CN109078011A

CN109078011A - 鸢尾苷元及其衍生物在防治胰岛素抵抗疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN109078011A
Application number: CN201811171293.4A
Authority: CN
Inventors: 孙陆果; 李玉新; 姚新蕾; 于春雷; 刘磊; 鲍永利; 王淑跃
Original assignee: Northeast Normal University
Current assignee: Northeastern University China; Northeast Normal University
Priority date: 2018-10-01
Filing date: 2018-10-01
Publication date: 2018-12-25

Abstract

本发明涉及一种鸢尾苷元及其衍生物在防治胰岛素抵抗疾病药物中的应用，属于生物医药领域。本发明所述鸢尾苷元及其衍生物具有防治胰岛素抵抗疾病的作用，能促进胰岛素靶组织对葡萄糖的摄取能力，增强胰岛素抵抗细胞对胰岛素的敏感性；对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠，可改善其胰岛素抵抗状态和由此引起的高糖血症和高胰岛素血症，对胰岛素抵抗具有明确的预防和治疗作用。

Description

鸢尾苷元及其衍生物在防治胰岛素抵抗疾病药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其是指一种鸢尾苷元及其衍生物在制备用于防治胰岛素抵抗相关疾病药物中的用途。

背景技术

胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)是指单位浓度胰岛素产生的细胞效应减弱，即胰岛素作用的靶器官、组织，如骨骼肌、脂肪和肝脏等，对胰岛素的反应性或敏感性下降，导致胰岛素介导的细胞摄取和代谢葡萄糖的能力降低。胰岛素通过与靶细胞表面的胰岛素受体结合，来激活细胞内的PI3K/AKT信号通路，活化的AKT通过激活底物最终促进葡萄糖转运蛋白(glucose transporters,GLUT)易位到细胞膜表面来摄取血中的葡萄糖并将其转运到细胞内进行代谢(SALTIEL A R,et al.Nature,2001,414(6865):799-806)。胰岛素抵抗即是以上介绍的胰岛素介导的信号传导过程出现障碍，导致胰岛素靶组织、器官对葡萄糖的摄取能力减弱，从而无法有效进行葡萄糖的摄取和利用(SHAO J,et al.TheJournal of endocrinology,2000,167(1):107-15.)。

胰岛素抵抗的概念是由Reaven在1988年首先提出(Reaven GM.Diabetes.1988,37(12):1595-607)，现如今发现它与多种代谢相关的疾病相关，被认为是这些代谢相关疾病即统称为代谢综合征的发病基础。传统的代谢综合征包括中心性肥胖、糖尿病、糖耐量受损、高胰岛素血症或高胰岛素原血症、高血脂、高血压(Vasudevan AR,et al.MinervaEndocrinol,2005,30(3):101-19.)，以及动脉粥样硬化类疾病，如心脑血管疾病(KachurS,et al.Minerva Med,2017,108(3):212-228；Tanne D,et al.AdvCardiol,2008,45:107-13.)等。随着近些年的深入研究，代谢综合征所包含的病症还在不断扩大，比如高尿酸血症(Battelli MG,et al.BiochimBiophysActa,2018,1864(8):2557-2565.)、多囊卵巢综合征(PCOS)、非酒精性脂肪肝(NAFLD)(Petta S,et al.PLoS One,2017,12(11):e0186136.)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)(Ande SR,et al.Sci Rep,2016,6:23608.)以及高纤维蛋白原血症(Martins C,et al.J Ren Nutr,2007,17(2):132-7.)等也被归入代谢综合征。这些疾病或病征的发病均直接或间接与胰岛素抵抗有关，因此胰岛素抵抗成为公众健康最严重的威胁之一。

胰岛素抵抗的发病机制较为复杂，遗传因素、肥胖、饮食习惯和年龄等在其发病过程中均发挥重要的作用。临床研究发现，约25％的正常人群存在胰岛素抵抗，糖耐量低减(IGT)人群75％存在胰岛素抵抗，II型糖尿病患者胰岛素抵抗的发生率为85％左右(MlinarB,et al.ClinChimActa,2007,375(1-2):20-35.)。目前胰岛素抵抗治疗药物是以噻唑烷二酮(thiazolidinedione,TZD)为典型代表的胰岛素增敏剂。TZD的作用机制是作用于PPARγ受体，调整胰岛素控制基因，提高周围肌肉和脂肪组织中胰岛素敏感性。此外治疗糖尿病的经典药物-双胍类药物也具有提高外周组织对胰岛素敏感性的作用(He L,et al.CellMetab,2015,21(2):159-162.)。这些药物治疗的有效性均很有限，只能部分改善胰岛素抵抗状态。除此之外，还容易产生耐药性，并且具有一定的副作用，比如TZD可引起严重的肝损伤而双胍类药物具有胃肠道反应。因此开发新型的改善胰岛素抵抗的药物仍是当前的关注重点。

