CN102697766B - N-甲基胡椒乙胺或其盐在制备预防和/或治疗脑病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了N-甲基胡椒乙胺或其盐在制备预防和/或治疗脑病药物中的应用，尤其涉及N-甲基胡椒乙胺或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防脑损伤疾病或脑血管疾病的药物中的应用。本发明通过药理研究发现，N-甲基胡椒乙胺盐用作制备治疗脑血管疾病药物应用时，对于脑缺血与脑再灌注损伤均有良好的治疗作用。本发明的研究从脑生理功能、神经细胞生化及病理形态学等方面表明N-甲基胡椒乙胺或其盐是一个治疗效果好、毒副反应低的化合物，疗效优于现有的相关脑血管病药物，有可能发展成为预防和/或治疗脑损伤、脑血管疾病、对抗脑缺血和再灌注损伤及外伤性脑水肿的新药。

Description

N-甲基胡椒乙胺或其盐在制备预防和/或治疗脑病药物中的应用

技术领域

本发明涉及N-甲基胡椒乙胺或其盐的一种新用途，具体涉及N-甲基胡椒乙胺或其盐在制备预防和/或治疗脑病药物中的应用。

背景技术

脑病（encephalopathy）指任何脑器质性损害，系由遗传、先天性脑发育不全、脑外伤、脑肿瘤、脑出血、脑梗阻、感染、化学药物中毒等原因引起的大脑神经组织损伤的疾病。常见的脑病可以分为三大类：一是遗传、先天发育不良造成的小儿脑瘫，智力低下等；二是外伤造成的急性脑损伤后遗症、脑血管病造成的脑中风后遗症等；三是因中枢神经纤维损伤导致脑神经细胞衰老退化的慢性退行性疾病，包括老年痴呆症、脑萎缩、帕金森病等。

纵观各种脑病，由于神经信息传导通道（脑路）——神经纤维的堵塞，造成神经各种信息的传导不畅，致使脑神经细胞功能缺失，是脑病的病变本质。例如：中风是指由于脑血管堵塞或破裂导致神经纤维传导功能的损伤、堵塞、断裂，进而使神经细胞变性、损伤或死亡，出现偏瘫、失语等感觉、运动功能障碍；胎儿脑神经纤维发育受阻、不能促进神经细胞的分化成熟，新生儿缺血、缺氧，就造成以中枢性运动功能障碍为主的脑性瘫痪；大脑黑质神经元数量减少，合成多巴胺不足，就会导致帕金森病；信息传导通道--神经纤维的衰老与凋亡加剧，导致脑细胞的衰老（脑组织萎缩），就形成了老年性痴呆。

目前，国内外越来越多的报道指出早期治疗缺血性脑血管疾病的重要性，特别在发病3～6小时内。抗凝治疗(包括肝素和口服抗凝剂)长时期用于防止血栓的扩延和进展性脑血管病、短暂性脑缺血发作、椎—基底动脉血栓形成和预防脑栓塞再发，其疗效仍不确定，如使用不当，可增加颅内和全身出血的危险。降纤治疗仍处于研究阶段，降纤至何种程度，如何减少出血并发症的问题，尚待解决，其疗效也有待进一步评价。在介入治疗方面，据报道，颈动脉内膜切除术对防治短暂性脑缺血性发作已取得肯定疗效，对颈内动脉闭塞70%以上者，疗效相对较好。虽然这些介入性治疗，已引起越来越多的重视，但资料不多，包括颅内外血管经皮腔内血管成形术、血管内支架置入或与溶栓治疗结合，尚处于研究阶段，缺乏成熟经验。

颅脑创伤排全身创伤发生率第二位，但致死率和致残率却位居第一。颅脑创伤病人通常存在意识丧失、运动神经功能障碍、记忆功能障碍和精神功能异常。为了挽救病人的生命，改善他们的生存状态，临床医师常常使用各种脑保护药物，期盼能够促进病人脑功能的恢复。但目前部分常用药物临床疗效极差，有的甚至有害。

脑保护剂已成为当今研究的热点，在理论上有一定的依据，但迄今尚未找到经临床研究证明确定有效的制剂。

长期以来，临床上出现了大量所谓脑保护药物，此类药物的选择使用也存在着很大的盲目性。国外学者已经采用循证医学方法，将200多种脑保护药物用于治疗急性颅脑创伤病人，但未能发现任何一种临床有特效的药物。

根据上述研究结果，结合我国的基本国情和临床诊治实际情况，《中国颅脑创伤病人脑保护药物治疗指南》对以下10类药物提出如下意见：对超大剂量激素、镁制剂和超大量白蛋白提出了强烈不推荐使用的意见；而常规剂量按药典使用。对尼莫地平、谷氨酸受体拮抗剂、自由基清除剂、缓激肽拮抗剂和线粒体功能保护剂不推荐使用。因多种肽类脑神经营养药物治疗颅脑创伤病人的疗效缺乏一级临床循证医学证据，建议慎重使用。对经长期临床应用证明无不良反应，且价格便宜，药理作用明确的三磷酸腺苷、辅酶A、维生素B6和维生素C，建议推荐使用。

因此，临床上强烈盼望新型有效的脑保护药物的出现，用于预防和治疗脑病。

N-甲基胡椒乙胺或其盐，其化学结构通式（1）如下所示，式中X为H、有机酸、无机酸、有机碱或碱金属。有机酸包括乙酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡萄糖醛酸、三氟乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、酒石酸；无机酸包括盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸；有机碱包括铵、葡甲胺、氨基葡萄糖、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸；碱金属包括钠、钾、钙、镁、锌、钡、锂。

