CN102813914B

CN102813914B - 一种用于治疗或预防脑血管及相关疾病的药物组合物

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Publication number: CN102813914B
Application number: CN201210337684.5A
Authority: CN
Inventors: 张芝庭
Original assignee: GUIZHOU MAOJKA GROUP HOLDING CO Ltd
Current assignee: Guizhou Shenqi Pharmaceutical Co ltd; GUIZHOU SHENQI PHARMACEUTICAL RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2012-09-12
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2032-09-12
Also published as: CN102813914A

Abstract

本发明公开了一种用于治疗或预防脑血管及相关疾病的药物组合物，该组合物由以下重量百分比的组分组成：DHA1-50份、灯盏花素1-50份、磷酸川芎嗪20-50份、水蛭素1-10份。组合物中还包括有效量的人脂肪干细胞，其作为药物组合物的载体，使治疗药物顺利透过血脑屏障，达到靶向治疗脑血管及相关疾病的效果。本发明的药物组合物可有效改善脑部缺血所引起的发作、梗塞、栓塞等疾病，有效抑制体内血栓的形成，并对脑血管病引起的老年痴呆即阿尔茨海默氏病有良好疗效。

Description

一种用于治疗或预防脑血管及相关疾病的药物组合物

技术领域

本发明涉及用于治疗脑血管及相关疾病的药物组合物，特别涉及利用人脂肪干细胞作为药物载体治疗脑血管及相关疾病的药物组合物。

技术背景

脑血管病是危害人类生命与健康的常见病和多发病，具有“发病率高、死亡率高、致残率高、复发率高、并发症多”—“四高一多”的特点，是中年人致死和致残的主要疾病。由于老年人口的不断增加和生活水平的提高，脑血管病的发病率仍在不断上升。在人类各种疾病死因的排序中，脑血管病一直列于前三位之内，成为人类死亡的主要原因之一。在全球范围内，每年使460万人死亡，其患病和死亡主要在65岁以上的人群。我国也是脑卒中死亡率高发地区，据估计居民现患脑血管病600万，每年新发生脑血管病130万人、死亡近100万人，在幸存者中约3/4的人留下偏瘫等后遗症状，部分病人丧失劳动能力和生活能力。

脑血管病，是指脑部动脉或支配脑的颈部动脉发生病变，或由于各种原因导致的脑血管的堵塞或破裂，致使颅内血液循环障碍，脑组织受损的一组疾病。能引起相关症状，是一种危害人民健康，威胁生命，影响劳动力的常见病和多发病。常见的脑血管病大致可以分为缺血性脑血管病和出血性脑血管病两大类。其中以缺血性脑血管病为主，包括短暂性脑缺血发作、脑血栓、脑栓塞和脑梗塞等四种，临床较多见，约占全部脑血管病人的70%~80%，是由于脑动脉硬化等原因，使脑动脉管腔狭窄，血流减少或完全阻塞，脑部血液循环障碍，脑组织受损而发生的一系列症状。

阿尔茨海默病（AD）即所谓的老年痴呆症。是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。据中国阿尔茨海默病协会2011年的公布调查结果显示，全球有约3650万人患有痴呆症，每七秒就有一个人患上此病，平均生存期只有5.9年，是威胁老人健康的“四大杀手”之一。在中国65岁以上的老人患病率高达6.6%以上，年龄每增加5岁，患病率增长一倍，3个85岁以上的老人中就有一个是老年痴呆。保守估计全国老年痴呆患病人数高达800万以上。

目前治疗或防治脑血管及相关疾病的药物不多，具有显著效果的则更少。其中西药具有治愈速度快，对症治疗效果明显等特点，但不宜长期服用，需过一段时间后更换药物种类；而中药复方含多味药，单味药含有多种成分，因此中药可以通过多层次、多靶点、多环节发挥作用，但中药起效慢，作用时间长；因此随着科学的进展与研究的深入，对中西药结合的研究越来越多，这是由于中西药联合使用，能够达到协调增效、降低毒副反应、减少剂量、减少禁忌等良好作用。