鸢尾苷元(Tectorigenin)，又名鸢尾黄素，是一种天然存在的异黄酮类化合物，存在于鸢尾科鸢尾属和射干属的植物根茎中。

鸢尾苷元及其衍生物的结构通式如下：

其中：

鸢尾苷元(R4，R5，R7为H，R1，R3，R6为OH，R2为OCH₃，化学名为4’,5,7-三羟基-6-甲氧基异黄酮，结构如图1所示)、鸢尾苷(R4，R5，R7为H，R1，R6为OH，R2为OCH₃，R3为Oglc)、野鸢尾苷(R4为H，R1，R5为OH，R2，R6，R7为OCH₃，R3为Oglc)、次野鸢尾黄素(R4为H，R1，R5，R6，R7为OCH₃，R2-O-CH₂-O-R3)、野鸢尾苷元(R4为H，R1，R3，R5为OH，R2，R6，R7为OCH₃)、鸢尾苷元-4’-葡萄糖苷(R4，R5，R7为H，R1，R3为OH，R2为OCH₃，R6为Oglc)、去亚甲基次野鸢尾黄素(R4为H，R2，R3为OH，R1，R5，R6，R7为OCH₃)、去甲基次野鸢尾黄素(R4为H，R2，R3为OH，R1，R5，R6，R7为OCH₃)、鸢尾甲黄素A(R4，R7为H，R1，R3，R5为OH，R2，R6为OCH₃)、5，6，7，3’-四羟基-4’-甲氧基异黄酮(R4，R7为H，R1，R2，R3，R5为OH，R6为OCH₃)、5，7-二羟基-6，3’，4’，5’-四甲氧基异黄酮(R4为H，R1，R3为OH，R2，R5，R6，R7为OCH₃)、5，7，3’-三羟基-8，4’，5’-三甲氧基异黄酮(R2为H，R1，R3，R5为OH，R4，R6，R7为OCH₃)、5，7，4’-三羟基-6，3’，5’-三甲氧基异黄酮(R4为H，R1，R3，R6为OH，R2，R5，R7为OCH₃)、5，3’，5’-三甲氧基-6，7-亚甲二氧基异黄酮-4’-O-β-D-葡萄糖(R4为H，R1，R5，R7为OCH₃，R6为Oglc，R2-O-CH2-O-R3)。

迄今为止，还未见有关于鸢尾苷元及其衍生物改善胰岛素靶组织、器官，如肌肉、肝脏和脂肪等胰岛素抵抗状态的研究报道。

发明内容

本发明提供一种鸢尾苷元及其衍生物在防治胰岛素抵抗疾病药物中的应用。

本发明采取的技方案是：

鸢尾苷元及其衍生物在防治胰岛素抵抗疾病药物中的应用。

本发明所述的胰岛素抵抗疾病是指与胰岛素靶组织葡萄糖代谢相关的疾病。

本发明所述的胰岛素抵抗疾病包括：中心性肥胖、糖尿病、糖耐量受损、高胰岛素血症、高血压、高血脂、动脉粥样硬化、高尿酸血症、多囊卵巢综合征、非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎或高纤维蛋白原血症。

本发明所述的胰岛素靶组织，包括骨骼肌、脂肪或肝脏组织。

本发明所述的鸢尾苷元化学名为4’,5,7-三羟基-6-甲氧基异黄酮。

本发明所述的鸢尾苷元衍生物包括：鸢尾苷、野鸢尾苷、次野鸢尾黄素、野鸢尾苷元、鸢尾苷元-4’-葡萄糖苷、去亚甲基次野鸢尾黄素、去甲基次野鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A、5，6，7，3’-四羟基-4’-甲氧基异黄酮、5，7-二羟基-6、3’，4’，5’-四甲氧基异黄酮、5，7，3’-三羟基-8，4’，5’-三甲氧基异黄酮、5，7，4’-三羟基-6、3’，5’-三甲氧基异黄酮或5，3’，5’-三甲氧基-6、7-亚甲二氧基异黄酮-4’-O-β-D-葡萄糖。

本发明发现鸢尾苷元及其衍生物具有改善胰岛素靶组织胰岛素抵抗的作用，表现为在体外的实验研究中，可提高胰岛素靶组织来源细胞系对葡萄糖的摄取能力(表1-3)，改善胰岛素抵抗状态细胞对胰岛素的敏感性，表现为提高胰岛素刺激下的磷酸化AKT的水平(图2)。

