CN110201025A - 青钱柳提取物在制备治疗或防治糖尿病心肌病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种青钱柳提取物在制备治疗或防治糖尿病心肌病药物中的应用，该药物包括有青钱柳提取物、以及药学上可接受的载体，所述的青钱柳提取物为青钱柳醇提物。本发明的有益效果是：青钱柳醇提物可以降小鼠低血糖，血清总胆固醇和甘油三酯；降低急性心肌梗死时因心肌细胞坏死而释放出LDH,CK,AST心肌三酶，心肌坏死标志物心肌肌钙蛋白的量。青钱柳醇提物可以明显改善糖尿病心肌细胞结构与形态，心肌细胞凋亡减少。

Description

青钱柳提取物在制备治疗或防治糖尿病心肌病药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种中药药物，具体是指一种青钱柳提取物在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用。
背景技术
糖尿病的发病率逐年增高，继发于糖尿病的心血管并发症已成为糖尿病患者死亡的主要原因。糖尿病病人70％以上死于心血管系统疾病，是非糖尿病人群心血管系统疾病病死率的2～3倍。其中，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者的主要并发症之一，随着糖尿病患者的逐年增加，糖尿病患者心肌病的发病率也迅速上升，糖尿病心肌病主要以心功能降低，心肌肥大为主要表现，长期发展还可以导致心肌纤维化和心力衰竭的发生。
青钱柳(Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinsk)，属于胡桃科青钱柳属植物，是一种高大的乔木，它广泛的分布在中国的亚热带地区的，是一种药食同源的植物，属于国家保护植物物种。《中华本草》记载青钱柳具有清热解毒，生津止渴的功效，它的叶子作为民间药常被用于治疗糖尿病、高血压和血脂异常，并在2014年被中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会批准为新食品原材料。现代研究发现，青钱柳的枝叶具有抗氧化，降血糖，降血脂的活性。
迄今为止，青钱柳水提物在治疗糖尿病心肌病活性的研究成果尚未有专利或文献报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种青钱柳提取物在制备治疗或防治糖尿病心肌病药物中的应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案是该药物包括有青钱柳提取物、以及药学上可接受的载体，所述的青钱柳提取物为青钱柳醇提物。
进一步设置是所述的青钱柳提取物的提取工艺为：将干燥的青钱柳药材用70％乙醇以10倍量加热回流提取2次，每次2小时，趁热过滤，合并滤液，减压回收溶剂至无醇味，加水分散，得上样液，以D101型大孔树脂，按径高比1:4装柱，上样浓度为1:10，浸膏量与树脂体积比为1:7，吸附流速0.5BV/h，洗脱流速2BV/h，水洗8BV除杂，30％乙醇洗脱10BV，50％乙醇洗脱10BV，75％乙醇洗脱10BV，收集30％-75％乙醇洗脱液，回收溶剂，真空干燥，即得青钱柳青钱柳提取物。
本发明涉及对青钱柳醇提物在制备糖尿病心肌病并发症药物上的应用，发现青钱柳醇提物可以降小鼠低血糖，血清总胆固醇和甘油三酯；降低急性心肌梗死时因心肌细胞坏死而释放出LDH,CK,AST心肌三酶，心肌坏死标志物心肌肌钙蛋白的量。青钱柳醇提物可以明显改善糖尿病心肌细胞结构与形态，心肌细胞凋亡减少，糖尿病小鼠出现的心肌细胞肥大坏死，心肌纤维化；升高抗氧化酶SOD,GSH-Px,CAT的量，降低丙二醛(MDA)的量；降低心肌组织炎性因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ的量。
本发明的有益效果是：青钱柳醇提物可以降小鼠低血糖，血清总胆固醇和甘油三酯；降低急性心肌梗死时因心肌细胞坏死而释放出LDH,CK,AST心肌三酶，心肌坏死标志物心肌肌钙蛋白的量。青钱柳醇提物可以明显改善糖尿病心肌细胞结构与形态，心肌细胞凋亡减少，糖尿病小鼠出现的心肌细胞肥大坏死，心肌纤维化；升高抗氧化酶SOD,GSH-Px,CAT的量，降低丙二醛(MDA)的量；降低心肌组织炎性因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ的量。
