CN102451209B - 一种中药组合物在制备脊髓损伤后神经保护药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药组合物对运动神经元的保护作用的应用。本发明中药组合物包括人参和淫羊藿，可促进脊髓损伤后大鼠后肢运动功能恢复，增强神经元细胞活力，抑制谷氨酸诱导的神经细胞凋亡，调节凋亡相关蛋白表达，具有一定的神经保护作用。

Description

一种中药组合物在制备脊髓损伤后神经保护药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种中药组合物的新用途，具体地，涉及一种中药组合物在制备脊髓损伤后神经元保护药物中的应用。

背景技术

运动神经元疾病（motor neuron disease，MND）包括肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、进行性脊肌萎缩、进行性延髓麻痹、原发性侧索硬化等，是由于中枢神经系统上下运动神经元广泛变性引起的，其症状有肌力减退、肌肉萎缩，并逐渐发展为饮食呛咳、吞咽困难、呼吸困难，直到死亡。ALS是一种病因未明的选择性侵犯脊髓前角细胞、脑干运动神经核及锥体束的慢性进行性变性疾病，临床表现为上下运动神经元合并受损的体征，是慢性运动神经元疾病中最常见的类型。进行性脊肌萎缩，大多数患者一侧或双侧手部肌群无力和萎缩，可见肌束颤动，肌张力减低，腱反射减弱或消失，严重者呈爪形手。肌萎缩和肌无力可向上发展，感觉神经不受累，少数患者下肢可出现症状。原发性侧索硬化症，成人起病，病程进展缓慢，常先侵犯下胸段的皮质脊髓束，出现双下肢无力、僵硬、行走时呈痉挛步态，逐渐累及双上肢。四肢肌张力增高，病理体征阳性。进行性延髓麻痹，以逐渐加重的延髓麻痹症状首发，表现为吞咽困难，饮水呛咳、言语含糊，咳嗽无力，甚至呼吸困难。同时或稍后出现出现躯体运动神经元受损的症状和体征。临床表现为，起病缓慢，病程也可呈亚急性，症状依受损部位而定。由于运动神经元疾病选择性侵犯脊髓前角细胞、脑于颅神经运动核以及大脑运动皮质锥体细胞、锥体束，因此若病变以下级运动神经元为主，称为进行性脊髓性肌萎缩症；若病变以上级运动神经元为主，称为原发性侧索硬化；若上、下级运动神经元损害同时存在，则称为肌萎缩侧索硬化；若病变以延髓运动神经核变性为主者，则称为进行性延髓麻痹。临床以进行性脊肌萎缩症、肌萎缩侧索硬化最常见。本病主要表现，最早症状多见于手部分，患者感手指运动无力、僵硬、笨拙，手部肌肉逐渐萎缩，可见肌束震颤。四肢远端呈进行性肌萎缩，约半数以上病例早期呈一侧上肢手部大小鱼际肌萎缩，以后扩展到前臂肌，甚至胸大肌，背部肌肉亦可萎缩，小腿部肌肉也可萎缩，肌肉萎缩肢体无力，肌张力高(牵拉感觉)，肌束颤动，行动困难、呼吸和吞咽障碍等症状。如早期病变性双侧锥体束，则可先出现双下肢痉挛性截瘫。

本病病因复杂，目前尚缺乏有效的治疗手段，中医药在改善患者临床症状、提高生存质量方面具有明显的优势，本发明药物作为医院制剂在运动神经元病治疗中取得较好的临床疗效[王雅慧，赵辉，黄佳荃．肌萎灵汤治疗多发性硬化的临床研究．现代中西医结合杂志，2006，15(12)：1608-1609；陈金亮，平阳，王殿华．肌萎灵系列制剂治疗肌萎缩侧索硬化症240例疗效观察．新中医，2005，37(9)：38-39]。本发明通过上调bcl-2蛋白表达、下调bax蛋白表达，从而抑制谷氨酸诱导的原代神经元细胞凋亡，增强神经元细胞活力，从而延缓病情发展，推测在改善患者肢体活动，提高生存质量等方面具有重要的临床应用价值。