（1）

目前尚未有N-甲基胡椒乙胺或其盐应用于脑保护剂、用于预防和/或治疗脑病的报导，通过N-甲基胡椒乙胺或其盐已知的性质无法推断其是否具有预防和/或治疗脑病的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供N-甲基胡椒乙胺或其盐在制备预防和/或治疗脑病药物中的应用。

本发明解决上述问题的技术方案为：

N-甲基胡椒乙胺或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗脑病药物中的应用。

优选的，N-甲基胡椒乙胺或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗脑损伤疾病药物中的应用。

优选的，N-甲基胡椒乙胺或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗脑血管疾病药物中的应用。

优选的，脑血管疾病为脑缺血、脑缺血/再灌注损伤中的至少一种。

优选的，脑血管疾病为脑出血。

优选的，N-甲基胡椒乙胺的药学上可接受的盐为N-甲基胡椒乙胺盐，包括有机酸盐、无机酸盐、有机碱盐或无机碱盐。

优选的，有机酸包括乙酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡萄糖醛酸、三氟乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、酒石酸；无机酸包括盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸；有机碱包括铵、葡甲胺、氨基葡萄糖、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸；无机碱盐包括钠、钾、钙、镁、锌、钡、锂盐。

优选的，N-甲基胡椒乙胺盐为N-甲基胡椒乙胺盐酸盐、N-甲基胡椒乙胺氢溴酸盐、N-甲基胡椒乙胺草酸盐、N-甲基胡椒乙胺琥珀酸盐、N-甲基胡椒乙胺马来酸盐。

优选的，N-甲基胡椒乙胺盐为N-甲基胡椒乙胺盐酸盐。N-甲基胡椒乙胺盐酸盐也称盐酸N-甲基胡椒乙胺，其分子式为C₁₀H₁₃O₂N·HCl，分子量为215.5，其化学结构式如下：

。

优选的，N-甲基胡椒乙胺或其药学上可接受的盐与药物上可接受的载体和/或稀释剂混合，组成一种药物组合物。

优选的，所述药物组合物与其他药物合用在制备预防和/或治疗脑损伤疾病药物的应用。

优选的，所述药物组合物与其他药物合用在制备预防和/或治疗脑血管疾病药物的应用。

本发明所述脑缺血/再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury）是指脑缺血致脑细胞损伤、恢复血液再灌注后，其缺血性损伤反而进一步加重的现象。

本发明的N-甲基胡椒乙胺或其药学上可接受的盐使用时，可以制成水剂、粉针、片剂或胶囊等，分别采用静脉注射、肌肉注射或口服的方法。根据不同的动物及实验模型，用量为0.1～80mg/kg。

本发明的N－甲基胡椒乙胺可由胡椒乙胺经和苯甲醛缩合后，得至的N-苄叉基胡椒盐再与硫酸二甲酯反应形成。

本发明所述N-甲基胡椒乙胺或其药学上可接受的盐用于制备预防和/或治疗哺乳动物脑病药物。所述哺乳动物包括人。

本发明通过在体动物实验表明N-甲基胡椒乙胺对脑缺血及缺血/再灌注损伤引起的脑梗塞有显著治疗作用。

本发明通过实验表明N-甲基胡椒乙胺和N-甲基胡椒乙胺盐能降低血管通透性，抗脂质过氧化，保护受损脑细胞，从而发挥治疗缺血性脑血管疾病作用。

本发明还从神经生化、神经病理学和行为学三个方面，观察和研究N-甲基胡椒乙胺盐对胶原酶所诱导的大鼠脑出血模型的保护作用。

本发明提供了盐酸N-甲基胡椒乙胺在脑缺血再灌注所致小鼠血管性痴呆保护方面的应用。

本发明还通过在体动物实验表明N-甲基胡椒乙胺单独和联合用药对大鼠脑缺血和脑损伤有显著保护作用。

本发明提供了注射用盐酸N-甲基胡椒乙胺在脑保护方面的应用。

本发明的有益效果是：

本发明通过药理研究发现，N-甲基胡椒乙胺盐用作制备治疗脑血管疾病药物应用时，对于脑缺血与脑再灌注损伤均有良好的治疗作用。本发明的研究从脑生理功能、神经细胞生化及病理形态学等方面表明N-甲基胡椒乙胺或其盐是一个治疗效果好、毒副反应低的化合物，疗效优于现有的相关脑血管病药物，有可能发展成为预防和/或治疗脑损伤、脑血管疾病、对抗脑缺血和再灌注损伤及外伤性脑水肿的新药。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。