本发明发现鸢尾苷元及其衍生物具有改善胰岛素靶组织胰岛素抵抗的作用，还表现为在体内的实验研究中，预防性应用鸢尾苷元可呈剂量依赖性改善高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠的胰岛素耐受不良(图3)，减轻胰岛素抵抗状态，进而部分抑制胰岛素抵抗引起的体内血糖(图4)和血清胰岛素水平(图5)的升高。同样，治疗性应用鸢尾苷元可纠正胰岛素抵抗小鼠的胰岛素耐受不良(图6)，改善胰岛素抵抗状态，进而恢复胰岛素抵抗小鼠体内的血糖(图7)和血清胰岛素(图8)至正常水平。

本发明所述的鸢尾苷元及其衍生物单独或组合物，作为可预防和治疗胰岛素抵抗相关的代谢综合征的药物，亦在本发明的范围之内。

本发明所述的鸢尾苷元及其衍生物的剂量使用范围为10mg/kg～40mg/kg。

本发明用于制备防治胰岛素抵抗疾病的药物时，其口服或非口服给药均是安全的。在口服情况下，其可以是任何常规形式给药，如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸、软胶囊、漂浮剂、口服液、悬浮液、糖浆、口腔含片、喷雾剂或气雾剂等；当该药物非口服给药时，可采用任何常规形式，如栓剂、注射剂：静脉注射、肌肉注射、软膏剂、吸入剂等。

本发明制备防治胰岛素抵抗疾病的药物时是与固体或液体的赋形剂一起构成的，这里使用的固体或液体赋形剂在本领域是众所周知的，下面举几个具体例子，固体制剂的赋形剂有乳糖、淀粉、浆糊精、碳酸钙、合成或天然硫酸铝、氯化镁、硬脂酸镁，碳酸氢钠、干燥酵母等；液体制剂的赋形剂有水、甘油、丙二醇、单糖浆、乙醇、乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇等；软膏剂的赋形剂可以使用脂油，含水羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蜡、木腊、液体石蜡、树脂、高级蜡等组合成的疏水剂或亲水剂。

本发明发现鸢尾苷元及其衍生物可提高肌肉、肝脏和脂肪细胞对葡萄糖的吸收能力，深入研究发现鸢尾苷元可增强靶细胞对胰岛素的敏感性，尤其可增强已发生胰岛素抵抗细胞对胰岛素的敏感性，表现为胰岛素介导的磷酸化AKT水平的增高；在此基础上，利用高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠进一步证明鸢尾苷元可纠正机体对胰岛素的耐受不良，改善胰岛素抵抗状态，从而维持或恢复胰岛素抵抗状态下体内血糖及胰岛素正常水平。本发明为将来将鸢尾苷元及其衍生物开发为一种新型改善胰岛素抵抗药物提供了实验依据。

附图说明

图1是鸢尾苷元的化学结构，化学名为4’,5,7-三羟基-6-甲氧基异黄酮，是以3-苯基苯并吡喃酮为母体的多羟基酚类化合物，结构与雌二醇相似,故称为植物雌激素；

图2显示鸢尾苷元可增加发生胰岛素抵抗的骨骼肌细胞对胰岛素的敏感性；在正常(normal)情况下，骨骼肌细胞在无胰岛素刺激的情况下，磷酸化AKT水平很低(左起第1泳道)，而当加入胰岛素刺激后，磷酸化AKT水平明显增加(左起第5泳道)，说明细胞对胰岛素反应良好；但当诱导细胞发生胰岛素抵抗(IR)后，再加入胰岛素短时间刺激，与normal组细胞(左起第5泳道)相比，胰岛素介导的磷酸化AKT水平明显降低(左起第6泳道)；而当同时用鸢尾苷元处理后，发现normal和IR组细胞，在无胰岛素刺激时，鸢尾苷元对本底磷酸化AKT的水平均无明显影响(左起第2、4泳道)；但在胰岛素刺激的情况下，无论是normal还是IR组细胞，与未加鸢尾苷元处理的细胞(左起第5、6泳道)相比，鸢尾苷元处理细胞中胰岛素介导的磷酸化AKT水平(左起第7、8泳道)，均明显增加，说明鸢尾苷元处理的细胞对胰岛素的敏感性明显增加，尤其增加了已发生IR细胞对胰岛素的敏感性；

图3显示预防性给予鸢尾苷元可改善胰岛素抵抗小鼠的胰岛素耐受不良；与正常小鼠相比，高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠在腹腔注射胰岛素耐量实验(IPITT)中，在注射胰岛素后，空腹血糖水平下降缓慢，且在各个时间点的血糖水平均高于正常组(A)，曲线下面积AUC(B)亦显示胰岛素抵抗模型组显著高于正常组，提示胰岛素耐量出现异常；而预防性给予不同剂量的鸢尾苷元后，在注射胰岛素的0min-15min内，20kg/mg和40kg/mg鸢尾苷元预防组与胰岛素抵抗模型组相比，血糖均显著降低；在15min-30min内，40kg/mg鸢尾苷元预防组与模型组相比，血糖亦显著降低(A)。胰岛素耐量曲线下面积AUC分析显示(B)，三种不同剂量鸢尾苷元预防组小鼠的胰岛素耐量受损均有一定程度的缓解，并具有统计学显著性。数据表示为均数±标准差(n≥6)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；