本发明是在中国专利CN1785223A的基础上进行的改进发明，在此引用该专利文件记载的内容。本发明提供了该中药组合物在制备保护运动神经元药物中的应用。

发明内容

本发明提供了该中药组合物在制备脊髓损伤后神经元保护药物中的应用。

本发明中药组合物是由如下重量份比例的原料制成：

人参总皂苷提取物30-70    淫羊藿总黄酮提取物20-60。

优选为：

人参总皂苷提取物35    淫羊藿总黄酮提取物55。

还优选为：

人参总皂苷提取物65    淫羊藿总黄酮提取物25。

或者：

人参总皂苷提取物50    淫羊藿总黄酮提取物40。

本发明原料中的人参皂苷提取物和淫羊藿总黄酮提取物均按照CN 1785223A公开的方法制得的。

人参总皂苷提取物制备方法：人参药材，用60-90%乙醇提取1-3次，第1次加药材8-12倍量溶剂提取1-2小时，第2次加6-10倍量溶剂提取1-2小时，第3次加6-10倍量溶剂提取0.5-1小时；合并上述提取液，趁热滤过，减压回收乙醇，并浓缩，放入不锈钢桶内，加纯水搅拌均匀,冷藏24-36h；将冷藏液取出，放至常温，板框过滤器过滤，用少量水洗涤板框，滤液加纯水稀释，备用；取人参浓缩药液通过处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱，并分别用pH值8-9的氨水、20%乙醇、80%乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱液。将80%洗脱液加入纯水，配成50%醇溶液，通过中性氧化铝柱，收集洗脱液，再用少量50%乙醇洗涤柱子，合并洗脱液备用；取药液加入活性炭，回流加热，煮沸20min，趁热板框抽滤，收集滤液，浓缩，冷藏过夜；澄清板过滤，减压干燥，即得人参总皂苷提取物。

淫羊藿总黄酮制备方法：取淫羊藿药材，加水煎煮提取2-5次，加水量为10-30倍，第一次提取时间定为0.5-2h，以后3次为0.5-1h；合并上述提取液，趁热滤过，减压浓缩，放入不锈钢桶内，加乙醇至药液含醇浓度为70%,冷藏；过滤，滤液回收乙醇并浓缩，加水搅拌均匀，冷藏，过滤，备用；取淫羊藿药液通过处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱，并分别用纯水、20%乙醇、50%乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱液；洗脱液拌入适量硅藻土混匀，用无水乙醇提取2-5次，提取液合并，回收乙醇并浓缩，浓缩液加入丙酮，并搅拌均匀，冷藏，过滤，沉淀加丙酮再同前处理2次，合并3次滤液，回收溶剂，并浓缩，减压干燥，即得淫羊藿总黄酮提取物。

本发明还提供了中药组合物冻干注射剂的制备方法：

a、将5-15倍原料重量的羟丙基-β-环糊精加水溶解制成15～30%的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水制成3～10%的溶液，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温50～90℃，动态搅拌包合，包合时间3～8小时，将人参总皂苷提取物加水制成30-50%的溶液，加入包合液中，继续包合1～2小时；

b、加水调节溶液总量至6ml/支，用5～20%的氢氧化钠溶液调节PH到6～9，加入活性炭至含活性炭0.1～0.5%，煮沸5～10分钟，趁热滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6ml/支；

c、105℃热压灭菌10～30分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-20℃～-40℃预冻2～5小时；

d、按照预冻条件，在真空度为0.05-0.5Pa状态下，从预冻温度至0℃升温升华20-35小时，再从0℃至30℃升温干燥3-8小时；

e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。

优选为：

a、将9倍原料重量的羟丙基-β-环糊精加水溶解制成20%的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水制成5%的溶液，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温60～80℃，动态搅拌包合，包合时间3～5小时，将人参总皂苷提取物加水制成33%的溶液，加入包合液中，继续包合1～2小时；