现有技术中，可知灯盏花素、水蛭素等药物具有抗凝血、抗血栓、扩张脑血管等作用，本发明研究人员在对前述药物的研究过程中，意外发现将灯盏花素、水蛭素和磷酸川芎嗪制成组合药物，再加入一定量的DHA，然后利用分离培养得到的人脂肪干细胞作为药物载体，得到的药物制剂用于治疗脑血管及相关疾病，其结果表明，该药物能够顺利透过血脑屏障，取得非常理想的治疗效果。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种用于治疗或预防脑血管及相关疾病的药物组合物，该组合物包含以下重量百分比的组分：DHA1-50份、灯盏花素1-50份、磷酸川芎嗪20-50份、水蛭素1-10份。

优选地，本发明所述药物组合物，包含以下重量百分比的组分：DHA10-40份、灯盏花素15-40份、磷酸川芎嗪25-45份、水蛭素3-8份。

上述药物组合物中还包括人脂肪干细胞，作为治疗和预防脑血管及相关疾病药物的载体，使药物组合物顺利透过血脑屏障，达到靶向治疗的效果。

所述人脂肪干细胞，是对人体的腹部、大腿或皮下脂肪进行切除术或吸脂手术后废弃的脂肪组织，通过提取、分离、培养得到的脂肪干细胞。

本发明的另一个目的是提供这种治疗和预防脑血管及相关疾病的药物组合物的制备方法。

制备方法包括以下步骤：

（1）药物混合溶液的制备：将处方量的DHA、灯盏花素、磷酸川芎嗪和水蛭素溶于药学上可接受的介质中，充分混合；

（2）人脂肪干细胞的分离培养：采用分离、纯化、培养的方法获得人脂肪干细胞，并将其重悬在药学上可接受的介质中；

（3）药物制剂的制备：将上述药物混合溶液与人脂肪干细胞重悬液混合，即得发明产物。

其中，步骤（1）、（2）中的药学上可接受的介质选自缓冲液、生理盐水、平衡盐溶液或其组合；

步骤（2）中采用质量与体积比为0.1-0.3%的混合胶原酶对脂肪组织进行消化，用含有10-15%胎牛血清、10³-10⁵U/ml LIF的MCDB-201培养液对提取分离后的干细胞进行培养；

所述混合胶原酶由Ⅰ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶组成，所述混合胶原酶的质量与体积比为1%的母液配制方法为：100ml D-Hanks平衡盐溶液中加入0.7g Ⅰ型胶原酶、0.3gⅣ型胶原酶；

步骤（3）中药物混合溶液与人脂肪干细胞培养液的比例为1:1-3，优选1:2。

具体地，本发明所述治疗脑血管及相关疾病的药物，制备方法包括以下步骤：

（1）取处方量DHA、灯盏花素、磷酸川芎嗪和水蛭素，溶于磷酸盐缓冲液中，制备成浓度为5-15mg/ml的混合溶液；

（2）取采集的脂肪组织，剔除肉眼可见的血管和纤维部分，剪碎，用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液洗涤多次，去除残留的血液，加入与脂肪组织等体积的0.2-0.4%（m/v）混合胶原酶，均匀震荡消化40-80分钟，再置于离心机中离心4-10分钟，去除表层脂肪，将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液反复清洗，经100目筛网过滤，滤液离心5-10分钟，弃去上清液，将获得的干细胞按照2-3×10⁴/cm²的密度接种于培养瓶，加入10mL含有10-15%胎牛血清、10³-10⁵U/ml LIF的MCDB-201培养液中进行培养，每隔1-2天更换新鲜的培养液，待细胞生成达到80%融合，在培养瓶中加0.25%胰酶-EDTA进行消化，按1:3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞；将2×10⁵个脂肪干细胞重悬在200μl等渗磷酸盐缓冲液中，得到浓度为1.0×10⁶/ml的干细胞悬液；

（3）将上述药物混合溶液和人脂肪干细胞悬液按照1:1-3的比例混合，即得发明产物。

本发明的药物组合物可以根据需要加入一种或多种药学上可以接受的载体，如稀释剂、赋形剂、填充剂、表面活性剂等等，按照药学领域的常规方法，制备成所需要的注射制剂。所述注射制剂是注射液和冻干粉针剂。

本发明的又一目的是提供本发明药物在治疗脑血管及相关疾病方面的用途，所述脑血管疾病是指缺血性脑血管病，具体包括脑局部缺血、脑血栓、血管收缩、脑梗塞；脑血管相关疾病是指阿尔茨海默氏病。