实施例1

本实施例涉及N-甲基胡椒乙胺及盐酸N-甲基胡椒乙胺对培养脑神经细胞的作用实验。

1、实验材料

普通级Sprague Dawley大鼠18只，体重250～280g；多聚赖氨酸为Sigma公司产品；DMEM培养基为Gibco公司产品；其余试剂均为分析纯。

2、神经细胞原代培养

将怀孕15d大鼠水合氯醛麻醉，75%乙醇消毒胸腹部，在无菌条件下取出胎鼠，剥出，分离两侧皮层组织，用手术刀切成糜状，移入含0.125%胰蛋白酶的磷酸缓冲液中消化30 min(37℃)后弃去消化液，加入含10%胎牛血清，10%马血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素的DMED培养液，用小口径吸管反复吹打分散，200目细胞筛过滤后，以DMEM调整细胞浓度至10⁵个/m1，接种至预先涂有0.0l%多聚赖氨酸的培养皿中，每皿2 m1，置CO₂培养箱中37℃孵育，于培养第3天在培养液中加入细胞分裂抑制剂阿糖胞普储备液以抑制非神经元细胞的过度增殖，作用48h后换新鲜培养液，以后每周换液2次，每次更换半量液。

3、NMDA诱导神经细胞损伤

细胞培养至14d后，随机分六组：（1）正常对照组；（2）N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)（50mmol/L）组；（3)NMDA+N-甲基胡椒乙胺（50mmol/L）组；（4）NMDA+盐酸N-甲基胡椒乙胺（10mmol/L）组；（5）NMDA+盐酸N-甲基胡椒乙胺（100mmol/L）组； （6）NMDA+神经节苷脂（Ganglioside,GM）（50mmol/L）组。将（3)组～（6）组所用的N-甲基胡椒乙胺、盐酸N-甲基胡椒乙胺、神经节苷脂分别与低血清DMEM(5%胎牛血清，5%马血清，30 mmol/L HEPES)混合配制成含药低血清DMEM；实验各组分别换含不同药物的低血清DMEM，其中，1）组和2）组使用不含药物的低血清DMEM，实验各组继续培养6h后除1）组外均加终浓度为50mmol/L 的NMDA，继续孵育12h后观察细胞形态，计数200个细胞，计算细胞死亡率。

4、结果

4.1对培养神经细胞形态变化的影响

正常神经细胞培养至14d时，生长良好，胞体呈锥形、梭形或三角形，突触粗而长，呈树根状交织成网；当细胞在仅含50mmol/L NMDA的培养基中孵育12h时，细胞出现肿胀、轮廓模糊，神经元突触断裂、消失、甚至细胞崩解；当细胞同时与10、100mmol/L盐酸N-甲基胡椒乙胺孵育，则细胞损伤程度明显减轻，细胞形态基本保持完整，但细胞密度有所降低，仍可见突触断裂等现象；表明盐酸N-甲基胡椒乙胺对NMDA诱导的大鼠神经细胞损伤有显著的保护作用。50mmol/L神经节苷脂的保护作用与10mmol/L盐酸N-甲基胡椒乙胺相当。

4.2 对培养神经细胞死亡率影响

各组对培养神经细胞死亡率的影响结果见表1，由表可知，神经细胞在含50mmol/L NMDA的培养基中孵育12h后，台盼蓝染色着色细胞明显增多(NMDA组49% vs正常对照组8.9%，P<0.001)，提示细胞死亡率增加；于培养基中加入N-甲基胡椒乙胺、盐酸N-甲基胡椒乙胺、GM可明显降低细胞死亡率，与NMDA组相比有显著差异。可见，N-甲基胡椒乙胺、盐酸N-甲基胡椒乙胺对NMDA诱导的大鼠脑神经细胞损伤有保护作用，其中，盐酸N-甲基胡椒乙胺的保护效果尤为显著，与神经节苷脂作用相当。故N-甲基胡椒乙胺、盐酸N-甲基胡椒乙胺对脑神经细胞有显著的保护作用。

实施例2

本实施例涉及N-甲基胡椒乙胺及盐酸N-甲基胡椒乙胺对闭合性脑外伤小鼠的作用实验。

1、实验仪器

跳台实验自动记录仪，中国医学科学院药物所仪电室；荧光分光光度计，日本HITACHI公司；酶标仪。

2、实验动物

清洁级昆明种小鼠，体重20～22g。

3、实验

取小鼠70只，随机分为七组：1）正常对照组；2）模型组； 3）N-甲基胡椒乙胺2mg/kg（药物使用时以5%葡萄糖注射液稀释至合适浓度，下同）组；4）盐酸N-甲基胡椒乙胺 1 mg/kg组；5）盐酸N-甲基胡椒乙胺2 mg/kg组；6）盐酸N-甲基胡椒乙胺4 mg/kg组；7）ATP （三磷酸腺苷二钠）4mg/kg组；每组10只。

将2）组～7）组小鼠禁食16小时后造成小鼠闭合性脑外伤模型，3）组～7）组分别静脉给药，24小时后所有组剥取鼠脑，称量湿重，70℃烘干24小时，称干重，计算脑含水量；脑含水量高于正常值表示脑部水肿，各组对闭合性脑外伤小鼠脑水肿的影响结果见表2。

由表2可知，由模型组与正常对照组比较，可知闭合性脑外伤造成小鼠脑严重水肿，给予不同剂量的盐酸N-甲基胡椒乙胺、N-甲基胡椒乙胺或ATP后，小鼠脑水肿有不同程度的减轻，盐酸N-甲基胡椒乙胺作用且呈剂量依赖性。N-甲基胡椒乙胺作用优于ATP。可见，N-甲基胡椒乙胺及盐酸N-甲基胡椒乙胺对闭合性脑外伤小鼠有治疗作用。

    