通过试验验证：随机将48只6周龄雄性db/db自发型糖尿病小鼠随机分为5组:青钱柳总三萜(ECL)高、中、低剂量实验组分别给予ECL 80，40，20mg·kg-1·d-1混悬液灌胃；模型组给予同等剂量0.9％生理盐水0.2mL﹒d-1灌胃；正常组不干预。连续干预10周。于给药前及给药后第2、4、6、8、10周末检测各组空腹血糖；于第10周末进行取材，将所有小鼠处死后取血和心脏，测定血清LDH,CK,AST心肌三酶和心肌肌钙蛋白的量。心脏留取左心室组织，并留取部分心肌组织以组织固定液固定后，使用HE染色法与Masson染色法观察心肌组织病理情况，使用ELISA法心肌组织TGFβ1，Collagen I和心肌组织炎性因子的水平。按照试剂盒说明书分别测定MDA、SOD、CAT和GSH-Px水平。使用Western blot法检测心肌组织中TGFβ1、Collagen I，心肌组织炎性因子和心肌组织凋亡相关蛋白表达。以上实验结果提示青钱柳醇提物具有防治糖尿病心肌病并发症的作用。
以上实验结果提示青钱柳醇提物具有防治糖尿病心肌病并发症的作用。
迄今为止，以上研究成果尚未有专利或文献报道。具体详细见说明书实施例。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1血糖、总胆固醇及甘油三酯的测定图，其中A为血糖、B为总胆固醇，C为甘油三酯；
图2本发明生化指标检测图，其中A为血清LDH,B为CK,C为AST心肌三酶检测，D为血清ELISA试剂盒检测；
图3心肌组织HE染色图；
图4本发明实施例案例四检测图，其中A为心肌组织masson染色图；B为心肌组织TGFβ检测图；C为CollagenI ELIS试剂盒检测图；D为心肌组织western图；E为蛋白统计图；
图5心肌组织抗氧化酶检测图，其中A为LDH,B为CK,C为AST心肌三酶，D为心肌肌钙蛋白(cTnl)；
图6本发明实施例Western blot检测心肌组织蛋白表达图，其中A、B和C为心肌组织炎性因子ELISA分析图；D为心肌组织蛋白检测图；E为蛋白统计图；
图7本发明心肌组织凋亡相关蛋白检测图；
图8本发明心肌组织PI3K/AKT信号蛋白检测图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施案例一青钱柳提取物制备
称取青钱柳干燥药材35kg，用70％乙醇以10倍量加热回流提取2次，每次2小时，趁热过滤，合并滤液。减压回收溶剂至无醇味，加水分散，得上样液。以D101型大孔树脂，按径高比1:4装柱，上样浓度(浸膏量:溶液体积)为1:10，浸膏量与树脂体积比为1:7，吸附流速0.5BV/h，洗脱流速2BV/h，水洗8BV除杂，30％乙醇洗脱10BV，50％乙醇洗脱10BV，75％乙醇洗脱10BV，收集30％-75％乙醇洗脱液，回收溶剂，真空干燥，称重，即得青钱柳有效部位1.8kg。
将该钱柳提取物应用于制备治疗或防治糖尿病心肌病药物，还可以包括有药学上可接受的其他载体；也可以与现有的治疗或防治糖尿病心肌病药物一起结合使用，形成药物组合物；另外，也可以将该钱柳提取物制成相应的食品组合物、饮料组合物。
当本发明化合物用于上述用途时，它们可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制成不同给药途径的药物剂型，如片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、口服液、栓剂等。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s PharmaceuticalSciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。
从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。优选口服给药。
实施案例二空腹血糖、总胆固醇及甘油三酯的测定