图4显示预防性给予鸢尾苷元可抑制胰岛素抵抗小鼠空腹血糖水平的升高；与正常小鼠相比，胰岛素抵抗模型组小鼠血糖明显增高，而预防性应用低、中、高剂量的鸢尾苷元均可明显降低胰岛素抵抗小鼠的空腹血糖水平；数据表示为均数±标准差(n≥6)，***P＜0.001；

图5显示预防性给予鸢尾苷元可抑制胰岛素抵抗小鼠血清胰岛素水平的升高；胰岛素抵抗模型组小鼠血清中胰岛素水平与正常小鼠相比明显增高，而预防性应用鸢尾苷元可呈剂量依赖性降低胰岛素抵抗小鼠血清中胰岛素水平，其中20kg/mg和40kg/mg鸢尾苷元预防组小鼠差异达到统计学显著性。数据表示为均数±标准差(n≥6)，**P＜0.01，***P＜0.001；

图6显示治疗性给予鸢尾苷元可纠正胰岛素抵抗小鼠胰岛素耐受不良；注射胰岛素后血糖水平曲线(A)及AUC(B)提示，治疗性应用不同剂量的鸢尾苷元可不同程度地改善胰岛素抵抗小鼠胰岛素耐受不良，AUC结果提示40kg/mg鸢尾苷元治疗组小鼠差异达到统计学显著性；数据表示为均数±标准差(n≥6)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；

图7显示治疗性给予鸢尾苷元可降低胰岛素抵抗小鼠的空腹血糖水平；治疗性应用鸢尾苷元可呈剂量依赖性降低胰岛素抵抗小鼠空腹血糖的水平，其中20kg/mg和40kg/mg鸢尾苷元治疗组小鼠差异达到统计学显著性，数据表示为均数±标准差(n≥6)，*P＜0.05，***P＜0.001；

图8显示治疗性给予鸢尾苷元可降低胰岛素抵抗小鼠的血清胰岛素水平；治疗性应用不同剂量的鸢尾苷元可不同程度地降低胰岛素抵抗小鼠血清胰岛素的水平，其中40kg/mg鸢尾苷元治疗组小鼠差异达到统计学显著性；数据表示为均数±标准差(n≥6)，*P＜0.05，***P＜0.001。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明进行说明，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例而不是全部，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，本发明的保护范围由权利要求限定。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、鸢尾苷元及其衍生物对胰岛素介导的骨骼肌、脂肪和肝等细胞摄取葡萄糖的影响

骨骼肌、脂肪和肝脏是胰岛素作用的主要靶器官/组织，也是体内最主要的代谢葡萄糖的组织器官。胰岛素抵抗即是指胰岛素靶组织对胰岛素的敏感性下降，而使正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态，即葡萄糖摄取和利用率下降。鉴于此，因此我们首先探讨鸢尾苷元及其衍生物是否可以促进胰岛素介导的葡萄糖摄取。

材料：成肌细胞C2C12细胞、脂肪前体细胞系3T3-L1，肝细胞系L02由本实验室传代培养；DMEM培养基、高糖DMEM培养基和胎牛血清(FBS)均购自Gibco公司；人重组胰岛素(货号，91077C)，Isobutylmethylxanthine(IBMX；货号，I-7018)和地塞米松(货号，D-4902)购自Sigma公司；葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法；货号，361500)购自上海荣盛生物药业有限公司。

鸢尾苷元及其衍生物可通过商品购买获得或通过以下方法制备：(1)鸢尾苷元、鸢尾苷的制备方法见中国专利200510017051.6(李玉新，王金凤，孟祥颖，鲍永利等.葛花异黄酮及单体鸢尾苷和鸢尾苷元的提取方法及其应用)。(2)次野鸢尾黄素的制备方法见中国专利201210184560.8(刘东锋，杨成东.一种高纯度次野鸢尾黄素的分离制备工艺)。(3)去亚甲基次野鸢尾黄素的制备方法见中国专利201510047872.8(廖循，贾颜维，龚舒，石海利等.一种异黄酮类化合物、其制备方法及应用)。(4)鸢尾甲黄素A的制备方法见You KM,JongHG,Kim HP.Archives of Pharmacal Research,1999,22(1):18-24.(5)野鸢尾苷、野鸢尾苷元、鸢尾苷元-4’-葡萄糖苷、去甲基次野鸢尾黄素、5，6，7，3’-四羟基-4’-甲氧基异黄酮、5，7-二羟基-6，3’，4’，5’-四甲氧基异黄酮、5，7，3’-三羟基-8，4’，5’-三甲氧基异黄酮、5，7，4’-三羟基-6，3’，5’-三甲氧基异黄酮、5，3’，5’-三甲氧基-6，7-亚甲二氧基异黄酮-4’-O-β-D-葡萄糖的制备方法见Jin L,Chen HS,Jin YS.Journal of Asian NaturalProducts Research,2008,10(1-2):89-94。各取以上化合物1mg溶于100l DMSO中制备鸢尾苷元及其衍生物原液，使用时取适量原液用培养基按1:1000比例稀释作用于细胞。