b、加水调节溶液总量至6ml/支，用10%的氢氧化钠溶液调节PH到7.5～8.0，加入活性炭至含活性炭0.4%，煮沸10分钟，趁热滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6ml/支；

c、105℃热压灭菌30分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-40℃预冻3小时；

d、按照预冻条件，在真空度为0.05-0.1Pa状态下，从-40℃至0℃升温升华28小时，再从0℃至30℃升温干燥4.5小时；

e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。

本发明冻干注射剂的制备方法中的所述百分比浓度，如果为固体溶解在液体中一般指重量体积比(g/ml或Kg/L)，例如：羟丙基-β-环糊精加水溶解制成20%的溶液，是指取20克羟丙基-β-环糊精加水100ml制成；如果为液体溶解在液体中，则为体积体积比(ml/ml或L/L)，比如50%乙醇浓度是指50ml纯乙醇与50ml的水制成的溶液，也可以使用高浓度乙醇稀释至体积体积比为50%的溶液。

本发明所述中药冻干注射剂的原辅料重量比例及制备方法是经过大量严格筛选试验，工艺验证，稳定性研究后才得到的，并非通过制剂教材或其它参考资料就可以直接得到的，经过筛选试验，工艺验证，稳定性研究证实本发明原辅料比例合理，制备工艺稳定，成品制剂稳定，符合制剂学以及国家食品药品监督管理局对于中药冻干注射剂的制剂指导原则要求。

本发明中药组合物还可以按常规的制剂工艺，例如，范碧亭《中药药剂学》（上海科学出版社1997年12月第1版）记载的制备工艺，制成药剂学可接受的任意常规剂型，例如胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂等。

本发明的应用中，所述中药组合物制剂剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂，为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料（范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社1997年12月第1版中各剂型记载的辅料）。

为阐明本发明中药组合物具有保护运动神经元的活性，用按实施例1的方法所制得的药物（以下称本发明药物）进行了下列试验。

1 实验材料

1.1 药物  本发明药物（JWLF），有效部位为总皂苷、总黄酮，每支0.8g，含生药3.5g，辅料含量约为91.4%，临床用量为每日2支，由石家庄以岭药业股份有限公司提供，批号：20081201。辅料对照冻干粉为白色疏松块状粉，批号：20090303。注射用七叶皂苷钠（冻干粉），10mg/支，黑龙江省珍宝岛制药有限公司生产，批号：20090401。利鲁唑，由Sigma公司生产，批号：057K3900。

1.2 试剂  谷氨酸：Sigma公司，批号：118K08801；高糖DMEM培养液：Gibco公司，批号：1290007；胎牛血清：Cellgro公司，批号：50020038；MTT：超纯级，Amressco公司；二甲基亚砜（DMSO）：ACS grade，Amressco公司；RIPA裂解液：Solarbio公司，批号：90090830；bcl-2、bax、β-actin抗体均为Santa cruz公司产品，批号分别为D0609、C0909、F2007。

1.3 实验动物  清洁级SD大鼠，雌雄各半，180~220g；清洁级SD雌性大鼠，孕期10~14d，均购于河北省实验动物中心，许可证号SCXK（冀）2008-1-003。大鼠笼养，饲养在河北省中西医结合医药研究院新药评价中心，光照12小时/天，温度20~25℃，相对湿度40%~70%。

1.4 仪器系统  Epics-XLII型流式细胞仪（Beckman Coulter），凝胶成像分析仪（Biorad），凝胶成像图像分析软件（Quantity one），5417R型低温离心机（Eppendorf），XD711酶标分析仪（上海迅达医疗仪器公司），二氧化碳细胞培养箱（日本三洋），座式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）。