实施例3

本实施例涉及盐酸N-甲基胡椒乙胺对血管性痴呆小鼠的神经保护作用实验。

药品及实验仪器：盐酸N-甲基胡椒乙胺：用时以5%葡萄糖注射液稀释至合适浓度。跳台实验自动记录仪，中国医学科学院药物所仪电室产品；荧光分光光度计，日本HITACHI公司产品；酶标仪。

实验动物：清洁级昆明种小鼠，体重20～22g。

1、盐酸N-甲基胡椒乙胺对脑缺血再灌注小鼠学习记忆功能障碍的改善作用

将小鼠50只，随机分为五组：假手术组，模型组，盐酸N-甲基胡椒乙胺 1 mg/kg组、2 mg/kg组、4 mg/kg组，每组10只。

禁食16小时后建立小鼠缺血再灌注致痴呆模型，具体操作如下：小鼠以戊巴比妥钠(60 mg/kg，ip)麻醉后，仰卧位固定，颈正中切口，分离双侧颈总动脉，并穿以零号丝线，双侧颈总动脉阻断血流10 min，然后恢复血流10 min，如此重复3次，缝合皮肤。置小鼠于正常饲养条件。假手术组只分离双侧颈总动脉。

缺血再灌注后10 min，尾静脉注射药物，缺血再灌注24h后，第2次给药。给药半小时后进行跳台实验。将待测小鼠放入跳台仪中，适应环境3 min，然后向底部栅板通电，观察小鼠跳上高台时间(反应时间)和5 min内小鼠由高台跳下受到电击的次数(训练期错误次数)。24 h后，再次给药，然后进行第2次跳台实验测定记忆获得功能。将小鼠放于实验仪高台上，底部栅板同时通电，记录小鼠跳下高台的时间(潜伏期)和5 min内受到电击次数(重测期错误次数)。每次缺血再灌注后给药方法：除假手术组和模型组外其余组小鼠尾静脉注射不同浓度盐酸N-甲基胡椒乙胺。各组对脑缺血再灌注小鼠学习记忆功能的影响结果见表3。

结果如表3所示，由模型组与假手术组结果对比可知，重复脑缺血再灌注可以使小鼠出现明显的学习记忆障碍，反应时间延长，错误次数增加，潜伏期缩短。而盐酸N-甲基胡椒乙胺对缺血再灌注引起的学习记忆障碍有改善作用，减少反应时间，延长潜伏期，减少测试期和重测期错误次数，与模型组比较有显著性差异(*P<0.05或**P<0.01)。

2、盐酸N-甲基胡椒乙胺对脑缺血再灌注小鼠脑SOD活性、MDA和GSH含量的影响

小鼠缺血再灌注方法和给药方式同上，缺血再灌注完成后，断头处死，于0℃下取出大脑用磷酸缓冲液制成匀浆，邻苯三酚自氧化法测定SOD的活性，TBA法测定MDA的含量，DTNB法测定GSH的含量，考马斯亮蓝定量蛋白质。各检测指标见表4。

由表4可知，由模型组与假手术组结果对比可知，重复脑缺血再灌注可以使小鼠脑匀浆SOD活性下降，MDA含量升高，GSH含量降低。而给予不同剂量盐酸N-甲基胡椒乙胺可抑制缺血再灌注小鼠脑组织MDA的升高，增加GSH的含量，提高SOD的活性，与模型组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。

实施例4

本实施例涉及盐酸N-甲基胡椒乙胺用于治疗感染性脑水肿的在体动物实验。

将体重200～220g的SD大鼠30只，随机分成3组：生理盐水对照组(NS，n=10)；百日咳菌液模型组(PB，n=10)；盐酸N-甲基胡椒乙胺预处理百日咳菌液组(JBTA，n=10)。

大鼠颈正中切口，分离左颈总动脉，颈外动脉，颈内动脉及分支，结扎翼腭动脉和枕动脉。夹闭颈外动脉后，用1ml注射器4.5号针头于左颈总动脉穿刺向左颈内动脉注射百日咳菌液0.2ml/kg(百日咳菌液由北京生物制品研究所提供的灭活菌液，含菌10.8×10⁹/ml)，15s内注射完毕。NS组则用同法注射等量的无菌生理盐水。盐酸N-甲基胡椒乙胺组在注百日咳菌液前48h每天静脉注射0.5mg/kg，连续2d。各组大鼠注菌或生理盐水4h后断头处死。

检测各组大鼠脑的脑含水量及钠、钾离子的含量，检测结果见表5。采用ELISA法与Griess法分别测大鼠脑组织匀浆中IL-1β、TNF-α和NO含量，检测结果见表6。

 

由表5可知，盐酸N-甲基胡椒乙胺预处理后能显著降低百日咳菌液脑水肿大鼠的脑含水量及钠离子的含量，增加钾离子含量。表明盐酸N-甲基胡椒乙胺预处理对大鼠感染性脑水肿有保护作用。

由表6可知，盐酸N-甲基胡椒乙胺预处理组IL-1β、TNFα及NO含量显著降低(P＜0.01)。

可见，PB组注菌后4h大鼠脑含水量增加、Na⁺含量增加，K⁺含量降低，表明已成功的建立了大鼠感染性脑水肿模型；同时脑组织中IL-1β、TNF-α及NO的含量增加，与相应NS对照组比较差异有极显著性(P＜0.01)。可见这些因子与感染性脑水肿关系密切，上述因子的大量生成可能加重感染性脑损伤。而大鼠经盐酸N-甲基胡椒乙胺预处理后再制成感染性脑水肿模型，与未作预处理的大鼠感染性脑水肿模型比较，预处理后脑组织的IL-1β、TNF-α及NO的含量明显下降，同时脑含水量，Na+含量降低，K+含量增加，与模型组比较，差异有极显著性(P＜0.01)。说明盐酸N-甲基胡椒乙胺可减少IL-1β、TNF-α及NO的生成量，对感染性脑水肿大鼠有保护作用。