方法：首先将C2C12和3T3-L1两种前体细胞诱导分化为成熟的骨骼肌和脂肪细胞，具体操作如下：生长状态良好的C2C12、3T3-L1以50％融合度接种于96孔板中，每孔体积100μL，培养至融合度达到100％时更换为分化培养基，C2C12细胞更换为无血清DMEM培养基，继续培养4-5天；而3T3-L1细胞首先更换为分化培养基1(含0.25mmol/L IBMX，5g/ml胰岛素，1mol/l地塞米松和10％FBS的高糖DMEM)，培养2天后，更换为分化培养基2(含10g/ml胰岛素和10％FBS的高糖DMEM)继续培养2天，然后在含10％FBS的高糖DMEM培养基中培养8-14天，期间每两天更换新鲜培养基。按上述方法获得的分化的C2C12和3T3-L1以及10％FBS DMEM培养的状态良好的人肝L02细胞，弃去旧培养基后加入含有200nM胰岛素和10μg/mL的鸢尾苷元及其衍生物或等量DMSO(对照组)的新鲜培养基，每组设置3个复孔，同时设置阴性对照；培养24h后，用葡萄糖测定试剂盒按照说明书所述方法检测每孔上清中葡萄糖剩余量，剩余的越多，说明摄取葡萄糖越少。由此，培养基原始葡萄糖浓度减去葡萄糖剩余量即为培养细胞对葡萄糖的摄取量。葡萄糖摄取倍数即为各实验组细胞葡萄糖摄取量相对于对照组的倍数。

结果：如表1-3所示，鸢尾苷元及其衍生物均能程度不等地促进胰岛素介导的骨骼肌、脂肪及肝细胞对葡萄糖的摄取。

表1鸢尾苷元及其衍生物对胰岛素介导的骨骼肌细胞摄取葡萄糖的影响

*p<0.05；**P<0.01

表2鸢尾苷元及其衍生物对胰岛素介导的脂肪细胞摄取葡萄糖的影响

*p<0.05；**P<0.01

表3鸢尾苷元及其衍生物对胰岛素介导的肝细胞摄取葡萄糖的影响

*p<0.05；**P<0.01

实施例2、鸢尾苷元对正常和胰岛素抵抗的骨骼肌细胞的胰岛素敏感性的影响

胰岛素通过结合并激活其胰岛素受体，进而激活细胞内PI3K/AKT信号通路，使磷酸化AKT水平(phospho-AKT,P-AKT)升高，再活化下游靶分子，来介导包括葡萄糖摄取代谢等在内的生物学作用。所以在一定范围内，胰岛素介导的细胞内磷酸化AKT水平与细胞对胰岛素的敏感性成正比。当胰岛素抵抗发生时，胰岛素将不能有效地升高磷酸化AKT水平。鉴于实施例1证明鸢尾苷元及其衍生物可促进胰岛素介导的葡萄糖摄取，接下来我们将探究在胰岛素抵抗的情况下，鸢尾苷元及其衍生物是否可以提高细胞对胰岛素的敏感性。

材料：C1C12细胞的获取和培养、胰岛素及化合物的获取见实施例1材料部分；抗P-AKT抗体(货号：4060)购自Cell Signaling公司；抗AKT抗体(货号：9272)、抗GAPDH抗体(货号60004-1-Ig)购自Proteintech Group公司；HRP标记山羊抗小鼠二抗(货号IH-0031)、HRP标记山羊抗兔二抗(货号IH-0011)均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；高效RIPA全细胞裂解液(货号R0010)购自索莱宝公司；超特敏ECL显影试剂盒(货号P0018A)购自碧云天公司；

方法：按照实施例1中介绍的方法获得分化的C2C12细胞，然后利用分化的C2C12建立胰岛素抵抗的体外细胞模型，具体操作如下：用500nM高浓度胰岛素持续刺激C2C12细胞24小时，然后用正常应用浓度100nM的胰岛素刺激细胞1小时，按常规方法提取细胞蛋白，进行SDS-PAGE和Western Blot来检测细胞内磷酸化AKT的水平。在此基础上，在加入100nM胰岛素刺激的同时，加入10g/mL的鸢尾苷元或等量DMSO作为对照，以检测鸢尾苷元对细胞内磷酸化AKT的水平。