2 实验方法

2.1 对大鼠脊髓损伤损伤后脊髓神经功能的影响

2.1.1 实验分组  将140只大鼠随机分为以下7组，每组20只。本发明药物设高中低三个剂量组，其剂量分别为2.32、1.16、0.58g生药/kg；另设假手术组、模型组、阳性药组和辅料组。阳性药为七叶皂苷钠冻干粉，给药剂量为3.33mg/kg。辅料组给药量为0.485g/kg。

2.1.2 给药方法  药物配制溶媒均为生理盐水，使用前溶解至相应浓度尾静脉注射给药，给药体积为1mL/100g体重。假手术组、模型组大鼠尾静脉注射生理盐水。于手术造模前2周开始预防性给药，造模后继续给药治疗2周。

2.1.3 大鼠脊髓损伤模型的建立  10%的水合氯醛麻醉，大鼠进入麻醉状态后固定于手术台上，常规碘伏消毒局部皮肤。以大鼠第12胸椎棘突处皮肤为切口的下缘，做中线3cm长的切口，切开皮肤、皮下，沿中线切开肌筋膜，暴露出T9-T11胸椎棘突，沿其两侧锐性分离肌肉至关节突，尖嘴咬骨钳咬除T10及上下各一个节段的椎板，暴露范围约3mm×12mm大小，保持硬脊膜完整，采用自制静态压迫装置，以30g重量，压迫10min。滴加抗生素，逐层缝合切口。假手术组仅行椎板切除手术，未行静态压迫过程。术后给损伤组大鼠行人工挤压膀胱，帮助排尿，每日2-3次，直到能自行排尿为止。

2.1.4 观察指标

2.1.4.1 神经运动功能评价  于术后第24h、7d、14d应用21分的BBB评分进行神经功能评价，观察其后肢的行走及肢体活动。

2.1.4.2 损伤处脊髓的形态学变化  脊髓损伤术后14d神经运动功能评价结束后，取损伤段脊髓约1.5cm，置于4%甲醛内过夜进行固定，常规石蜡包埋，做冠状面连续切片，HE染色，观察损伤处脊髓的形态学变化。

2.2 对谷氨酸诱导的原代神经元细胞凋亡的影响

2.2.1 药物配制  将本发明药物溶于无血清的DMEM中，配制成41.2g/L的母液，0.22μm的针头滤器过滤除菌，置-20℃冰箱保存。实验时用无血清DMEM稀释成相应浓度的工作液。

2.2.2 神经元细胞原代培养  碘酒、酒精依次消毒孕鼠腹部，取胎鼠大脑皮层放于PBS中，剥净脑膜。无血清培养液洗两遍，吸出液体，将组织剪成细小碎块，0.125％胰酶消化20min，吸出组织块放入含10%FBS的DMEM中，终止消化，吸管吹打15次左右，过200目筛网，800转离心5min，弃上清，沉淀的细胞用含10%FBS的DMEM吹打均匀。计数5.0×105个/mL，接种于96孔板或6孔板后继续培养，48h加入0.01mmol/L阿糖胞苷，作用24h吸出，换上新鲜的DMEM培养基。

2.2.3 实验分组  本发明药物设高中低三个剂量组，其剂量分别为2.06、1.03、0.52g/L，另设空白对照组、模型对照组、利鲁唑组和辅料组。神经元培养72h后，实验组分别加入用新鲜培养基配制的2.06g/L、1.03g/L、0.52g/L本发明药物，利鲁唑组加入10μmol/L利鲁唑，辅料组加入1.89g/L辅料，空白对照组和模型对照组加入等量新鲜培养基，共同培养24h后，神经毒性损伤各组（除空白对照组外）均加入谷氨酸（终浓度为0.5mmol/L），作用24h后进行指标检测。