实施例5

本实施例涉及盐酸N-甲基胡椒乙胺联合临床常用脑病药物用于治疗感染性脑水肿的在体实验。

感染性脑水肿模型同实施例4。研究盐酸N-甲基胡椒乙胺和特异性L-型钙离子通道阻断剂尼莫地平对感染性脑水肿脑含水量和伊文思蓝（EB）含量的影响，旨在为临床治疗提供实验和理论依据。

健康SD大鼠90只，体重200～220g，随机分为4组：(1)生理盐水对照(NS)组，20只；(2)百日咳菌液(PB)组，30只；(3)尼莫地平治疗(Nim)组，20只；(4) 盐酸N-甲基胡椒乙胺预处理后尼莫地平治疗（盐酸N-甲基胡椒乙胺+Nim)组，20只。各组又分为30min、4h和24h 3个时间组。

注菌后5min内向静脉内注入尼莫地平(Nim治疗组，0.25mg／kg体重)，24h尼莫地平治疗组每8h重复注射1次相同剂量；盐酸N-甲基胡椒乙胺预处理后尼莫地平治疗组于实验前48 h和24h向静脉内注入盐酸N-甲基胡椒乙胺(0.5mg/kg，共2次)，预处理后再进行尼莫地平治疗。盐水组同菌液组操作一样，在同样时间内注射等体积的生理盐水。注菌或注生理盐水后10min内从舌下静脉注入2%的伊文思兰(EB,0.2mL/100g体重)。各组动物观察至规定时间后断头处死，迅速取脑，去除皮质表面的软脑膜及凝血块，取左侧大脑半球后1/3全层脑组织标本(约0.1～0.2g，包括灰质和白质)，行干湿法测定脑组织水分含量及伊文思兰（EB）含量测定、脑组织电镜检查。

各个时间组感染性脑水肿脑组织含水量与EB含量的均数、标准差、方差分析及其相关分析结果见下表7。结果显示，应用尼莫地平治疗后注菌侧脑组织含水量和EB含量明显低于百日咳菌液组脑组织含水量和EB含量(P＜0.05)，以4h治疗组疗效最佳。盐酸N-甲基胡椒乙胺预处理后尼莫地平治疗组脑组织含水量与EB含量在30min时间组无明显改变，在4和24h组则明显降低(P＜0.05)，与单独尼莫地平治疗组比较差异有显著性(P＜0.01)。菌液组各时间亚组脑组织含水量与EB的含量呈高度正相关(r＞0.90，P＜0.05)。

 

电镜检查结果表明：4 h菌液组内皮细胞明显肿胀，脑血管周围间隙增宽，胶质细胞足突明显肿胀；胞浆结构模糊，线粒体水肿，细胞器胀肿。24 h菌液组除上述改变外，主要表现为神经细胞核浓聚固缩，出现“暗黑细胞”，说明24 h菌液组发生神经元迟发性坏死。

尼莫地平是一种选择性较强的二氢吡啶类有机钙拮抗剂，易于透过血脑屏障（BBB），一方面选择性作用于脑血管，对脑血管具有选择性扩张作用，解除脑血管痉挛、改善脑微循环和保护BBB；另一方面，尼莫地平特异性阻断神经细胞膜上L-型钙离子通道，恢复Ca^2＋-ATP酶的活性，减轻脑损伤时Ca^2＋内流，从而减轻脑水肿。本研究发现4h和24h 盐酸N-甲基胡椒乙胺预处理后尼莫地平治疗组脑组织水分含量和EB的含量则明显下降，作用优于单用尼莫地平组。说明盐酸N-甲基胡椒乙胺预处理后尼莫地平治疗组对于迟发性脑水肿有防治作用，即L-型钙离子通道阻滞剂(如尼莫地平)与盐酸N-甲基胡椒乙胺联合应用，可从不同的环节阻断细胞外Ca^2＋内流，对大鼠百日咳菌液所致的感染性脑水肿有治疗的作用。

实施例6

本实施例涉及盐酸N-甲基胡椒乙胺对局部脑缺血大鼠的保护作用实验。

实验试剂：尼莫地平注射液，山东新华制药股份有限公司产品，规格：10 mg/50 ml，TUNEL试剂盒：南京建成生物工程开发公司。

实验动物：普通级SD大鼠60只，体重250～280g。

1、局部脑缺血模型制作

动物随机分为假手术组，模型组，尼莫地平组(Nim，1 mg/kg)，盐酸N-甲基胡椒乙胺组（0.5、1、2mg/kg)，每组10只。各组小鼠禁食16小时后，水合氯醛(350 mg/kg，ip)麻醉，分离右侧颈总动脉，夹闭颈内、颈总动脉，颈外动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，将栓线(选用直径0.24尼龙线，长度5.0cm)由颈外动脉插入至颅内，遇轻微阻力时停止，插入深度约为2 cm。结扎颈外动脉开口，并打开颈总动脉动脉夹，消毒缝合伤口，造成右侧大脑中动脉局灶性缺血模型（MACO）；假手术组仅进行右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉的分离(以上实验均在23～25℃进行)。各组动物手术完成30 min后除假手术组、模型组外分别给予相应药物。