为了使本领域普通技术人员更好的理解本发明，以下通过实验及实施例来进一步阐述本发明复方荭草制剂的组成、其制备方法及用途：

试验1对局灶性脑缺血的影响

1.1试验药物：A：本发明注射用冻干粉，规格为每支装200mg，按照实施例5的方法制备；B：注射用血塞通，规格为每支装200mg，黑龙江珍宝岛股份有限公司生产；C：右旋糖酐40氯化钠注射液，规格为500ml:30g:4.5g，山东齐都药业有限公司生产。

1.2试验动物：Wistar大鼠，体重230-270g，贵阳中医学院实验动物中心提供。

1.3试验方法：健康成年大鼠随机分为四组，每组10只，其中缺血对照组用生理盐水灌胃；药物A、B、C组分别以50.0mg/kg、60.0mg/kg、40.0mg/kg剂量给药。

动物模型的建立：采用两血管闭塞合并放血法，造成急性脑缺血。实验动物先麻醉后固定在手术台上。经颈正中切口，钝性分离两侧颈总动脉，丝线结扎悬挂30min，同时断尾放血0.8ml，然后松开丝带结扎线10min，再结扎两侧颈总动脉30min后松开。术后给予进食进水。

观测指标：（1）凝血系统凝血酶时间（TT）、凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血酶时间（APTT）、纤维蛋白原测定（FBG）。

（2）脑梗死面积的测定术后一定时间采血后处死，取一定量大鼠大脑，去掉小脑和脑干，冠状切为0.3cm的脑片，观察有无出血灶。将脑片浸入TTC中，恒温后甲醛固定，利用图像病理分析系统测定梗死面积。

病理学检测：脑片经染色后，在光镜下观察脑组织病理变化。

1.4结果

（1）凝血纤溶系统的检测结果：如下表1

表1凝血纤溶系统的检测结果（x±s）

结论：药物组给药后可以看到TT、APTT、FBG含量较对照组高，当双侧颈总动脉结扎造成前脑缺血性损伤后，可使TT、APTT延长，且FBG的降低与对照组相比均有显著差异性，药物A组与B、C组相比，无显著差异性，但数据明显好于其他两组。表明本发明药物组合物的治疗作用优于右旋糖酐40和血塞通。

（2）大鼠局灶性脑缺血一定时间后脑梗死面积及药物的影响结果：如下表2。

表2脑梗死范围（x±s）

组别	例数	梗死面积/%
			药物A组	10	5.04±1.61*
药物B组	10	5.63±1.88*
			药物C组	10	5.27±2.04*
缺血对照组	10	11.36±2.51

注：治疗组与对照组比较*P<0.05

结论：治疗组的脑梗死面积明显低于对照组，且组间无显著差异性。证明本发明药物组合物能减少脑缺血动物的脑梗死面积。

（3）病理学改变：对照组光镜下观察，发现组织间隙增宽，水肿，有空泡形成，神经元细胞核缩小，甚至溶解消失。而治疗组可以看到组织间隙水肿较对照组轻，细胞间隙改变不明显，神经元细胞核大小基本正常，核较深染，病灶中心区有少许空泡形成。

试验2对小鼠体内血小板血栓形成的影响

2.1试验药物：药物1：按照实施例6制备得到的注射液；药物2：按照实施例7制备得到的注射液，药物3：按照实施例8制备得到的注射液。

2.2试验动物：雄性小鼠，体重28±2g，贵阳中医学院实验动物中心提供。

2.3试验方法：将大鼠随机分为四组，每组10只，实验组分别给予药物1、2和3各40mg/kg，每天一次，连续7天，对照组给予等量的生理盐水，末次给药1小时后麻醉，固定，分离气管插入气管导管，分离右颈总动脉和左颈外静脉。在聚乙烯管仲放入一根已称重的丝线，用含肝素的生理盐水充满聚乙烯管，将管的一端插入右颈总动脉，另一端插入左颈外静脉。打开血流15min后中断，取出丝线称重，计算血栓重量。

2.4试验结果见表3：

表3药物对血栓重量的影响（x±s）

组别	例数	血栓重量（mg）
			药物1组	10	20.5±6.71*
药物2组	10	28.4±8.15*
			药物3组	10	24.1±7.22*
对照组	10	37.6±7.43