2.2.4  MTT法测定神经元细胞活力  谷氨酸作用24h后进行细胞活力检测，在培养板中加入MTT（5mg/mL）20μL，37℃闭光孵育4h，去上清，各孔加入DMSO 100μL，微型震荡器震荡10min后，570nm测定OD值。

2.2.5 神经元细胞的形态观察  神经元细胞原代培养经过细胞计数后接种于含有盖玻片的6孔板，谷氨酸作用24h后，用冷PBS漂洗2min×3次，4%多聚甲醛4℃孵育10 min，冷PBS漂洗2min×3次，1%Triton X -1004℃孵育5 min，冷PBS漂洗2min×3次，苏木素液染核1min，自来水洗1min，1%盐酸酒精分化1sec，流水冲洗3min，0.5％伊红水溶液染色1min，自来水洗1 min，无水酒精脱水三次，二甲苯透明后封片观察。

2.2.6 神经元细胞凋亡率检测  实验结束后，用0.125％胰蛋白酶消化收集细胞，PBS清洗两遍，去上清液，用500μLPBS将细胞沉淀吹打成单细胞悬液，缓缓注入70％乙醇固定，4℃保存过夜。PBS清洗两次，加入1mL碘化丙啶（PI）染液，4℃冰箱避光染色30min，采用Epics-XLⅡ型流式细胞仪检测凋亡率。

2.2.7 神经元细胞凋亡蛋白检测  实验结束后，加入0.2mLRIPA裂解液冰上裂解30min，4℃、3000rpm离心20min，吸取上清，BCA法测定总蛋白浓度，用样品缓冲液稀释至5μg/μL。取100μg的蛋白样品进行12%的SDS-PAGE凝胶电泳，待目的蛋白接近凝胶中央部分时停止电泳，4℃、120V恒压电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1h。分别加入bcl-2、bax和β-actin一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜10min×3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1：10000）室温孵育1h，TBST洗膜5min×3次。ECL发光显色，凝胶成像系统照相，采用quantity one软件分析，扫描灰度值，以目的蛋白与内参β-actin的比值表示。

2.3 统计方法  所有数据用均数±标准差（                                                ±s）表示。采用SPSS统计软件包，首先进行正态性检验，符合正态分布的数据，均数比较用单因素方差分析（One-Way ANOVA），若方差齐，两两比较采用最小显著差法（LSD），若方差不齐则采用Dunnett’s T3检验；如不符合正态分布，则用非参数检验进行统计分析。

3 结  果

3.1神经运动功能评价    模型组大鼠BBB评分在脊髓静压损伤术后24h、7d、14d均显著低于假手术组；各给药组BBB评分较模型组均有不同程度的提高，并随着时间的延长，改善作用尤为明显。辅料组在各时间段与模型组无明显差异，见表1。

表1  本发明药物在不同时间对脊髓损伤大鼠的BBB评分结果比较 （±s）

组别	脊髓损伤术后24h	脊髓损伤术后7d	脊髓损伤术后14d
				假手术组	12.82±2.77**	15.09±2.51**	20.39±0.47**
模型组	1.23±1.33	2.86±2.91	5.00±3.26
				七叶皂苷钠组	2.46±1.98*	6.61±4.31**	10.69±4.66**
高剂量组	2.10±1.41*	5.50±2.45**	10.23±2.88**
				中剂量组	1.99±2.04	5.79±4.06*	9.04±4.30*
低剂量组	2.08±1.76	5.66±5.53	8.91±5.06*
				辅料组	1.41±1.27	2.98±2.34	5.43±2.72

注：与模型组比较：*P<0.05；**P<0.01

3.2 损伤处脊髓的形态学变化  假手术组脊髓外观形态正常，HE染色脊髓形态结构正常，未见异常。模型组受压脊髓颜色变暗，HE染色切片镜下可见明显水肿，神经元胞体皱缩、消瘦，可见红染的神经元。各给药组脊髓水肿程度较轻，神经元形态明显改善，见图1。