2、神经行为评分和TTC染色测定梗死面积

24小时后观察并记录大鼠的行为障碍：(1)提鼠尾观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面，计为0分，如手术对侧前肢出现腕屈曲计为1分，肘屈曲计为2分，肩内旋计为3分，既有腕屈曲和／或肘屈曲，又有肩内旋者，计为4分。(2)将动物置于平地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力，计为0分，如向手术对侧推动时阻力下降者，根据下降程度不同分为轻、中、重三度，分别计为l，2和3分。(3)将动物双前肢置一金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢肌张力对等且有力者计为0分。同样根据手术对侧肌张力下降程度不同计为1，2和3分。(4)动物有不停地向一侧转圈者，计为1分。根据标准评分，满分为11分，分数越高，表示动物行为障碍越严重。

行为评分后处死大鼠，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，冠状切成5片，脑片用红四氮唑(TTC)染色，正常组织经染色后呈红色，梗塞组织呈白色，染色后照相，用中国航空航天大学病理图像分析软件求梗塞面积比。

各组对局部脑缺血大鼠神经行为、脑梗死面积的影响结果见表8所示。由表可知，缺血24小时后，大鼠表现出明显的行为障碍，大鼠脑组织也出现明显的灶状缺血坏死区，达到全脑的25％左右；给予不同剂量的盐酸N-甲基胡椒乙胺(0.5、1、2mg/kg)，动物行为障碍有不同程度的减轻，大鼠脑缺血区也有明显缩小。

病理观察: 经TTC染色后的脑片置10%福尔马林中固定，经脱水、浸蜡、包埋、切片等步骤后，制成8 μm厚的组织切片，甲苯胺蓝染色，在光学显微镜下进行检查，并进行细胞计数。计数的方法：选择每只大鼠视交叉与漏斗柄连线中点处的病理切片，以固定范围的皮层下基底节为观察对象，以细胞核消失、细胞体暗染的坏死神经元为计数对象，用细胞计数器，计算坏死神经元数占总神经元数的百分比。

数据用x±SD表示，组内给药前后、组间均以参比差值法(ANOVA)进行统计学处理。检测结果见表9。

病理检查结果： MCAO后24 h，模型组的大鼠患侧半球MCA供血区苍白、无光泽，脑病理切片显示，于MCA闭塞侧脑组织有严重损伤的坏死中心区和轻中度损伤的半影区及其以外的外周区，其中半影区对缺血性变化较为敏感，在模型组大鼠表现为大量神经元周围间隙扩大，出现散在的暗染神经元，神经细胞出现不同程度的皱缩。对侧脑组织未见病理改变。给予盐酸N-甲基胡椒乙胺组动物有不同程度的减轻。我们以相同切面的脑片半影区来进行细胞计数。由表9可见，盐酸N-甲基胡椒乙胺治疗组皮层、纹状体神经元坏死百分比明显减少，与模型组比较差异显著(P<0.05或P<0.01)。

实施例7

本实施例涉及盐酸N-甲基胡椒乙胺用于治疗脑缺血再灌注损伤疾病的动物实验。

采用小鼠线栓法制作局灶性脑缺血再灌注损伤模型，缺血2h，再灌24h，证明盐酸N-甲基胡椒乙胺对缺血再灌注损伤脑的保护作用。

将小鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，静注给予1mg/kg，5mg/kg盐酸N-甲基胡椒乙胺或20u/kg的辅酶A(CoA)，按实施例6所述方法制作大脑中动脉缺血。术后2h将尼龙线从颈内动脉中拔出，直至头端达颈总动脉分叉处，再灌注24h。假手术组除不插线外，其余步骤同上。再灌注24h后存活的小鼠断头取脑，迅速置-20℃冷冻箱中5 min后取出，在操作台上迅速由前向后切厚度为2.0mm的冠状切片，将切片立即置于1%的TTC磷酸盐缓冲液中，避光常温孵育30 min。每隔10 min翻动脑片使均匀接触到染色液，扫描观察染色结果。各组对脑缺血模型小鼠脑梗死面积的影响见表10。

脑梗死体积观察：由于TTC是脂溶性光敏感复合物，是呼吸链中吡啶-核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内脱氢酶活性下降，不能反应，故不会产生变化呈苍白。因此，假手术组(A)脑组织无梗塞，由表10可知，手术组(B)缺血侧脑组织有明显梗塞现象，脑片梗塞区占整个冠面的百分比为26.7±2.2(%)，盐酸N-甲基胡椒乙胺治疗组(C)可显著缩小缺血侧脑组织梗塞面积，与手术组相比有非常显著差异(P<0.01)，5mg/kg盐酸N-甲基胡椒乙胺组效果优于CoA组。可见，盐酸N-甲基胡椒乙胺对小鼠脑缺血/再灌注损伤引起的脑梗塞有显著保护作用。