结果：如图2所示，C2C12细胞未诱导抵抗的对照组(Normal)和诱导了抵抗的IR组，在未加胰岛素刺激时，基础磷酸化AKT(P-AKT)水平均较低。当加入100nM胰岛素刺激1h后，对照组(Normal)对胰岛素的响应最明显，P-AKT蛋白表达水平显著增高，而与之相比，IR模型组细胞的P-AKT蛋白水平则相对较低，提示IR组细胞对胰岛素敏感性下降，说明胰岛素抵抗细胞模型造模成功。而10μg/mL鸢尾苷元处理的细胞，在无100nM胰岛素刺激的条件下，各组细胞基础磷酸化AKT的水平均较低。但在100nM胰岛素刺激的条件下，加入10μg/ml的鸢尾苷元处理1h后，无论是正常细胞还是IR细胞，相比于鸢尾苷元未处理组，P-AKT蛋白水平均明显增加，说明鸢尾苷元可以明显的增加C2C12正常细胞或胰岛素抵抗细胞对胰岛素的敏感性。

实施例3、鸢尾苷元对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠的预防作用

我们在体外确定了鸢尾苷元可以促进胰岛素介导的骨骼肌、脂肪和肝细胞对葡萄糖的摄取，并且可改善胰岛素靶组织来源细胞的胰岛素抵抗状态。为了进一步确定鸢尾苷元在体内的抗胰岛素抵抗作用，我们利用小鼠构建了胰岛素抵抗模型，并首先检测了鸢尾苷元对胰岛素抵抗发生的预防作用。

材料：中性胰岛素注射液购自江苏万邦生化医药股份有限公司；45％高脂饲料(货号，MD12032)购自江苏美迪森生物医药有限公司；血糖仪购自雅培有限公司；小鼠胰岛素(INS)ELISA试剂盒(货号，m1001983)购自上海酶联生物技术有限公司。鸢尾苷元溶解于DMSO，用生理盐水稀释，DMSO所占比例不超过1％

动物：3周龄雄性C57BL/6J小鼠(SPF级)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

方法：将3周大的雄性C57BL/6J小鼠，在实验室进行适应性培养2周后，随机分为五组，其中每组不少于6只小鼠。正常对照组，正常普通饲料喂养的C57BL/6J小鼠，实验组开始给药的同时，按照相同的给药方式和频次，腹腔注射同等体积的生理盐水；胰岛素抵抗模型组，持续高脂饮食喂养的C57BL/6J小鼠，实验组开始给药的同时，按照相同的给药方式和频次，腹腔注射同等体积的生理盐水；鸢尾苷元低、中、高剂量实验组三组，持续高脂饮食喂养C57BL/6J小鼠，喂养4w后，每组分别预防性腹腔注射10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg三个剂量的鸢尾苷元，隔天注射一次。实验从开始高脂喂养算起，至大约13周时，取小鼠尾静脉血液，测量空腹12h后小鼠血糖含量。连续3天测得胰岛素抵抗模型组小鼠空腹血糖≥7.0mmol/L，以及腹腔注射胰岛素耐量实验(IPITT)显示胰岛素耐量受损，则代表本发明中的C57BL/6J小鼠胰岛素抵抗模型造模成功。小鼠处死前，于小鼠心脏取血，5000rpm离心5min，取上清，即为血清，小鼠胰岛素(INS)ELISA试剂盒检测血清的胰岛素含量，实验方法参照说明书。

胰岛素耐量受损是发生胰岛素抵抗的重要指标之一。IPITT具体操作步骤和评估标准如下：小鼠隔夜禁食8小时，以0.5IU/kg剂量腹腔注射0.25IU/mL胰岛素溶液，使用血糖仪分别在0min，15min，30min，45min，60min，90min时检测尾静脉血血糖含量，将测量的各个时间点的血糖值绘制成曲线并计算曲线下面积(area under curve，AUC)。

实验结果

(1)预防性给予鸢尾苷元改善胰岛素抵抗小鼠的胰岛素耐受不良

结果如附图3所示，注射胰岛素后，正常对照组，30min左右空腹血糖迅速下降，其后，血糖渐渐恢复，而与之相比，模型组注射胰岛素后，空腹血糖水平下降缓慢，且在各个时间点的血糖水平均高于正常组(图3A)，进一步分析胰岛素耐量曲线下面积AUC(图3B)，显示胰岛素抵抗模型组AUC显著高于正常组，提示高脂喂养模型组小鼠胰岛素耐量出现异常，已呈现胰岛素抵抗状态。但在0min-15min内，20kg/mg鸢尾苷元预防组和40kg/mg鸢尾苷元预防组与未给药的胰岛素抵抗模型组相比，血糖均显著降低。在15min-30min内，40kg/mg鸢尾苷元预防组与模型组相比，血糖亦显著降低(图3A)。胰岛素耐量曲线下面积AUC分析显示，三种不同剂量鸢尾苷元预防组小鼠的胰岛素耐量受损均有一定程度的缓解，并具有统计学显著性(图3B，P<0.05)。