3.3神经元细胞的形态观察  空白对照组神经元细胞胞体大而透亮，胞核和核仁清晰可见，神经元突起长、多，末端分支形成典型的神经网络；模型组神经元细胞数量减少，胞体模糊，神经元突起明显稀疏，变短变少，甚至消失。与模型组相比：利鲁唑和本发明药物各组细胞状态明显好转，很大程度上缓解了谷氨酸诱导的兴奋性毒性损伤，尤以本发明药物高剂量组作用最为明显；辅料组没有变化，见图2。

3.4对神经元细胞活力的影响  与空白对照组相比，模型对照组神经元细胞活力明显下降（P<0.01）。各给药组均可增强神经元细胞的活力（P<0.01），对谷氨酸造成的兴奋性毒性损伤具有显著的保护作用。辅料组与模型对照组没有差别，见表2。

表2  本发明药物对神经元细胞活力及凋亡率的影响 （±s）

组别	例数	剂量（g/L）	OD值	凋亡率（%）
					空白对照组	6	——	0.220±0.059**	2.50±0.91**
模型对照组	6	——	0.097±0.022	14.08±2.72
					利鲁唑组	6	——	0.259±0.065**	3.49±1.04**
高剂量组	6	2.06	0.223±0.062**	3.55±0.68**
					中剂量组	6	1.03	0.162±0.017**	5.02±0.49**
低剂量组	6	0.52	0.152±0.026**	6.18±0.13**
					辅料组	6	1.89	0.083±0.017	16.56±9.69

注：与模型组比较：**P<0.01

3.5对神经元细胞凋亡率的影响  谷氨酸损伤下神经元细胞出现明显的凋亡，凋亡率显著上升（P<0.01），利鲁唑与本发明药物均可明显减少神经元细胞的凋亡（P<0.01）。辅料组凋亡率与模型组相比没有变化，见表2。

3.6 对bcl-2、bax蛋白表达的影响  谷氨酸诱导的原代神经元损伤可以显著抑制bcl-2蛋白表达（P<0.05），上调bax蛋白的表达（P<0.01）；利鲁唑和高中剂量的本发明药物能够显著抑制bax蛋白的表达（P<0.05），对bcl-2蛋白表达有明显的上调趋势，但未见统计学差异。辅料组bcl-2和bax两个蛋白表达与模型组相比未见明显变化，见表3。

表3  本发明药物对bcl-2、bax蛋白表达的影响 （±s）

组别	例数	bcl-2	bax
				空白对照组	3	1.00*	1.00**
模型对照组	3	0.53±0.23	3.41±0.29
				利鲁唑组	3	0.77±0.17	1.44±0.69*
高剂量组	3	0.74±0.19	1.63±0.58*
				中剂量组	3	0.86±0.23	1.75±0.67*
低剂量组	3	0.63±0.24	2.30±1.13
				辅料组	3	0.47±0.30	2.30±1.60

注：与模型对照组比较：*P<0.05；**P<0.01

综上所述，本发明药物可通过上调bcl-2蛋白表达、下调bax蛋白表达，从而抑制谷氨酸诱导的原代神经元细胞凋亡，增强神经元细胞活力，从而延缓病情发展，推测在改善患者肢体活动，提高生存质量等方面具有重要的临床应用价值。

附图说明

图1 实验各组脊髓损伤术后病理形态学改变（HE染色，×400），1为模型组；2为本发明药物高剂量组；3为本发明药物中剂量组；4为本发明药物低剂量组。

图2 各组细胞形态学改变（HE染色，×400）。 注：1为模型对照组；2为为本发明药物高剂量组；3为本发明药物中剂量组；4为本发明药物低剂量组；。

具体实施方式

下述实施例用于举例说明本发明中药冻干注射液的制备，但其不能对本发明的范围构成任何限制。

实施例1

原料重量比例：

人参总皂苷提取物50克    淫羊藿总黄酮提取物40克   羟丙基-β-环糊精800克

制备方法：

a、将羟丙基-β-环糊精加水4000ml溶解制成20%的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水750ml（5.33%）加热溶解，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温80℃±1℃，动态搅拌包合，包合时间3小时，将人参总皂苷提取物加水100ml(50%)加热溶解，加入包合液中，继续包合1小时；