实施例8

本实施例涉及盐酸N-甲基胡椒乙胺对大鼠脑出血保护作用。

实验动物：Wistar大鼠，雌雄各半，体重180～250g，术前12h禁食，自由饮水。

1、实验动物分组

动物随机分成五组：1）假手术(sham)24h组；2）脑出血（Intracerebral Haemorrhage，ICH）+生理盐水组(模型组)；3）ICH +盐酸N-甲基胡椒乙胺(2mg/kg)组，称为高剂量组(h)；4）ICH+盐酸N-甲基胡椒乙胺(0.5mg/kg)组，称为低剂量组(1)；5）ICH+尼莫地平(Nim,0.5mg/kg)组。后四个组又分为4h，8h，12h，24h四个时间点亚组。生理盐水、盐酸N-甲基胡椒乙胺和尼莫地平于ICH造模前30min经大鼠尾静脉给药，每日一次。缓慢注射，药液总量控制在1 m1/200g体重：生理盐水也按1 m1/200g体重给予。每组Wistar大鼠7只。

2、大鼠ICH模型的建立

本实施例参照Rosenberg等报道的方法。本发明选用的鼠脑出血模型是胶原酶诱导模型，此模型是目前国内外最为常用的脑出血模型之一。该模型中采用的胶原酶是一种金属蛋白酶，可降解间质和基底膜胶原，将其注入脑内后，能降解血管壁的胶原，从而造成出血。此模型在某些方面的病理如脑水肿、组织学和行为学等与临床很接近，而且该模型注入脑内的液体量较少，几乎没有药液本身的压迫占位效应。

具体操作步骤如下：实验鼠经水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉后，仰卧位固定于立体定位仪上，并按照包新民等报道的定位方法使大鼠前囟和后囟在同一平面。用碘酒局部消毒，头皮正中切口，剪开骨膜，暴露前囟，于前囟后1mm，中线向左旁开3mm用五号针头钻一直径大约为1 mm的小孔，深达硬脑膜。用固定于立体定位仪上的微量注射器沿钻孔进针，进针深度为5.8mm(即尾状核位置)，缓慢注射胶原酶VI 0.5U。注射时间为3min，注射完后留针5min再退针，然后缝合皮肤，回笼饲养。假手术组只插针，不注射药物，其余操作一样。

统计学处理：各组测定值用均数±标准差(x±SD)表示，用SPSS统计软件作单因素方差分析(one-way ANOVA)，显著性水平P<0.05。

3、观察指标及结果

3.1 ICH大鼠神经病学评分

动物苏醒后，各组均按照Bedersog等的神经缺损分级评分标准(稍加改进)立即进行神经功能缺失评分。ICH模型大鼠神经病学评分标准见表11。

 

3分及以上动物入选本实验，术后动物分笼饲养，正常进食进水。室温控制在20～25℃，以后于造模后4h、8h、12h、24h进行评分。神经病学评分结果见表12。

结果：假手术组各时间点神经功能缺损评分均为0分；模型组动物麻醉清醒后立即评分均为3分或4分，一方面说明ICH大鼠造模成功，另一方面说明ICH造成了极为明显的大鼠神经功能缺损。由表12可知，随着时间的推移，各组ICH大鼠神经功能评分逐渐下降，而给药组评分的下降快于模型组。在ICH后12h、24h大剂量盐酸N-甲基胡椒乙胺给药组与模型组、小剂量盐酸N-甲基胡椒乙胺组相应时点的神经缺损评分比有显著性差异(P<0.05)。ICH后12h、24h时点，尼莫地平组与模型组相应时点的神经缺损评分比有显著性差异(P<0.05)。上述结果提示盐酸N-甲基胡椒乙胺2 mg/kg静脉给药能够改善ICH后神经缺损评分，其作用优于0.5mg/kg的尼莫地平产生的作用。

3.2脑含水量(BWC)测定

观察盐酸N-甲基胡椒乙胺对大鼠脑出血后4h、8h、12h、24h脑含水量的影响，各组动物在预定的时间点，经水合氯醛麻醉后，迅速断头取脑，将取出的脑组织放在已经用生理盐水湿润过的滤纸上，以防止水分蒸发。去除软脑膜和血迹，以进针孔为中心，切取前半部分脑组织，精密称重(精确到0.1mg)。取脑到称完重量时间控制在5min内。然后置于95℃恒温烘箱24h，再称取干重。按Blliot公式计算脑含水量：BWC=(湿重一干重)/湿重×100%。结果见表13。

由13可知，大鼠脑出血后其脑含水量在4h、8h、12h、24h时点与假手术组比明显上升，并具有显著性差异(P<0.05)，而且脑含水量随着时间的进程不断增加，并在脑出血后24小时达到一个高峰。治疗组ICH大鼠脑含水量与模型组比，各个时点均不同程度降低。这些结果表明，盐酸N-甲基胡椒乙胺2mg／kg给药能够降低ICH后大鼠脑水肿的严重程度，其治疗效果与0.5mg/kg的尼莫地平的作用相似。  

3.3组织病理学观察

观察盐酸N-甲基胡椒乙胺对大鼠脑出血病理形态的影响。随机选取各组动物，于预定的时间点以水合氯醛深度麻醉，迅速断头取脑，切取含血肿的脑组织片(约5mm)，立即放入10％甲醛液中，固定24h后经乙醇梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片(5μm)，HE染色，封片。光镜观察病变区及附近脑组织病理改变。