随机将48只6周龄雄性db/db自发型糖尿病小鼠随机分为5组:青钱柳总三萜(ECL)高、中、低剂量实验组分别给予ECL 80，40，20mg·kg-1·d-1混悬液灌胃；模型组给予同等剂量0.9％生理盐水0.2mL﹒d-1灌胃；正常组不干预。连续干预10周。于给药前及给药后第2、4、6、8、10周末检测各组空腹血糖。
实验给药结束后，小鼠禁食12h，心脏取血，3500r·min-1离心取血清，10min,取血清4℃保存用于生化指标检测。使用罗氏血糖仪进行空腹血糖测试，按照甘油三酯试剂盒说明书说明方法测定血清中甘油三酯的含量，测定波长为520nm。按照总胆固醇测定试剂盒说明书方法测定血清中总胆固醇含量，测定波长为500nm。
实施案例三生化指标检测
按照试剂盒说明书分别测定LDH,CK,AST心肌三酶，SOD、CAT、MDA、GSH-PX水平,ELISA法测定心肌肌钙蛋白(cTnl)和炎性因子IFNγ、IL-1β、MCP-1、TNFα水平。心肌组织按质量体积比1:9加生理盐水，匀浆后3 000r·min-1离心10min,取上清按试剂盒说明书测定TGFβ1和Collagen I水平。
实施案例四心肌组织HE染色
将各组小鼠解剖后，取左心室心肌组织切成2-3mm薄片后，取心肌同一部分置入4％多聚甲醛固定，0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液浸泡过夜，常规梯度酒精脱水包埋，制成4mm石蜡切片。经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水后，苏木素染色，之后再进行梯度乙醇、二甲苯脱水。固定封片，200倍显微镜下观察、拍照。
实施案例四心肌组织Masson染色
取左心室心肌组织,用4％多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,制作切片,脱蜡后行Masson染色,光镜下观察心肌细胞呈红色,胶原纤维呈蓝色,每张切片在200倍光学显微镜下观察并随机选取5个视野拍照。
实施案例五Western blot检测心肌组织蛋白表达
心肌组织按质量体积比1∶9加生理盐水,匀浆后3 000r·min-1离心10min。弃去上清,沉淀加入组织裂解液重悬,于4℃裂解1h,12 000r·min-1离心15min,收集上清液即为总蛋白,细胞核蛋白提取按核蛋白抽提试剂盒操作说明进行。BCA法测定蛋白浓度,每组取20g总蛋白,12％SDS-PAGE分离蛋白,用电转移法将蛋白质转移至PVDF膜,5％脱脂奶粉室温封闭3h,分别加入TGFβ1、Collagen I、TNF-α、IL-1β、IFN-γ、NFкB、AKT、p-AKT、β-actin、LaminB一抗,4℃过夜；TBST溶液洗涤3次(每次5min),加入辣根素过氧化酶标记的二抗,室温孵育4h,TBST溶液洗膜3次(每次5min),化学发光法显影。
统计学分析所有实验均重复3次,采用SPSS18.0软件对数据进行分析,计量资料用均数±标准差表示,各组间比较用单因素方差分析法,以P<0.05为差异有统计学意义。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (3)

1.一种青钱柳提取物在制备治疗或防治糖尿病心肌病药物中的应用，其特征在于：该药物包括有青钱柳提取物、以及药学上可接受的载体，所述的青钱柳提取物为青钱柳醇提物。
2.根据权利要求1所述的一种青钱柳提取物在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用，其特征在于：所述的青钱柳提取物的提取工艺为：
将干燥的青钱柳药材用70％乙醇以10倍量加热回流提取2次，每次2小时，趁热过滤，合并滤液，减压回收溶剂至无醇味，加水分散，得上样液，以D101型大孔树脂，按径高比1:4装柱，上样浓度为1:10，浸膏量与树脂体积比为1:7，吸附流速0.5BV/h，洗脱流速2BV/h，水洗8BV除杂，30％乙醇洗脱10BV，50％乙醇洗脱10BV，75％乙醇洗脱10BV，收集30％-75％乙醇洗脱液，回收溶剂，真空干燥，即得青钱柳青钱柳提取物。
3.一种青钱柳提取物在制备治疗或防治糖尿病心肌病药物中的应用，其特征在于：该药物为食品组合物或者饮料形态，其包括有作为活性成分的青钱柳提取物，所述的青钱柳提取物为青钱柳醇提物。
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