(2)预防性给予鸢尾苷元抑制胰岛素抵抗引起的小鼠空腹血糖的升高

实施例3结果(1)显示，预防性应用鸢尾苷元可部分缓解胰岛素抵抗引起的胰岛素耐量受损，那么接下来我们检测预防性应用鸢尾苷元是否同样可缓解胰岛素抵抗引起的血糖升高。结果见图4，胰岛素抵抗模型小鼠空腹血糖水平均≥7.0mmol/L，达到糖尿病标准，而预防性注射三种剂量的鸢尾苷元(10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg)均能显著抑制胰岛素抵抗小鼠空腹血糖的升高，其中剂量为40mg/kg时效果最显著。

(3)预防性给予鸢尾苷元可抑制胰岛素抵抗引起的小鼠血清胰岛素水平的升高

胰岛素抵抗发生时，由于正常分泌量的胰岛素不能有效降低血糖水平，所以机体会代偿性由胰腺分泌更多的胰岛素，以维持血糖平衡，因此在发病初期会出现高胰岛素血症。我们的实验结果如图5所示，与正常对照组小鼠相比，胰岛素抵抗模型组小鼠的血清胰岛素水平显著上升，提示因胰岛素抵抗小鼠出现了高胰岛素血症，与预期一致。而实验组中40mg/kg剂量鸢尾苷元的预防性处理，可以显著抑制胰岛素抵抗引起的血清胰岛素水平的升高，部分遏止了高胰岛素血症的发生。

小结：预防性给予鸢尾苷元可部分阻止长期高脂喂养诱导的胰岛素抵抗的发生，表现为可改善胰岛素耐受不良的状态，进而部分抑制高血糖症和高胰岛素血症。机体内，骨骼肌、脂肪和肝脏组织是最主要的介导胰岛素促进葡萄糖代谢的组织，因此，以上结果，再结合体外的实验结果提示鸢尾苷元及其衍生物可预防骨骼肌、脂肪和肝脏等胰岛素靶组织胰岛素抵抗的发生。

实施例4、鸢尾苷元对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠的治疗作用

实施例3结果显示鸢尾苷元可预防高脂饮食引起的胰岛素抵抗的发生。接下来我们检测鸢尾苷元对长期高脂饮食诱发的胰岛素抵抗是否具有治疗作用。

材料：与实施例3所用相同

方法：将40只3周龄的雄性C57BL/6J小鼠，在实验室进行适应性培养2周后开始实验。其中6只小鼠设为正常对照组，全程普通饲料喂养；其它小鼠均持续高脂饮食喂养约3个月，空腹12h后，分别进行腹腔注射胰岛素耐量实验(IPITT)和空腹血糖的检测(方法见实施例3的实验方法)，IPITT显示小鼠胰岛素耐量受损，以及连续3天，空腹血糖≥7.0mmol/L，提示小鼠胰岛素抵抗模型造模成功。将造模成功的胰岛素抵抗小鼠随机分为4组，每组不少于6只。这4组分别为模型对照组及低(10mg/kg)、中(20mg/kg)、高(40mg/kg)剂量鸢尾苷元实验组，4组继续高脂饮食喂养。其中低、中、高鸢尾苷元实验组分别腹腔注射相应浓度的鸢尾苷元，每天注射一次，持续四周。而正常对照组及模型对照组小鼠则按照相同的注射方式、频次和时长腹腔注射生理盐水作为对照。实验结束前，小鼠尾静脉取血检测空腹血糖，并进行IPITT实验，实验结束时，各组小鼠心脏取血获得血清，检测血清中胰岛素水平，检测方法见实施例3。

实验结果

(1)治疗性给予鸢尾苷元纠正胰岛素抵抗小鼠的胰岛素不耐受

结果图6显示，注射胰岛素后，与正常对照组相比，胰岛素抵抗模型组小鼠的血糖曲线(图6A)和曲线下面积AUC(图6B)均呈现出胰岛素耐量异常。而胰岛素注射后0min-15min和30min-60min这两个时间段内，40kg/mg鸢尾苷元治疗组与胰岛素抵抗模型组相比，血糖均显著降低。而其他时间段内，不同剂量鸢尾苷元组与模型组相比，血糖均有下降趋势(图6A)；AUC分析结果显示，三种不同剂量鸢尾苷元治疗组与糖耐量受损的模型组相比，胰岛素耐量均有不同程度的缓解，尤其40kg/mg鸢尾苷元治疗组胰岛素耐受情况得到显著改善(图6B)。