结果：脑出血后大鼠脑组织出现明显的病理改变，第4、8、12小时的切片可见到明显的出血灶，病灶周围组织疏松水肿，伴有少许炎症细胞浸润；第24小时的切片可见到病灶周围组织仍然疏松水肿，炎症细胞浸润更为严重。预先给予大剂量盐酸N-甲基胡椒乙胺治疗ICH大鼠能够明显减轻脑出血后组织水肿和炎症细胞浸润；而预先给予小剂量盐酸N-甲基胡椒乙胺或尼莫地平也能不同程度减轻上述病变。

3.4对脑组织中NE的影响

各组大鼠经水合氯醛麻醉后，快速断头取脑，切取针孔周围脑组织，精密称重后，用生理盐水作为匀浆介质，在冰浴环境中以玻璃匀浆器制成10%的组织匀浆。取上清液ELISA法测定NE活性，检测结果见表14。

由表14可知，模型组（ICH）与假手术组相比，大鼠脑出血后脑组织NE活性明显增加(P<0.01)；盐酸N-甲基胡椒乙胺高剂量能显著降低大鼠脑出血后脑组织的NE活性(P<0.01)。

3.5对大脑组织中N0的影响

各组大鼠经水合氯醛麻醉后，快速断头取脑，切取针孔周围脑组织，精密称重后，用生理盐水作为匀浆介质，在冰浴环境中以玻璃匀浆器制成10％的组织匀浆，取上清液以硝酸还原酶法测定N0含量，检测结果见表15。

由表15可知，模型组（ICH）与假手术组相比，大鼠脑出血后脑组织NO含量明显增加(P<0.01)，盐酸N-甲基胡椒乙胺高剂量能降低大鼠脑出血后脑组织NO的含量(P<0.01)。

实施例9

本实施例涉及盐酸N-甲基胡椒乙胺联合其他药物用于治疗脑缺血实验。

模型制备、给药方法及指标检测同实施例6。盐酸N-甲基胡椒乙胺联合NGF(注射用鼠神经生长因子)、Vit B6（维生素B6）治疗脑缺血。盐酸N-甲基胡椒乙胺剂量1mg/kg iv，大鼠脑损伤后即刻肌肉注射NGF 250U，Vit B6剂量0.2mg/kg iv。联合用药对局部脑缺血大鼠的影响结果见表16。由表16可知，盐酸N-甲基胡椒乙胺与其他药物合用效果更佳。

实施例10

本实施例涉及注射用盐酸N-甲基胡椒乙胺用于治疗缺血再灌注性脑血管疾病的在体动物实验。

本实施例注射用盐酸N-甲基胡椒乙胺冻干制剂处方及工艺如下：

处方(5ml/瓶×1000瓶)： 

盐酸N-甲基胡椒乙胺原料药    10.0g

甘露醇               100.0g

将以上原料溶于注射用水中，同时用盐酸调节pH至3，用注射用水定容至5000ml，得盐酸N-甲基胡椒乙胺制剂，分装成1000瓶，5ml/瓶。   

将配制、分装好的盐酸N-甲基胡椒乙胺制剂放入冻干箱样品室内→-30℃预冻→-15℃升华干燥→25℃再干燥→自动压塞→盖铝盖→压盖→质检。

成品按注射用盐酸N-甲基胡椒乙胺质量标准检验，应符合规定。

模型制备及给药方法同实施例7，实验各组脑缺血模型小鼠的梗死面积结果见表17。由表17可知，盐酸N-甲基胡椒乙胺（冻干制剂）对小鼠脑缺血/再灌注损伤引起的脑梗塞有显著保护作用，且作用优于ATP及依达拉奉。

本发明选用通过胶原酶诱导产生的大鼠脑内出血模型为研究对象，以目前临床治疗脑出血常用药尼莫地平为对比参照，研究了盐酸N-甲基胡椒乙胺对脑出血的保护作用。通过对比观察给药后ICH大鼠行为学变化、病理学、脑含水量改变，证明了盐酸N-甲基胡椒乙胺对脑出血具有保护作用。

本发明另外的动物试验结果也表明盐酸N-甲基胡椒乙胺(2mg/kg)能降低胶原酶所引起的ICH大鼠出血侧脑BBB通透性的增加程度；可以阻止胶原酶所引起的ICH大鼠出血侧脑内SOD含量的降低和MDA含量的升高；能降低胶原酶所引起的ICH大鼠出血侧脑内TNF-Q表达和MPO含量的增加。表明盐酸N-甲基胡椒乙胺可能通过保护ICH后大鼠BBB、提高组织清除自由基的能力以及抗多形核粒细胞的聚集、释放炎症介质等机制实现对胶原酶引起的大鼠ICH具有保护作用。

Claims (9)

1.N-甲基胡椒乙胺或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗脑病药物中的应用；所述脑病为脑损伤疾病或脑血管疾病。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：脑血管疾病为脑缺血、脑缺血/再灌注损伤中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：脑血管疾病为脑出血。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：N-甲基胡椒乙胺的药学上可接受的盐为N-甲基胡椒乙胺盐，包括有机酸盐、无机酸盐。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：有机酸包括乙酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡萄糖醛酸、三氟乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、酒石酸；无机酸包括盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：N-甲基胡椒乙胺盐为N-甲基胡椒乙胺盐酸盐。

7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于：N-甲基胡椒乙胺或其药学上可接受的盐与药物上可接受的载体和/或稀释剂混合，组成一种药物组合物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物组合物与其他药物合用在制备预防和/或治疗脑损伤疾病药物的应用。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物组合物与其他药物合用在制备预防和/或治疗脑血管疾病药物的应用。