b、加水调节溶液总量至6000ml，用10%的氢氧化钠溶液调节PH到7.5，加入活性炭24克(即含活性炭0.4%)，煮沸10分钟，趁热用澄清板框过滤，滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml；

c、105℃热压灭菌30分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至15ml西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-40℃预冻3小时；

d、按照预冻条件，在真空度为0.05Pa状态下，从-40℃至0℃升温升华28小时，再从0℃至30℃升温干燥4.5小时；

e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。

实施例2

原料重量比例：

人参总皂苷提取物35克    淫羊藿总黄酮提取物55克   羟丙基-β-环糊精900克

制备方法：

a、将羟丙基-β-环糊精加水3000ml溶解制成30%的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水1800ml(3.11%)溶解，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温50±1℃，动态搅拌包合，包合时间8小时，将人参总皂苷提取物加水105ml(33.3%)加热溶解，加入包合液中，继续包合2小时；

b、加水调节溶液总量至6000ml，用20%的氢氧化钠溶液调节PH到6.2，加入活性炭6克(含活性炭0.1%)，煮沸10分钟，趁热用砂滤棒过滤，滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml；

c、105℃热压灭菌15分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至10ml西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-20℃预冻5小时；

d、按照预冻条件，在真空度为0.5Pa状态下，从预冻温度至0℃升温升华35小时，再从0℃至30℃升温干燥8小时；

e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。

实施例3

原料重量比例：

人参总皂苷提取物65克    淫羊藿总黄酮提取物25克   羟丙基-β-环糊精650克

制备方法：

a、将羟丙基-β-环糊精加水4000溶解制成16.3%的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水250ml(10%)加热溶解，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温90℃±1℃，动态搅拌包合，包合时间3小时，将人参总皂苷提取物加水130ml(50%)加热溶解，加入包合液中，继续包合1小时；

b、加水调节溶液总量至6000ml，用5%的氢氧化钠溶液调节PH到8.5，加入活性炭30克(含活性炭0.5%)，煮沸6分钟，趁热抽滤，滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml；

c、105℃热压灭菌10分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-30℃预冻4.5小时；

d、按照预冻条件，在真空度为0.1Pa状态下，从预冻温度至0℃升温升华25小时，再从0℃至30℃升温干燥6小时；

e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。

实施例4

原料重量比例：

人参总皂苷提取物45克    淫羊藿总黄酮提取物35克   羟丙基-β-环糊精700克

制备方法：

a、将羟丙基-β-环糊精加水2800ml溶解制成25%的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水1000ml(3.5%)溶解，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温60℃±1℃，动态搅拌包合，包合时间4小时，将人参总皂苷提取物加水150ml(30%)加热溶解，加入包合液中，继续包合1.5小时；

b、加水调节溶液总量至6000ml，用15%的氢氧化钠溶液调节PH到6，加入活性炭18克（含活性炭0.3%），煮沸25分钟，趁热滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml；

c、105℃热压灭菌20分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-25℃预冻4小时；

d、按照预冻条件，在真空度为0.45Pa状态下，从预冻温度至0℃升温升华30小时，再从0℃至30℃升温干燥6.5小时；

e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。

实施例5

原料重量比例：

人参总皂苷提取物60    淫羊藿总黄酮提取物50   羟丙基-β-环糊精700

制备方法：

a、将羟丙基-β-环糊精加水4000ml溶解制成17.5%的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水1500(3.33%)溶解，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温85℃，动态搅拌包合，包合时间8小时，将人参总皂苷提取物加水150ml(40%)溶解，加入包合液中，继续包合1小时；