(2)治疗性给予鸢尾苷元降低胰岛素抵抗小鼠的血糖水平

在实验组小鼠持续注射鸢尾苷元四周后，各组小鼠经尾静脉取血，测量空腹12h后血糖。结果见图7，与正常对照组比较，胰岛素抵抗模型对照小鼠空腹血糖显著升高，与预期一致。低、中、高剂量鸢尾苷元治疗小鼠，血糖均有不同程度降低，并且具有剂量依赖性，尤其注射鸢尾苷元剂量为40mg/kg能显著降低胰岛素抵抗小鼠空腹血糖水平。

(3)治疗性给予鸢尾苷元降低胰岛素抵抗小鼠血清胰岛素水平

结果如图8所示，与正常对照组小鼠相比，胰岛素抵抗模型对照组小鼠的血清胰岛素水平显著上升，出现了预期的高胰岛素血症，而不同剂量鸢尾苷元治疗组血清胰岛素水平均有不同程度下降，其中10mg/kg剂量鸢尾苷元组小鼠的血清胰岛素水平恢复到了正常水平，说明鸢尾苷元的治疗可纠正胰岛素抵抗引起的高胰岛素血症。

小结：鸢尾苷元可有效纠正高脂喂养诱导产生的胰岛素抵抗，提高胰岛素的敏感性，进而缓解胰岛素抵抗引起的血糖增高及高胰岛素血症，而这主要通过鸢尾苷元改善骨骼肌、脂肪和肝脏组织等胰岛素靶组织的胰岛素抵抗来实现的。结合体外实验结果，本实验提示鸢尾苷元及其衍生物通过改善骨骼肌、脂肪和肝脏组织的胰岛素抵抗状态而对胰岛素抵抗具有治疗作用。

Claims

1.鸢尾苷元及其衍生物在防治胰岛素抵抗疾病药物中的应用。

2.如权利要求1所述的鸢尾苷元及其衍生物在防治胰岛素抵抗疾病药物中的应用，其特征在于：所述的胰岛素抵抗疾病是指与胰岛素靶组织葡萄糖代谢相关的疾病。

3.如权利要求1或2所述的鸢尾苷元及其衍生物在防治胰岛素抵抗疾病药物中的应用，其特征在于：所述的胰岛素抵抗疾病包括：中心性肥胖、糖尿病、糖耐量受损、高胰岛素血症、高血压、高血脂、动脉粥样硬化、高尿酸血症、多囊卵巢综合征、非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎或高纤维蛋白原血症。

4.如权利要求2所述的鸢尾苷元及其衍生物在防治胰岛素抵抗疾病药物中的应用，其特征在于：所述的胰岛素靶组织，包括骨骼肌、脂肪或肝脏组织。

5.如权利要求1所述的鸢尾苷元及其衍生物在防治胰岛素抵抗疾病药物中的应用，其特征在于：所述的鸢尾苷元化学名为4’,5,7-三羟基-6-甲氧基异黄酮。

6.如权利要求1所述的鸢尾苷元及其衍生物在防治胰岛素抵抗疾病药物中的应用，其特征在于：所述的鸢尾苷元衍生物包括：鸢尾苷、野鸢尾苷、次野鸢尾黄素、野鸢尾苷元、鸢尾苷元-4’-葡萄糖苷、去亚甲基次野鸢尾黄素、去甲基次野鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A、5，6，7，3’-四羟基-4’-甲氧基异黄酮、5，7-二羟基-6、3’，4’，5’-四甲氧基异黄酮、5，7，3’-三羟基-8，4’，5’-三甲氧基异黄酮、5，7，4’-三羟基-6、3’，5’-三甲氧基异黄酮或5或3’，5’-三甲氧基-6、7-亚甲二氧基异黄酮-4’-O-β-D-葡萄糖。

7.如权利要求1所述的鸢尾苷元及其衍生物在防治胰岛素抵抗疾病药物中的应用，其特征在于：制备药物时包括鸢尾苷元及其衍生物中的至少一种。

8.如权利要求1或7所述的鸢尾苷元及其衍生物在防治胰岛素抵抗疾病药物中的应用，其特征在于：鸢尾苷元及其衍生物的剂量使用范围为10mg/kg～40mg/kg。

9.如权利要求1所述的鸢尾苷元及其衍生物在防治胰岛素抵抗疾病药物中的应用，其特征在于：提高胰岛素靶组织来源细胞系对葡萄糖的摄取能力，改善胰岛素抵抗状态细胞对胰岛素的敏感性，提高胰岛素刺激下的磷酸化AKT的水平。

10.如权利要求1所述的鸢尾苷元及其衍生物在防治胰岛素抵抗疾病药物中的应用，其特征在于：改善高脂饮食诱导的胰岛素抵抗模型中小鼠的胰岛素耐受不良，减轻胰岛素抵抗状态，进而部分抑制胰岛素抵抗引起的体内血糖和血清胰岛素水平的升高。