙醇、75％乙醇、90％乙醇、无水乙醇(Ⅰ)、无水乙醇(Ⅱ)梯度脱水，各30分钟；二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)各15分钟；石蜡(Ⅰ)、石蜡(Ⅱ)各60分钟；脱水后，心脏平放于石蜡中包埋；徕卡石蜡切片机切片，片厚5μm。

(2)心肌细胞肥大的检测：

每组随机选取5个心脏石蜡切片进行心肌细胞肥大的检测实验，心脏石蜡切片HE染色，主要步骤为：60℃烘烤30分钟→二甲苯(Ⅰ)10分钟→二甲苯(Ⅱ)10分钟→无水乙醇(Ⅰ)3分钟→无水乙醇(Ⅱ)3分钟→95％乙醇(Ⅰ)1分钟→70％乙醇1分钟→蒸馏水2分钟→苏木素液5-10分钟→流水洗去苏木素1-3秒钟→1％盐酸酒精1-2秒钟→流水冲洗20分钟→蒸馏水过洗1-2秒钟→0.5％伊红2分钟→蒸馏水稍洗1-2秒钟→95％乙醇(Ⅱ)2-3秒钟→无水乙醇(Ⅲ)3-5秒钟→无水乙醇(Ⅳ)5-10秒钟→二甲苯(Ⅰ)2分钟→二甲苯(Ⅱ)2分钟→中性树胶封片观察(图5A)→Image J软件分析细胞面积(图5B)。

(3)心肌细胞间质纤维化的检测：

每组剩余5个心脏石蜡切片进行心肌细胞间质纤维化的检测实验，心脏石蜡切片Masson染色，主要步骤为：60℃烘烤30分钟→二甲苯(Ⅰ)10分钟→二甲苯(Ⅱ)10分钟→无水乙醇(Ⅰ)3分钟→无水乙醇(Ⅱ)3分钟→95％乙醇(Ⅰ)1分钟→70％乙醇1分钟→蒸馏水2分钟→Weigert氏铁苏木素染5分钟→流水洗去苏木素1-3秒钟→1％盐酸酒精1-2秒钟→流水冲洗20分钟→蒸馏水过洗1-2秒钟→丽春红酸性品红液染5-10分钟→蒸馏水快速漂洗数秒→磷钼酸水溶液处理约3-5分钟→苯胺蓝液复染分钟→1％冰醋酸处理分钟→95％乙醇(Ⅱ)2-3秒钟→无水乙醇(Ⅲ)3-5秒钟→无水乙醇(Ⅳ)5-10秒钟→二甲苯(Ⅰ)2分钟→二甲苯(Ⅱ)2分钟→中性树胶封片观察(图6A)→Image J软件分析胶原沉积面积(图6B)。

二、结果分析

结果显示，与野生组和STZ组小鼠比较，STZ+AGN组的小鼠在成模15周时，出现了严重的心肌细胞肥大和心肌细胞间质纤维化。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.AGN 193109在构建二型糖尿病小鼠快速心衰模型方面的应用。

2.一种二型糖尿病小鼠快速心衰模型的构建方法，其特征在于，高脂饮食联合链脲佐菌素诱导得到二型糖尿病小鼠模型，再给药小分子化合物AGN193109。

3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，所述AGN 193109的配制方法为先用DMSO促溶，再用无毒副作用的有机溶剂稀释。

4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，所述有机溶剂为玉米油。

5.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，所述小鼠为4周龄C57BL/6小鼠。

6.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，所述给药方式为灌胃，直至所述小鼠的左心室射血分数出现下降，即得所述二型糖尿病小鼠快速心衰模型。

7.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，所述下降为下降至射血分数小于60％。

8.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，所述灌胃为每天以1.15μMol/kg_体重的用量灌胃一次。

9.根据权利要求8所述构建方法，其特征在于，所述灌胃为每天早上九点灌胃。

10.根据权利要求1～9所述构建方法，其特征在于，所述二型糖尿病小鼠模型给药小分子化合物AGN 193109期间，维持高脂饮食。