b、加水调节溶液总量至6000ml，用8%的氢氧化钠溶液调节PH到7.5，加入活性炭24克（含活性炭0.4%），煮沸10分钟，趁热滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml；

c、105℃热压灭菌30分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中， -35℃预冻3.5小时；

d、按照预冻条件，在真空度为0.05Pa状态下，从预冻温度至0℃升温升华35小时，再从0℃至30℃升温干燥8小时；

e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。

实施例6

原料重量比例：

人参总皂苷提取物50克    淫羊藿总黄酮提取物45克   羟丙基-β-环糊精800克。

制备方法：

a、将羟丙基-β-环糊精加水5000ml溶解制成16%的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水450ml制成10%的溶液，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温90℃，动态搅拌包合，包合时间5.5小时，将人参总皂苷提取物加水125ml(40%)加热溶解，加入包合液中，继续包合1.5小时；

b、加水调节溶液总量至6000ml，用12.5%的氢氧化钠溶液调节PH到7.5，加入活性炭18克(含活性炭0.3%)，煮沸8分钟，趁热滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml；

c、105℃热压灭菌20分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-30℃预冻3.5小时；

d、按照预冻条件，在真空度为0.25Pa状态下，从预冻温度至0℃升温升华28小时，再从0℃至30℃升温干燥5小时；

e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。

Claims (8)

1.一种中药组合物冻干注射剂在制备治疗脊髓损伤后神经元保护药物中的应用，所述中药组合物由如下重量份比例的原料制成：

人参总皂苷提取物30-70    淫羊藿总黄酮提取物20-60，其特征在于所述中药组合物冻干注射剂由以下步骤制成：

a、将5-15倍原料重量的羟丙基-β-环糊精加水溶解制成15～30%的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水制成3～10%的溶液，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温50～90℃，动态搅拌包合，包合时间3～8小时，将人参总皂苷提取物加水制成30-50%的溶液，加入包合液中，继续包合1～2小时；

b、加水调节溶液总量至6ml/支，用5～20%的氢氧化钠溶液调节pH到6～9，加入活性炭至含活性炭0.1～0.5%，煮沸5～10分钟，趁热滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6ml/支；

c、105℃热压灭菌10～30分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-20℃～-40℃预冻2～5小时；

d、按照预冻条件，在真空度为0.05-0.5Pa状态下，从预冻温度至0℃升温升华20-35小时，再从0℃至30℃升温干燥3-8小时；

e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于该中药组合物是由如下重量份比例的原料制成：

人参总皂苷提取物35    淫羊藿总黄酮提取物55。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于该中药组合物是由如下重量份比例的原料制成：

人参总皂苷提取物65    淫羊藿总黄酮提取物25。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于该中药组合物是由如下重量份比例的原料制成：

人参总皂苷提取物50    淫羊藿总黄酮提取物40。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于所述冻干注射剂由以下步骤制成：

a、将9倍原料重量的羟丙基-β-环糊精加水溶解制成20%的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水制成5%的溶液，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温60～80℃，动态搅拌包合，包合时间3～5小时，将人参总皂苷提取物加水制成33%的溶液，加入包合液中，继续包合1～2小时；

b、加水调节溶液总量至6ml/支，用10%的氢氧化钠溶液调节pH到7.5～8.0，加入活性炭至含活性炭0.4%，煮沸10分钟，趁热滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6ml/支；

c、105℃热压灭菌30分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-40℃预冻3小时；

d、按照预冻条件，在真空度为0.05-0.1Pa状态下，从-40℃至0℃升温升华28小时，再从0℃至30℃升温干燥4.5小时；

e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。

6.如权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物在制备促进脊髓损伤后大鼠后肢运动功能恢复药物中的应用。

7.如权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物在制备增强神经元细胞活力药物中的应用。

8.如权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物在制备抑制谷氨酸诱导的神经细胞凋亡，调节凋亡相关蛋白表达药物中的应用。