实验结果说明，本发明药物组合物可抑制体内血栓的形成，其在本发明范围内效果理想。

试验3对AD大鼠学习记忆的影响

3.1材料和方法

3.1.1动物及分组：雄性SD大鼠，体重170-230g，2月-3月大，贵阳医学院实验动物中心提供。随机分为A对照组、B模型组、C模型加药物1组、D模型加药物2组、E模型加药物3组。药物1、2和3的制备同实验2.1。治疗组每天腹腔注射本发明组合物注射液，模型组和对照组大鼠为正常喂养，连续给药20d后测定学习记忆行为。

3.1.2试剂及仪器：本发明药物组合物，按照实施例1的方法制备成注射用冻干粉。鹅膏蕈氨酸(IBO)：瑞士Alexis公司生产,批号LO5308；大鼠脑立体定位仪(张家港市教学实验器械厂生产)；Y型迷宫、MG-3迷宫刺激器(张家港市教学实验器材厂)。

3.1.3AD动物模型制备

大鼠用10%水合氯醛(0.4g/kg)腹腔麻醉后，固定于脑立体定位仪上。常规备皮消毒，于头顶正中做一个1.5cm的矢状切口，参照大鼠脑立体定位图谱，Meynert核定位坐标为(Ap:1.6mm Lat±2.8mm Dv.8.2mm)，于双侧颅骨各对应点分别钻一个直径1mm的孔洞，用玻璃微量进样器进行垂直注射。模型组和治疗组双侧Meynert核每侧一次性注射BO5μg(以1μl生理盐水溶解)。每针注射时间5min，留针10min，使BO充分扩散。对照组同样方法注入等容积的生理盐水。术后肌注青霉素预防感染。

3.1.4跳台试验

自制跳台实验箱，箱底铺有铜栅作为刺激电极，箱内右后侧放置一个橡皮垫作为大鼠逃避电击的安全区。先放入大鼠适应5min，随后通入70V，0.5A～0.7A电流,大鼠遭到电击后正常反应是跳上平台以躲避伤害性刺激。记录大鼠从开始通电到完全上台所用的时间。24h后重测验一次以测记忆能力。

3.1.5Y迷宫试验

将大鼠放入Y型迷宫中适应3min后开始实验，有灯光的支臂为不通电安全区，安全区灯亮10s后，另两臂底部铝栅同时通入70V，0.5A～0.7A电流，大鼠受电击后跑到有灯光的安全区后停止，灯光继续作用30s，以大鼠所在的支臂作为下一次测试的起点，无规则随机变换安全区。以大鼠一次性跑向安全区为正确反应，否则为错误反应。连续测试30次，记录正确反应次数作为学习成绩。次日重做进行记忆能力测试。

3.1.6统计学处理

所有数据以（x±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3.2结果

各组大鼠跳台实验及迷宫实验学习、记忆能力的比较，见表4、表5。与对照组相比模型组学习记忆能力有显著性下降(P＜0.01)，说明模型建立成功；治疗组与模型组相比，学习能力均有显著性差异，各治疗组间相比，可以看出采用本发明的处方范围，对AD大鼠学习记忆的影响优于低量和高量的药物组合物，说明采用本发明处方范围合理有效。

表4跳台实验学习记忆能力的比较(x±s)

注：**P<0.01；*P<0.05

表5迷宫实验学习记忆能力的比较(x±s)

注：**P<0.01；*P<0.05

3.3结论

阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease,AD)在临床上首先表现为近期记忆力降低，继而呈现持续性智能衰退，其中认知功能障碍为其核心症状。通过回避性跳台和Y迷宫试验，观察本发明药物组合物对BO损伤双侧NBM造成的拟AD大鼠学习记忆等认知功能的影响，结果表明本发明药物组合物可提高AD大鼠的学习记忆能力，改善血管性痴呆患者的智能障碍。

以上实验表明，本发明提供的药物组合物，可有效改善脑部缺血所引起的发作、梗塞、栓塞等疾病，有效抑制体内血栓的形成，并对脑血管病引起的老年痴呆即阿尔茨海默氏病有良好疗效。

具体实施方式：

需要说明的是，本制备实施例仅仅是介绍一种制备药物的方法，是为了阐释本发明，而不是限制本发明。

实施例1、

处方：DHA10mg、灯盏花素15mg、磷酸川芎嗪25mg、水蛭素3mg；

制备工艺：（1）取处方量DHA、灯盏花素、磷酸川芎嗪和水蛭素，溶于5.3ml磷酸盐缓冲液中，制备成浓度为10mg/ml的混合溶液；

（2）取采集的脂肪组织，剔除肉眼可见的血管和纤维部分，剪碎，用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液洗涤多次，去除残留的血液，加入与脂肪组织等体积的0.3%（m/v）混合胶原酶，均匀震荡消化60分钟，再置于离心机中离心5分钟，去除表层脂肪，将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液反复清洗，经100目筛网过滤，滤液离心8分钟，弃去上清液，将获得的干细胞按照2×10⁴/cm²的密度接种于培养瓶，加入10mL含有12%胎牛血清、10³U/mlLIF的MCDB-201培养液中进行培养，每隔1-2天更换新鲜的培养液，待细胞生成达到80%融合，在培养瓶中加0.25%胰酶-EDTA进行消化，按1:3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞；将2×10⁵个脂肪干细胞重悬在200μl等渗磷酸盐缓冲液中，得到浓度为1.0×10⁶/ml的干细胞悬液；

（3）将上述药物混合溶液和人脂肪干细胞悬液按照1:2的比例混合，即得发明产物。

实施例2、

处方：DHA40mg、灯盏花素40mg、磷酸川芎嗪45mg、水蛭素8mg；

制备工艺：（1）取处方量DHA、灯盏花素、磷酸川芎嗪和水蛭素，溶于8.9ml磷酸盐缓冲液中，制备成浓度为15mg/ml的混合溶液；

（2）取采集的脂肪组织，剔除肉眼可见的血管和纤维部分，剪碎，用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液洗涤多次，去除残留的血液，加入与脂肪组织等体积的0.2%（m/v）混合胶原酶，均匀震荡消化80分钟，再置于离心机中离心10分钟，去除表层脂肪，将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液反复清洗，经100目筛网过滤，滤液离心5分钟，弃去上清液，将获得的干细胞按照2-3×10⁴/cm²的密度接种于培养瓶，加入10mL含有10%胎牛血清、10⁵U/ml LIF的MCDB-201培养液中进行培养，每隔1-2天更换新鲜的培养液，待细胞生成达到80%融合，在培养瓶中加0.25%胰酶-EDTA进行消化，按1:3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞；将2×10⁵个脂肪干细胞重悬在200μl等渗磷酸盐缓冲液中，得到浓度为1.0×10⁶/ml的干细胞悬液；

（3）将上述药物混合溶液和人脂肪干细胞悬液按照1:1的比例混合，即得发明产物。

实施例3、

处方：DHA1mg、灯盏花素1mg、磷酸川芎嗪20mg、水蛭素1mg；

制备工艺：（1）取处方量DHA、灯盏花素、磷酸川芎嗪和水蛭素，溶于4.0ml磷酸盐缓冲液中，制备成浓度为5mg/ml的混合溶液；

（2）取采集的脂肪组织，剔除肉眼可见的血管和纤维部分，剪碎，用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液洗涤多次，去除残留的血液，加入与脂肪组织等体积的0.4%（m/v）混合胶原酶，均匀震荡消化40分钟，再置于离心机中离心4分钟，去除表层脂肪，将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液反复清洗，经100目筛网过滤，滤液离心10分钟，弃去上清液，将获得的干细胞按照2-3×10⁴/cm²的密度接种于培养瓶，加入10mL含有15%胎牛血清、10³U/ml LIF的MCDB-201培养液中进行培养，每隔1-2天更换新鲜的培养液，待细胞生成达到80%融合，在培养瓶中加0.25%胰酶-EDTA进行消化，按1:3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞；将2×10⁵个脂肪干细胞重悬在200μl等渗磷酸盐缓冲液中，得到浓度为1.0×10⁶/ml的干细胞悬液；

（3）将上述药物混合溶液和人脂肪干细胞悬液按照1:3的比例混合，即得发明产物。

实施例4、

处方：DHA50mg、灯盏花素50mg、磷酸川芎嗪50mg、水蛭素10mg；

制备工艺：（1）取处方量DHA、灯盏花素、磷酸川芎嗪和水蛭素，溶于20.0ml磷酸盐缓冲液中，制备成浓度为8mg/ml的混合溶液；

（2）取采集的脂肪组织，剔除肉眼可见的血管和纤维部分，剪碎，用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液洗涤多次，去除残留的血液，加入与脂肪组织等体积的0.3%（m/v）混合胶原酶，均匀震荡消化50分钟，再置于离心机中离心6分钟，去除表层脂肪，将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液反复清洗，经100目筛网过滤，滤液离心6分钟，弃去上清液，将获得的干细胞按照2-3×10⁴/cm²的密度接种于培养瓶，加入10mL含有10%胎牛血清、10³U/mlLIF的MCDB-201培养液中进行培养，每隔1-2天更换新鲜的培养液，待细胞生成达到80%融合，在培养瓶中加0.25%胰酶-EDTA进行消化，按1:3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞；将2×10⁵个脂肪干细胞重悬在200μl等渗磷酸盐缓冲液中，得到浓度为1.0×10⁶/ml的干细胞悬液；

实施例5、将按照实施例1-4任一所述方法得到的发明产物，用制剂学常规技术制备成注射用冻干粉针剂。

实施例6、将按照实施例1-4任一所述方法得到的发明产物，用制剂学常规技术制备成小容量注射液。

实施例7、（低处方量）

处方：DHA0.5mg、灯盏花素0.5mg、磷酸川芎嗪15mg、水蛭素0.8mg；

制备工艺：取处方量药物，按照实施例1-4任一所述的制备工艺，制备得到目的药物。

实施例8、（高处方量）

处方：DHA55mg、灯盏花素60g、磷酸川芎嗪55g、水蛭素15g；

Claims

1.用于治疗或预防脑血管及相关疾病的药物组合物，其特征在于：该组合物由以下重量百分比的组分和人脂肪干细胞制成：DHA1-50份、灯盏花素1-50份、磷酸川芎嗪20-50份、水蛭素1-10份，其中药物组分溶于药学上可接受的介质中制成混合溶液，人脂肪干细胞分离培养后重悬于药学上可接受的介质中制备成培养液，所述药物混合溶液与人脂肪干细胞培养液的比例为1:1-3；制备方法为：

(1)取处方量DHA、灯盏花素、磷酸川芎嗪和水蛭素，溶于磷酸盐缓冲液中，制备成浓度为5-15mg/ml的混合溶液；

(2)取采集的脂肪组织，剔除肉眼可见的血管和纤维部分，剪碎，用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液洗涤多次，去除残留的血液，加入与脂肪组织等体积的0.2-0.4％(m/v)混合胶原酶，均匀震荡消化40-80分钟，再置于离心机中离心4-10分钟，去除表层脂肪，将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液反复清洗，经100目筛网过滤，滤液离心5-10分钟，弃去上清液，将获得的干细胞按照2-3×10⁴/cm²的密度接种于培养瓶，加入10mL含有10-15％胎牛血清、10³-10⁵U/mlLIF的MCDB-201培养液中进行培养，每隔1-2天更换新鲜的培养液，待细胞生成达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化，按1:3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞；将2×10⁵个脂肪干细胞重悬在200μl等渗磷酸盐缓冲液中，得到浓度为1.0×10⁶/ml的干细胞悬液；混合胶原酶由Ⅰ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶组成，所述混合胶原酶的质量与体积比为1％的母液配制方法为：100mlD-Hanks平衡盐溶液中加入0.7gⅠ型胶原酶、0.3gⅣ型胶原酶；

(3)将上述药物混合溶液和人脂肪干细胞悬液按照1:1-3的比例混合，即得所述药物组合物；

所述脑血管及相关疾病为脑局部缺血、脑血栓和阿尔茨海默氏病。

2.如权利要求1所述的治疗或预防脑血管及相关疾病的药物组合物，其特征在于：所述组合物中药物为以下重量百分比的组分：DHA10-40份、灯盏花素15-40份、磷酸川芎嗪25-45份、水蛭素3-8份，所述药物混合溶液与人脂肪干细胞培养液的比例为1:2。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物可以根据需要加入一种或多种药学上可以接受的载体，按照药学领域的常规方法，制备成所需要的注射液和冻干粉针剂。